RU2595383C2

RU2595383C2 - Комбинированная терапия антителами анти-cd20 типа i и типа ii

Info

Publication number: RU2595383C2
Application number: RU2010112940/10A
Authority: RU
Inventors: ФРИСС Томас; КЛАЙН Кристиан; УМАНА Пабло
Original assignee: Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг; Роше Гликарт Аг
Priority date: 2007-09-05
Filing date: 2008-08-20
Publication date: 2016-08-27
Also published as: WO2009030368A1; MX2010002406A; JP2010538024A; ES2449070T3; AR068818A1; CA2697482C; JP5209723B2; CN101821292A; CL2008002613A1; US20120134990A1; US20090060913A1; ZA201001442B; CN101821292B; TW200918090A; KR101234436B1; US20130195846A1; BRPI0816458A2; RU2010112940A; EP2197918A1; US20110243931A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к области медицины, биотехнологии и иммунологии. Предложено применение антитела анти-CD20 типа I для лечения рака, экспрессирующего CD20, а также применение для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанное антитело анти-CD20 типа I вводят совместно с антителом анти-CD20 типа II, где антителом анти-CD20 типа I является ритуксимаб, а антителом анти-CD20 типа II - гуманизированное антитело B-LyI, причем по меньшей мере 40% или более олигосахаридов Fc областей антител анти-CD20 типа II в составе композиции являются нефукозилированными, а раком, экспрессирующим CD20, является не-Ходжкинская лимфома. Применение антитела анти-CD20 типа I совместно с антителом анти-CD20 типа II по настоящему изобретению обеспечивает долговременное подавление роста опухоли по сравнению с применением указанных антител в отдельности. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 3 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к применению двух различных антител анти-CD20 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего рака, экспрессирующего CD20.

Предпосылки создания изобретения

Белок CD20 (так называемый дифференцировочный антиген созревания В-лимфоцитов или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с мол. массой приблизительно 35 кДа, локализованный в предшественниках В-клеток и в зрелых В лимфоцитах (Valentine M.A. и др., J. Biol. Chem., 264(19), 11282-11287 (1989) и Einfield D.A. и др., ЕМВО J.. 7(3), 711-717 (1988)). CD20 найден на поверхности более 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов, экспрессируется на ранней стадии развития предшественников В-клеток и остается до дифференцировки плазматических клеток. CD20 присутствует в нормальных В-клетках, а также в злокачественных В-клетках. CD20 прежде всего экспрессируется в более 90% В-клеток лимфомы не-Ходжкина (НХЛ) (Anderson К.С. и др., Blood, 63(6), 1424-1433 (1984)), но не обнаружен на кроветворных стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или на других нормальных тканях (Tedder T.F. и др., J, Immunol., 135 (2), 973- 979 (1985)).

С-концевой фрагмент (содержащий 85 аминокислотных остатков) белка CD20 локализован в цитоплазме. Длина такого участка существенно отличается от размеров цитоплазматического участка других поверхностных белков В-клеток, таких как тяжелые цепи IgM, IgD, и IgG или α-, или β-цепей антигенов гистосовместимости класса I1, которые характеризуются относительно короткими цитоплазматическими фрагментами, содержащими 3, 3, 28, 15 и 16 аминокислотных остатков, соответственно (Komaromy M. и др., NAR, 11, 6775-6785 (1983)). В С-концевом фрагменте 21 из 61 аминокислотных остатков являются кислотными и только 2 основными, т.е. указанная область обладает суммарным высоким отрицательным зарядом (The GenBank рег. №NP-690605). Принято считать, что CD20 может принимать участие в регуляции ранней стадии (стадий) процесса активации и дифференцировки В-клеток (Tedder и др., Eur. J. Immunol., 25, 16, 881-887 (1986)) и может функционировать как кальциевый канал (Tedder T.F. и др., J.Cell. Biochem., 14D, 195 (1990)).

Существуют два различных типа антител анти-CD20, которые существенно отличаются по способу связывания с CD20 и по биологической активности (Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 1045-1052 (2003)). Антитела типа I, ритуксимаб, активны в проявлении цитотоксичности, опосредованной комплементом, в то время как антитела типа II, тоситумомаб (B1), 11B8 и АТ80 или гуманизированные антитела В-Lyl, эффективно инициируют гибель клеток-мишеней за счет каспаза-независимого апоптоза с одновременным воздействием фосфатидилсерина.

Сводка общих свойств антител анти-CD20 типа I и типа II приводятся в Таблице 1.

Таблица 1
Свойства антител анти-CD20 типа I и типа II
Антитела анти-CD20 типа I	Антитела анти-CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
Локализует CD20 в липидном слое	Не локализует CD20 в липидном слое
Повышенный КЗЦ (если изотип IgGl)	Пониженный КЗЦ (если изотип IgGl)
ЗАКЦ активность (если изотип IgGl)	ЗАКЦ активность (если изотип IgGl)
Полная связывающая способность	Пониженная связывающая способность
Гомотипическая агрегация	Высокая гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза после перекрестного сшивания с рецептором	Индукция быстрой гибели клеток без перекрестного сшивания с рецептором

Изобретение относится к моноклональным антителам человека, специфичным к CD20, и к их применению для лечения заболеваний, ассоциированных с клетками, экспрессирующими CD20.

Краткое описание сущности изобретения

Изобретение включает применение антител анти-CD20 типа I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Изобретение также включает применение антител анти-CD20 типа I в качестве первых антител анти-CD20 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что

а) соотношение связывающих активностей указанных первых антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2,

б) указанные первые антитела анти-CD20 вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II в качестве вторых антител анти-CD20,

в) соотношение связывающих активностей указанных вторых антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6.

Изобретение также включает применение антител анти-CD20 типа I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Изобретение также включает применение антител анти-CD20 типа I в качестве первых антител анти-CD20 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа I для лечения рака, экспрессирующего CD20, отличающиеся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа I для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, отличающиеся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, обозначает В-клеточную лимфому не-Ходжкина (ЛНХ).

Предпочтительно указанные первые и вторые антитела анти-CD20 (типа I и типа II) являются моноклональными антителами.

Предпочтительно указанными антителами анти-CD20 типа I является ритуксимаб.

Предпочтительно указанными антителами анти-CD20 типа II являются гуманизированные антитела B-Lyl.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II обладают повышенной зависимой от антител клеточной цитотоксичностью (ЗАКЦ).

Предпочтительно соотношение связывающих активностей указанных антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС №CCL-86) составляет от 0,9 до 1,1,

Предпочтительно соотношение связывающих активностей указанных антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС №CCL-8б) составляет 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.

В одном предпочтительном варианте изобретения указанными антителами анти-CD20 типа I является ритуксимаб, указанными антителами типа II являются гуманизированные антитела B-Lyl, а указанным раком, экспрессирующим CD20, является В-клеточная лимфома не-Ходжкина.

Изобретение также включает набор, включающий антитела анти-CD20 типа II и анти-CD20 типа I, предназначенный для комбинированного лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20

Предпочтительно набор отличается тем, что указанными антителами анти-CD20 типа I является ритуксимаб, указанными антителами типа II являются гуманизированные антитела B-Lyl, а указанным раком, экспрессирующим CD20, является В-клеточная лимфома не-Ходжкина (ЛНХ).

Подробное описание изобретения

Термин "антитела" обозначает различные формы антител, включающих, но, не ограничиваясь только ими, полноразмерные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела и генно-инженерные антитела, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты таких антител при условии сохранения их характерных свойств по изобретению.

