TW200936139A - Method for cancer therapy - Google Patents
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Description
200936139 六、發明說明： 【先前技術】 癌症仍然為全世界範圍内死亡率及發病率 儘管最近可為患者提供存活錢 ’、 大吝齡眚舻睹由工 物巳取件成功。對於 大多數實體腫瘤而言，預後較差時腫瘤復發及轉移之 仍然很^當前可用之藥物包括細胞毒性化學治療藥物、 抗血管生成劑絲向劑。大多數當前可用抗癌藥物所達成 之臨床益處由於出現抗藥性或侵襲多種器官之不可耐受之 毒性（例如’血液學毒性、肝毒性、腎毒性、及神經毒性） 而受到限制。 癌症係特徵在於不受控制增殖之疾病。對於引起癌症之 信號的瞭解已取得進展。在發育及組織重建期間，多能幹 細胞可用作分化細胞以產生非增殖性專用細胞類型之來 源。該等幹細胞之特徵與腫瘤之快速不受控制增殖之間的 聯繫已經很清楚^ Notch途徑係主要的發育信號轉導轴之 一 °在成人多能幹細胞發育及自我更新期間，N〇tch信號 轉導藉由介導祖細胞分化來調節細胞命運。Notch起將祖 細胞保持在多能快速增殖狀態之作用。Notch途徑在發育 分化及血細胞生成及淋巴細胞生成過程中起重要作用。其 與胚胎發育期間造血幹細胞之產生、增殖及分化有關。
Notch基因擴增、染色體移位或突變導致N〇tch信號轉導 提高’由此藉由將腫瘤細胞保持在類幹細胞增殖狀態而賦 予腫瘤生長益處。因此，Notch信號轉導途徑突變與惡性 腫瘤發病之間存在非常強之相關性。 137090.doc 200936139 由哺乳動物中之四種同系物（Notchl、Notch2、 Notch3、及Notch4)表示之Notch蛋白與配體§_樣1、§_樣 3、δ·樣4、Jagged 1及Jagged 2相互作用。在與配體結合 後，Notch受體藉由包括膜内裂解（藉由γ_分泌酶調節）在内 之一系列蛋白水解裂解事件激活。該經分泌酶處理之 Notch變成被稱為細胞内亞單元（icn)之具活性形式。ICN 移位至細胞核並構成大轉錄複合物之一部分，該大轉錄複 合物包括直接改變重要增殖及分化特異性基因之表現的 CSL(CBF-1、無毛阻抑基因（suppress〇r of hairless)、Lag) 轉錄調節子。 另外，γ·分泌酶參與數種其他蛋白（包括澱粉樣蛋白前體 [ΑΡΡ]、CD44幹細胞標記、及HER4 [ErbB4])之膜内蛋白水 解處理。經由抑制γ-分泌酶來阻斷]^〇化11信號轉導可在活 體内於人類癌細胞中產生生長較為緩慢之低轉化表現型。 重要的是，該表現型於不存在進一步投藥下仍然穩定。該 類型新賴治療方法具有使癌症成為更易處理之疾病的潛力 且無傳統細胞毒性藥物之強烈副作用。 2,2-一甲基-N-((S)-6-側氧基·6,7-二氫 _5H_二苯并[b，d]氮 呼·7-基）-；^’-(2,2,3,3,3-五氟_丙基>丙二醯胺（1)揭示於_ 2005/023772中’其可用於治療阿兹海默氏症（Alzheimer，s disease) ° I37090.doc 200936139
因此，當前需要開發新穎藥物/化學治療方案以進一步 改良可用於癌症患者之治療。 【發明内容】 本發明提供治療患有癌症之患者的方法，其包含向該患 者投與治療有效量的具有下式之化合物（1)或其醫藥上可接 受之鹽：
本發明亦提供治療患有癌症之患者的方法，其包人向贫 患者投與治療有效量的具有下式之化合物（1)或其醫藥上< 接受之鹽： 137090.doc 200936139
其中化合物（1)係在21天週期之第1、2、3、8、9及10天 ❹ 以約400 ng-hr/ml至約9000 ng-hr/ml的量每天投與一次。 本發明進一步提供治療患有癌症之患者的方法，其包含 向該患者投與治療有效量的具有下式之化合物（丨）或其醫藥 上可接受之鹽：
其中化合物（1)係在21天週期之第1-7天以約4〇〇 ng_hr/ml 至約9000 ng_hr/mi的量每天投與一次。 本發月還進一步提供包含一或多種口服單位劑型之套 組，每一單位含有約3 mg至約3〇〇 mg具有下式之化合物 (1)或其醫藥上可接受之鹽： 137090.doc 200936139
❹ 本發明還進-步提供上文所述式⑴化合物或其醫藥上 可接又之鹽用以製備用於治療癌症之藥劑的料，該癌症 尤其是諸如非小細胞肺癌、結腸直腸癌、胰腺癌、結： 癌、乳癌或前列腺癌等實體腫瘤。 本發明還進—步提供上文所述式⑴化合物或其醫藥上 可接又之鹽用以製備用於治療癌症之藥劑的用★，該癌症 尤其是諸如非小細胞肺癌、結腸直腸癌、胰腺癌、結： 癌、乳癌或前列腺癌等實體腫瘤，該用途包含按照本文 述之任何特定方法、劑量方案及/或治療週期 ^ 化合物或其醫藥上可接受之鹽。 -式(1) 本發明另外提供製備擬用於治療癌症之藥劑的方法，s 尤其是諸如非小細胞肺癌、結腸直腸癌、騰腺癌：： 腸癌、礼癌或前列腺癌等實體腫瘤，該方法之 用式⑴化合物或其醫藥上可接受之鹽。 於使 本發明另外提供製備擬用於治療癌症之藥劑的方 = 癌症尤其是諸如非小細胞肺癌、結腸直腸癌 、該 nS. jp 碼腺癌、結 腸癌、礼癌或前列腺癌等實體腫瘤，該方法 、符徵在於按 137090.doc 200936139 照本文所述之任何特定方法、劑量方案及/或治療週期來 使用式（1)化合物或其醫藥上可接受之鹽。 本發明最後提供本文所述之特定方法及用途其中化合 物⑴係與治療有效量之吉西他濱（以咖減狀）組合使用， 其較佳用於治療胰腺癌。 【實施方式】 • 本發明提供治療患有癌症之患者的新穎方法，其包含向 該患者投與治療有效量的化合物⑴或其醫藥上可接受之 © 鹽。化合物⑴係γ·分泌酶之強效及選擇性抑制劑，其可在 腫瘤細胞中產生Notch信號轉導抑制活性。 本文所用之以下術語具有下述含義。 : 術語”抗踵瘤"意指抑制或預防惡性細胞發育、成熟或增 殖。 術語"曲線下面積"（AUC)係血漿中之藥物濃度相對於時 間之圖中的曲線下面積。AUC表示藉由身體所吸收之藥物 φ ㈣量，其與吸收速率無關。此可將藥物之治療監測。 量測患者血漿中之藥物濃度並計算康可用於指導該藥物 之劑量。AUC可用於瞭解經一段時間間隔之平均濃度， . AUC/t。通常將Auc表示為（質量*時間/體積），例如 hr/ml。 術語”醫藥上可接受之，，（諸如醫藥上可接受之載劑、賦 形劑等）意指藥琴上可接受且料投與特定化合物之個 體實質上無毒。術語”醫藥上可接受之鹽"係指保留本發明 化合物之生物學效力及特性且可自適宜無毒有機或無機酸 137090.doc 200936139 或有機或無機鹼形成之習用酸加成鹽或鹼加成鹽。酸加成 鹽樣品包括彼等衍生自諸如氫氣酸、氫溴酸、氫破酸、硫 酸、胺基磺酸、磷酸及硝酸等無機酸之鹽，以及彼等衍生 自諸如對曱基苯磺酸、水楊酸、甲烷磺酸、草酸、琥珀 酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、富馬酸及諸如此類等有機酸 之鹽。鹼加成鹽樣品包括彼等衍生自氫氧化銨、氫氧化 鉀、氫氧化鈉及氫氧化四級銨（例如，氫氧化四曱基銨）之 鹽。術語化合物之”醫藥上可接受之酯”意指具有羧基之以 習用方式酯化之化合物，該等酯保留化合物之生物學效力 及特性。將醫藥化合物（即’藥物）化學修飾成鹽係藥物化 學豕所熟知的用來獲得改良之化合物物理及化學穩定性、 吸濕性及溶解性之技術❶參見，例如，H Ansei等人，醫 藥劑型與藥物遞送系統（Pharmaceutical Dosage Forms and
Drug Delivery Systems)(第 6版，1995)，第 196頁及第 1456- 1457 頁。 術語"前藥”係指經歷轉化之後可呈現藥理學效果之化合 物°對藥物進行化學修飾以解決醫藥問題亦被稱為"藥物 潛效化”。藥物潛效化係對具有生物活性之化合物進行化 學修飾以形成新化合物，該新化合物受到活體内酶攻擊後 會釋放母體化合物。該母體化合物之化學改變致使物理化 學特性態樣的變化將對吸收、分佈及酶代謝造成影響。藥 物潛效化之定義亦已延伸至包括母體化合物之非酶再生。 再生作為水解、離解及其他不必由酶介導之反應之結果發 生。術語前藥、經潛效化藥物及生物可逆衍生物可互換使 137090.doc -10- 200936139 用。據推斷，潛效化意味著與活體内生物活性母體分子之 再生有關之時間滯後要素或時間部分。術語前藥通常包括 經潛效化之藥物衍生物以及彼等在投與後會轉變成與受體 結合之實際物質的物質。術語前藥係經歷生物轉化之後可 呈現藥理學作用之藥劑的通稱。 術語"治療有效量"意指在投與至患者後可有效產生期望 治療效果以（例如）阻止癌性腫瘤生長或導致其收縮之藥物 的量。與化合物（1)組合投與之吉西他濱的治療有效量較佳 Ο 意指如下文實例7中所揭示之特定劑量及時間表。 本文所用之術語"組合投與"意指同時或依序投與。 化合物"吉西他濱"意指4-胺基·ΐ-[3,3-二氟-4·羥基-5-(羥 基曱基）-四氫呋喃-2-基]-1丑-嘧啶-2-酮且例如以<3emzarTM 出售。 術語"治療指數”在選擇用於臨床試驗之抗癌劑中係重要 參數。治療指數考慮到抗癌劑之功效、藥物代謝動力學、 代謝及生物利用性。參見，例如，j. Natl. Cancer Inst 81 ❹ w (13): 988-94(1989年 7 月 5 日）。 術語”腫瘤控制"意指可量測損傷之垂直直徑自上一次量 測以來之增加不超過25%或以上。參見，例如，世界衛生 組織（World Health Organization) ("WHO”）癌症治療之報告 結果手冊（Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment)，日内瓦（Geneva) (1979)。 術語"實體腫瘤"意指非小細胞肺癌（NSCLC)、結腸直腸 癌、騰腺癌、結腸癌、乳癌、前列腺癌及諸如此類。 137090.doc 200936139 所用之"化合物（1)"之含義 整篇說明書及申請專利範圍中 涵蓋具有下式之特定化合物
❹ 以及其醫藥上可接受之鹽。 本發明提供治療患有癌症之患者 者投與治療有效量的具tie 法，其包含向該患 受之鹽：有效量的具有下式之化合物⑴或其醫藥上可接
化合物（1)係γ-分泌 酶係造成Notch受體 增、染色體移位、或 酶之強效及選擇性抑制劑，該丫_分泌 =解及激活之重要酶。由於基因擴 突變而引起之N〇tch信號轉導失調與 J37090.doc •12- 200936139 包括白血病、髓母細胞瘤及膠質母細胞瘤、乳癌、頭頸癌 及騰腺癌在内之多種類型癌症有關。臨床前證據已顯示， 通過抑制γ-分泌酶之蛋白水解活性來阻斷Notch信號轉導 可阻止小鼠異種移植物模型中之腫瘤生長。 化合物（1)之治療有效量係在投與至患者後可有效產生 期望治療效果以阻止癌性腫瘤生長或導致其收縮的量。較 佳地’化合物（1)之治療有效量係約4〇〇 ng-hr/ml至約9000 ng-hr/ml ’ 更佳為約 11〇〇 ng-hr/ml至約 4100 ng-hr/ml，且 最佳為約 1380 ng-hr/ml至約 2330 ng-hr/ml。 在一個實施例中，化合物（1)之治療有效量係約4〇〇 ng- hr/ml 至約 9000 ng-hr/m卜更佳為約 11〇〇 ng-hr/ml 至約 4100 ng-hr/ml ’ 且最佳為約 1380 ng-hr/ml至約 2330 ng-hr/ml， 投與長達約21天。 在另一實施例中，化合物係在21天週期之第1、2、 3、8、9及10天每天投與一次。在一較佳實施例中，化合 物⑴係在21天週期之第1、2、3、8、9及10天以約400 ng-hr/ml至約9000 ng-hr/ml的量每天投與一次。 在再一實施例中’化合物（1)係在21天週期之第1_7天每 天投與一次。在一較佳實施例中，化合物（1)係在21天週期 之第1-7天以約400 ng_hr/mi至約9〇〇〇 ng_hr/ml的量每天投 與一次。 較佳地，化合物（1)係呈醫藥口服單位劑型。本發明方 法亦可包含使患者額外接受放射療法。 在一特定實施例中，本發明提供治療患有癌症之患者的 137090.doc 200936139 方法其包含向該患者投與治療有效量的具有下气之化人 物（1)或其醫藥上可接受之鹽：
其中化合物（1)係在21天週期之第1、2、3、8、9及1〇天 以約400 ng_hr/ml至約9000 ng_hr/l]Ql的量每天投與一次， 只要癌症仍在控制之下便重複。 在另一特定實施例中，本發明提供治療患有癌症之患者 的方法，其包含向該患者投與治療有效量的具有下式之化 合物（1)或其醫藥上可接受之鹽：
其中化合物（1)係在21天週期之第17天以約4〇〇 ng_hr/ml 137090.doc •14· 200936139 至約9000 ng-hr/ml的量每天投與一次，只要癌症仍在控制 之下便重複。 在另一特定實施例中’本發明提供化合物（1)或其醫藥 上可接受之鹽的用途，
