TW201350131A - 包含四ｇａｌｎａｃ之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示包含以下之模組化組合物：1)寡核苷酸；2)一或多個式(I)之四GalNAc配體，其可相同或不同；視情況，3)一或多個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)一或多個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
Description
正在進行集中於出於治療目的以全身性方式傳送寡核苷酸之科學努力。三種用以寡核苷酸傳送之突出方法包括1)脂質奈米粒子(LNP)囊封、2)聚合物結合及3)單一化學結合。單一化學結合通常採用連接至寡核苷酸之靶向配體或脂質或增溶基團或內體裂解肽或細胞穿透肽及/或兩種或所有四種之組合。連接體可存於結合物以及其他官能基中。已知單一化學結合物且寡核苷酸連接發生於寡核苷酸之5'-或3'-端、兩端或內部。參見WO2005/041859、WO2008/036825及WO2009/126933。
大量文獻證據支持以下假說：寡核苷酸傳送之主要障礙係細胞攝取及內體逃逸。業內仍需要可提供有效傳送效率、細胞攝取及/或內體逃逸之額外單一化學結合物。
包含本文所揭示四GalNAc配體之單一化學結合物具有改良傳送效率、細胞攝取及/或內體逃逸之驚人性質。
在一個實施例中，本文所揭示模組化組合物包含：1)單股或雙股寡核苷酸；2)一或多個式(I)之四GalNAc配體，其可相同或不同：
其中X係-O-、-S-、-CR1R2-或-NR1-，其中R1及R2各自獨立地選自由氫及C1-C6烷基組成之群；n係1、2、3或4；且具有「」之鍵指示連接點；視情況，3)一或多個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)一或多個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。在一個實施例中，R1及R2各自獨立地選自由氫、甲基及乙基組成之群。在另一實施例中，R1及R2各自係氫。
在一個實施例中，四GalNAc配體具有式(II)，其中X、R1、R2及n係如上文所定義。在另一實施例中，四GalNAc配體具有式(III)，其中X、R1、R2及n係如上文所定義：
在另一實施例中，模組化組合物包含：1)單股或雙股寡核苷酸；2)1-8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其
中X係-O-、-S-、-CH2-或-NH-；且n係1、2、3或4；3)1-24個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
在另一實施例中，模組化組合物包含：1)單股或雙股siRNA；2)1-8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH2-或-NH-；且n係1、2、3或4；3)1-16個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
在上述實施例之一個子集中，連接體在寡核苷酸或siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在寡核苷酸或siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA。
在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體視情況經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA。
在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體在寡核苷酸或siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在寡核苷酸或siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA；且四GalNAc配體視情況經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA。
在上述實施例之另一子集中，式(I)、(II)或(III)之X係-O-、-S-或-CH2-；且n係1、2或3。
在上述實施例之另一子集中，式(I)、(II)或(III)之X係-O-或-CH2-且n係1或2。
在上述實施例之另一子集中，式(I)、(II)或(III)之X係-O-且n係1或2。
在上述實施例之另一子集中，式(I)、(II)或(III)之X係-CH2-且n係1或2。
在上述實施例之另一子集中，組合物包含1-6個四GalNAc配體，
或更特定而言1-4個四GalNAc配體，其可相同或不同。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股；且四GalNAc配體在核糖環之不同2’位置連接至寡核苷酸或siRNA之導向股或過客股。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股；且四GalNAc配體在不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA之導向股或過客股。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股；且兩個或更多個四GalNAc配體在核糖環之不同2’位置及/或在不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA之導向股及過客股。
在上述實施例之另一子集中，每一連接體獨立地選自表1。
在上述實施例之另一子集中，每一連接體獨立地選自表2。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股；且可選靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑連接至寡核苷酸或siRNA之同一或不同股。
在一個實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-8個式(IV)、(V)或(VI)之四GalNAc配體：
3)1-16個獨立地選自表1之連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
在另一實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-4個式(IV)、(V)或(VI)之四GalNAc配體；3)1-8個獨立地選自表1之連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體視情況經由連接體連接至siRNA。
在上述實施例之一個子集中，四GalNAc配體經由連接體連接至siRNA之同一股。
在一個實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-4個式(V)之四GalNAc配體；3)1-8個獨立地選自表2之連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體經由連接體連接至siRNA。
在上述實施例之一個子集中，四GalNAc配體經由連接體連接至siRNA之同一股。
本文揭示包含以下之單一化學結合物：單股或雙股寡核苷酸；及一或多個式(I)之四GalNAc配體，其可相同或不同：
其中X係-O-、-S-、-CR1R2-或-NR1-，其中R1及R2各自獨立地選自由氫及C1-C6烷基組成之群；n係1、2、3或4；且具有「」之鍵指示連接點。視情況存在其他官能基，例如靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。在一個實施例中，R1及R2各自獨立地選自由氫、甲基及乙基組成之群。在另一實施例中，R1及R2各自係氫。
在一個實施例中，四GalNAc配體具有式(II)，其中X、R1、R2及n係如上文所定義。在另一實施例中，四GalNAc配體具有式(III)，其中X、R1、R2及n係如上文所定義：
在一個實施例中，寡核苷酸係短干擾RNA(siRNA)。在另一實施例中，siRNA係單股siRNA。在另一實施例中，siRNA係雙股siRNA。
使用本文所揭示四GalNAc可藉由將模組化組合物引導至特定細胞提供寡核苷酸或siRNA之有效傳送。舉例而言，靶向配體可在靶細胞表面上與分子特異性或非特異性結合且有利於配體-siRNA結合之攝取。
連接體可存於每一四GalNAc與寡核苷酸之間。連接體在寡核苷酸之核糖環之不同2’位置及/或末端3'及/或5'位置連接至寡核苷酸。
在一個實施例中，模組化組合物包含1)單股或雙股寡核苷酸；2)一或多個式(I)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH2-或-NH-；n係1、2、3或4；且具有「」之鍵指示連接點；視情況，3)一或多個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)一或多個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