Термины "моноклональные антитела" или "композиция моноклональных антител", используемые в описании заявки, относятся к получению молекул антител одного аминокислотного состава. Соответственно, термин "моноклональные антитела человека" относится к моноспецифичным антителам, содержащим вариабельные и константные области иммуноглобулинов зародышевой линии клеток человека. В одном варианте моноклональные антитела человека получают с использованием гибридомы, которая включает В-клетки, полученные от трансгенного животного (исключая человека), например, трансгенной мыши, в геноме которой содержится трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, включенные в иммортализованные клетки.

Предпочтительно указанные первые и вторые анти-CD20 антитела (типа I и типа II) являются моноклональными антителами.

Термин "химерные антитела" обозначает моноклональные антитела, включающие вариабельную область, т.е. связывающий участок, от одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области от другого источника или вида, обычно полученные методов рекомбинантных ДНК. Более предпочтительны химерные антитела, включающие вариабельную область мыши и константную область человека. Такие химерные антитела человека/мыши являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина мыши и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина человека. Другими формами " химерных антител" по настоящему изобретению являются такие антитела, класс или подкласс которых модифицирован или изменен по сравнению с исходными антителами. Такие "химерные" антитела обозначаются также как "переключенные по классу антитела". Способы получения химерных антител включают метод рекомбинантных ДНК и методы генной трансфекции, известные в данной области техники. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984), US 5202238 и US 5204244.

Термин "гуманизированные антитела" обозначает антитела, в которых каркасный участок или "участки комплементарности" (CDR) модифицированы для включения CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с исходным иммуноглобулином. В предпочтительном варианте CDR мыши прививают в каркасный участок антител человека для получения "гуманизированных антител". См., например, Riechmann L. и др., Nature, 332, 323-327 (1988) и Neuberger M.S. и др., Nature, 314, 268-270 (1985)). Более предпочтительные CDR представляют собой аминокислотные последовательности, узнающие антигены, указанные выше для химерных и бифункциональных антител.

Термин "антитела человека", используемый в описании заявки, включает антитела, содержащие вариабельную и константную области иммуноглобулина зародышевой линии клеток человека. Антитела человека известны в данной области техники (van Dijk M.A. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. in Chemical Biology, 5, 368-374 (2001)). С использованием такой технологии получают антитела человека, специфичные в отношении множества мишеней. Примеры антител человека, описаны, например, в статье Kellermann S.A., и др., Curr. Opin. Biotechnol., 13, 593-597 (2002).

Термин "рекомбинантные антитела человека", используемый в описании заявки, обозначает все антитела человека, которые получают, экспрессируют, конструируют или выделяют рекомбинантными методами, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, таких как клетки NSO или СНО, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека, или антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку-хозяина. Такие рекомбинантные антитела человека содержат константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии клеток человека в перегруппированной форме. Рекомбинантные антитела человека по изобретению подвергались in vivo соматической гипермутации. Таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются такими последовательностями, которые, хотя они получены из последовательностей VH и VL зародышевой линии клеток человека, не содержатся в нативном репертуаре зародышевой линии клеток человека in vivo.

Термин "специфичное связывание" или "специфично связывается", используемый в описании заявки, обозначает антитела, которые специфично связываются с антигеном CD20. Предпочтительно аффинность связывания характеризуется величиной KD 10^-8 моль./л или менее, предпочтительно 10^-9моль/л или менее (например, 10^-10 моль/л), более предпочтительно величиной KD 10^-10 моль./л или менее (например, 10^-12 моль/л). Аффинность связывания определяют стандартным анализом связывания, таким как метод поверхностного плазменного резонанса (например, Biacore®) с использованием клеток, экспрессирующих CD20.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый в описании заявки, обозначает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты является одноцепочечной или двухцепочечной, предпочтительно двухцепочечной ДНК.

Термин "константные домены" не имеет прямого отношения к связыванию антител с антигеном, а относится к эффекторным функциям (ЗАКЦ, связывание комплемента и КЗЦ).

Термин "вариабельная область" (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)), используемый в описании заявки, каждый, обозначает пару легкой и тяжелой цепей, которые принимают непосредственное участие в связывании антител с антигеном. Домены вариабельной легкой цепи и тяжелой цепи человека характеризуются одинаковой общей структурой, и каждый домен включает четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются строго консервативными, соединенные тремя "гипервариабельными областями" (или участками комплементарности, CDR). Каркасные участки образуют конформацию β-складчатого листа, а участки CDR образуют петли, связывающие β-складчатую структуру. В каждой цепи CDR сохраняют свою трехмерную структуру благодаря каркасным участкам и вместе с CDR другой цепи образуют антиген-связывающий участок. Участки CDR3 тяжелой и легкой цепи играют главную роль в специфичности связывания антитела по изобретению и, следовательно, представляют еще одни объект изобретения.

Термины "гипервариабельная область" или "антиген-связывающий участок антитела", используемый в описании заявки, обозначают аминокислотные остатки, которые отвечают за связывание с антигеном. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из "участков комплементарности" или участков "CDR". "Каркасные участки" или "FR" представляют собой такие области вариабельного домена, которые не относятся к указанным гипервариабельным участкам. Следовательно, легкая и тяжелая цепи антитела включают (в направлении от N- до С-концевого фрагмента) домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Наиболее важным фрагментом тяжелой цепи является CDR3, который вносит основной вклад в связывание с антигеном. Области CDR и FR определяют, как описано Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), и/или по их остаткам, включенным в состав "гипервариабельной петли".

Термины "CD20" и "антиген CD20" используются взаимозаменяемым образом и обозначают любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD20 человека, который обычно экспрессируется клетками или на клетках, трансфектированных геном CD20. Связывание антител по изобретению с антигеном CD20 опосредует гибель клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевых клеток), за счет инактивациии CD20. Гибель клеток, экспрессирующих CD20, может происходить по одному или более следующих механизмов: индукция апоптоза, ЗАКЦ и/или КЗЦ.

Синонимами CD20, известными в данной области техники, являются антиген CD20 В-лимфоцитов, поверхностный антиген В1 В-лимфоцитов, Leu-16, Вр35, ВМ5 и LF5.

Термин "антитела анти-CD20" по изобретению обозначает антитела, которые специфично связываются с антигеном CD20. В зависимости от связывающих свойств и биологической активности антитела анти-CD20 подразделяются на два типа: тип I и тип II (См. Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 1045-1052 (2003)), как указано в таблице 2.

Таблица 2

Свойства антител анти-CD20 типа I и типа II

Антитела анти-CD20 типа I	Антитела aHTH-CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
Локализует CD20 в липидном слое	Не локализует CD20 в липидном слое
Повышенный КЗЦ (если изотип IgGl)	Пониженный КЗЦ (если изотип IgGl)
ЗАКЦ активность (если изотип IgGl)	ЗАКЦ активность (если изотип IgGl)
Полная связывающая способность	Пониженная связывающая способность
Антитела анти-CD20 типа I	Антитела анти-CD20 типа II
Гомотипическая агрегация	Высокая гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза после перекрестного сшивания с рецептором	Индукция быстрой гибели клеток без перекрестного сшивания с рецептором

Одним из важнейших свойств антител анти-CD20 типа I и типа II является способ связывания. Таким образом, антитела анти-CD20 типа I и типа II классифицируются по соотношению связывающих активностей указанных антител и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86).

Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1. Примерами таких антител анти-CD20 типа I являются, например, ритуксимаб, 1F5 IgG2a (ECACC, гибридома. Press O.W. и др., Blood, 69/2, 584-591 (1987)), HI47 IgG3 (ECACC, гибридома), 2С6 IgGl (описанные в WO 2005/103081), 2F2 IgGl (описанные в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgGl (описанные в WO 2004/056312). Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа I являются моноклональными антителами, которые связываются с тем же эпитопом, что и ритуксимаб.

Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5. Примерами таких антител анти-CD20 типа II являются, например, тоситумомаб (В1 IgG2a), гуманизированные антитела В-Lyl IgGl (химерные гуманизированные антитела IgGl, описанные в WO 2005/044859), 11 В8 IgGl (описанные в WO 2004/035607) и АТ80 IgGl. Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются моноклональными антителами, которые связываются с тем же эпитопом, что и гуманизированные антитела В-Lyl (описанные в WO 2005/044859).

Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86)" определяют прямым измерением иммунофлуоресценции (измеряется средняя интенсивность флуоресценции (СИФ)) указанных антител анти-CD20, конъюгированных с Су5, и ритуксимаба, конъюгированного с Су5, на клеточном сортере FACS (фирма Becton Dickinson) и клеток Raji (ATCC, №CCL-86), как описано в Примере 2, и рассчитывают по следующей формуле:

Соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji

\begin{array}{l} (ATCC . №CCL-86) = \\ \frac{С И Ф (С у 5 / а н т и т е л а а н т и - C D 20)}{С И Ф (С У 5 / р и т у к с и м а б)} \times \frac{с о д е р ж а н и е С у 5 в конъюгате (С у 5 -ритуксимаб)}{с о д е р ж а н и е Су5 в конъюгате (С у 5 / антитела анти-CD20)} \end{array}

СИФ обозначает среднюю интенсивность флуоресценции. Термин "содержание Су5 в конъюгате" обозначает число молекул метки Су5-в расчете на молекулу антитела.

Обычно соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1.

Обычно соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.

В предпочтительном варианте указанные антитела анти-CD20 типа II, предпочтительно гуманизированные антитела В-Lyl, обладают повышенной зависимой от антител клеточной цитотоксичностью (ЗАКЦ).

Термин "антитела, обладающие повышенной зависимой от антител клеточной цитотоксичностью (ЗАКЦ)" обозначает антитела, описанные выше, обладающие повышенной ЗАКЦ, которую определяют способом, известным специалисту в данной области. Например, известными способом анализа ЗАКЦ является следующий:

1) анализ проводят с использованием клеток-мишеней, которые экспрессируют антиген, узнаваемый антиген-связывающей областью антитела,

2) анализ проводят с использованием в качестве эффекторных клеток одноядерных клеток периферической крови человека (ОКПК), выделенных из крови произвольно выбранного здорового донора,

3) анализ проводят в соответствии со следующим протоколом:

3.1) ОКПК выделяют с использованием стандартного центрифугирования в градиенте плотности и суспендируют с плотностью 5×10⁶ клеток в культуральной среде RPMI,

3.2) клетки-мишени выращивают стандартными методами культуры тканей, собирают на экспоненциальной фазе роста с выживаемостью более 90%, промывают культуральной средой RPMI, вводят метку в виде 100 мкКи Cl^-, дважды промывают культуральной средой и ресуспендируют в культуральной среде с плотностью 10' клеток/мл,

3.3) 100 мкл конечной суспензии клеток-мишеней переносят в лунки 96-луночного планшета для микротитрования,

3.4) раствор антител серийно разбавляют культуральной средой (от 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл) и полученные растворы добавляют (по 50 мкл) в лунки 96-луночного планшета, содержащие клетки-мишени, анализ проводят при различных концентрациях антител в указанном выше интервале при тройном повторе,

3.5) для контролей с максимальным высвобождением (MB) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антитела (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл 2% водного раствора неионного детергента (VN, Nonidet, фирма Sigma, St. Louis),

3.6) для контролей с произвольным высвобождением (ПВ) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антитела (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл культуральной среды RPMI,

3.7) затем 96-луночный планшет центрифугируют при 50 g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С,

3.8) в каждую лунку добавляют по 50 мкл суспензии ОКПК (см. п.3.1, выше) до соотношения клетки эффекторы/клетки-мишени 25:1 и планшеты инкубируют в инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при 37°С в течение 4 ч,

3.9) из каждой лунки извлекают супернатант и измеряют экспериментальную радиоактивность (ЭР) с использованием γ-счетчика,

3.10) для каждой концентрации антитела рассчитывают процент специфичного лизиса по формуле (ЭР-МВ)/(МВ-СВ)×100, где ЭР обозначает среднее значение измеренной радиоактивности (см. п.3.9) для данной концентрации антитела, MB обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) для MB контролей (см. п.3.5) в СВ обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) для СВ контролей (см. п.3.6),

4) "повышенный уровень ЗАКЦ" определяют по повышению максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале концентраций антител, анализируемых выше, и/или по понижению концентрации антител, необходимой для снижения вдвое максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале концентраций антител, анализируемых выше. Превышение ЗАКЦ по сравнению с цитотоксичностью (ЗАКЦ), измеренной в указанном выше анализе, опосредуется указанными антителами, продуцируемыми теми же клетками-хозяина, с использованием той же стандартной методики методов очистки, получения и хранения, известной специалисту в данной области, но которые не продуцируются клетками-хозяина, сконструированными для гиперэкспрессии GnTIII.

Указанную "повышенную ЗАКЦ" получают гликоинженерией указанных антител, которая обозначает усиление указанных природных опосредованных клетками эффекторных функций моноклональных антител за счет инженерии их олигосахаридного компонента, как описано в статье Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684.

Термин "комплемент-зависимая цитотоксичность (КЗЦ)" обозначает лизис клеток-мишеней опухоли человека антителами по изобретению в присутствии комплемента. Предпочтительно КЗЦ измеряют при обработке клеток, экспрессирующих CD20, антителами анти-CD20 по изобретению в присутствии комплемента. КЗЦ наблюдается в том случае, если при концентрации 100 нМ антитела индуцируют лизис 20% или более опухолевых клеток через 4 ч. Предпочтительно анализ проводят с использованием опухолевых клеток, меченых ⁵¹Cr или Eu, и измеряют высвобождаемый ⁵¹Cr или Eu. Контроль включает инкубацию опухолевых клеток-мишеней в присутствии комплемента, но в отсутствие антител.

Обычно антитела анти-CD20 типа I и типа II изотипа IgGl обладают характерными КЗЦ свойствами. Антитела анти-CD20 типа I (изотипа IgGl) обладают повышенной КЗЦ активностью, а антитела анти-CD20 типа II (изотипа IgGl) обладают пониженной КЗЦ активностью, по сравнению друг с другом. Предпочтительно оба типа антител (тип I и тип II) являются изотипами IgGl.

