TW200911984A - Novel strain of Bacillus natto and soft natto produced by using the Bacillus natto strain - Google Patents

Description

200911984 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於新穎之納豆菌，及使用該納豆菌所製造 之新穎之納豆，進而詳細地與具有隨發酵進程而使納豆變 柔軟能力之納豆菌，及使用該納豆菌所製造之軟質納豆有 關。 【先前技術】 納豆係一種將大豆之煮豆藉由屬於枯草桿菌（ B a c i 11 u s s u b t i 1 i s )之納豆菌進行發酵所生產的傳統食品， 而左右納豆品質的因子之一爲硬度（柔軟度）。 在近年喜好軟質納豆的傾向中，進行了例如選用具有 很軟地煮好的特性之大豆、使用加強大豆的蒸煮強度後很 軟地煮成之煮豆等爲製造軟質納豆的試驗，但難以安定地 處理具有很軟地煮好的特性之大豆，且加強大豆的蒸煮強 度時豆色會變黑，反而造成品質低下的問題。 另外，納豆的硬度有報告指出在比較以納豆菌發酵的 前後，以發酵後變爲較硬（例如參照非專利文件1 )。另 外亦報告有隨發酵進程，豆子會變隨有經時的變硬（例如 參照非專利文件2 )。 現今狀況中，若取得其他發酵性能不遜於以往的納豆 菌，且具有隨發酵進程而使納豆變柔軟能力之納豆菌，則 可期待其起絲性、風味、色澤等特性不會遜色，且可安定 製造之軟質納豆。 -5- 200911984 然而實情是目前爲止並無具有該種能力的納豆菌被開 發之報告。 〔非專利文件1〕食總硏報，5 1卷，p · 4 8 - 5 8，1 9 8 7 年 〔非專利文件2〕日本食品工業學會誌，40卷，1號 ，p.75-82 ， 1993 年 【發明內容】 本發明係提供具有隨發酵進程而使納豆變柔軟能力之 納豆菌，以提供使用該納豆菌之軟質納豆之製造方法，及 根據該製造方法所製造之軟質納豆爲目的。 本發明之發明者們爲取得最適合製造軟質之納豆菌參 考各方且重複專心檢討後，發現自主要於韓國被食用，利 用稻桿之韓國傳統的大豆發酵食品戰國醬中分離，選拔之 納豆菌中，存在有其他發酵性能不遜於以往的納豆菌，且 具有隨發酵進程而使納豆變柔軟能力之納豆菌，檢證藉由 使用該經選拔之納豆菌來製造納豆，可製造軟質納豆，而 完成本發明。 亦即，如申請專利範圍第1項記載，本發明係有關一 種屬於具有隨發酵進程而使納豆變柔軟之能力之枯草桿菌 (Bacillus subtilis)之納豆菌。 如申請專利範圍第2項之記載，本發明係有關如申請 專利範圍第1項記載之納豆菌，其中，1 6sRNA基因係如 序列表之序列編號1所記載之鹼基序列所示。 -6 - 200911984 如申請專利範圍第3項之記載，本發明係有關如申請 專利Ib圍桌1或2項記載之納丑菌，其係枯草桿菌Κ3( Bacillus subtilis K3 )株（FERM ΒΡ — 10801 )。 如申請專利範圍第4項之記載，本發明係有關軟質納 豆之製造方法’其係使用如申請專利範圍第1〜3項中任 一項之納豆菌。 如申請專利範圍第5項之記載，本發明係有關根據如 申請專利範圍第4項之納豆之製造方法所製造的納豆。 如申請專利範圍第5項之記載，本發明係有關如申請 專利範圍第5項之軟質納豆，其係根據如申請專利範圍第 4項之納豆之製造方法所製造’且與使用對照納豆菌株之 枯草桿菌 OUV2348 1 (Bacillus subtilis OUV2348 1 )株（ FERM BP— 665 9 )所製造之納豆相比，硬度較低。 如申請專利範圍第6項之記載，本發明係有關如申請 專利範圍第5項之軟質納豆，其係根據如申請專利範圍第 4項之納豆之製造方法所製造，硬度爲0.2〜0.4N。 根據本發明可提供隨發酵進程使納豆變柔軟之納豆菌 (製造軟質納豆之納豆菌），藉由使用該納豆菌生產納豆 ，可製造近年來需求日益增加的軟質納豆。根據本發明其 所獲得之效果，柔軟程度例如具體而言與使用對照納豆菌 株之枯草桿菌OUV23481 (FERM BP - 6659)所製造之納 豆相比，硬度較低，（亦即較爲柔軟）。 以下詳細說明本發明。 本發明進行納豆菌之分離。 200911984 並未特別限制納豆菌之分離源，可爲稻桿、枯葉、土 壤、世界各國之發酵食品等，但以例如韓國之食用大豆發 酵食品戰國醬爲佳。 納豆菌之分離可如下所述方式實施。