RU2428996C2 - Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей (варианты), способ получения биотрансплантата (варианты) и способ коррекции дефектов мягких тканей - Google Patents
Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей (варианты), способ получения биотрансплантата (варианты) и способ коррекции дефектов мягких тканей Download PDFInfo
- Publication number
- RU2428996C2 RU2428996C2 RU2009132350/15A RU2009132350A RU2428996C2 RU 2428996 C2 RU2428996 C2 RU 2428996C2 RU 2009132350/15 A RU2009132350/15 A RU 2009132350/15A RU 2009132350 A RU2009132350 A RU 2009132350A RU 2428996 C2 RU2428996 C2 RU 2428996C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- culture
- biograft
- cell
- cells
- autologous
- Prior art date
Links
- 230000007547 defect Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 238000012937 correction Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 125
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 47
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 44
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 34
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 33
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 31
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 28
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 24
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 23
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 50
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 47
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 38
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 34
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 claims description 31
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 claims description 31
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 claims description 31
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 20
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 19
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 18
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 14
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 14
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 14
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 11
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 11
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 claims description 11
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 11
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 claims description 11
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims description 11
- 210000000515 tooth Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 abstract description 11
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 16
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 16
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 8
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 8
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 7
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical group O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 6
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 5
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 5
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 5
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 5
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 5
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 4
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 4
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 4
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 4
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 4
- 230000037377 skin turgor Effects 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 3
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108010023728 Alloderm Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010033733 Papule Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N Phalloidin Chemical compound N1C(=O)[C@@H]([C@@H](O)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C[C@@](C)(O)CO)NC(=O)[C@H](C2)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](O)CN3C(=O)[C@@H]1CSC1=C2C2=CC=CC=C2N1 KPKZJLCSROULON-QKGLWVMZSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000501 collagen implant Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 230000005641 tunneling Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 208000008960 Diabetic foot Diseases 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010009711 Phalloidine Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 206010039580 Scar Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010046543 Urinary incontinence Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004489 deciduous teeth Anatomy 0.000 description 1
- 230000005786 degenerative changes Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002682 general surgery Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010020199 glutaraldehyde-cross-linked collagen Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000000107 myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000002642 osteogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003239 periodontal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002379 periodontal ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004357 third molar Anatomy 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000001260 vocal cord Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и представляет собой биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию, содержащую аутологичную культуру фибробластов в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-3,0×106 в 1 мл биотрансплантата, интегрированных на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице в растворе фармацевтически приемлемого биосовместимого биодеградируемого препарата гиалуроновой кислоты, при этом объемное соотношение аутологичной культуры фибробластов, бесклеточной матрицы и препарата гиалуроновой кислоты составляет 4:1:1 соответственно, а в качестве фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой бесклеточной матрицы используют препарат «Сайметра», представляющий собой переработанную донорскую кожу человека, лишенную клеток и структурных иммуноспецифических белков, основу которого составляет коллаген и эластин, представленный в виде инъекционной формы. Изобретение обеспечивает значительное снижение количества инъецируемых клеток, повышение их жизнеспособности и обеспечение длительного сохранения импланта в поврежденной ткани. 7 н. и 12 з.п. ф-лы, 5 ил.
Description
Изобретение относится к медицине и касается лекарственных средств для коррекции дефектов мягких тканей, а именно к биотрансплантатам для коррекции дефектов мягких тканей, к способам получения таких биотрансплантатов, а также к способам коррекции дефектов любых мягких тканей, содержащих фибробласты или фибробластподобные клетки. Изобретение может быть использовано в реконструктивной и пластической хирургии, дерматологии, терапевтической косметологии - коррекции локальных дефектов, дистрофических и возрастных нарушений, требующих восстановления объема мягких тканей, в хирургической отоларингологии - пластике голосовых связок, в урологии - лечении недержания мочи, в стоматологии - лечении заболеваний пародонта, в комбустиологии - лечении обширных глубоких ожогов, в эндокринологии - лечении диабетической язвы стопы и подошвы, то есть для регенерации тканей, которые претерпели дегенеративные изменения в результате патологических нарушений или функционального расстройства в организме.
В настоящее время в медицине широко используются различные имплантационные препараты, созданные на основе компонентов, синтезируемых фибробластами [Hruza G.J.Arch. Facial Plast. Surg. Vol 6, Nov/Dec 2004].
Материалы, в состав которых входит коллаген, в медицине используют уже более 100 лет. Так, в терапевтической косметологии для коррекции морщин, рубцов постакне, контурной пластики известно применение коллагеновых препаратов на основе бычьего коллагена, например Zyderm, Zyplast; Inamed Aesthetics, Santa Barbara, Calif.
Однако бычий коллаген - это чужеродный белок и у значительного числа пациентов (до 10%) наблюдаются аллергические реакции как местного, так и системного действия.
Более предпочтительным в этом отношении препаратом, лишенным вышеуказанных недостатков является «АллоДерм», производимый компанией «ЛайфЦелл», США. Это переработанная донорская кожа человека, лишенная клеток и структурных иммуноспецифических белков. Основу материала составляют коллаген и эластин. Инъекционная форма «АллоДерм» имеет коммерческое название «Сайметра» и представляет собой матрицу, измельченную до размера 100-200 мкм. Препарат получил широкое распространение для лечения ожоговых поражений, в хирургической отоларингологии, общей хирургии, пластической хирургии, нейрохирургии, хирургической стоматологии, урологии, дерматокосметологии.
В настоящее время широкое распространение в медицине, в частности в дерматокосметологии, получили устойчивые гиалуроновые кислоты неживотного происхождения. Это гликозаминогликаны, полученные биотехнологическим путем, не вызывающие иммунного ответа со стороны организма - реципиента, обладающие выраженными гидрофильными свойствами, то есть способностью удерживать воду [Минимально инвазивная косметическая хирургия лица. Под ред. Дж.Нимату III, Р.Хога, Москва, 2007].
Однако экзогенная гиалуроновая кислота довольно быстро выводится из места введения, что является недостатком данной группы препаратов.
