TW200918090A - Combination therapy with type I and type II anti-CD20 antibodies - Google Patents

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200918090 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明針對2種不同抗-CD20抗體用於製造治療癌症，尤 其表現CD20之癌症之藥劑的用途。 【先前技術】 CD20分子（亦稱為人類淋巴細胞限制分化抗原或Bp35) 為位於前B及成熟B淋巴細胞上之具有大致35 kD之分子量 之疏水性跨膜蛋白質（Valentine, M.A·等人，J. Biol. Chem. 264(19) (1989) 11282-11287 ;及 Einfield，D.A·等人，EMBO J. 7(3) (1988) 711-717)。CD20見於大於90%之來自周邊血 液或淋巴器官之B細胞的表面上且在早期前b細胞發育期 間表現且保留直至血漿細胞分化。CD20呈現在正常B細胞 以及惡性B細胞上。詳言之，CD20表現在大於90%之B細 胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphomas)(NHL)上 (Anderson, K.C.等人，Blood 63(6) (1984) 1424-1433)，但 不見於造血幹細胞、前B細胞、正常血漿細胞或其他正常 組織上（Tedder，T.F.等人，J，Immunol. 135 (2) (1985) 973-979)。 CD20蛋白質之85胺基酸羧基-未端區域位於細胞質内。 該區域之長度與其他B細胞特定表面結構，諸如igM、IgD 及IgG重鏈或組織相容性抗原〗丨類a或β鏈之長度形成對 比’該等Β細胞特定表面分別具有3、3、2 8、1 5及1 6個胺 基酸之相對短之細胞質内區域（Komaromy，Μ.等人，NAR Π (1983) 6775-6785)。在後61個羧基··未端胺基酸中，21 133838,doc 200918090 種為酸性殘基，而僅2種為鹼性，指示該區域具有強的淨 負電荷。GenBank寄存編號為NP-690605。據認為’ CD2〇 可涉及調節B細胞之活化及分化過程中之早期步驟（Tedder 等人，Eur. J. Immunol. 25 第 16卷（1986) 881-887)且可起妈 離子通道作用（Tedder, T.F.等人，J. Cell. Biochem. 14D (1990) 195)。 存在2種不同類型之在其CD20結合模式及生物學活性上 顯著不同之抗-CD20抗體（Cragg，M.S·等人，Blood, 103 (2004) 2738-2743 ;及 Cragg，M.S.等人，Blood，1〇1 (2003) 1 045· 1 〇52)。如利妥昔單抗（Rituximab)之第I型抗體在補體 介導細胞毒性中有效，而如托西莫單抗（To si turn omab)(B 1) 、11B8及AT80或人類化B-Lyl抗體之第II型抗體經由卡斯 蛋白酶（caspase)非依賴性細胞凋亡，在伴隨磷脂醯絲胺酸 曝露下有效引發標靶細胞死亡。 第I型及第II型抗-CD20抗體之共用共同特徵概述於 表1中： 第I型抗-CD20抗體 第II型抗-CD20抗艘 第I型CD20抗原決定基 第II型CD20抗原決定基 將CD20定位至脂質筏 不將CD20定位至脂質筏 增加CDC(若為IgGl同型） 降低CDC(若為IgGl同型） ADCC活性(若為IgGl同型） ADCC活性(若為IgG 1同型） 完全結合能力 降低之結合能力 同型凝集 更強同型凝集 交聯後細胞凋亡誘導 無交聯之強細胞死亡誘導 表1 :第I型及第II型抗-CD20抗體之性質 133838.doc 200918090 W0200403 5607係關於針對CD20之人類單株抗體及其用 於治療與表現CD20之細胞相關之疾病的用途。 【發明内容】 本發明包含第I型抗-CD20抗體用於製造治療表現CD20 之癌症之藥劑的用途，其特徵在於該第I型抗-CD20抗體與 第II型抗-CD20抗體一起共同投與。 本發明另外包含第I型抗-CD20抗體作為用於製造治療表 現CD20之癌症之藥劑的第一抗-CD20抗體之用途，其特徵 在於 a) 該第一抗-CD20抗體具有0.8至1.2之該第一抗-CD20抗 體與利妥昔單抗相比之與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86) 上的CD20之結合能力比率， b) 該第一抗-CD20抗體與作為第二抗-CD20抗體之第II型 抗-CD20抗體一起共同投與 c) 該第二抗-CD20抗體具有0.3至0.6之該第二抗-CD20抗體 與利妥昔單抗相比之與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86)上 的CD20之結合能力比率。 本發明包含第I型抗-CD20抗體用於製造治療罹患表現 CD20之癌症之患者的藥劑之用途，其特徵在於該第I型抗-CD20抗體與第II型抗-CD20抗體一起共同投與。 本發明另外包含第I型抗-CD20抗體作為用於製造治療罹 患表現CD20之癌症之患者的藥劑之第一抗-CD20抗體之用 途，其特徵在於 a)該第一抗-CD20抗體具有0.8至1.2之該第一抗-CD20抗 133838.doc 200918090 體與利妥昔單抗相比之與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86) 上的CD20之結合能力比率， b) 該第一抗-CD20抗體與作為第二抗-CD20抗體之第II型 抗-CD20抗體一起共同投與 c) 該第二抗-CD20抗體具有0.3至0.6之該第二抗-CD20抗 體與利妥昔單抗相比之與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86) 上的CD20之結合能力比率。 本發明另外包含用於治療表現CD20之癌症之第I型抗-CD20抗體，其特徵在於該第I型抗-CD20抗體與第II型抗-CD20抗體一起共同投與。 本發明另外包含用於治療罹患表現CD20之癌症之患者 的第I型抗-CD20抗體，其特徵在於該第I型抗-CD20抗體與 第II型抗-CD20抗體一起共同投與。 較佳地，表現CD20之癌症為B細胞非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)。 較佳地，該第一及第二抗-CD20抗體（第I型及第II型）為 單株抗體。 較佳地，該第I型抗-CD20抗體為利妥昔單抗。 較佳地，該第II型抗-CD20抗體為人類化B-Lyl抗體。 較佳地，該第II型抗-CD20抗體具有增加之抗體依賴性 細胞毒性（ADCC)。 較佳地，該第I型抗-CD20抗體具有0.9至1.1之該第一抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比之與Raji細胞（ATCC-編號 CCL-86)上的CD20之結合能力比率。 133838.doc 200918090 較佳地，該第II型抗-CD20抗體具有0.35至0.55，更佳 0.4至0.5之該第二抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比之與 細胞（ATCC-編號CCL-86)上的CD20之結合能力比率。 在本發明之一較佳實施例中，該第I型抗_CD2〇抗體為利 女昔單抗’ δ亥苐II型抗-CD20抗體為人類化B-Lyl抗體且該 表現CD20之癌症為B細胞非霍奇金淋巴瘤（NHL)。 本發明另外包含包括用於組合治療罹患表現CD2〇之癌症 之患者的第11型抗-CD20抗體及第I型抗_CD20抗體之套組。 較佳地，套組之特徵在於，該第I型抗_CD20抗體為利妥 昔單抗，該第II型抗-CD20抗體為人類化β-Lyl抗體且該表 現CD20之癌症為b細胞非霍奇金淋巴瘤（nhl)。 【實施方式】 術语"抗體’’涵蓋各種形式之抗體，包括（但不限於）完整 抗體、人類抗體、人類化抗體及遺傳工程化抗體，如單株 杬體、嵌合抗體或重組抗體以及該等抗體之片段，只要保 , 留根據本發明之特徵性質即可。 本文中所使用之術語”單株抗體"或"單株抗體組合物" 係心具有單一胺基酸組合物之抗體分子之製劑。因此，術 D人類單株抗體"係指顯示單一結合特異性之抗體，其具 有知自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。在 實施例中，人類單株抗體藉由融合瘤產生，該融合瘤包 2自^如轉殖基因小鼠之轉殖基因非人類動物獲得之B細 ”具有包含與永生化細胞融合之人類重鏈轉殖基因及 人類輕鏈轉殖基因之基因組。 133838.doc 200918090 較佳地，該第一及第二抗_CD20抗體（第j型及第π型）為 單株抗體。 術語"嵌合抗體"係指包含來自一種來源或物種之可變 區亦即’結合區及得自不同來源或物種之.丨亙定區之至少 部分的單株抗體，其通常藉由重組DNA技術來製備。包含 鼠可變區及人類恆定區之嵌合抗體尤其較佳。該鼠/人類 欲合抗體為包含編碼鼠免疫球蛋白可變區之DNA區段及編 碼人免疫球蛋白恆定區之DNA區段的經表現免疫球蛋白基 因之產物。藉由本發明涵蓋之"嵌合抗體，，之其他形式為其 中種類或子類已自原始抗體之彼者修飾或改變之彼等形 式。該等’’嵌合抗體"亦稱為”種類轉換抗體”。用於產生嵌 合抗體之方法涉及習知重組DNA及現在此項技術中熟知之 基因轉染技術。參見（例如）’ Morrison, S.L.等人，proc.

Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 685 1-6855 ; US 5,202,238及 US 5,204,244 ° 術語n人類化抗體，，係指其中框架或"互補判定區"（CDR) 已經修飾以包含具有不同特異性之免疫球蛋白（當與母體 免疫球蛋白之彼特異性比較時）之CDR的抗體。在一較佳 實施例中’將鼠CDR移植至人類抗體之框架區中以製備"人 類化抗體"。參見（例如）’ Riechmann，L.等人，Nature 332 (1988) 323-327 ;及 Neuberger，M.S.等人，Nature 314 (1985) 268-270。尤其較佳CDR相應於表示識別上文對嵌 合及雙功能抗體所述之抗原之序列的彼等CDR。 如本文中所使用之術語''人類抗體"欲包括具有得自人類 133838.doc 200918090 生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。人類抗 體在菖刖技術水平下熟知（van Dijk，M.A.及van de Winkel J.G·，Curr. Opin. in Chemical Biology. 5 (2001) 368-374)。 基於該技術，可產生針對各種標靶之人類抗體。人類抗體 之實例（例如）描述於Kellermann，S. A.等人，Curr 〇pin Biotechnol. 13 (2002) 593-597 中。 如本文中所使用之術語”重組人類抗體"意欲包括藉由重 組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如自 宿主細胞（諸如NS0或CHO細胞）分離之抗體；或自動物（例 如小鼠）分離之抗體’該動物就人免疫球蛋白基因而言為 轉殖基因的，或使用轉染至宿主細胞中之重組表現载體來 表現之抗體。該等重組人類抗體具有呈重排形式之得自人 類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。根據本發明 之重組人類抗體已經受活體内體細胞超突變。因此，重組 抗體之VH及VL區之胺基酸序列為可不活體内天然存在於 人類抗體生殖系戲目内之序列’雖然其得自人類生殖系 VH及VL·序列且與其相關。 如本文中所使用，”特異結合”或"與…特異結合I，係指與 CD20抗原特異結合之抗體。較佳地，結合親和力為1〇_8 mol/1或更低，較佳1〇_9 m〇i/i或更低（例如1〇-1Q ^οΐ/ι)之kd 值’更佳10·10 mol/1或更低（例如l〇-〗2 m〇1/ikKD值。用標 準結合檢定’諸如在表現CD20之細胞上之表面電衆共振 技術（例如Biacore®)測定結合親和力。 如本文中所使用之術語”核酸分子"意欲包括Dna分子及 133838.doc 12 200918090 RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈的，但較佳為雙鏈 DNA。 恆定域”不直接涉及將抗體結合於抗原，但涉及效應功 能（ADCC、補體結合及CDC)。 如本文中所使用之"可變區"（輕鏈可變區（VL)、重鏈可變 區（VH))表示直接涉及將抗體結合於抗原之輕鏈及重鏈對 之各者。可變人類輕鏈及重鏈之域具有相同通用結構且各 域包含4個框架（FR)區（其序列廣泛保守），其藉由3個”高變 區"（或互補判定區’ CDR)來連接。框架區採用b片構形且 CDR可形成連接b片結構之環。各鏈中之CDR藉由框架區 保持在其三維結構中且連同來自另一鏈之CDR—起形成抗 原結合位點。抗體重鏈及輕鏈CDR3區在根據本發明之抗 體之結合特異性/親和力中起尤其重要之作用且因此提供 本發明之另一目標。 當在本文中使用時，術語"高變區”或，，抗體之抗原結合 部分”係指負責抗原結合之抗體之胺基酸殘基。高變區包 含來自"互補判定區”或"CDR”之胺基酸殘基。，'框架，'或 ”FRn區為不同於如本文中所定義之高變區殘基之彼等可變 域區域。因此，抗體之輕鏈及重鏈自N末端至C末端包含 域 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 及 FR4。特別 地，重鏈之CDR3為最有助於抗原結合之區域。CDR及FR 區係根據 Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins 〇f Immunological Interest，第 5 版。Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991)之標準 133838.doc •13- 200918090 定義及/或來自"高變環”之彼等殘基來測定。 術語nCD20”及nCD20抗原"可在本文中交替使用，且包 括人類CD20之任何變體、同功異型物及物種同系物，其 藉由細胞天然表現或表現在經CD20基因轉染之細胞上。 本發明之抗體與CD20抗原之結合藉由使CD20失活來殺死 表現CD20之細胞（例如腫瘤細胞）。表現CD20之細胞之殺 死可藉由以下機制之一或多者來發生：細胞死亡/細胞凋 亡誘導、ADCC及/或CDC。 如此項技術中所識別’ CD20之同物異名包括B淋巴細胞 抗原CD20、B淋巴細胞表面抗原Bl、Leu-16、Bp35、BM5 及 LF5。 根據本發明之術語π抗-CD20抗體"為與CD20抗原特異結 合之抗體。視抗-CD20抗體與CD20抗原之結合性質及生物 學活性而定，可根據Cragg，M.S.等人，Blood 103 (2004) 2738-2743 ;及 Cragg，M.S.等人 Blood 101 (2003) 1045-1052來辨別2種類型之抗-CD20抗體（第I型及第II型抗-CD20抗體），參見表2。 表2 :第I型及第II型抗-CD20抗體之性質 第I型抗-CD20抗體 第II型抗-CD20抗體 第I型CD20抗原決定基 第II型CD20抗原決定基 將CD20定位至脂質筏 不將CD20定位至脂質筏 增加CDC(若為IgG 1同型） 降低CDC(若為IgGl同型） ADCC活性(若為lgG 1同型） ADCC活性(若為igG 1同型） 完全結合能力 Γ 降低之結合能力 同型凝集 更強同型凝集 交聯後細胞凋亡誘導 無交聯之強細胞死亡誘導 133838.doc -14· 200918090 第I型及第II型抗-CD20抗體之一基本性質為其結合模 式。因此，第I型及第II型抗-CD20抗體可藉由該抗-CD20 抗體與利妥昔單抗相比之與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86) 上的CD20之結合能力比率來分類。 第I型抗-CD20抗體具有0.8至1.2，較佳0.9至1.1之該抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比之與Raji細胞（ATCC-編號 CCL-86)上的CD20之結合能力比率。該等第I型抗-CD20抗 體之實例包括（例如）利妥昔單抗、1F5 IgG2a (ECACC，融 合瘤；Press, O.W.等人，Blood 69/2 (1987) 584-591)、 HI47 IgG3 (ECACC，融合瘤）、2C6 IgGl (如 WO 2005/103081 中所揭示）、2F2 IgGl (如 WO 2004/035607及 WO 2005/103081 中所揭示）及2H7 IgGl(如WO 2004/056312中所揭示）。較 佳地，該第I型抗-CD20抗體為結合於與利妥昔單抗相同之 抗原決定基之單株抗體。 第II型抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比與Raji細胞 (ATCC-編號CCL-86)上CD20之結合能力具有0.3至0.6，較 佳0.35至0.55，更佳0.4至0.5之比率。該等第II型抗-CD20 抗體之實例包括例如托西莫單抗（B1 IgG2a)、人類化B-Lyl 抗體IgGl (如WO 2005/044859中所揭示之嵌合人類化IgGl 抗體）、11B8 IgGl(如 WO 2004/035607 中所揭示）及 AT80 IgGl。較佳地，該第Π型抗-CD20抗體為一種與人類化B-Lyl抗體（如WO 2005/044859中所揭示）相同之抗原決定基 結合之單株抗體。 '’抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比與Raji細胞（ATCC-編號 133838.doc 15 200918090 CCL-86)上CD20的結合能力之比率”係如實例2中所述，藉 由直接免疫螢光測量（測量平均螢光強度（MFI))，使用與 Cy5結合之該抗-CD20抗體及與Cy5結合之利妥昔單抗於具 有 Raji 細胞（ATCC-編號 CCL-86)之 FACSArray (Becton Dickinson)中測定，且如下計算： 與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86)上CD20之結合能力之比率= MFI(Cy5-抗-CD20抗體)X Cy5-標記比率(Cy5-利妥昔單抗） MFI(Cy5-利妥昔單抗）X Cy5-標記比率(Cy5-抗-CD20抗體） MFI為平均螢光強度。本文中所使用之”Cy5標記比率”意 謂每分子抗體之Cy5標記分子之數量。 通常，該第I型抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比與Raji細 胞（ATCC-編號CCL-86)上CD20之結合能力具有0.8至1.2， 較佳0.9至1.1之比率。 