在另一實施例中，模組化組合物包含：1)單股或雙股寡核苷酸；2)1-8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH2-或-NH-；n係1、2、3或4；3)1-16個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
在另一實施例中，模組化組合物包含：1)單股或雙股siRNA；2)1-8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH2-或-NH-；n係1、2、3或4；3)1-16個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
在上述實施例之一個子集中，四GalNAc配體在寡核苷酸或siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在寡核苷酸或siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA。
在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體視情況經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA。在一個實施例中，存在連接體。
在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體在寡核苷酸或siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在寡核苷酸或siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA；且四GalNAc配體經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA。
在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA且連接體在核糖環之不同2’位置連接至寡核苷酸或siRNA。
在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體經由連接體連接至寡核苷酸或siRNA，且連接體在寡核苷酸之不同末端3’及/或5’位置連接至寡核苷酸或siRNA。
在上述實施例之另一子集中，X係-O-、-S-或-CH2-。在另一實施例中，X係-O-或-CH2-。在另一實施例中，n係1、2或3。在另一實施例中，X係-O-且n係1或2。在另一實施例中，X係-CH2-且n係1或2。在另一實施例中，X係-O-且n係1。在又一實施例中，X係-CH2-且n係1。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係單股。在另一
實施例中，寡核苷酸或siRNA係雙股。
在上述實施例之另一子集中，組合物包含1-6個四GalNAc配體。在另一實施例中，組合物包含1-4個四GalNAc配體。在另一實施例中，組合物包含1-2個四GalNAc配體。在又一實施例中，組合物包含1個四GalNAc配體。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體在核糖環之不同2’位置連接至導向股。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體在不同末端3’及/或5’位置連接至導向股。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體在核糖環之不同2’位置連接至過客股。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體在不同末端3’及/或5’位置連接至過客股。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體在核糖環之不同2’位置及/或不同末端3'及/或5'位置連接至導向股及過客股。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體連接至同一股。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且四GalNAc配體連接至不同股。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且可選靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑連接至同一或不同股。
在上述實施例之另一子集中，寡核苷酸或siRNA係雙股且可選靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑經由連接體連接至同一或不同股。在一個實施例中，每一連接體獨立地選自表
1。在另一實施例中，每一連接體獨立地選自表2。
在一個實施例中，模組化組合物包含1)單股或雙股siRNA；2)1-8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同；其中X係-O-、-S-、-CH2-或-NH-；且n係1、2、3或4；3)1-16個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體視情況經由連接體連接至siRNA。在一個實施例中，存在連接體。在另一實施例中，X係-O-、-S-或-CH2-，且n係1、2或3。在另一實施例中，X係-O-或-CH2-，且n係1或2。
在另一實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-6個式(I)之四GalNAc配體，其可相同或不同；其中X係-O-、-S-或-CH2-；且n係1、2或3；3)1-18個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-6個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體視情況經由連接體連接至siRNA。在一個實施例中，存在連接體。在另一實施例中，X係-O-、-S-或-CH2-且n係1或2。在另一實施例中，連接體獨立地選自表1。在另一實施例中，連接體獨立地選自表2。
在另一實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-4個式(I)之四GalNAc配體，其可相同或不同；其中X係-O-、-S-或-CH2-；且n係1或2；3)1-8個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體經由連接體連接至siRNA。在一個實施例中，X係-O-或-CH2-且n係1或2。在另一實施例
中，連接體獨立地選自表1。在另一實施例中，連接體獨立地選自表2。
在另一實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-4個式(IV)、(V)或(VI)之四GalNAc配體：
3)1-8個獨立地選自表1之連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體在siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體經由連接體連接至siRNA。
在另一實施例中，模組化組合物包含1)雙股siRNA；2)1-4個式(V)之四GalNAc配體；3)1-8個獨立地選自表2之連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1-4個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中四GalNAc配體在siRNA之核糖環之不同2’位
置及/或在siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至siRNA；且其中四GalNAc配體經由連接體連接至siRNA。
在上述實施例之一個子集中，四GalNAc配體經由連接體連接至siRNA；且其中四GalNAc配體連接至同一股。
在上述實施例之另一子集中，四GalNAc配體經由連接體連接至siRNA；且其中四GalNAc配體連接至不同股。
為經由草圖(cartoon)闡釋本發明，本發明之特徵在於模組化組合物，該模組化組合物包含寡核苷酸([O1][O2][O3]......[On])、一或多個連接體(L)、一或多個四GalNAc配體(G)、及一或多個可選脂質(X)、靶向配體(X)及/或增溶基團(X)。
在實施例中，模組化組合物可具有下式：G-L-[O1][O2][O3]......[On]。
在另一實施例中，模組化組合物可具有下式：G-L-[O1][O2][O3]......[On]-X。
