TW201300411A

TW201300411A - Ｆｇｆｒ１促效劑及其使用方法

Info

Publication number: TW201300411A
Application number: TW101117265A
Authority: TW
Inventors: Junichiro Sonoda; Yan Wu
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2011-05-16
Filing date: 2012-05-15
Publication date: 2013-01-01
Also published as: EA201391540A1; ES2628385T3; WO2012158704A1; AU2012255881C1; MY175338A; KR20140012150A; US9845359B2; HUE033584T2; ZA201307364B; US20200140557A1; EP2710035A1; PT2710035T; BR112013026266A2; CA2834879C; CY1119098T1; EP2710035B1; PL2710035T3; US20180100018A1; DK2710035T3; AU2012255881A1

Abstract

本發明提供FGFR1促效劑，其包括促效性抗FGFR1抗體；及其使用方法。

Description

FGFR1促效劑及其使用方法

本發明係關於FGFR1促效劑及其使用方法。

相關申請案之交互參照

本申請案主張2011年5月16日申請之美國專利申請案61/486,731及2011年9月20日申請之61/536,936之優先權之權益，其每一者之全部內容以引用方式全文併入本文中。

不能控制血糖含量導致各種代謝病狀。糖尿病係由因應葡萄糖之胰島素分泌之缺陷(1型及2型糖尿病)及刺激骨骼肌葡萄糖攝取及限制肝葡萄糖方面之降低之胰島素效力(2型糖尿病)引起之高血糖症候群。糖尿病係非常普遍之疾病，且儘管治療選擇方案對於一些糖尿病患者係可用的，但仍迫切需要額外療法。

纖維母細胞生長因子21(FGF21)係內分泌FGF子族(包括FGF19及FGF23)之成員，且其已識別為逆轉肥胖症及肥胖症誘導之肝脂肪變性(hepatosteatosis)及高血糖症之可能疾病改善藥劑(參見，例如Kharitonenkov及Larsen,Trends Endocrinol.Metab.22(3)：81-6(2011)；Kharitonenkov等人，J.Clin.Invest.115：1627-35(2005)；WO 2010/042747)。內分泌FGF21蛋白質結合至3個FGF受體(FGFR 1-3)，且藉由該等受體與其膜結合共受體β-Klotho一起改良胰島素抗性及緩解2型糖尿病。然而，因其藥物動力學較差及對生物作用機制之瞭解較少，其研發已受阻。亦已提出將抗FGFR1 拮抗劑抗體用於治療糖尿病(WO 2005/037235)。然而，尚未發現該3個FGFR中介導FGF21之有益代謝活性者之身份。

本發明係部分地基於FGFR1之激活改善糖尿病之發現。本發明提供FGFR1促效劑(包括促效劑抗FGFR1抗體)及其使用方法。

在一態樣中，本發明提供治療個體之代謝疾病或病狀之方法，其包含向個體投與有效量之抗纖維母細胞生長因子受體-1(FGFR1)促效劑，其中該代謝疾病係選自由以下組成之群：多囊性卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿性自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)。在一些實施例中，FGFR1促效劑不會激活FGFR2或FGFR3。在一些實施例中，FGFR1促效劑係抗FGFR1抗體。在一些實施例中，抗FGFR1抗體具有2個FGFR1結合位點，例如全長抗體或F(ab')2片段。在一些實施例中，抗體結合至26號肽KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：28)或28號肽FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：29)。在一些實施例中，抗體結合至26號肽及28號肽二者。在一些實施例中，抗FGFR1抗體結合至FGFR1b及FGFR1c二者。在一些實施例中，抗體係雙特異性抗體。在一些實施例中，雙特異性抗體亦結合至β-Klotho。

在另一態樣中，本發明提供結合至FGFR1之經分離抗體，其中該抗體係FGFR1活性之促效劑。在一些實施例中，抗體並非FGFR2或FGFR3之促效劑。在一些實施例中，抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗體係人類、人類化或嵌合抗體。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H3，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：16)、SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)、EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：18)、TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)及GTDVMDY(SEQ ID NO：20)；(b)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQSYTTPPT(SEQ ID NO：23)；及(c)HVR-H2，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG，其中X₁係A或G，X₂係D或E，X₃係D或Y，X₄係N或Y，X₅係A或D，且X₆係D或Y(SEQ ID NO：24)；及X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG，其中X₁係D或E，X₂係D或Y，X₃係N或Y，X₄係A或D，且X₅係D或Y(SEQ ID NO：25)。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列GFTFX₁X₂X₃X₄IX₅，其中X₁係S或T，X₂係N或S，X₃係N或T，X₄係W或Y，X₅係H或S(SEQ ID NO：26)；(b)HVR-H2，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG，其中X₁係A或G，X₂係D或E，X₃係D或Y，X₄係N或Y，X₅係A或D，且X₆係D或Y(SEQ ID NO：24)；及X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG，其中X₁係D或E，X₂係D或Y，X₃係N或Y，X₄係A或D，且X₅係D或Y(SEQ ID NO：25)；及(c)HVR-H3，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：16)、SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)、EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：18)、TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)及GTDVMDY(SEQ ID NO：20)。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列GFTFTSTWIS(SEQ ID NO：7)，(b)HVR-H2，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：GEIDPYDGDTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)及EIDPYDGDTYYADSVKG(SEQ ID NO：11)，及(c)HVR-H3，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：16)及SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列GFTFSNNYIH(SEQ ID NO：8)，(b)HVR-H2，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：ADIYPNDGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：12)及DIYPNDGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：13)，及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：18)。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列GFTFTSNWIS(SEQ ID NO：9)，(b)HVR-H2，其包含選自由組成之群之胺基酸序列：AEIDPYDGATDYADSVKG(SEQ ID NO：14)及EIDPYDGATDYADSVKG(SEQ ID NO：15)，及(c)HVR-H3，其包含選自由組成之群之胺基酸序列：TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)及GTDVMDY(SEQ ID NO：20)。在一些實施例中，抗體進一步包含(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：21)；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：22)；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQSYTTPPT(SEQ ID NO：23)。在一些實施例中，抗體包含選自由SEQ ID NO：2、3及4組成之群之VH序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：6之VL序列。

在一些實施例中，抗FGFR1抗體具有2個FGFR1結合位點，例如全長抗體或F(ab')2片段。在一些實施例中，本發明抗體係多特異性抗體。在一些實施例中，抗體亦結合至β-Klotho。在一些實施例中，抗體係IgG1抗體。在一些實施例中，本發明提供經分離之核酸編碼之本發明抗體。在一些實施例中，本發明提供包含技術方案21之核酸之宿主細胞。在一些實施例中，本發明提供產生抗體之方法，其包含培養技術方案22之宿主細胞以便產生抗體。在一些實施例中，該方法進一步包含自宿主細胞回收抗體。

在一些實施例中，本發明提供包含本發明抗體及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。

在一些實施例中，本發明提供用作醫藥之本發明抗體。在一些實施例中，本發明抗體係用於治療選自由以下組成之群之代謝疾病或病狀：多囊性卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿性自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)。在一些實施例中，本發明抗體係用於使個體對胰島素敏感。

在一些實施例中，本發明提供本發明抗體在製造醫藥中之用途。在一些實施例中，醫藥係用於治療選自由以下組成之群之代謝疾病或病狀：多囊性卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿性自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)。在一些實施例中，醫藥係用於使個體對胰島素敏感。

在一些實施例中，本發明提供治療個體之糖尿病之方法，其包含向個體投與有效量之本發明抗體。在一些實施例中，該方法進一步包含向個體投與用以治療糖尿病之另一藥劑，限制條件係其他藥劑不為胰島素。在一些實施例中，該方法進一步包含向個體投與用以治療心血管疾病之藥劑。

I.定義

出於本文目的，「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列的框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數量為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4 或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列相同。

「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)間之非共價相互作用之總強度。除非另有說明，否則本文所用「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如，抗體及抗原)間之1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(Kd)代表。可藉由業內已知之常用方法來量測親和力，包括彼等本文所述者。用於量測結合親和力之具體闡釋性及實例性實施例係闡述於下文中。

術語「抗FGFR1促效劑抗體」係指如下抗體：其能夠以足夠親和力結合FGFR1以使得該抗體作為治療劑用於激活FGFR1。在一實施例中，抗FGFR1抗體與不相關非FGFR1蛋白之結合程度小於該抗體與FGFR1之結合的約10%，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至FGFR1之抗體具有◆1 μM、◆100 nM、◆10 nM、◆1 nM、◆0.1 nM、◆0.01 nM或◆0.001 nM(例如10^-8 M或更小，例如10^-8 M至10^-13 M，例如10^-9 M至10^-13 M)之解離常數(Kd)。

術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其呈現期望抗原結合活性即可。

「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、雙鏈抗體、直鏈抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及自抗體片段形成之多特異性抗體。

術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之剩餘部分源自不同來源或物種的抗體。

抗體之「類別」係指其重鏈所擁有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5個主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干者可進一步分成亞類(同型)，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。

「效應子功能」係指彼等歸因於抗體之Fc區之生物活性，其隨抗體同型而有所變化。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞激活。

藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指以所需劑量且在所需時間段內有效達成期望治療或預防結果之量。

術語「Fc區」在本文中係用於界定免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分的C端區域。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自 Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非在本文中另外指出，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU指數)，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。

「框架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由4個FR結構域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現在VH(或VL)中之以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，其係指具有實質上類似於天然抗體結構之結構或具有含有本文所定義Fc區之重鏈的抗體。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已向其中引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉形體」及「轉形細胞」，其包括原代轉形細胞及源自其之子代(不考慮傳代次數)。子代與親代細胞之核酸含量可不完全相同，且可含有突變。本文包括經篩選或選擇用於原始轉形細胞中之具有相同功能或生物活性的突變體子代。

「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者：其由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。

「人類共有框架」係表示在選擇人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最普遍存在之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列係自可變結構域序列亞組選擇。通常，序列亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版物91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞組。在一實施例中，對於VL而言，亞組係如Kabat等人所述之亞組◆ I(參見上文)。在一實施例中，對於VH而言，該亞組係如Kabat等人(參見上文)所述之III亞組。

「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之HVR(例如，CDR)對應於非人類之彼等HVR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。「人類化形式」之抗體(例如，非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。

本文所用術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變結構域區域中序列具有高變性及/或形成結構上經界定之環(「高變環」)中的每一者。通常，天然四鏈抗體包含6個 HVR；3個位於VH中(H1、H2、H3)，且3個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自高變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或參與抗原識別。實例性高變環出現在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處。(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)。)實例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在胺基酸殘基L1之24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2之50-65及H3之95-102處。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版。Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)。)除VH中之CDR1外，CDR通常包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其係接觸抗原之殘基。SDR係含於CDR中稱為縮短-CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之區域內。實例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在胺基酸殘基L1之31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58及H3之95-102。(參見Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)。)除非另有說明，否則在本文中根據Kabat等人(參見上文)來編號可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)。