通常，該第II型抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比與Raji細 胞（ATCC-編號CCL-86)上CD20之結合能力具有0.3至0.6， 較佳0.35至0.55，更佳0.4至0.5之比率。 在一個較佳實施例中，該第II型抗-CD20抗體，較佳人 類化B-Lyl抗體，具有增加之抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。 π具有增加之抗體依賴性細胞毒性（ADCC)之抗體”意謂如 本文中所定義之術語之抗體，其具有如藉由一般技術者已 知之任何適合方法所測定增加之ADCC。一經接受之活體 外ADCC檢定如下： 133838.doc -16- 200918090 1) 該檢定使用已知表現藉由抗體之抗原結合區識別之標 靶抗原的標靶細胞； 2) 該檢定使用自隨機選擇健康供體之血液分離之人類周 邊血液單核細胞（PBMC)作為效應細胞； 3) 該檢定根據以下協定進行： i) 使用標準密度離心程序分離PBMC，且將其以5 X 106 個細胞/毫升懸浮於RPMI細胞培養基中； 11)將該等靶細胞藉由標準組織培養方法生長，自具有 高於90%之生存力之指數生長期收穫，以RpMI細胞培養基 洗蘇，用100微居里之，，CI-標記，以細胞培養基洗滌兩 次，且在細胞培養基中以1 〇1細胞/毫升之密度再懸浮； in)將1 〇〇微升上述最終靶細胞懸浮液轉移至96孔微量滴 定板之各孔中； iv) 在細胞培養基中將抗體自4000 ng/ml連續稀釋至0.04 ng/m卜且將50微升所得抗體溶液添加至96孔微量滴定板 中之標靶細胞中，重複三次測試，涵蓋上文所有濃度範圍 之各種抗體濃度； v) 對於最大釋放（MR)對照組而言，含有經標記標靶細 胞之板中之3個額外孔接受50微升之2% (VN)非離子清潔劑 水溶液（Nonidet，Sigma，St. Louis)，替代抗體溶液（上文之 點 iv)。 vi) 對於自發釋放（SR)對照組而言，含有經標記標乾細胞 之板中之3個額外孔接受50微升之RPMI細胞培養基，替代 抗體溶液（上文之點iv); 133838.doc 17 200918090 vii) 隨後以5〇xg離心96孔微量滴定板卜分鐘且在4〇c下培 養1小時； ° viii) 將50微升之PBMC懸浮液（上文之點〇添加至各孔中以 產生25·· 1之效應子：標靶細胞比率且在37它下在c〇2 氣氛下，將板置放於恆溫箱中歷時4小時； IX) 收穫來自各孔之不含細胞上清液且使用γ計數器定量 實驗釋放放射性（ER); X) 根據式（eR-mr)/(mr-sr)X 1 〇〇計算各抗體濃度之特異 性溶解百分比，其中ER為對彼抗體濃度所定量之平均放射 性（見上文點ix)，MR為對MR對照組（見上文點…定量之平 均放射性（見上文點ix)，aSR為對SR對照組（見上文點 所定量之平均放射性（見上文點ix); 4)"增加之ADCC”定義為在上文測試之抗體濃度範圍内所 觀察之特異性溶解之最大百分比的增加，及/或為達到在 上文測試之抗體濃度範圍内所觀察之特異性溶解最大百分 比一半所需要之抗體濃度的降低。增加之Adcc係相對於 使用相同標準之產生、純化、調配及儲存方法（該等方法 為熟習此項技術者已知），藉由相同類型之宿主細胞產 生’藉由相同抗體介導，以上文檢定量測之Adcc而言， 但該ADCC並非藉由經設計以過度表現GnTIII之宿主細胞 產生。 該"增加之ADCC"可藉由該等抗體之醣工程化來獲得， 即意謂，如Umana，P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及US 6,602,684中所述，藉由工程化其寡醣組分來 133838.doc -18· 200918090 增強單株抗體之該等天然、細胞介導效應功能。 術語"補體依賴性細胞毒性（CDC)”係指在補體存在下， 人類腫瘤標靶細胞藉由根據本發明之抗體之溶解。CDC較 佳藉由在補體存在下，用根據本發明之抗-CD20抗體處理 具有表現CD20之細胞之製劑來量測。若抗體在4小時後， 在100 nM之濃度下誘導20%或20%以上之溶解（細胞死 亡）’則可見CDC。較佳用51 Cr或Eu標記之腫瘤細胞執行檢 定且量測所釋放之51Cr或Eu。對照組包括用補體但不用抗 體培養腫瘤標把細胞。 通常，IgGl同型之第I型及第Π型抗_CD20抗體展示特徵 CDC性質。彼此相比較，第ί型抗-cd2〇抗體具有增加之 CDC(若為igGl同型）且第II型抗-CD20抗體具有降低之 CDC(若為IgGl同型）。較佳地’第I型及第η型抗_CD20抗 體為IgGl同型抗體。 "利妥昔單抗”抗體為針對人類CD20抗原之含有遺傳工程 化嵌合人類γΐ鼠恆定域之單株抗體。該嵌合抗體含有人類 γΐ怪定域且藉由受讓於IDEC Pharmaceuticals C〇rporati()n 之1998年4月17日頒予之US 5,736，137 (Andersen等人）中的 名稱nC2B8”來識別。批准利妥昔單抗用於治療具有復發性 或難治性低級或濾泡性、CD2〇陽性、b細胞非霍奇金淋巴 瘤。活體外作用機制研究已展示，利妥昔單抗顯示人類補 體依賴性細胞毒性（CDC)(Reiff，Μ·Ε.等人，81〇〇〇1 83(2) 435-445 (1994))。另外，其在量測抗體依賴性細胞毒性（adcc) 之檢定中顯示顯著活性。 133838.doc -19· 200918090 術語"人類化B-Lyl抗體"係指如WO 2005/044859及WO 2007/031875中所揭示之人類化B-Lyl抗體，其藉由用來自 IgG 1之人類恆定域嵌合且隨後人類化（參見WO 2005/044859 及WO 2007/03 1875)，自鼠單株抗-CD20抗體B-Lyl(鼠重鏈 可變區（VH) : SEQ ID ΝΟ:1 ;鼠輕鏈可變區（VL) : SEQ ID NO:2-參見 Poppema，S.及 Visser，L·，Biotest Bulletin 3 (1987) 131-139)獲得。該等"人類化B-Lyl抗體"詳細揭示於 WO 2005/044859及 WO 2007/031875 中。 較佳地，"人類化B-Lyl抗體"具有選自SEQ ID NO:3至 SEQ ID NO:20 (WO 2005/044859及 WO 2007/031875之 B-HH2至B-HH9及B-HL8至B-HL17)之群之重鏈可變區（VH)。 尤其較佳為 SEQ ID NO:3、4、7、9、11、13 及 15 (WO 2005/044859 ^ B-HH2、BHH-3、B-HH6、B-HH8、B-HL8、B-HL11及B-HL13)。較佳地，"人類化B-Lyl抗體"具 有 SEQ ID NO:20 (WO 2005/044859之B-KV1)之輕鏈可變區 (VL)。此外，人類化B-Lyl抗體較佳為IgGl抗體《較佳 地，該等人類化B-Lyl抗體根據WO 2005/044859、WO 2004/065540、WO 2007/031875、Umana，P·等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及 WO 99/154342 中所述之程 序，在Fc區中醣工程化（GE)。該等醣工程化人類化B-Lyl 抗體在Fc區中具有改變類型之糖基化，較佳具有降低含量 之海藻糖殘基。較佳地，Fc區之募醣之至少40%或40%以 上（在一實施例中在40%與60%之間，在另一實施例中至少 50%且在另一實施例中至少70%或70°/。以上）為非海藻糖基 133838.doc •20· 200918090 化的。此外，較佳將FC區域之寡醣平分。 本發明包含第I型抗-CD20抗體用於製造治療表現CD2〇 之癌症之藥劑的用途，其特徵在於該第j型抗_CD2〇抗體與 第II型抗- CD20抗體一起共同投與。 本發明包含第I型抗-CD20抗體用於製造治療罹患表現 CD20之癌症之患者的藥劑之用途，其特徵在於該第丨型抗_ CD20抗體與第π型抗_CD2〇抗體一起共同投與。 較佳地，該用途之特徵在於，該第〗型抗_CD2〇抗體為利 妥昔單抗，該第π型抗_CD20抗體為人類化B_Lyl抗體且該 表現CD20之癌症為B細胞非霍奇金淋巴瘤（nhl)。 募醣組分可顯著影響與治療性醣蛋白之功效有關之性 貝其包括物理穩定性、對蛋白酶攻擊之抗性、與免疫系 統之相互作用、藥物動力學及特異性生物活性。該等性質 可不僅視募醣之存在與否而定，而且視寡醣之特定結構而 定。可製得募醣結構與醣蛋白功能之間的一些通則。舉例 而έ，某些募醣結構經由與特定碳水化合物結合蛋白相互 作用而介導醣蛋白自血流巾快速清除，而其他㈣結構可 藉由抗體結合且觸發非所要之免疫反應。(Jenkins，Ν.等 人，Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-81)。 由於哺乳動物細胞將蛋白質以對人類應用而言最相容形 式糖基化之能力’故其為產生治療性醣蛋白之較佳宿主。 (Cumming，D.A.等人，Glyc〇bi〇1〇gy i (1991) 1153〇 ; Jenkins，N·等人，Nature Bi〇techn〇1 14 (Η%) 975 81)。 、、’田菌極夕使蛋白質糖基化且如其他類型之常見宿主（諸如 133838.doc 200918090 酵母、絲狀真菌、昆蟲及植物細胞）一樣，產生與自血流 中快速清除、不良免疫相互作用及（在某些特定狀況中）降 低生物活性相關之糖基化模式。在哺乳動物細胞之中，在 近二十年期間最通常使用中國倉鼠卵巢細胞。除提 供適當糖基化模式之外，該等細胞允許一致地產生遺傳穩 定性高度多產無性系細胞系。其可在簡單生物反應器中使 用不含血清之培養基培養至較高密度且允許開發安全且可 重現生物方法。其他通常所用之動物細胞包括嬰兒倉鼠腎 (ΒΗΚ)細胞、NSO-及SP2/0-小鼠骨髓瘤細胞。近年來，亦 測試來自轉殖基因動物之產品。（Jenkins，Ν等人，Nature