包含末端結合之雙股寡核苷酸的模組化組合物之非限制性實例係：
包含內部結合之雙股寡核苷酸的模組化組合物之非限制性實例係：
該等實例僅用作闡釋。熟習此項技術者將認識到，存在在過客股及導向股上放置期望組份之多種變更。
任何數目之連接體、且因此任何數目之四GalNAc配體可連接至寡核苷酸。連接體之較佳數目範圍係1-16。連接體之更佳數目範圍係1-8，或更特定而言1-4。四GalNAc配體之較佳數目範圍係1-8。肽之更佳數目範圍係1-8，或更特定而言1-4。
兩股分別含有n及n'個核苷酸。數目n及n'可相等或不同。數目係8至50範圍內之整數。較佳地，數目係12-28範圍內之整數。更佳地，數目係19-21範圍內之整數。
作為實例，含有連接體(L-G及/或L-X)之每一核苷酸[On]或[On']具有以下草圖中所示之通用結構：
對於每一核苷酸而言，1)E=氧(O)或硫(S)；2)鹼基=A、U、G或C，其可經修飾或未經修飾；3)D係核糖環與連接體L之間之連接點，D=氧(O)、硫(S、S(O)或S(O)2)、氮(N-R，其中R=H、烷基、L-P或L-X)、碳(CH-R，其中R=H、烷基、L-P或L-X)或磷(P(O)R或P(O)(OR)，其中R=烷基、L-G或L-X)。較佳地，D=氧(O)。
兩個核苷酸[On-1]及[On]或[On'-1]及[On']經由磷酸二酯鍵或硫代-磷酸二酯鍵連接。
在寡核苷酸係雙股寡核苷酸時，「G-L」及脂質、靶向配體及/或增溶基團可位於同一股或不同股上。
在一些實施例中，「G-L」及脂質、靶向配體及/或增溶基團在同一股上。
在一些實施例中，「G-L」及脂質、靶向配體及/或增溶基團在過客股上。
在一些實施例中，「G-L」及脂質、靶向配體、及/或增溶基團在導向股上。
在一些實施例中，「G-L」及脂質、靶向配體及/或增溶基團位於不同股上。
在一些實施例中，「G-L」在過客股上，而脂質、靶向配體及/或增溶基團在導向股上。
在一些實施例中，脂質、靶向配體及/或增溶基團之「G-L」在不同股上，但在雙股寡核苷酸之相同末端上。
在一些實施例中，「G-L」及脂質、靶向配體及/或增溶基團在不同股上且在雙股寡核苷酸之相反末端上。
在一些實施例中，可使用相同或不同性質之其他「G-L」替代上述實施例中提及之脂質、靶向配體及/或增溶基團。
在一些實施例中，「G-L」可位於過客股或導向股之多個末端上
且脂質、靶向配體及/或增溶基團可位於過客股及導向股之其餘末端上。
在一些實施例中，一個「G-L」及兩個或更多個脂質、靶向配體及/或增溶基團存在於寡核苷酸中。
在一些實施例中，兩個或更多個「G-L」及兩個或更多個脂質、靶向配體及/或增溶基團存在於寡核苷酸中。
在一些實施例中，當寡核苷酸係雙股寡核苷酸且存在多個「G-L」組份及/或脂質、靶向配體及/或增溶基團時，該等多個「G-L」組份及/或脂質、靶向配體及/或增溶基團可均存在於雙股寡核苷酸之一股或兩股中。
當存在多個「G-L」組份及/或脂質、靶向配體及/或增溶基團時，其可均相同或不同。
在一些實施例中，「G-L」僅在內部核苷酸上(即排除寡核苷酸之3'及5'端)。
在另一態樣中，本發明包括傳送寡核苷酸或siRNA至細胞之方法。該方法包括(a)提供或獲得本文所揭示之模組化組合物；(b)使細胞與模組化組合物接觸；及(c)允許細胞內化模組化組合物。
該方法可在活體外(in vitro)、離體(ex vivo)或在活體內實施以例如治療鑑別為需要寡核苷酸或siRNA之個體。需要該寡核苷酸之個體係需要一或多種基因(例如與病症有關之基因)之表現下調或沉默的個體，例如人類。
在一個態樣中，本發明提供抑制一或多種基因表現之方法。該方法包含使一或多個細胞與有效量之本發明寡核苷酸接觸，其中有效量係抑制一或多種基因表現之量。該方法可在活體外、離體或在活體內實施。
本發明之方法及組合物(例如本文所述之模組化組合物)可與業內
已知之任何寡核苷酸或siRNAs一起使用。另外，本發明之方法及組合物可用於治療業內已知之任何疾病或病症，且用於治療任何個體，例如任何動物，任何哺乳動物，例如任何人類。熟習此項技術者亦將認知，本發明之方法及組合物可用於治療任何將受益於基因下調或沉默之疾病。
本發明之方法及組合物(例如本文所述模組化組合物)可與本文所述之任何劑量及/或調配物或業內已知之任何劑量或調配物一起使用。除本文所述投與路徑外，熟習此項技術者亦應瞭解，可使用其他投與路徑以投與本發明模組化組合物。
如本文所用「寡核苷酸」係雙股或單股、未經修飾或經修飾RNA或DNA。經修飾RNA之實例包括彼等對核酸酶降解之抗性比未經修飾RNA大者。其他實例包括彼等具有2'糖修飾、鹼基修飾、單股懸垂部分(例如3'單股懸垂部分)之修飾，或尤其若係單股，則為包括一或多個磷酸酯基團或一或多個磷酸酯基團類似物的5'修飾。寡核苷酸之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。
在實施例中，寡核苷酸係反義、miRNA、肽核酸(PNA)、聚-嗎啉基(PMO)或siRNA。較佳寡核苷酸係siRNA。另一較佳寡核苷酸係siRNA之過客股。另一較佳寡核苷酸係siRNA之導向股。
siRNA經由稱作RNA干擾(RNAi)之製程引導mRNA之序列特異性沉默。該製程發生於多種有機體(包括哺乳動物及其他脊椎動物)中。已知製備及投與siRNA之方法及其用於使基因功能特異性不活化之用途。siRNA包括經修飾及未經修飾之siRNA。siRNA之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。
已知多種可用於向個體投與siRNA之例示性傳送路徑。另外，siRNA可根據業內已知之任何例示性方法調配。siRNA調配及投與之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。
片語「短干擾核酸」、「siNA」、「短干擾RNA」、「siRNA」、「短干擾核酸分子」、「寡核苷酸」、「短干擾寡核苷酸分子」或「經化學修飾短干擾核酸分子」係指任何能夠藉由調介RNA干擾(「RNAi」)或以序列特異性方式使基因沉默抑制或下調基因表現或病毒複製之核酸分子。該等術語可指個別核酸分子、複數種該核酸分子或該等核酸分子池。siNA可為雙股核酸分子包含自互補有義及反義股，其中反義股包含與靶核酸分子或其一部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列且有義股包含對應於靶核酸序列或其一部分之核苷酸序列。siNA可為具有雙螺旋、不對稱雙螺旋、髮夾或不對稱髮夾二級結構之多核苷酸，該結構自互補有義及反義區，其中反義區包含與單獨靶核酸分子或其一部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列且有義區包含對應於靶核酸序列或其一部分之核苷酸序列。siNA可為具有兩個或更多個環結構及包含自互補有義及反義區之桿的環形單股多核苷酸，其中反義區包含與靶核酸分子或其一部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列且有義區包含對應於靶核酸序列或其一部分之核苷酸序列，且其中環形多核苷酸可在活體內或活體外處理以產生能夠調介RNAi之活性siNA分子。siNA亦可包含具有與靶核酸分子或其一部分中之核苷酸序列互補之核苷酸序列的單股多核苷酸(例如，其中該siNA分子無需在對應於靶核酸序列或其一部分之核苷酸序列之siNA分子內存在)，其中單股多核苷酸可進一步包含末端磷酸酯基團(例如5’-磷酸酯(例如，參見Martinez等人，2002,Cell,110,563-574及Schwarz等人，2002,Molecular Cell,10,537-568))或5’,3’-二磷酸酯。
模組化組合物之四GalNAc與寡核苷酸或siRNA之間之共價連接可由連接體調介。端視應用而定，此連接體可裂解或不可裂解。在某些實施例中，可使用可裂解連接體以在自內體運輸至細胞質後釋放寡核苷酸。結合或偶合相互作用之預期性質或期望生物效應可決定連接體基團之選擇。連接體基團可經組合或具支鏈以提供更複雜架構。適宜連接體包括彼等如WO2009/126933中所述者，其以引用方式併入本文中。
在一個實施例中，本發明之連接體示於表1中：表1
在另一實施例中，較佳連接體示於表2中：表2
市售連接體可自多個供應商(例如Pierce或Quanta Biodesign)購得，包括該等連接體之組合。另外，經由磷酸酯鍵連接之市售連接體可獨立地用作連接體或與該連接體組合使用。連接體亦可經組合以產生容納1至8個四GalNAc配體之更複雜具支鏈架構，如以下一個該實例中所闡釋：
本發明模組化組合物可包含靶向配體。在一些實施例中，此靶向配體可將模組化組合物引導至特定細胞。舉例而言，靶向配體可在靶細胞表面上與分子特異性或非特異性結合。靶向部分可為對於靶細胞具有特異性親和力之分子。靶向部分可包括抵抗靶細胞表面上發現之蛋白質之抗體或靶細胞表面上發現之分子之配體或配體之受體結合部分。靶向配體之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。