В ряде экспериментальных исследований in vivo было продемонстрировано выраженное стимулирующее влияние факторов роста, продуцируемых фибробластами на ускорение процессов ангиогенеза, усиление процессов пролиферации эндотелиоцитов капилляров и крупных сосудов, стимуляция пролиферации гладкомышечных клеток и перицитов, усиление дифференциации миоцитов, усиление остеогенетического процесса, стимуляция регенерации хрящевой ткани, усиление митогенеза периодонтальной связки [Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., 1992, Tran-Hung L et al., J Dent Res 85(9): 819-823, 2006].
Известен способ доставки живых фибробластов к месту дефекта ткани на микросферах [Патент РФ №2277423, МПК A61K 35/28], в котором показано, что фибробласты являются субстратзависимыми клетками и в суспензии находятся в состоянии стресса.
Однако, при таком способе доставки, функционирование микросфер с интегрированными на них фибробластами не достаточно эффективно, что не позволяет обеспечить длительное сохранение имплантата в поврежденной ткани.
Известны способы восстановления дефектов мягких тканей путем трансплантации аутологичных дермальных фибробластов в суспензии [Патент РФ №2281776, МПК A61K 35/36] и [Патент США №5660850, НКИ 424/426, МПК A61F 2/02]. Известны также смеси аллогенных фибробластов, полученных из пуповины новорожденного и аутологичных фибробластов из кожи собственно пациента [Патент РФ №2308957, МПК A61K 35/36].
Недостатком этих технических решений является высокое количество и низкая жизнеспособность инъецируемых фибробластов, а также недостаточно длительное сохранение имплантата в поврежденной ткани.
Известен способ применения клеток на носителе в пародонтологии [Патент РФ №2210352, МПК A61K 6/00], где используют постнатальные дермальные фибробласты, интегрированные на носитель - синтетический гидроксиапатит.
Недостатком этого способа является необходимость хирургического вмешательства для внесения трансплантируемого материала, что вызывает значительную травматизацию тканей, а также риск инкапсулирования имплантов фиброзной тканью.
Известен способ иммобилизации клеточной суспензии аттестованного диплоидного штамма или коллагеновых микроносителей с выращенным клеточным монослоем в гель полиэтиленоксида [Патент РФ №2189223, МПК A61K 9/10].
Ограниченное применение данного средства для лечения глубоких кожных дефектов нанесением его на ожоговые поверхности является существенным недостатком данного изобретения.
Известен способ коррекции дефектов мягких тканей посредством одновременного введения аутологичных фибробластов с различными формами коллагена и гликозаминогликанов [Патент США №6878383, НКИ 424/422, МПК A61F 13/00].
В этом способе используются коллагены любого типа и гликозаминогликаны, поперечно-сшитые с помощью, например, глютаральдегида. Ограничением этого способа является то, что при биодеградации зкзогеного коллагена может высвобождаться мономерный глютаральдегид в ткани и жидкости организма, который будет оказывать цитотоксическое действие на фибробласты и вызывать развитие непредвиденных побочных эффектов.
Известен способ получения гибридных матричных имплантатов и эксплантатов [Патент РФ №2201765, МПК A61K 39/00], в состав которых входит матричный материал, образованный фибриллами нерастворимого коллагена и расположенными в нем множеством клеток млекопитающих и множеством микросфер, состоящих из различных веществ.
Недостатком данного изобретения является использование нерастворимого коллагена.
Задачей настоящего изобретения является создание высокоэффективного биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей, разработка способа его получения и способа коррекции дефектов мягких тканей, универсальных для соединительной ткани всех органов с устойчиво высоким терапевтическим эффектом.
Техническим результатом настоящего изобретения является значительное снижение количества инъецируемых клеток, повышение их жизнеспособности и обеспечение длительного сохранения имплантата в поврежденной ткани.
Предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.
Для решения поставленной задачи биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей характеризуется тем, что он представляет собой суспензию, содержащую культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-3,0×106 в 1 мл биотрансплантата, интегрированных на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице в растворе фармацевтически приемлемого биосовместимого биодеградируемого препарата гиалуроновой кислоты.
В частном варианте объемное соотношение суспензии культуры клеток, бесклеточной матрицы и препарата гиалуроновой кислоты составляет 4:1:1 соответственно.
Для решения поставленной задачи способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей характеризуется тем, что биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика в среде ДМЕМ и переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа, инкубацию биоптата проводят при 37°C 16-17 часов, полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования ДМЕМ, 10-20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина, высевают и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры, затем клетки трипсинизируют и культивируют до наращивания необходимого количества, после чего среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду ДМЕМ 90% и 10% аутологичной сыворотки и выдерживают 8-14 часов при 37°C, после культивирования клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-3,0×106 в 1 мл биотрансплантата, интегрируют на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице и культивируют для адгезии фибробластподобных клеток 1-2 часа при 37°C, после чего соединяют с фармацевтически приемлемым биосовместимым биодеградируемым препаратом гиалуроновой кислоты.
Для решения поставленной задачи также предложен биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию, содержащую культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-4,2×106 в 1 мл биотрансплантата, интегрированных на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице.
В частном варианте объемное соотношение суспензии культуры клеток и бесклеточной матрицы составляет 5:1 соответственно.
Для решения поставленной задачи также предложен способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика в среде ДМЕМ и переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа, инкубацию биоптата проводят при 37°C 16-17 часов, полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования ДМЕМ, 10-20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина, высевают и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры, затем клетки трипсинизируют и культивируют до наращивания необходимого количества, после чего среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду ДМЕМ 90% и 10% аутологичной сыворотки и выдерживают 8-14 часов при 37°С, после культивирования клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-4,2×106 в 1 мл биотрансплантата, затем суспензию клеток интегрируют на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице и культивируют для адгезии фибробластподобных клеток 1-2 часа при 37°С.
Для решения поставленной задачи также предложен биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию, содержащую культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-5,5×106 в 1 мл биотрансплантата в растворе фармацевтически приемлемого биосовместимого биодеградируемого препарата гиалуроновой кислоты или препарата коллагена.
В частном варианте объемное соотношение суспензии культуры клеток и препарата гиалуроновой кислоты или препарата коллагена составляет 5:1 соответственно.