Biotechnol. 14 (1996) 975-81 〇 ) 所有抗體在重鏈恆定區中之保守位置上含有碳水化合物 結構，各同種型擁有N-連接碳水化合物結構之相異陣列， 該等結構變化地影響蛋白質裝配、分泌或功能活性。 (Wright, A. ’ 及 Morrison，S. L.，Trends Biotech. 15 (1997) 26-3 2)。所連接之N-連接碳水化合物結構視處理程度而顯 著變化且可包括高甘露糖、多支鏈以及二天線複合寡醣。 (Wright，Α.及 Morrison，S. L·，Trends Biotech. 15 (1997) 26- 32)。通常，存在連接於特定糖基化位點上之核心募醣結 構的異種處理以便甚至單株抗體以多糖型形式存在。同 樣，已展示抗體糖基化中之主要差異出現於細胞系之間且 甚至可見在不同培養條件下生長之給定細胞系之次要差 異。（Lifely，M. R.等人，Glycobiology 5(8) (1995) 813-22)。 獲得效能之大增加，同時維持簡單產生方法及可能避免 133838.doc -22- 200918090 顯著、不良田彳作用之一方式為如Umana，P.等人，Nature

Biotechnol. 17 (1999) 176-180 及 US 6,602,684 中所述，藉 由工程化其募聽組分來增強單株抗體之天然、細胞介導效 應功能。IgG 1類型抗體（癌症免疫療法中之最常用抗體）為 在各CH2域中之Asn297處具有經保存n連接糖基化位點之 醣蛋白。連接於Asn297之2個複合二天線募醣埋於CH2域 之間’與多肽主鏈形成廣泛接觸’且其存在對抗體介導諸 如抗體依賴性細胞毒性（ADCC)之效應功能而言為基本的 (Lifely，M· R·等人，Glycobiology 5: 813-822 (1995); Jefferis，R.等人，Immunol. Rev. 163: 59-76 (1998); Wright，Α·及 Morrison, S. L·, Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)) ° 先前已展示，β(1，4)-Ν-乙醯基葡糖胺基轉移酶in ("GnTII17y)( —種催化經平分寡醣之形成之糖基轉移酶）在 中國倉鼠卵巢（CHO)細胞中之過度表現顯著增加藉由工程 化CHO細胞產生之抗神經母細胞瘤嵌合單株抗體（chCE7) 之活體外ADCC活性。（參見Umana, Ρ·等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ;及 WO 99/154342，其全部 内容在此以引用之方式併入）。抗體chCE7屬於非結合單株 抗體之一大類，其具有高腫瘤親和力及特異性，但當以缺 乏GnTIII酶之標準工業細胞系產生時具有極小之臨床使用 效能（Umana, P.等人，Nature Biotechnol· 17 (1999) 176-180)。該研究最先展示，可藉由使產生抗體之細胞工程化 以表現GnTIII而獲得ADCC活性之大量增加，其亦導致恆 133838.doc -23- 200918090 定區（Fc)相關之經平分寡醣（包括經平分非海藻糖基化募 醣）之比例增加超過天然存在抗體中所見之水平。 術語"表現CD20"抗原意欲指示CD20抗原在細胞，較佳τ 細胞或Β細胞之細胞表面上’更佳分別來自腫瘤或癌症， 較佳來自非實體腫瘤之Β細胞之細胞表面上的顯著表現 量。具有"表現CD20之癌症”之患者可藉由此項技術中已知 之標準檢定來測定。舉例而言，CD20抗原表現係使用免 疫組織化學（IHC)偵測、FACS或經由相應mRNA之基於 PCR之偵測來量測。 如本文中所使用之術語”表現CD20之癌症，，較佳係指淋巴 瘤（較佳B細胞非霍奇金氏淋巴瘤（NHL))及淋巴球性白企 病。該等淋巴瘤及淋巴球性白血病包括（例如），a)渡泡性 淋巴瘤，b)小非分裂細胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤（Burkiu，s lymphoma)(包括地方性伯基特淋巴瘤、偶發性伯基特淋巴 瘤及非伯基特淋巴瘤），c)邊緣區淋巴瘤（包括結外邊緣區B 細胞淋巴瘤（黏膜相關淋巴組織淋巴瘤，MALT)、節邊緣 區B細胞淋巴瘤及脾邊緣區淋巴瘤），d)套細胞淋巴瘤 (MCL) ’ e)大細胞淋巴瘤（包括B細胞擴散大細胞淋巴瘤 (DLCL·)、擴散混合細胞淋巴瘤、免疫母細胞淋巴瘤、原發 性縱隔B細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺β細胞淋巴 瘤），f)毛細胞白血病，g)淋巴細胞性淋巴瘤、瓦爾登斯特 偷巨球蛋白血·症（Waldenstrom’s maeroglobulinemia)，h)急 性淋巴細胞性白血病（ALL)、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)/小淋巴細胞性淋巴瘤（SLL)、B細胞前淋巴細胞白血 133838.doc -24- 200918090 病，i)企漿細胞贅瘤、漿細胞骨髓瘤、多發性骨髓瘤、漿 細胞瘤，j)霍奇金氏病。 較佳地，表現CD20之癌症為B細胞非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)。表現CD20之癌症尤其為套細胞淋巴瘤（mcl)、急 性淋巴細胞性白血病（ALL)、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)、B細胞擴散大細胞淋巴瘤（DLCL)、伯基特淋巴 瘤、毛細胞白血病、濾泡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤、邊緣 區淋巴瘤、移植後淋巴增生性病症（PTLD)、脚相關淋巴 瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症或原發性CNS*巴瘤。 當應用於（例如）癌症時，術語"治療方法π或其等價物係 指經設計減少或消除患者中之癌症細胞數量，或減輕癌症 症狀之程序或作法。”治療癌症或另—增生性病症之方法，, 並非必要地意謂將事實上消除癌症細胞或其他病症，將事 實上減少細胞數量或病症，或將事實上減輕癌症或其他病 症之症狀。常常，將甚至以低的成功可能性來執行治療癌 症之方法，但在給定患者之病史及經估算之存活期望時， 其仍視為誘導總體上之有益作法。 術語”共同投藥”或”共同投與"係指該第一及第二抗_ CD20抗體作為一單一調配物或作為2種分離調配物來投 與。共同投藥可同時或以任一順序連續進行，其中較佳存 在時間週期，而2種（或所有）活化劑同時發揮其生物學活 性。若使用-單-調配物，則同時共同投與2種抗_cJ〇抗 體。若使用2種分離調配物（一種用於第—抗-cdm抗體且 一種用於第二抗-CD20抗體），則該第—及第二抗_c^2〇2 133838.doc -25- 200918090 體同時(例如，經由一單— 連續輪液)或連續共同投與。當二欠同時之分離 在同-天，以2次分離投藥來二=2種抗體時’ 間之2次分離連續輸液， 齊^例如，在不同時 天至第71 4在第1天投與抗體之一且在第2 第7天，較佳在第2天至第4天共同 此，術語"連續地"意謂在第 、第-抗體。因 第一抗體之级Μ 4 4 抗體之給樂後7天内，較佳 抗體之給樂後4天内；術語 間。钟户1 w τ %恩明在相同時 1就抗-CD20抗體之維持劍一 神m 士 則里而έ ，術語”共同投荜"咅 明可同時共同投與維持劑量， & 杈樂心 輿，芒、A & & 如在一-人連續輸液期間投 興右冶療循環適於2種抗體，目,丨“丨，、— 共同投盘…曰 （例如)每週投與。或連續 、丨J仅與維持劑置，在一 天内或右干天内共同投與，例 如，大致每週投與抗體之一南 ^ m . <、.㈣劑ϊ且每2週亦共同投 ，、第一抗體之維持劑量。复 μ ，、他>0療循環/通常（例如）3天至 右干週亦可用於2種抗體。 不言而喻，抗體係以治療右蚪旦 縻有效里投與至患者，該有效量 為引出藉由研究員、獸醫師、醫學醫生或其他臨床醫師尋 找之組織、系統、動物或人類之生物學或醫學反應的主題 化合物或組合之量。 难 該第一及第二抗-C⑽抗體之共同投藥之量及共同投藥 之定時將視所治療之患者之類型（物種、性別、年齡、體 重等等）及病狀及所治療之疾病或病狀之嚴重性而定。該 第-及第二抗_ C D 2 〇抗體適合一次性或經一系列治療而共 同投與至患者。視疾病之類型及嚴重性而定，無論（例如） 藉由-或多次分離投藥還是藉由連續輪液，約丨响至5〇 133838.doc -26 - 200918090 mg/kg(例如〇」_2〇 mg/kg)之該第 用於向患者體為 於該第-或第二抗_CD2〇抗體之 實施例中，用 液時間更長，制如^ 。輪液時間可比後續輸 分二二：鐘用於初始輪液，… ㈣輸液（㈣始輸液為良好耐受 該第一或第二抗_CD2〇抗體之較佳劑量 kg至約3〇，之範圍内。因此，可向串者： g 多劑之約0.5 mg/kg、2 〇 、、者、同投與一或 3〇 mg/kg(^ ^ g、4.G 叫~、1G mg/kg或 齡、體重視患者之類型（種、性別、年 體重等等）及病狀及抗_C⑽抗體 者之劑量可不同於第二抗_c 而疋該第一 每日哎間Μ此门 柷體之剤置。該等劑量可 共二= :::如每3至6天，或甚至每⑽ 多次較低劑量個W始較―接著投與-或 在一個較佳實施例中，藥劍 現CD20之癌症患者的轉移或；預防或減少該罹患表 加該患者之存活期I增加^擴散。藥劑可用於增 加反應期Η ^患者之無疾病進行存活，增 戍反=如存活期間、無疾病進行存活' 反庳率 广得之所治療患者的統計上顯著 : :::1 率一佳 f 一 :.： 增=====性劑、化學治療劑或抗癌劑或 仕無e亥等其他細胞毒性 133838.doc -27· 200918090 劑、化學治療劑或抗癌劑或增強該等藥劑效應之化合物下 使用抗-CD20抗體組合治療。 