TW201219573A - Anti-fibrotic response provided by fetal cells to implants and delivery systems - Google Patents

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201219573 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明有關於生物相雜域物，其係使躲獅或盘 研究對象中的植體材料或輸送系統有關之纖維化組織反應的方 法。發明亦有關於用以治療或預防與研究對象中之植體材料 輸送系統有關的纖維化組織缺陷之方法。 一 【先前技術】 諸如髖關節、膝關節及肩關節義體(以及所有活動關節）、乳 房、肌肉及牙齒植體、心瓣膜、血管移植物及皮膚移植物的植體 應用已自不同類型之包含鈦、聚合物之生物材料及如膠原蛋白、 玻尿酸、幾丁聚醣、豬小腸、肌腱等之生物成分及組織成功地發 展。然而，即使至今所使用的材料具有惰性本質，但仍由於與周 圍細胞及組織缺乏建設性交互作用（生物相容性)而常有植體^力能 不良。此外，用以促進細胞再生的人工裝置植入或細胞移植已遭 到受限的臨床成功。 因此，為了改善人體健康及病患生命品質，而對處理位於植 體組織界面之植體裝置及細胞輸送系統的生物接受度問題有条迫 需求。 ^ 組織受傷後，可能發生二明顯現象：1.受傷細胞由相同類型的 健康細胞所取代的正常再生過程；或2.結締組織以細胞外基質之 未X控沉積取代正常組織的慢性纖維化反應。可將已開發世界中 的所有死亡中約45%歸因為一些類型的慢性纖維增生疾病。關於 植體材料的纖維化反應經常變成植體鬆弛及器官功能減低(即髖 部、肩部、及頜骨）。 WO 98/54301 (MICKLE DONALD A G et al.)揭露用以在心臟 組織中形成移植物的方法，包含移植選自心肌細胞、纖維母細胞、 平滑肌細胞、内皮細胞及骨骼肌母細胞的細胞。移植物在治療心 臟上的傷疤組織方面尤其有用。亦提供用於此移植物的分離及培 201219573 養心肌細胞的方法。 WO 01/32129 (GERIGENE MEDICAL CORP)揭露藉由注射或 直接手術放置/植入源自結締組織、真皮、肌膜、固有層^啦^^ propria)、基質(stroma)、脂肪組織、肌肉、肌腱、韌帶或毛囊的自 體培養細胞及/或培養細胞產生的細胞外基質，而長期增^及/ 或修復皮膚缺陷(傷疤、皮膚鬆弛、皮膚變薄、及皮膚增生）、皮下 脂，團、乳房組織、創傷及灼傷、泌屎道及腸胃道的括約肌結構、 疝氣)牙周疾病及失調、肌腱及韌帶撕裂及禿頭的方法。改善性 應用係進行於鄰近或在缺陷區域内的組織上。該方法涉及自嬰兒 或人類胎兒的主體取出能發育的細胞。亦或是，改善性應用涉及 在置入關於研究對象缺陷的位置之前，放置於較佳地由作為三維 結構或作為懸浮物的自體細胞外基質成份所組成之基質中的細 胞。在進一步實施例中，自培養物收集較佳的自體細胞外基質成 份並放置在關於研究對象缺陷的位置。 US^2010/129414 (Medtronic Vascular，Inc.)描述用以治療動脈 瘤、血管阻塞、及血管受損的方法。該方法包含使用可植入的醫 療裝置，其包含與其表面結合的生物活性劑基質。微脂體儀 封裝生物活性劑並全身性或局部性地輸送至血流。一旦選定適當 位置且微脂體已經由血管分佈將自身分散，便使用自微脂體釋放 生物活性劑的方法。一經釋放，則可藉由與可植入的醫療裝置結 合的生物活性劑基質隔離生物活性劑，並緩慢地釋放以給予g 組織治療效果。 未分化的胎兒細胞已揭露於WO 03/068287 (Neocutis SA)中。 亦揭露設計成用以治療罹患皮膚症狀、失調或疾病之研究對象的 方法及組成物。組成物包含與膠原蛋白基質或與載體結合之未分 化的胎兒皮膚細胞。 對於續保可回復失去的組織功能及克服導致全面整體性降低 的纖維化不利反應的安全具作用之植體材料具有急迫需求。迄 今’尚未有藥物被核准為抗纖維化療法(s. Schultze_M〇sgau et al. "Principles and mechanisms of peri-implant soft tissue healing» 4 201219573

Quintessence International, Vol. 36, Number 10, November/December i〇〇5-pp759_769)，且因此協助結合再生組織及克服植體媒介(輸送 系統媒介)之纖維化反應的能力之方法將具有重大益處。 •如將自前述内容顯而易見的該等及其他目標已由本發明達 成0 【發明内容】 .在第一貫施例中，本發明有關於生物相容性組成物，使用於 預防或治療與研究對象中之植體材料或輸送系統有關的纖維組織 反應的方法。本發明之生物相容性組成物包含自懷孕9至16週、 較佳地自10至16週、且更佳地自懷孕12_14週之已分化所得到的 胎兒細胞產物。 本發明亦有關於用以治療與研究對象中之植體材料或輸送系 統有關的纖維化組織缺陷的方法，該方法包含將本發明之生物相 谷性組成物置入位於該纖維化組織缺陷内或鄰近該纖維組織缺陷 處的該植體材料或輸送系統。