Для решения поставленной задачи также предложен способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика в среде ДМЕМ и переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа, инкубацию биоптата проводят при 37°С 16-17 часов, полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования ДМЕМ, 10-20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина, высевают и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры, затем клетки трипсинизируют и культивируют до наращивания необходимого количества, после чего среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду ДМЕМ 90% и 10% аутологичной сыворотки и выдерживают 8-14 часов при 37°С, после культивирования клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-5,5×106 в 1 мл биотрансплантата, после чего соединяют с фармацевтически приемлемым биосовместимым биодеградируемым препаратом гиалуроновой кислоты или препаратом коллагена.
Для решения поставленной задачи способ коррекции дефектов мягких тканей характеризуется тем, что биотрансплантат, представляющий собой суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток в количестве 3,6-60×106 клеток на курс лечения, вводят в область дефекта инъекционным путем двукратно с интервалом 3-6 недель.
В частном варианте в качестве фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой бесклеточной матрицы используют препарат «Сайметра».
В другом частном варианте биотрансплантат содержит суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток, выделенных из ткани органа, соответствующего поврежденному.
В другом частном варианте биотрансплантат содержит суспензию культуры аутологичных или аллогенных фибробластов, или фибробластоподобных клеток, выделенных из кожи, или слизистой оболочки, или крайней плоти, или пуповины новорожденного, или костного мозга, или жировой ткани, или пульпы зуба.
Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.
На Фиг.1 представлены фибробластподобные клетки в культуре. Фазово-контрастная микроскопия х200.
На Фиг.2 представлены колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф).
На Фиг.3 представлен Western-blott анализ тотальных клеточнах лизатов на содержание коллагена I типа в культурах фибробластов из различных источников.
На Фиг.4 представлен конъюгированный флюоресцентной меткой (TRITC) фаллоидин, специфично связывающий F-формы актина фибробластов. Флюоресцентная микроскопия.
На Фиг.5а представлена интактная кожная матрица «Сайметра» без фибробластоподобных клеток. Фазово-контрастная микроскопия х200.
На Фиг.5б представлена кожная матрица «Сайметра» с интегрированными фибробластподобными клетками. Фазово-контрастная микроскопия х200.
Создание условий, способствующих повышению жизнеспособности инъецируемых клеток, позволяет повысить эффективность действия биотрансплантатов, снизить количество инъецируемых клеток и эффективно оперировать количеством живых инъецируемых клеток в зависимости от размеров повреждения. После трансплантации биотрансплантата фибробласты или фибробластподобные клетки постепенно мигрируют с матрицы и благодаря своим синтетическим функциям (синтез волокон, гликозаминогликанов, ферментов, цитокинов, факторов роста) способствуют восстановлению поврежденных тканей.
Использование в биотрансплантате бесклеточной матрицы «Сайметра» (Фиг.5а) или любой другой фармацевтически приемлемой биодеградируемой биосовместимой матрицы в качестве носителя позволяет повысить жизнеспособность инъецируемых фибробластов, оптимизировать их доставку в место дефекта и обеспечить синтез физиологически необходимого уровня компонентов межклеточного матрикса.
Для повышения жизнеспособности клеток большую роль играет создание такого биотрансплантата, который максимально бы соответствовал физиологическим условиям, в которых находится фибробласт, а именно - густая сеть межклеточного матрикса, состоящего преимущественно из волокон и основного вещества - гликозаминогликанов, в частности гиалуроновой кислоты.
По этой причине целесообразным является создание биотрансплантата, содержащего фармацевтически приемлемые препараты биосовместимой биодеградируемой измельченной бесклеточной матрицы с интегрированными на ней фибробластподобными клетками (Фиг.5б), включающей волокна (коллагена, эластина) и гиалуроновую кислоту, которая, имея консистенцию геля, позволяет имплантированным клеткам оставаться локализованными в определенном месте, в частности в месте дефекта ткани.
Указанные в изобретении соотношения используемых компонентов - культуры клеток, бесклеточной матрицы и препарата гиалуроновой кислоты или препарата коллагена - позволяют получить биотрансплантат с консистенцией, удобной для инъецирования и наряду с выраженным клиническим эффектом обеспечивают малотравматичность и простоту инъецирования.
Предложенный в изобретении способ введения биотрансплантата двукратно с интервалом в 3-6 недель в зависимости от размеров дефекта мягких тканей позволяет также снизить травматичность способа, обеспечить полную реабилитацию тканей после трансплантации и создать оптимальный временной интервал для приживления клеток.
После успешно проведенного культивирования часть выведенной культуры фибробластподобных клеток подвергают криоконсервированию после 1-го пассажа в среде для криозаморозки: 50% ДМЕМ, 40% ЭТС, 10% ДМСО («Merk») в количестве 1×106/мл, где в жидком азоте они могут храниться бессрочно. Запас криоконсервированных клеток дает возможность создать мастер-банк, что позволяет проводить процедуры в определенно назначенное время.
Тестирование клеток на биобезопасность проводят следующим образом.
После 1-го пассажа образец культуры фибробластподобных клеток исследуют на исключение вирусной и бактериальной инфекции, проводят кариотипирование.
Наличие вирусной и бактериальной инфекции являются абсолютным противопоказанием к дальнейшему культивированию и хранению клеток. Все процедуры по получению клеточных биотрансплантатов проводят в условиях GMP, GTP, GLP.
Для характеризации полученных клеток определяют их фенотип, проводят фазово-контрастную микроскопию (Фиг.1), выполняют тест на КОКф (колониеобразующие единицы фибробластов (Фиг.2), проводят специфическое окрашивание клеток на F - актин (Фиг.4) и Western-blott анализ клеточных лизатов на экспрессию коллагена I типа (Фиг.3).
Выделение первичных культур фибробластов или фибробластподобных клеток.
Первичные культуры фибробластов или фибробластподобных клеток получают стандартными методами (A Culture of Animal Cells., Freshney J. 3rd edition, Wiley Liss Inc., New York 1994) с небольшими модификациями.