Антитела "ритуксимаб" представляют собой генетически модифицированные химерные моноклональные антитела γ1 человека, содержащие константный домен мыши, специфичные в отношении антигена CD20 человека. Указанные химерные антитела содержат константные домены γ1 человека и обозначаются "С2 В8" (US 5736137, Andersen, и др., зарегистрированном 17 апреля 1998 г. Фармацевтическая корпорация IDEC). Ритуксимаб предназначен для лечения пациентов с рецидивирующей или повторной вялотекущей или фолликулярной, CD20-позитивной В-клеточной лимфомы не-Ходжкина. При исследовании механизма действия in vitro установлено, что ритуксимаб проявляет комплемент-зависимую цитоксичность (КЗЦ) (Reiff M.E. и др., Blood, 83(2), 435-445 (1994)). Кроме того, препарат проявляет высокую активность в анализах, где измеряется зависимая от антител клеточная цитотоксичность (ЗАКЦ).

Термин "гуманизированные антитела В-Lyl" обозначает гуманизированные антитела В-Lyl, описанные в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которые получают из мышиных моноклональных антител анти-CD20 В-Lyl (вариабельная область тяжелой цепи (VH): SEQ ID NO: 1, вариабельная область легкой цепи (VL): SEQ ID NO: 2, см. Poppema S. и Visser L., Biotest. Bulletin, 3, 131-139 (1987)) за счет химеризации с константным доменом IgGl человека и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Указанные "гуманизированные антитела В-Lyl" подробно описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Lyl" содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, включающей SEQ ID No.3 - SEQ ID No.20 (B-HH2 - B-HH9 и B-HL8 - B-HL17, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Более предпочтительны Seq. ID No. 3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (B-HH2, ВНН-3, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и B-HL13, описанные в WO 2005/044859). Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Lyl" содержат вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID No. 20 (В-KV1, см. WO 2005/044859). Кроме того, гуманизированные антитела В-Lyl предпочтительно являются антителами IgGl. Предпочтительно такие гуманизированные антитела В-Lyl гликозилируют в Fc области по методикам, описанным в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana P. и др.. Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и WO 99/154342. Такие гликозилированные гуманизированные антитела В-Lyl обладают измененным характером гликозилирования в Fc области, предпочтительно они характеризуются пониженным содержанием остатков фукозы. Предпочтительно в этих антителах не фукозилированы по меньшей мере 40% или более (в одном варианте от 40% до 60%, в другом варианте по меньшей мере 50%, и в еще одном варианте по меньшей мере 70% или более) олигосахаридов Fc области. Кроме того, олигосахариды Fc области предпочтительно являются двухсекционными.

Изобретение включает применение антител анти-CD20 типа I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения, рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Изобретение включает применение антител анти-CD20 типа I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Предпочтительно применение характеризуется тем, что указанными антителами анти-CD20 типа I является ритуксимаб, указанными антителами анти-CD20 типа II являются гуманизированные антитела В-Lyl, а указанным раком, экспрессирующим указанные CD20 является В-клеточная лимфома не-Ходжкина (ЛНХ).

Олигосахаридный компонент может оказывать существенное влияние на свойства, обеспечивающие эффективность действия терапевтического гликопротеина, такие как стабильность, устойчивость к действию протеазы, взаимодействие с иммунной системой, фармакокинетика и специфичная биологическая активность. Такие свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия, но также и от конкретных структур олигосахаридов. Можно указать на некоторое соответствие между структурой олигосахарида и функцией гликопротеина. Например, некоторые структуры олигосахарида опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока за счет взаимодействия с некоторыми белками, связывающимися с конкретными углеводами, тогда как другие углеводы могут связываться с антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)).

Предпочтительными клетками для продуцирования терапевтических гликопротеинов являются клетки млекопитающих благодаря их способности гликозилировать белки в форме, наиболее совместимой с организмом человека (Gumming D.A. и др., Glycobiology, 1, 115-130 (1991), Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)). Бактерии очень редко гликозилируют белки, а другие подобные типы продуцентов, такие как дрожжи, нитевидные грибы, клетки насекомых и растений, обеспечивают такой профиль гликозилирования, который ассоциируется с быстрым клиренсом из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями и некоторыми процессами, снижающими биологическую активность. Последние двадцать лет в качестве клеток млекопитающих наиболее часто используют клетки яичника китайского хомячка (СНО). Кроме того, для придания пригодного профиля гликозилирования указанные клетки позволяют провести последовательное размножение генетически стабильных, высокопродуктивных линий клональных клеток. Такие клетки можно культивировать до высокой плотности в простых биореакторах с использованием бессывороточной среды, что позволяет разрабатывать безопасные и воспроизводимые биотехнологии. Другие часто используемые клетки животных включают клетки почек детеныша хомячка (ВНК.), клетки NSO- и SР2/0-мышинной миеломы. Кроме того, в последнее время исследовалось продуцирование с использованием трансгенных животных (Jenkins N. и др. Nature Biotechnol., 14, 975-981 (1996)).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных позициях константных областей тяжелой цепи, причем каждый изотип обладает собственным профилем N-углеводных структур, которые по разному воздействует на сборку, секрецию или функциональную активность белка (Wright А. и Morrison S.L, Trends Biotech., 15, 26-32 (1997)). Структуры N-углеводных цепей существенно варьируют в зависимости от степени процессинга и могут включать олигосахариды с высоким содержанием маннозы, полиразветвленные, а также двухантенные комплексные олигосахариды (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotech. 15, 26-32 (1997)). Обычно имеет место гетерогенный процессинг каркасных олигосахаридных структур, присоединенных к конкретному сайту гликозилирования, и даже моноклональные антитела присутствуют в виде полигликозилированных форм. Установлено также, что главные различия в гликозилировании антител наблюдаются между клеточными линиями и даже незначительные различия проявляются для данной клеточной линии в различных условиях культивирования (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5(8), 813-822 (1995)).

Одним из способов существенного повышения активности и возможно исключения значительного нежелательного побочного действия антител в процессе получения является усиление природных, клеточно-опосредованных эффекторных функций моноклональных антител за счет формирования их олигосахаридного компонента, как описано в статье Umana P. и др.. Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684. Антитела типа IgGl, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые содержат консервативный сайт N-гликозилирования по Asn297 в каждом домене СН2. Два сложных двухантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, располагаются между СН2 доменами, формируя плотные контакты с полипептидной цепью, и их присутствие является существенным для антител при осуществлении эффекторных функций, таких как зависимая от антител клеточная цитотоксичность (ЗАКЦ) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 813-822 (1995); Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 59-76 (1998), Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 26-32 (1997)).

Ранее установлено, что гиперэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I11 (GnTII17y), гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает активность ЗАКЦ in vitro анти-необластомных химерных моноклональных антител (chCE7), продуцируемых модифицированным клетками СНО (см. статьи Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17. 176-180 (1999) и WO 99/154342, включенные в описание заявки в качестве ссылок в полном объеме). Антитела chCE7 принадлежат к большому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые обладают высокой аффинностью и специфичностью в отношении опухоли, но малоэффективны для клинического применения при продуцировании в стандартных производственных клеточных линиях, не содержащих фермента GnTIII (Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999)). В указанной работе впервые установлено, что значительное увеличение ЗАКЦ можно получить благодаря конструированию клеток, продуцирующих антитела и экспрессирующих GnTIII, что приводит к повышению доли (Fc)-ассоциированных, бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные, нефукозилированные олигосахариды, на уровне, превышающем уровень, наблюдаемый в природных антителах.

Термин "экспрессия антигена CD20" обозначает высокий уровень экспрессии в клетке антигена CD20, предпочтительно на поверхности Т- или В-клеток, более предпочтительно В-клеток, полученных от опухоли или рака, соответственно, предпочтительно несолидной опухоли. Пациентов, страдающих от "рака, экспрессирующего CD20", определяют стандартными методами анализа. Например, экспрессию антигена CD20 измеряют иммуногистохимическим детектированием (ИГХ), АФАК (FACS) или детектированием соответствующей мРНК методом ПЦР.