該等藥劑包括例如：烷化劑或具有烷基化作用之藥劑， 諸如環磷醯胺（CTX ;例如cytoxan®)、苯丁酸氮芬（CHL ; 例如leukeran®)、順鉑（cisp ;例如piatin〇i⑧）白消安（例如 myleran®)、美法侖、卡莫司汀（BCNU)、鏈脲佐菌素、三 伸乙基三聚氰胺（TEM)、絲裂黴素c、及其類似物；抗-代 謝產物’諸如甲胺喋呤（ΜΤχ)、依託泊苷（VP16 ;例如 vepesid®)、6-巯基嘌呤（6MP)、6-硫鳥嘌呤（6TG)、阿糖胞 苦（Ara-C)、5-說尿嘧啶（5-FU)、卡培他濱（capeci_ tabine)(例如 Xeloda®)、達卡巴嗓（dacarbazine)(DTIC)及其 類似物，抗生素’諸如放線菌素D(actinomycin D)、阿徽 素（doxorubicin)(DXR ;例如 adriamycin®)、道諾徽素 (daunorubicin，daunomycin)、博萊黴素（bleomycin)、光輝 黴素（mithramycin)及其類似物；生物鹼，諸如長春花生物 驗，諸如長春新驗（vincristine，VCR)、長春花驗 (vinblastine)及其類似物；及其他抗癌藥劑，諸如太平洋 紫杉醇（paclitaxel)(例如taxol®)及太平洋紫杉醇衍生物， 細胞生長抑制劑，糖皮質激素，諸如地塞米松 (dexamethasone)(DEX ;例如 decadron®)及皮質類固醇，諸 如強的松（prednisone)，核苷酶抑制劑，諸如羥基腺，胺美 酸耗盡酶，諸如天門冬醯胺酶，甲醯四氫葉酸及其他葉酸 衍生物，及相似、不同之抗癌藥劑。以下藥劑亦可用作額 外藥劑：阿尼氟斯汀（arnifostine)(例如ethyol®)、放線菌 133838.doc -28 - 200918090 素、氮芥（mechlorethamine，nitrogen mustard)、鏈佐星 (streptozocin)、環磷醯胺、洛莫司汀（i〇rnustine)(CCNU)、 阿黴素脂（doxorubicin lipo)(例如doxil®)、吉西他濱 (gemcitabine)(例如 gemzar®)、道諾黴素脂（daunorubicin Προ)(例如 daunoxome®)、丙卡巴肼（procarbazine)、絲裂黴 素（mitomycin)、多烯紫杉醇（docetaxel)(例如 taxotere®)、 阿地白介素（aldesleukin)、卡波翻（carboplatin)、奥沙利在白 (oxaliplatin)、克拉屈濱（cladribine)、喜樹驗（eamptothecin)、 CPT 11 (伊立替康（irin〇tecan))、1 〇_羥基7-乙基-喜樹鹼 (SN38)、既尿苷、氟達拉賓（fiudarabine)、異環礙醯胺 (ifosfamide)、伊達比星（idarubicin)、巯乙磺酸鈉、干擾素 β、干擾素α、米托蒽酿（mit〇Xantrone)、拓撲替康（topotecan)、 党丙立德（leuprolide)、甲地孕網（megestrol)、美法侖、疏 基嘌呤、普卡黴素（plicamyCin)、米托坦（mit〇tane)、培門 冬 _ (pegaspargase)、噴司他丁（pent〇statin)、〇辰泊漠院 (pipobroman)、普卡黴素、他莫昔芬（tam〇xifen)、替尼泊 普（teniposide)、睪内酪（test〇iact〇ne)、硫鳥嘌呤、硫替派 (thiotepa)、尿哺σ定亂芬、長春瑞賓（vin〇reibine)、苯丁酸 氮芥。較佳地’在無該等額外藥劑時使用抗_CD2〇抗體組 合治療。 上文所述之細胞毒素劑及抗癌劑以及如蛋白激酶抑制劑 之抗增生標靶特異抗癌藥物在化學治療方案中之用途通常 在癌症療法技術中已充分表徵，且其在本文中之用途處於 對監視耐受性及有效性及控制投藥路線及劑量之相同考慮 133838.doc -29- 200918090 下，稍作調整。舉例而+ . ± 3，細胞毋素劑之實際劑量可視藉 :使用組織培養方法測定之患者培養細胞反應而變化心 吊’與在缺少額外其他藥劑時所用之量比較，劑量將 低。 有效細胞毒素劑之典型劑量可在藉由製造商推薦之範圍 内’且在藉由動物模型中之活體外反應指示時，可降低至 多、、’勺1個數量級之濃度或量。因&，實際劑量將視醫師之 判斷、患者之病狀及基於初級培養惡性細胞或組織培養組 織樣本之活體外反應之治療方法的有效性，或在適當動物 模型中所觀察到之反應而定。 在本發明之上下文中’除表現Cd20之癌症之抗_CD20抗 體組合治療外，可進行有效量之電離放射及/或可使用放 射性藥物。放射源可在所治療患者之外部或内部。當來源 在患者外部時，療法稱為外束放射療法（EBRT)。當放射源 在患者内部時，治療稱為近接療法（BT)。用於本發明之上 下文中之放射性原子可選自包括（但不限於）以下物質之 群’鐳、绝-137、銀-192、鋒·241、金-198、姑-57、銅-67、鍀-99、碘-123、碘-131及銦- ill。亦可能用該等放射 性同位素標記抗體。較佳地，在無該電離放射時使用抗-CD20抗體組合治療。 放射療法為用於控制不可切除或不宜手術之腫瘤及/或 腫瘤轉移之標準療法。當放射療法已與化學療法組合時， 已見改良之結果。放射療法係基於以下原理：傳遞至標靶 區域之高劑量放射將產生腫瘤及正常組織之生殖細胞之死 133838.doc -30· 200918090 亡。放射給藥方案通常根據放射吸收劑量（Gy)、時間及分 級來定義，且必須藉由腫瘤學家小心定義。患者接受之放 射量將視各種考慮而定，但2個最重要的為腫瘤相對於身 體之其他關鍵結構或器官之位置，及腫瘤已傳播之程度。 用於經歷放射療法之患者之治療的典型時程將為經丨至6週 時期，投與至患者之總劑量在1〇與8〇 Gy之間，以約！ 8至 2.0 Gy之單一每日份量，一週5天之治療日程。在本發明 之一較佳實施例中，當用本發明及放射之組合治療來治療 人類患者中之腫瘤時，存在協同作用。換言之，當與放 射，視需要用額外化學治療劑或抗癌劑組合時，腫瘤生長 藉助於包含本發明之組合之藥劑的抑制增強。輔助放射療 法之參數（例如）含在WO 99/60023中。 抗體係根據已知方法，藉由作為快速注射靜脈内投藥或 藉由經一定時期連續輸液，藉由肌肉内、腹膜内、腦脊髓 内、皮下、關節内、滑膜内或鞘内路線投與至患者。靜脈 内或皮下投與抗體為較佳的。 本發明另外包含套組，其特徵在於包含容器，容器内之 組合物包含該第I型及第II型抗-CD20抗體，其呈一單一調 配物或2種分離調配物形式；及包裝插頁，其指導組合物 之使用者將該第I型及第Η型抗_CD2〇抗體投與至罹患表現 CD20之癌症之患者。 較佳地，套組之特徵在於，該第〗型抗_CD2〇抗體為利妥 昔單抗，該第II型抗-CD20抗體為人類化B_Lyl抗體且該表 現CD20之癌症為B細胞非霍奇金淋巴瘤（nhl)。 133838.doc 200918090 術§吾’包裳播頁，，孫# 中之說明慣上包括在治療產品之商業包裝 匕括闕於適應症、用法、劑量、投藥、 禁忌及/或有關該等治療產品之使用之警告的資訊。 在一較佳實施財，製品容器可另外包 受之載劑。製品可另呆予上了接 另外包括無菌稀釋劑，其較佳 離額外容器中。 相廿&刀 如本文中所使用，”醫荜 苗杀干上可接文之載劑"意欲包括任 何及所有可與醫藥投藥相容之材料，包括溶劑、分散介 質、塗層、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及可 與醫樂投藥相容之其他材料及化合物。除非任何習知介質 或藥劑不可與活性化合物相容’否則涵蓋其在本發明之組 合物中之使用。補充性活性化合物亦可併入組合物中。 醫藥調配物 藉由將具有所要純度之抗體與任選醫藥學上可接受之載 劑、賦形劑或穩定劑（Remingtonis Pha_ceutical Sciences 第16版，〇sol，八.編（198〇))混合來製備用於儲存之呈經冷 凍乾燥調配物或水溶液形式的根據本發明使用之抗體之治 療性調配物。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量 及濃度下對受體無毒且包括：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬 酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺 酸；防腐劑（諸如十八烷基二甲基苄基氣化銨；氯化六羥 季錢；氣苄烧敍、苄索氣敍；苯盼、丁醇或苄醇；烧基對 經基苯甲酸酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對經基苯甲酸丙 ’兒命盼，間本·一盼，％己醇，3 -戊醇；及間甲紛）；低 133838.doc -32- 200918090 分子量（少於約10個殘基）多 ;夕肽，蛋白質，諸如血清白蛋 白、明膠或免疫球蛋白；雜k 親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯咬 酮；胺基酸，諸如甘胺酸、艇 麵私醯胺、天冬醯胺酸、組胺 酸、精胺酸或離胺酸；單醣、_ ^ —醣及其他碳水化合物類， 包括葡萄糖、甘露糖或糊精. 猜，螯合劑，諸如EDTA ;糖 類，諸如蔑糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇’·鹽形成性抗 衡離子，諸如納’·金屬複合物(例如&蛋白複合物)；及/ 或非離子界面活性劑法 ^ 渚如 TWEENtm、PLUR〇NICSTM 或 聚乙二醇（PEG)。 根據本發明之調配物可為用於抗-CD20抗體之各者之2種 分離調配物。或者，本文中之調配物亦可在一種調配物中 含有2種抗體。 另外，組合物可另外包含化學治療劑、細胞毒素劑、細 胞激素、生長抑制劑或抗-血管生成劑。料分子以對所 欲目的有效之量適合地以組合形式存在。 