尤其，該方法有關於受培養之三維 ^分化胎兒細胞產物或其衍生物或碎片的注射、植入、及/或附 著。 〆 士，明之另一目標有關於用以預防與研究對象中之植體材料 或輸送祕有_纖維組織反應之方法，該方法包含咖本發明 之生物相谷性組成物塗覆該植體材料或輸送系統。 亦揭路治療或預防研究對象罹患纖維化組織反應失調，該方 法包含將本發明之生物相容性組成物施加至該研究對象。 見 而、隹ίϊίϋί術領域者而言，藉由檢閱參考以下例示性圖式 ，進订的__續畴糊，其他目標及優鱗變得顯而易 【實施方式】 申請人已出乎意料地魏朗胎兒 助使得生物材料適用於成人細胞及幹細胞輸送(見f下實 201219573 體或基置人體㈣’軟_，尤其是硬纽軟骨，伴 成纖維組織的反應。申請人已說明自懷孕9至16週、較佳地 至16週且更佳地自週取得的已分化胎兒細胞產物藉由 及/或>肖除紐/輸送系、關®的纖維纟職形成秘得外來物更 具可接受度。 此外’多半使用巧理上自宿主分離細胞且偈限細胞的封裝程 序，以呈現用於臨床環境的胚胎幹細胞進而使得其免疫上可為 且預防腫瘤職。實際上這些植體仍在植體周圍u般性ς 化且未排列的組織形成。在這些情況中，提出使用得自懷孕9至 較^地自1G至16週且更佳地自1244週的已分化胎兒細 胞產物，平行地亦限制及/或消除這有害的纖維化反應。 如同此處所使用，為了增進本發明之理解，提供;列定義。 「一」意為「至少一個」或「一或更多」。 用語-「包含」通常用於包括的概念，亦即是允許出現一或更 多特徵或元件。 用語「生物材料」意為當與細胞或生物組織接觸時不具有害 作用的包含金屬、陶瓷及聚合物之自然或合成材料。通常^物& 料支持物係選自由聚合支持物、生物相容金屬支持物、及/或生 物相容陶瓷、及其混合物所組成的群組，該聚合支持物包含烯烴 ♦合物、氟聚合物、聚苯乙烯、聚丙浠聚合物、聚酯聚合物、聚 氨醋聚合物、石夕聚合物、、纖維素聚合物、氧樹脂聚合^、石夕樹 脂基聚合物、合成水凝膠、聚碳酸酯；該生物相容金屬支持物包 含鈦及鈦合金、鎳鈦形狀記憶合金、鍅土、不鏽鋼及鈷鉻合金、 矽土一錯土組成物；且該生物相容陶瓷包含瓷、氫氧基鱗灰石。 此處所使用的用語「生物相容」應意為不造成動物傷害或死 亡、或當安置成與動物組織緊密接觸時不在動物中引發有害反應 的任何材料。有害反應包含但不侷限於：發炎、感染、X纖士組^ 形成、細胞死亡及血栓形成。 201219573 ϋ斤，用=「生物可降解」意指生物相容 途狀作用麵_受到分解的聚合體 =吊生化 換使用，然而它們不具有制顧^^ 聚合物為生物可降解，並因此可經ί化催itlt 切割成生物相容性職物。 ⑽水解作用 此處所使用的「非生物可降解意指生 經由正常生化麵之作較解㈣合體内不 ϋ所使用的「無實質上毒性」意指全身或局性， 理，術領域具有通常技能的醫師及藥理學家所判定4 接文者的利益超過治療的生理上有害作用。 與質上I接受^指於活體内的有效劑量無 只貝上:性的所有化合物、前驅藥物、衍生物、及鹽類。 用語「已分化胎兒細胞」意為相較=依wo 03/068287_)〇^ SA)之未分化胎兒細胞的已分化細胞。^本發 明相反I用於WO_68287的用語「未分化」描述未成熟^^ 細胞:舉，言，未分化的敎皮膚細胞包含可分化成真皮纖維 母細胞及表皮肖質細胞者。已分化細胞為當放置在特定針對另一 細胞麵的分化培養基中或至不同微環境中時，將不輕易去分化 成不同細胞譜系者。糊來說’如果將胎兒皮膚_母細胞放置 到成骨性分化培養基中，則其將不會變成整群的造骨細胞；或如 果將其放置在成脂性分化培養基中’則其將不會變成整群的脂肪 細胞，並且如果將相同細胞放置到與硬骨結合的3D基質中，則除 非經過不合理時期’其將不會由於環境改變而去分化成整群的造 骨細胞。如少於9週之胎兒細胞的未分化細胞族群及間質幹細胞 (Mesend^nal stem cell，MSC)可藉由添加14_21天的特定生長因子 而誘導成諸如成骨性或成脂性的其他細胞譜系。 /用語「得自懷孕9_16週的已分化胎兒細胞產物」意為細胞族 群係源自特定組織，亦即皮膚、硬骨、軟骨、肌肉，且具有特定 組織類型的型態及表面標記。低於9週之妊娠的細胞按照定義為. 201219573 MSC且構成未分化細胞族群。 在許多國家，懷孕16週之後，針對移植目的而使用胎兒組織 /細胞在法律上及倫理上不可允許。（例如，見“Bioengineering: Principles, Methodologies and Applications, ISBN: 978-1-60741-0; 2009 Nova Science Publisher, Inc. Chapter 4 Bioengineering of Human Fetal Tissues For Clinical Use, Lee Ann Applegate et al; see also Verklan，MT. (1993), “The ethical use of fetal tissue for transplantation and research”. J Advanced Nursing, 18, 1172-1177; or Rahman A. et al. (1998) “A global review of laws on induced abortion’’，1985-1997. Intern Family Planning Perspec, 24, 56-64) 用語「適當的培養條件」為包含促進增殖之養分的用於培養 細胞之培養基。