亦即將做爲納豆 菌分離源之試樣懸濁於滅菌水等，稀釋至適當濃度後，再 將其塗佈於標準洋菜培養基（每1公升含酵母萃取2.5g， 胰化蛋白5.0g，葡萄糖lg，洋菜15g，ρΗ7·1 :榮硏化學 股份有限公司製）上，於37°C培養一晚，再分離所產生的 菌落。 此時以菌落形狀爲指標選擇認爲是納豆菌的菌落爲佳 。進而將所選出之菌落塗佈於SG培養基（蔗糖5%，L-麩 醯胺酸鈉鹽 1.5%，KH2P〇4 (磷酸二氫鉀）0.27%， Na2HP04 · 12H20(磷酸氫二鈉（12 水））0.42%，NaCl 0.05%，MgS04 . 7H2〇 (硫酸鎂7水合物）0.05%，生物素 O.lpg/ ml，洋菜 1.6%，pH 6.4 :參照例如特開平 10-2 1 5 86 1號公報）上，於37°C培養一晚，再選擇生成黏性 物質的菌落。 自所得菌落遵循常用方法製成孢子液（參照例如特開 平10-215861號公報），可得納豆製造用之種菌。 可依常用方法製造納豆。例如將浸漬後之大豆瀝乾水 分，以0.18MPa蒸煮18分鐘後所得之蒸煮大豆每lg植入 1000至4000個孢子，每40g裝入PSP盤，以薄被膜覆蓋 表面，再加上蓋子後，置入批次式納豆發酵室，於室溫3 7 〜42t，高溼度下進行發酵。發酵完成後，使其熟成後， -8- 200911984 評價所製成之納豆的品質。且納豆硬度之評價可實施官# 評價以及硬度測定（參照例如特開20〇4-24 1 97號公報） 〇 目標納豆之選拔可以如下所述之方式實施。亦即，使 用經選擇之納豆菌做爲種菌而製造納豆，首先將僅能製^ 起絲性弱納豆之納豆菌排除。其次，將使用現有的納豆菌 枯草桿菌 OUV23481 (Bacillus subtilis OUV23481 )株（ FERM BP - 66 5 9 )(以下有時會稱做 OUV2 3 48 1株）（ 參照例如特開2000-28 7 676號公報）所生產之納豆做爲對 照，可選擇可製造較其柔軟的納豆之納豆菌。進而進行使 用經選擇之納豆菌所製造之納豆品質之評價，可選拔硬度 之外之有關品質指標優異的納豆菌。 枯草桿菌 OUV23 48 1 (Bacillus subtilis OUV2348 1 ) 株係通商產業省工業技術院生命工學工業技術硏究所（1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305- 8566 ( JP ) )，獨立行政法人產業技術硏究所專利生物寄存中心（1 -6, Higashi 1-chome，Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566 ( JP) )，於1999年（平成11年）2月23曰寄存，其編號爲 FERM BP— 6659。 對於可製造如上所述經選拔之軟質納豆之優異的納;g 菌之納豆生產的利用，可採取自過去即已被實施之方法， 並無特別限制。 例如一般的以完整的黃豆做爲原料而製造之納豆，φ 稱爲九大豆納豆，亦有以一部分預先輾碎的大豆做爲原米斗 -9- 200911984 的碎型納豆。 九大豆納豆的製造方法一般係將原料之完整大豆浸漬 於冷水中十數小時後，於蒸煮鍋中使用加壓蒸氣進行加壓 蒸煮（0.15〜〇.20MPa)，再對所得之蒸煮大豆於高溫（ 70〜100 °C )狀態下接種納丑並進行混合後充於規定 的容器內後再搬入發酵室中，於室溫37〜42 °C下’使其發 酵規定之時間（1 5〜2 0小時左右）之後，於5 °C前後進行 冷藏熟成（12〜72小時左右）而完成。 製作碎型納豆時除將預先輾碎的大豆浸漬於水中之外 ，其他則與九大豆納豆的製造方法相同° 於該種以往納豆之製作方法中’可將於本發明之發酵 步驟中使用之納豆菌，藉由取代根據前述之方法所選拔出 之優異的納豆菌而使用，而可進行製造。如此’可製造較 過去納豆更爲軟質之納豆。 根據本發明之製造方法所製造之納豆’於製造完成時 非常柔軟，顯示其僅具由對照株（OUV2 348 1株）所製成 之納豆硬度（N)之50〜75 %左右的硬度（N)(換言之與 對照納豆相比具有相當的柔軟度）。另外，相對於隨發酵 時間經過，對照株之硬度（N )增加，與本發明有關之納 豆其特徵爲完全相反地降低硬度（N)。 於進行發酵第12個小時’與本發明有關之納豆硬度 (N)爲對照納豆之75〜85%，於進行發酵第18個小時’ 爲對照納豆之40〜50%，與本發明有關之納豆硬度（N ) 較對照納豆更低，且隨發酵時間經過而變得更低。