亦可（例如）藉由凝聚技術或藉由介面聚合將活性成份俘 ㈣所製備之微膝囊中，例如經基甲基纖維素或明膠微囊 及聚-(曱基丙稀酸甲g旨）微膠囊分別俘獲於膠狀藥物傳遞系 統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈 米囊劑）中或於巨乳液中。該等技術揭示於Remingt〇n，s Pharmaceutical 8 —卿第 16版，〇s〇i，a 編。刚)中。 可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含 有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成 形物品（例如薄膜或微膠囊）形式，持續釋放基質之實例包 133838.doc -33· 200918090 括聚酯、水凝膠（例如聚（2-羥乙基-曱基丙烯酸酯）或聚（乙 稀醇））、聚乳酸交酯（US 3,773,919)、L-麩胺酸與γ-乙基-L-麩胺酸之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、諸如 LUPRON DEPOT™(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙立德 組成之可注射微球體）之可降解乳酸-乙醇酸共聚物及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。 欲用於活體内投藥之調配物必須為無菌的。其易藉由經 由無菌過渡膜之過滤來完成。 本發明另外包含用於治療表現CD20之癌症之第I型抗-CD20抗體，其特徵在於該第I型抗-CD20抗體與第II型抗-CD20抗體一起共同投與。 本發明另外包含用於治療罹患表現CD20之癌症之患者 的第I型抗-CD20抗體，其特徵在於該第I型抗-CD20抗體與 第II型抗-CD20抗體一起共同投與。 在本發明之一較佳實施例中，該第I型抗-CD20抗體為利 妥昔單抗，該第II型抗-CD20抗體為人類化B-Lyl抗體且該 表現CD20之癌症為B細胞非霍奇金淋巴瘤（NHL)。 本發明另外包含用於治療表現CD20之癌症或罹患表現 CD20之癌症之患者的第I型抗-CD20抗體，其特徵在於 a) 該第I型抗-CD20抗體具有0.8至1.2之該第I型抗-CD20抗 體與利妥昔單抗相比之與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86) 上的CD20之結合能力比率， b) 該第I型抗-CD20抗體與第II型抗-CD20抗體一起共同投 與，且 133838.doc -34- 200918090 C)該第II型抗-CD20抗體具有0.3至0.6之該第II型抗-CD20 抗體與利妥昔單抗相比之與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86)上的CD20之結合能力比率。 較佳地，表現CD20之癌症為B細胞非霍奇金氏淋巴瘤 (NHL)。 較佳地，該第I型抗-CD20抗體為利妥昔單抗。 較佳地，該第II型抗-CD20抗體為人類化B-Lyl抗體。 較佳地，該第II型抗-CD20抗體具有增加之抗體依賴性 細胞毒性（ADCC)。 提供如下實例及圖示以幫助理解本發明，其真實範疇陳 述於附加申請專利範圍中。應瞭解，可在不脫離本發明之 主旨時對所述程序進行修改。 序列清單 SEQ ID ΝΟ:1 鼠單株抗-CD20抗體B-Ly 1之重鏈可變區 (VH)之胺基酸序列。 SEQ ID NO:2 鼠單株抗-CD20抗體B-Lyl之輕鏈可變區 (VL)之胺基酸序列。 SEQ ID NO:3-19 人類化 B-Lyl 抗體（B-HH2 至 B-HH9、B- HL8及B-HL10至B-HL17)之重鏈可變區 (VH)之胺基酸序列 SEQ ID NO:20 人類化B-Lyl抗體B-KV1之輕鏈可變區 實驗程序 實例1 (VL)之胺基酸序列 133838.doc •35 - 200918090 第I型抗-CD20抗體（利妥昔單抗）與第II型抗-CD20抗體（B-HH6-B-KV1 GE)之組合治療之抗腫瘤活性 測試藥劑 第I型抗-CD20抗體利妥昔單抗提供為來自Hoffmann La Roche, Basel, Switzerland 之儲備溶液（c=10 mg/ml)。緩衝 液含有聚山梨酸酯80、氣化鈉及擰檬酸鈉。 第 II 型抗-CD20 抗體 B-HH6-B-KV1 GE (=人類化 B-Lyl、 醣工程化 B-HH6-B-KV1，參見 WO 2005/044859 及 WO 2007/031875)提供為來自 GlycArt，Schlieren, Switzerland之 儲備溶液（c=9.4 mg/kg)。抗體緩衝液包括組胺酸、海藻糖 及聚山梨酸酯20。 將來自儲備之2種溶液適當稀釋於PBS中用於預先注 射。 細胞系及培養條件 使用OCI-Ly 18人類非霍奇金淋巴瘤（NHL)細胞（Chang， Η.等人，Leuk Lymphoma. 1992 Sep; 8(1-2):129-36)(擴散 性大細胞淋巴瘤-DLCL)。慣例地將腫瘤細胞系於補充有 20〇/〇胎牛血清（PAA Laboratories，Austria)及 2 mM L-麵胺醯l 胺、25 nM HEPES及0.05 mM巯基乙醇之INDM培養基 (PAA，Laboratories, Austria)中，在37°C下，在水飽和氣氛 中，在5% C02下培養。第2繼代用於移植。 動物 根據委託準則（GV-Solas; Felasa; TierschG)，在不含特 異病原體條件下維持雌性SCID米色小鼠；到達時年齡4_5 133838.doc •36· 200918090 週（自 Bomholtgard，Ry，Denmark購買），每日 12 h光照 /12 h 黑暗之循環。藉由地方政府評論及批准實驗性研究協定。 到達後，將動物維持在動物設施之檢疫部分中歷時1週以 適應新環境及用於觀測。定期進行連續健康監視。隨意提 供食物（Provimi Kliba 3337 3337)及水（酸化 pH 2.5-3)。 監視 每曰控制動物之臨床症狀及不利效應之偵測。為在實驗 期間監視’每週兩次將動物之體重備案且在分級（staging) 後藉由側徑規量測腫瘤體積。 動物之治療 在隨機化當天（細胞移植後24天）開始動物治療。在研究 第24、3 1、38、45及52天時，以30 mg/kg之指示劑量i.v. q7d治療接受人類化第II型抗-CD20抗體B-HH6-B-KV1 GE 之群及相應媒劑群。在第26、33 ' 40、47及54天，執行作 為單一藥劑及與第II型抗_CD20抗體B-HH6-B-KV1 GE組合 之第I型抗-CD20抗體利妥昔單抗治療。 活體内腫瘤生長抑制研究 由於腫瘤負荷，治療起始後1〇天，必須排除接受媒劑對 照之具有腫瘤之動物。每週用作為單一藥劑之3〇 mg/kg之 利安昔單抗治療動物抑制異種移植物生長1 0天（TGI 68%)。稍後，不管其他每週之利妥昔單抗單一藥劑注射， 腫瘤異種移植持續進行。相反，每週一次用b_HH6_b_kv1 GE (30 mg/kg)之單一藥劑療法控制〇CI_Lyl8腫瘤生長（TGI 1〇〇/。）。然而，最後在B-HH6-B_KV1 GE單一藥劑投藥 133838.doc -37- 200918090 下’腫瘤異種移植物開始發展。然而，均為30 mg/kg之利 妥昔單抗及B-HH6-B-KV1 GE之組合明顯卓越地有效。異 種移植腫瘤被控制且與各單一藥劑抗體臂對比，腫瘤停滯 隨時間得到維持。 實例2 測定第II型抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比之與Raji細胞 (ATCC-編號CCL·86)上之CD2〇的結合能力比率 在含有 10% FCS (Gibco，目錄號 10500-064)之RPMI-1640 培養基（PanBiotech GmbH，目錄號p〇4-l 8500)中維持Raji 細胞（ATCC-編號CCL-86)培養。根據製造商之說明書，使 用 Cy5 單 NHS 酯（Amersham GE Healthcare，目錄號 PA15101)將第 Π 型抗 _Cd2〇 抗體 B-HH6-B-KV1(人類化 B-Lyl抗體）及利妥昔單抗標記。Cy5j#合利妥昔單抗具有每 抗體2.0分子Cy5之標記比率。Cy5結合B-HH6-B-KV1具有 每抗體2.2分子Cy5之標記比率。為測定且比較2種抗體之 結合能力及模式，藉由直接免疫螢光，使用伯基特淋巴瘤 細胞系Raji (ATCC-編號CCL-86)來產生結合曲線（藉由滴定 Cy5結合利妥昔單抗及Cy5結合B-HH6-B-KV1)。平均螢光 強度（MFI)分別分析為Cy5結合利妥昔單抗及Cy5結合B-HH6-B-KV1之EC50(最大強度之50%)。在4°C下，將每個樣 本5M05個細胞染色30 min。後來，在培養基中洗滌細 胞。碘化丙咬（PI)染色用以排除死細胞。使用FACSArray (Becton Dickinson)執行量測，破化丙咬（PI)在Far Red A下 量測且Cy5在Red-A下量測。圖2展示在EC50(最大強度之 133838.doc -38- 200918090 50%)下，Cy5標記B-HH6-B-KV1(黑色條）及Cy5標記利妥昔 單抗（白色條）之結合之平均螢光強度（MFI)。 隨後，根據下式計算與Raji細胞（ATCC·編號CCL-86)上 之CD20之結合能力比率： 與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86)上之CD20之結合能力比率= MFI(Cy5-抗-CD2〇抗體)二Cy5標記比#(Cy5_利妥昔單抗） MFI(Cy5-利妥昔單抗f X Cy5標記比率(Cy5-抗-CD20抗體）