其係用以製備用於治療癌症（尤其是實體腫瘤）之藥劑。 在另一特定實施例中，本發明提供上文所述化合物（1) 的用途’其中該治療包含投與治療有效量之約400 ng-hr/ml 至約 9000 ng-hr/ml的 化合物 （1) 。 Q 在另一特定實施例中，本發明提供上文所述化合物（1) 的用途’其中化合物（1)之治療有效量係約11〇〇 ng-hr/ml至 約 4100 ng-hr/ml。 ’ 在另一特定實施例中’本發明提供上文所述化合物（1) 的用途，其中化合物（1)之治療有效量係約1380 ng-hr/ml至 約 2330 ng-hr/ml。 在另一特定實施例中，本發明提供上文所述化合物〇) 的用途，其中化合物（1)之治療有效量係約400 ng-hr/ml至 137090.doc 15· 200936139 約9000 ng-hr/m卜投與長達約21天。 在另一特定實施例中，本發明提供上文所述化合物〇) 的用途’其中化合物（丨）之治療有效量係約11〇〇叫—心/…至 約4100 ng-hr/m卜投與長達約21天。 在另一特定實施例中，本發明提供上文所述化合物（1) 的用途’其中化合物（1)之治療有效量係約138〇叫-匕/…至 約2330 ng-hr/ml，投與長達約21天。 在另一特定實施例中，本發明提供上文所述化合物（1) 的用途’其中化合物（〇係在21天週期之第1、2、3、8、9 及10天每天投與一次。 在另一特定實施例中，本發明提供上文所述化合物（1) 的用途’其中化合物（1)係在21天週期之第1、2、3、8、9 及10天以約400 ng-hr/mi至約9〇〇〇 ng_hr/ml的量每天投與 一次。 在另一特定實施例中’本發明提供上文所述化合物（1) 的用途’其中化合物（1)係在21天週期之第1·7天每天投與 一次0 在另一特定實施例中，本發明提供上文所述化合物（1) 的用途’其中化合物係在21天週期之第1_7天以約4〇〇 ng-hr/ml至約9000 ng-hr/ml的量每天投與一次。 在另一特定實施例中，本發明提供上文所述化合物（1) 的用途，其中化合物（1)係呈醫藥口服單位劑型。 在另一特定實施例中，本發明提供上文所述化合物（1) 的用途，其包含使患者额外接受放射療法。 137090.doc -16- 200936139 在另一特定實施例中，本發明提供化合物（1)或其醫藥 上可接受之鹽的用途，
❹ 其係用以製備用於治療癌症（尤其是實體腫瘤）之藥劑 、9及10天以 其中該治療包含在21天週期之第1、2、 約400 ng-hiVml至約9000 ng_hr/m丨的量每天投與一次化合 物（1)。 在另一特定實施例中，本發明提供化合物（1)或其醫藥 上可接受之鹽的用途’ ❹
其係用以製備用於治療癌症（尤其是實體腫瘤）之藥劑， 137090.doc 200936139 其中該治療包含在21天週期之第！ _7天以約4〇〇 ng hr/mi至 約9000 ng-hr/ml的量每天投與一次化合物（j)。 在再一特定實施例中，本發明提供製備擬用於治療癌症 (尤其是實體腫瘤）之藥劑的方法，該方法之特徵在於式^ 化合物
係以治療有效量使用。 在又一特定實施例中，本發明提供如上所述之方法，其 中化合物（1)之治療有效量係約4〇〇 ng_hr/ml至約9〇〇〇 ng· hr/ml。 在又一特定實施例中，本發明提供如上所述之方法，其 中化合物（1)之治療有效量係約1100 ng_hr/ml至約41〇〇 ng_ hr/ml。 在又一特定實施例中，本發明提供如上所述之方法，其 中化合物（1)之治療有效量係約1380 ng_hr/ml至約2330 ng_ hr/ml。 在又一特定實施例中’本發明提供如上所述之方法，其 中化合物（1)之治療有效量係約400 ng_hr/ml至約9〇〇〇叫· 137090.doc •18- 200936139 h"ml，投與長達約21天。 在又—特定實施例中，本發明提供如上所述之方法，其 中化合物（1)之治療有效量係約1100 ng-hr/ml至約4100 ng-ht/ml，投與長達約2 i天。 在又一特定實施例中’本發明提供如上所述之方法，其 中化合物（1)之治療有效量係約138〇 ng hr/ml至約233〇叫_ hr/ml，投與長達約21天。 在又一特定實施例中，本發明提供如上所述之方法，其 ❹中化合物⑴係在21天週期之第1、2、3、8、9及10天每天 投與一次。 在又一特定實施例中，本發明提供如上所述之方法，其 中化合物（1)係在21天週期之第卜2、3、8、9及1〇天以約 400 ng-hr/mi至約9〇〇〇 ng_hr/ml的量每天投與一次。 在又一特定實施例中，本發明提供如上所述之方法，其 中化合物⑴係在21天週期之第1_7天每天投與一次。
在又-特定實施例中’本發明提供如上所述之方法其 中化合物⑴係在21天週期之第17天以約彻吵副至約 9000 ng-hr/ml的量每天投與—次。 在又一特定實施例中，本發明提供如上所述之方法，其 中化合物（1)係呈醫藥σ服單位劑型。 在又一特定實施例中，本發明提供如上所述之方法，里 包含使患者額外接受放射療法。 (尤t實:2施例令，本發明提供製備擬用於治療癌症 (尤其疋^瘤）之藥劑的方法，該方法之特徵在於式⑴ 137090.doc •19· 200936139 化合物
❷ 或其醫藥上可接受之鹽係在21天週期之第1、2、3、8、 9及1〇天以約彻ng'hr/ml至約9_ ng-hr/ml的量每天使用 一次。 在又-特定實施例中，本發明提供製備擬用於治療癌症 (二其物是實體腫瘤)之藥劑的方法，該方法之特徵在於式⑴
或其醫藥上可接受之鹽係在21天週期之第17天以約4〇〇 ng-hr/ml至約9000 ng_hr/ml的量每天使用一次。 137090.doc -20- 200936139 途，其中^實〜例中，本發明提供如上所述之方法及用 在兮音。物(1)係與有效量之吉西他濱組合投與。 在該實施例巾，人 製備用於治療騰腺癌之^與吉西他濱之組合較佳用以 位劑實發明提供包含-或多種口服單 之化合物〇)或其醫藥上至約300 mg*有下式
。在該實施例中’該套組可包含含有足夠數量單位之口服 ❹ 單位劑型以使患者可經約21天期間每天投與約则mg化合 物（1)或其醫藥上可接受之鹽。 在該實施例中，該套組可進—步包含含有有效量之吉西 他濱的單位劑型。 醫師可端視患者需要及患者對治療之反應將每—組份之 劑量篁調整至低於或高於本文所述者。可按照由醫師根據 患者需要所確定之任何劑量時間表來投與劑量。例如，該 兩種組份中每一者之劑量可以單次或分開劑量經數天期 137090.doc •21 - 200936139 間、或交替的每天時間表來投與。 較佳地，治療時間表每二十—天或毒性恢復容許便重 複人要腫瘤在控制之下且患者耐受該方案或腫瘤消 退較佳地’該等治療週期重複總共多達約八個週期。 本發明方法可根據下文所陳述之實例來實施。呈現該等 實例係出於例示而非限制本發明化合物及組合物之製備的 目的0 ❹ 實例 實例1 在裸小鼠人類臚瘌異種移植物中每天鳗口投與一次化合物 (1)之抗腫痛活性的幅度》 在先前抗腫瘤功效研究中，當將化合物（1)經口投與至 具有A549非小細胞肺癌（NSCLC)異種移植物之小鼠時，每 天給與一次或兩次3、1〇、或3〇 mg/kg劑量持續14 (14+/7-) 或21天可達成顯著且持續之腫瘤生長抑制，與經媒劑治療 之對照動物相比’ ％腫瘤生長抑制（TGi)在66-83%範圍 内。每天投與一次化合物（1)與用14+/7-或21天治療時間表 每天兩次治療同樣有效且無劑量依賴性。而且，較短投藥 持續時間（14+/7-)與投藥完整21天在抑制A549腫瘤生長態 樣同樣有效。 為研究化合物（1)之抗腫瘤活性的幅度，在兩種結腸直 腸癌（Lovo及HCT116)及兩種非小細胞肺癌（NSCLC)(Calu-6 及H460a)異種移植物模型中實施四項額外功效研究。儘管 並不瞭解可能促成功效之參數，但吾人認為Notch下游乾 137090.doc •22· 200936139 標Hes-l及Hey-l之表現表明活性Notch信號轉導途徑。此 外，據報導Ras癌基因表現在Notch激活中起作用。基於 Notch配體、受體及下游靶標之内在基因表現分佈曲線， 預測Lovo、HCT116及Calu-6腫瘤模型對化合物（1)介導之 生長抑制敏感，而預測H460a模型不敏感》例如，Lovo結 腸直腸癌細胞系與已顯示對化合物（1)介導之腫瘤生長抑制 敏感之A549異種移植物模型具有類似基因表現，其中 Notch配體Jag 1及DNER、Notch受體1、2及3、及下游靶標 © Hes-l及Hey-l被表現。NSCLC細胞系Calu-6及H460a具有 類似配體及受體基因分佈曲線，其中Notch 1及Notch 3二 者均高度表現。該兩種細胞系亦具有提高之Hes-1、Hey-1 及NUMB表現。而且，所有該等細胞系皆具有突變體K- ras ° 在當前研究中，將化合物（1)經口投與至具有定殖皮下 (sc) Lovo、Calu-6、HCT116、或H460a腫瘤之小鼠中，持 續長達三週。化合物（1)係以3 mg/kg及10 mg/kg每天一次 (qd)持續21天、或以30 mg/kg及60 mg/kg按間歇時間表（7 天服用，14天停用，且隨後7天服用（7+/14-/7+))來投藥。 材料及方法 動物 使用自查爾斯河實驗室（Charles River Laboratories) (Wilmington, ΜΑ)獲得之約13-14週齡且重約23-25克之雌 性裸小鼠（10只/組）。藉由大體觀察實驗動物及藉由分析圈 養在共用搁板架上之哨兵動物之血液樣品每天測定一次所 137090.doc -23- 200936139 有動物之健康狀況。在實驗使用之前，經最少72小時使所 有動物適應新環境並自任何航運相關壓力恢復過來。隨意 提供高壓滅菌水及輻照食品[5058-ms Pico飼料（小 鼠）Purina，Richmond, IN]，並將動物保持12小時光照及黑 暗循環。籠子、墊料及水瓶在使用前皆經高壓滅菌且每週 更換一次。 腫瘤
Lovo人類結腸直腸、Calu-6 NSCLC及HCT116結腸直勝 © 細胞係購自 ATCC (Manassas，VA)。H460a NSCLC細胞由
Dr. Jack Roth(MD安德森醫學中心（MD Anderson Medical Center)，Houston，TX)贈與。Lovo細胞係在 FI2K培養基 中培養，Calu-6及H460a係在杜貝克改良必需培養基 (Dulbecco’s Modified Essential Medium) (DMEM)中生長， 且HCT116細胞係在McCoy、5A培養基中生長。所有培養 基皆補充有10% (v/v) FBS及1% (v/v) 200 nM L-麩胺醯 胺。分別在 9/22/06、9/22/06、9/26/06、及 9/29/06針對每 只小鼠將存於0.2ml體積PBS中之5χl06個Lovo、3xl06個 Calu-6或HCT116、或lxlO7個H460a細胞經皮下（sc)植入小 .鼠右後側腹中。 測試劑 如下文所述，將化合物（1)調配成供經口（po)投與之懸浮 液，該懸浮液存於1.0%羥丙纖維素（Klucel)水溶液與0.2% Tween-80 中。 137090.doc •24- 200936139 醫藥調配物 成份 劑量 化合物(1) 7.5 mg/ml 化合物(1) 3.73 mg/ml 化合物(1) 1.25 mg/ml 化合物(1) 0.375 mg/ml 將調配之化合物及媒劑於4°C下儲存並每週製備一次。
在投與之前將化合物（1)劇烈混合。 随機化 使植入Lovo及Calu-6異種移植物之小鼠在植入後第19天 隨機化，使植入HCT116異種移植物之小鼠在第20天隨機 化，而使植入H460a異種移植物之小鼠在植入後第12天隨 機化。按照腫瘤體積使所有小鼠隨機化，由此所有組皆具 有約100-180 mm3的類似開始平均腫瘤體積。 研究設計 該報告中之所有4項活體内研究之研究設計皆相同。劑 量組列示如下。 研究設計 组 治療 制量 時間表 1 媒劑 qd><21 天 2 化合物(1) 3 mg/kg qdx21天 3 化合物(1) 10 mg/kg qdx21天 4 化合物(1) 30 mg/kg qdx7 天 * 5 化合物(1) 60 mg/kg qd><7 天 * *除在早期中斷之H460a功效研究外均接受兩輪7天治療。 137090.doc -25- 200936139 治療 對於Lovo及Calu-6腫瘤研究，治療開始於1〇/Π/〇6(腫瘤 細胞植入後第19天），對於HCT116研究開始於10/16/06(腫 瘤細胞植入後第20天），且對於H460a研究開始於1〇/11/〇6 (腫瘤細胞植入後第12天）。媒劑或化合物（1)懸浮液係使用 無菌1 cc注射器及18號強飼針（0.2 ml/動物）每天一次（qd)持 續21天、或使用間歇時間表（7天服用，14天停用，且隨後 7天服用（7+/14-/7+))來投藥❶對於Lovo及Calu-6研究，為 期21天之投藥在腫瘤細胞植入後第40天結束。對於間歇投 藥’在第26天結束之治療在第40天重新開始，並於第47天 結束。對於HCT116研究’為期21天之投藥在腫瘤細胞植 入後第42天結束。在第27天結束之間歇投藥在第42天重新 開始’並於第49天結束。對於H460a研究，為期21天之投 藥在腫瘤細胞植入後第27天提早結束，而對於間歇投藥， 療在第19天結束’且沒有重新開始（由於無功效）。 〇 病理學/屍《I剖檢 在研究結束時’對 Eff #1137 (Lovo)、Eff #1147 (HCT116)、及Eff #1148 (H460a)實施屍體剖檢。在實施無 痛致死以評估腫瘤細胞增殖之前2 hr，給動物注射存於】 ml無菌水中之1 mg BrdU(溴脫氧尿苷）。藉由引入c〇2隨後 實施頸椎脫位術使動物無痛致死。如下所述採集來自經媒 劑治療及經選擇化合物（1)治療之組的腫瘤並在鋅_福爾馬 林（formalin)中固定過夜、處理、經石蠟包埋，並進行組 137090.doc • 26 · 200936139 織病理學切片（用於形態學評估之蘇木素及曙紅（Η & E)染 色、及BrdU染色）。 屍艘剖檢/病理學概述 研究編號. 