另外’ -10- 200911984 針對兩種納豆隨時間經過硬度（N )的變化，對照 進行發酵第1 8個小時時，與第1 2個小時相比增力口 〜1 3 5 % ’但與本發明有關之納豆卻完全相反，減c 〜7 5 % (—般爲6 0〜7 0 % )。 因此，根據本發明不僅可獲得較對照更柔軟之 且相對於對照納豆隨發酵時間經過變硬，與本發明 納豆卻反而變得更軟，而可充分期待製造完成後之 豆，爲其極大之特徵。當然，與本發明有關之納豆 起絲性、硬度（官能評價）、風味等，亦確認與對 相比毫不遜色’而可稱與本發明有關之納豆係新穎 有用的食品。 【實施方式】 實施例 以下舉實施例等具體說明本發明。 (實施例1 ) (1 )納豆菌之分離 將戰國醬懸濁於適量的滅菌水中，並稀釋滅菌 將其塗佈於標準洋菜培養基（榮硏化學股份有限公 ，於3 7 °c培養1晚後，將出現之菌落植入S G培養 於3 7 °C進行2 4小時培養後，選擇產生黏性物質之 將所得之菌製作成孢子液，根據常用方法製造納豆 納豆於 了 110 & 了 55 納豆， 有關之 軟質納 關於其 照納豆 且極爲 水後， 司製） 基，再 菌。再 -11 - 200911984 (2 )納豆之評價 對所製造之納豆的起絲進行官能評價，排除表現較弱 者。其次，對納豆的硬度進行官能評價，選擇軟質者，再 以下所述之硬度計確認硬度。 硬度計係使用將裝置有直徑1.5mm活塞之電子式拉力 計（型號：FGC-0.2，日本電產Sinpo公司製），其活塞 的一部分設置於電動式縱型簡易檢驗台（型號：FGS-50V-L，日本電產Sinpo公司製）下方者。 於是首先將待測納豆加溫至1 5〜2 5 °C後，以不夾碎豆 粒的方式，將任意一粒置於上述之電動式縱型簡易檢驗台 上。 其後，使該電子式拉力計以60mm /分之速度下降， 以活塞刺入豆粒中心的方式將其壓碎。當活塞降至距豆粒 底部1±0.2mm時，停止電子式拉力計下降，並紀錄此時之 表示値（單位：牛頓（N )，峰値）。 以下，針對合計1 4粒進行相同步驟計測表示値後， 排除最高的2個與最低的2個表示値，以1〇粒份之表示 値進行平均，而求出納豆硬度（N)。 進行納豆評價時，以相同蒸煮條件、發酵條件’使用 OUV23 48 1株所製造之納豆做爲對照。 表1係表示使用以上述方法所選拔出之納丑囷所製造 之納豆其起絲性、硬度（官能評價）及硬度。 -12- 200911984 表1 菌株名稱 起絲性 硬度 硬度(N) K3株 普通 柔軟 0.218 R1株 普通 柔軟 0.251 R4株 普通 稍柔軟 0.325 W1株 普通 柔軟 0.276 W4株 稍弱 稍柔軟 0.291 W5株 普通 稍柔軟 0.297 OUV23481 株 普通 普通 0.431 以該等納豆菌進行煮豆發酵時，可製造與以 Ο U V 2 3 4 8 1株所製造之納豆相比軟質之納豆。 (實施例2 ) 使用於實施例1所得之納豆菌中可產生最爲軟質之納 豆之K3株與〇UV23481株’遵循常用方法製造納豆。並 自發酵開始時經時地測定納豆的硬度。其結果示於表2 ° 表2 OUV23481 株 K3株 發酵時間 硬度(N) 起絲性 風味 硬度(N) 起絲性 風味 12小時 0.433 弱 弱 0.360 弱 弱 15小時 0.407 稍弱 弱 0.326 稍弱 弱 18小時 0.555 普通 普通 0.246 普通 普通 使用現有之〇UV23 4 81株進行發酵時’於發酵最後的 階段硬度增加。即爲逐漸變硬。反之，使用K3株且經過 發酵之納豆’於全部的發酵過程中’較使用0UV23 4 8 1株 -13- 200911984 所製造之納豆更爲柔軟。另外，隨發酵時間經過，一貫維 持低硬度’並逐漸變軟（表2 )。且使用K3株所製造之 納豆’其味道、風味、起絲性與使用〇 U V 2 3 4 8 1株所製造 之納豆同等。 (實施例3 ) 將K3株於細菌學上之特徵，與枯草桿菌（Bacilius subtilis)進行比較之結果示於表3。針對各指標，係參照 Bergey s manual of determinative bacteriology 8th ( The

