CN106701652B - 一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺 - Google Patents
一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺：(1)制备种子培养基；(2)种子培养；(3)制备发酵培养基：配方：葡萄糖，麸皮、豆粕粉、NaCl、水苏糖、磷酸二氢钾、氯化钙,植物复合发酵提取液，pH7.5；(4)发酵培养：发酵条件：快速发酵阶段：接种量为4％(v/v)，液量75％，低温32‑35℃，培养时间18‑20小时，期间充分供氧；快速发酵期间分2次补加葡萄糖，控制补加后终浓度不高于20％。芽孢诱导阶段：加入臭椿萜酮降温至10‑15℃厌氧发酵2‑3h以提高芽孢率。具有耗时短，成本低，芽孢率超高，具有很大的经济价值，在农业养殖领域具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，属于微生物培养领域。
背景技术
发酵床养猪是应用含有纳豆芽孢杆菌、枯草杆菌、放线杆菌、乳酸菌等一种或多种有益微生物的特制菌群制剂，与锯末、稻壳、秸秆等垫料混合，铺设成发酵床，有益菌通过耗氧和厌氧发酵，大量繁殖形成优势菌群。饲养在发酵床上的猪将粪尿排泄到发酵床里，通过猪拱或人工翻动，粪尿与垫料充分搅拌混合均匀，粪尿在垫料中被有益菌迅速降解消化、无臭味、无污染，从而达到粪尿零排放、节能增效、环境友好的目标。日本、韩国等主要是应用纳豆芽孢杆菌单一菌种进行发酵降解，主要是耗氧发酵。我国采用土著菌培养加工成育生菌制剂，菌群种类繁多，主要是枯草杆菌、放线杆菌和乳酸菌，通过耗氧和厌氧发酵进行降解。该技术在应用中不断发展和完善。该技术的关键是垫料碳氮比与发酵微生物的选择，以及发酵床的铺设和管理。由于微生物菌群制剂不同，不同地区的垫料原料差别很大，配套技术还不完善，致使应用效果差异较大。
纳豆芽孢杆菌是一种从保健食品纳豆中分离出来的益生菌，属于枯草芽孢杆菌的一个亚种。纳豆芽孢杆菌应用于饲料中不仅可以提高畜禽对饲料中营养物质的吸收，还可以调节机体的肠内微生态环境，提高动物肌体的免疫力。由于菌体在生产过程中极易失去活性，而纳豆芽孢杆菌所能形成的芽孢，能够耐酸碱、耐高温及耐挤压，并且芽孢在肠道中不增殖，只在肠道上段迅速发育转变成具有新陈代谢作用的营养型细胞，具有十分良好的稳定性及生产性能。
现有技术纳豆芽孢杆菌生产成本高，耗时长，芽孢率低，本发明旨在提供一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，具有耗时短，成本低，芽孢率超高，具有很大的经济价值，在农业养殖领域具有广阔的市场前景。
发明内容
针对现有技术的缺点，本发明提供一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，具有耗时短，成本低，芽孢率超高，具有很大的经济价值，在农业养殖领域具有广阔的市场前景。
菌体生长是一个复杂的过程，众多因素都影响着菌体的生长状况，如温度、pH、供氧强度、底物浓度、产物浓度等。一般而言，糖浓度适宜菌体生长良好，发酵结束获得较高的菌体量和产物浓度,高浓度糖的抑制作用，菌体量和产酸水平均受到影响。本发明提供一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，具有耗时短，成本低，芽孢率超高的优点。
臭椿Ailanthus altissima(Mill.)Swingle为苦木科(Simaroubaceae)臭椿属植物，落叶乔木，是我国本土树种，除黑龙江、吉林和海南外，全国各地均有分布。臭椿的根皮和茎皮入药，称为椿皮，为《中国药典》2010年版收载，具有清热燥湿、止血和杀虫的功效。国内外在20世纪60～80年代对臭椿根皮和茎皮进行了大量的研究，这与椿白皮的氯仿提取物显示出较强的抗疟疾活性有关。近些年对臭椿的研究又逐渐增多，主要转移到抗癌、抗病毒等方面，并且分离得到一些新的化学成分作为活性研究的物质基础。研究证明，臭椿发挥其抗疟疾、抗癌、抗病毒等生物活性的物质基础主要是苦木苦味素类化合物。王乐飞等人从臭椿根皮的乙醇提取物中分离得到1个达玛烷型三萜，结构鉴定为20(R)-24,25-三羟基达玛烷-3-酮(1)，命名为臭椿萜酮，其具有较弱的抑菌效果。