「免疫偶聯物」係偶聯至一或多個異源分子之抗體。

「個體(individual或subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴子)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體係人類。

「經分離」抗體係已自其天然環境之組份分離者。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)方法所測定。關於評估抗體純度之方法之綜述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。

「經分離」核酸係指已自天然環境之組份分離之核酸分子。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置。

「編碼抗FGFR1抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括於單一載體或各別載體中之該(等)核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置之該(等)核酸分子。

本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群獲得之抗體，即，該群包含之個別抗體相同及/或結合相同表位，除了可能之變體抗體，例如含有天然發生之突變或在產生單株抗體製劑期間產生，該等變體通常以小量存在。與通常包括針對不同決定基(表位)之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定基。因此，修飾語「單株」指示自實質上同源抗體群獲得之抗體之特徵，且不應理解為需要藉由任一特定方法產生該抗體。例如，欲用於本發明之單株抗體可藉由各種技術製得，包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體呈現法，及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，該等方法及製備單株抗體之其他實例性方法述於本文中。

「天然抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體係約150,000道耳頓(dalton)之異源四聚體糖蛋白，其由雙硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈組成。自N端至C端，每一重鏈具有可變區(VH)(亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)，接著係三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，每一輕鏈具有可變區(VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)，接著係恆定輕鏈(CL)結構域。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將抗體之輕鏈分為兩種類型中之一者，稱為稱為◆型及λ型。

術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有有關適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於治療產品之使用之警告的資訊。

關於參考多肽序列，「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列並引入間隔(gap)(若需要)以達到最大序列一致性百分比後候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於比對序列之合適參數，包括在所正比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。然而，出於本文目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech有限公司設計，且原始碼已與使用者文件一起歸檔於美國版權局(U.S.Copyright Office)Washington D.C.,20559中，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech有限公司，South San Francisco,California公開獲得，或可自原始碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)中。所有序列比較參數係藉由ALIGN-2程式設定且不改變。

在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形中，給定胺基酸序列A相對於(to)給定胺基酸序列B、與(with)其或對(against)其之胺基酸序列一致性%(或者可表達為相對於給定胺基酸序列B、與其或對其具有或包含一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)係如下來計算：100×分數X/Y 其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%的值皆係如前面緊接段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。

術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其係呈使得其中所含活性成份之生物活性有效之形式，且不含對投與調配物之個體具有不可接受之毒性的額外組份。

「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份外對個體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

除非另有說明，否則本文所用術語「纖維母細胞生長因子受體1或FGFR1」係指來自任一脊椎動物來源之任一天然FGFR1，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。該術語涵蓋細胞中「全長」未加工FGFR1以及自加工所產生之任一形式的FGFR1。該術語亦涵蓋FGFR1之天然存在之變體，例如，剪接變體或對偶基因變體。實例性人類FGFR1b及FGFR2b之胺基酸序列分別顯示於下文中：NTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPA NKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKHSGINSSDAEVLTLFNVTEAQSGEYVCKVSNYIGEANQSAWLTVTRPVAKALEERPAVMTS(SEQ ID NO：1)；及NTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTS(SEQ ID NO：5)。

本文所用「治療(treatment)」(及其語法變化形式，例如「treat」或「treating」)係指試圖改變正治療個體之自然病程的臨床干預，且可出於預防性目的或在臨床病理學過程期間實施。治療之期望效應包括(但不限於)防止疾病發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理學後果、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。

術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與使抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有類似結構，其中每一結構域皆包含4個保守框架區(FR)及三個高變區(HVR)。(例如，參見，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。)單一VH或 VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域分別篩選互補VL或VH結構域之文庫來分離。例如，參見，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。

本文所用術語「載體」係指能夠傳送與其連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括呈自複製核酸結構之載體，以及納入引入其之宿主細胞基因組中之載體。某些載體能夠引導與其可操作連接之核酸的表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。

II.組合物及方法

在一態樣中，本發明係部分地基於抗FGFR1促效性抗體及該等抗體之治療活性之發現。例如，本發明抗體係用於治療包括糖尿病之代謝疾病。

A.實例性抗FGFR1抗體

在一態樣中，本發明提供結合至FGFR1之經分離抗體。在某些實施例中，抗FGFR1抗體結合至FGFR1b及/或FGFR1c且促效FGFR1活性。

在一態樣中，本發明提供抗FGFR1抗體，其包含選自以下之至少1個、2個、3個、4個、5個或6個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：26；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：25；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：21；(e) HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：22；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：23。

在一些實施例中，抗FGFR1抗體可係完全人類、人類化或非人類抗體。在一實施例中，抗FGFR1抗體包含上文實施例中任一實施例中之HVR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。

在另一態樣中，抗FGFR1抗體包含如下重鏈可變結構域(VH)序列：其相對於如下胺基酸序列SEQ ID NO：2、3或4具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSTWISWVPGKGLEWVGEIDPYDGDTYYADSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCASSGYGGSDYAMDYWGQ(SEQ ID NO：2)、EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNNYIHWVPGKGLEWVADIYPNDGDTDYADSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCAREHFDAWVHYYVMDYWGQ(SEQ ID NO：3)及EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNWISWVPGKGLEWVAEIDPYDGATDYADSVKGRFTISADTSKNLQMNSLRAEDTAVYYCATGTDVMDYWGQ(SEQ ID NO：4)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗FGFR1抗體保持結合FGFR1及促效其活性之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO 2、3或4中，總共有1個至10 個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(即，在FR中)。視情況，抗FGFR1抗體包含SEQ ID NO：2、3或4中之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，提供抗FGFR1抗體，其中該抗體包含如下輕鏈可變結構域(VL)：其相對於如下胺基酸序列SEQ ID NO：6具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：6)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗FGFR1抗體保持結合FGFR1之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO6中，總共有1個至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(即，在FR中)。視情況，抗FGFR1抗體包含SEQ ID NO：6中之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，提供抗FGFR1抗體，其中該抗體包括上文所提供實施例中任一實施例中之VH及上文所提供實施例中任一實施例中之VL。在一實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：2、3或4及SEQ ID NO：6(分別)中之VH及VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。

在本發明之又一態樣中，上文實施例中任一實施例之抗FGFR1抗體係單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在一實施例中，抗FGFR1抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙鏈抗體或F(ab')₂片段。在另一實施例中，該抗體係全長抗體，例如完整IgG1抗體或本文所定義之其他抗體類別或同型。

在又一態樣中，上文實施例中任一實施例之抗FGFR1抗體可單獨或組合納入下文中在部分1-7中所述特徵中之任一特徵：

1.抗體親和力

在某些實施例中，本文所提供抗體具有◆1 μM、◆100 nM、◆10 nM、◆1 nM、◆0.1 nM、◆0.01 nM或◆0.001 nM(例如10^-8 M或更小，例如10^-8 M至10^-13 M，例如10^-9 M至10^-13 M)之解離常數(Kd)。

在一實施例中，Kd係藉由利用所關注抗體之Fab形式及其抗原實施之放射性標記抗原結合分析(RIA)來量測，如藉由以下分析來闡述。Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由以下來量測：在滴定系列之未標記抗原之存在下，利用最低濃度之(¹²⁵I)標記抗原平衡Fab，然後利用抗Fab抗體塗佈板捕獲所結合抗原(例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立該分析之條件，將MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)利用5 μg/ml存於50 mM碳酸鈉(pH 9.6)中之捕獲用抗Fab抗體(Cappel Labs)塗佈過夜，且隨後在室溫下(大約23℃)利用存於PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2小時至5小時。在非吸收性板(Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM[¹²⁵I]抗原與系列稀釋之所關注Fab混合(例如，與Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中對抗VEGF抗體(Fab-12)之評估一致)。然後將所關注Fab培育過夜；然而，培育可持續較長時期(例如，約65小時)，以確保達到平衡。其後，將混合物轉移至捕獲板以在室溫下培育(例如，持續1小時)。然後移除該溶液，並用存於PBS中之0.1%聚山梨醇脂20(TWEEN-20®)將該板洗滌八次。當已乾燥板時，添加150 μl/孔之閃爍體(MICROSCINT-20^TM；Packard)，且在TOPCOUNT^TM γ計數器(Packard)上將板計數10分鐘。產生小於或等於20%之最大結合之每一Fab之濃度經選擇用於競爭性結合分析。

根據另一實施例，Kd係使用表面電漿子共振分析來量測，該分析係在25℃下使用BIACORE^®-2000或BIACORE^®-3000(BIAcore有限公司，Piscataway，NJ)利用約10個反應單元(RU)之固定化抗原CM5晶片進行。簡言之，根據供應商說明書，利用N-乙基-N'-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE有限公司)。用10 mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5 μg/ml(約0.2 μM)，然後以5 μl/分鐘之流速注射，以達成大約10個反應單元(RU)之偶合蛋白。在注射抗原之後，注射1 M乙醇胺以阻斷未反應基團。對於動力學量測，在25℃下以大約25 μl/min之流速將兩倍系列稀釋之Fab(0.78 nM至500 nM)與0.05%聚山梨醇脂20(TWEEN-20^TM)表面活性劑(PBST)一起注射於PBS中。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIACORE^®評價軟體3.2版本)藉由同時擬合締合感測圖及解離感測圖來計算締合速率(k_on)及解離速率(k_off)。以比率k_off/k_on之形式來計算平衡解離常數(K_d)。例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若經上文表面電漿子共振分析締合速率(on-rate)超過10⁶ M^-1 s^-1，則締合速率可藉由使用螢光淬滅技術來測定，該技術係在25℃下在遞增濃度之抗原存在下量測存於PBS(pH 7.2)中之20 nM抗抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度(激發=295 nm；發射=340 nm，16 nm帶通)之增強或降低，如在光譜儀中所量測，例如配備有停流之分光光度計(Aviv Instruments)或帶有攪拌比色管之8000系列SLM-AMINCO^TM分光光度計(ThermoSpectronic)。

2.抗體片段

在某些實施例中，本文所提供抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，例如，參見Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第 5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')₂片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。

雙鏈抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。例如，參見EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三鏈抗體及四鏈抗體亦闡述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。

單一結構域抗體係包含抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis有限公司，Waltham,MA；例如，參見美國專利第6,248,516 B1號)。

抗體片段可藉由各種技術來製備，包括(但不限於)蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)產生，如本文所述。

3.嵌合及人類化抗體

在某些實施例中，本文所提供抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體係闡述於(例如)美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))中。在一實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴子)之可變區)及人類恆定區。在又一實例中，嵌合抗體係類別或亞類已自親代抗體發生變化之「類別轉換」抗體。嵌合抗體包括其抗原結合片段。

在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以減小對人類之免疫原性，同時保持親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)源自非人類抗體，且FR(或其部分)源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。

人類化抗體及製備其之方法係綜述於(例如)Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且係進一步闡述於(例如)Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(闡述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(闡述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(闡述「導向選擇」方法至FR改組)中。