靶向配體係選自由以下組成之群：抗體、受體之配體結合部分、受體之配體、適體、D-半乳糖、N-乙醯基-D-半乳糖(GalNAc)、多價N-乙醯基-D-半乳糖、D-甘露糖、膽固醇、脂肪酸、脂蛋白、葉酸鹽、促甲狀腺素、促黑色素細胞素、表面活性劑蛋白A、黏蛋白、碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡萄糖胺、多價甘露糖、多價果糖、糖基化聚胺基酸、鐵傳遞蛋白、雙膦酸酯、多麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、增強血漿蛋白結合之親脂性部分、類固醇、膽酸、維生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模擬物、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、阿司匹林(aspirin)、葉酸鹽及其類似物及衍生物。
較佳靶向配體係選自由以下組成之群：D-半乳糖、N-乙醯基-D-半乳糖(GalNAc)、GalNAc2及GalNAc3、膽固醇、葉酸鹽及其類似物及衍生物。
親脂性部分(例如膽固醇或脂肪酸)在連接至高親水性分子(例如核酸)時可實質上增強血漿蛋白結合且因此增強循環半衰期。另外，親脂性基團可增加細胞攝取。舉例而言，脂質可結合至某些血漿蛋白，例如脂蛋白，其因此顯示可增加表現相應脂蛋白受體(例如，
LDL-受體或清除劑受體SR-B1)之特定組織中之攝取。亦可將親脂性結合物視為靶向傳送方法且可藉由與內體裂解試劑組合進一步潛在地改良其細胞內運輸。
增強血漿蛋白結合之例示性親脂性部分包括(但不限於)固醇、膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧基己基、十六烷基甘油、莰醇、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、吩噁嗪、阿司匹林、萘普生、布洛芬、維生素E及生物素等。脂質之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文中。
較佳脂質係膽固醇。
模組化組合物可包含一或多個可增強水溶解性、循環半衰期及/或細胞攝取之其他部分/配體。該等部分/配體包括天然物質，例如蛋白質(例如，人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；或碳水化合物(例如，葡聚糖、支鏈澱粉、殼多糖、殼聚糖、菊粉、環糊精或透明質酸)。該等部分亦可為重組或合成分子，例如合成聚合物或合成聚胺基酸。實例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG，例如PEG-0.5K、PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K)、甲基-PEG(mPEG)、[mPEG]2、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚膦嗪。增溶劑之實例及進一步說明可參見WO2009/126933，其以引用方式併入本文
中。
較佳增溶基團係0.5K至30K之PEG。
在一個態樣中，本發明之特徵在於治療處於可受益於投與本發明模組化組合物之疾病風險或患有該疾病的個體之方法。該方法包含向有需要之個體投與本發明模組化組合物，藉此治療該個體。所投與寡核苷酸將端視所治療疾病而定。對於關於特定適應症之治療之方法的其他詳細內容，參見WO2009/126933。
存在多種製備寡核苷酸化合物之結合物的方法。彼等熟習此項技術者應熟悉該等技術。該等反應之有用參考文獻係Bioconjugate Techniques,Hermanson,G.T.,Academic Press,San Diego,CA,1996。其他參考文獻包括WO2005/041859、WO2008/036825及WO2009/126933。
藉由以下實例進一步闡述本發明，但其不應視為進一步限制本發明。貫穿本申請案引用之所有參考文獻、待決專利申請案及已公開專利之內容皆係以引用方式明確併入本文中。本文所述siRNA經設計以靶向普遍表現之基因SSB(Sjogren症候群抗原B；NM_009278.4)。
連接體基團可在鍵聯連接點(LAP)處連接至寡核苷酸或siRNA股且可包括任何含碳部分，在一些實施例中其具有至少1個氧原子、至少1個磷原子及/或至少1個氮原子。在一些實施例中，磷原子構成連接體基團上之末端磷酸酯或硫代磷酸酯基團之部分，其可用作寡核苷酸股之連接點。在某些實施例中，氮原子構成連接體基團上之末端醚、酯、胺基或醯胺基(NHC(O)-)之部分，其可用作目標連接體、內體裂解單元、細胞穿透肽、增溶基團、脂質、靶向基團或其他目標連
接體之連接點。該等末端連接體基團包括(但不限於)C6己基、C5二級-羥基、C3硫醇或C6硫醇部分。下述RNA序列之實例係C6己基：[(CH2)6NH2]。
四GalNAc配體及四GalNAc-siRNA結合物之製備闡述於下文實例及合成反應圖中。用於下述化合物及/或結合物之特定siRNA序列示於表3中。
如本文所用，ome=2'甲氧基；flu=2'氟；click=2'炔丙基；iB=反向無鹼基；「s」下標=硫代磷酸酯；且r=2'核糖；6amil=正
己基胺基。
使用稍後闡述之方法，在表4中提供活體內及活體外數據。
應注意，下文siRNA繪示係出於闡釋目的。特定序列資訊可參見表3。
使用以下反應圖1製備四GalNAc化合物9及10。
反應圖1
向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之2000-mL 3頸圓底燒瓶中放入(2S)-2,6-二胺基己酸(50g,342.03mmol,1.00當量)存於乙腈(1000mL)中之溶液並加熱至50℃。向此中添加氫氧化鉀(22.6g，0.4025mol，1.00當量，85%)。將所得溶液攪拌30min。隨後添加3-溴丙-1-炔(29.5mL，1.00當量)。將所得溶液於50℃下攪拌1小時。向溶液中添加其他
氫氧化鉀(22.6g，0.4025mol，1.00當量)並於50℃下攪拌30min。向此中添加3-溴丙-1-炔(29.5mL，1.00當量)。將所得溶液攪拌1小時。向此中再次添加氫氧化鉀(22.6g，0.4025mol，1.00當量)。將所得溶液於50℃下攪拌30min，之後添加更多3-溴丙-1-炔(29.5mL，1.00當量)。將所得溶液攪拌1小時。向此中添加氫氧化鉀(22.6g，0.4025mol，1.00當量)。將所得溶液攪拌30min。向此中添加3-溴丙-1-炔(29.5mL，1.00當量)。將所得溶液攪拌3小時。將反應混合物用水/冰浴冷卻至25℃。濾出固體。用HCl(6M)將濾液調節至pH 4。濾出固體。在真空下濃縮濾液。將殘餘物施加至矽膠管柱上並用二氯甲烷/甲醇(100：1-25：1)洗脫。此產生淺黃色油狀(2S)-2,6-雙[雙(丙-2-炔-1-基)胺基]己酸(化合物1)。
MS(ES,m/z)：297.2,[M-H]-1HNMR(CDCl3,500MHz，ppm)：3.62(d,J=2.0Hz,4H),3.52-3.49(m,1H),3.50(d,J=2.4Hz,4H),2.62(t,J=7.1Hz,2H),2.30(t,J=2.4Hz,2H),2.27(t,J=2.4Hz,2H),1.88-1.79(m,2H),1.60-1.53(m,2H),1.52-1.43(m,2H)。
向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之2000-mL 3頸圓底燒瓶中放入2-(2-羥基乙氧基)乙-1-醇(化合物2，42.4g，399.55mmol，1.00當量)存於二氯甲烷(1000mL)及三乙胺(27.9g，275.72mmol，0.25當量)中之溶液。向上述物質中添加對甲苯磺醯氯(19.1g，100.18mmol，0.50當量)。在25℃下攪拌1h後，分別用1×500mL硫酸氫鉀水溶液(1M)及1×500mL碳酸氫鈉水溶液(5%)洗滌所得混合物。經無水硫酸鈉乾燥有機層並在真空下濃縮。將殘餘物施加至矽膠管柱上並用二氯甲烷/甲醇(100：1)洗脫。此產生無色油狀4-甲基苯磺酸2-(2-羥基乙氧基)乙基酯(化合物3)。
向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之500-mL圓底燒瓶中放入4-甲基苯磺酸2-(2-[[(4-2-(2-羥基乙氧基)乙基酯(化合物3，50g，192.08mmol，1.00當量)存於N,N-二甲基甲醯胺(250mL)中之溶液。之後於25℃下添加疊氮化鈉(18.79g，289.03mmol，1.50當量)。將所得溶液於100℃下在油浴中攪拌5h。冷卻並過濾反應混合物。在真空下濃縮濾液。將殘餘溶液用1000mL二氯甲烷稀釋並用1×500mL水洗滌。經無水硫酸鈉乾燥有機層並在真空下濃縮。將殘餘物施加至矽膠管柱上並用二氯甲烷/甲醇(80：1)洗脫。此產生無色油狀2-(2-疊氮基乙氧基)乙-1-醇(化合物4)。
1HNMR(CDCl3,400MHz，ppm)：3.42-3.45(t,J=4.8Hz,2H),3.63-3.65(t,J=4.8Hz，2H),3.71-3.74(t,J=4.8Hz,2H),3.71-3.79(m,2H)。