組 劑量/頻率 動物編號 1137 媒劑 qd><21 天 101-104 1137 化合物(1) 10 mg/kg qd><21 天 201-204 1137 化合物(1) 60 mg/kgx7 天 301-304 1147 媒劑 qd><21 天 101-104 1147 化合物(1) 10 mg/kg qd><21 天 201-204 1147 化合物(1) 60 mg/kgx7 天 301-304 1148 媒劑 qd><21 天 101-104 1148 化合物(1) 10 mg/kg qd><21 天 201-204 監測 腫瘤量測及小鼠重量係每週測定兩次。在整個實驗期間 所有動物皆單獨跟蹤。 計算及統計學分析 利用下式將重量減輕生動地表示成組平均體重之百分比 變化： ((W-W0)/W0)xlOO， 其中W表示特定天時治療組之平均體重，且WG表示治療 開始時相同治療組之平均體重。最大重量減輕亦利用上式 來表示，且表示在整個實驗期間之任何時間所觀察到之特 定組的最大體重減輕百分比。 將功效數據生動地表示成平均腫瘤體積土平均值之標準 誤差（SEM)。利用下式將治療組之腫瘤體積表示成對照組 137090.doc -27- 200936139 腫瘤體積之百分比（％ τ/c): 10〇x((T-T〇)/(C-C〇)) ’ 其中T表示在實驗期間之特定天時治療組之平均腫瘤體 積’ τ〇表示在治療第一天相同治療組之平均腫瘤體積；c 表示在實驗期間之特定天時對照組之平均腫瘤體積，且Co 表示在治療第一天相同治療組之平均腫瘤體積。 腫瘤體積（以立方毫米計）係利用橢圓體公式來計算： (Dx(d2))/2， 其中D表示腫瘤之較大直徑，且d表示較小直徑。 在一些情形下’利用下式來計算腫瘤消退及/或腫瘤體 積之百分比變化： ((Τ_Τ〇)/Τ〇)χ100， 其中Τ表示特定天時治療組之平均腫瘤體積，且Tg表示 治療開始時相同治療組之平均腫瘤體積。 藉由等級和檢驗及單因素方差分析（〇ne Way Anova)及 事後邦弗朗尼 t-檢驗（p0st_h〇c Bonferroni t-test) (SigmaSUt，2·0版本，Jandel Scientific，San Francisc〇， CA)來測定統計學分析。當概率值（p)係^ 〇5時，認為組 間差異顯著。 結果 先前已發現，在當前研究組中測試之化合物（1)之劑量 及方案在裸小鼠中具有良好耐受性。如吾人所預期，在當 前研究中未注意到體重減輕或其他毒性臨床體徵。 备 功效 137090.doc -28- 200936139 在當前研究組中，化合物⑴係以3 mg/kg&1〇 mg/kg每 天：人（叫）持續21天、或以30 mg/kg及60 mg/kg按間歇時 間表（7天服用，Η天停用，且隨後7天服用（7+/14_/7+))來 測試。當用化合物（1)按21天或7+/14-/7+時間表來治療具 有L〇v〇結腸直腸異種移植物之裸小鼠時，腫瘤生長顯著受 抑制’在第47天觀察到最大腫瘤生長抑制，對於21天治療 組（21 +/7-)其為治療之最後一天後7天，或對於7天治療 (7+/14-/7+)之第2輪其為治療結束。與經媒劑治療之對照 ® 相比，3及10 mg/kg qdx21天化合物（1)劑量分別達成4〇0/〇 (P=〇.136)及 83% (pSO.OOl) TGI，而間歇投藥 30 及 60 mg/kg 化合物（1)劑量獲得 59% (p=〇.〇21)及 85% (p=〇.〇〇l) TGI。 與Lovo結腸直腸腫瘤模型中化合物（1)之抗腫瘤活性相 比’ Calu-6 NSCLC模型中之腫瘤生長抑制減弱。在第47天 達成最大腫瘤生長抑制，對於21天治療組（21+/7-)其為治 療之最後一天後7天，且對於7天治療（7+/14-/7+)之第2輪 _ 其為治療結束。在3 mg/kg最低劑量下觀察到最大抗腫瘤 效果’其將腫瘤生長抑制59% (ρ=〇.〇ιι)，而10 mg/kg僅具 有42%之TGI且與經媒劑治療之對照小鼠相比在統計學上 不顯著（p=0.083p在兩個週期之7天治療後，3〇 mg/kg劑 量未顯著抑制Calu-6腫瘤生長（34% TGI，p=〇.179)，而將劑 量加倍至60 mg/kg化合物（1)則達成52% TGI (p=0.035)〇 HCT116結腸直腸模型中化合物（1)介導之腫瘤生長抑制 與Lovo結腸直腸模型中者非常類似，所有劑量及時間表皆 鑒定出顯著抗腫瘤活性。在21天方案之第42天（21天治療 137090.doc 29- 200936139 結束）、及在7+/14-/7+方案之第53天（在第二次7天治療結 束後3天）注意到最大抗腫瘤活性。與媒劑對照相比，在用 3 mg/kg化合物（1)實施為期21天的連續每天治療結束時， HCT116結腸直腸腫瘤之生長被抑制85% (p^O.OOl)，且每 天一次 10 mg/kg劑量獲得 76% TGI (p=0.003)。用 30 mg/kg 及60 mg/kg化合物（1)實施兩輪7天治療分別產生63% (ρ=0·016)及 90% (pso ooi)之TGI。 H460a NSCLC模型證實完全抵抗化合物（1)介導之腫瘤 © 生長抑制。由於在所有劑量下皆無功效，故對具有H460異 種移植物之小鼠的治療提早停止（在僅2週後）。 與A549 NSCLC異種移植物模型中之先前功效研究類 似，在當前研究中注意到每天投藥時腫瘤生長抑制通常不 存在劑量反應。例如，當將3或10 mg/kg化合物（1)投藥至 具有HCT116腫瘤之小鼠並持續21天時，所得％ TGI不與劑 量成正比，分別為85%及76% TGI。當將相同劑量之化合 物（1)投與至具有Cain-6腫瘤之小鼠並持續21天時，與較低 W 劑量相比，較高劑量之％ TGI較小（42% TGI相對於59% TGI)。 . 通過向具有定殖腫瘤之裸小鼠經口投與γ-分泌酶抑制劑 化合物（1)來破壞Notch信號轉導可達成抗腫瘤功效。早期 發現已顯示，化合物（1)可有效地長期且持續抑制植入於裸 小鼠中之A549 NSCLC腫瘤。開始額外活體内研究以研究 化合物（1)之抗通瘤功效的幅度。Lovo結腸直腸癌、Calu-6 NSCLC、HCT116結腸直腸癌及H460a NSCLC經選擇以在 137090.doc -30- 200936139 基於内源號轉導證據之活體内異種移植物研究令 實施測試。化合物⑴在四種腫_型中之三種中具有效力 且顯著抑制腫瘤生長，並且無毒性。
在當前功效研究組中，以兩種不同方案來測試化合物 ⑴之兩種劑量的每-者：3及1〇 mg/kg叫持續21天或間 歇給與30及60 mg/kg (7+/14士）。先前已測試該等劑量及 時間表且發現其在裸小鼠中具有良好耐受性。化合物⑴在 兩種結腸直腸模型Lovo及HCT116中展示最大抗腫瘤活 性。在為期21天之投藥後，與經媒劑治療之對照相比，3 及10 mg/kg化合物（1)劑量分別達成4〇%及83% tgi，而3〇 及60 mg/kg化合物⑴劑量獲得59%及85% TGI。在HCTn6 模型中’與經媒劑治療之對照相比，3 mg/kg之最低劑量 甚至更具活性（TGI=85%)，且1〇 mg/kg具有類似效力，TGI 為76%。用30 mg/kg及60 mg/kg化合物⑴實施兩輪7天治療 分別產生63%及90%之丁〇1。 化合物（1)對抗所測試之兩種NSCLC異種移植物模型 (Calu-6及H460a)不甚有效。在Calu-6模型中，每天給與一 次3 mg/kg最低劑量並持續21天達成最大生長抑制（與媒劑 相比’ TGI為59%)，而所有其他劑量及方案皆經證實不甚 有效。化合物（1)之抗腫瘤效果對H460a模型完全無療效。 儘管迄今之數據組較小，僅總共測試了四種腫瘤模变， 但所觀察到之活體内抗腫瘤反應似乎與細胞系Notch 1/Notch 3表現比相關。已顯示，在藉由γ-分泌酶處理及蛋 白水解裂解後Notch 3起細胞内Notch 1 (ICN)之負調節子的 137090.doc •31 - 200936139 作用。在核移位及與轉錄因子結合後Notch 3與ICN競爭。 内部數據揭示，Notch 3蛋白在H460a細胞中之表現提高且 在敏感細胞系（即Lovo、HCT116及A549)中之表現降低咬 較低。 與在化合物（1)之先前活體内研究中所注意到者一樣， 此處觀察到當給小鼠每天投藥持續21天時，腫瘤生長抑制 通常不與劑量成正比。另一方面，按間歇（7+/14_/7+)時間 ❹
表給與較高劑量時似乎存在劑量反應。覺察到之無劑量反 應不能70全藉由藥物暴露來解釋。在短期相對於長期投藥 10 mg/kg化合物（1)之小鼠中血漿暴露之比較展示類^暴 露，表明隨時間流逝無暴露損失，此可解釋無與劑量成正 比之抗腫瘤反應。此外，裸小鼠中之另—藥物代謝動力學 研究揭示血漿暴露高達30 mg/kg劑量時具有極佳劑量比例 性。因此，就TGI而言，無劑量比例性反應並非緣於血聚 暴露藥物飽和。料研究再次證實％加並非始終與暴露 成正比’且表明生物學閾值效應。 來自本文所述活體内研究之結果展示γ-分泌酶抑制劑化 合物之抗通瘤活性的幅度。每天經口投與或間歇(即兩個 投藥可有效抑制腫瘤生長且無毒性。化合物⑴在四 :異種移植物模型中的三種中具有口服活性。該等數:: 實’通過投與γ-分泌酶抑制劑化合物⑴來抑 為 癌症治療之有效策略。 r為 結論 其可阻斷腫瘤細胞 化合物（1)係γ-分泌酶之強效抑制劑 137090.doc -32- 200936139 中之Notch信號轉導激活。在先前研究中，向具有A549腫 瘤之小鼠經口投與化合物（1)可達成持續抗腫瘤反應。為進 一步評估化合物（1)之抗腫瘤活性的幅度，在Lovo及 HCT116人類結腸直腸、及Calu-6及H460a NSCLC異種移植 物模型中實施四項功效研究。兩種劑量（3及10 mg/kg)係每 天給與一次，持續21天，而30及60 mg/kg係使用間歇時間 表（7天服用，14天停用，且隨後7天服用（7+/14-/7+))給 與。化合物（1)在兩種結腸直腸模型Lovo及HCT116中展示 © 最大抗腫瘤活性。在為期21天之投藥後，與經媒劑治療之 對照相比，10 mg/kg化合物（1)劑量達成83%腫瘤生長抑制 (TGI)，而30及60 mg/kg化合物（1)劑量獲得59%及85% TGI。在HCT116模型中，低至3 mg/kg之劑量具有效力， 與媒劑對照相比，TGI為85%，且10 mg/kg劑量具有類似效 力。用30 mg/kg及60 mg/kg化合物（1)實施兩輪7天治療分 別產生63%及90%之TGI。化合物（1)對抗所測試之兩種 NSCL。異種移植物模型（Calu-6及H460a)不甚有效。在 Calu-6模型中，每天給與一次3 mg/kg最低劑量並持續21天 達成顯著生長抑制（與媒劑相比，TGI為59%)，而所有其他 劑量及方案皆經證實不甚有效。化合物（1)之抗腫瘤效果對 H460a棋型完全無療效。所觀察到之抗腫瘤活性模式似乎 與細胞系之Notchl/Notch3表現比相關，然而，數據組較小 且對於促成功效之因素仍知之甚少。該等數據證實，通過 才X與γ-分泌酶抑制劑化合物（丨）來抑制Notch可為癌症治療 之有效策略。 137090.doc -33- 200936139 實例2 化合物（1)在A549 NSCLC腫瘤細胞中之細胞活性 在細胞分析及無細胞分析中，化合物（1)的IC5G值在低毫 微莫耳範圍内，對於75個不同類型的其他結合位點（受 體、離子通道、酶）所觀察到之選擇性大於2個對數單位。 化合物（1)之生長抑制活性較為複雜。化合物（1)不阻斷腫 瘤細胞增殖，亦不誘導細胞凋亡，而是代之以產生生長更 為平穩緩慢之低轉化表現型。此機制與Notch抑制一致並 排除採集標準EC50值。如藉由西方墨點法所量測的ICN表 現降低所示，化合物（1)可降低Notch處理。此導致轉錄把 基因產物Hesl之表現降低，此亦藉由西方墨點法來量測。 在發育及組織重建期間’多能幹細胞可用作分化細胞之 來源，以產生非增殖性專一化細胞類型。該等幹細胞之特 徵與腫瘤之快速失控增殖之間的關聯已經很清楚。Notch 途徑係主要的發育信號轉導轴之一。在成人多能幹細胞發 育及自我更新期間，Notch信號轉導藉由介導祖細胞分化 來調節細胞命運。Notch之功能在於將祖細胞保持在多能 快速增殖狀態下。Notch基因擴增、染色體移位或突變導 致Notch信號轉導提高’由此藉由將腫瘤細胞保持在類幹 細胞增殖狀態而賦予腫瘤生長益處。 膜内處理法為膜受體激活及信號轉導係新出現的主題。 γ-分泌酶係包括Notch(藉由γ-分泌酶處理之其他蛋白實例 係丨殿粉樣蛋白前體[ΑΡΡ]、CD44幹細胞標記、及hER4 [ErbB4])在内之數種信號轉導受體之膜内蛋白水解處理法 137090.doc -34- 200936139 中之重要酶。Notch之γ-分泌酶處理產生稱為ICN之活性形 式。該蛋白移位至細胞核並構成大轉錄複合物之一部分， 該大轉錄複合物涉及直接改變重要增殖及分化特異性基因 表現的CSL轉錄調節子。經由抑制γ-分泌酶來阻斷Notch信 號轉導可在活體内人類癌細胞中產生生長較為緩慢之低轉 化表現型。該類型新穎治療方法具有使癌症成為更易處理 之疾病的潛力且無傳統細胞毒性藥物之強烈副作用。 材料及方法 ❹ 細胞系及培養 A549細胞系係自美國組織培養物保藏中心（American Tissue Culture Collection) (ATCC)(Manassas，VA)獲得並保 持於補充有10%經熱滅活之胎牛血清（HI-FBS; GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD)及 2 mM L-麩胺酿胺 (GIBCO/BRL)之Ham's培養基中。將lxlO6個A549細胞接種 於10 cm3板中以用於FACS分析並將3xl05個細胞/孔接種於 6-孔板中以用於西方墨點分析。容許細胞附著24小時並隨 後用以下濃度的化合物（1)進行處理：0.1、0.25、0.5、1、 2.5及5 μΜ。將細胞培育72或120小時並收集用於FACS分 . 析。 測試物品 將測試化合物（1)以10 mM溶解於100%二甲亞砜（DMSO) (Sigma)中並儲存於-20°C下之玻璃小瓶中。 5-點投藥及西方墨點分析 A549細胞係藉由用冷PBS洗滌板並將樣品緩衝液（1:1水： 137090.doc -35- 200936139 2X Tris-甘胺酸 SDS 樣品緩衝液（Invitrogen，Carlsbad, CA) ’其含有5% 2-β巯基乙醇）直接添加至板上來收集。所 用裂解緩衝液之體積約為每1X1 〇5個細胞100 μΐ。藉由煮沸 5分鐘使蛋白質變性，使用4-20% Tris-甘胺酸凝膠 (Invitrogen)藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分離並電印 跡至0.45 μιη頌化纖維素媒（Invitrogen)上。將膜在室溫下 於阻斷緩衝液（存於PBS中之5%乳/0.1 % Tween 20)中阻斷1 hr，隨後與一級抗體在4°C下培育過夜。洗滌膜並將其與