可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；源自具有輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列的框架區(例如，參見Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.，151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)框架區或人類種系框架區(例如，參見Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及源自篩選用FR文庫之框架區(例如，參見Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。

4.人類抗體

在某些實施例中，本文所提供抗體係人類抗體。可使用業內已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體係概述於van Dijk及van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg，Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。

可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改良以產生完整人類抗體或具有因應抗原性激發之人類可變區之完整抗體。該等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座可替代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在該等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常未激活。關於用於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg，Nat.Biotech.23：1117-1125 (2005)。例如，亦參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSE^TM技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VELOCIMOUSE®技術。可藉由(例如)與不同人類恆定區組合來進一步修飾來自由該等動物所產生之完整抗體的人類可變區域。

人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製得。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(例如，參見Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker有限公司，New York，1987)；及Boerner等人，J.Immunol.，147：86(1991)。)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)中。額外方法包括彼等闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述自融合瘤細胞系產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(闡述人類-人類融合瘤)中者。人類融合瘤技術(三體融合瘤(Trioma)技術)亦闡述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。

亦可藉由分離選自源自人類之噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域序列來產生人類抗體。然後，可將該等可變結構域序列與期望人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術係闡述於下文中。

5.源自文庫之抗體

可藉由自組合文庫篩選具有一或多種期望活性之抗體來分離本發明抗體。例如，業內已知用於產生噬菌體展示文庫及自該等文庫篩選具有期望結合特性之抗體的各種方法。該等方法係綜述於Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)中，且係進一步闡述於(例如)以下文獻中：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。

在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)來單獨選殖VH及VL基因譜且將其隨機重組於噬菌體文庫中，然後可篩選抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常展示抗體片段，該等抗體片段呈單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段。來自免疫化來源之文庫向免疫原提供高親和力抗體而無需構築融合瘤。另一選擇為，可選殖天然譜(例如，自人類)以向廣泛範圍之無任何免疫之非自體抗原以及自體抗原提供單一來源之抗體，如由Griffiths等人，EMBO J、12：725-734(1993)所述。最後，亦可藉由以下方式以合成方式製得天然文庫：選殖來自幹細胞之未重排V-基因片段，且使用含有隨機序列之PCR引物編碼高度可變CDR3區域並在活體外實現重排，如由Hoogenboom及Winter，J.Mol.Biol.，227：381-388(1992)所述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。

自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段係視為本文中之人類抗體或人類抗體片段。

6.多特異性抗體

在某些實施例中，本文所提供之抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係針對FGFR1且另一者係針對任一其他抗原，例如β-Klotho。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至FGFR1之兩種不同表位。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製得。

製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「隆凸於孔洞中(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體：改造用於製備抗體Fc-異源二聚體分子之靜電牽引效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(例如，參見美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science 229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(例如，參見Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙鏈抗體」技術(例如，參見Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如(例如)Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述。

本文亦包括經改造以具有三個或更多個功能抗原結合位點之抗體(包括「章魚抗體」)(例如，參見US 2006/0025576A1)。

本文之抗體或片段亦包括包含結合至FGFR1以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙重作用之FAb」或「DAF」(例如，參見US 2008/0069820)。

7.抗體變體

在某些實施例中，涵蓋本文所提供抗體之胺基酸序列變體。例如，可期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物性質。抗體之胺基酸序列變體係藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適宜修飾或藉由肽合成來製備。該等修飾包括(例如)抗體之胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以達成最終構築體，限制條件係最終構築體具有期望特性，例如抗原結合。

a)取代、插入及缺失變體

在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代誘變之所關注位點包括HVR及FR。保守取代係顯示於表1中之「保守取代」標題下。更多實質性變化係提供於表1中之「實例性取代」標題下，且如下文中參照胺基酸側鏈類別進一步所述。可將胺基酸取代引入所關注抗體及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)保持/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。

可根據常見側鏈性質對胺基酸分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代需要將該等類別中之一者之成員替換成另一類別。

一種類型之取代變體涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，經選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗體在某些生物性質(例如，增強之親和力、減小之免疫原性)方面具有修飾(例如，改良)及/或實質上將保持親代抗體之某些生物性質。實例性取代變體係親和力成熟抗體，其可便利地使用(例如)基於噬菌體展示之親和力成熟技術(例如彼等本文所述者)產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且將變體抗體展示於噬菌體上並篩選特定生物活性(例如結合親和力)。

可在HVR中作出改變(例如，取代)以(例如)改良抗體親和力。該等改變可在HVR「熱點」(亦即，由在體細胞成熟過程期間發生高頻率突變之密碼子編碼的殘基)(例如，參見Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行，其中測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由自次級文庫構築及重新選擇來達成親和力成熟已闡述於(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由各種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之誘變)中之任一者將多樣性引入經選擇用於成熟之可變基因中。然後建立次級文庫。然後篩選文庫以鑑別任一具有期望親和力之抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。可具體鑑別(例如，使用丙胺酸掃描誘變或建模)參與抗原結合之HVR殘基。特定而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。

在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要該等改變不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。例如，不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，本文所提供之保守取代)可發生在HVR中。該等改變可位於HVR「熱點」或SDR外面。在上文所提供之變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。

用於鑑別抗體中可經靶向用於誘變之殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在此方法中，鑑別殘基或目標殘基之群(例如，諸如arg、asp、his、lys及glu等帶電殘基)，並將其由中性或帶負電荷胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)代替以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。另一選擇為或另外，抗原-抗體複合體之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間之接觸點。可靶向該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物或將其排除。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。

胺基酸序列插入包含胺基端及/或羧基端融合(長度在一個殘基至含有上百或更多個殘基之多肽之範圍內)，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括抗體之N端或C端與酶(例如，用於ADEPT)或可延長抗體血清半衰期之多肽之融合體。

b)糖基化變體

在某些實施例中，改變本文所提供抗體以增加或降低使抗體糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列以產生或去除一或多個糖基化位點來便利地實現抗體糖基化位點的添加或缺失。

若抗體包含Fc區，則可改變其所附接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈、二天線寡糖，該寡糖通常係藉由至Fc區之CH2結構域之Asn297的N-連接附接。(例如，參見Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。該寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及附接至二天線寡糖結構之「幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可修飾本發明抗體中之寡糖以產生具有某些改良性質之抗體變體。

在一實施例中，提供具有缺乏附接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構的抗體變體。例如，該抗體中之岩藻糖之量可係1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻糖之量係藉由計算糖鏈內Asn297處之岩藻糖相對於附接至Asn 297之所有糖結構(例如複雜、雜合及高甘露糖結構)之總和的平均量來確定，如藉由MALDI-TOF質譜法所量測，如(例如)WO 2008/077546中所闡述。Asn297係指位於Fc區中之大約位置297(Fc區殘基之Eu編號)之天冬醯胺殘基；然而，由於抗體中之較小序列變化，Asn297亦可位於位置297之上游或下游大約±3個胺基酸，即，介於位置294與300之間。該等岩藻糖基化變體可具有改良之ADCC功能。例如，參見美國專利公開案第US 2003/0157108(Presta,L.)號；第US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)號。與「去岩藻糖基化」或「缺乏岩藻糖」抗體變體相關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包括缺少蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)及基因剔除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(例如，參見Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。

進一步提供具有二等分型寡糖之抗體變體，例如，其中附接至抗體之Fc區之雙天線寡糖由GlcNAc二等分。該等抗體變體可具有減小之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變體之實例係闡述於(例如)WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在附接至Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。該等抗體變體可具有改良之CDC功能。該等抗體變體係闡述於(例如)WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。

c)Fc區變體

在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，由此產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。

在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非全部效應子功能之抗體變體，此使其成為應用之期望候選物，在該等應用中抗體之活體內半衰期較為重要，但某些效應子功能(例如補體及ADCC)係不必要或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析來證實CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。例如，可實施Fc受體(FcR)結合分析，以確保抗體缺乏FcγR結合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保持FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現Fc(RIII，然而單核細胞表現Fc(RI、Fc(RII及Fc(RIII。在Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-492(1991)之第464頁表3中總結FcR於造血細胞中之表現。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例係闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom,I.等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。另一選擇為，可採用非放射性分析方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTI^TM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology有限公司，Mountain View，CA)；及CytoTox 96^®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。用於該等分析之有用效應子細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。另一選擇為或另外，可在活體內(例如)在諸如Clynes等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示者等動物模型中評估所關注分子之ADCC活性。亦可實施C1q結合分析來證實抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體激活，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見Petkova,S.B.等人，Int'l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。

具有降低之效應子功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297經丙胺酸取代之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。

闡述與FcR具有改良或減小之結合的某些抗體變體。(例如，參見美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。

在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代之Fc區，例如，在Fc區之位置298、333及/或334處(殘基之EU編號)之取代。

在一些實施例中，Fc區中有所改變，從而改變(即，改良或減小)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，如(例如)美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所闡述。

具有延長之半衰期及與新生Fc受體(FcRn)(其負責將母體IgG轉移至胎中)(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))之改良結合的抗體係闡述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。該等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，其改良Fc區與FcRn的結合。該等Fc變體包括彼等在以下Fc區殘基之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。

關於Fc區變體之其他實例，亦參見Duncan及Winter， Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。

d)半胱胺酸改造之抗體變體

在某些實施例中，可期望產生半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基係經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基出現在抗體之可觸及位點處。藉由用半胱胺酸取代該等殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之可觸及位點處，且可用於使抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)，以產生免疫偶聯物，如本文進一步所闡述。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)、重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所闡述來產生。

e)抗體衍生物

在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供抗體，以含有業內已知且易於獲得之額外非蛋白質性部分。適於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化之多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其水中之穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物的數量可有所變化，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，衍生所用聚合物之數量及/或類型可基於包括(但不限於)以下之考慮因素來確定：欲改良之抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等。

在另一實施例中，提供抗體與非蛋白質性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)如下波長之輻射：其不危害正常細胞，但將非蛋白質性部分加熱至殺死毗鄰抗體-非蛋白質性部分之細胞的溫度。

B.重組方法及組合物

可使用重組方法及組合物來產生抗體，如(例如)美國專利第4,816,567號中所闡述。在一實施例中，提供本文所述之編碼抗FGFR1抗體之經分離核酸。該核酸可編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及/或包含抗體之VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在又一實施例中，提供一或多個包含該核酸之載體(例如，表現載體)。在又一實施例中，提供包含該核酸之宿主細胞。在一該實施例中，宿主細胞包含以下物質(例如，已經該等物質轉形)：(1)包含如下核酸之載體：其編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列；或(2)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列之核酸的第一載體及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一實施例中，宿主細胞係真核的，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一實施例中，提供製備抗FGFR1抗體之方法，其中該方法包含在適於表現抗體之條件下培養包含編碼如上文所提供抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。

對於抗FGFR1抗體之重組產生，將一或多個編碼抗體之核酸(例如，如上文所闡述)分離並插入一或多個載體中用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該核酸可使用習用程序容易地加以分離並測序(例如，藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因之寡核苷酸探針)。