向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之2000-mL 3頸圓底燒瓶中放入(3R,4R,5R,6R)-3-胺基-6-(羥基甲基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三醇鹽酸鹽(化合物5，120g，556.50mmol，1.00當量)存於吡啶(1200mL)中之溶液。之後於0℃下在攪拌下逐滴添加乙酸酐(341.6g，3.35mol，6.00當量)。將所得溶液於25℃下攪拌過夜。隨後藉由添加8000mL水/冰驟冷反應。藉由過濾收集固體。此產生白色固體狀(3R,4R,5R,6R)-三乙酸3-乙醯胺基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-2,4,5-三基酯(化合物6)。
向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之2000-mL圓底燒瓶中放入(3R,4R,5R,6R)-三乙酸3-乙醯胺基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-
2,4,5-三基酯(化合物6，30g，77.05mmol，1.00當量)存於二氯甲烷(1500mL)中之溶液，隨後添加氯化鐵(III)(30g，184.95mmol，2.40當量)。將所得混合物於25℃下攪拌2h。隨後藉由添加1000mL水/冰驟冷反應。將有機層用1×1000mL碳酸氫鈉水溶液及1×1000mL水洗滌，經無水硫酸鈉乾燥並在真空下濃縮。此產生黃色油狀(3aR,5R,6R,7R,7aR)-二乙酸5-(乙醯氧基甲基)-2-甲基-5,6,7,7a-四氫-3aH-吡喃并[3,2-d]噁唑-6,7-二基酯(化合物7)。
1HNMR(CDCl3,300MHz，ppm)：2.03(s,9H),2.12(s,3H),3.97-4.27(m,4H),4.90-4.93(m,J=3.3Hz,1H),5.45-5.47(t,J=3.0Hz,1H),5.98-6.00(d,J=6.6Hz,1H)。
向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之500-mL圓底燒瓶中放入(3aR,5R,6R,7R,7aR)-二乙酸5-(乙醯氧基甲基)-2-甲基-5,6,7,7a-四氫-3aH-吡喃并[3,2-d]噁唑-6,7-二基酯(化合物7，40g，121.47mmol，1.00當量)存於1,2-二氯乙烷(200mL)、2-(2-疊氮基乙氧基)乙-1-醇(化合物4，23.89g，182.18mmol，1.50當量)中之溶液。向上述中添加若干4A沸石。將所得混合物於25℃下攪拌1h。隨後添加三氟甲烷磺酸三甲基矽基酯(10.8mL，0.50當量)。於25℃下攪拌過夜後，將反應混合物用500mL二氯甲烷稀釋並用1×500mL水、1×500mL碳酸氫鈉水溶液及1×500mL水洗滌。經無水硫酸鈉乾燥有機層並在真空下濃縮。將殘餘物施加至矽膠管柱上並用二氯甲烷/甲醇(100：1)洗脫。此產生無色油狀(2R,3R,4R,5R,6R)-二乙酸5-乙醯胺基-2-(乙醯氧基甲基)-6-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]四氫-2H-吡喃-3,4-二基酯(化合物8)。
MS(m/z)：461.1,[M+H]+
1HNMR(CDCl3,500MHz，ppm)5.78(d,J=8.90Hz,1H),5.36
(d,J=2.9Hz,1H),5.22(dd,J=11.2,3.6Hz,1H),4.77(d,J=8.3Hz,1H),4.19-4.12(m,2H),4.11-4.05(m,1H),3.98-3.92(m,2H),3.82-3.78(m,1H),3.71-3.63(m,4H),3.49-3.38(m,2H),2.16(s,3H),2.05(S,3H),2.01(s,3H),1.97(s,3H)。
向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之250-mL圓底燒瓶中以各別次序裝入(2S)-2,6-雙[雙(丙-2-炔-1-基)胺基]己酸(化合物1，1.0g，1.0當量)、(2R,3R,4R,5R,6R)-二乙酸5-乙醯胺基-2-(乙醯氧基甲基)-6-[2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基]四氫-2H-吡喃-3,4-二基酯(化合物8，9.26g，6.0當量)、50mL無水THF、CuBr．SMe2(0.138g，0.20當量)及無水DBU(1.5ml，3.0當量)。將所得溶液於室溫下攪拌16h，用乙酸(0.75mL，4.0當量)驟冷，用MP-TMT樹脂(型號：801472，來自Biotage)(9g)處理，於室溫下老化16h，過濾並將濾液濃縮成發泡固體。隨後將固體溶解於CH2Cl2(140mL)中，且用AcOH/NaCl溶液(140mL)洗滌。利用1mL AcOH及100mL 20% NaCl溶液製備AcOH/NaCl溶液。濃縮底部有機層，並在SiO2管柱(220g)上用CH2Cl2/MeOH洗脫來純化。此產生白色固體狀(S)-2,6-雙(雙((1-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)-1H-l,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)己酸(化合物9)。
MS(m/z)：2139.5,[M+H]+
向吹入並維持有氮氣之惰性氣氛之250-mL圓底燒瓶中以各別次序裝入(S)-2,6-雙(雙((1-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)己酸(化合物9，6.9g，1.0當量)、Na2CO3(6.83g，20當量)、水(56mL)及MeOH(32mL)。將反應物於室溫下老化16h，濃縮成殘餘物，重新溶解於水(50mL)中，並在Combiflash C18金反相管柱(415g)上用水/MeCN洗脫來純化。在真空下濃縮後，將產物溶解於最少量之水中，並凍乾以獲得白色固體狀(S)-2,6-雙(雙((1-(2-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-乙醯胺基-4,5-二羥基-6-(羥基甲基)四氫-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)己酸(化合物10)。
MS(m/z)：1657[M+Na]+
1HNMR(D2O,500MHz，ppm)：8.05(s,2H),7.91(s,2H),4.62(t,J=5.0Hz,4H),4.57(t,J=5.0Hz,4H),4.45-4.41(d,J=8.6Hz,4H),3.99-3.82(m,28H),3.80-3.61(m,28H),3.14(t,J=7.1Hz,1H),2.52(broad s,2H),1.99(s,6H),1.98(s,6H),1.73(m,2H),1.60(m,2H),1.29(m,2H)。
使用以下反應圖2製備四GalNAc化合物17a、17b及17c。
反應圖2
向5-氯-1-戊醇(3.0g,24.47mmol)化合物11存於DMF(20mL)中之溶液中添加疊氮化鈉(1.909g,29.4mmol)化合物12。於60℃下攪拌過夜後，在真空中濃縮反應混合物。藉由矽膠層析(EtOAc/己烷1：3)純化殘餘物，從而得到澄清液體狀產物化合物13。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ 3.62(m,2H),3.25(t,J=6.9Hz,2H),1.63-1.53(m,4H),
1.45-1.40(m,2H)。
將化合物13(0.796g,6.16mmol)及D-半乳糖胺五乙酸酯(2.00g,5.14mmol)化合物14懸浮於20mL DCM中，之後添加三氟甲烷磺酸(0.154g,1.027mmol)。使所得混合物回流過夜。LC-MS指示SM完全轉化，將反應混合物用EtOAc稀釋並用碳酸氫鈉洗滌並經硫酸鈉乾燥。移除溶劑並藉由ISCO DCM/MeOH經30min自100/0至90/10純化殘餘物，從而獲得白色固體狀化合物15。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ：1.97(6H,s),2.02(6H,s),2.06(6H,s),2.15(6H,s),3.28(6H,t,J=6.89Hz),3.50(3H,dt,J=9.63,6.66Hz),3.68(1H,q,J=5.98Hz),3.94-3.92(7H,m),4.16-4.15(5H,m),4.73(2H,d,J=8.34Hz),5.31(2H,dd,J=11.16,3.48Hz),5.40-5.38(5H,m)。計算質量：[M+H]+：C19H31N4O9,459.2；觀察值：459.4。