Термин "рак, экспрессирующий CD20", используемый в описании заявки, предпочтительно обозначает лимфомы (предпочтительно В-клеточную лимфому не-Ходжкина (ЛНХ)) и лимфолейкозы. Такие лимфомы и лимфолейкозы включают, например: а) фолликулярные лимфомы; б) мелкоклеточную лимфому с нерасщепленным ядром/лимфому Беркитта (включая эндемическую лимфому Беркитта, спорадическую лимфому Беркитта и лимфому не-Беркитта); в) лимфомы маргинальной зоны (включая В-клеточную лимфому экстранодальной маргинальной зоны (ассоциированная со слизистой и лимфоидной тканью лимфома, MALT), В-клеточную лимфому нодальной маргинальной зоны и лимфому селезеночной маргинальной зоны); г) лимфому мантийных клеток (ЛМК); д) крупноклеточную лимфому (включая В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (ДККЛ), диффузную клеточную лимфому смешанного типа, иммунобластическую лимфому, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, В-клеточную лимфангиому легких); е) лейкоз ворсистых клеток; ж) лимфолейкоз, макроглобулинемию Вальденстрема; з) острый лимфолейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ)/слабый лимфолейкоз (СЛЛ), В-клеточный пролимфолейкоз; и) плазмоцитому, миеломную болезнь, множественную миелому, плазмацитому; к) болезнь Ходжкина.

Предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, представляет собой В-клеточные лимфомы не-Ходжкина (НХЛ). Рак, экспрессирующий CD20, прежде всего представляет собой лимфому мантийных клеток (ЛМК), острый лимфолейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (ДККЛ), лимфому Беркитта, лейкоз ворсистых клеток, фолликулярную лимфому, множественную миелому, лимфому маргинальной зоны, посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (ПТЛЗ), лимфому, ассоциированную с ВИЧ, макроглобулинемию Вальденстрема или первичную лимфому ЦНС.

Термин "способ лечения" или его эквивалент, например, в отношении рака, обозначает способ или курс лечения, который предназначен для снижения числа или ликвидации ряда раковых клеток в организме пациента, или уменьшения интенсивности симптомов рака. "Способ лечения" рака или другого пролиферативного нарушения необязательно обозначает, что раковые клетки или другое нарушение будет ликвидировано фактически, или, что симптомы рака или другого нарушения будут уменьшены фактически. Часто способ лечения рака проводят даже при слабой надежде на успех, но которые, при данной истории болезни и предполагаемой продолжительности жизни пациента, тем не менее обеспечивают общий благоприятный ход лечения.

Термин "совместное введение" обозначает введение указанных первых и вторых антител анти-CD20 в составе одной композиции или в составе двух отдельных композиций. Совместное введение можно проводить одновременно или последовательно в любом порядке, причем предпочтительно существует период времени, когда оба (или все) активные агенты одновременно проявляют биологическую активность. Если используется одна композиция, оба типа антител анти-CD20 вводятся одновременно. Если используются две отдельных композиции (одна, содержащая антитела анти-CD20 типа I, а другая - антитела анти-CD20 типа II), указанные типы антител анти-CD20 вводятся одновременно (например, в виде одного непрерывного вливания или в виде двух отдельных непрерывных вливаний одновременно) или последовательно. Если оба типа антител вводятся последовательно, дозу вводят в один и тот же день двумя отдельными частями, например, двумя отдельными вливаниями в разное время, или одно из антител вводят в день 1, а другой тип антител вводят в день 2-7, предпочтительно в день 2-4. Таким образом, термин "последовательно" обозначает в течение 7 дней после введения дозы первых антител, предпочтительно в течение 4 дней после введения дозы первых антител, а термин "одновременно" обозначает в одно время. Термин "совместное введение" в связи с поддержанием уровня антител анти-CD20 обозначает, что поддержание уровня антител можно проводить за счет совместного введения одновременно, например, одним непрерывным вливанием, если курс лечения является пригодным для обоих типов антител, например, каждую неделю. В другом варианте поддержание уровня антител проводят введением последовательно в течение одного или нескольких дней, например, одно из антител вводят приблизительно каждую неделю, и другие антитела вводят совместно также каждый две недели. Кроме того, оба типа антител можно вводить по другой схеме, например, в течение от 3 дней до нескольких недель.

Подразумевается, что антитела вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве, которое обозначает количество соединения по изобретению или комбинации, вызывающее биологическую или лечебную ответную реакцию ткани, системы, животного или человека, которая предполагалась исследователем, ветеринаром, лечащим врачом или другим медицинским персоналом.

Количество совместно введенных антител анти-CD20 типа I и типа II и время совместного введения зависят от типа субъекта (вида, пола, возраста, массы тела и т.п.), состояния пациента, подлежащего лечению, и тяжести заболевании или состояния, подлежащего лечению. Указанные антитела анти-CD20 (антитела типа I и типа II) являются пригодными для совместного введения пациенту одновременно или для многократного введения. В зависимости от типа и тяжести заболевания первоначальные варианты доз указанных антител анти-CD20 (типа I и типа II) для совместного введения пациенту составляют приблизительно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг), например, в виде одного или более отдельных введений или непрерывного вливания. В одном варианте первоначальное вливание указанных антител анти-CD20 типа I и типа II является более продолжительным, чем последующие циклы введения, например, первоначальное вливание можно проводить в течение приблизительно 90 мин, а последующее вливание можно проводить в течение приблизительно 30 мин (при условии хорошо переносимого первоначального вливания).

Предпочтительная доза указанных антител анти-CD20 типа I и типа II составляет от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг. Таким образом, пациенту можно совместно вводить одну или более доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг (или их любую комбинацию). В зависимости от типа субъекта (вида, пола, возраста, массы тела и т.п.), состояния пациента и от типа антитела анти-CD20, доза первых антител анти-CD20 отличается от доз вторых антител анти-CD20. Такие дозы можно вводить совместно ежедневно или периодически, например, каждые 3-6 дней или даже каждые 1-3 недели. Причем первоначальная доза является более высокой, а последующие одна или более доз являются более низкими.

В предпочтительном варианте лекарственное средство можно использовать для профилактики или снижения метастазирования или дальнейшего распространения патологического состояния в организме пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20. Лекарственное средство можно использовать для увеличения продолжительности жизни такого пациента, увеличения выживаемости такого пациента без развития заболевания, увеличения продолжительности ответной реакции, приводящей к статистически достоверному и клинически подтвержденному улучшению состояния пациента по данным продолжительности жизни, выживаемости без развития заболевания, скорости или продолжительности ответной реакции. В предпочтительном варианте лекарственное средство можно использовать для увеличения ответной реакции в группе пациентов.

В контексте настоящего изобретения при лечении рака, экспрессирующего анти-CD20, комбинацией антител анти-CD20 можно дополнительно использовать другие цитотоксичные, химиотерапевтические или противоопухолевые агенты или соединения, которые усиливают действие таких агентов. Предпочтительно комбинация антител анти-CD20 используется в отсутствии таких дополнительных цитотоксичных, химиотерапевтических или противоопухолевых агентов или соединений, усиливающих действие таких агентов.