營養培養基可以適當組合及以適當濃度而包含下 列之任何一者：等張食鹽溶液、緩衝液、胺基酸、血清或血清取 代物、及其他外來添加因子。熟悉本技藝者將察覺可使用任何一 般性使用的培養條件。 用語「細胞系」意指：給予適當的新鮮培養基及充足空間而 將無限增殖的長期不變地建立之細胞培養物。吾人並非生產已建 立的細胞系，而生產初代細胞系。 初代細胞糸之用語意指具有受限傳代數的已建立細胞培養 物。 用語「純株」意指通常發展自單一選定細胞的次群集細胞。 ^用語「細胞寄存」意指：自捐贈者胎兒組織獲得檢體；在適 當培養條件下，使胎兒組織生長並將胎兒細胞增殖至高濃度；使 組織及產生的培養物之細胞受到胰蛋白酶作用來允許其懸浮； 合懸浮細胞以自培養物製成大致均⑽細麟浮體；與^東劑^ 緩混合；將等分之細麟浮體贿在魏巾；及鮮分結 由以1°C /min降低安瓿溫度直到書c，而後約24小時後 ^ 已鮮的WFf㈣作_輯進行完整 本超低溫庫贿細胞使其停止老化，藉此允許聽有在其被 201219573 採集當天所具有的功能及活性。 用語「治療」（如在「治療纖維化組織缺陷、症狀、失調或疾 病」中）包含：（1)預防症狀，即避免任何症狀之臨床徵候；（2)抑制 症狀，即停止臨床徵候之發展或進展；及/或⑶緩和、修復或逆 轉症狀’即造成臨床徵候之復原。 少 用叩症狀」、「缺陷」、「失調」、及「疾病」於此處可互相交 換使用，以意指可藉由施用敘述於此的本發明之包含胎兒細胞產 物的生物相容性組成物而加以預防或治療的生理狀態。 …f語「研究對象」（如於「研究對象」之治療中）或「病患」 係欲思指涉受到折磨、易於或罹患症狀、缺陷、失調、及疾病(如 ^處所指明)的哺乳類健。本聽包含人類及動物兩者。舉例而 吕’研究對象可為如人類、非人類的靈長類、野生動物、狗、猶、 馬牛、豬、緯羊、兔、大鼠、或小鼠。如此處所使用，野生動 任何非•丨翻哺乳類、鳥類、兩棲類或魚類。此野 生動物之:r例包含但不舰H雜、獅、虎、熊、鷹 二維基質意為選自膠原蛋白基質或PLA、PLGA、PE(}、 ί& HM_Hyal_ie add，必)的水凝膠、 =二f:?喊其組成物的任何基質。基質提供三維空間 絲胞或胎兒產物適當覆蓋及輸送至或亦與額外植體材 妝化=「ϊ原蛋白」意指受到料酵素降解之师上親水的多 受到徹底研究，因此許多關鍵參數可加以 =方3 itif原’藉此導致最小的排斥可能。用於本發 月之τ法及用途中的較佳膠原蛋白為馬膠原蛋白。 「植體」可被視為欲替換欠缺的生物 如療植體為人造裝置，且接觸身體的植體表面可』 如鈦、魏樹脂、聚合物、鱗灰石、生物 成。—些植體可具有如可植入膠囊或塗藥血管竿的 —式生物活性溶出麵。频材料可針對抗齡化反應而= 201219573 定組織類型的已分化胎兒細胞結合。 .產生纖維化組織反應的植體材料之具體實例包含但不侷限 於.： 齒植體:最頻繁的材料為作為決定性_的鈦及並混人 合金。植體表面可藉由電浆喷塗、陽極處理、_或喷沙^加二 修改來增加植體之表面積及整合可能性。 、 -齒增大物 硬骨：包含PLA、PLGA、氫·磷灰石、碟酸三灿 phosphate，TCP)的多種聚合物 -軟組織：膠原發泡體、水凝膠、針對植體 膜及牙齦增料合物絲 瓷 料 體 建 _競關節、肩關節、膝關節、活動關節植體：材料 健’ A體可包含如喊頭絲乙職關蛛的其他材 -乳房植體：㈣包含各種轉性f的鄉性體 膠原蛋白、水凝膠。 γ安…日乂尥 量重 -肌植體：使用如矽氧樹脂及膠原蛋白的材料之軟組織大 -角膜及視網膜植體包含石夕氧樹脂、凝膠、pla -皮膚植體包含HA凝膠、膠原蛋白、矽氧樹脂。 -或熟悉本技藝者已知的其絲何可獻醫縣置。例 植入醫療裝置包含但不偈限於：企管支架、導尿管、一般 縫線、可植入的心律調節器、微粒、探針及血管移 醫療裝置可單獨或組合使用。 」植入 用語「輸送系統」意為提供轉移已分化胎兒細胞或依 明之已分化胎兒細胞產物本身或與植體結合之手段以治 ^ 使得植體的任何金屬性或常用的整形外科、創傷、顎面之自、= 合成植體材料、水凝膠、矽氧樹脂或移植物。 “'、2 此伴隨得自懷孕9至16週、較佳地自1〇至16週且 12-14週的已分化减細胞輸送之抗_化活性的新發現丄有決 201219573 定性的重要性。再者，用 16週且更佳地自12_14 代孕9至16週、較佳地自1〇至 助使得生物材料相容於成人細月產物(存活或死亡)，協 植體及裝置可取決於 輸达(見以下實例）。 殺菌程序而與組織不佳的 ^置材料、表面降解性質及終端 體/裝置周圍的快出現有關。植 孕9至16週、較佳地自1〇V=敦/决疋取佳功能結果。得自懷 胎兒細胞可協助植體/裝置 规自12·14週的已分化 炎反應。在懷孕早期的(ff 修復及適應以避免發 在12-14警八斗週較佳地自10至16週且更佳地 纖維母細胞形成刀5為在組織修復_抑制肌 /麥置妹人日士 Βπ^^/ 並猎此抑制纖維化，尤其當與植體 肌^香^丨Ϊ義母細胞在以細胞外基質過量產生及平滑肌 ii 重要角色。對抗與逐步組織破壞有關之纖維化的可能 ϋ應針對局雜眺組織修復區域及/或與植體表面結合的 肌纖維母細胞之常駐族群。間f幹細胞及胎躺f幹細胞呈現指 不肌纖維母細胞類型之細胞的alpha_ SMA陽性。這些細胞為形成 傷疲及纖維組織中的關鍵要素(Estes et al，Differentiati〇n，