將Lys-炔烴化合物1(130mg,0.436mmol)及GalNAc疊氮化物6(999mg,2.178mmol)溶解於THF(5mL，脫氣)中。向反應混合物中一次性添加溴化銅(I)-二甲硫醚複合物(17.91mg,0.087mmol)並將THF溶液於40℃下攪拌過夜。反應物顏色變為藍色/綠色，指示出現Cu2+，向反應混合物中添加存於0.2mL水中之37mg新鮮抗壞血酸鈉並使其反應過夜。濃縮反應物並藉由RP HPLC 5-60 MeCN(0.5% TFA)/水(0.5% TFA)經20min純化。合併並凍乾所收集部分，從而獲得白色固體狀化合物8。計算質量：[M+3H]3+：C94H145N18O38,2134.0,m/z=711.3；觀察值：711.9。
於0℃下向存於5mL DCM/MeOH=1/1中之經保護四GalNAc化合物8(300mg,0.141mmol)中添加甲醇鈉(91mg,1.688mmol)。將反應
物攪拌1h並藉由添加2mL水驟冷。移除揮發性溶劑，並藉由P4生物凝膠利用水純化反應混合物，且合併且凍乾所收集部分，從而獲得白色固體狀化合物9。計算質量：[M+3H]3+：C70H121N18O26,1629.9,m/z=543.3；觀察值：543.8；[M+2H]2+：C70H120N18O26,1628.9,m/z=814.5；觀察值：814.9。
以類似於用於化合物17a之方式之方式使用適當疊氮化物來源完成具有以下結構之化合物17b及17c之合成。
以下反應圖3顯示可用於製備四GalNAc-siRNA結合物之通用反應圖。
使用通用反應圖3可獲得結合物10-1、10-2、10-3、10a-1、17a-1、17b-1、17c-1。可在預形成siRNA雙螺旋或上或在單股上實施偶合程序，之後退火。或者，可利用 Bioconjug Chem. 2011,22，第1723-8頁中所概述之方案。
向四GalNAc乙酸酯(化合物9，58.7mg，0.027mmol)存於乙腈(1.5ml)中之溶液中添加DIPEA(2.2mg,0.055mmol)及HATU(10.44mg,0.027mmol)。將混合物於室溫下攪拌30min，經20min經由注射器幫浦轉移至siRNA(51)(0.014mmol)存於水(1.5ml)及乙腈(1.5ml)中之溶液中，並攪拌30min，之後在真空下將其濃縮至1.5mL。隨後添加碳酸鈉(218mg,2.059mmol)，之後添加MeOH(0.50ml)。將所得溶液於室溫下攪拌16h，濃縮，經由透析純化，並凍乾，從而產生四GalNAc-siRNA結合物10-1。
向四GalNAc酸化合物10(41.2mg,0.025mmol)存於DMSO(200μL)中之溶液中添加HATU(9.6mg,0.025mmol)及DIPEA(17.6μL,0.126mmol)。將混合物於室溫下攪拌15min，轉移至二胺基-siRNA(18.8mg,2.52μmol)存於水(40μL)及DMSO(360μL)中之溶液中並攪拌30min。將混合物用水(1.5mL)稀釋並在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用0-30% CH3CN/水(含有100mM TEAA)之梯度純化。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生化合物18。
使用以下反應圖4製備四GalNAc-siRNA結合物19-1。
嚮導向siRNA(9.3mg,1.35μmol)溶解於水(100μL)中之溶液中添加3'5'雙四GalNAc-siRNA結合物18(13.7mg,1.29μmol)存於水(200μL)中之溶液並於90℃下加熱1分鐘。冷卻並凍乾所得溶液，從而產生雙螺旋19-1。
使用以下反應圖5製備四GalNAc化合物24。
於0℃下向N-BOC-1,3-二胺基丙烷(化合物20，115mg，0.660mmol)存於1：1 CH2Cl2/CH3CN(1mL)中之溶液中添加3-馬來醯亞胺丙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(化合物21，185mg，0.695mmol)溶解於乙腈(4mL)及CH2Cl2(1mL)中之溶液。將混合物攪拌1h並在真空下濃縮。藉由矽膠層析(0-5% MeOH/CH2Cl2)純化殘餘物，從而得到產物化合物22。計算質量：[M+H]+：C15H24N3O5,326.2；觀察值：326.3。
向馬來醯亞胺化合物22(56mg,0.172mmol)存於CH2Cl2(1ml)中之溶液中添加4M HCl(1ml,4.00mmol)存於二噁烷中之溶液。將混合物攪拌1h並在真空下濃縮。將殘餘物與CH2Cl2(2×)共沸並在真空下乾燥，從而得到產物化合物23。計算質量：[M+H]+：C10H16N3O3,226.1；觀察值：226.3。
向四GalNAc酸化合物10(100mg,0.061mmol)存於DMF(500μL)中之溶液中添加HATU(34.9mg,0.092mmol)、Et3N(42.6μL,0.306mmol)及N-(3-胺基丙基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺鹽酸鹽(16.0mg,0.061mmol)。將混合物於室溫下攪拌1.5h，用TFA酸化並藉由反相0-50% CH3CN/水(含有0.1% TFA)純化。凍乾各部分，從而產生化合物24。計算質量：[M+2H]2+：C76H125N21O32,1843.8,m/z=921.9；觀察值：922.7。
使用以下反應圖6製備化合物26。
反應圖6
向2'-3,17炔丙基siRNA(RNA 25,33mg,4.49μmol)及PEG9 SPDP疊氮化物(26mg，36μmol，自市售PEG-疊氮化物及吡啶基二硫化物試劑製備)存於3：1 DMA/水(1mL)中之脫氣溶液中添加溴化銅(I)-二甲硫醚複合物之脫氣溶液(1.8mg,9.0μmol)。將混合物於室溫下攪拌72h，用水(2mL)稀釋，使用0.45μM注射式過濾器過濾並藉由透析濃縮。在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用0-50% CH3CN/水(含有100mM TEAA)之梯度純化濃縮混合物。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生化合物26。
使用以下反應圖7製備化合物27及28。
反應圖7
向2'-3,17click PEG9 SPDP結合物26(13.2mg,1.50μmol)存於水(1mL)中之溶液中添加TCEP鹽酸鹽(9.15mg,32.2μmol)溶解於水(0.5mL)中之溶液。將混合物於RT下攪拌30min，隨後在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用5-40% CH3CN/水(含有100mM TEAA)之梯度純化。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生化合物27。
向2'-3,17-click PEG9SH 27(3mg,0.35μmol)存於pH 6.0乙酸鹽緩衝液(100μL)中之溶液中添加四GalNAc馬來醯亞胺(5.1mg,2.77μmol)溶解於pH 6.0乙酸鹽緩衝液(100μL)中之溶液。將混合物於室溫
下攪拌30min，隨後在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用5-40% CH3CN/水(含有100mM TEAA)之梯度純化。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生化合物28。
對於結合物19詳述之程序用於雙螺旋28以製造結合物29。
使用以下反應圖8製備化合物31。
向四GalNAc酸化合物10(54mg,0.033mmol)存於N,N-二甲基乙醯胺(500μl)中之溶液中添加胱胺二鹽酸鹽30(14.9mg,0.066mmol)、EDC(12.7mg,0.066mmol)、HOAT(10.2mg,0.066mmol)及DIPEA(57.7μl,0.330mmol)。將混合物於室溫下攪拌18h，隨後添加DTT(50.9mg,0.330mmol)存於N,N-二甲基乙醯胺(100μl)中之溶液。將混合物於室溫下攪拌0.5h，用TFA酸化並藉由反相0-30% CH3CN/水(含有0.1% TFA)純化。凍乾各部分，從而產生化合物31。計算質量：[M+2H]2+：C68H115N19O29S,1695.8,m/z=847.9；觀察值：848.0。
使用以下反應圖9製備結合物35-37。
向2'-click 15 GS化合物32(130mg,0.019mmol)及(2-疊氮基乙基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯(29.1mg,0.095mmol)存於3：1 DMA/水(2mL)中之脫氣溶液中添加溴化銅(I)-二甲硫醚複合物(9.72mg,0.042mmol)溶解於脫氣DMSO(0.32mL)中之溶液。將混合物於45℃下攪拌2h，冷卻至室溫，並添加pH 8 EDTA(0.5M,2mL)以驟冷反應。攪拌15min並在XBridge製備型苯基管柱(5μM，30×150mm)上使用0-