=MFI(B-HH6-B-^^Cy5標記比率(Cy5-利妥昔單抗） MFI(Cy5-利妥昔單抗）x Cy5標記比率(B- hh6- B_ KV1) 207 2.2 Λ _ ——χ—=0.44 433 2.0 因此’與利妥昔單抗比較，作為典型第π型抗_CD2〇抗 體之B-HH6-B-KV1展示降低結合能力。 實例3 糖工程化（GE)及非餘工程化（野生型，抗_Cd2〇抗艟（B-HH6-B-KV1 GE及wt)針對SCID米色小鼠中之Z138 MCI^ 種移植物之相似抗隨痛活^性 測試藥劑 第II型抗-CD20抗體Β_ΗΗ6_Β·κνι(醣工程化（GE)及野生 型（wt))提供為來自 GlycArt，schlieren，Switzerland之儲備 溶液（c=9.4 !^/!«1及l2.5 mg/nil) u抗體緩衝液包括組胺 酸、海藻糖及聚山梨賤I旨2〇。 將來自儲備之2種湾:夜適當稀釋於pBS中用於預先注射。 133838.doc -39· 200918090 細胞系及培養條件 最初自Glycart獲得Z138人類B細胞非霍奇金淋巴瘤 (NHL)細胞（套細胞淋巴瘤-MCL)。慣例地將腫瘤細胞系於 補充有 10%胎牛血清（PAA Laboratories, Austria)及 2 mM L-麵胺酿胺之DMEM培養基（PAA, Laboratories, Austria)中， 在3 7°C下，在水飽和氣氛中，在5% C02下培養。第2繼代 用於移植。 動物 根據委託準則（GV-Solas; Felasa; TierschG)，在不含特 異病原體條件下維持雌性SCID米色小鼠；到達時年齡4_5 週（自 Bomholtgard，Ry，Denmark購買），每日 12 h光照 /12 h 黑暗之循環。藉由地方政府評論及批准實驗性研究協定。 到達後，將動物維持在動物設施之檢疫部分中歷時1週以 適應新環境及用於觀測。定期進行連續健康監視。隨意提 供食物（Provimi Kliba 3337 3337)及水（酸化 pH 2.5-3)。 監視 每曰控制動物之臨床症狀及不利效應之偵測。為在實驗 期間監視’每週兩次將動物之體重備案且在分級時開始藉 由側徑規量測腫瘤體積。 動物之治療 在隨機化當天（s.c.細胞移植後14天）開始動物治療。在研 究第14、20、27及3 4天時，以10 mg/kg之指示劑量i v q7d 治療接受人類化抗CD20抗體（B-HH6-B-KV1 GE及wt)之群 及相應媒劑群。 133838.doc -40· 200918090 活體内腫瘤生長抑制研究 由於腫瘤負荷，治療起始後19天，必須排除接受媒劑對 照之具有腫瘤之動物。每週一次用10 mg/kg之wt或II工程 化 B-HH6-B-KV1 (B-HH6-B-KV1 GE及wt)之治療動物，在 治療開始後不久抑制異種移植物長出。對照終止時，所有 抗體腫瘤退化且稍後大多數Z1 38腫瘤異種移植物展示完全 緩解。在該異種移植模型中，未觀察到抗CD20抗體B-HH6-B-KV1之wt及醣工程化版本之間的顯著差異。其並非 不可能，因為小鼠不在其NK細胞上表現正確Fc受體且此 外，認為SCID米色小鼠由於嚴重三倍免疫缺陷而不適於 NK介導ADCC。因此，SCID米色小鼠中之s.c.異種移植模 型不適於用醣工程化經修飾抗體來模擬人類ADCC介導效 應。 【圖式簡單說明】 囷1 具有1.0之該第I型抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比 之與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86)上的CD20之結合能力比 率之第I型抗-CD20抗體（利妥昔單抗）與具有0·44之該第II 型抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比之與Raji細胞（ATCC-編 號CCL-86)上的CD20之結合能力比率之第II型抗-CD20抗 體（B-HH6-B-KV1 GE)之組合治療對OCI-Lyl8人類非霍奇 金淋巴瘤（NHL)的抗腫瘤活性。腫瘤體積[mm3]之平均值繪 於y軸上；注射腫瘤細胞後之天數繪於X軸上。圖例：A)媒 劑（激嚴）’ B)利妥昔單抗30 mg/kg i.v.，每週一次（三肩 形）。C)人類化 B-lyl(B-HH6-B-KVl GE)30 mg/kg，每週一 133838.doc -41 - 200918090 次（丑才形）及D)與B-HH6-B-KV1 GE共同投與之利妥昔單 抗（各3 0 mg/kg，每週一次）（义）。 囷2 Raji細胞（ATCC-編號CCL-86)上之第I型抗-CD20抗 體（Cy5-利妥昔單抗=白色條）及第II型抗-CD20抗體（Cy5人 類化B-Lyl B-HH6-B-KV1 GE=黑色條）之平均螢光強度 (MFI，左邊y軸）；第I型抗-CD20抗體（利妥昔單抗）及第II ' 型抗-CD20抗體（B-HH6-B-KV1 GE)與利妥昔單抗相比之與 CD20之結合能力比率（在右邊y軸上標度） 圖3 2種第II型抗-CD20抗體之治療對Z138人類非霍奇 金淋巴瘤（NHL)之抗腫瘤活性。2種抗體為人類化B-Lyl抗-CD20 抗體；1) B-HH6-B-KV1 醣工程化（GE)及 2) B-HH6-B-KV1野生型（wt，非醣工程化）。腫瘤體積[mm3]之平均值繪 於y軸上；注射腫瘤細胞後之天數繪於X軸上。圖例：A)媒 劑（嚴嚴），B)人類化 B-lyl GE (B-HH6-B-KV1 GE) 30 mg/kg，每週一次（_Ξ 声形）及 C)人類化8-1乂1\¥1;(8-^1116-6-# ' KV1 wt) 3 0 mg/kg每週一次（义）。 133838.doc -42- 200918090 序列表 <11〇>瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 士商克雷雅生物公司 <120>使用第I型及第π型抗_CD2〇抗體之組合療法 <130> 24509 <140〉 097133968 <141> 2008-09-04 <150> 07017337.2 <151> 2007-09-05 <160> 20 <170> Patentln version 3.2