用於選殖或表現抗體編碼載體之適宜宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。例如，抗體可在細菌中產生，特別在不需糖基化及Fc效應功能時。對於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。在表現後，抗體可以可溶部分自細菌細胞糊分離且可進一步純化。

除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母菌)亦係抗體編碼載體之適宜選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已「人類化」而產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。

用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出許多可與昆蟲細胞聯合使用之桿狀病毒株，尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。

亦可利用植物細胞培養物作為宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIES^TM技術)。

亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係由SV40(COS-7)轉形之猴腎CV1細胞系；人類胚胎腎細胞系(293或293細胞，如Graham等人J.Gen Virol.36：59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽特利氏(sertoli)細胞(TM4細胞，如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR^-CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。

C.分析

可藉由業內已知之各種分析來鑑別本文所提供之抗FGFR1抗體，篩選或表徵其物理/化學性質及/或生物活性。

1.結合分析及其他分析

在一態樣中，藉由(例如)諸如ELISA、西方墨點(Western blot)等已知方法測試本發明抗體之抗原結合活性。

2.活性分析

在一態樣中，提供用於鑑別其具有促效活性之抗FGFR1抗體之分析。例如，生物活性可包括激活特定途徑之信號轉導之能力，其可藉由(例如)測定磷酸-FRS2a、磷酸-MEK、磷酸-ERK/MAPK、磷酸-STAT3之含量或使用本文所述之基於GAL-Elk1之螢光素酶分析來量測(例如，亦參見Wu等人，J.Biol.Chem.5；282(40)：29069-72(2007)及Wu等人，PLoS One 18；6(3)：e17868(2011))。亦提供在活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體。

D.免疫偶聯物

本發明亦提供包含偶聯至一或多種諸如以下等細胞毒性劑之本文抗FGFR1抗體之免疫偶聯物：化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌之酶促活性毒素、真菌、植物或動物來源或其片段)或放射性同位素。

在一實施例中，免疫偶聯物係將抗體偶聯至一或多種藥物之抗體-藥物偶聯物(ADC)，包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；奧裏斯他汀(auristatin)，例如單甲基奧裏斯他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；尾海兔素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環抗生素，例如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；甲胺蝶呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，例如多西他賽(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及歐塔紫杉醇(ortataxel)；新月毒素；及CC1065。

在另一實施例中，免疫偶聯物包含偶聯至酶促活性毒素或其片段之本文所述抗體，該酵素活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素(ricin)A鏈、相思豆毒素(abrin)A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-八疊球素(alpha-sarcin)、光桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商路(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、皂質草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、米托潔林(mitogellin)、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯族毒素(tricothecene)。

在另一實施例中，免疫偶聯物包含偶聯至放射性原子以形成放射性偶聯物的本文所述抗體。各種放射性同位素可用於產生放射性偶聯物。實例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、 Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²及Lu之放射性同位素。當偶聯物用於檢測時，其可包含用於閃爍研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，例如碘-123(再次)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。

抗體與細胞毒性劑之偶聯物可使用各種雙官能蛋白質偶合劑製得，例如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基噻◆(IT)、亞胺酸酯之雙官能衍生物(例如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所闡述來製備。經碳-14標記之1-異硫氰基苄基-3-甲基二伸乙基三胺基五乙酸(MX-DTPA)係用於偶聯放射性核苷酸與抗體之實例性螯合劑。參見WO94/11026。連接體可係促進細胞毒性藥物在細胞內釋放之「可裂解連接體」。例如，可使用酸不穩定性連接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定性連接體、二甲基連接體或含有二硫化物之連接體(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020)。

本文免疫偶聯物或ADC明確地涵蓋(但不限於)利用包括(但不限於)以下之交聯體試劑製備之該等偶聯物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC及硫代-SMPB及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，以上試劑市面有售(例如，可購自Pierce Biotechnology有限公司，Rockford,IL.,U.S.A)。

E.用於診斷及檢測之方法及組合物

在某些實施例中，本文所提供抗FGFR1抗體中之任一者均係用於檢測生物樣品中FGFR1之存在。本文所用術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，例如褐色脂肪組織、胰腺組織、肝組織、白色脂肪組織及腫瘤組織。

在一實施例中，提供用於診斷或檢測之方法中之抗FGFR1抗體。在又一態樣中，提供檢測生物樣品中FGFR1之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含在準許抗FGFR1抗體結合至FGFR1之條件下使生物樣品與本文所述抗FGFR1抗體接觸，及檢測抗FGFR1抗體與FGFR1之間是否形成複合體。該方法可係活體外或活體內方法。在一實施例中，使用抗FGFR1抗體選擇適用於利用抗FGFR1抗體之療法之個體，例如，其中FGFR1係用於選擇患者之生物標記。

在某些實施例中，提供標記之抗FGFR1抗體。標記包括 (但不限於)直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及藉助(例如)酶促反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。實例性標記包括(但不限於)放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H及¹³¹I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光黃及其衍生物)、玫瑰紅及其衍生物、丹磺醯、傘形酮、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶)(美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、山葵過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶聯)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及諸如此類。

F.醫藥調配物

本文所述抗FGFR1抗體之醫藥調配物係藉由將具有期望純度之該抗體與一或多種醫藥上可接受之可選載劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980))以凍乾調配物或水溶液之形式製得。醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文實例性醫藥上可接受之載劑進一步包括諸如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)等間質性藥物分散劑，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX^®，Baxter International有限公司)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)係闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，將sHASEGP與一或多種額外糖胺聚糖酶(例如軟骨素酶)組合。

實例性凍乾抗體調配物係闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括彼等闡述於美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中者，後一些調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。

本文調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性成份，較佳為彼等具有相互間不會產生不利影響之補充活性者。例如，可期望進一步提供glp-1類似物、合成澱粉素、升糖素受體拮抗劑(例如抗GCGR抗體)或瘦素。該等活性成份適宜以對預期目的有效之量以組合形式存在。

活性成份亦可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或介面聚合製備之微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或巨乳液中。該等技術係揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980)中。

可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件之形式，例如，膜或微膠囊。

欲用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可藉由(例如)過濾穿過無菌過濾膜來容易地實現。

G.治療方法及組合物

本文所提供促效性抗FGFR1抗體中之任一者均可用於治療方法。

在一態樣中，提供用作醫藥之促效性抗FGFR1抗體。在其他態樣中，提供用於治療代謝疾病之促效性抗FGFR1抗體。在某些實施例中，提供用於治療方法之促效性抗FGFR1抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有代謝疾病之個體之方法的促效性抗FGFR1抗體，該方法包含向個體投與有效量之抗FGFR1抗體。在一該實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如glp-1類似物、合成澱粉素、升糖素受體拮抗劑(例如抗GCGR抗體)或瘦素。上文實施例中任一實施例之「個體」較佳為人類。

在又一態樣中，本發明提供抗FGFR1抗體在製造或製備醫藥中之用途。在一實施例中，該醫藥係用於治療代謝疾病。在又一實施例中，該醫藥係用於治療代謝疾病之方法，該方法包含向患有該疾病之個體投與有效量之該醫藥。在一該實施例中，該方法進一步包含向該個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如如下文所闡述。上文實施例中任一實施例之「個體」可為人類。

在又一態樣中，本發明提供用於治療代謝疾病之方法。在一實施例中，該方法包含向患有該代謝疾病之個體投與有效量之促效性抗FGFR1抗體。在一該實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，如下文所闡述。上文實施例中任一實施例之「個體」可為人類。

在又一態樣中，本發明提供醫藥調配物，其包含本文所提供促效性抗FGFR1抗體中之任一者用於(例如)上文治療方法中之任一者。在一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供促效性抗FGFR1抗體中之任一者及醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供促效性抗FGFR1抗體中之任一者及至少一種額外治療劑，例如如下文所闡述。

本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。例如，本發明抗體可與至少一種額外治療劑共投與。在某些實施例中，額外治療劑係glp-1類似物、合成澱粉素、升糖素受體拮抗劑(例如抗GCGR抗體)或瘦素。

該等上文所述組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於相同或個別調配物中)及個別投與(在此情形中，可在投與額外治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投與本發明抗體)。

本發明抗體(及任一額外治療劑)可藉由任何適宜方法投與，包括非經腸、肺內及鼻內以及(若期望用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑給藥，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射，此部分地視投與時間長短而定。本文涵蓋各種投藥方案，包括(但不限於)在不同時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。

本發明抗體之調配、給藥及投與應以符合良好醫療實踐之方式進行。在此上下文中，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑遞送位點、投與方法、投與時間安排及醫療從業者已知之其他因素。抗體不必(但視情況)與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量視調配物中所存在抗體之量、病症或治療之類型以及上文所論述之其他因素而定。該等藥劑通常以相同劑量且以本文所述之投與途徑，或本文所述約1%至 99%之劑量，或以經驗/臨床確定為合適之任一劑量及任一途徑使用。

對於疾病之預防或治療，本發明抗體之合適劑量(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視欲治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重性及病程、投與抗體係用於預防目的還是治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。該抗體適於向患者一次性地或經一系列治療投與。視疾病之類型及嚴重性而定，約1 μg/kg至15 mg/kg(例如0.1 mg/kg至10 mg/kg)抗體可為向患者投與之初始候選劑量，不論(例如)藉由一或多次個別投與還是藉由連續輸注。視上述因素而定，一種典型日劑量可在約1 μg/kg至100 mg/kg或更高之範圍內。對於經若干天或更長時間重複投與，視病狀而定，治療通常將持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。抗體之一實例性劑量將在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg之範圍內。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg(或其任一組合)之一或多個劑量。該等劑量可間歇性投與，例如每週一次或每三週一次(例如，以使患者接受約兩個至約20個或例如約6個劑量之抗體)。可在開始時投與較高負荷劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可藉由習用技術及分析來容易地監測。

H.製品

在本發明之另一態樣中，提供含有用於治療、預防及/ 或診斷上述病症之材料的製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標籤或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、唧筒、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠等各種材料形成。容器容納組合物自身或其與另一組合物之組合以有效用於治療、預防及/或診斷病狀，且可具有無菌存取埠(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子之小瓶)。組合物中之至少一種活性劑係本發明抗體。標籤或包裝插頁指示該組合物係用於治療選定病狀。此外，該製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或另外治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之包裝插頁。另一選擇為或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者角度考慮之其他期望材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及唧筒。