所述臭椿萜酮的化学结构式为：
本发明人发现，通过在芽孢诱导阶段加入微量臭椿萜酮，配合之前的培养优化，具有显著的提高芽孢率的技术效果。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，其步骤如下：
(1)制备种子培养基：
配方如下：葡萄糖50g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨8g/L，牛肉膏3g/L，植物复合发酵提取液5-8g/L，硫酸铵0.05g/L，NaCl 0.5g/L，磷酸二氢钠3g/L，硫酸镁0.02g/L；
所述植物复合提取液的制备方法如下：
按照重量份，称取蒺藜10-15份，玫瑰5-8份，海底椰2份，鱼腥草1份，加入100份去离子水，保持煮沸20min，然后静置24小时，再用200目的滤布过滤，得到提取液以及药渣；
将所得的药渣与去离子水按重量体积比1∶5加入去离子水，再次煮沸并保持沸腾50min，过滤，得到滤液；
将两种滤液混合后，取5份混合滤液，1份去渣芒果皮汁混合，得到植物复合提取液；
按照接种量3％接种罗伊乳酸杆菌，在恒温29℃下，低温发酵12-16小时，然后升温至80℃，灭活罗伊乳酸杆菌，得植物复合发酵提取液；
(2)种子培养：
种子培养条件：温度40℃，初始pH值为7.0，转速230r/min，装液量为40mL(250mL的三角瓶)，接种量为5％(v/v)，发酵时间5-8h；
(3)制备发酵培养基：
配方：葡萄糖200-250g/L，麸皮2g/L、豆粕粉5g/L、NaCl0.8g/L、水苏糖0.5-0.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙32mg/L,植物复合发酵提取液2-3g/L，pH7.5；
(4)发酵培养：
发酵条件：
快速发酵阶段：接种量为4％(v/v)，液量75％，低温32-35℃，培养时间18-20小时，期间充分供氧；
快速发酵期间分2次补加葡萄糖，控制补加后终浓度不高于20％。
芽孢诱导阶段：快速发酵后，臭椿萜酮用二甲基亚砜(DMSO)溶解，将其稀释为100μg/m L的稀释液，然后按照终浓度5-8μg/L的浓度加入培养基，降温至10-15℃厌氧发酵2-3h以提高芽孢率。
本发明的有益之处在于：
1.菌体生长是一个复杂的过程，众多因素都影响着菌体的生长状况，如温度、pH、供氧强度、底物浓度、产物浓度等。本发明通过特殊工艺生产纳豆芽孢杆菌，其具有耗时短，成本低，芽孢率超高，生产过程不产生泡沫，无菌体自溶现象，具有很大的经济价值，在农业养殖领域具有广阔的市场前景。
2.本发明创新使用植物复合发酵提取液，配合培养基的优化，培养条件的优化，最终获得超高芽孢率的纳豆芽孢杆菌，非常适合用于仔猪繁育垫料。
具体实施方式
实施例1：
本发明实施例所用菌株购于韶关市颐林泉生物科技有限公司，为普通饲料用纳豆芽孢杆菌。
一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，其步骤如下：
(1)制备种子培养基：
配方如下：葡萄糖50g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨8g/L，牛肉膏3g/L，植物复合发酵提取液5g/L，硫酸铵0.05g/L，NaCl 0.5g/L，磷酸二氢钠3g/L，硫酸镁0.02g/L；
所述植物复合提取液的制备方法如下：
按照重量份，称取蒺藜10份，玫瑰8份，海底椰2份，鱼腥草1份，加入100份去离子水，保持煮沸20min，然后静置24小时，再用200目的滤布过滤，得到提取液以及药渣；
将所得的药渣与去离子水按重量体积比1∶5加入去离子水，再次煮沸并保持沸腾50min，过滤，得到滤液；
将两种滤液混合后，取5份混合滤液，1份去渣芒果皮汁混合，得到植物复合提取液；