J Ι"，56。73-：!8”。由糾人纖維母細胞去分化成肌纖維母細胞的’ 型態及其在收縮能力方面的内在差異，胎兒及成人纖維母細胞的 差異係胎兒纖維母細胞為何不能產生纖維化反應及在胎兒受傷治 癒期間沒有傷疤組織的主要機制之一的關鍵要素(M〇ulin et al.， Cell Physiology, 188:211-222, 2001) ° 得自懷孕9至16週、較佳地自10至16週且更佳地自12-14 週的已分化胎兒皮膚細胞不輕易去分化，且不具有肌纖維母細胞 表型的型態（圖11)。已在特定專用的細胞庫中發展的這些細胞族 群與以上機制中的胎兒間質皮膚細胞及間質幹細胞非常不同（見實 例4)。alpha-SMA之表現顯示出表現於早期間質細胞族群中的胚 胎發展(C16ment et al·，J of Cell Science，120:229-238,2006)。 當12-14週或10-16週之間或9-16週的胎兒皮膚細胞在只包 11 201219573 各=作伴隨生物材料、基質及植體(即pLA、勝原蛋白泡棉、 凝膠、塑膠)之生長因子的胎兒血清的培養基中培養時，其不去分 化成肌纖維母細胞，亦不表現alpha_SMA(見圖1〇)。這些細胞不造 成材料周圍的收縮或硬化。成人間質幹細胞不與基質、植體材料 結合或合併’且去分化成在基質/植體界面形成累積的肌纖維母 細胞表型。這些細胞亦具有肌纖維母細胞之表型，且在其生長方 =叉到改變(本質上凋亡）。具體與細胞類型及細胞寄存方式有關的 這些巧鍵差異，顯示細胞選擇及懷孕時期的重要性(見如圖9)。 當隨著時間培養於2D培養物中時，如胚胎幹細胞的間質細胞 及其他未分化族群的細胞去分化，並顯示肌纖維母細胞表型。肌 纖維母細胞係惡名昭彰地涉及產生實心體植體周圍的組織收縮及 因此涉及纖維化組織反應(Siggeik〇w et ai，Bi〇materials，24: 1101-1109, 2003)。吾人一致同意肌纖維母細胞為涉及間隙基質累 積、結構變形、及逐步纖維化情況的細胞類型(Bames and G〇rin， Kidney Int., 79: 944-956, 2011 ° 當植體或基質被置入體内時，具有尤其伴隨軟組織、但亦伴 隨硬骨及軟骨的形成纖維組織之反應。申請人已見到得自懷孕9 至16週、較佳地自1〇至16週且更佳地自12_14週的已分化胎兒 皮膚細胞藉由消除或限制植體(或輸送系統)周圍的纖維組織形成 而使得外來物更具可接受性，見以下實例1_4。 申請人已發展出不侷限於此的下列應用： -由以各種劑量施用在各種輸送系統中的已分化胎兒細胞自 身引起的抗纖維化活性； -利用已分化胎兒細胞、純株或其碎片的植體及/或輸送系統 之塗層； -在( 褒孕9至16週，較佳地在1〇至16週且更佳地在12-14 週的已分化胎兒細胞與基質的組合，用以取代傳統飼養層來製備 用於病患自體移植的「生物活性的輸送系統」（用以自體移植的皮 膚移植物輸送之實例在以下實例1中顯示）。這亦已於如硬骨、軟 骨、肌肉、盤、肌腱及肺臟的其他組織類型之情形中顯示。 12 ⑧ 201219573 16週I 東乾燥的懷孕9至16週(較佳地在懷孕10至 • 4週)之已分化胎兒細胞(見以下實例3及圖8 if性4效性）。經由冷;東乾燥處理的已分化軌細胞之安 項“對於「傳統藥物」而言提供用於植體塗層的令人關注 在⑺療性理由方面，使用已分化胎兒細胞之重要優點 $ H滩(p&immunoincompe㈣且與此細胞之接受 者中引么免疫反應的能力降低有關。 ㈣ϋΐΐ施例中，可藉由在谬原蛋白或水凝膠内混合、組合、 =s反覆吸注、植覆(seeding)、平板培養(plating)、或放置細 胞而發生懷孕9至16週、較佳地在10至16週且 週的已，化胎兒細胞與膠原蛋白或水凝膠之整合。 用香「整合」或「整合於」用以描述任何混合的手段豆 有關巧細胞添加至基f。_語包含但純限於]合、植合： 以吸罝官反覆吸注、植覆、平板培養、或放置。 、、 本技藝者將察覺可運用任何結合手段 原蛋白賴三維基質)為馬膠原蛋白基質， κ把例中為HA組成物之水凝膝。 Λ另包含依據本發明的得自9至16週、較佳地自 更佳地自m4週姑娘的已分化胎兒細胞產物的生物 f可藉由下列方式加以製備：自捐贈者胎兒組織獲 兒組織發展細胞系；使胎兒組織生長並將胎兒細胞 “基物的細胞庫；及使移植物與膠原 & ^ ^又另、悲樣中，包含依據本發明的在懷孕9至16週、較佳 相六wfiL週且更佳地在12-14週之已分化胎兒細胞產物的生物 ΪΓίΐί可藉由下列方式加以製備：獲得胎兒細胞；使胎 蛋田胞或已分化胎兒細胞產物與朦原 在基本目的方面，本發明有關使用於預防、限制或治療有關 13 201219573 研究對^中之植體材料或輪送系統的纖維化組織反應之方法中的 生物相容性組成物。