Такими агентами являются, например, алкилирующие агенты или агенты с алкилирующим действием, такие как циклофосфамид (СТХ, например, cytoxan®), хлорамбуцил (CHL, например, leukeran®), цисплатин (CisP, например, platinol®), бусулфан (например, myleran®), мелфалан, кармустин (BCNU), стрептозотоцин, триэтиленметамин (ТЕМ), митомицин С и т.п., антиметаболиты, такие как метотрексат (МТХ), этопозид (VP16, например, vepesid®), 6-меркаптопурин (6МП), 6-тиогуанин (6ТГ), цитарабин (Ara-С), 5-фторурацил (5-ФУ), капецитабин (например, Xeloda®), декарбазин (DTIC) и т.п., антибиотики, такие как актиномицин D, доксорубицин (DXR, например, adriamycin®), даунорубицин (дауномицин), блеомицин, митрамицин и т.п., алкалоиды, такие как алкалоиды барвинка розового, такие как винкристин (VCR), винбластин и т.п., и другие противоопухолевые агенты, такие как паклитаксел (например, taxol®) и производные паклитакселя, цитостатические агенты, глюкортикоиды, такие как дексаметазон (DEX, например, decadron®), и кортикостероиды, такие как преднизон, ингибиторы нуклеаз, такие как гидроксимочевина, специфичные протеазы, такие как аспарагиназа, лейковорин и другие производные фолиевой кислоты и подобные противоопухолевые агенты. Кроме того, могут также использоваться другие дополнительные агенты, такие как арнифостин (например, ethyol®), дактиномицин, меклоретамин (азотистый иприт), стрептозоцин, циклофосфамид, ломустин (CCNU), доксорубицин липо (например, doxil®), гемцитабин (например, gemzar®), даунорубицин липо (например, daunoxome®), прокарбазин, митомицин, досетаксел (например, taxotere®), алдеслейкин, карбоплатин, оксалиплатин, кладрибин, камптоцетин, СРТ 11 (иринотекан), 10-гидрокси-7-этилкамфотецин (SN38), флоксуридин, флударабин, ифосфамид, идарубицин, месна, β-интерферон, α-интерферон, митоксантрон, топотекан, лейпролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, пликамицин, митотан, пегаспаргаза, пентостатин, пипоброман, пликамицин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, урацилиприт, винорелбин, хлорамбуцил. Предпочтительно комбинация антител анти-CD20 используется в отсутствие таких дополнительных агентов.

Применение цитотоксических и противоопухолевых агентов, описанных выше, а также антипролиферативного специфичного противоопухолевого лекарственного средства, такого как ингибиторы протеинкиназы, в курсе химиотерапии обычно известно в терапии рака, и их применение должно соответствовать тем же требованиям переносимости, эффективности и контроля способов введения и дозирования, с некоторыми поправками. Например, фактические дозы цитотоксических агентов могут изменяться в зависимости от ответной реакции культивированных клеток пациента, которую определяют гистохимическими методами на культуре ткани. В общем случае, доза снижается по сравнению с количеством, которое используется в отсутствии других дополнительных агентов.

Типичные дозы эффективного цитотоксического агента могут находиться в интервалах, рекомендованных производителем, а по результатам испытаний на ответные реакции in vitro и на модели животных концентрация или количество агента может снижаться приблизительно на порядок. Таким образом, фактическая доза зависит от мнения врача, состояния пациента и эффективности способа лечения, основанного на чувствительности первичных культивированных злокачественных клеток или культуры ткани, или ответной реакции, наблюдаемой на соответствующей модели животных.

В контексте настоящего изобретения при лечении рака, экспрессирующего CD20, в дополнение к комбинации антител анти-CD20 можно использовать эффективное количество ионизирующего излучения и/или радиотерапевтические методы. Источником излучения являются внешний и внутренний относительно пациента источники. Лечение с использованием внешнего источника называется лучевая терапия (ЛТ), лечение с использованием внутреннего источника носит название брахитерапия (БТ). Радиоактивные элементы для применения по изобретению выбирают из группы, включающей, но не ограничиваясь только ими, радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, иод-123, иод-131 и индий-111. Кроме того, такие радиоактивные изотопы можно вводить в антитела. Предпочтительно комбинация антител анти-CD20 используется без применения лучевой терапии.

Лучевая терапия является стандартным способом лечения неоперабельных опухолей и/или опухолевых метастазов. Положительные результаты наблюдаются в том случае, когда лучевую терапию используют в комбинации с химиотерапией. Лучевая терапия основана на том принципе, что интенсивное облучение очага поражения должно привести к гибели репродуктивных клеток в опухолевых и нормальных тканях. Курс лучевой терапии обычно приводится в виде поглощенной дозы (ПД), времени и фракционирования дозы, и должен тщательно контролироваться онкологом. Количество излучения, полученного пациентом, зависит от ряда факторов, наиболее важными из которых являются локализация опухоли относительно других важных структур или органов и степень распространения опухоли. Типичный курс лечения пациента с использованием лучевой терапии представляет собой график, рассчитанный на 1-6 недель, с общей дозой от 10 до 80 ПД, вводимой пациенту в виде суточной фракции приблизительно от 1,8 до 2,0 ПД в течение 5 дней в неделю. В предпочтительном варианте настоящего изобретения, если опухоли в организме пациентов подвергаются воздействию комбинации по изобретению и облучения, наблюдается синергичное действие. Иными словами, подавление роста опухоли с использованием агентов, включающих комбинацию по изобретению, усиливается при одновременном облучении, необязательно с использованием дополнительных химиотерапевтических или противоопухолевых агентов. Параметры адъювантной лучевой терапии приводятся, например, в WO 99/60023.

Антитела вводят пациенту известными методами. Внутривенно в виде однократного вливания или непрерывным вливанием в течение определенного времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, интраартикулярным, внутрисуставным или интратекальным способом. Предпочтительны внутривенный или подкожный способ введения антител.

Изобретение также включает набор, содержащий контейнер, композицию, включающую указанные антитела анти-CD20 типа I и типа II в форме одного или двух отдельных препаратов, и листовку-вкладыш для потребителя по введении композиции указанных антител анти-CD20 типа I и типа II пациенту, страдающему от рака, экспрессирующего CD20.

Предпочтительно набор, отличается тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I обозначают ритуксимаб, а указанные антитела анти-CD20 типа II обозначают гуманизированные антитела В-Lyl, а указанный рак, экспрессирующий CD20, обозначает В-клеточную лимфому не-Ходжкина (ЛНХ)).

Термин "листовка-вкладыш" обозначает инструкции, обычно включенные в коммерческие упаковки лекарственных средств, которые содержат информацию относительно показаний, применения, доз, способа введения, противопоказаний и/или предупреждения относительно применения таких лекарственных средств.

В предпочтительном варианте, содержание контейнеров включает также фармацевтически приемлемый носитель, а также стерильный разбавитель, который предпочтительно хранится в отдельном дополнительном контейнере.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель", используемый в описании заявки, включает любые материалы, пригодные для введения в составе фармацевтического препарата, включая растворители, диспергирующие среды, материалы покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и другие материалы и соединения, пригодные для введения в составе фармацевтического препарата. Изобретение включает применение таких носителей в составе композиций по изобретению, за исключением любых обычных сред или агентов, несовместимых с активным соединением. Композиции могут также включать дополнительные активные соединения.