按照接种量3％接种罗伊乳酸杆菌，在恒温29℃下，低温发酵15小时，然后升温至80℃，灭活罗伊乳酸杆菌，得植物复合发酵提取液；
(2)种子培养：
种子培养条件：温度40℃，初始pH值为7.0，转速230r/min，装液量为40mL(250mL的三角瓶)，接种量为5％(v/v)，发酵时间6h；
(3)制备发酵培养基：
配方：葡萄糖230g/L，麸皮2g/L、豆粕粉5g/L、NaCl0.8g/L、水苏糖0.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙32mg/L,植物复合发酵提取液2g/L，pH7.5；
(4)发酵培养，使用50L发酵罐：
发酵条件：
快速发酵阶段：接种量为4％(v/v)，液量75％，低温35℃，培养时间20小时，期间充分供氧，可以观察到只有少量泡沫产生；
快速发酵期间分2次补加葡萄糖，控制补加后终浓度不高于20％。快速发酵阶段后，活菌数达到36.2亿CFU/mL，芽孢率86.3％；
芽孢诱导阶段：快速发酵后，臭椿萜酮用二甲基亚砜(DMSO)溶解，将其稀释为100μg/m L的稀释液，然后按照终浓度5μg/L的浓度加入培养基，降温至15℃厌氧发酵3h以提高芽孢率。
最终活菌数为36.2亿CFU/mL，芽孢数为34.75亿CFU/mL，芽孢率为96％。
实施例2：
一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，其步骤如下：
(1)制备种子培养基：
配方如下：葡萄糖50g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨8g/L，牛肉膏3g/L，植物复合发酵提取液6g/L，硫酸铵0.05g/L，NaCl 0.5g/L，磷酸二氢钠3g/L，硫酸镁0.02g/L；
所述植物复合提取液的制备方法如下：
按照重量份，称取蒺藜12份，玫瑰5份，海底椰2份，鱼腥草1份，加入100份去离子水，保持煮沸20min，然后静置24小时，再用200目的滤布过滤，得到提取液以及药渣；
将所得的药渣与去离子水按重量体积比1∶5加入去离子水，再次煮沸并保持沸腾50min，过滤，得到滤液；
将两种滤液混合后，取5份混合滤液，1份去渣芒果皮汁混合，得到植物复合提取液；
按照接种量3％接种罗伊乳酸杆菌，在恒温29℃下，低温发酵15小时，然后升温至80℃，灭活罗伊乳酸杆菌，得植物复合发酵提取液；
(2)种子培养：
种子培养条件：温度40℃，初始pH值为7.0，转速230r/min，装液量为40mL(250mL的三角瓶)，接种量为5％(v/v)，发酵时间6h；
(3)制备发酵培养基：
配方：葡萄糖250g/L，麸皮2g/L、豆粕粉5g/L、NaCl0.8g/L、水苏糖0.6g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙32mg/L,植物复合发酵提取液3g/L，pH7.5；
(4)发酵培养，使用50L发酵罐：
发酵条件：
快速发酵阶段：接种量为4％(v/v)，液量75％，低温32℃，培养时间19小时，期间充分供氧，可以观察到只有少量泡沫产生；
快速发酵期间分2次补加葡萄糖，控制补加后终浓度不高于20％。快速发酵阶段后，活菌数达到36.9亿CFU/mL，芽孢率85.3％；
芽孢诱导阶段：快速发酵后，臭椿萜酮用二甲基亚砜(DMSO)溶解，将其稀释为100μg/m L的稀释液，然后按照终浓度8μg/L的浓度加入培养基，降温至12℃厌氧发酵2h以提高芽孢率。
最终活菌数为36.9亿CFU/mL，芽孢数为36.53亿CFU/mL，芽孢率为99％。
实施例3：
一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，其步骤如下：
(1)制备种子培养基：
配方如下：葡萄糖50g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨8g/L，牛肉膏3g/L，植物复合发酵提取液7g/L，硫酸铵0.05g/L，NaCl 0.5g/L，磷酸二氢钠3g/L，硫酸镁0.02g/L；