45% CH3CN/水(含有100mM TEAA)之梯度純化。經由透析濃縮各部分。向存於水(3mL)中之合併物質中添加六氫吡啶之溶液(936μL,1.891mmol)。將混合物於4℃下儲存18h，用水(10mL)稀釋並經由注射式過濾器過濾固體。添加pH 8 EDTA(0.5M,2mL)，經由透析濃縮並凍乾，從而產生化合物33。
向2'-15 click C2 NH2 GS化合物33(43.6mg,6.26μmol)存於200mM NaHCO3溶液(2000μl)及甲醯胺(1000μL)中之溶液中添加N-琥珀醯亞胺基-3-[2-吡啶基二硫基]丙酸酯(17.9mg,0.057mmol)溶解於DMSO(298μL)中之溶液。將混合物於10℃下攪拌15min，用水(10mL)及甲醯胺(1mL)稀釋，並藉由透析濃縮。添加2M TEAA(200μL)並在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用5-40% CH3CN/水(含有100mM TEAA)之梯度純化。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生化合物34。
向2'-15 click C2 NH2 NHS SPDP GS化合物34(13mg,1.82μmol)存於1：1甲醯胺/水(200μl)中之溶液中添加四GalNAc SH(4.62mg,2.72μmol)存於甲醯胺(200μL)中之溶液。將混合物於室溫下攪拌3.5h，添加2M TEAA(50μL)且在XBridge製備型苯基管柱(5μM，19×250mm)上使用2-35% CH3CN/水(含有100mM TEAA)之梯度純化。經由透析濃縮各部分並凍乾。在Proteomix SAX-NP10管柱(22.1×50mm)上使用2-30%(溶劑A：60：40 TFE/水與40mM Et3N，溶劑B：60：40 TFE/水與40mM Et3N，1M胍HCl)純化所得固體。經由透析濃縮各部分並凍乾，從而產生結合物35。
對於結合物19-1詳述之程序用於雙螺旋結合物35及適當過客股以
分別製備結合物36及37。
使用以下反應圖10及11製備結合物38-44。
反應圖11
反應圖11.來自表2之用於將四GalNAc結合至siRNA之不同連接體之實例。
向FMOC-PRO-OH(11.11mg,0.033μmol)存於120μL DMSO中之溶液中添加DIPEA(43.2μl,0.247μmol)，之後添加HATU(10.96mg,0.029μmol)。將淺黃色混合物於室溫下攪拌30min。隨後將混合物添加至寡核苷酸過客股TEAA鹽(60mg,8.24μmol)存於500μL(10% H2O/DMSO)中之溶液中，且將混合物於室溫下繼續攪拌1小時。反應混合物經由LC-MS顯示期望產物。向反應混合物中添加二乙胺(43.0μl,0.412μmol)且將混合物攪拌1小時，經由LC-MS確認期望產物。藉由離心透析使用3kDa截止膜純化反應混合物。該製程用水(每次14mL)重複三次。將所得溶液濃縮，冷凍並凍乾過夜，從而產生白色鬆散固體狀產物。LC/MS確認產物[7384.9]
向四GalNAc化合物10(53.2mg,0.033μmol)存於532μL DMSO中之溶液中添加DIPEA(42.6μl,0.244μmol)，之後添加HATU(12.36mg,0.033μmol)。將淺黃色混合物於RT下攪拌30min。隨後將混合物添加至連接體-寡核苷酸過客股存於500μL DMSO中之溶液中，且將混合物於室溫下繼續攪拌2小時。LC/MS顯示期望產物。使反應混合
物經受使用3kDa截止膜之離心透析。該製程用水(每次14mL)重複三次。藉由Gilson PLC 2020使用XBRIDGE PHENYL、10-27% CH3CN與200μM TEAA將所得溶液純化35分鐘。經由使用3kDa截止膜之離心透析濃縮收集溶液。將所得濃縮溶液用1.0N NaCl處理並離心透析。該製程用水(每次14mL)重複五次。將所得濃縮溶液(約1.5mL)冷凍並凍乾過夜，從而產生白色鬆散固體狀產物。LC/MS確認產物[9002.5]。
使存於1.5mL水中之四GalNAc-連接體-RNA(18.5mg,2.055μmol)與存於1.5mL水中之ApoB導向股(14.12mg,2.055μmol)形成雙螺旋。將混合物於存在攪拌棒下於90℃下加熱5min。冷卻雙螺旋並移除攪拌棒。經2天凍乾溶液，從而產生白色鬆散固體狀期望雙螺旋結合物38。LC/MS確認產物[16048]。
所有剩餘結合物皆係使用相同通用程序製備。
使用以下反應圖12製備化合物及/或結合物46-48。
反應圖12
將SPDP酸(2.2mg,10.3μmol)溶解於DMSO 100μL中，且依序添
加N,N-二異丙基乙胺(14.0μl,0.08mmol)、HATU(19.6mg,0.051mmol)。添加存於200μL DMSO：水(9：1)中之RNA(15mg,2.06μmol)且將所得反應混合物攪拌1h，藉由添加3mL水驟冷反應且透析至500μL，藉由甲醯胺稀釋至3mL且藉由SAX(緩衝液A：60%存於水中之TFE，20mM TEA，緩衝液B：60%存於水中之TFE，20mM TEA，1M CsCl，梯度A/B自100/0至35/65，經15min)純化。合併所收集部分並針對水透析並凍乾，從而獲得白色固體狀化合物46。計算質量：[M-H]-：C234H300F8N72O150P23S3,7480.1；觀察值：7483.0。
將RNA化合物46(22mg,2.9μmol)及四GalNAc硫醇化合物31(10.0mg,5.9μmol)溶解於400μL甲醯胺：pH=6.8 Tris緩衝液(3：1)中並攪拌1h。藉由SAX(緩衝液A：60%存於水中之TFE，20mM TEA，緩衝液B：60%存於水中之TFE，20mM TEA，1M CsCl，梯度A/B自100/0至35/65，經15min)純化反應混合物。合併所收集部分並針對水透析並凍乾，從而獲得白色固體狀結合物47。計算質量：[M-H]-：C297H410F8N90O179P23S3,9063.9；觀察值：9066.2。
將結合物47(10.9mg,1.20μmol)及導向股(7.81mg,1.14μmol)在1mL無RNAse之水中混合2h。凍乾反應混合物，從而獲得定量產率之雙螺旋結合物48。
使用以下反應圖13製備化合物及/或結合物49-51。
反應圖13
將33.3mg siRNA過客股稱重至4mL小瓶中，隨後添加1mL 100mM NaHCO3以溶解。添加0.86μL丙酸酐並於RT下攪拌。在老化約2h後，針對水旋轉透析3×。經由玻璃料過濾並經由凍乾乾燥溶液，從而獲得30.8mg RNA化合物49。
步驟1. 向40mL小瓶中裝入2.8mg疊氮化物、25.7mg siRNA、25ml充N2之DMSO及4ml水。充入N2。裝入2.98mL Cu/配體溶液(充入N2，20/100μmol，存於10ml DMSO中)。在充N2下於RT下攪動。
步驟2. 裝入化合物10及1ml DMSO。裝入6μL DIPEA並攪動2
min。裝入6mg HBTU並攪動2min。裝入步驟1之siRNA混合物。反應並不完全，因此裝入一半前述試劑進行重複。蒸發反應混合物，透析並HPLC純化(X-Bridge Phenyl，TEAA/ACN梯度)。蒸發，透析並凍乾，從而獲得結合物50。
將10.65mg GS(結合物50)溶解於1ml水中並將10.20mg PS(結合物49)溶解於1.17ml水中。向所有結合物50中添加8.7mg結合物49以形成1：1雙螺旋。加熱至90℃並保持1min，經15min冷卻至RT。過濾溶液並經由凍乾乾燥，從而獲得白色固體狀結合物51。
產生經螢光素酶載體穩定轉染之HEK293細胞，該載體含有海腎螢光素酶(renilla luciferase)之3'UTR中之siRNA之靶位點。在96孔組織培養板(Corning：編號3903)上以7.5e3個細胞/孔之密度在DMEM 10%血清培養基中接種該等細胞。隨後將細胞板於37℃/5% CO2下培育24hr。在培育後，將板用經轉染試劑Lipofectamine 2000(invitrogen：編號11668-019)共轉染之測試化合物在Opti-MEM(Gibco：編號31985)中根據製造商之方案處理。處理濃度在10nM至0.03pM範圍內。隨後將處理板於37℃/5% CO2下培育24hr。在處理培育後，使細胞裂解並根據Dual-GloTM螢光素酶分析(Promega：E2920)進行處理並在TECAN safire2板讀數器上進行讀數。
在膠原塗佈之板(BioCoat：356649)上以7.5e3個細胞/孔之密度在10% DMEM血清培養基中接種HepG2細胞(ATCC：HB-8065)。隨後將細胞板於37℃/5% CO2下培育24hr。在培育後，將板用經轉染試劑Lipofectamine 2000(invitrogen：編號11668-019)共轉染之測試化合物在Opti-MEM(Gibco：編號31985)中根據invitrogen之方案處理。處理
濃度在10nM至0.03pM範圍內。隨後將處理板於37℃/5% CO2下培育24hr。在處理培育後，根據所供應方案將細胞用PLA緩衝液(AB：4448542)裂解。使用高容量cDNA套組(AB：4368813)將所得細胞裂解物反向轉錄至cDNA並使用Life Technology 7900運行qPCR。