Williams and Wilkins company, 1 974 )」、「食品微生物學 手冊（技報堂出版（股份有限），1 995年）」、「好氧性 形成芽孢菌圖鑑（日本Becto n，Dickinson (股份有限）， 2004年）」並進行檢查。 表3 指標 K3株 Bacillus subtilis 型態 桿菌 桿菌 革蘭氏染色 + + 形成芽孢 + + 需氧培養下生長 + + 厭氧培養下生長 - _ 利用檸檬酸 + +/- VP + + 自葡萄糖產生酸 + + 還原硝酸鹽 - +/- 自甘露醇產生酸 - +/- 圖1及序列表中序列中序列編號1表示K3株之 -14- 200911984 16sRNA基因之鹼基序列。16sRNA基因係使用圖2所示之 引子進行增幅並決定鹼基序列。 亦 β卩，使用 Quicklyse Miniprep Kits ( QIAGE 公司製 )所萃取出的K3株之DNA做爲鑄型，使用圖2所示之引 子，針對藉由 GeneAmp PCR 系統 2400 ( Appliedbiosystems Japan公司製）進行PCR反應所得之增幅片斷，再使用 ABI PRISM 3700 (Appliedbiosystems Japan 公司製）決定 鹼基序列。 所使用之引子爲27F (序列編號2) 、520R(序列編 號3 ) 、520F (序列編號4 ) 、920R (序列編號5 )、 920F (序列編號6 ) 、1 492R (序列編號7 )。且將該等引 子之鹼基序列整理示於圖2。 K3株之 16sRNA基因之鹼基序列，與枯草桿菌（ Bacillus subtilis)之比對株之枯草桿菌 DMS10 ( Bacillus subtilis DMS10)株之 16sRNA基因之鹼基序列，具有 99.9%以上之相似性。 由上述結果，K3株與現有之納豆菌相同，同屬於枯 草桿菌（Bacillus subtilis)。 因此K3株係於可製造軟質納豆此點爲極具特徵者。 於是將K3株以枯草桿菌K3 ( Bacillus subtilis K3 )之名 稱，向獨立行政法人 產業技術硏究所 專利生物寄存 中心（1-6, Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566(JP))，於平成19年（2007年）3月19日申請寄 存。其受託編號爲FERM BP — 10801。 -15- 200911984 另外，K3株與特開2002-23 3 3 9 1號公報中所記載之 Bacillus subtilis var. chungkookjang KCTC 0697ΒΡ 株不同 ，較易孢子化。亦即，K3株於營養培養基（酵母萃取2% 、食鹽0.5%、ρΗ7 )於37°C、48小時之震動培養，或孢 子形成培養基（參照例如特開平10-2 1 5 86 1號公報）於37 °C、24小時之震動培養，均可確認90%以上產生孢子化。 因此，可確認 K3 株與 Bacillus subtilis var. chungkookjang 不同。 【圖式簡單說明】 〔圖1〕表示K3株之16sRNA基因之鹼基序列之圖。 〔圖2〕表示各種引子之鹼基序列之圖。 -16- 200911984 序列表 <110〉味滋康集團有限公司 <120〉新穎之納豆菌，及使用該納豆菌所製造之軟質納豆 <130> 7002 <140〉 2007-4-25 <160〉 7 <210> 1 <211> 1486 <212〉 DNA <213〉枯草桿菌 <400> 1 ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg gacagatggg 60 agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa 120 gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt 180 caaacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt 240 tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc 300 acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc 360 aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa 420 gctctgttgt tagggaagaa caagtaccgt tcgaataggg cggtaccttg acggtaccta 