© 二級抗體在室溫下培育30分鐘。使用增強之化學發光（ECL
Plus，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)來實施 免疫檢測。對於西方墨點法，總ICN係使用來自Cell Signaling (#2421)之經 1··1〇〇〇稀釋之裂解Notch-1 (vall744) 抗體來檢測，Hesl係使用來自US Biological (#H2034-35) 之經1:1000稀釋之Hesl抗體來檢測，且肌動蛋白係使用來 自Sigma (#5316)之經1:10,000稀釋之肌動蛋白抗體來檢 測。 ❹ 細胞週期分析 將細胞與化合物（1)培育72或120小時，藉由刮擦收穫， 在磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)中洗滌兩次，在1.5xl03 rpm下離 心，並在-20°C下用70%乙醇固定過夜。隨後利用MPM2-FITC及碘化丙錠（PI)雙重染色（Becton Dickinson，San Jose, CA)對細胞進行分析。簡言之，將細胞用含有0.05% Tween-20 (PBST)之冷PBS洗滌兩次，與抗-填酸Ser/Thr MPM2抗體（#05-368，Upstate/Millipore，Bullerica，ΜΑ) — 137090.doc •36- 200936139 起培育2小時，再次用PBST洗滌，在黑暗中與二級IgG-FITC 抗體（#AP308F，Chemicon，Temecula, CA)—起進行培 育，用 PBST 洗蘇並與 PI/RNA 酶溶液（Becton Dickinson, San Jose, CA)在 37 °C 下再培育 30 min。 在裝備有488 nm氩離子雷射之FACScan流式細胞儀 (Becton Dickinson，San Jose，CA)上對樣品進行分析。綠色 異硫氰酸螢光素（FITC)螢光係用530/30 nm帶通濾波器利用 對數放大來收集且來自碘化丙錠（PI)之橙色發射係藉助 © 585/42 nm帶通濾波器利用線性放大來過濾。每一樣品採 集最少20,000個事件。DNA直方圖之細胞週期分析係用 FlowJo軟體（Tree Star公司，Ashland，OR)來實施。
Notch處理之西方墨點分析 在藉由γ-分泌酶實施Notch受體裂解後形成ICN蛋白係 Notch信號轉導中之關鍵性步驟。ICN移動至細胞核，成為 調節包括i/eW在内之多種靶基因之轉錄的較大轉錄複合物 之一部分。腫瘤細胞系中ICN表現及Notch把基因產物Hesl ❹ 之降低係藉由西方墨點法來檢測。在人類NSCLC A549細 胞中於處理五天後化合物（1)阻抑ICN產生，使得組織培養 .物中產生平緩的低轉化腫瘤細胞表現型。形態學與在組織 培養物中生長之未轉化的原始支氣管上皮細胞類似。自 Clonetics網站可獲得比擬物以供視覺比較。此數據與抑制 腫瘤細胞中之γ-分泌酶一致。在化合物處理後未觀察到細 胞凋亡表現型出現。 細胞週期分析 137090.doc -37- 200936139 利用FACS分析來獲得對化合物（1)處理後細胞週期抑制 效果之瞭解。用增加濃度之化合物（1)將A549細胞處理72 及120小時。如下文所述，FACS分析顯示對細胞週期進程 影響較小，5 μΜ 72及120小時時細胞週期減慢不多。 FACS分析之定量 化合物⑴，μΜ 時間，hr subGl, % Gl，％ G2/M, % 0 5.2 60.1 23.5 0.10 6.5 63.1 23.3 0.25 72 5.9 64.8 20.3 0.50 4.3 66.6 19.4 1.0 6.6 64 21.5 5.0 8.4 64.9 20 0 7.2 58.2 59 0.10 6.8 59.0 24.1 0.25 120 6.7 61.1 23.8 0.50 9.6 Ί 58.6 23.3 1.0 8.0 60.9 19.8 5.0 13.7 58.7 18.3 化合物（1)不阻斷腫瘤細胞增殖，亦不誘導細胞凋亡， 而疋代之以產生生長更為平穩緩慢之低轉化表現型。此機 制與Notch抑制一致。如藉由西方墨點法所量測的ICN表現 之降低所示’化合物（1)可降低Notch處理。此導致轉錄把 基因產物Hes 1之表現降低’此亦藉由西方墨點法來量測。 實例3 在投藥化合物（1)後AS49異種移植物的西方墨點分析 137090.doc -38- 200936139 化合物(1)係γ·分泌酶之強效及選擇性抑制劑，其可在腫 瘤細胞中產生N 〇 t c h信號轉導抑制活性⑴。在細胞分析及 無細胞分析中，化合物⑴的％。值在低毫微莫耳範圍内， 對於75個不同類型的其他結合位點（受體、離子通道、酶） ~觀察到之選擇性大於2個對數單位。化合物⑴之生長抑 制/ 14較為複雜。化合物⑴不阻斷腫瘤細胞增殖亦不誘 導、<胞凋亡，而是代之以產生生長更為平穩緩慢之低轉化 纟見f此機制與N()teh抑制-致。經化合物（1)治療之腫 ，瘤之、’田胞外基質蛋白第5型膠原的含量降低且⑽A”的含 量提同另外，如藉由1CN損失及Notch-Ι受體表現所量 測腫瘤細胞中之Notch處理受抑制。當給具有A549異種 移植物之小鼠每天投藥至多6〇 mg/kg化合物（丨）時，及 Notch-1有變化。此可能係緣於功效研究期間於重複投藥 後暴露損失或腫瘤内化合物分佈較差。 在發育及組織重建期間，多能幹細胞可用作分化細胞以 φ 產生非增殖性專用細胞類型之來源。該等幹細胞之特徵與 腫瘤之快速不受控制增殖之間的聯繫已經很清楚。N〇tch 途徑係主要的發育信號轉導軸之一。在成人多能幹細胞發 • 育及自我更新期間，Notch信號轉導藉由介導祖細胞分化 來調節細胞命運。Notch起將祖細胞保持在多能快速增殖 狀態之作用》Notch基因擴增、染色體移位或突變導致 Notch信號轉導提高，由此藉由將腫瘤細胞保持在類幹細 胞增殖狀態而賦予腫瘤生長益處。 膜内處理對於膜受體激活及信號轉導係新出現的主題。 137090.doc -39- 200936139 γ-分泌酶係包括Notch(藉由γ_分泌酶處理之其他蛋白實例 係澱粉樣蛋白前體[ΑΡΡ]、CD44幹細胞標記、及HER4 [&肋4])在内之數種信號轉導受體之膜内蛋白水解處理中 之重要酶。Notch之γ-分泌酶處理產生稱為ICN之活性形 式。該蛋白移位至細胞核並構成大轉錄複合物之一部分， 該大轉錄複合物包括直接改變重要增殖及分化特異性基因 之表現的CSL轉錄調節子。經由抑制7_分泌酶來阻斷N〇tch 信號轉導可在活艎内人類癌細胞中產生生長較為緩慢之低 ^ 轉化表現型。該類型新穎治療方法具有使癌症成為更易處 理之疾病的潛力且無傳統細胞毒性藥物之強烈副作用。 材料及方法 測試物品 將測試化合物（1)以10 mM溶解於100%二甲亞硬（DMS〇) (Sigma)中並儲存於-20°C下之玻璃小瓶中。 腫瘤收穫及西方墨點分析 按每天經口時間表以指定劑量給具有A549腫瘤之裸小鼠 投藥，持續21天《在屍體剖檢之時收集來自每一組的三個 A549腫瘤並快速冷凍。藉由以下來製備蛋白提取物：將樣 品緩衝液（1:1水：2X Tris-甘胺酸SDS樣品緩衝液 (Invitrogen，Carlsbad，CA)’ 其含有 5% 2-β巯基乙醇）直接 添加至腔瘤上並藉助艾本德研棒（eppendorf pestle)破壞。 所用裂解緩衝液之體積約為每lxlO6個細胞100 μΐ。藉由煮 沸5分鐘使蛋白質變性，使用4-20% Tris-甘胺酸凝膠 (Invitrogen)藉由SDS-聚丙稀醯胺凝膠電泳進行分離並電印 137090.doc -40- 200936139 跡至0.45 μιη硝化纖維素膜（Invitrogen)上。將膜在室溫下 於阻斷緩衝液（存於PBS中之5%乳/0.1 % Tween 20)中阻斷1 hr，隨後與一級抗體在4°C下培育過夜。洗滌膜並將其與 二級抗體在室溫下培育30分鐘。使用增強之化學發光（ECL Plus，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)來實施 免疫檢測。對於西方墨點法，總ICN係使用來自Cell Signaling (#2421)之經 1:1000稀釋之裂解Notch-1 (vall744) 抗體來檢測，總Notch-1係使用來自Santa Cruz ❹ Biotechnology (#SC-6014)之經 1:1000稀釋之 Notch-1 C-20 抗體來檢測，Hesl係使用來自US Biological (#H2034-35) 之經1:1000稀釋之Hesl抗體來檢測，肌動蛋白係使用來自 Sigma (#5316)之經1:10,000稀釋之肌動蛋白抗體來檢測， 第 V型膠原係使用來自 Santa Cruz biotechnology (#20648) 之經1:1000稀釋之H-200抗體來檢測，且MFAP5係使用來 自 Abnova (#H00008076-A01)之經 1:1000 稀釋之 MFAP5 抗 體來檢測。 ❹ 異種移植物西方墨點分析 經γ-分泌酶抑制劑治療之A549異種移植物腫瘤的微陣列 分析揭示RNA表現變化與細胞外基質改變一致。製備經化 合物（1)治療之腫瘤以用於西方墨點分析。第V型膠原之表 現顯著降低，而MFAP5蛋白質之表現提高。在除最高劑量 組之外的所有動物組中，Notch-Ι蛋白質含量及ICN表現均 降低。第V型膠原及MFAP5係構成細胞外基質之結構蛋 白。在更分化之組織中第V型膠原之表現通常降低且 137090.doc 41 200936139 MFAP5之表現通常提高。此數據與A549腫瘤細胞中之 Notch-1抑制會導致更分化之表現型的作業假設一致。 結論 經化合物（1)治療之腫瘤之細胞外基質蛋白第5型膠原的 含量降低且MFAP5的含量提高。另外，如藉由ICN損失及 Notch-Ι受體表現所量測，腫瘤細胞中之Notch處理受抑 制。當給具有A549異種移植物之小鼠每天投藥至多60 mg/kg化合物（1)時，ICN及Notch-Ι有變化。此可能係緣於 ❿ 功效研究期間於重複投藥後暴露損失或腫瘤内化合物分佈 較差。 實例4 在投藥化合物（1)後MDA-MB-468乳房腫瘤細胞中軟瓊脂生 長潛力之損失 化合物（1)係γ-分泌酶之強效及選擇性抑制劑，其可在腫 瘤細胞中產生Notch信號轉導抑制活性。在細胞分析及無 細胞分析中，化合物（1)的IC5〇值在低毫微莫耳範圍内，對 ❹ 於75個不同類型的其他結合位點（受體、離子通道、酶）所 觀察到之選擇性大於2個對數單位。化合物（1)之生長抑制 活性較為複雜。化合物（1)不阻斷腫瘤細胞增殖，亦不誘導 細胞凋亡，而是代之以產生生長更為平穩緩慢之低轉化表 現型。此機制與Notch抑制一致並排除採集標準EC50值。 化合物（1)降低軟瓊脂中MDA-MB-468菌落之大小。 在發育及組織重建期間，多能幹細胞可用作分化細胞以 產生非增殖性專用細胞類型之來源。該等幹細胞之特徵與 137090.doc -42- 200936139 腫瘤之快速不受控制增殖之間的聯繫已經很清楚。Notch 途徑係主要的發育信號轉導轴之一。在成人多能幹細胞發 育及自我更新期間，Notch信號轉導藉由介導祖細胞分化 來調節細胞命運。Notch起將祖細胞保持在多能快速增殖 狀態之作用。Notch基因擴增、染色體移位或突變導致 Notch信號轉導提高，由此藉由將腫瘤細胞保持在類幹細 胞增殖狀態而賦予腫瘤生長益處。 膜内處理對於膜受體激活及信號轉導係新出現的主題。 γ_分泌酶係包括Notch(藉由γ-分泌酶處理之其他蛋白實例 係殿粉樣蛋白前體[ΑΡΡ]、CD44幹細胞標記、及HER4 [ErbB4])在内之數種信號轉導受體之膜内蛋白水解處理中 之重要酶。Notch之γ-分泌酶處理產生稱為ICN之活性形 式°該蛋白移位至細胞核並構成大轉錄複合物之一部分， 該大轉錄複合物包括直接改變重要增殖及分化特異性基因 之表現的CSL轉錄調節子。經由抑制γ-分泌酶來阻斷Notch 信號轉導可在活體内人類癌細胞中產生生長較為緩慢之低 轉化表現型。該類型新穎治療方法具有使癌症成為更易處 理之疾病的潛力且無傳統細胞毒性藥物之強烈副作用。 材料及方法 細胞系及培養 MDA-MB-468細胞系係自美國組織培養物保藏中心 (ATCC)(Manassas，VA)獲得並保持於補充有10%經熱滅活 之胎牛赢清（HI-FBS; GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)及 2 mML-麩胺醯胺（GIBCO/BRL)之RPMI培養基中。 137090.doc -43- 200936139 測試物品 將測試化合物（1)以10 mM溶解於100%二甲亞硬（DMS〇) (Sigma)中並儲存於_2〇°C下之玻璃小瓶中。 軟壤脂菌落形成分析 對於不依賴貼壁之生長分析’將含有0.5%低解鍵溫度