本發明之生物相容性組成物包含得自懷孕 9-16週的已分化胎兒細胞產物。較佳而言，本發明之該生物相容 性組成物在於得自懷孕9-16週’較佳地自懷孕ι〇_16週的已分化 的胎兒細胞產物’及更佳地得自懷孕12_14週的已分化胎兒細胞產 物。 、尤其’「已分化胎兒細胞產物」由已分化胎兒細胞、其衍生物 或碎片所組成。已分化胎兒細胞之衍生.物可包含生長因子、細胞 激素、蛋自質、DNA、RNA、細缝、或全細胞產物。已分化胎 兒細胞產物之碎片係定義為如細胞胞器、細胞壁及細胞膜。 該胎兒細胞為已分化的存活或死亡細胞。已分化胎兒細胞來 自特定組織，例如：來自胎兒皮膚真皮的胎兒皮膚纖維母細胞、 來自胎兒長骨的胎兒硬骨細胞、來自硬骨終板或活動關節的胎兒 軟骨細胞、來自胎兒肌腱的胎兒肌腱細胞等。當展 胞族群置於細齡化專用的鱗基憎，特定細胞類型佔^優 勢^將相同的胎兒細胞族群置於非適用於其分化的另一培養基 中時’並無整健群之妓化。置於成纽或成雜培養基中的 胎兒皮膚纖騎細胞以整體族群來說將不去分化成造#細胞 肪細胎.。 .在本發明之第一實施例中，得自懷孕9至16週、較佳地自十 孕10至16週的已分化胎兒細胞且更佳地得自懷孕12_14週的已j 化胎兒細胞係源自單一器官捐贈。抑或是’本發明之已分化 兒細胞可源自體外培養。 典本發明之已分化胎兒細胞或其碎片較佳地係選自皮膚、^ 骨、肌肉、盤、肺臟或肌腱細胞。該已分化胎兒細胞通$ 為新鮮或冷凍乾燥的胎兒細胞。 _ 關中，包含得自鮮9至16週的已分化的胎u 物’及較佳地得自懷孕1()至16週且更佳地自12_14週的 化胎兒細胞產物的生物相容性組成物，進一步包含由任何合邊 自然材料所製成的三絲質(如上述）。健而言，其巾整合依據々

14 201219573 杳明的已分化胎兒細胞產物的三維基質係選自膠原蛋白基質 匕LA、PLGA、PEG、雜蛋白、包含ha的水凝膠、石夕氧樹脂： 4丁聚料其混合物。本發明中所用的三絲質可取決於其應用 „為可生物賴或非可生物轉。顯而m敎的 為無實質上毒性，且應為藥物上可接受。 可藉由三維組織及/或細胞及相關的生長因子而表現的生物 性質包含但不侷限於預防及/或減少組織纖維化反應、組織重 塑、促進上皮形成、組織生長、血管形成及/或血管新生。因此， 對研究對象提供用以促進組織重塑、上皮形成、組織生長、血管 形成及/或血管新生之方法亦為本發明之目的，該方法包含將如 上述的本發明之生物相容性組成物施加至該研究對象。若具有纖 ，化^應的組織修復獲得預防，則因血管可遷移，故正常組織修 復不文阻礙反而在關於上皮形成、.組織生長、血管形成及/戋血 管新生方面獲得提昇。 通常而言，產生纖維化組織反應的植體材料係選自牙齒植 體、牙齒增大物、髖關節、肩關節、膝關節、活動關節植體、乳 房植體、肌肉植體、可植人的f療裝置、或包含皮膚及肌肉的任 何軟組織。其它軟組織可為心臟、肺臟、腦部、腎臟、胰 以上定義）。 v A在另一方面，產生纖維化組織反應的輸送系統係選自金屬性 或常用整形外科、鑛、麵的自然或合成植體材料、水凝膠、 幾丁聚醣、石夕氧樹脂或移植物。 如此處所使用的本發明之「生物相容性組成物」可含有來自 懷孕9-16週^較佳地自10_16週的一或更多已分化胎兒細胞，且 更佳地源自懷孕12-14週的已分化的胎兒細胞；伴隨其他化學成分 包含但不侷限於：傳統藥物、生理上適合的載體及辅藥。抑或是， 本發明之生物相容性組成物可包含得自懷孕9至％週及較佳地自 10至16週的一或更多已分化胎兒細胞，且更佳地得自懷孕12_14 巧的已分化胎兒細胞及/或已受到安定化的一或更多胎兒蛋白， 伴隨其他化學成分包含但不侷限於：傳統藥物、生理上適合的载 15 201219573 體及辅藥。 此成分協助促進對研究對象施用蛋白質及/或細胞。本發明 之生物相容性組成物可藉由本麟領域所熟知練序加以製造， ^利用習用的混合、溶解、粒化、裹糖衣、磨細、乳化、膠 ，封裝、包覆或冷;東乾騎理。潍成分的配製及施用的技術可 於併於，匕處作為參考的"Remingt〇n· The §cience and practice 〇f

Pharmacy" Lippincott Williams & Wilkins Publishing Co., 20th edition。 其他活性劑亦可被包含於本發明之「生物相容性組成物」中， 例?：抗發㈣、止鋪、抗微生侧、抗黴_、抗生素、維 他命、抗氧化劑。 生物相容性組成物之「有效」或「治療上有效」劑量意指在 伴Ik任何醫學棘的之合理效以驗比例下提供鮮效果的無毒 ，但充分之魅。舰效果可紐和或驗疾病的症候、徵候、 或原因、或生物系統的其他任何期望改變。 热悉本技藝者將理解，用來製成本發明之三維生物相容性組 成物的得自懷孕9至16週及較佳地自10至16週的已分化胎兒細 胞、且更佳地源自懷孕12-14週的已分化胎兒細胞，可包含：用於 皮膚移植的已分化胎兒皮膚細胞、用於肌肖移植的已分化胎兒肌 肉細胞、用於硬骨移植的已分化胎兒硬骨細胞、用於肌鍵移植的 已分化胎兒肌腱細胞、及用於軟骨移植的已分化胎兒軟骨細胞且 更具體之=於關節軟骨移植的已分化的月台兒關節軟骨細胞。 