III.實例

以下係本發明方法及組合物之實例。應理解，根據上文所提供之一般說明，可實踐各種其他實施例。

實例1. 抗FGFR1促效劑抗體之產生及表徵

吾人使用噬菌體展示技術及人類FGFR1b及FGFR1c(作為抗原)之His標記之IgD2-D3產生對FGFR1具有特異性之單株抗體。使用在選定互補決定區(H1、H2、H3、L3)中具有合成多樣性之人類噬菌體抗體文庫(模擬人類IgG譜之天然多樣性)用於淘選。將Fab片段以二價方式展示於M13噬菌體顆粒之表面上(Lee等人，J.Immunol.Methods 284：119-32(2004))。先前已闡述淘選方案(Liang等人，J.Mol.Biol.366：815-29(2007))。在自多個文庫篩選許多純系之後，藉由噬菌體ELISA鑑別結合至FGFR1之b及c同種型二者之獨特且特定噬菌體抗體。為測試抗體至人類FGFR之結合，使用2 μg/ml之FGFR1 ECD-人類Fc嵌合蛋白質來採用習用ELISA方案。

吾人亦量測抗FGFR1抗體對FGFR1之結合親和力，其係藉由Biacore/SPR使用所述BIAcore^TM T100儀器(Liang等人，參見上文)利用以下修改來量測。首先，按照製造商所闡述之程序使用至游離胺基之直接偶合將小鼠抗人類Fc抗體塗佈於BIAcore^TM羧甲基化葡聚糖CM5晶片上。然後在CM5生物感測器晶片上捕獲抗體，以達成大約200個反應單元(RU)。使用由10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、0.005%表面活性劑P20(HBS-P緩衝液)組成之電泳緩衝液實施結合量測。在25℃下以30 μL/分鐘之流速以存於HBS P緩衝液中之1.550 nM之範圍注射2倍稀釋系列之FGFR1 ECD-His蛋白質。使用簡單的一對一Langmuir結合模型(BIAcore^TM評價軟體3.2版本)計算締合速率(K_on，每mol/s)及解離速率(K_off，每s)。以k_off/k_on之比率形式來計算平衡解離常數(K_d，每mol)。

如上文所闡述在獨立實驗中所鑑別之兩種抗FGFR1抗體(本文指定為R1MAb1及R1MAb2)以類似親和力結合至FGFR1b及FGFR1c，但不會結合至任何其他FGFR同種型(圖1A及B)。在缺乏內源性FGFR、但經轉染表現每一FGFR同種型(及視需要KLB)之大鼠L6細胞中使用基於Gal-Elk1之螢光素酶分析測試其信號活性。該等抗體係出乎意料強效的促效劑：兩種R1MAb以劑量依賴性方式誘導螢光素酶活性，但僅當細胞表現重組FGFR1b或FGFR1c時如此，此指示R1MAb作為FGFR1之特異性促效劑起作用(圖1C)。在此分析格式中，R1MAb不會明顯影響鹼性FGF(bFGF)(經典FGFR1配體)之活性(圖1D)。然而，當細胞表現FGFR1c及KLB時，R1MAb及FGF21顯示累加效應(圖1D)。R1MAb2之F(ab')2片段而非Fab片段顯示FGFR1依賴性促效活性，此表明R1MAb藉由促進FGFR1之同源二聚合來發揮其促效活性(圖1E)。先前，已報導含有FGFR1結合肽及c-jun白胺酸拉鏈結構域之人工FGFR二聚合促效劑。稱為C19jun之此分子亦藉助c-jun結構域結合至肝素，且需要肝素用於FGFR1激活(Ballinger等人，Nature Biotechnol.17：1199-1204(1999))。相比之下，在螢光素酶分析中肝素不會影響R1MAb1之促效活性(圖5)。R1MAb1之非肝素依賴性促效活性進一步係藉由檢查ERK及MEK1/2(FGFR之下游信號組份)在所培養之鼠類3T3-L1脂肪細胞(圖1F)中或在腹膜內注射R1MAb之C57BL/6小鼠之WAT中的磷酸化 (圖1G)來證實。

吾人實施實驗以測定R1MAb1及R1MAb2所結合之FGFR1表位之位置。吾人合成30個FGFR1序列中具有胺基端生物素標記之肽代表部分且使用其用於ELISA結合分析。肽之該等序列係如下：1號：SSSEEKETDNTKPNPVAPY(SEQ ID NO：36)；2號：PVAPYWTSPEKMEKKLHAV(SEQ ID NO：37)；3號：KLHAVPAAKTVKFKCPSSG(SEQ ID NO：38)；4號：CPSSGTPNPTLRWLKNGKE(SEQ ID NO：39)；5號：KNGKEFKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：40)；6號：YKVRYATWSIIMDSVVPSD(SEQ ID NO：41)；7號：VVPSDKGNYTCIVENEYGS(SEQ ID NO：42)；8號NEYGSINHTYQLDVVERSP(SEQ ID NO：43)；9號VERSPHRPILQAGLPANKT(SEQ ID NO：44)；10號PANKTVALGSNVEFMCKVY(SEQ ID NO：45)；11號MCKVYSDPQPHIQWLKHIE(SEQ ID NO：46)；12號：LKHIEVNGSKIGPDNLPYV(SEQ ID NO：47)；13號：NLPYVQILKTAGVNTTDKE(SEQ ID NO：48)；14號：TTDKEMEVLHLRNVSFEDA(SEQ ID NO：49)；15號：SFEDAGEYTCLAGNSIGLS(SEQ ID NO：50)；16號：SIGLSHHSAWLTVLEALEE(SEQ ID NO：51)；17號：YWTSPEKMEKKLHAVPAAK(SEQ ID NO：52)；18號：EKMEKKLHAVPAAKTVKFK(SEQ ID NO：53)；19號：PAAKTVKFKCPSSGTPNPT(SEQ ID NO：54)；20號：KFKCPSSGTPNPTLRWLKN(SEQ ID NO：55)；21號： GTPNPTLRWLKNGKEFKPD(SEQ ID NO：56)；22號：TLRWLKNGKEFKPDHRIGG(SEQ ID NO：57)；23號：FKPDHRIGGYKVRYATWSI(SEQ ID NO：58)；24號：HRIGGYKVRYATWSIIMDS(SEQ ID NO：59)；25號：LHAVPAAKTVKFKCPSS(SEQ ID NO：60)；26號：KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：28)；27號：AVPAAKTVKFKCPSSG(SEQ ID NO：61)；28號：FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：29)；29號：KPDHRIGGYKVR(SEQ ID NO：62)；30號：GTPNPTLRWLKN(SEQ ID NO：63)。如圖17A中所顯示，對於R1MAb1及R1MAb2二者，其展示顯著結合之最短肽係26號肽及28號肽。

實例2. R1MAb展示持續之抗糖尿病活性。

吾人使用糖尿病之小鼠模型測試本發明抗FGFR1抗體是否將具有抗糖尿病活性。所有小鼠係自Jackson Laboratory購得並在21℃及標準12 hr光/12 hr暗循環下供養於不含病原體之動物設施中，且可隨意獲取飼料(標準齧齒類飼料(Labdiet 5010，12.7%卡(calorie)來自脂肪)或高脂肪高碳水化合物飲食(Harlan Teklad TD.03584，58.4%卡來自脂肪)及水。C57BLKS/J背景下之db/db小鼠為雌性且其他小鼠均為雄性。所有小鼠在約9-11週大時用於注射，只是ap2-SREBP1c小鼠係8個月大(圖3E)或4個月大(圖3F)。對於連續輸注FGF21蛋白質，經皮下植入滲透幫浦(Alzet® 2001)。使用OneTouch® Ultra®血糖測計儀量測葡萄糖含量。對於肝脂質分析，根據Folch方法提取脂質並將其重新懸浮於含有5% Triton X-100之PBS中。藉由使用酶反應測定總膽固醇、三酸甘油酯、β-羥基丁酸酯(Thermo DMA)及未酯化之脂肪酸(Roche)。藉由ELISA測定血清胰島素含量(Crystal Chem)。

吾人藉由向高血糖耐瘦素的db/db小鼠注射3 mg/kg(mpk)、10 mg/kg及50 mg/kg之R1MAb1來測定R1MAbs活體外及活體內之促效活性。吾人觀測到在所有三個劑量下1週後血糖含量正常化，且所觀測到之葡萄糖降低效應出乎意料地強且持久，且葡萄糖含量在單次注射後30天內保持低於對照小鼠(圖2A)。此與體重暫時但顯著下降相關(圖2A)。葡萄糖降低效應可能係藉助胰島素敏感性之改良來實現，此乃因血清胰島素含量亦因R1MAb1注射而顯著降低(圖2B)。利用R1MAb2觀察到類似R1MAb誘導之血糖含量降低(圖6)，且在具有顯著胰島素抗性之三個額外小鼠模型(缺乏瘦素之ob/ob小鼠、餵養高脂肪飲食(HFD)之小鼠及Ins2Akita小鼠)中觀察到類似R1MAb誘導之血糖含量降低(Hong等人，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.293：E1687-96(2007))(圖2C及7)。成對餵養實驗顯示db/db及Ins2Akita小鼠中R1MAb誘導之重量損失係歸因於食物攝入量之降低；然而，所觀測到之血糖降低在很大程度上與食物攝入量無關(圖2D及6-7)。在胰腺中，與成對餵養或非成對餵養之對照小鼠相比，R1MAb1注射增加胰島素陽性面積/每一胰島(圖2E及8)。FGFR1係在胰腺β細胞中表現(Hart等人，Nature 408：864-68(2000))且FGF21促進離體β 細胞功能(Wente等人，Diabetes 55：2470-78(2006))；因此β細胞中FGFR1之激活可直接促成胰腺胰島素含量之增加。該等數據證明FGFR1(而非FGFR2或FGFR3)之激活足以概括重組FGF21之抗糖尿病及抗脂血症活性。

為仔細分析IgG官能性對R1MAb活性之重要性，吾人使用兩種類型之修飾。Fc區中之雙突變(D265A/N297A；DANA)廢止至FcγR之結合及免疫效應細胞經IgG分子之募集(Gong等人，2005)。R1MAb2之促效或抗糖尿病活性均不受DANA突變引入之影響；因此效應子功能對R1MAb2之抗糖尿病活性不起作用(圖9A-C)。然而，R1Mab1之經改造單臂(OA)形式(Atwell等人，J.Mol.Biol.270：26-35(1997))缺乏一個Fab片段(OA-R1MAb1)(圖9A及D)，其顯示減小之促效活性(圖9E及F)且未能降低db/db小鼠之血糖、體重及肝及血清脂質含量(圖9G及H)，此指示R1MAb之促效及抗糖尿病活性二者均取決於Ab二價性(儘管吾人亦測試僅具有一個抗FGFR1臂(例如，具有抗β-Klotho臂)之雙特異性抗體，並證實其保持二價抗FGFR1 R1MAb之有益屬性)。該等相關性強烈表明FGFR1下游信號途徑之R1MAb誘導之激活可能介導其抗糖尿病效應。