Фармацевтические композиции

Лекарственные препараты антител, используемые по настоящему изобретению, получают для хранения смешиванием антител (требуемой степени чистоты) с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизирующими агентами (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 изд., Osol А., ред. (1980)), в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизирующие агенты являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах или концентрациях и включают буферные вещества, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты, антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин, консерванты (такие, как хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие, как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и мета-крезол), низкомолекулярные полипептиды (содержащие менее приблизительно 10 аминокислот), белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу, или декстрины, комплексоны, такие как ЭДТА, сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит, солеобразующие противоионы, такие как натрий, комплексы металлов (например, Zn-содержащие белки), и/или неионные ПАВ, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Препараты по изобретению могут представлять собой две отдельных композиции каждого из антител анти-CD20. В другом варианте препарат может также содержать оба антитела в одной композиции.

Кроме того, композиция может также включать химиотерапевтический агент, цитоксический агент, цитокин, агент, подавляющий рост (клеток) или анти-ангиогенный агент. Такие агенты обычно присутствуют в составе комбинации в количествах, которые являются эффективными для терапевтического применения.

Активные ингредиенты можно включать в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, гидроксиметилцеллюлозы или желатиновых микрокапсул и микрокапсул поли(метилметакрилата), соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 изд., Osol А., ред. (1980).

Кроме того, можно получать препараты с замедленным высвобождением. Пригодными примерами таких препаратов являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитела, причем матрицы могут иметь различные формы, такие как пленки или микрокапсулы. Примерами матриц с замедленным высвобождением являются полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (см. US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочная кислота/гликолевая кислота, такие как LUPRON DEPOT^TM(инъецируемые микросферы сополимера молочная кислота/гликолевая кислота и лейпролидацетата) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.

Препараты, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Стерилизацию проводят фильтрованием через стерильные мембраны.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа I, предназначенные для лечения рака, экспрессирующего CD20, отличающиеся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа I, предназначенные для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, отличающиеся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II.

В одном предпочтительном варианте изобретения указанные антитела анти-CD20 типа I представляют собой ритуксимаб, а указанные антитела анти-CD20 типа II представляют собой гуманизированные антитела В-Lyl, а указанный рак, экспрессирующий CD20, представляет собой В-клеточную лимфому не-Ходжкина (ЛНХ).

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа I, предназначенные для лечения рака, экспрессирующего CD20, или пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, отличающиеся тем, что

а) соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2,

б) указанные антитела анти-CD20 типа I вводят совместно с антителами анти-CD20 типа II, а

в) соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6.

Предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, является В-клеточной лимфомой не-Ходжкина (ЛНХ).

Предпочтительно антитела анти-CD20 типа II характеризуются повышенной зависимостью от антител клеточной цитотоксичностью (ЗАКЦ).

Настоящее изобретение, объем которого указан в прилагаемых пунктах формулы изобретения, иллюстрируется следующими примерами и чертежами. Подразумевается, что в пределах сущности изобретения возможны различные модификации указанных методик.

Перечень аминокислотных последовательностей

SEQ ID NO: 1 аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) моноклональных антител анти-CD20 B-Lyl мыши.

SEQ ID NO: 2 аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) моноклональных антител анти-CD20 B-Lyl мыши.

SEQ ID NO: 3 -19-аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) гуманизированных антител B-Lyl (B-HH2 - В-НН9, B-HL8 и B-HL10 - B-HL17).

SEQ ID NO: 20-аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (LH) гуманизированных антител B-Lyl B-KV1.

Описание чертежей

Фиг.1. Противоопухолевая активность при комбинированном воздействии на клетки человека (OCI-Lyl8) лимфомы не-Ходжкина (ЛНХ) антител анти-CD20 типа I (ритуксимаб), соотношение связывающих активностей которых и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках (АТСС №CCL-86) составляет 1,0, и антител анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE), соотношение связывающих активностей которых и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках (АТСС XoCCL-86) составляет 0,44. На оси у указан средний объем опухоли (мм), на оси х указаны дни после инъекции опухолевых клеток. А) носитель (кружочки), В) ритуксимаб, 30 мг/кг внутривенно один раз в неделю (треугольники). С) гуманизированные антитела B-lyl DE (B-HH6-B-KV1 GE), 30 мг/кг один раз в неделю (квадратики) и D) ритуксимаб вместе с B-HH6-B-KV1 GE (30 мг/кг один раз в неделю) (крестики).

Фиг.2. Среднее значение интенсивности флуоресценции (СИФ, ось у) антител анти-CD20 типа I (Су5/ритуксимаб=белый столбик) и антител анти-CD20 типа II (Су5/гуманизированные B-Lyl B-HH6-B-KV1 GE=черный столбик) на клетках Raji (ATCC №CCL-86), соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I (ритуксимаб) и ритуксимаба и антител анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE) и ритуксимаба в отношении CD20 указаны на правой оси у.

Фиг.3. Противоопухолевая активность при комбинированном воздействии на клетки человека (Z138) лимфомы не-Ходжкина (ЛНХ) двух антител анти-CD20 типа II. Оба антитела являются гуманизированными антителами анти-CD20 B-Lyl, 1) B-HH6-B-KV1 гликомодифицированные и 2) B-HH6-B-KV1 дикого типа (негликомодифицированные). На оси у указан средний объем опухоли (мм), на оси х указаны дни после инъекции опухолевых клеток. А) носитель (кружочки), В) гуманизированные антитела B-lyl GE (B-HH6-B-KV1 GE), 30 мг/кг один раз в неделю (треугольнички) и С) гуманизированные B-lyl (B-HH6-B-KV1) 30 мг/кг один раз в неделю (крестики).

Примеры

Пример 1

Противоопухолевое действие при комбинированном лечении антителами анти-CD20 типа I (ритуксимаб) и антителами анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE)

Анализируемые агенты

Антитела анти-CD20 типа I (ритуксимаб) получали в виде концентрированного раствора (с=10 мг/мл, в буферном растворе, содержащем полисорбат 80, хлорид натрия и цитрат натрия (фирма Hoffmann La Roche, Базель, Швейцария)).

Антитела анти-CD20 типа II B-HH6-B-KV1 GE (гуманизированные B-Lyl, гликомодифицированные B-HH6-B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875) получали в виде концентрированного раствора (с=9,4 мг/мл, в буферном растворе, содержащем гистидин, трегалозу и полисорбат 80 (фирма GlycArt, Шлирен, Швейцария).

Перед инъекцией оба концентрированных раствора разбавляли в ФСБ.

Клеточные линии и условия культивирования

В эксперименте использовали клетки человека OCI-Lyl8 лимфомы не-Ходжкина (диффузная крупноклеточная лимфома, см. Chang Н. и др., Leuk. Lymphoma, Sep., 8(1-2), 129-136 (1992)). Линию опухолевых клеток культивировали в стандартных условиях в среде INDM (фирма РАА Laboratories, Австрия), содержащей 20% ЭТС (фирма РАА Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамин, 25 нМ HEPES и 0,05 мМ меркаптоэтанол, при 37°С в насыщенной влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Для трансплантации использовали клетки после двухкратного пересева.

Животные

Самок мышей SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров возрастом 4-5 недель (полученных от фирмы Bomholtgard, Ry, Дания) после доставки выдерживали в специальных стерильных условиях в режиме 12 ч свет/12 ч темнота в соответствии с методическими рекомендациями (фирма GV-Solas, Felasa, TierschG). Протокол испытаний рассмотрен и утвержден местными административными органами. После доставки животных выдерживали в карантинном блоке вивария в течение одной недели для привыкания к новым условиям и для обследования. При этом проводили непрерывный контроль состояния здоровья при свободном доступе к корму (Provimi Kliba 3337) и воде (подкисленная до рН 2,5-3).