在一態樣中，本發明提供包含與膠原蛋白基質(如馬膠原蛋白) 整合之得自懷孕9-16週及較佳地自懷孕1〇_16週的已分化胎兒細 胞’且更佳地得自懷孕12-14週的已分化胎兒細胞的三維皮膚組織 異體移植建構物。舉例而言，得自懷孕9_16週及較佳地自1〇至 16週的已分化胎兒細胞，且更佳地得自懷孕12_14週的已分化胎 兒細胞可為例如在適當培養條件下可分化成真皮纖維母細胞及上 皮角質細胞者的胎兒皮膚細胞。整合可藉由熟悉本技藝者所熟知 的包含但不侷限於··混合、組合、以吸量管反覆吸注、植覆了平 201219573 ίΐί祕f放置的倾方法加以達成。本建難而射用以治療 罹桃域反應雜、失贼赫之研究縣。 ’、 产理if 之已分化胎兒細胞的細胞庫，在依據CHUV的 二i 及政策的鮮中止之後立即取得來自胎兒組織 ，分成在複數個1G em2的組織培養皿中則H Dulbecco, MEM (DMEM)^,,^ ^ 培4皿。#細胞生長進行時，如約-週後，組織及細 立^騰St酶作用。而後將-些培養皿如麵態氮巾冰殊成獨 =胞ΚΓ兒細胞離心並重新懸浮以自培養物產生大略均 其次’將細胞和緩地與防凍劑(如DMEM5ml+胎兒小牛血清 4ml+二甲基亞砜(dimethylsulf〇xide，DMS〇) i禪昆合。然後將胎 ，細胞懸#體㈣於等分巾，絲例如液態氮巾财。在一較佳 貫施例中’等分係j^C/min之速率、纟綠，朗其達到_8()()c之溫 度’而後在約24小時後轉變至_160〇c。藉纟開啟胎兒細胞庫的安 ，、融化内容物、並轉移至一般細胞培養基内，同質儲存的細胞 等^而後可用於如三維組織異體移植建構物及/或本發明之生物 相谷性組成物之生產的任何預期目的，或用於製且苴 求之研究對象中的纖維化組織反應缺陷的藥物。Ί、南 為了製成本發明之生物相容性組成物，可取得來自胎兒捐贈 者的組織之檢體，並如上述内容發展細胞系。舉例而言，可將胎 兒組織分成複數個1〇 cm2的組織培養皿中的小碎片，該等組織培 養皿已製備成具有利用手術刀產生之切口。將具有麩醯胺酸及 1^2胎兒血清的DMEM組織培養基加至培養皿◊胎兒細胞擴張成 咼濃度以產生細胞庫。而後將胎兒細胞冷凍於DMS〇、DMEM& 胎兒血清之混合物中直到需要時。 來自第5-10代的胎兒細胞係製備成約5 3 χ 1〇3細胞/毫升的濃 度。此濃度可取決於纖維組織反應缺陷的類型及病患是否為成人 或小孩而加以改變。舉例而言，細胞濃度可在自約9.3 χ 1〇2細胞/ 17 201219573 細胞/毫升的範圍。而後使胎兒蛋白質安定且以 早蜀^式或與月口兒細胞結合而併入載體(三維基質）中。 仔自懷孕9-16週及較佳地自懷孕1〇_16週的已分化胎兒細 更佳2地得自懷孕m4週的已分倾兒細胞係由來自腹部粗 織的lcm2之皮膚加以製備。 股丨、，且 平例而言，將胎兒組織分成在複數個1〇 cm2的組織培養皿中 =小碎片，且於具有麩醯胺酸的Duibec⑺，①廳以)組 基中生長。而後將胎兒血清加至培養皿。當細胞生長進行 如約-週後’組織及細胞受到胰蛋白酶作用。而後將一些培養瓜 如在液態氮中冰凍成獨立單元。然後將胎兒細胞離心並重新懸 以自培養物產生大略均勻的細胞懸浮體。 其次，將細胞和緩地與防凍劑(如DMEM5ml+胎兒小牛血清 4ml+ 二甲基亞颯(dimethyisulf0xide，DMS〇)匕喊合。而後二 兒細胞懸浮體密封於等分巾，並如在雜氮巾財。在—較佳二 施例中’等分以TC/min之速率結來，直到其達到_8〇〇c之溫产、， 而後在約24小時後轉變至_160eC。藉由開啟胎兒細胞庫的安 融化内容物、並轉移至一般細胞培養基内，同質儲存的細胞等分 而後可用於如三維組織異體移植建構物及〆或本發明之生物相容 性組成物之生產的任何預期目的，或用於製造治療具有其需求 研究對象中的纖維化組織反應缺陷的藥物。 八 對於本發明之目的而言，各種施用生物相容性組成物之 徑均有可能。 本發明之另一目的為k供用以治療與研究對象中之植體材料 或輸送系統有關的纖維化組織缺陷的方法，該方法包含將如上述 的本發明之生物相容性組成物置入位於該纖維組織缺陷内或鄰近 於該纖維組織缺陷的該植體材料或輸送系統。 本發明之進一步目的為用以限制及/或預防與研究對象中之 植體材料或輸送系統有關的纖維化組織反應的方法，該方法包含 具有本發明之生物相容性組成物的該植體材料或輸送系統之^ ⑧ 層0 18 201219573 ㈣ίϋ之i—目標為治療或預防研究對象罹患纖維組織反應 研究對氣女t方ϋ含將本發明之生物相容性組成物施加至該 或輸送系統纖維化組織反應失調係較佳地源自植體材料 之生物相容性經成物使用在製造用於治療或預 材料或輪送系統或移植物的纖維化組織反應失 十，fun的ΐ法提供數種技術性及生物性的優點。舉例而 i，且更刀佳地即得自懷孕9_16週及較佳地自懷孕1(Μ6 ί主接i t=12·14獅__細齡衫疫上可受 乂义=個$s*贈對於細胞庫產生及檢驗有所必要。 Φ ^fr m >fS 〇 3所有此種變化及修改。本發明亦包含本說B月奎 有變化包使來自均等之意纽翻内的所 為參ΐ朗各種辦文獻，其各者健義於此處作 士旅^上描述參打列實鑛更完伽解。