MAb已作為強有力治療方式出現用於治療多種人類疾病。吾人證明抗FGFR1促效MAb具有強效抗高血糖及脂質降低活性，此開啟研發靶向FGFR1之治療性MAb或含有FGFR1之受體錯合物用於治療2型糖尿病及其他與肥胖症相關之慢性病症之新穎途徑。FGFR1之基於MAb之靶向提供優於重組FGF21療法之若干有利性質。首先，因其性質，與FGF21或任一其他非抗體治療蛋白質相比，MAb提供可預測、可調節且極優良藥物動力學。的確，吾人證明以1-3 mpk向db/db小鼠中單次腹膜內注射R1MAb1或R1Mab2使得30天內顯著持續改善高血糖症(圖2及5)。先前所述抗糖尿病藥劑中之任一者尚從未報導過此一持久血糖效應。

實例3. 脂肪組織在R1MAb及FGF21之糖尿病作用中之重要性。

已表明重組FGF21藉助脂肪組織及肝改良胰島素敏感性(Berglund等人，Endocrinology 150：4084-93(2009)；Li等人，FEBS Letters 583：3230-34(2009))。向小鼠中注射FGF21誘導四個表現KLB之組織類型(肝、白色脂肪組織(WAT)、褐色脂肪組織(BAT)及胰腺)中的MEK及ERK磷酸化，如先前所報導(圖3A，頂部)(Kurosu等人，J.Biol.Chem.282：26687-95(2007)；Xu等人，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.297(5)：E1105-14(2009))。相比之下，R1MAb1注射使得脂肪組織及胰腺中(而非肝中)之相同下游效應子磷酸化(圖4A，底部)，此與FGFR1 mRNA在肝中之極低表現一致(圖10)(Fon Tacer等人，Mol.Endocrinol.24(10)：2050-64(2010))。的確，肝基因表現之並行比較揭示兩個先前鑑別之FGF21靶向基因(瘦素受體(LepR)及細胞因子信號2之抑制因子(SOCS2)；Coskun等人，Endocrinology 149：6018-27(2008)、Inagaki等人，Cell Metabolism 8：77-83(2008))之表現係由FGF21而非由R1MAb1誘導(圖15)。另一方面，已知胰島素調控基因(乙醯基-CoA羧酶1(ACC1)、脂肪酸合成酶(FAS)、長鏈脂肪酸家族6延長酶(Elovl6)、似胰島素生長因子(IGF)-結合蛋白(IGFBP)-1、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK))之肝表現類似地係藉由FGF21及R1MAb1二者來改變，此表明該等基因可間接地經由激素(例如胰島素)或代謝變化來調控。當在單次注射後第7天注射至db/db小鼠中時，R1MAb1明顯降低肝及血清脂質，此大概歸因於藉助脂肪組織達成之脂質再分配效應(圖3B-D)。R1MAb1注射不誘導肺及前列腺(兩個表現FGFR1之易患癌症組織類型)中MEK或ERK之磷酸化(圖3A)。該等觀察結果同時表明脂肪組織而非肝係R1MAb及FGF21之普通代謝活性之核心。

為進一步研究此點，吾人使用脂肪萎縮性ap2-srebp1c轉基因小鼠，其由於缺乏白色脂肪組織及褐色脂肪功能受損而展示嚴重的胰島抗性、瘦素缺乏及肝腫大(圖3E、11)(Shimomura等人，Genes Dev.12：3182-94(1998)；Shimomura等人，Nature 401：73-76(1999))。與R1MAb1之代謝活性需要正常脂肪組織功能之理念一致，以1 mpk單次腹膜內注射僅在對照ob/ob小鼠而非ap2-srebp1c小鼠中改良HOMA-IR及葡萄糖耐受性(圖3E)。與注射對照IgG之成對餵養小鼠相比，藉由在ob/ob小鼠及ap2-srebp1c轉基因小鼠二者中注射R1MAb1來減少食物攝入量(圖3E)。另外，連續輸注重組FGF21亦未能改良ap2-srebp1c小鼠中之胰島素耐受性，但觀測到血清β-羥基丁酸酯(即酮體)顯著增加且膽固醇降低(圖3F)。

實例4. 褐色脂肪中藉由R1MAb達成之PGC1-α激活。

目前已表明，FGF21激活脂肪組織及肝中之核受體轉錄共激活劑PGC-1α蛋白質，以誘導與氧化代謝相關之下游基因表現(Chau等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 107：12553-58(2010)；Hondares等人，Cell Metabolism 11：206-12(2010)；Potthoff等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 30；106(26)：10853-8(2009))。的確，當向ob/ob小鼠中注射時，R1MAb1顯著增加OXPHOS及脂肪酸代謝中所涉及基因之BAT表現，如藉由DNA微陣列分析接著進行基因集合富集分析(gene-set enrichment analysis)所揭示(圖4A)。R1MAb1(及FGF21)亦增加PGC-1α、PGC-1β及其主要標靶CIDEA及UCP1在褐色脂肪組織中之表現(藉由qPCR所量測；圖4B及16)。

PGC-1α之轉錄係藉助啟動子區域中之cAMP反應元件(CRE)及結合至CRE之CREB轉錄因子來調控(Herzig等人，Nature 413：179-83(2001)；Karamitri等人，J.Biol.Chem.284：20738-52(2009)；Muraoka等人，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.296：E1430-39(2009)；Shi等人，J.Biol.Chem.(2005))。在鑑別在表現KLB之HEK293細胞中可藉由FGF21激活之與代謝相關之轉錄因子的篩選中，吾人發現GAL-CREB融合蛋白可藉由FGF21激活(圖12A-B)。其後，吾人發現在HEK293細胞中FGF21及R1MAb1二者均可以劑量依賴性方式激活GAL-CREB報告基因以及CRE螢光素酶報告基因(圖4C)。與CREB作為下游效應子起作用的理念一致，在小鼠白色脂肪組織(圖4D)、經區分人類原代脂肪細胞(圖4E)及HEK293細胞(圖12C)中，FGF21增加CREB及p90RSK(藉由ERK調控之上游CREB激酶)之磷酸化。因此，藉由FGF21及R1MAb達成之CREB激活可能有助於脂肪組織中之氧化代謝中所涉及之PGC-1α及一組下游基因的引入(圖4F及12D)。除本文所表明之轉錄調控之外，已報導FGF21在轉譯後經由激活AMPK來激活PGC-1α(Chau等人，參見上文)，但吾人未能觀測到活體外或活體內藉由R1MAb達成AMPK激活之證據(數據未顯示)。吾人結果共同支持脂肪組織中之PGC-1α在介導FGF21及R1MAb之抗脂質及抗糖尿病效應中之作用。

實例5. 測試雙特異性抗FGFR1/抗β-Klotho抗體

R1MAb與FGF21之間之另一重要差異係目標受體特異性。FGF21可對FGFR1c、2c及3c起作用，但其效應可能限於KLB表現組織(即肝、脂肪及胰腺)(Fon Tacer等人，參見上文；Kurosu等人，J.Biol.Chem.282：26687-95(2007)；Ogawa等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 104：7432-37(2007))。相比之下，R1MAb之目標組織係藉由FGFR1之表現及抗體分子之組織分佈來確定，但不太可能受KLB表現限制。的確，吾人在用R1MAb1處理之小鼠中觀測到輕度低磷酸鹽血症，此表明腎中FGF23/Klotho途徑被激活。因此，吾人使用產生個別抗KLB抗體之噬菌體展示或融合瘤技術(用表現FGFR1c及KLB之HEK293細胞免疫之BALBc小鼠)及隆凸與空洞(knob-and-hole)技術來產生雙特異性抗KLB/FGFR1雙特異性抗體(Merchant等人，Nature Biotechnol.16(7)：677-81(1998))。吾人測試該等雙特異性抗體激活GAL-Elk1表現之能力，並證實該等抗體取決於用於下游信號激活之β-Klotho及FGFR1二者之存在。吾人亦證實抗體中之一者可增加經區分原代人類脂肪細胞中下游信號中間物(MEK及ERK ½)之磷酸化。雙特異性抗體中之一者與鼠類蛋白質交叉反應，且吾人使用此抗體來測試雙特異性抗體之活體內活性。吾人觀測到此雙特異性抗體減少血糖含量，而不升高血清FGF23，但相應的對照抗FGFR1(單特異性)抗體使血糖含量減少至類似程度，但顯著升高血清FGF23含量。

然後，吾人測試該等雙特異性抗體提供抗FGFR1促效性抗體之代謝益處之能力。吾人產生表現人類β-Klotho之轉基因小鼠(R1MAb1及R1MAb2各自識別鼠類FGFR1)，並證實上文所述抗KLB/FGFR1雙特異性抗體改良小鼠模型(例如餵養高脂肪飲食之hKLB轉基因小鼠)中之葡萄糖耐受性。吾人亦產生與其他模型動物(例如大鼠、兔、石蟹獼猴及恒河猴)中之蛋白質反應之抗β-Klotho抗體，且類似地測試利用該等抗體及抗FGFR1抗體所構築之雙特異性抗體提供代謝益處之能力。

儘管出於清晰理解之目的藉助圖解說明及實例相當詳細地闡述了上述發明，但該等說明及實例不應解釋為限制本發明範圍。本文所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容皆全文以引用方式明確併入。

圖1A顯示量測抗FGFR1抗體至經純化FGFR ECD片段之結合之ELISA。

圖1B顯示R1MAb1及R1MAb2之表面電漿子共振結合常數。

圖1C-1及1C-2顯示大鼠L6細胞中之GAL-Elk1螢光素酶分析。用所示FGFR同種型以及GAL-Elk1、SV40海腎螢光素酶及Gal響應之螢火蟲螢光素酶報告基因之表現載體一起共轉染細胞。在螢光素酶分析之前，用含有遞增濃度之R1Mab或酸性FGF(aFGF：陽性對照)之培養基將經轉染細胞培育6小時。藉由經海腎螢光素酶活性正規化且表示為相對螢光素酶單位(RLU)之螢火蟲螢光素酶相對活性來評估轉錄激活。

圖1D顯示類似於1C之實驗，只是L6細胞表現FGFR1c及KLB二者。

圖1E顯示類似於1C之實驗，只是使用HEK293細胞。

圖1F顯示用所示蛋白質以0.5 μg/ml處理所示時間之3T3-L1脂肪細胞之西方墨點分析。

圖1G顯示在以1 mpk之R1Mab(+)或對照IgG(-)腹膜內注射後在所示時間自瘦的C57BL/6小鼠收穫並經受西方墨點分析之WAT。

圖2A顯示在以所示劑量單次腹膜內注射(箭頭)R1Mab1 或對照IgG後db/db小鼠之血糖(左邊)及體重(右邊)。觀測到在第1-30天之間所有群組之葡萄糖(相對於對照IgG)之顯著性以及第8天所有群組及在第12-18天之間50 mpk群組之重量(相對於對照IgG)之顯著性。N=6至14，*p<0.05，**p<0.01。

圖2B顯示隨機餵養及禁食過夜之小鼠(左)之血糖以及禁食過夜後及腹膜內注射1 g/kg葡萄糖後30分鐘之血清胰島素含量(右)。N=6至14，*p<0.05，**p<0.01。