У пациентов берут биопсийный материал из-за ушной раковины, или со слизистой оболочки ротовой полости, или крайней плоти, или пуповины новорожденного. Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/м, амфотерицин B 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и 400-500 мкг/мл коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°C, 16-17 часов. Среду с коллагеназой предварительно стерильно фильтруют. После инкубации полученную клеточную взвесь промывают в фосфатно-солевом буфере («ПанЭко») pH 7,4-7,5 путем центрифугирования при 400g 10 минут. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т - 25 “Nunc”). Флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°C, 5% CO2) и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры. В качестве сыворотки используют как ЭТС, так и тестированную сыворотку пуповинной крови человека, так и аутологичную сыворотку крови пациента. Оптимальная концентрация сыворотки 10-20%. Более высокие концентрации сыворотки стимулируют быструю пролиферацию фибробластов. Концентрацию глюкозы в среде ДМЕМ варьируют от 1 до 4,5 г на 1 литр среды. Для культивирования фибробластов и фибробластподобных клеток используют также бессывороточную среду, например бессывороточную полную ростовую среду для культивирования фибробластов (Fibroblast Basal Medium, BioWhittaker Inc., USA) или иные аналогичные бессывороточные среды для культивирования фибробластподобных клеток. Перед использованием ЭТС проводят тестирование каждого лота ЭТС на колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф) и отбирают лоты только с высокой эффективностью колониеобразования. Культивирование проводят в чашках Петри, эксплантируя от 100 до 200 клеток в 10 мл полной ростовой среды. После 14 дней культивирования клетки снимают раствором трипсина - ЭДТА («ПанЭко») и переносят в новый (Т-75 «Nunc») культуральный флакон с питательной средой. Клетки инкубируют в течение недели в CO2 инкубаторе (37°C, 5% CO2). Каждые 48-72 часа производят смену питательной среды. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-150, либо Т-175 «Nunc») культуральный флакон. Культуральные флаконы Т-150, Т-175 обладает емкостью, позволяющей снимать 7-15×106 клеток. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 «Nunc» с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса снимают 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду с 10% аутологичной сывороткой пациента. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°C. Инкубация клеток на среде, не содержащей сыворотки, позволит избавиться от чужеродных белков, содержащихся в ЭТС. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций. Затем клетки соединяют с фармацевтически приемлемым носителем, препаратом «Сайметра» и препаратом гиалуроновой кислоты, или препаратом «Сайметра», или препаратом гиалуроновой кислоты, или коллагеном. Объем готового биотрансплантата подбирают для каждого пациента индивидуально.
Выделение фибробластподобных клеток из костного мозга.
Выделение фибробластподобных клеток из костного мозга проводят по стандартной методике [Metod in molecular biology. Basic Cell Culture Protocols, Helgason C.D., Miller C.L., 3 ed, New Jersey, 2005].
Аспират костного мозга донора (10-15 мл) выделяют из крыла подвздошной кости, используя гепарин как антикоагулянт у пациента под местной анестезией. Суспензию костномозговых клеток разводят в эквивалентном объеме фосфатно-солевого буфера Дульбекко +2% ЭТС. В 50 мл коническую пробирку («Nunc»), содержащую 15 мл раствора фиколла с плотностью 1,077 г/см3 («ПанЭко»), осторожно наслаивают 20 мл разведенного пунктата костного мозга. Затем полученную смесь центрифугируют при 330g 25 мин. Интерфазное мононуклеарное кольцо осторожно отбирают 5 мл пипеткой в 50-мл пробирки. Омывают с 5-кратным объемом фосфатно-солевого буфера, двухкратно при 330g 10 мин. Клетки подсчитывают в камере Горяева. Клеточную суспензию в количестве 1×107/мл ресуспендируют в культуральной среде α - MEM (Invitrogen) с 20% ЭТС (лот сыворотки отбирают, как описано выше) и антибиотиками (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл). 10 мл клеточной суспензии высевают в культуральный флакон 25 см2 («Nunc») при 37°C и 5% CO2, и инкубируют 14 дней, получая таким образом первичную клеточную культуру. Для дальнейшей экспансии клетки пассируют в количестве 3000-5000 кл/см2 в культуральные матрасы («Nunc») с большей посевной площадью. По мере роста и достижения 90% конфлюэнтного слоя клетки снимают раствором 0,25% трипсин-ЭДТА и рассеивают в культуральные фабрики.
Выделение фибробластподобных клеток из жировой ткани.
Выделение фибробластподобных клеток из жировой ткани проводят по стандартной методике [Zak Р.А., Tissue Engineering vol. 7, №2, 2001] с небольшими модификациями.
Образцы жировой ткани получают посредством липосакции. Жировую ткань измельчают и подвергают ферментативной обработке коллагеназой I типа (200 ед/мл, Sigma) в среде DMEM, содержащей 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина при соотношении ткани и среды 1:1 и инкубируют при 37°C в течение часа с постоянным покачиванием/перемешиванием. По окончании инкубации образец смешивают с культуральной средой DMEM, содержащей 10% ЭТС и фильтруют через 100 мкм нейлоновый фильтр. Профильтрованную суспензию центрифугируют при 200g 5-7 минут. Полученный осадок обрабатывают лизирующим буфером (154 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA) в течение 5 минут при 37°C для лизиса эритроцитов, после чего клеточную суспензию центрифугируют при 400g 7 минут. Клеточный осадок (1×106 /см2) ресуспендируют в культуральной среде, описанной выше, высевают в культуральный флакон и инкубируют в CO2 инкубаторе (37°C, 5% CO2). Смену среды проводят каждые 3-4 дня. По мере роста и достижения 80-90% конфлюэнтного монослоя клеточную суспензию снимают 0,25% трипсин-ЭДТА.
Выделение фибробластподобных клеток из пульпы зуба.
Выделение фибробластподобных клеток из пульпы зуба проводят по оригинально разработанной методике.
Клетки получают из молочных зубов детей или удаленных третьих моляров взрослых. Зубы трехкратно промывают средой DMEM, содержащей 200 мкг/мл гентамицина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Затем зуб переносят во флакон с 10 мл среды DMEM, содержащей 10% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина и 400-500 мкг/мл коллагеназы II типа. Инкубацию ведут при 37°C, 17 час. Затем клеточную суспензию центрифугируют и осадок ресуспендируют в 5 мл культуральной среды DMEM, содержащей 20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина. Культивирование проводят в CO2 инкубаторе (37°C, 5% CO2) в течение 2-х недель до образования монослоя. Дальнейшее культивирование и пассирование клеток проводят в среде DMEM с 15% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина. Среду меняют каждые 3-4 дня. По мере роста и достижения 80-90% конфлюэнтного монослоя клеточную суспензию снимают 0,25% трипсин - ЭДТА.