SeaPlaque瓊脂糖（#50100，Cambrex，Rockland，ME)之2 ml 細胞類型特異性完全培養基（補充有20%胎牛血清（Fbs)、 1%青黴素/鏈黴素、1%丙酮酸鈉、1% HEPES之RPMI培養 基）的底層傾倒至6-孔板之每一孔中。在瓊脂培養基於室溫 下凝固後’添加存於0.5 ml含有0.3% SeaPlaque緩脂糖之如 上所述完全培養基中的3x 103個細胞/孔。第二天，向細胞 中添加1 ml含有〇、1〇〇、或250 nM化合物（1)之培養基。培 育細胞4週以形成菌落，一週兩次更換含有化合物之培養 基。 軟瓊脂生長 化合物（1)係γ-分泌酶之強效及選擇性抑制劑，其可在腫 瘤細胞中產生Notch信號轉導抑制活性。化合物（1)之生長 抑制活性較為複雜。化合物（1)不阻斷腫瘤細胞增殖，亦不 誘導細胞凋亡，而是代之以產生生長更為平穩緩慢之低轉 化表現型。軟瓊脂中形成菌落之能力表示腫瘤細胞進程中 之關鍵性事件。當將未轉化細胞及致瘤性較差之細胞鋪板 於軟瓊脂中時，其不能生長。相比之下，高致瘤性細胞在 軟瓊如條件下生長迅速，產生較大菌落。在人類乳癌細胞 系MDA-MB-468中藉由量測軟瓊脂中之生長潛力對化合物 137090.doc -44- 200936139 (1)對經轉化表現型之影響予以評價。化合物（1)以劑量依 賴性方式降低菌落生長（250 ηΜ>100 ιιΜ>對照）。 結論 化合物（1)不阻斷腫瘤細胞增殖’但降低軟複脂中mdA_ MB-468菌落之大小。此與在MDA_MB_46^l房腫瘤細胞中 化合物（1)誘導低轉化表現型一致。 實例5 在具有A549非小細胞肺癌異種移植物之裸小鼠中每天經口 投與一次或兩次γ-分泌酶抑制劑化合物（1)之耐受性及功效 化合物（1)係最初用於治療阿茲海默氏症之γ分泌酶的強 效及面度選擇性抑制劑。在活體外，毫微莫耳濃度之化合 物（1)可抑制Notch激活及處理’且向培養物中之腫瘤細胞 中添加化合物（1)可誘導低轉化表現型並且阻斷軟凌脂中之 生長。在活體内，在齧齒類動物、狗及人類中化合物（1)具 有良好的口服生物利用性及有利的藥物代謝動力學分佈曲 線。在當前研究中’在21天治療週期中之7、η或21天中 給具有A549非小細胞肺癌（NSCLC)異種移植物之裸小鼠qd 或bid經口投藥化合物（1)。對於bid投藥’確定最高耐受劑 量（MTD)為 60 mg/kg(服用 7 天）、30 mg/kg(服用 14天）、及 10 mg/kg(服用21天）。對於qd投藥，注意到最高耐受劑量 為60 mg/kg(服用14天）或30 mg/kg(服用21天）。當僅在21天 週期之7天中（7+/14-)投與60 mg/kg化合物（1)時，開始觀察 到腫瘤消退，且在不治療14天後，與經媒劑治療之對照動 物相比，％腫瘤生長抑制（TGI)仍為另外，每天給與 137090.doc •45· 200936139 一次或兩次較低劑量之化合物（1)(3 mg/kg、10 mg/kg&3〇 mg/kg)持續14天（14+/7-)或21天在21天週期結束時達成顯 著且持續之腫瘤生長抑制，％ TGI在66-83%範圍内。每天 投與一次化合物（1)與14+/7-或21天治療時間表之每天兩次 治療同樣有效’且具有劑量依賴性。而且，較短投藥持續 時間（7+/14-或14+/7-)與投藥完整21天在抑制A549腫瘤生 長態樣同樣有效。此數據支持通過投與γ分泌酶抑制劑化 合物（1)來抑制Notch可為癌症治療之有效臨床療法的觀 點。 在祖細胞及多能幹細胞發育至分化調節、增殖及細胞〉周 亡期間Notch信號轉導途徑參與決定細胞命運。由於基因 擴增、染色體移位、或突變而引起之Notch信號轉導組件 失調與包括白血病、髓母細胞瘤及膠質母細胞瘤、乳癌、 頭頸癌及胰腺癌在内之多種類型惡性腫瘤有關。例如， Notch在決定造血系統中之細胞譜系中起作用，並且已顯 示激活Notch-1突變係造成全部τ_細胞ALL(急性成淋巴細 胞性白血病）的約一半的原因。Notch信號轉導途徑包含 Notch受體（Notch受體1-4)，當與配體（δ_樣·丨、·3、_4、
Jagged-Ι及-2)結合並通過蛋白水解裂解激活時，其移位至 細胞核’其中其起乾基因之轉錄激活子的作用。 γ-分泌酶係造成Notch受體裂解及激活之兩種重要酶之 一，且已乂出作為癌症治療之靶標。藉由γ_分泌酶實施之 細胞内Notch (ICN)的酶促裂解容許ICN移位至細胞核，導 致下游致癌乾標轉錄，該等下游致癌乾標包括丑^^相 137090.doc -46- 200936139 關bHLH阻抑物、丹叮、//五、細胞週期調節子（p21、細 胞週期調節蛋白A、細胞週期調節蛋白di)、SKP2、NF-κΒ轉錄因子、AKT、PI-3K、erbB2、β-連環蛋白及細胞凋 亡過程之調節子。Ras癌基因可激活野生型N〇tch信號轉 導，其為Ras介導之至惡性腫瘤轉化的表觀需要。最近證 據表明，來自腫瘤細胞之Notch信號轉導可觸發鄰近内皮 細胞之Notch激活’從而促使腫瘤生成及血管生成。因 此’乾向Notch活性之γ-分泌酶抑制劑可在不同癌症類型 中具有多效性。 除處理Notch外，γ-分泌酶亦可處理β_澱粉樣肽前體 (ΑΡΡ) ’該β_澱粉樣肽前體係治療阿茲海默氏症之靶標。 已顯示，靶向γ_分泌酶之小分子對於阻斷Αρρ相對於N〇tch 處理能夠具有一定程度之選擇性。當前臨床前導物化合物 (1)係為阿茲海默氏症患者而研製，但對抑制App相對於丫_ 分泌酶缺少足夠的特異性e吾人認為靶向正常細胞中之 Notch的後果不適於阿茲海默氏適應症，但為腫瘤學所接 又例如’技藥分泌酶抑制劑之Fischer大鼠中之毒理學 研究揭不’ Notch途徑激活阻斷導致黏膜分泌 (mucosecreting)杯形細胞的大小及數量增加。 化合物（1)係γ-分泌酶之高度選擇性及強效抑制劑（IC50= 4 nM)。考慮到該確切數據並聯繫N〇tch信號轉導途徑失調 與癌症之關係，所採用的交又治療策略使用γ-分泌酶抑制 劑作為癌症治療藥物。毫微莫耳範圍内之化合物（1)可抑制 人類Abeta蛋白產生（jc5〇=4- 14 nM)、及Notch活性/處理 137090.doc -47- 200936139 (IC5〇=5 riM)(在細胞報導子基因分析中）。化合物在小鼠 中具有有利的藥物代謝動力學分佈曲線，1 力r寻至鬲的 口服生物利用性》 在當前研究中，對化合物（1)對抗裸小鼠中之 • NSCLC人類異種移植物模型的抗腫瘤活性予以評價。 A549細胞似乎具有功能性N〇tcMf號轉導途徑此乃因受 體、配體及諸如Hes-Ι及Hey-Ι等下游效應物被表現（如藉 由基於PCR之基因表現分佈曲線所評估）。A549細胞在 ❹ Notch途徑中具有至少一個可識別之缺陷；負調節子\11〇^ 僅以較低含量被表現。在活體外，nM濃度之化合物（1)在 A549細胞中誘導低轉化表現型且導致MDA_MB_468乳房腫 瘤細胞在軟瓊脂中之生長損失，此與N〇tch激活之機制抑 制一致。為測試化合物（1)之活體内抗腫瘤效果，在本研究 中於21天時間表中之7、14或21天中將化合物（1)每天一次 (qd)或每天兩次（bid)投與至具有A549異種移植物之雌性無 ©胸腺(裸）小鼠。 材料及方法 動物 -使用自查爾斯河實驗室（Wilmington, ΜA)獲得之約13-14 週齡且重約23-25克之雌性裸小鼠（1〇只/組）。藉由大體觀 察實驗動物及藉由分析圈養在共用搁板架上之哨兵動物之 金液樣品每天測定一次所有動物之健康狀況。在實驗使用 之前，經最少72小時使所有動物適應新環境並自任何航運 相關壓力恢復過來。隨意提供高壓滅菌水及輻照食品 137090.doc •48- 200936139 [5058-ms Pico飼料（小鼠）Purina，Richmond，IN]，並將動物 保持12小時光照及黑暗循環。籠子、墊料及水瓶在使用前 皆經高壓滅菌且每週更換一次。 腫瘤 A549人類NSCLC細胞係購自ATCC (Manassas，VA)並在
I 含有10% (v/v) FBS之RPMI 1640培養基中進行培養。使細 胞生長並由活體内腫瘤研究部門（Oncology /« F/vo Section) (OIVS)之成員收穫。每只小鼠接受存於0.2 ml ® PBS(磷酸鹽緩衝鹽水）中之7.5χ106個細胞，此由OIVS之成 員於8/17/06經皮下植入右後側腹中。 測試劑 將化合物（1)調配成供經口（po)投與之懸浮液，該懸浮液 存於1.0%經丙纖維素水溶液與0.2% Tween-80中。在取出 及投與之前將化合物（1)劇烈混合。每週製備一次經調配之 化合物及媒劑並於4°C下儲存，如下文所述。 醫藥調配物 成份 劑量 化合物(1) 0.375 mg/ml 化合物(1) 1.25 mg/ml 化合物(1) 3.75 mg/ml 化合物(1) 11.25 mg/ml 隨機化 ❹ _ 在第25天，按照腫瘤體積使腫瘤植入後的動物隨機化， 由此所有組皆具有約100-150 mm3的類似開始平均腫瘤體 137090.doc -49- 200936139 積。 研究設計 劑量組列示如下。 研究設計 投藥7天及14天之組 組 治療 劑量 時間表 1 媒劑 bid><14天 2 化合物(1) 3 mg/kg qd><14 天 3 化合物(1) 10 mg/kg qd><14 天 4 化合物(1) 30 mg/kg qdxl4天 5 化合物(1) 60 mg/kg qd><14 天 6 化合物(1) 3 mg/kg bid><14天 7 化合物(1) 10 mg/kg bid><14天 8 化合物(1) 30 mg/kg bid><14天 9 化合物(1) 60 mg/kg bid><14天 10 RO3929097 60 mg/kg bid><7 天 投藥21天之組 組 治療 劑量 時間表 11 媒劑 一- bidx21 天 12 化合物(1) 3 mg/kg qdx21天 13 化合物(1) 10 mg/kg qd><21 天 14 化合物(1) 30 mg/kg qd><21 天 15 化合物(1) 60 mg/kg qdx21天 16 化合物(1) 3 mg/kg bid><21 天 17 化合物(1) 10 mg/kg bidx21 天 18 化合物(1) 30 mg/kg bid><21 天 19 化合物(1) 60 mg/kg bidx21 天 I37090.doc -50- 200936139 治療 治療開始於9/12/06(腫瘤細胞植入後第26天）。化合物 及媒劑係使用無菌1 cc注射器及18號強飼針（〇2 mi/動物） 以懸浮液形式在21天時間表中之7、14或21天中每天一次 (qd)或兩次（bid)(相隔8小時）投藥。對於投藥7天（7+/14·)之 動物而言，治療在9/19/06(腫瘤細胞植入後第33天）結束。 將該等小鼠在第67天用相同劑量之化合物再治療另外7 天直至第74天。對於投藥14天（14+/7-)之動物而言，治療 ϋ 在9/26/06(腫瘤細胞植入後第4〇天）結束，且對於投藥21天 之動物而言，治療在1 〇/3/〇6(腫瘤細胞植入後第47天）結 束0 病理學及屍艟剖檢 在實施無痛致死以評估腫瘤細胞增殖之前2 hr，給動物 注射存於1 ml無菌水中之i mg Brdu(溴脫氧尿苷卜藉由引 入C〇2隨後實施頸椎脫位術使動物無痛致死。採集來自經 ，媒劑治療及經選擇化合物（丨）治療之組的腫瘤並在鋅福爾 馬林中固定過夜、處理、經石蝶包埋，並進行組織病理學 切片（用於形態學評估之蘇木素及曙紅（H & E)染色及 BMIJ染色）。採集脾及胃腸道之—部分並實施福爾馬林固 定、處理、石蝶包埋、切片、及Η & Ε染色以分別評估邊 緣區Β_細胞去除及杯形細胞形成，此乃因該等係兩種已知 的γ-分泌酶抑制劑之靶標相關影響。結果陳述於下文中。 137090.doc -51 · 200936139 屍髏剖檢/病理學概述 組 媢量/類率/途租 動物編靓 1.媒劑 qdx21 天，po 101-104 2.化合物(1) 3 mg/kg，qdx21 天，po 201-204 3.化合物(1) 10 mg/kg，qdx21 天，po 301-304 監測 腫瘤量測及小鼠重量係每週測定兩次。在整個實驗期間 所有動物皆單獨跟蹤。 ❹ 計算及统計學分析 利用下式將重量減輕生動地表示成組平均體重之百分比 變化：（(\ν-\ν〇)Λν〇)χ100，其中'w，表示特定天時治療組之 平均鱧重’且’w0·表示治療開始時相同治療組之平均體 重°最大重量減輕亦利用上式來表示，且表示在整個實驗 期間之任何時間所觀察到之特定組的最大體重減輕百分 比°毒性定義為給定組中220%的小鼠展示>2〇%的體重減 輕及/或死亡率。 ❹ 將功效數據生動地表示成平均腫瘤體積+平均值之標準 誤差（SEM)。利用下式將治療組之腫瘤體積表示成對照組 腫瘤體積之百分比（％ T/c) : 10〇x((T-T〇)/(c_c〇))，其中τ . 表示在實驗期間之特定天時治療組之平均腫瘤體積，τ〇表 示在治療第一天相同治療組之平均腫瘤體積；C表示在實 驗期間之特定天時對照組之平均腫瘤體積，且C()表示在治 療第一天相同治療組之平均腫瘤體積。腫瘤體積（以立方 毫米計）係利用橢圓體公式來計算：（D X (d2))/2，其中，Di表 137090.doc •52· 200936139 示腫瘤之較大直徑’且’d’表示較小直徑。