圖2C顯示在以3 mpk單次腹膜內注射R1Mab1或對照IgG後Ins2Akita小鼠之血糖(左邊)及體重(右邊)。N=10。*p<0.01。

圖2D顯示在以1 mpk劑量單次腹膜內注射R1Mab1或對照IgG後db/db小鼠之食物攝入量(左邊)、血糖(中間)及體重(右邊)。PF：相對於R1MAb處理群組成對餵養。N=7。#p<0.001(相對於IgG)，*p<0.001(相對於PF-IgG)。

圖2E顯示經固定胰腺部分中胰島素陽性面積之定量。在單次腹膜內注射3 mpk(左邊)或1 mpk(右邊)R1MAb1後第7天收集組織並對胰島素及升糖素染色。N=4至7。**p<0.002。***p<0.001。

圖3A顯示小鼠組織中之MAPK信號激活。在腹膜內注射瘦的C57BL/6小鼠後15分鐘(25 μg/小鼠FGF21：頂部)或1小時(1 mpk R1Mab1：底部)收穫所示組織並經受西方墨點分析。PBS(頂部)及對照IgG(底部)用作陰性對照。

圖3B-D顯示肝(B)、肝脂質(C)及血清脂質(D)之代表性 H&E染色。在單次腹膜內注射1 mpk R1MAb1後第7天收集樣品。成對餵養對照小鼠以使體重正規化。N=7，*p<0.05，**p<0.001。

圖3E顯示注射1 mpk Ab之ob/ob或轉基因ap2-SREBP1c(srebp)小鼠之代謝參數。成對餵養對照群組以使體重正規化(圖11)。在3小時禁食後第3天量測用於HOMA-IR計算之葡萄糖及胰島素。在禁食過夜後第4天利用1 g/kg腹膜內葡萄糖注射實施GTT。在第5天量測組織重量。N=7，*p<0.05，***p<0.01。

圖3F顯示經皮下植入滲透幫浦以輸注FGF21(12 ng/天)之ap2-SREBP小鼠之代謝參數。在第4天利用1 U/kg胰島素腹膜內注射實施ITT。在第6天收集血清。N=6至8。

圖4A-1及4A-2顯示屬於所示KEGG途徑之基因在BAT中之mRNA表現(紅色：較高表現且藍色：較低表現)。在單次腹膜內注射1 mpk R1MAb1或用對照IgG注射之成對餵養小鼠後第4天收集樣品。

圖4B顯示BAT中藉由qPCR所達成之mRNA表現。N=6，*p<0.05，**p<0.001。

圖4C顯示HEK293細胞中之螢光素酶分析。該圖顯示FGF21及R1MAb1二者以劑量依賴性方式藉助融合至GAL4 DNA結合結構域之CREB(GAL-CREB)誘導UAS驅動之螢光素酶報告基因在HEK293細胞中之轉錄(左邊兩個圖片)，或誘導CRE驅動之螢光素酶報告基因之轉錄(右邊兩個圖片)。一些細胞亦經共轉染以表現FGFR1c及KLB(紅色；各圖中頂部曲線)。結果代表經海腎活性正規化之螢光素酶活性之一式三份實驗的平均值。

圖4D顯示在靜脈注射25 μg之FGF21(+)或PBS(-)後15分鐘收穫並經受西方墨點分析之WAT。

圖4E顯示用FGF21以1 μg/ml處理30分鐘之經區分原代人類脂肪細胞之西方墨點分析。

圖4F顯示在脂肪組織中FGF21及R1Mab激活PGC-1α程式所用之信號途徑之模型。

圖5顯示R1MAb1之非肝素依賴性及FGFR1依賴性促效活性。HEK293細胞中之GAL-Elk1螢光素酶分析。在利用或不利用所示FGFR1c之表現載體之情況下連同GAL-Elk1、SV40海腎螢光素酶及Gal響應之螢火蟲螢光素酶報告基因之表現載體共轉染細胞。在螢光素酶分析之前，在含有遞增濃度之R1Mab1之培養基中利用或不利用25 mg/L所示豬肝素將經轉染細胞培育6小時。藉由經海腎螢光素酶活性正規化且表示為相對螢光素酶單位(RLU)之螢火蟲螢光素酶相對活性來評估轉錄激活。

圖6A顯示在第0天以3 mpk劑量單次腹膜內注射R1Mab2或對照IgG後db/db小鼠之食物攝入量(左邊)、體重(中間)及血糖(右邊)。成對餵養(PF)對照小鼠以調節食物攝入量，直至第11天為止。在第11天，R1MAb2處理小鼠之食物攝入量回歸正常，且從而在第11天之後隨意餵養所有小鼠(AL)。N=7至12。p<0.001。

圖6B顯示第26天圖6A中所用隨機餵養小鼠之血糖含量。

圖6C顯示在第28天使用相同小鼠實施之GTT。

圖6D顯示在第37天使用相同小鼠實施之ITT。

圖7A顯示在第0天以1 mpk劑量單次腹膜內注射R1Mab1或對照IgG後ob/ob小鼠之血糖(左邊)及體重(右邊)。相對於R1MAb處理群組成對餵養(PF)對照小鼠。N=7。*p<0.05(相對於PF-IgG)。

圖7B顯示在第0天以1 mpk單次腹膜內注射R1Mab1或對照IgG後餵養HFD之C57BL/6小鼠之血糖(左邊)及體重(右邊)。N=7至9。*p<0.05。

圖7C顯示在Ab注射後第8天對在圖7B中所用之餵養HFD之小鼠所實施的GTT。禁食過夜之後利用1 g/kg葡萄糖腹膜內注射小鼠。平均體重係28.6 +/- 0.6(R1MAb1)及32.1 +/- 0.8(對照IgG)(p<0.01)。N=7。

圖7D顯示在以1 mpk單次腹膜內注射R1Mab1或對照IgG後第5天Ins2Akita小鼠之血糖(左邊)及體重(右邊)。成對餵養(PF-IgG)對照小鼠以使體重正規化。* p<0.05。

圖8A顯示圖4E中所分析db/db小鼠中之胰島之代表性染色。紅色：胰島素，綠色：升糖素，藍色：核。注意：R1MAb不影響胰島之整體形態。

圖8B顯示每一動物中之每一胰島中之胰島素陽性面積(%)之分佈。

圖9A顯示IgG及單臂(One-Armed，OA)IgG之示意性代表圖。藍色：重鏈，綠色：輕鏈。紅色星號指示DANA突變體中所突變之殘基之近似位置。

圖9B顯示表現FGFR1c之HEK293細胞中比較R1MAb2與R1MAb2之DNA突變體(R1MAb2 DANA)之基於GAL-Elk之螢光素酶分析。

圖9C顯示在以1 mpk腹膜內注射所示Ab之前及在其之後第7天db/db小鼠之血糖。成對餵養對照小鼠以使體重正規化。

圖9D顯示量測至所純化FGFR ECD片段之抗體結合之ELISA。OA-R1MAb1：R1MAb1之OA形式。

圖9E顯示類似於圖9B之基於GAL-Elk之螢光素酶分析。

圖9F顯示用所示蛋白質以0.5 μg/ml處理所示時間之3T3-L1脂肪細胞之西方墨點分析。

圖9G顯示在第0天(箭頭)單次腹膜內注射所示Ab後db/db小鼠之血糖(左邊)及體重(右邊)。N=7。*p<0.05(對照IgG相對於3 mpk R1MAb1)，**p<0.0005(對照IgG相對於3 mpk R1MAb1及對照IgG相對於1 mpk R1MAb1)。

圖9H顯示在Ab注射後第7天收集樣品之肝及血清脂質。N=7。*p<0.05，**p<0.0005(相對於對照IgG)。

圖10顯示KLB及FGFR同種型在肝及WAT中之mRNA表現。餵養飼料及餵養HFD之C57BL/6小鼠係25週大。餵養HFD之小鼠以HFD為食21週。*p<0.05或**p<0.001。N=6。

圖11顯示FGF21及R1Mab之活性對正常脂肪功能之需要。在第0天以1 mpk劑量單次腹膜內注射R1Mab1或對照IgG後ob/ob或ap2-srebp1c轉基因小鼠之食物攝入量(左邊)、血糖(中間)及體重(右邊)。圖3E中所述之相同小鼠。N=7。#p<0.001(相對於IgG)，*p<0.001(相對於PF-IgG)。在注射後第1天進行治療後量測。

圖12A顯示HEK293中之基於細胞之螢光素酶分析。用所示GAL融合蛋白、SV40-海腎螢光素酶及GAL響應之螢光素酶報告基因之表現載體共轉染細胞。亦用所示KLB之表現載體共轉染一些細胞。利用含有用FGF21之表現載體或所示對照空載體轉染之HEK293細胞之條件培養基的培養基培育經轉染細胞。培育6小時之後，使細胞經受螢光素酶分析。藉由經海腎螢光素酶活性正規化且表示為誘導倍數之螢火蟲螢光素酶相對活性來評估轉錄激活。

圖12B顯示類似螢光素酶分析，其中用以下核受體配體共處理一些細胞：1MM Wy14643(PPARα)、5 nM GW101516(PPARδ)、50 nM羅格列酮(rosiglitazone)(PPARγ)、50 nM T0901317(LXRα)、5 nM T3(TRβ)、30MM CDCA(FXR)。注意：FGF21不影響本文中利用或不利用同源配體處理所測試之核受體中任一者之活性。

圖12C顯示用FGF21以0.5 μg/ml處理10分鐘之HEK293細胞之西方墨點分析。用所示之FGFR之抑制劑(100 nM PD173074),mTOR之抑制劑(100 nM雷帕黴素(rapamycin))、MEK1/2之抑制劑(10 μM U0126)、PI3K之抑制劑(1 μM渥曼青黴素(wortmannin))預處理一些細胞。

圖12D顯示藉由FGF21及R1MAb達成之CREB激活可能有助於脂肪組織中之氧化代謝中所涉及之PGC-1α及一組下游基因的引入。

圖13顯示以所示劑量單次腹膜內注射R1MAb2(標記為182.2)、R1MAb3(標記為182.5)或對照IgG(抗Her2)後db/db小鼠之血糖(頂部)及體重(底部)。N=6，*p<0.05，**p<0.005，***p<0.0005。R1MAb3包含包括SEQ ID NO：6之VH及包括SEQ ID NO：4之VH。

圖14A顯示以0.5 mpk單次腹膜內注射R1MAb1或對照IgG後瘦的C57BL/6小鼠之累積食物攝入量、血糖及體重變化。亦在第0天將小鼠經皮下植入滲透迷你幫浦(mini-pump)，以1.2 mpk/天連續輸注(c.i.)重組FGF21或媒劑對照(PBS)。在第3天，使小鼠禁食過夜以在第4天(箭頭)實施葡萄糖耐受性測試(GTT)。