Для иллюстрации изобретения приведены следующие примеры.
Пример 1.
Доброволец В. 50 лет, пол мужской.
При осмотре кожи лица обнаружено: наличие глубоких морщин на лбу, наличие выраженных, глубоких носогубных складок.
Диагноз: возрастные изменения кожи лица.
Коррекция проблемных зон кожи была проведена заявленным способом с использованием биотрансплантата, состоящего из аутологичной культуры фибробластов, интегрированных на матрице фармацевтически приемлемого препарата «Сайметра» в фармацевтически приемлемом препарате гиалуроновой кислоты IALSystem.
Для этого у добровольца из заушной области был взят биоптат кожи диаметром 0,4 мм.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин B 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°C, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т-25 “Nunc”). Флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°C, 5% CO2) и культивируют в течение 2 недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-175 «Nunc») культуральный флакон. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 («Nunc») с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса можно снять 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°C. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций в количестве 15×106 в 4 мл.
Для регидратации препарата «Сайметра» используют 0,9% раствор хлорида натрия для инъекций. Регидратацию проводят по алгоритму компании «ЛайфЦелл». Клеточную суспензию в 4 мл 0,9% раствора хлорида натрия для инъекций смешивают осторожным пипетированием с 1 мл препарата «Сайметра» и инкубируют гибридный имплант для адгезии фибробластподобных клеток 2 часа при 37°C. Затем 5 мл импланта смешивают с 1 мл препарата гиалуроновой кислоты - «IAL System» с получением биотрансплантата.
Биотрансплантат в количестве 15×106 клеток двукратно с интервалом 3 недели инъецируют в средний слой дермы кожи лба и носогубных складок туннельным способом. Вкол производят интрадермально посредством инсулиновой иглы 25,4 мм, 27 G параллельно ходу морщины или поперек с интервалом 8-10 мм, на вколе производят введение 0,05 мл препарата.
Перед инъекциями поверхность кожи обрабатывают 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводят местную анестезию 5% кремом Эмла.
Наблюдения за клиническими результатами проводят посредством фотографирования пациента до, после и через 6 месяцев после курса лечения.
Результаты оценивают по сравнительному анализу до и после пересадки фибробластов, а также по данным визуального наблюдения. Через 6 месяцев после проведения курса лечения наблюдали уменьшение глубины и значительное сглаживание морщин в области лба, значительное уменьшение выраженности и глубины носогубных складок.
Пример 2.
Доброволец А. 47 лет, пол женский.
При осмотре кожи лица обнаружено: снижение тургора кожи в области щек и подбородка, изменение контура лица, наличие мелких морщин на лбу, вокруг глаз, наличие выраженных носогубных складок.
Диагноз: возрастные изменения кожи лица.
Коррекция проблемных зон кожи была проведена заявленным способом с использованием биотрансплантата, состоящего из аутологичной культуры фибробластов, интегрированных на матрице фармацевтически приемлемого препарата «Сайметра».
Для этого у добровольца из заушной области был взят биоптат кожи диаметром 0,5 мм.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин B 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°C, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т-25 “Nunc”). Флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°C, 5% CO2) и культивируют в течение 2 недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-175 «Nunc») культуральный флакон. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 («Nunc») с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса можно снять 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°C. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций в концентрации 20×106 в 5 мл.
Для регидратации препарата «Сайметра» используют 1 мл 0,9% раствор хлорида натрия для инъекций. Регидратацию проводят по алгоритму компании «ЛайфЦелл». Клеточную суспензию в растворе 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций смешивают осторожным пипетированием с 1 мл препарата «Сайметра» и инкубируют гибридный имплант для адгезии фибробластподобных клеток 2 часа при 37°C с получением биотрансплантата.
Биотрансплантат в количестве 20×106 клеток двукратно с интервалом 3 недели инъецируют в средний слой дермы кожи лба и носогубных складок туннельным способом. Вкол производят интрадермально посредством инсулиновой иглы 25,4 мм, 27 G параллельно ходу морщины или поперек с интервалом 8-10 мм, на вколе производят введение 0,05 мл препарата.
Перед инъекциями поверхность кожи обрабатывают 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводят местную анестезию 5% кремом Эмла.
Наблюдения за клиническими результатами проводят посредством фотографирования пациента до, после и через 6 месяцев после курса лечения.
Результаты оценивают по сравнительному анализу до и после пересадки фибробластов, а также по данным визуального наблюдения.
Через месяц после завершения курса лечения кожи отмечали улучшение состояния кожи, уменьшение глубины морщин, улучшение цвета и контура лица, которое усиливалось со временем и сохранялось на протяжении всего срока наблюдения. Через 6 месяцев после проведения курса лечения наблюдали улучшение тургора кожи, цвета и контура лица; наблюдали сглаживание морщин, уменьшение выраженности и глубины носогубных складок.
Пример 3.
Доброволец В. 47 лет, пол мужской.
При осмотре кожи лица обнаружено: обезвоживание кожи и снижение ее тургора, наличие морщин вокруг глаз, на щеках, в области лба.
Диагноз: возрастные изменения кожи лица.
Коррекция проблемных зон кожи была проведена заявленным способом с использованием биотрансплантата, состоящего из аутологичной культуры фибробластов в фармацевтически приемлемом препарате гиалуроновой кислоты TEOSYAL Meso.
Для этого у добровольца из заушной области был взят биоптат кожи диаметром 0,3 мм.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин B 25 мкг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°C, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т-25 “Nunc”). Флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°C, 5% CO2) и культивируют в течение 2 недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-175 «Nunc») культуральный флакон. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 («Nunc») с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса можно снять 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°C. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций в количестве 30×106 в 5 мл. Затем клетки соединяют с 1 мл фармацевтически приемлемым носителем гиалуроновой кислоты - TEOSYAL Meso с получением биотрансплантата.