在一些情形下， 利用下式來計算腫瘤消退及/或腫瘤體積之百分比變化·· ((T-TQ)/TG)xl〇〇，其中，τ，表示特定天時治療組之平均腫瘤 體積’且T〇表示治療開始時相同治療組之平均腫瘤體 積。藉由等級和檢驗及單因素方差分析及事後邦弗朗尼t_ 檢驗（SigmaStat ’ 2.0版本 ’ jandel Scientific，San Francisco， CA)來測定統計學分析，當概率值係〇5時認為組 間差異顯著。 © 藥物暴露 為評估長期藥物暴露，在最後一次劑量後〇5、1、2、 4、8及24 h的每個時間點上採集來自1〇 mg/kg化合物⑴組 (qdx21天）之2只小鼠的血液樣品。為評估短期藥物暴露’ 在研究的最後一天給首次用於實驗的裸小鼠組投與單次劑 量之10 mg/kg化合物（1)。製備血漿樣品並藉由lc/ms/ms 對化合物（1)實施分析。 0 计算2只動物/組/時間點之平均血漿濃度。濃度低於定量 限值（<12.5 ng/ml)之血漿樣品設定為零。自平均血漿濃度 數據來估計藥物代謝動力學參數。取樣時間以標稱時間報 - 告。所報告之藥物代謝動力學參數係最大血漿濃度 (Cmax)' 〇_8 hr的血漿濃度-時間曲線下的面積（auc0.8 hr) 及經劑量標準化之AUCCAUCo-8 hr/劑量）。Cmax值係直接得 自第時間點的血漿濃度-時間分佈曲線而無任何外推。 AUC係使用線性梯形法則來計算。 在長期投藥之小鼠中，10 mg/kg劑量產生之Cmax為7〇8 137090.doc -53- 200936139 ng*小時/ml且AUCo.s hr為923 ng*小時/ml。在首次用於實 驗之小鼠中單次劑量提供類似暴露，Cmax及AUC〇_8 hr分別 為559 ng*小時/ml及1279 ng*小時/ml，此表明在長期投藥 時既無藥物累積亦無暴露衰退。結果陳述於下文中。 築物暴露概述 10 mg/kg剩量之平均血漿暴露》 參數(ng*小時/ml) 第1天 笫21天 AUC〇.8hr 1279 923 Cmax 559 709 結果 毒性 在先前最大耐受劑量（MTD)研究中，給首次用於實驗之 裸小鼠bid投藥90 mg/kg化合物（1)持續14天具有毒性且顯 著導致體重減輕，而每天投藥一次90 mg/kg則具有财受 性。在當前研究中，bid投藥60 mg/kg化合物（1)超過7天不 ❹ 能耐受，且qd投藥超過14天不能耐受。當給動物投藥60 mg/kg bid持續21或14天時，每一治療組中分別有七隻及四 隻小鼠死亡，大多數動物在死亡之前先呈現體重減輕。當 給動物qd投藥持續21天時，三隻小鼠死亡。60 mg/kg qd持 •續14天或bid持續7天的劑量具有良好耐受性，無明顯重量 減輕或其他毒性臨床體徵。 30 mg/kg劑量qd持續21天可耐受，然而30 mg/kg劑量bid 持續21天具有毒性，有兩隻動物死亡。30 mg/kg劑量qd或 137090.doc -54- 200936139 bid投藥持續14天具有良好耐受性，無明顯重量減輕或其 他毒性臨床體徵。低於3〇 mg/kg(即1〇 mg/kg或3 mg/kg)之 劑量按照所有投藥時間表皆具有良好耐受性且未觀察到明 顯毒性臨床體徵。 抗肢瘤功效 在21天時間表中之7、14或21天内每天向具有A549 NSCLC異種移植物之裸小鼠經口投與一次或兩次化合物 (1)可達成顯著腫瘤生長抑制（TGI)，與經媒劑治療之動物 相比在治療期後繼續充分阻抑生長。在第47天計算腫瘤生 長抑制之百分比，該第47天對於21天治療組而言為治療之 最後一天’對於14天治療組（14+/7-)而言為治療後7天，或 對於7天治療組（7+/14-)而言為治療後14天。 用14+/7-時間表經qd或bid治療之所有組皆達成顯著腫瘤 生長抑制，生長阻抑持續到長達治療後23天（第63天）。在 21天週期完成後，在腫瘤植入後第47天，qd投與最低劑量 之3 mg/kg化合物（1)達成66% TGI (p<0.001)，而與經媒劑 治療之對照動物相比bid給與相同劑量使所得TGI增大至 83% (p<〇.〇〇i) 。 1〇 mg/kg qd 劑量產生 77% TGI (P<0.001)，且bid給與相同劑量違成 80% TGI (ρ<〇.〇〇1)。 在60 mg/kg qd或30 mg/kg bid之最高耐受劑量下分別觀察 到 88% 及 79% 之 TGI (ρ<0·001)。當給與30 mg/kg qd 劑量 時，與經媒劑治療之對照動物相比獲得79%之TGI (P<0.001)。 當用7+/14-時間表每天兩次用60 mg/kg化合物（1)治療小 137090.doc -55- 200936139 鼠時，治療最初造成定殖之八549腫瘤阻抑，而在2i天週期 結束時在腫瘤植入後第47天，與媒劑對照小鼠相比腫瘤生 長抑制仍為91%。腫瘤生長抑制仍然延長且持續到長達治 療後34天（第67天）。在第67天，將該等小鼠用相同刺量之 化合物⑴再治療第二個週期(7天)直至第74天。腫瘤生長 在第90天後繼續受到抑制。 當連續21天qd或bid投與化合物⑴時觀察到類似結 果，治療在應瘤植入後第47天結束》在為期21天之治療 後最低劑量之3 mg/kg qd化合物⑴獲得76% TGI (P=〇.〇〇2)，而 bid投藥達成 83% T(JI (p<〇 〇〇1卜與 14+/7_時 間表類似，與經媒劑治療之對照相比，對於qd及bid治療 、卫用10 mg/kg冶療小鼠21天分別達成7〇% (p=〇 〇〇4)及 (P=0.003)之TGI。儘管3〇 mg/kg bid劑量具有毒性，但扣投 藥具有良好耐受性，且與經媒劑治療之小鼠相比A549腫瘤 生長被抑制66% (p=〇.009p對於所有21天治療組，腫瘤生 _ 長之抑制仍然延長且持續到長達治療後〗6天（第63天）。 注意到，無論用14+/7-或完整21天治療時間表或bid投 藥γ-分泌酶抑制劑化合物（1)，通常觀察到腫瘤生長抑制無 劑量反應。例如，當qd投藥3或10 mg/kg化合物（1)且持續 21天時’所得％ 丁〇1非常類似且不與劑量成正比，TGI分 別為76%及70%〇當bid(使每天給與藥物的量加倍）投藥相 同劑量之化合物（1)且持續21天時，％ TGI未成正比增加， 分別為83°/。及72% TGI相對於76%及70% TGI。 不斷增加之臨床前證據已證實，藉由靶向γ·分泌酶使 137090.doc •56· 200936139
Notch途徑失活可為治療癌症之可行及可信策略。已在白 血病、T-ALL、髓母細胞瘤及膠質母細胞瘤、乳癌、頭頸 癌、騰腺癌及許多其他惡性踵瘤中觀察到Notch信號轉導 途徑失調。化合物（1)最初作為APP之強效抑制劑而研製用 於阿兹海默氏症’然而，本文中吾人報導該化合物經由抑 制γ-分泌酶介導之Notch處理及激活而交又治療應用於治 療癌症。 向活體外A549 NSCLC細胞中添加化合物（1)導致低轉化 表現型以及在軟瓊脂中生長之能力損失。為測定化合物（1) 在活體内之抗腫瘤潛力，利用7+/14_、14+/7_、或完整21 天治療時間表給具有A549 NSCLC異種移植物之裸小鼠每 天一次或兩次經口投藥化合物（1)。 對於bid投藥，確定最高耐受劑量（MTD)為60 mg/kg(服 用7天）、30 mg/kg(服用14天）、及1〇 mg/kg(服用21天）。對 於qcU又藥，注意到最高耐受劑量為6〇 (服用μ天）或 3〇 mg/kg(服用21天）。高於MTD之劑量及時間表引起體重 減輕及死亡率，此與靶標相關之胃腸毒性一致。經分泌 酶抑制劑治療之腸隱窩的早期組織學檢查揭示杯形細胞分 化顯著增強，此為靶向N〇tch信號轉導途徑之已知效應。 田使用7+/14-投藥時間表以6〇111§/1^每天投藥兩次”分 泌酶抑制劑化合物（1)時，開始觀察到腫瘤消退，在Μ天週 期結束時TGI為91%，且生長阻抑再持續數週。在停止治 療後34天’重新開始化合物⑴之第二個投藥週期，繼續阻 抑腫瘤生長。另外，用14+/7•或完整21天時間表每天給與 137090.doc -57- 200936139 一次或兩次化合物（1)之所有其他劑量（3 mg/kg、10 mg/kg 及3 0 mg/kg)皆達成顯著腫瘤生長抑制，此抑制效果分別在 治療停止後第40天或第47天仍得到較佳保持。該等數據表 明，化合物（1)之較短投藥持續時間（即7或14天）與投藥持 續較長間隔（即21天）在抑制A549腫瘤生長態樣同樣有效。 在許多情形下，化合物（1)之最大抗腫瘤效果被延遲且 在停止投藥化合物後更為明顯。該臨床前抗腫瘤分佈曲線 與經典細胞毒性劑極為不同，在經典細胞毒性劑情形下通 常在治療期期間觀察到最大腫瘤生長抑制，且當治療停止 時腫瘤迅速開始再生長。吾人已知N〇tch在正常及癌症幹 細胞中表現，且本文中所觀察到之抗腫瘤效果延遲令人回 憶起當靶向癌症幹細胞時腫瘤收縮之理論上預測之延遲。 儘管僅靶向一小部分腫瘤細胞群體，但由於其係關鍵性部 分’故在腫瘤中之癌症幹細胞最終分化或被殺死後，剩餘 細胞缺少自我更新能力且腫瘤體積保持穩定或逐漸減小。
觀察到腫瘤生長抑制通常無劑量比例性，以3、1〇或3〇 mg/kg qd投藥21天具有類似之％ TGI。當在bid組中使每天 劑量加倍時觀察到TGI僅有微弱増加。在當前研究結束時 短期相對於長期投藥10 mg/kg化合物（丨）之小鼠中血漿暴露 之比較展示類似暴露，表明隨時間流逝無暴露損失，此可 解釋無劑量比例性。此外，裸小鼠中之非依賴性藥物代謝 動力學（PK)研究（PK #U28)證實血漿暴露高達3〇 mg/kg劑 量時具有極佳劑量比例性°因此’腫瘤生長抑制無劑量比 例性可能並非緣於血漿暴露飽和。該等結果表明，％ TGI 137090.doc •58- 200936139 不與暴露成正比，而是可能反映靶向癌症幹細胞而非快速 增殖細胞之獨特性質，或簡言之存在生物學閾值效應。 經Η & E染色之腫瘤切片之組織學分析揭示經化合物。） 治療之腫瘤細胞表現型不存在任何不同，然而與來自經媒 劑/α療之小鼠的腫瘤相比來自用1 〇 mg/kg化合物（！）治療η 天之小鼠的腫瘤具有增加之壞死面積及細胞基質。 當別研究之結果揭示，每天投與一次化合物（丨）與用 14+/7-或21天治療時間表每天兩次治療同樣有效且無劑量 依賴性。而且，較短投藥持續時間（7+/14_或14+/7)與投藥 完整21天在抑制A549腫瘤生長態樣同樣有效，且抗腫瘤效 果在治療停止後成功延長。該等數據證實，通過投與丫分 泌酶抑制劑化合物（1)來抑制^^丨“可為癌症治療之有效策 略。 實例6 非臨床藥理學概述 化合物（1)係γ-分泌酶之強效及選擇性抑制劑，其可在腫 瘤細胞中產生Notch信號轉導抑制活性。化合物（1)產生良 好活體内抗腫瘤活性，其在投藥停止後仍保持，組織學分 析顯示與Notch信號轉導抑制一致之獨特的腫瘤表現型。 在細胞分析及無細胞分析中，化合物（1)的1(：5()值在低毫 微莫耳範圍内，對於75個不同類型的其他結合位點（受 體、離子通道、酶）所觀察到之選擇性大於2個對數單位。 化合物（1)之生長抑制活性較為複雜。化合物（1)不阻斷腫 瘤細胞增殖，亦不誘導細胞凋亡，而是代之以產生生長更 137090.doc -59- 200936139 為平穩緩慢之低轉化表現型。此機制與Notch抑制—致並 排除採集標準EC50值。如藉由西方墨點法所量測的ICN表 現之降低所示，化合物（1)可降低Notch處理。此導致轉錄 靶基因產物Hesl之表現降低，此亦藉由西方墨點法來量 測。 在活體内應用中，化合物（1)在經口投藥後具有活性。 按間歇或每天時間表5種異種移植物中之3種展示抗腫瘤活 性且無體重減輕。重要的是，當投藥停止時功效仍保持。 經治療A549 NSCLC腫瘤之組織學分析顯示特徵在於壞死 面積較大、細胞外基質增多之腫瘤表現型。此與膠原第v 型及MFAP5蛋白質表現之變化一致。 該等非臨床藥理學結果支持腫瘤學臨床研究甲對化合物 (1)之進一步評價。 初級藥物效應動力學 活體外選擇性 利用多種活體外分析來定性化合物（1)之效能及選擇 性。該初級活體外分析使用無細胞之膜製品來提供分泌 酶酶複合物進行活體外分析^化合物（1)強烈抑制丫_分泌酶 酶活性，效能為4 ηΜ。由此點推斷其在基於細胞之報導子 基因分析中可強效抑制澱粉樣蛋白前體（Αρρ; 14 ηΜ)及 Notch (5 ηΜ)處理。ΑΡΡ之細胞處理係使用基kEUSA之讀 數器來量測。HEK293細胞已經改造以過度表現App。由A 1-40 γ分泌酶產物之基於此13八的定量來量測該處理效 應。細胞之Notch抑制活性係使用穩定表現截短之人類 137090.doc 200936139