圖14B顯示在禁食過夜後第4天利用腹膜內注射之2 g/kg葡萄糖實施之葡萄糖耐受性測試。

圖14C顯示圖2C、14A及14B中所示小鼠之血清分析。在4 h禁食後第5天收集血清樣品。數據代表平均值±SEM，其中n=6個小鼠/群組；藉由雙尾非成對student t檢驗，相對於PBS(c.i.)+IgG控制*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(n.s.=不顯著)。

圖15顯示使用自圖2C及14中所用小鼠之肝組織分離之mRNA的基因表現分析。在4 h禁食後第5天分離組織樣品。數據代表平均值±SEM，其中n=6個小鼠/群組；藉由雙尾非成對student t檢驗，相對於PBS(c.i.)+IgG控制*p<0.05，***p<0.001(n.s.=不顯著)。

圖16顯示使用自圖2C、14及15中所用小鼠之褐色脂肪組分離之mRNA的基因表現分析。在4 h禁食後第5天分離組織樣品。數據代表平均值±SEM，其中n=6個小鼠/群組；藉由雙尾非成對student t檢驗，相對於PBS(c.i.)+IgG控制*p<0.05，***p<0.001(n.s.=不顯著)。

圖17A顯示量測至生物素化肽片段之抗體結合的ELISA結果。

圖17B顯示FGFR1之胺基酸序列(胺基酸161-212；SEQ ID NO：27)、26號肽(SEQ ID NO：28)及28號肽之胺基酸序列(SEQ ID NO：29)以及與來自FGFR2(SEQ ID NO：30)、FGFR3(SEQ ID NO：31)及FGFR4(SEQ ID NO：32)之26號肽相對應之胺基酸及與來自FGFR2(SEQ ID NO：33)、FGFR3(SEQ ID NO：34)及FGFR4(SEQ ID NO：35)之28號肽相對應之胺基酸。FGFR1中之26號肽及28號肽序列與FGFR2-4之相應區域之間之差異用方框圈出。

圖17C顯示在各種濃度之R1MAb1或對照IgG存在下量測至FGF2蛋白質之His標記之FGFR1結合的ELISA結果。數據表示為FGFR1-His結合%且代表平均值±SEM(n=3)。

圖17D顯示在各種濃度之未標記R1MAb1或FGF21存在下碘化FGF21至穩定表現KLB及FGFR1c二者之HEK293細胞之結合(該反應亦含有BSA(10 mg/ml)及對照IgG(350 mM)以阻斷非特異性結合)。數據表示為反應中總放射性標記之FGF21之所結合FGF21%。

<110> 美商建南德克公司

<120> FGFR1促效劑及其使用方法

<130> P4653R1WO

<140> 101117265

<141> 2012-05-15

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<150> 61/486,731

<151> 2011-05-16

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<170> PatentIn version 3.5

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<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

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<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 9

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 11

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 12

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 13

<210> 14

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 15

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 16

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 17

<210>> 18

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 20

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 21

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 22

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 23

<210> 24

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> /替代="Gly"

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)..(2)

<223> /替代="Glu"

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> /注意=「關於該位置之注解，序列中所給出殘基並無偏好」

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> /替代="Tyr"

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> /替代="Tyr"

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<220>

<221> VARIANT

<222> (9)..(9)

<223> /替代="Asp"

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<220>

<221> VARIANT

<222> (11)..(11)

<223> /替代="Tyr"

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<400> 24

<210> 25

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> /替代="Glu"

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<220>

<221> VARIANT

<222> (3)..(3)

<223> /替代="Tyr"

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)..(5)

<223> /替代="Tyr"

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<220>

<221> VARIANT

<222> (8)..(8)

<223> /替代="Asp"

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<220>

<221> VARIANT

<222> (10)..(10)

<223> /替代="Tyr"

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<400> 25

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (5)..(5)

<223> /替代="Thr"

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)..(6)

<223> /替代="Ser"

<220>

<221> VARIANT

<222> (7)..(7)

<223> /替代="Thr"

<220>

<221> VARIANT

<222> (8)..(8)

<223> /替代="Tyr"

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(8)

<220>

<221> VARIANT

<222> (10)..(10)

<223> /替代="Ser"

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<400> 26

<210> 27

<211> 53

<212> PRT

<213> 智人

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<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 28

<210> 29

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 29

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 30

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 31

<210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 32

<210> 33

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 33

<210> 34

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 34

<210> 35

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 35

<210> 36

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 36

<210> 37

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 37

<210> 38

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 38

<210> 39

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 39

<210> 40

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<222> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 40

<210> 41

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 41

<210> 42

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 42

<210> 43

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 43

<210> 44

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 44

<210> 45

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 45

<210> 46

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 46

<210> 47

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 47

<210> 48

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 48

<210> 49

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 49

<210> 50

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 50

<210> 51

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 51

<210> 52

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 52

<210> 53

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 53

<210> 54

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 54

<210> 55

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 55

<210> 56

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 56

<210> 57

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 57

<210> 58

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 58

<210> 59

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 59

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 60

<210> 61

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 61

<210> 62

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 62

<210> 63

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意=「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 63

Claims

一種抗纖維母細胞生長因子受體-1(FGFR1)促效劑之用途，其用於製造用於治療個體之代謝疾病或病狀之醫藥，其中該代謝疾病係選自由以下組成之群：多囊性卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿性自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)，其中該FGFR1促效劑不激活FGFR2或FGFR3。
如請求項1之用途，其中該FGFR1促效劑係抗FGFR1抗體。
如請求項2之用途，其中該抗FGFR1抗體結合至26號肽KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：28)或28號肽FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：29)。
如請求項2之用途，其中該抗FGFR1抗體結合至FGFR1b及FGFR1c二者。
如請求項1至4中任一項之用途，其中該抗體係雙特異性抗體。
如請求項5之用途，其中該抗體亦結合至β-Klotho。
一種經分離之抗體，其結合至FGFR1，其中該抗體係FGFR1活性之促效劑。
如請求項7之經分離抗體，其中該抗體不為FGFR2或FGFR3之促效劑。
如請求項7或8之抗體，其中該抗體係單株抗體。
如請求項7或8之抗體，其中抗體結合至26號肽KLHAVPAAKTVKFKCP(SEQ ID NO：28)或28號肽FKPDHRIGGYKVRY(SEQ ID NO：29)。
如請求項7或8之抗體，其中該抗體係人類、人類化或嵌合抗體。
一種抗FGFR1抗體，其中該抗體包含(a)HVR-H3，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：16)、SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)、EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：18)、TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)及GTDVMDY(SEQ ID NO：20)；(b)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQSYTTPPT(SEQ ID NO：23)；及(c)HVR-H2，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG，其中X₁係A或G，X₂係D或E，X₃係D或Y，X₄係N或Y，X₅係A或D，且X₆係D或Y(SEQ ID NO：24)；及X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG，其中X₁係D或E，X₂係D或Y，X₃係N或Y，X₄係A或D，且X₅係D或Y(SEQ ID NO：25)。
一種抗FGFR1抗體，其中該抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列GFTFX₁X₂X₃X₄IX₅，其中X₁係S或T，X₂係N或S，X₃係N或T，X₄係W或Y，X₅係H或S(SEQ ID NO：26)；(b)HVR-H2，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：X₁X₂IX₃PX₄DGX₅TX₆YADSVKG，其中X₁係A或G，X₂係D或E，X₃係D或Y，X₄係N或Y，X₅係A或D，且 X₆係D或Y(SEQ ID NO：24)；及X₁IX₂PX₃DGX₄TX₅YADSVKG，其中X₁係D或E，X₂係D或Y，X₃係N或Y，X₄係A或D，且X₅係D或Y(SEQ ID NO：25)；及(c)HVR-H3，其包含選自由組成之群之胺基酸序列：SSGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：16)、SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)、EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：18)、TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)及GTDVMDY(SEQ ID NO：20)。
如請求項13之抗體，其中該抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列GFTFTSTWIS(SEQ ID NO：7)；(b)HVR-H2，其包含選自由GEIDPYDGDTYYADSVKG(SEQ ID NO：10)及EIDPYDGDTYYADSVKG(SEQ ID NO：11)組成之群之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含選自由SSGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：16)及SGYGGSDYAMDY(SEQ ID NO：17)組成之群之胺基酸序列。
如請求項13之抗體，其中該抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列GFTFSNNYIH(SEQ ID NO：8)；(b)HVR-H2，其包含選自由ADIYPNDGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：12)及DIYPNDGDTDYADSVKG(SEQ ID NO：13)組成之群之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列EHFDAWVHYYVMDY(SEQ ID NO：18)。
如請求項13之抗體，該抗體包含(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列GFTFTSNWIS(SEQ ID NO：9)；(b)HVR-2，其包含選自由AEIDPYDGATDYADSVKG(SEQ ID NO：14)及EIDPYDGATDYADSVKG(SEQ ID NO：15)組成之群之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含選自由TGTDVMDY(SEQ ID NO：19)及GTDVMDY(SEQ ID NO：20)組成之群之胺基酸序列。
如請求項12至16中任一項之抗體，其進一步包含(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：21)；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：22)；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQSYTTPPT(SEQ ID NO：23)。
如請求項13之抗體，其包含選自由SEQ ID NO：2、3及4組成之群之VH序列。
如請求項18之抗體，其進一步包含SEQ ID NO：6之VL序列。
如請求項7、8及12至16中任一項之抗體，其中該抗體係多特異性抗體。
如請求項20之抗體，其中該抗體亦結合至β-Klotho。
如請求項7、8及12至16中任一項之抗體，其係IgG1抗體。
一種經分離之核酸，其編碼如請求項7至22中任一項之抗體。
一種宿主細胞，其包含如請求項23之核酸。
一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項24之宿主細胞以產生該抗體。
如請求項25之方法，其進一步包含自該宿主細胞回收該抗體。
一種醫藥調配物，其包含如請求項7至22中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
如請求項7、8及12至16中任一項之抗體，其用作醫藥。
如請求項7、8及12至16中任一項之抗體，其用於治療選自由以下組成之群之代謝疾病或病狀：多囊性卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿性自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)。
如請求項7、8及12至16中任一項之抗體，其用於使個體對胰島素敏感。
一種如請求項7至22中任一項之抗體之用途，其用於製造醫藥。
如請求項31之用途，其中該醫藥係用於治療選自由以下組成之群之代謝疾病或病狀：多囊性卵巢症候群(PCOS)、代謝症候群(MetS)、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、高脂血症、高血壓、2型糖尿病、非2型糖尿病、1型糖尿病、隱匿性自體免疫糖尿病(LAD)及青少年成熟發病型糖尿病(MODY)。
如請求項31之用途，其中該醫藥係用於使個體對胰島素敏感。
如請求項32之用途，其中該醫藥係與用以治療糖尿病之另一藥劑組合使用，但該其他藥劑不為胰島素。
如請求項32之用途，其中該醫藥係與用以治療心血管疾病之藥劑組合使用。