缺而H為杆 本發明之方法的例示，且並非意欲舰I明之^圍此貝例為心 實例 實例1 在「敎細胞塗層」基質上附著及運送的成人角質細胞移植 19 201219573 物: 、角質細胞的自體移植物傳統上作為必須利用約12個鈦夾及/ 戴^蛋白_著至紗布以能將這些配製轉移至病患的薄層细 t 為飼養層㈣丽€絲械狀械蚊纖維母細 胞或包皮纖維母細胞上)(圖2)而加以輸送。更有甚者，如 配製物非常脆弱，且與供細胞形成輸朝之整體細 肊層的培養時間有關。成人細胞通常不輕易地黏附至如膠原蛋白 =棉這就是為何迄今尚未將翻來安定角質細胞 込養。月口兒細胞輕易與如膠原蛋白的植體材料 黏合^見® 3，PLA表面上之胎兒細胞的SEM圖顯示完全^著口)物 藉由使用具杨兒皮膚細胞(不論存活或死 ίίΪΪ，、或聚合物’這使得基質能生物相容於成人 角質、·田胞生長並貫施對於病患更穩定的自體移植物輸送。 結論： 产ϋ胎ΐί”胞之基質塗層提供所有類型的利用諸如皮 膚、軟月、硬月、角膜之細胞的自體移植技術之輸送。 的太Ϊ兒「生物相容」於成人細胞並具有抗纖維化 的本質。、k並非早獨基質的情況(即成人角質細胞不輕易附著）。 -成人細胞附著 -受控制的經由表面之—致分布(無法彻本f上黏稠的喷 務） -當病患傷口基部準備好時，移植物就緒 實例2 應 由月。兒細胞及/或碎片所提供之龍材料的抗纖維化反 处生Ϊ多=維組織並產生如植體鬆他及不穩定的機 月b φ 疋；體/、軟組織的交互作用及纖维化反;s。纖维 組織可形成如圍繞植體材料的歸m 4 化反f W念隹八♦展(圖親察_關圍之實心 白色饴市刀帶及圓圈内之非常少至無硬骨生長）0 20 ⑧ 201219573 士當將單獨生物材料(PLA)插入綿羊股骨頭中的硬骨缺陷中 組織回應外來物質而形成於鋪周圍。若胎兒細胞與進 帛手杈型中之硬骨缺陷的相同植體材料結合，則沒有觀察到纖 維組織定位雜復(圖5，整體财硬骨形成，且無麟組織形= 實例3 在軟組織中的基質中所輸送的胎兒細胞之抗纖維化反應： 、許多植體材料、裝置、骨架在如皮膚及肌肉的軟組織中產生 纖巧化組織累積。當如皮膚的軟組織受傷時，於修復過程中可具 有壞死性、纖維化組織反應。當前期的纖維化組織已於皮膚移植 法^前出現時，吾人已見到與基質/植體結合的胎兒細胞可降低 或消除纖維化組織反應。這可見於肌肉及皮膚軟組織中（見圖6)及 大型表面皮膚重建中（見圖7)。重要地，就比較血管新生活性而言， 胎兒細胞之生物活性可藉由將細胞及/或碎片冷凍/冷凍乾燥(見 圖8)來加以安定化。 實例4 特定細胞類型之間的差異為伴隨懷孕12-14週(或9-16週、較 佳地10-16週)的已分化胎兒皮膚細胞所見的抗纖維化反應的原 因。未分化之特定細胞的胎兒間質皮膚細胞(MSC)可輕易地分化成 複數個細胞譜系，且具有與alpha- SMA表現有關的肌纖維母細胞 表型(Hinz，JBiomechanics，43: 146-155, 2010)。MSC 細胞族群亦具 有alpha- SMA，且與傷疤及纖維組織反應中之關鍵要素的肌纖維 母細胞有關(Comut et al·，Biomaterials，21: 1887-1896, 2000)。懷孕 12- 14週(或9-16週)的已分化胎兒皮膚細胞為難以去分化的已分 化細胞，且當與基質或與植體材料結合時不造成纖維化反應。當 懷孕12-14週或9-16週之間的胎兒皮膚細胞與生物材料、基質及 植體(即PLA、膠原蛋白海綿、HA凝膠、塑膠)一起培養時，其不 去分化成肌纖維母細胞，亦不表現alpha- SMA。這些細胞不造成 材料周圍的收縮或硬化。成人間質幹細胞不與基質、植體材料結 21 201219573 合或整合’且去分化成在基質//顧介面形成?、積的肌纖維母細 胞表型。具體與細胞麵及細胞寄存方式有關的這些瞻差異， 顯示細胞選擇及懷孕時期之重要性。 當隨著時間培養於2D培養中時，間質細胞及如胚胎幹細胞的 其他細胞之未分化族群去分化，並顯示肌_母細胞表型。肌纖 維母細胞惡名崎地涉及產生實心體植體周_組敵縮及因此 涉及纖維化組織反應(Siggelkow et al.，Bi〇materials，2令 11〇1_11〇9, 2003)。吾人一致同意肌纖維母細胞為涉及間隙基質累積、結構變 形、及逐步，纖維化情況的細胞類型(Bames _ G〇rin，⑺如办Μ 79: 944-956, 2011； Valentin et aL, J Bone Joint Surgery 88* 2673-2686,2006)。 g ^ ' 肌纖維母細胞型態及其在收縮能力方面的固有差異，係為何 .胎兒纖維母細胞不能產錢靴反應及在胎兒創絲細間沒有 傷疤組織的主要機制之一的關鍵要素^河⑽丨化et此，了 cell