所述植物复合提取液的制备方法如下：
按照重量份，称取蒺藜14份，玫瑰5份，海底椰2份，鱼腥草1份，加入100份去离子水，保持煮沸20min，然后静置24小时，再用200目的滤布过滤，得到提取液以及药渣；
将所得的药渣与去离子水按重量体积比1∶5加入去离子水，再次煮沸并保持沸腾50min，过滤，得到滤液；
将两种滤液混合后，取5份混合滤液，1份去渣芒果皮汁混合，得到植物复合提取液；
按照接种量3％接种罗伊乳酸杆菌，在恒温29℃下，低温发酵13小时，然后升温至80℃，灭活罗伊乳酸杆菌，得植物复合发酵提取液；
(2)种子培养：
种子培养条件：温度40℃，初始pH值为7.0，转速230r/min，装液量为40mL(250mL的三角瓶)，接种量为5％(v/v)，发酵时间7h；
(3)制备发酵培养基：
配方：葡萄糖200g/L，麸皮2g/L、豆粕粉5g/L、NaCl0.8g/L、水苏糖0.7g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙32mg/L,植物复合发酵提取液3g/L，pH7.5；
(4)发酵培养，使用50L发酵罐：
发酵条件：
快速发酵阶段：接种量为4％(v/v)，液量75％，低温32℃，培养时间20小时，期间充分供氧，可以观察到只有少量泡沫产生；
快速发酵期间分2次补加葡萄糖，控制补加后终浓度不高于20％。快速发酵阶段后，活菌数达到35.8亿CFU/mL，芽孢率85.8％；
芽孢诱导阶段：快速发酵后，臭椿萜酮用二甲基亚砜(DMSO)溶解，将其稀释为100μg/m L的稀释液，然后按照终浓度5μg/L的浓度加入培养基，降温至12℃厌氧发酵2h以提高芽孢率。
最终活菌数为35.8亿CFU/mL，芽孢数为34.37亿CFU/mL，芽孢率为96％。
实施例4：
一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，其步骤如下：
(1)制备种子培养基：
配方如下：葡萄糖50g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨8g/L，牛肉膏3g/L，植物复合发酵提取液8g/L，硫酸铵0.05g/L，NaCl 0.5g/L，磷酸二氢钠3g/L，硫酸镁0.02g/L；
所述植物复合提取液的制备方法如下：
按照重量份，称取蒺藜4份，玫瑰6份，海底椰2份，鱼腥草1份，加入100份去离子水，保持煮沸20min，然后静置24小时，再用200目的滤布过滤，得到提取液以及药渣；
将所得的药渣与去离子水按重量体积比1∶5加入去离子水，再次煮沸并保持沸腾50min，过滤，得到滤液；
将两种滤液混合后，取5份混合滤液，1份去渣芒果皮汁混合，得到植物复合提取液；
按照接种量3％接种罗伊乳酸杆菌，在恒温29℃下，低温发酵16小时，然后升温至80℃，灭活罗伊乳酸杆菌，得植物复合发酵提取液；
(2)种子培养：
种子培养条件：温度40℃，初始pH值为7.0，转速230r/min，装液量为40mL(250mL的三角瓶)，接种量为5％(v/v)，发酵时间6h；
(3)制备发酵培养基：
配方：葡萄糖220g/L，麸皮2g/L、豆粕粉5g/L、NaCl0.8g/L、水苏糖0.6g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙32mg/L,植物复合发酵提取液2g/L，pH7.5；
(4)发酵培养，使用50L发酵罐：
发酵条件：
快速发酵阶段：接种量为4％(v/v)，液量75％，低温32℃，培养时间19小时，期间充分供氧，可以观察到只有少量泡沫产生；
快速发酵期间分2次补加葡萄糖，控制补加后终浓度不高于20％。快速发酵阶段后，活菌数达到36.6亿CFU/mL，芽孢率86.1％；
芽孢诱导阶段：快速发酵后，臭椿萜酮用二甲基亚砜(DMSO)溶解，将其稀释为100μg/m L的稀释液，然后按照终浓度8μg/L的浓度加入培养基，降温至12℃厌氧发酵2h以提高芽孢率。
最终活菌数为36.6亿CFU/mL，芽孢数为35.13亿CFU/mL，芽孢率为96％。
实施例5：