Notch 1之HEK293細胞系來量測，該截短之人類Notch 1之 細胞内結構域與驅動螢火蟲螢光素酶基因之VP16/Gall4轉 錄激活子融合。由其化學發光所量測，抑制Notch處理會 引起螢光素酶報導子基因活性降低。 機制研究 由γ-分泌酶裂解Notch受體後形成ICN蛋白係Notch信號 轉導中之關鍵性步驟^ ICN移動至細胞核，成為調節包括 i/es /在内之多種乾基因之轉錄的較大轉錄複合物之一部 分。腫瘤細胞系中ICN表現及Notch靶基因產物Hesl之降低 係藉由西方墨點法來檢測。在人類NSCLC A549細胞中處 理五天後，化合物（1)阻抑ICN產生，使得組織培養物中產 生平緩的低轉化腫瘤細胞表現型。化合物（1)之處理在組織 培養物中產生平緩的未轉化表現型。此數據與抑制腫瘤細 胞中之γ-分泌酶一致。在化合物處理後未觀察到細胞凋亡 表現型出現。 軟壤脂中形成菌落之能力代表腫瘤細胞進程中之關鍵。 當將未轉化細胞及致瘤性較差之細胞塗覆於軟環脂_時， 其不能生長。反之，高致瘤性細胞在軟瓊脂條件下生長迅 速’產生較大菌落。量測人類乳癌細胞系MDA-MB-468在 軟瓊脂中之生長潛力，評估化合物（1)對經轉化表現型之影 響。化合物（1)隨劑量變化降低菌落生長（25〇 ηΜ>1〇〇 ηΜ> 對照組）。 活體内評價 臨床前抗腫瘤活性係在數種異種移植物模型中使用多種 137090.doc -61- 200936139 劑量及時間表來測試。在A549 NSCLC模型中，在經QD治 療21天之裸小鼠中，化合物（1)給出統計學上顯著之腫瘤生 長抑制（70% TGI)。使用體重減輕來替代功效測試期間長 期投藥後化合物（1)之總體耐受性。按每天10 mg/kg之時間 表經口投藥時產生功效之暴露（AUC24/天）約為1100 h.ng/ml且不導致體重減輕或顯示毒性臨床體徵。在連續每 天投藥後於第1天與第21天期間未觀察到暴露損失。該研 究結束時所收穫腫瘤之組織學分析揭示壞死面積較大且細 ® 胞外基質增加。 化合物（1)在3/4的定殖腫瘤模型中具有口服活性，該等 定殖腫瘤模型經預測在按每天時間表以低於MTD之劑量投 藥二十一天之裸小鼠中敏感（基於内源Notch信號轉導之程 度）。其在經預測不敏感之1/1模型中不具有活性。功效反 應可能與腫瘤Notchl/Notch3表現比相關。據報導，Notch3 藉由與Notchl ICN競爭核轉錄因子而起Notchl之負調節子 的作用。初步數據顯示，Notch3蛋白質在非反應性異種移 植物細胞系中之表現提高且在敏感性細胞系中之表現降 低。 化合物（1)在3/4的經預測敏感之異種移植物棋型中具有口服 活性且在經預測不敏感之1/1模塑中不具有活性 異種移植物模塑 3 mg/kg qdx21天 (% TGI) 10 mg/kg qdx21天 (% TGI) 30 mg/kg qdx7 天 (% TGI) 60 mg/kg qdx7 天 (% TGI) A549 NSCLC 76 70 - - Calu-6 NSCLC f59 f42 #34 #52 137090.doc -62- 200936139 LOVO結腸 f40 卞83 *59 #85 HCT-116結腸 •85 *76 卜’63 ^90 H460aNSCLC 0 0 ______ 0 0 NSCLC =非小細胞肺癌。 功效=與媒劑對照組相比，％ TGI > 60且p $ 0.05。 . *21天治療結束時的最大TGI。 2 1天治療結東後一週時（21 +/7-)的最大TGI。 #第2輪7天治療（7+/14-/7+)後的最大丁〇1。 ❾ 第2輪7天治療後5天時（7+/14-/7+/5-)的最大丁01。 在21天治療週期中之7天或14天BID治療後，A549模型 中之額外劑量及時間表研究產生介於79_9丨％之間的統計學 上顯著之腫瘤生長抑制且無體重減輕。對7天治療組再監 測43天。在整個觀察期期間腫瘤生長保持穩定。在第66天 重新開始為期7天之投藥’直至第90天仍產生腫瘤生長抑 制。與其他癌症治療藥物所觀察到之功效模式相比，在用 化合物（1)之小鼠中觀察到之功效模式較為獨特，即最大功 〇 效有時在治療停止後延遲一週或兩週，且在治療後亦觀察 到延長之功效。此反應類型與Notch抑制一致❶連續每天 及間歇時間表二者均具有效力且無體重減輕。化合物（丨）適 於週期投藥。此數據支持對於第1階段提出的間歇投藥觀 念。該時間表有助於降低預期來自在人類中每天投藥之潛 在毒性及CYP3A4影響。 按每天經口投藥10 mg/kg時間表產生功效之暴露 (AUC24/天）約為1100 h.ng/ml且不導致體重減輕或顯示毒 137090.doc •63- 200936139 性臨床體徵。在每天投藥之第1天與第21天期間未觀察到 暴露損失，此與在重複劑量後無代謝誘導一致。在大鼠及 狗研究期間亦觀察到於長期投藥後無暴露變化。 活體内機制研究 經γ-分泌酶抑制劑治療之A549異種移植物腫瘤的微陣列 分析揭示RNA表現變化與細胞外基質改變一致。製備經化 合物（1)治療之腫瘤以用於西方墨點分析。第V型膠原之表 現顯著降低’而MFAP5蛋白質之表現提高。在除最高劑量 © 組之外的所有動物組中，Notch-1蛋白質含量及iCN表現均 降低》第V型膠原及MFAP5係構成細胞外基質之結構蛋 白。在更分化之組織中第V型膠原之表現通常降低且 MFAP5之表現通常提高。此數據與A549腫瘤細胞中之 Notch-Ι抑制會導致更分化之表現型的作業假設一致。 實例7 人類胰腺癌異種移植物中之抗腫瘤活性 動物 雌性（無胸腺ww/nu)裸小鼠係自查爾斯河實驗室 (Wilmington, MA)獲得，而雌性SCID-灰棕色小鼠係賭自 Taconic (Germantown, NY)。使用約 8-12 週齡（裸）或 8_1〇週 齡（SCID-裸小鼠）且重約23-25克之小鼠。藉由大體觀察實 驗動物及藉由分析圈養在共用擱板架上之哨兵動物之血液 樣品每天測定一次所有動物之健康狀況。在實驗使用之 前’經最少72小時使所有動物適應新環境並自任何航運相 關壓力恢復過來。隨意提供高壓滅菌水及輕照食品[5〇58_ 137090.doc 200936139 ms Pico飼料（小鼠）Purina，Richmond, IN]，並將動物保持 12小時光照及黑暗循環。籠子、墊料及水瓶在使用前皆經 高壓滅菌且每週更換一次。 肢瘤
MiaPaca2、AsPC 1及BxPC3人類胰腺癌細胞係購自ATCC (Manassas，VA)。BxPC3及 AsPCl 細胞係在 RPMI培養基十 生長且MiaPaca2細胞係在杜貝克改良必需培養基（DMEM) 中生長。所有培養基皆補充有1〇〇/0 (v/v) FBS及1% (v/v) 200 nM L-麩胺酿胺。分別在1/22/07及3/14/07針對每只小 鼠將存於0.2 ml體積PBS中之6 X 106個MiaPaca2細胞或5 X 106個AsPCl細胞經皮下（sc)植入小鼠右後側腹中。在 5/22/07針對每只小鼠將存於〇.2 ml體積1:1基質膠：pbs混合 物中之5 X 106個BxPC3細胞經植入小鼠右後侧腹中。 測試劑 將化合物（1)調配成供經口（p〇)投與之懸浮液，該懸浮液 存於1.0%羥丙纖維素水溶液與0.2% Tween-80中。將調配 之化合物及媒劑於4°C下儲存並每週製備一次，在投與之 前將懸浮液劇烈混合。將吉西他濱（Gemzar⑧，Eli Lilly and Company，indianapolis，IN，USA)用無菌鹽水重構以 獲得用於全部3-4週研究之38 mg/ml儲備溶液。在投藥之 曰用無菌鹽水對吉西他濱實施進一步稀釋以得到用於活體 内投與之期望濃度。 隨機化 分別在細胞植入後第i 7天及第9天使植入Mupaca2或 137090.doc -65· 200936139
AsPC 1異種移植物之裸小鼠隨機化。在植入後8天使具有 BxPC3異種移植物之SCID-灰棕色小鼠隨機化。按照腫瘤 體積使所有小鼠隨機化，由此所有組皆具有約1004 5〇 mm3的類似開始平均腫瘤體積。 開始治療 對於MiaPaca2研究，治療開始於2/8/07(腫瘤植入後第17 天），對於AsPCl開始於3/23/07(腫瘤植入後第9天），且對 於BxPC3研究開始於5/30/07(腫瘤植入後第8天）。口服媒劑 或化合物（1)懸浮液係使用無菌1 ^注射器及18號強飼針 (0.2 ml/動物）每天一次（qd)持續21-28天或使用間歇時間表 (7天服用’ 7天停用’ 7天服用（7+/7-/7+) ; 7天服用，7天停 用（7+/7-) ; 3天服用，4天停用（3+/4-);或14天服用，14天 停用（14+/14-))來投藥。使用i cc注射器及26號針將吉西他 濱經腹膜腔内（ip) q3d(每3天一次）投與至小鼠。 對於MiaPaca2及AsPCl研究，qd化合物⑴懸浮液或q3d 吉西他濱治療在腫瘤細胞植入後第37天結束，而對於 BxPC3研究，qd化合物（1)懸浮液或q3d吉西他濱治療在腫 瘤細胞植入後第35天結束。 對於在MiaPaCa2研究中使用7+/7-/7+時間表間歇投藥化 合物（1)懸浮液，治療在第23天結束，在第31天重新開始， 並於第37天結束。在組合組（組9及10)中，使用7+/7/7+時 間表依序給與化合物（1)懸浮液與吉西他濱，由此化合物 (1)僅在第一週及第三週期間每天投藥，而吉西他濱僅在第 二週期間q3d投藥。 I37090.doc • 66· 200936139 對於在AsPC 1研究中使用7+/7_時間表χ 2個週期間歇投 藥化合物（1)懸浮液，治療在第15天結束，在第23天重新開 始，並最終於第29天結束。對於使用3+/4·時間表χ 4個週 期之間歇投藥，治療在第11天結束，在第丨6天重新開始， 於第18天結束，於第23天重新開始，於第25天結束，於第 30天重新開始，並最終於第32天結束。在第一組合組（組乃 中，每天化合物（1)與q3d吉西他濱同時給與，總共持續四 週。對於剩餘組合組，依序而非同時給與化合物（1 )與吉西 他濱。在組8中，吉西他濱在第1及第3週期間q3d投藥，而 化合物（1)僅在第2及第4週期間每天給與。在組9中，化合 物之投藥次序顛倒過來，化合物（1)懸浮液在第丨及第3週期 間每天給與，而吉西他濱在第2及第4週期間q3d給與。在 組10中，吉西他濱在第1及第2週期間q3d投藥，而化合物 (1)在第3及第4週期間每天給與。在組π中，化合物之投藥 次序顛倒過來，化合物（1)在第丨及第2週期間每天給與，而 吉西他濱在第3及第4週期間q3d投藥。 在治療停止後’在所有三項研究中，在額外隨訪期内用 卡尺測量具有腫瘤之小鼠以評價腫瘤再生長。對於 MiaPaca2研究，隨訪期持續至第63天（治療後26天），對於 AsPCl持續至第48天（治療後11天），且對於BxPC3持續至 第50天（治療後15天）。 s十算及統計學分析 利用下式將重量減輕生動地表示成組平均體重之百分比 變化：（(W-W0)/W0)xlOO，其中，W’表示特定天時治療組之 137090.doc •67· 200936139 平均體重，且表示治療開始時相同治療組之平均體 重。最大重量減輕亦利用上式來表示，且表示在整個實驗 期間之任何時間所觀察到之特定組的最大體重減輕百分 比。毒性定義為給定組中220%的小鼠展示>20%的體重減 輕及/或死亡率。 將功效數據生動地表示成平均腫瘤體積+平均值之標準 誤差（SEM)。利用下式將治療組之腫瘤體積表示成對照組 趙瘤體積之百分比（％ T/C) : l〇〇x((T-T0)/(C-C0))，其中T 表示在實驗期間之特定天時治療組之平均腫瘤髏積，τ〇表 不在治療第一天相同治療組之平均腫瘤體積；C表示在實 驗期間之特定天時對照組之平均腫瘤體積，且“表示在治 療第一天相同治療組之平均腫瘤體積。腫瘤體積（以立方 毫米計）係利用橢圓體公式來計算：（£^(32))/2，其中，D，表 示腫瘤之較大直徑’且’d’表示較小直徑^在一些情形下， 利用下式來計算腫瘤消退及/或腫瘤體積之百分比變化： ((T-T〇)/T0)xl〇〇 ’其中τ表示特定天時治療組之平均腫瘤 體積’且·Τ〇’表示治療開始時相同治療組之平均腫瘤體 積。藉由等級和檢驗及單因素方差分析及事後邦弗朗尼t_ 檢驗（SigmaStat ’ 2.0 版本，Jandel scientific，San
Francisco，CA)來測定統計學分析。當概率值（p)係n〇5 時，認為組間差異顯著。 對於存活評估，將結果以存活百分比相對於腫瘤植入後 之天數續示於圖上（Stat View，S AS Institute，Cary NC)。0/。 ILS按100χ[(治療組之中值存活天數_對照組之中值存活天 137090.doc •68- 200936139 數）/對照組之中值存活天數]來計算。利用Kaplan Meier存 活分析來測定中值存活天數。藉由對數等級檢驗來比較治 療組與媒劑組之存活，並藉*Bresl〇w Gehan_Wilc〇x〇n檢 驗（Stat View，SAS，Cary，NC)來分析各組間之存活比較。 當概率值（p)係<〇.〇5時，認為組間差異顯著。 結果 毒性 在所有二項研究（MiaPaca2、AsPCl、及BxPC3)中，單 獨或組合給與化合物（丨）或吉西他濱之所有劑量及時間表均 具有藉由<20%的動物呈現2 20%體重減輕、發病率或死亡 所界定之良好耐受性。在MiaPaca2研究中，在60 mg/kg q3d吉西他濱及30 mg/kg 7+/7-/7 +化合物（1)組之每一組中 各有一隻小鼠由於誤投藥而死亡。在AsPC 1研究中，在第 22天90 mg/kg吉西他濱單一藥劑組中之一只小鼠由於體重 減輕>20%而被無痛致死，由於在一週期間内漸進性體重 減輕其被視為與毒性相關《在BxPC3研究中，在研究之最 後一天10 mg/kg qd組中之一只小鼠呈現>2〇〇/0體重減輕 (bwl)，由於該小鼠在研究之最後數週期間呈現漸進性體重 減輕，此亦被視為與毒性相關。 功效 當將化合物（1)投與至具有MiaPaca2人類胰腺癌異種移 植物之小鼠時’單獨或與吉西他濱組合均不能達成生物學 上顯著之腫瘤生長抑制（TGI)(藉由NCI界定為TGI2 60%)， 此與劑量或時間表無關[11 ]。與經媒劑治療之對照相比， 137090.doc •69· 200936139 向具有MiaPaca2異種移植物之裸小鼠中連續21天_投與 化合物⑴可達成統計學上顯著但生物學上不顯著之腫瘤生 長抑制(调。在qd組中，觀察到劑量反應，其中與媒劑 治療相比丨mg/kg達成39% TGI (㈣施），3獲得 42% TGI㈣·002) ’且1〇 mg/kg將腫瘤生長抑制训 ㈣.001)。在按7+/7-/7+天時間表（在第！週及第3週每天投 藥)間歇投與化合物⑴之組中，所有三種劑量皆展示生物 學上不顯著之類似生長抑制’表明用該時間表無劑量反 ® 應。60 mg/kg之最高劑量將腫瘤生長抑制48% (ρ5〇.〇〇υ, 而10 mg/kg及30 mg/kg之化合物（1)劑量分別達成5i% tgi (PW001)及 58% TGI (㈣.001)。當以 6〇 mg/kg ㈣投與吉 西他濱時’與媒劑治療對照相比觀察到62% tGI (PS0.001)。在組合組中，抗腫瘤活性既非生物學上顯著亦 非統計學上顯著不同於各化合物0)單一療法組，在吉西他 濱加上化合物（1) 10 mg/kg或30 mg/kg 7+/7_/7+組中TGI為 ❿ 57%或54%。在治療停止後，在為期26天之隨訪期内（直至 第63天）監測腫瘤生長。在第63天，所有組之TGI值皆低於 第37天，表明MiaPaca2腫瘤在治療後再生長。 - 與MiaPaca2研究類似，當將化合物（1)以單一療法投與 至具有AsPCl人類胰腺癌異種移植物之小鼠時，不能達成 生物學上顯著之踵瘤生長抑制’此與劑量或時間表無關。 另一方面’當將化合物（1)與吉西他濱組合給與時，同時給 與兩種藥物或首先給與兩週吉西他濱後依序給與均可達成 生物學上顯著之腫瘤生長抑制。與經媒劑治療之對照相 137090.doc -70· 200936139 比’向具有AsPCl異種移植物之裸小鼠中連續28天（qd)投 與化合物（1)可達成統計學上顯著但生物學上不顯著之腫瘤 生長抑制（TGI) »在3 mg/kg及10 mg/kg qd劑量下，與經媒 劑治療之小鼠相比，分別觀察到49% (p=0.004)及58% TGI (ρ=0·Ό04)。當間歇（3+/4- X 4個週期或7+/7- X 2個週期）投