Биотрансплантат в количестве 30×106 клеток двукратно с интервалом 3 недели инъецируют в средний слой дермы туннельным способом по всему лицу и папулами в области глаз. Вкол производят интрадермально посредством инсулиновой иглы 25,4 мм, 30 G параллельно ходу морщины или поперек с интервалом 8-10 мм, на вколе производят введение 0,05 мл препарата; в случае сниженного тонуса кожи и мелких морщин биотрансплантат вводят папуллами в проблемную зону: вколы производят на глубину 2 мм по параллельным линиям с интервалом 5-8 мм.
Перед инъекциями поверхность кожи обрабатывают 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводят местную анестезию 5% кремом Эмла.
Наблюдения за клиническими результатами проводят посредством фотографирования пациента до, после и через 6 месяцев после курса лечения.
Результаты оценивают по сравнительному анализу до и после пересадки фибробластов, а также по данным визуального наблюдения.
Через неделю после завершения курса отмечали улучшение состояния кожи, которое усиливалось со временем и сохранялось на протяжении всего срока наблюдения.
Через 6 месяцев после проведения курса лечения наблюдали улучшение тургора кожи, цвета и контура лица; наблюдали сглаживание морщин, уменьшение выраженности и глубины носогубных складок.
Пример 4.
Доброволец К. 52 года, пол мужской.
При осмотре кожи лица обнаружено: обезвоживание кожи и снижение ее тургора, наличие морщин вокруг глаз, на щеках, в области лба.
Диагноз: возрастные изменения кожи лица.
Коррекция проблемных зон кожи была проведена заявленным способом с использованием биотрансплантата, состоящего из аутологичной культуры фибробластов в фармацевтически приемлемом препарате коллагена, например Evolance.
Для этого у добровольца из заушной области был взят биоптат кожи диаметром 0,1 мм.
Перед получением первичной клеточной культуры биоптат промывают растворами антибиотиков и антимикотика (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, гентамицин 200 мкг/мл, амфотерицин В 0,0025 мг/мл) в среде ДМЕМ. После промывки биоптат переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа («Sigma»). Инкубацию биоптата проводят при 37°C, 16-17 часов. Полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования - ДМЕМ, 10-20% ЭТС («ПанЭко»), 40 мкг/мл гентамицина и высевают в культуральные флаконы (Т-25 “Nunc”). Флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°C, 5% CO2) и культивируют в течение 3-х недель до получения первичной культуры. По мере роста и достижения субконфлюэнтного слоя клетки трипсинизируют и переносят в новый большей площадью (Т-75, Т-175 «Nunc») культуральный флакон. В дальнейшем клетки переносят в фабрики Т-500 («Nunc») с тройным дном, после 7 дней культивирования с такого матраса можно снять 20-30×106 клеток. При достижении субконфлюэнтного монослоя среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки. До снятия клеток и получения готовой суспензии клетки выдерживают не менее 8-14 часов при 37°C. В конце инкубации клетки собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9% растворе хлорида натрия для инъекций в количестве 30×106 в 5 мл. Затем клетки соединяют с 1 мл фармацевтически приемлемым препаратом коллагена «Evolance» с получением биотрансплантата.
Биотрансплантат в количестве 30×106 клеток двукратно с интервалом 3 недели инъецируют в средний слой дермы туннельным способом по всему лицу и папулами в области глаз. Вкол производят интрадермально посредством инсулиновой иглы 25,4 мм, 30 G параллельно ходу морщины или поперек с интервалом 8-10 мм, на вколе производят введение 0,05 мл препарата. В случае сниженного тонуса кожи и мелких морщин биотрансплантат вводят папуллами в проблемную зону, вколы производят на глубину 2 мм по параллельным линиям с интервалом 5-8 мм.
Перед инъекциями поверхность кожи обрабатывают 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводят местную анестезию 5% кремом Эмла.
Наблюдения за клиническими результатами проводят посредством фотографирования пациента до, после и через 6 месяцев после курса лечения.
Результаты оценивают по сравнительному анализу до и после пересадки фибробластов, а также по данным визуального наблюдения.
Через неделю после завершения курса отмечали улучшение состояния кожи лица, которое усиливалось со временем и сохранялось на протяжении всего срока наблюдения в течение 6 месяцев. Наблюдалось улучшение цвета и контура лица, тургора кожи, сглаживание крупных и исчезновение мелких морщин.
Таким образом, проведенные экспериментальные исследования подтверждают высокий терапевтический эффект при использовании предлагаемого биотрансплантата, отсутствие побочных реакций и осложнений, и дают возможность использовать фармацевтически приемлемые препараты с регистрационными удостоверениями МЗ РФ. Значительное снижение количества инъецируемых клеток, повышение их жизнеспособности и обеспечение длительного сохранения имплантата в поврежденной ткани также позволит снизить стоимость лечения.
Claims (19)
1. Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию, содержащую аутологичную культуру фибробластов в 0,9%-ном растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-3,0·106 в 1 мл биотрансплантата, интегрированных на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице в растворе фармацевтически приемлемого биосовместимого биодеградируемого препарата гиалуроновой кислоты, при этом объемное соотношение аутологичной культуры фибробластов, бесклеточной матрицы и препарата гиалуроновой кислоты составляет 4:1:1 соответственно, а в качестве фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой бесклеточной матрицы используют препарат «Сайметра», представляющий собой переработанную донорскую кожу человека, лишенную клеток и структурных иммуноспецифических белков, основу которого составляет коллаген и эластин, представленный в виде инъекционной формы.
2. Биотрансплантат по п.1, характеризующийся тем, что он содержит суспензию аутологичной культуры фибробластов, выделенных из ткани органа, соответствующего поврежденному.
3. Биотрансплантат по п.1, характеризующийся тем, что он содержит суспензию аутологичной культуры фибробластов, выделенных из кожи, или слизистой оболочки, или крайней плоти, или пуповины новорожденного, или костного мозга, или жировой ткани, или пульпы зуба.
4. Способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей по п.1, характеризующийся тем, что биоптат ткани промывают растворами антибиотиков и антимикотика в среде ДМЕМ и переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа, инкубацию биоптата ткани проводят при 37°С 16-17 ч, полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования ДМЕМ, 10-20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина, высевают и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры клеток, которую затем трипсинизируют и культивируют, после чего среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду ДМЕМ 90% и 10% аутологичной сыворотки и выдерживают 8-14 ч при 37°С, после культивирования первичную культуру клеток собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-3,0·106 в 1 мл биотрансплантата, интегрируют на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице, при этом в качестве фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой бесклеточной матрицы используют препарат «Сайметра», представляющий собой переработанную донорскую кожу человека, лишенную клеток и структурных иммуноспецифических белков, основу которого составляет коллаген и эластин, представленный в виде инъекционной формы, и культивируют для адгезии аутологичной культуры фибробластов 1-2 ч при 37°С, после чего соединяют с фармацевтически приемлемым биосовместимым биодеградируемым препаратом гиалуроновой кислоты.
5. Способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей по п.4, характеризующийся тем, что биоптат ткани выделяют из ткани органа, соответствующего поврежденному.
6. Способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей по п.4, характеризующийся тем, что биоптат ткани выделяют из кожи, или слизистой оболочки, или крайней плоти, или пуповины новорожденного, или костного мозга, или жировой ткани, или пульпы зуба.
7. Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию, содержащую аутологичную культуру фибробластов в 0,9%-ном растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-4,2·106 в 1 мл биотрансплантата, интегрированных на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице, причем объемное соотношение аутологичной культуры фибробластов, бесклеточной матрицы составляет 5:1 соответственно, а в качестве фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой бесклеточной матрицы используют препарат «Сайметра», представляющий собой переработанную донорскую кожу человека, лишенную клеток и структурных иммуноспецифических белков, основу которого составляет коллаген и эластин, представленный в виде инъекционной формы.
8. Биотрансплантат по п.7, характеризующийся тем, что он содержит суспензию аутологичной культуры фибробластов, выделенных из ткани органа, соответствующего поврежденному.
9. Биотрансплантат по п.7, характеризующийся тем, что он содержит суспензию аутологичной культуры фибробластов, выделенных из кожи, или слизистой оболочки, или крайней плоти, или пуповины новорожденного, или костного мозга, или жировой ткани, или пульпы зуба.
10. Способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей по п.7, характеризующийся тем, что биоптат ткани промывают растворами антибиотиков и антимикотика в среде ДМЕМ и переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа, инкубацию биоптата ткани проводят при 37°С 16-17 ч, полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования ДМЕМ, 10-20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина, высевают и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры клеток, которую затем трипсинизируют и культивируют, после чего среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду ДМЕМ 90% и 10% аутологичной сыворотки и выдерживают 8-14 ч при 37°С, после культивирования первичную культуру клеток собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-4,2·106 в 1 мл биотрансплантата, затем суспензию клеток интегрируют на фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой измельченной до размера 100-200 мкм бесклеточной матрице, при этом в качестве фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой бесклеточной матрицы используют препарат «Сайметра», представляющий собой переработанную донорскую кожу человека, лишенную клеток и структурных иммуноспецифических белков, основу которого составляет коллаген и эластин, представленный в виде инъекционной формы, и культивируют для адгезии аутологичной культуры фибробластов 1-2 ч при 37°С.
11. Способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей по п.10, характеризующийся тем, что биоптат ткани выделяют из ткани органа, соответствующего поврежденному.
12. Способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей по п.10, характеризующийся тем, что биоптат ткани выделяют из кожи, или слизистой оболочки, или крайней плоти, или пуповины новорожденного, или костного мозга, или жировой ткани, или пульпы зуба.
13. Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию, содержащую аутологичную культуру фибробластов в 0,9%-ном растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-5,5·106 в 1 мл биотрансплантата в растворе фармацевтически приемлемого биосовместимого биодеградируемого препарата гиалуроновой кислоты или препарата коллагена, причем объемное соотношение суспензии аутологичной культуры фибробластов и препарата гиалуроновой кислоты или препарата коллагена составляет 5:1 соответственно, а в качестве фармацевтически приемлемой биосовместимой биодеградируемой бесклеточной матрицы используют препарат «Сайметра», представляющий собой переработанную донорскую кожу человека, лишенную клеток и структурных иммуноспецифических белков, основу которого составляет коллаген и эластин, представленный в виде инъекционной формы.
14. Биотрансплантат по п.13, характеризующийся тем, что он содержит суспензию аутологичной культуры фибробластов, выделенных из ткани органа, соответствующего поврежденному.
15. Биотрансплантат по п.13, характеризующийся тем, что он содержит суспензию аутологичной культуры фибробластов, выделенных из кожи, или слизистой оболочки, или крайней плоти, или пуповины новорожденного, или костного мозга, или жировой ткани, или пульпы зуба.
16. Способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей по п.13, характеризующийся тем, что биоптат ткани промывают растворами антибиотиков и антимикотика в среде ДМЕМ и переносят в среду ДМЕМ, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина и коллагеназы II типа, инкубацию биоптата ткани проводят при 37°С 16-17 ч, полученный клеточный осадок ресуспендируют в среде для культивирования ДМЕМ, 10-20% ЭТС, 40 мкг/мл гентамицина, высевают и культивируют в течение 2-3 недель до получения первичной культуры клеток, которую затем трипсинизируют и культивируют, после чего среду с 10-20% ЭТС заменяют на среду без сыворотки или на среду ДМЕМ 90% и 10% аутологичной сыворотки и выдерживают 8-14 ч при 37°С, после культивирования первичную культуру клеток собирают с помощью 0,25% трипсин - ЭДТА, отмывают трехкратно путем центрифугирования - ресуспендирования и суспендируют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия в концентрации 0,6-5,5·106 в 1 мл биотрансплантата, после чего аутологичную культуру фибробластов соединяют с фармацевтически приемлемым биосовместимым биодеградируемым препаратом гиалуроновой кислоты или препаратом коллагена.
17. Способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей по п.16, характеризующийся тем, что биоптат ткани выделяют из ткани органа, соответствующего поврежденному.
18. Способ получения биотрансплантата для коррекции дефектов мягких тканей по п.16, характеризующийся тем, что биоптат ткани выделяют из кожи, или слизистой оболочки, или крайней плоти, или пуповины новорожденного, или костного мозга, или жировой ткани, или пульпы зуба.