对比试验采用常规发酵方法：
一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，其步骤如下：
(1)制备种子培养基：
配方如下：葡萄糖50g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨8g/L，牛肉膏3g/L，硫酸铵0.05g/L，NaCl 0.5g/L，磷酸二氢钠3g/L，硫酸镁0.02g/L；
(2)种子培养：
种子培养条件：温度40℃，初始pH值为7.0，转速230r/min，装液量为40mL(250mL的三角瓶)，接种量为5％(v/v)，发酵时间5-8h；
(3)制备发酵培养基：
配方：葡萄糖200-250g/L，麸皮2g/L、豆粕粉5g/L、NaCl0.8g/L、水苏糖0.5-0.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙32mg/L,pH7.5；
(4)发酵培养，使用50L发酵罐：
发酵条件：
快速发酵阶段：接种量为4％(v/v)，液量75％，37℃，培养时间36小时，期间充分供氧，可以观察到有大量泡沫产生，并且菌体自溶现象严重；
快速发酵期间分2次补加葡萄糖，控制补加后终浓度不高于20％。快速发酵阶段后，活菌数仅仅1.2亿CFU/mL，几乎无芽孢。
芽孢诱导阶段：然后降温至10-15℃厌氧发酵2-3h以提高芽孢率。
最终活菌数为1.2-1.3亿CFU/mL，芽孢数约为0.31-0.35亿CFU/mL，芽孢率很低。
综上，本发明通过特殊工艺生产纳豆芽孢杆菌，其具有耗时短，成本低，芽孢率超高，生产过程不产生泡沫，无菌体自溶现象，具有很大的经济价值，在农业养殖领域具有广阔的市场前景。本发明创新使用植物复合发酵提取液，配合培养基的优化，培养条件的优化，臭椿萜酮的应用，最终获得超高芽孢率的纳豆芽孢杆菌，非常适合用于仔猪繁育垫料。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种生物垫料菌纳豆芽孢杆菌的生产工艺，其步骤如下：
(1)制备种子培养基，制备配方为：葡萄糖50g/L，酵母粉8g/L，蛋白胨8g/L，牛肉膏3g/L，植物复合发酵提取液5-8g/L，硫酸铵0.05g/L，NaCl 0.5g/L，磷酸二氢钠3g/L，硫酸镁0.02g/L；
所述植物复合发酵提取液的制备方法为：按照重量份，称取蒺藜10-15份，玫瑰5-8份，海底椰2份，鱼腥草1份，加入100份去离子水，保持煮沸20min，然后静置24小时，再用200目的滤布过滤，得到提取液以及药渣；将所得的药渣与去离子水按重量体积比1∶5加入去离子水，再次煮沸并保持沸腾50min，过滤，得到滤液；将两种滤液混合后，取5份混合滤液，1份去渣芒果皮汁混合，得到植物复合提取液；按照接种量3％接种罗伊乳酸杆菌，在恒温29℃下，低温发酵12-16小时，然后升温至80℃，灭活罗伊乳酸杆菌，得植物复合发酵提取液；
(2)种子培养，种子培养条件为：温度40℃，初始pH值为7.0，转速230r/min，装液量为40mL，接种量为5％v/v，发酵时间5-8h；
(3)制备发酵培养基：
配方：葡萄糖200-250g/L，麸皮2g/L、豆粕粉5g/L、NaCl0.8g/L、水苏糖0.5-0.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙32mg/L,植物复合发酵提取液2-3g/L，pH7.5；
(4)发酵培养，其发酵条件为：
快速发酵阶段：接种量为4％v/v，液量75％，低温32-35℃，培养时间18-20小时，期间充分供氧；
快速发酵期间分2次补加葡萄糖，控制补加后终浓度不高于20％；
芽孢诱导阶段：快速发酵后，臭椿萜酮按照终浓度5-8μg/L的浓度加入培养基，降温至10-15℃厌氧发酵2-3h以提高芽孢率。
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2017
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