Physiology，188:211-222, 2001)。在懷孕 9-16 週較佳地在 12_14 週 的已么:b胎兒皮膚細鮮㈣去絲，且*具有肌雜母細胞表 型之型態(圖11及12)。已發展於特定專用的細胞庫中的這些細胞 族群與以上補巾_躺f皮膚細胞關f幹細麟常不同。 alpha-, SMA之表現係顯示為表現於早期間質細胞族群中的胚胎發 展(Clement et al” J of Cell Science，120:229-238, 2006)。 【圖式簡單說明】 圖1顯不依據描述於此的一些實施例之提供生物相容性證據 的j由生物相容性馬膠原蛋白所組成之「胎兒細胞塗覆」基質上 附著及運送的成人角質細胞皮膚移植物。在圖丨中， 胞，而b)代表基質，即具有胎兒細胞之植體。 #自^田 —，2顯示正自塑膠組織培養瓶酵素性分離的人類角質細胞之 貫際薄層’其需要支持來如® 1巾所示㈣層形式或單獨細胞轉 移至病患。 圖3顯示依據描述於此之一些實施例的生物材料表面上的胎 ⑧ 22 201219573 兒細胞之SEM圖，其顯示出表面的生物相容性交互作用。 、圖4顯不纖維組織係形成於植體材料周圍。將單獨之生物材 料(PLA)插進硬骨缺陷中。伴隨單獨之生物材料的纖維組織形成： 觀察到圈周圍之實心白色密集分帶及圓圈内之非常少至無硬骨 生長。這描繪出依據描述於此的一些實施例之軟及硬組 體材料之纖維化反應。 圖5顯示促進硬骨形成之pLA中的胎兒細胞輸送至硬骨缺 陷。依據描述於此的一些實施例，整體僅有硬骨形成，且無纖維 組織形成，描繪出胎兒細胞及/或其碎片的抗纖維化活性。 圖6描繪出依據描述於此的一些實施例之在胎兒細胞輸送及 與膠原發泡體基質相容之後所見的自皮膚至肌肉之軟組織中的抗 纖維化活性。. 圖7顯示依據描述於此之一些實施例的在與胎兒細胞輸送及 與膠原發泡體基質相容之後的嚴重受傷之皮膚中的抗纖維化組織 累積。吾人觀察到利用胎兒皮膚細胞及膠原蛋白基質/植體 纖維化反應。 圖8描繪出依據描述於此的一些實施例之藉由冷凍乾燥/冷 凍以維持生物生產力及功能來使胎兒細胞及/或衍生物安定化。 生物活性在冷象乾燥之後受到保存。 圖9顯示展現出明顯細胞型態及染色的胎兒肌肉（Μ週)及胎 兒皮膚(14週）。在長期培養期間，未見到纖維母細胞至肌纖維母 細胞之形成。 圖10顯示出在懷孕期12-14週的已分化的胎兒皮膚纖維母細 胞並未去分化成肌纖維母細胞且為alpha· SMA陰性。在這懷孕期 的細胞以纖維母細胞型態與基質表面交互作用。未分化的胎<兒皮 . 膚纖維母細胞及間質幹細胞為alpha- SMA陽性，且分化成^纖維 母細胞並在界面伴隨著纖維化反應與基質材料交互作用。 圖11已分化的胎兒皮膚細胞，尤其在懷孕12_14週時，不分 化成肌纖維母細胞，亦不去分化成其他細胞譜系，例如：當放^ 於成骨性型態發生素中(以生長因子補充來誘發成骨分化的^養 23 201219573 ί羊因造骨細胞；當放置於成脂性型態發生素中(以 放置於分化的培養基口天時，亦不成為脂肪細 胎兒二(<9.MSim補充的培養基中時，未分化的 分化成肌_母細胞。分彳卩使細胞絲質祕體接觸仍不 之誘發受到限制。成其他細胞(即硬骨、肌肉、軟骨……) 【主要元件符號說明】 a自體細胞 J3^ 體 b基質’即具有胎兒細胞之植 24

Claims (1)

1. 201219573 七、申請專利範圍： 1、 ·, /一種生物相容性組成物，用於與一研究對象中之植體材料或輸 送系統有關的纖維化組織反應的預防或治療方法中，其特徵在 於.該生物相容性組成物包含由得自懷孕9_16週的胎兒細胞或其 碎片所組成的已分化胎兒細胞產物。 2. 如申請專利範圍第1項之生物相容性粗成物，其中該已分化胎 兒細胞產物係由得自懷孕12_14週的已分化胎兒細胞或其碎片所 組成。 3.如申請專利範圍第2項之生物相容性組成物，其中該已分化的 胎兒細胞為存活或死亡之細胞。 4·如申請專利範圍第1至3項中任一項之生物相容性組成物，其 中該已分化胎兒細胞係源自單一器官捐贈。 5.如申請專利範圍第1至3項中任一項之生物相容性組成物，其 中該已分化胎兒細胞係源自體外培養。 6·如前述請求項中任一項之生物相容性組成物，其中該已分化胎 兒細胞或其碎片係選自皮膚、軟骨、硬骨、肌肉、盤、肺臟或肌 鍵細胞。 7·如前述請求項中任一項之生物相容性組成物，其中該已分化胎 兒細胞為新鮮或冷凍乾燥的胎兒細胞。 8.如申請專利範圍第1至7項中任一項之生物相容性組成物，其 中包含已分化胎兒細胞產物的該生物相容性組成物更包含由任何 合成或自然材料製成的一三維基質。 25 201219573 9.如申請專利範圍第8項之生物相容性組成物，其中該三維基質 係選自膠原蛋白基質或PLA/PLGA、PEG、彈性蛋白、包含^尿 酸(Hyaluronic acid，HA)之水凝膠、幾丁聚醣、矽氧樹脂或其混合 10.如申請專利範圍第丨至9項中任一項之生物相容性組成物，其 中產生纖維化組織反應的植體材料係選自牙齒植體、牙嵩增大 物、髖關節、肩關節、膝關節、活動關節植體、乳房植體、肌肉 植體、可植入的醫療裝置或任何軟組織。 U.如申請專利範圍第1至9項中任-項之生物相容性組成物，其 中產生纖維化組織反應的輸送系統係選自金屬性或常 ^創傷、顎面的自然或合成植體材料、水凝膠、幾石夕卜 氧树脂或移植物。

   主琢研旯對象。 15.如申請專利範圍第14 化組織反應失調的方法， 項之用以治療或預防研究對象罹患纖維 其中該纖維化組織反應失調係源自植體 26 ⑧ 201219573 材料或輸送系統或移植物。 16. —種用以對於研究對象促進組織重塑、上皮形成、組織生長、 • 血管形成及/或血管新生的方法，該方法包含將如申請專利範圍 第1項至第11項中任一項之生物相容性組成物施加至該研究對 象。 八、圖式： 27