480 accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540 tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc 600 ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag 660 tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg 720 cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag 780 ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct 840 tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac 900 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 960 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt 1020 cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080 taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta 1140 aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200 tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg 1260 ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg 1320 aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380 gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt 1440 ttaggagcca gccgccgaag gtgggacaga tgattggggt gaagtc 1486 〈210〉 2 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210〉 3 <211〉 18 <212> DNA <213〉人工序列 18200911984 <400> 3 gtattaccgc ggctgctg <210> 4 <211〉 18 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 4 cagcagccgc ggtaatac 18 〈210〉 5 <211〉 20 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 5 ccgtcaattc atttgagttt 20 <210〉 6 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 6 aaactcaaat gaattgacgg <210〉 7 <211〉 19 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <400〉 7 ggctaccttg ttacgactt 20 19

Claims (1)

1. 200911984 十、申請專利範圍 1. 一種納豆菌，其係屬於具有隨發酵進程而使納豆 變柔軟之能力之枯草桿菌（Bacillus subtilis)。 2. 如申請專利範圍第1項之納豆菌，其中16sRNA 基因係如序列表之序列編號1所記載之鹼基序列所示。 3-如申請專利範圍第1或2項之納豆菌，其係枯草 桿菌 K3 ( Bacillus subtilis K3)株（FERM BP-10801 )。 4 · 一種納豆之製造方法，其係使用如申請專利範圍 第1〜3項中任一項之納豆菌。 5 _ —種軟質納豆’其係根據如申請專利範圍第4項 之納豆之製造方法所製造。 6.如申請專利範圍第5項之軟質納豆，其係根據如 申請專利範圍第4項之納豆之製造方法所製造，硬度爲 0_2 〜0.4N。