❹ 藥化合物（1) (10 mg/kg)時，與連續每天投藥相比抗腫瘤活 性減弱（TGI分別為32%及41 %)。q3d投藥90 mg/kg吉西他濱 在AsPC 1胰腺模型中展示非常弱之抗腫瘤活性，與媒劑對 照相比TGI僅為39% (p=〇.〇16)。相比之下，當將化合物（1) 與吉西他濱同時組合投與時，可觀察到增強之抗腫瘤活 性’ TGI為77% (pso.ooi)。此結果與吉西他濱單一療法組 相比不僅生物學上顯著且亦統計學上顯著（p=〇 〇〇5)，但與 化合物（1)單一療法組相比不顯著（p==0 251) ^在按一週排 序之組合組中，儘管在化合物（1)之前投與吉西他濱較顛倒 -人序對AsPCl腫瘤生長之抑制為佳（58% TGI，ρ^Ο.001相對 於37%，ρ=0.012)，但兩種結果均為生物學上不顯著的。 在按兩週排序之組合組中，在化合物（1)之前投與吉西他濱 再次較顛倒次序對AsPCl腫瘤生長之抑制為佳，然而，在 該情形下抗腫瘤活性在生物學上顯著，7〇% TGI (衫〇 〇〇1) 相對於55% TGI (ps〇.001)。在治療停止後監測Aspci腫瘤 生長11天（直至第48天）。在第48天，所有組之TGI值皆低 於第37天，表明AsPCl腫瘤在治療後再生長。 與在MiaPaCa2及八^以胰腺異種移植物模型中化合物（ι) 單一療法未引起穩健腫瘤生長阻抑相比，8^^胰腺異種 137090.doc •71 · 200936139 移植物模型對化合物（1)介導之生長抑制敏感。與媒劑對照 相比’投與3 mg/kg及10 mg/kg化合物（1)以劑量依賴性方 式顯著抑制BxPC3腫瘤生長（生物學上及統計學上），分別 為72% (p<〇.〇〇l)及 82〇/0 TGI (p<〇〇〇1)。類似地，大多數間 歇投藥組亦獲得統計學上及生物學上顯著之腫瘤生長抑 制，儘管未觀察到劑量反應。當使用7+/7_時間表投藥化合 物（1)時’與經媒劑治療之對照小鼠相比，1〇 mg/kg及2〇 mg/kg劑量分別獲得74% (psO.OOl)及63% TGI (ρ=〇·〇〇2)。 β 化合物（1)亦係使用3+/4-時間表來投藥，其中10 mg/kg、 23 mg/kg、及30 mg/kg劑量分別將腫瘤生長抑制56% (ρ=0·002)、64% (ρ<〇.〇〇ι)、及 5〇% (p=〇 〇24)。在治療停 止後監測BxPC3腫瘤生長15天（直至第5〇天）。在第5〇天’ 每天投藥組之TGI值與第35天類似，表明化合物（1)在 BxPC3胰腺模型中引起持續腫瘤生長抑制。
Notch信號轉導途徑與胰腺癌發病有關。在當前研究 ❹ 中，將γ分泌酶抑制劑（化合物丨）單獨或與吉西他濱組合經 口投與至具有定殖π MiaPaca2、腺腫瘤 之小鼠中，持續長達四週。在三種胰腺腫瘤模型中之一種 模型中，化合物（1)作為單一療法引起生物學上顯著之抗腫 瘤活性（藉由NCI界定為TGI260%)。BxPC3模型對化合物 (1)"導之生長抑制敏感’不管化合物是每天還是用 或3+/4_時間表間歇投與。當每天給與化合物（1)時，腫瘤 生長抑制之程度依賴於劑量，而當按間歇時間表給與時抗 腫瘤活性似乎不依賴於劑量。當比較按不同投藥時間表每 I37090.doc -72- 200936139 月所給與之藥物總量時，每天投藥獲得較佳功效。例如’ 當將280 mg/kg之總每月劑量分成qd給與1〇 mg/kg、7+/7-給與10 mg/kg、或3+/4-給與23 mg/kg時間表時，每天投藥 之抗腫瘤活性較佳（分別為82%相對於63%或64% TGI)。在 治療停止後監測BxPC3腫瘤生長1 5天，在此期間每天投藥 組之TGI值保持穩定，表明化合物（1)在BxPC3胰腺模型中 引起持續之腫瘤生長抑制。 儘管化合物（1)作為單一療法在MiaPaca2或AsPCl胰腺腫 Ο 瘤模型中未產生生物學上顯著之功效’但當在AsPCl模型 中與吉西他濱組合時其可增強吉西他濱之抗腫瘤活性。與 化合物（1)或吉西他濱單一療法分別產生58%或39% TGI相 比，同時給與1〇1^/1<;§9(1化合物（1)加上9〇11^/]^吉西他濱 q3d之組合產生77% TGI。當依序而非同時給與化合物（1) 與吉西他濱之組合時，僅吉西他濱在化合物（1)之前給與之 兩週依序組合產生生物學上顯著之腫瘤生長抑制，觀察到 TGI為70%。另一方面，當以顛倒次序給與該兩種藥物 時，僅觀察到55% TGI。 儘管BxPC3、MiaPaca2及AsPCl胰腺腫瘤模型對Notch受 . 體、配體及下游靶標之表現有所不同，但此等差異均未明 顯地表明可能與該等模型對γ分泌酶抑制劑之敏感性聯繫 起來。例如，所有三種細胞系均表現低含量之Notch-1， BxPC3及AsPCl表現低含量之Notch-2，而MiaPaca2表現低 含量之Notch-2且其亦為表現Notch 3及4之唯一細胞系 [12]。所有三種細胞系均表現配體Jagged-Ι，其中AsPCl細 137090.doc •73- 200936139 胞表現最高含量’繼之BxPC3，且MiaPaca2表現最低含 量。配體Jagged-2及δ-l在BxPC3及MiaPaca2細胞中表現， 但不在AsPCl細胞中表現[12]。儘管文獻中有一些數據表 明激活K-Ras中之突變可有利於Notch轉化細胞，但在本研 究中，對g分泌酶介導之生長抑制敏感之唯一腫瘤模型係 野生型 K-Ras (BxPC3)。 ' 在本活體内研究中已證實化合物（1)作為單一療法或與 吉西他濱組合可在一些胰腺腫瘤模型中有效抑制腫瘤生 β 長’然而，各模型之間敏感性具有差異之機制尚知之甚 少〇 雖然已描述本發明之多個實施例，但顯然可改變士
構以提供㈣本發明之其他實_，此並不背離本發明I =及範圍。所有料修改及改㈣意欲包括在 請專利範圍㈣轉財式提供之具體實 = 發明範圍内。 j所疋義之本
137090.doc -74-
Claims (1)
- 200936139 七、申請專利範圍： 1. 一種化合物（1)或其醫藥上可接受之鹽的用途八係用以製備用於治療癌症，尤其是實體腫瘤之藥劑。 2.如μ求項！之用途，其中該治療包括投與治療有效量之 約400 ng-hr/ml至約9000 ng-hr/ml的化合物⑴。 3·如π求項2之用途，其中化合物⑴之該治療有效量係約 1100 ng-hr/ml至約 4100 ng-hr/ml。 4.如凊求項3之用途，其中化合物⑴之該治療有效量係約 φ 1380 ng-hr/ml至約 2330 ng-hr/m卜 5·如*月求項2之用途，其中化合物⑴之該治療有效量係約 4⑻ng_hr/ml至約9〇〇〇ng hr/ml，投與長達約η天。 6·如清求項3之用途，其中化合物⑴之該治療有效量係約 110〇ng-hr/ml至約410〇ng-hr/m卜投與長達約21天。 7.如4求項4之用途，其中化合物⑴之該治療有效量係約 1380 ng-hr/ml至約2330 ng-hr/m卜投與長達約21天。 8如咕求項1之用途，其中化合物（1)係在21天週期之第1、 2、3、8、9及10天每天投與一次。 137090.doc 200936139 9.如清求項8之用途，其中化合物（1)係在21天週期之第1、 λ /¾ 8、9及 10 天以約 400 ng-hr/ml至約 9000 ng-hr/ml 的 量每天投與一次。 1〇·如凊求項1之用途，其中化合物（1)係在21天週期之第1-7 天每天投與一次。 11·如請求項10之用途，其中化合物（1)係在21天週期之第卜 7天以約400 ng-hr/ml至約9000 ng-hr/ml的量每天投與一 次。 © 12.如請求項1之用途，其中化合物⑴係呈醫藥口服單位劑 型。 13. 如叫求項1之用途，其包含使患者額外接受放射療法。 14. 一種式（1)化合物或其醫藥上可接受之鹽的用途其係用以製備用於治療癌症、尤其是實體腫瘤之藥劑， 其中該治療包括在21天週期之第丨、2、3、8、9及1〇天 以約400 ng-hr/ml至約9000 ng_hr/mi的量每天投與一次化 合物（1)。 137090.doc ~ 2 - 200936139 參 15. —種式（1)化合物或其醫藥上可接受之鹽的用途其係用以製備用於治療癌症、尤其是實體腫瘤之藥劑， 其中該治療包括在21天週期之第丨_7天以約400 ng-hr/ml 至約9000 ng-hr/ml的量每天投與一次化合物⑴。 16. —種製備擬用於治療癌症、尤其是實體腫瘤之藥劑的方 法，該方法之特徵在於使用治療有效量之式（1)化合物17.如請求項16之方法’其中化合物（1)之該治療有效量係約 400 ng-hr/ml至約 9000 ng-hr/ml。 1 8.如請求項17之方法’其中化合物（1)之該治療有效量係約 137090.doc 200936139 1100 ng-hr/ml至約 4100 ng-hr/ml。 19. 如請求項18之方法，其中化合物⑴之該治療有效量係約 1380 ng-hr/ml至約 2330 ng-hr/ml。 20. 如請求項17之方法，其中化合物⑴之該治療有效量係約 4〇〇 ng-hr/ml至約9000 ng_hr/m卜投與長達約21天。 如咐求項18之方法，其中化合物⑴之該治療有效量係約 1100 ng-hr/ml至約4100 ng_hr/m卜投與長達約21天。 22. 如明求項19之方法，其中化合物⑴之該治療有效量係約 1380 ng-hr/ml至約233〇ng-hr/m卜投與長達約以天。 23. 如叫求項16之方法，其中化合物（丨）係在η天週期之第 1、2、3、8、9及1〇天每天投與一次。 24. 如請求項23之方法，其中化合物（1)係在21天週期之第 1 2 3、8、9及 1〇天以約 4〇〇 ng_hr/mi 至約 9〇〇〇 ng_ hr/ml的量每天投與一次。 25·如請求項16之方法，其中化合物（1)係在21天週期之第^ 7天每天投與一次。 26. 如明求項25之方法，其中化合物（1)係在2丨天週期之第1· 7天以約400 ng-hr/ml至約9000 ng-hr/ml的量每天投與一 次。 27. 如請求項16之方法’其中化合物⑴係呈醫藥口服單位劑 型0 28. 如請求項16之方法，其包含使患者額外接受放射療法。 29· —種製備擬用於治療癌症、尤其是實體腫瘤之藥劑的方 法，該方法之特徵在於式（1)化合物 137090.doc 20093613930. 或其醫藥上可接受之鹽係在21天週期之第丨、2、3、8、 9及10天以約400 ng-hr/ml至約9〇〇〇 ng_hr/ml的量每天使 用一次。 -種製備擬用於治療癌症、尤其是實體腫瘤之藥劑的方 法，該方法之特徵在於式（丨）化合物❹ 或其醫藥上可接受之鹽係在21天週期之第1-7天以約4〇〇 ng-hr/ml至約9000 ng-hr/ml的量每天使用一次。 31. 一種套組，其包含一或多種口服單位劑型，每一單位含 有約3 mg至約300 mg具有式（1)之化合物（1)或其醫藥上 可接受之鹽 137090.doc 200936139請求項31之套組，其中該等口服單位劑型含有足夠數 量之單位，使患者可在約2丨天期間每天投與約3〇〇 化 合物（1)或其醫藥上可接受之鹽。 33. 如請求項1至15中任一項之用途其中該化合物（1)係與 /α療有效量之吉西他濱（gemcitabine)組合使用。 34. 如請求項33之用途，其係用於治療胰腺癌。 35. 如凊求項16至3〇中任一項之方法其中該化合物（丨）係與 治療有效量之吉西他濱組合使用。 36. 如請求項35之方法，其係用於治療胰腺癌。 137090.doc 200936139 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第(無）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 美 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： ❹137090.doc
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