19. Способ коррекции дефектов мягких тканей, характеризующийся тем, что биотрансплантат по любому из пп.1, 7, 13, представляющий собой суспензию аутологичной культуры фибробластов в количестве 3,6-60·106 клеток на курс лечения, вводят в область дефекта инъекционным путем двукратно с интервалом 3-6 недель.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009132350/15A RU2428996C2 (ru) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей (варианты), способ получения биотрансплантата (варианты) и способ коррекции дефектов мягких тканей |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009132350/15A RU2428996C2 (ru) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей (варианты), способ получения биотрансплантата (варианты) и способ коррекции дефектов мягких тканей |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009132350A RU2009132350A (ru) | 2011-03-10 |
| RU2428996C2 true RU2428996C2 (ru) | 2011-09-20 |
Family
ID=44758816
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009132350/15A RU2428996C2 (ru) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей (варианты), способ получения биотрансплантата (варианты) и способ коррекции дефектов мягких тканей |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2428996C2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8790890B2 (en) | 2011-10-03 | 2014-07-29 | Obshhestvo S Organichennoi Otvetstvennost' Yu “Vitacel” | Diagnostic method for connective tissue and its application |
| RU2567004C2 (ru) * | 2013-11-14 | 2015-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Экселлент Кволити Брендинг" | Способ выделения фибробластов, способ создания биотрансплантата на их основе (варианты) и способ регенерации тканей человека (варианты) |
| RU2578804C1 (ru) * | 2015-04-27 | 2016-03-27 | Екатерина Евгеньевна Фаустова | Способ омоложения организма пациента |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114344454A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-04-15 | 郑州市金水区蕾娜斯医疗美容门诊部 | 自体脂肪胶原蛋白注射剂的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998040027A1 (en) * | 1997-02-20 | 1998-09-17 | Gerigene Medical Corporation | Augmentation and repair of dermal, subcutaneous, and vocal cord tissue defects |
| RU2281776C1 (ru) * | 2005-08-29 | 2006-08-20 | Вадим Леонидович Зорин | Биотрансплантат и способ коррекции дефектов мягких тканей, способ получения биотрансплантата |
| CN101361990A (zh) * | 2008-09-03 | 2009-02-11 | 陕西瑞盛生物科技有限公司 | 一种双层人工皮肤及其制备方法 |
-
2009
- 2009-08-28 RU RU2009132350/15A patent/RU2428996C2/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998040027A1 (en) * | 1997-02-20 | 1998-09-17 | Gerigene Medical Corporation | Augmentation and repair of dermal, subcutaneous, and vocal cord tissue defects |
| RU2281776C1 (ru) * | 2005-08-29 | 2006-08-20 | Вадим Леонидович Зорин | Биотрансплантат и способ коррекции дефектов мягких тканей, способ получения биотрансплантата |
| CN101361990A (zh) * | 2008-09-03 | 2009-02-11 | 陕西瑞盛生物科技有限公司 | 一种双层人工皮肤及其制备方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8790890B2 (en) | 2011-10-03 | 2014-07-29 | Obshhestvo S Organichennoi Otvetstvennost' Yu “Vitacel” | Diagnostic method for connective tissue and its application |
| RU2567004C2 (ru) * | 2013-11-14 | 2015-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Экселлент Кволити Брендинг" | Способ выделения фибробластов, способ создания биотрансплантата на их основе (варианты) и способ регенерации тканей человека (варианты) |
| RU2578804C1 (ru) * | 2015-04-27 | 2016-03-27 | Екатерина Евгеньевна Фаустова | Способ омоложения организма пациента |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2009132350A (ru) | 2011-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11369716B2 (en) | Reparative cell isolation and delivery | |
| JP6687757B2 (ja) | ３ｄ軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法 | |
| TWI283707B (en) | Use of adipose tissue-derived stromal cells for chondrocyte differentiation and cartilage repair | |
| US11801331B2 (en) | Composition for cartilage regeneration and preparing thereof | |
| CN113318274A (zh) | 一种水凝胶及其制备方法和应用 | |
| JP2003517858A (ja) | 老齢関連の軟組織の欠陥の増強と修復 | |
| CN103585177A (zh) | 间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞的用途 | |
| CN108865986B (zh) | 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 | |
| MXPA04011043A (es) | Tratamientos con fibrolasto antologo. | |
| CN103768656A (zh) | 同种异体骨髓间充质干细胞构建的组织工程骨及其应用 | |
| CN108057116A (zh) | 干细胞组合物在皮肤损伤治疗药物中的应用 | |
| CN112870445A (zh) | 一种软组织修复材料的制备方法及应用 | |
| RU2428996C2 (ru) | Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей (варианты), способ получения биотрансплантата (варианты) и способ коррекции дефектов мягких тканей | |
| KR102104120B1 (ko) | 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 기반 3d 바이오프린팅 조직체 및 이의 이용 | |
| US20190015551A1 (en) | Construct for preventing immunological rejection generated when used in transplants, and method for using collagen in a gel state, in the form of dry lyophilised spongy mouldings and 3d matrices | |
| CN109771694A (zh) | 自组装多肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备方法及应用 | |
| CN104232570B (zh) | 建立单克隆间充质干细胞的方法及其应用 | |
| RU2418571C1 (ru) | Биотрансплантат, способ его получения и способ лечения заболеваний пародонта | |
| CN108066750A (zh) | 干细胞及其分泌物用于治疗皮肤烧烫伤的新用途 | |
| KR20160046970A (ko) | 지지체 기반 트립신 프리 세포 스탬프 시스템을 이용한 세포 배양방법 | |
| RU2281776C1 (ru) | Биотрансплантат и способ коррекции дефектов мягких тканей, способ получения биотрансплантата | |
| US20100104641A1 (en) | Therapeutic composition, and use of a cell-free substance | |
| Asad et al. | Three-dimensional cultures of gingival fibroblasts on fibrin-based scaffolds for gingival augmentation: A proof-of-concept study | |
| CN108057131A (zh) | 一种含有干细胞的新型试剂盒 | |
| CN110755689B (zh) | 一种毛囊的三维重建方法、重建方法制得的毛囊 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20150508 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: SUB-LICENCE Effective date: 20150714 |
|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20210617 |