<210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <220>

<221> MISC_FEATURE <223>鼠單;^抗_CD20抗體B-Lyl之重鏈可變區（VH)之胺基酸序列 <400> 1

Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys 15 10 15

Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Leu 20 25 30

Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp 35 40 45

Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 50 55 60

Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu Thr Ser Leu Thr 65 70 75 80

Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly 85 90 95

Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 100 105 110 <210> 2 <211> 103

<212> PRT 133838.doc 200918090 <213> Mus sp. <220>

<221> MI SC FEATURE <223>鼠單株抗-CD20抗體B-Lyl之輕鏈可變區（VL)之胺基酸序列 <400> 2

Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser 15 10 15

Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly lie Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu 20 25 30

Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gin Met Ser Asn 35 40 45

Leu Val Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 60

Asp Phe Thr Leu Arg lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 85 90 95

Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 <210> 3 <211> 119

<212> PRT <213〉 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HH2)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 3

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys A丄a Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 -2- 133838.doc 200918090

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HH3)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 4

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys 85 90 95 A丄a Arg Asn Va_L Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 133838.doc 200918090

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HH4)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 5

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 i5

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 119 <212〉 PRT <213〉 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HH5)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 6 4 133838.doc 200918090

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HH6)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 7

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 133838.doc 200918090

Lys Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 no

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HH7)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 8

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 i

J

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 133838.doc -6- 200918090 <210> 9 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HH8)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 9

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 10 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HH9)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 10

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 133838.doc 200918090

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B_Lyl抗體(B-HL8)之重鏈可變區(YH)之胺基酸序列 <400> 11

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 133838.doc 200918090

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HL10)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 12

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 9- 133838.doc 200918090 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HL11)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 13

Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Glv 1 5 10 I5y

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 3〇

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 HO

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 119

<212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HL12)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 14

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 10- 133838.doc 200918090 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 '

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HL13)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 15

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Sar Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 Ί5 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly -11 - 133838.doc 200918090 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HL14)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 16

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Lys Lys pro Glv Glv 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tvr Ser 20 25 3〇

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 HO

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HL15)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 • 12- 133838.doc 200918090 <400> 17

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HL16)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列

<400> 18

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Giu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 • 13- 133838.doc 200918090

Lys Gly Arg Val Thr I丄e Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 119 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體(B-HL17)之重鏈可變區(VH)之胺基酸序列 <400> 19

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 /

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 14· 133838.doc 200918090 <210> 20 <211> 115 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>人類化B-Lyl抗體B-KV1之輕鏈可變區(VL)之胺基酸序列 <400> 20

Asp lie Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro 15 10

Val Thr Pro Gly 15

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30

Asn Gly lie Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gin Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn 85 90 95

Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105

Glu lie Lys 110

Arg Thr Val 115 133838.doc 15-

Claims (1)

1. 200918090 十、申請專利範圍： 1. 一種第I型抗-CD20抗體用於製造治療表現CD20之癌症之 藥劑的用途，其特徵在於該第I型抗-CD20抗體與第II型 抗-CD20抗體一起共同投與。 2. —種第I型抗-CD20抗體用於製造治療罹患表現CD20之癌 症患者的藥劑之用途，其特徵在於該第I型抗-CD20抗體 與第II型抗-CD20抗體一起共同投與。 3 一種用於治療表現CD20之癌症之第I型抗-CD20抗體，其 ( 特徵在於該第I型抗-CD20抗體與第II型抗-CD20抗體一 起共同投與。 4. 一種用於治療罹患表現CD20之癌症患者的第I型抗-CD20 抗體，其特徵在於該第I型抗-CD20抗體與第II型抗-CD20抗體一起共同投與。 5. 如請求項1或2之用途，其特徵在於 a) 該第I型抗-CD20抗體與利妥昔單抗（rituximab)相比與 Raji細胞（ATCC-編號CCL-86)上CD20之結合能力具有 0.8至1.2之比率，及 b) 該第II型抗-CD20抗體與利妥昔單抗相比與Raji細胞 (ATCC-編號CCL-86)上CD20之結合能力具有0.3至0.6 之比率。 6. 如請求項1或2之用途，其特徵在於該表現CD20之癌症為 B細胞非霍奇金氏淋巴瘤（B-Cell Non-Hodgkiis lym-phoma，NHL) 〇 7. 如請求項1或2之用途，其特徵在於該第I型及第II型抗- 133838.doc 200918090 CD20抗體為單株抗體。 8·如6月求項1或2之用途’其特徵在於該第I型抗-CD20抗體 為利妥昔單抗。 9_如靖求項1或2之用途’其特徵在於該第II型抗-CD20抗體 為人類化B-Lyl抗體。 1〇·如清求項1或2之用途’其特徵在於該第I型抗-CD20抗體 為利妥昔單抗，該第Π型抗_CD2〇抗體為人類化B-Lyl抗 體’該表現CD20之癌症為B細胞非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 〇 U.如凊求項1或2之用途，其特徵在於該第II型抗-CD20抗體 具有增加之抗體依賴性細胞毒性（ADCC)。 12. 如明求項1或2之用途’其特徵在於該第II型抗-CD20抗體 之遠Fc區之至少4〇%或4〇%以上的寡醣為非海藻糖基 化。 13. 如請求項1或2之用途，其特徵在於該第I型抗-CD20抗體 ) 與利妥昔單抗相比與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86)上 CD20之結合能力具有0.9至1.1之比率。 14. 如請求項之用途’其特徵在於該第π型抗_CD2〇抗體 與利妥昔單抗相比與Raji細胞（ATCC-編號CCL-86)上 CD20之結合能力具有0.35至0.55，較佳0.4至〇·5之比 率 〇 15. —種包含第Π型抗_CD2〇抗體及第j型抗{〇2〇抗體用於 組合治療罹患表現CD20之癌症患者之套組。 16·如請求項15之套組’其特徵在於該第I型抗_CD2〇抗體為 133838.doc 200918090 C 利妥昔單抗，該第II型抗-CD20抗體為人類化B-Lyl抗 體，該表現CD20之癌症為B細胞非霍奇金淋巴瘤 (NHL)。 133838.doc