以200μL體積藉由皮下注射投與CD1雌性小鼠。觀察動物之行為或生理變化。在投藥之後72hr藉由CO2窒息殺死動物，之後經由心臟穿刺進行驅血。肝試樣係作為自內葉之3mm穿孔並將其放入RNAlater管中以分離總RNA。藉由Taqman分析使用標準程序實施mRNA敲除分析。
所選化合物/結合物之活體外及活體內數據之概述示於先前提出之表4中。
熟習此項技術者將易於瞭解，本發明極其適合實施該等目標並獲得所涉及及彼等存在於本文中之目的與優勢。目前代表較佳實施例之本文所述之方法及組合物係例示性的且並非意欲限制本發明之範疇。彼等熟習此項技術者將構想出本文之變化及其他用途，其涵蓋於本發明之精神中且藉由申請專利範圍之範疇界定。
<110> 美商默沙東藥廠
大衛 泰勒
史蒂芬 L 克萊提
瓦丁 杜德金
諾里諾 伊凱模托
宏表 廖
克雷格 派利斯
濤 裴
安東尼 邵
鄺 楚昂
利軍 王
宇 袁
曼 朱
<120> 包含四GALNAC之新穎結合物及傳送寡核苷酸之方法
<130> 23227
<140> 102115516
<141> 2013-04-30
<150> 61/641,761
<151> 2012-05-02
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
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<223> 合成
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<223> 未經修飾或經如描述於此序列修飾之核糖核苷酸
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<223> 胺基己基磷酸鹽反向無鹼基蓋
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<223> 2'-O-甲基
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<223> 硫代磷酸酯核苷酸間連接
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<223> 硫代磷酸酯核苷酸間連接
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<223> 硫代磷酸酯核苷酸間連接
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<223> 硫代磷酸酯核苷酸間連接
<220>
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<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸酯核苷酸間連接
<400> 16
Claims (22)
- 一種模組化組合物，其包含：1)單股或雙股寡核苷酸；2)一或多個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同：
- 如請求項1之模組化組合物，其包含：1)單股或雙股寡核苷酸；2)1至8個式(II)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CH2-或-NH-；且n係1、2、3或4；3)1至16個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1至8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
- 一種模組化組合物，其包含：1)單股或雙股siRNA；2)1至8個式(I)、(II)或(III)之四GalNAc配體，其可相同或不同，其中X係-O-、-S-、-CR1R2-或-NR1-，其中R1及R2各獨立地選自由氫及C1-C6烷基組成之群；且n係1、2、3或4；3)1至16個連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1至8個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑。
- 如請求項3之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體在該siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在該siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至該siRNA；且其中該等四GalNAc配體視情況經由連接體連接至該siRNA。
- 如請求項3或4之模組化組合物，其中式(II)之X係-O-、-S-或-CH2-；且n係1、2或3。
- 如請求項3或4之模組化組合物，其中該組合物包含1至4個四GalNAc配體，其可相同或不同。
- 如請求項3或4之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且 其中該等四GalNAc配體在該siRNA之核糖環之不同2’位置連接至該siRNA之導向股(guide strand)或過客股(passenger strand)。
- 如請求項3或4之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且其中該等四GalNAc配體在該siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至該siRNA之導向股或過客股。
- 如請求項3或4之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且其中該等四GalNAc配體在該siRNA之核糖環之不同2’位置及/或不同末端3'及/或5'位置連接至該siRNA之導向股及過客股二者。
- 如請求項3或4之模組化組合物，其中該組合物包含2至8個式(II)之四GalNAc配體，其可相同或不同；且該等四GalNAc配體連接至該siRNA之同一股。
- 如請求項3或4之模組化組合物，其中該組合物包含2至8個式(II)之四GalNAc配體，其可相同或不同；且該等四GalNAc配體連接至該siRNA之不同股。
- 如請求項3或4之模組化組合物，其中該等四GalNAc配體經由連接體連接至該siRNA之同一或不同股。
- 如請求項12之模組化組合物，其中各連接體獨立地選自表1。
- 如請求項12之模組化組合物，其中各連接體獨立地選自表2。
- 如請求項3或4之模組化組合物，其中該siRNA係雙股；且其中該等視情況之靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑經由連接體連接至該siRNA之同一股或不同股。
- 一種模組化組合物，其包含：1)雙股siRNA；2)1至8個式(IV)、(V)或(VI)之四GalNAc配體：
- 如請求項16之模組化組合物，其包含：1)雙股siRNA；2)1至3個式(V)之四GalNAc配體；3)1至6個獨立地選自表1之連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1至3個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑； 其中該等四GalNAc配體在該siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在該siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至該siRNA；且其中該等四GalNAc配體視情況經由連接體連接至該siRNA。
- 如請求項16或17之模組化組合物，其包含2至3個四GalNAc配體，其中該等四GalNAc配體經由連接體連接至該siRNA之同一股或不同股。
- 如請求項16或17之模組化組合物，其包含：1)雙股siRNA；2)1至2個式(V)之四GalNAc配體；3)1至4個獨立地選自表2之連接體，其可相同或不同；及視情況，4)1至2個靶向配體、增溶劑、藥物動力學增強劑、脂質及/或掩蔽劑；其中該等四GalNAc配體在該siRNA之核糖環之不同2’位置及/或在該siRNA之不同末端3’及/或5’位置連接至該siRNA；且其中該等四GalNAc配體經由連接體連接至該siRNA。
- 如請求項19之模組化組合物，其包含2個四GalNAc配體，其中該等四GalNAc配體經由連接體連接至該siRNA之同一股或不同股。
- 如請求項19之模組化組合物，其包含1個四GalNAc配體，其中該四GalNAc配體經由連接體連接至該siRNA。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至21中任一項之模組化組合物及醫藥上可接受之賦形劑。
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