Обследование

Животных ежедневно обследовали на наличие клинических симптомов и проявление побочного действия. В течение эксперимента у животных дважды в неделю регистрировали массу тела и измеряли размер опухоли штангенциркулем после определения стадии заболевания.

Лечение животных

Лечение начинали в день рандомизации через 24 дня после трансплантации клеток. Исследуемым группам животных вводили гуманизированные антитела анти-CD20 типа II, B-HH6-B-K.V1 GE, а контрольной группе вводили соответствующий носитель, внутривенно, один раз в неделю, в день 24, 31, 38, 45 и 52 в дозе 30 мг/кг. Антитела анти-CD20 типа I (ритуксимаб) вводили отдельно и в комбинации с антителами анти-CD20 типа II, B-HH6-B-KV1 GE, в день 26, 33, 40, 47 и 54.

Подавление роста опухоли in vivo

Контрольную группу животных, которым вводили носитель, исключали из эксперимента через 10 дней после начала лечения из-за большой опухолевой массы. Лечение животных, которым еженедельно вводили ритуксимаб в дозе 30 мг/кг, приводило к подавлению роста ксенотрансплантата через 10 дней (ПРО 68%). Однако позднее наблюдался непрерывный рост опухолевого ксенотрансплантата, несмотря на еженедельные инъекции ритуксимаба в отдельности. Напротив, лечение антителами B-HH6-B-KV1 GE (30 мг/кг, один раз в неделю) подавляло рост опухоли OCI-Ly18 (ПРО 100%). Тем не менее, в конце-концов наблюдался рост опухолевого ксенотрансплантата даже при введении антител B-HH6-B-KV1 GE. Однако комбинация ритуксимаба и антител B-HH6-B-KV1 GE (оба в дозе 30 мг/кг) оказалась значительно более эффективной. При этом наблюдалось подавление опухолевых ксенотрансплантатов и, в отличие от действия указанных агентов в отдельности, комбинация антител поддерживала опухолевый стаз в течение дополнительного времени.

Пример 2

Определение соотношения связывающих активностей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №CCL-86)

Клетки Raji (ATCC №CCL-86) культивировали в среде RPMI-1640 (фирма PanBiotech GmbH, Cat. №РO4-18500), содержащей 10% ЭТС (фирма Gibco, Cat. №10500-064). В антитела анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1, гуманизированные антитела В-Lyl) и в ритуксимаб вводили метку с использованием moho-nhs-эфира Су5 (фирма Amersham GE Healthcare, Cat. №РА15101) по методике фирмы-производителя. Конъюгат ритуксимаб/Су5 содержал 2,0 молекулы Су5 в одной молекуле антитела. Конъюгат B-HH6-B-KV1/Су 5 содержал 2,2 молекулы Су5 в одной молекуле антитела. Для определения и сравнения связывающих активностей и способа связывания обоих конъюгатов строили кривые связывания (титрованием Су5-конъюгированного ритуксимаба и Су5-конъюгированных антител B-HH6-B-KV1) методом прямой иммунофлуоресценции с использованием линии клеток Raji лимфомы Беркитта (ATCC №CCL-86). По величине средней интенсивности флуоресценции (СИФ) рассчитывали величину ЕС₅₀ (50% от максимальной интенсивности флуоресценции) Су5-ритуксимаба и Су5-антител B-HH6-B-KV1, соответственно. 5×10⁵ клеток в образце окрашивали в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки промывали культуральной средой, для исключения погибших клеток использовали окрашивание пропидийиодидом. Измерения проводили на приборе FACS (фирма Becton Dickinson), пропидийиодид регистрировали в дальней красной области А, а Су5 в красной области А. Средние интенсивности флуоресценции (СИФ) для связывания при ЕС₅₀ (50% от максимума) приводятся на фиг.2 (Су5-антитела B-HH6-B-KV1 - черный столбик, а Су5-ритуксимаб - белый столбик).

Затем рассчитывали соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №CCL-86) по следующей формуле:

\begin{array}{l} (ATCC . №CCL-86) = \\ \frac{С И Ф (С у 5 / а н т и т е л а а н т и - C D 20)}{С И Ф (С У 5 / р и т у к с и м а б)} \times \frac{с о д е р ж а н и е С у 5 в конъюгате (С у 5 / ритуксимаб)}{с о д е р ж а н и е Су5 в конъюгате (С у 5 антитела анти-CD20)} \\ = \frac{С И Ф (В-НН6-В-КV1)}{С И Ф (Су5/ритуксимаб)} \times \frac{с о д е р ж а н и е С у 5 в конъюгате (С у 5 / ритуксимаб)}{с о д е р ж а н и е С у 5 в к о н ъ ю г а т е (B - H H 6 - B - K V 1))} \\ = \frac{207}{433} \times \frac{2.2}{2.0} = 0,44 \end{array}

Таким образом антитела B-HH6-B-KV1, т.е. типичные антитела анти-CD20 типа II, обладают пониженной связывающей активностью по сравнению с ритуксимабом.

Пример 3

Одинаковая противоопухолевая активность гликомодифицированных и немодифицированных (дикого типа) антител анти-CD20 (B-HH6-B-KV1 GE и дикого типа) в отношении Z138 MCL, ксенотрансплантата мышей SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров

Анализируемые агенты

Антитела анти-CD20 типа II, B-HH6-B-KV1, (гликомодифицированные и дикого типа) получали в виде концентрированного раствора (с=9,4 мг/мл и 12,5 мг/мл) в буферном растворе, содержащем гистидин, трегалозу и полисорбат 20 (фирма GlycArt, Шлирен, Швейцария),

Клеточные линии и условия культивирования

Клетки человека Z138 В-клеточной лимфомы не-Ходжкина (лимфома из клеток мантийной зоны) получали от фирмы Glycart. Линию опухолевых клеток культивировали в стандартных условиях в среде DMEM (фирма РАА Laboratories, Австрия), содержащей 10% ЭТС (фирма РАА Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамин, при 37°С в насыщенной влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Для трансплантации использовали клетки после двухкратного пересева.

Животные

Обследование

Лечение животных

Лечение начинали в день рандомизации через 14 дней после трансплантации клеток. Исследуемым группам животных вводили гуманизированные антитела анти-CD20 (B-HH6-B-KV1 GE и дикого типа), а контрольной группе животных вводили соответствующий носитель, внутривенно, один раз в неделю, в день 14, 20, 27 и 34, в дозе 10 мг/кг.

Подавление роста опухоли in vivo

Контрольную группу животных, которым вводили носитель, исключали из эксперимента в день 19 после начала лечения из-за большой опухолевой массы. Лечение животных, которым еженедельно вводили B-HH6-B-KV1 (гликомодифицированные и дикого типа) в дозе 10 мг/кг, приводило к подавлению роста ксенотрансплантата сразу после начала лечения. После завершения контроля наблюдалась регрессия всех опухолей, обработанных антителами, через некоторое время наблюдалась полная ремиссия ксенотрансплантатов опухоли Z138. При этом не наблюдалось никакой значимой разницы между диким типом и гликомодифицированными вариантами антител анти CD20 В-HH6-B-KV1 на этой модели ксенотрансплантата. Такое явление вполне возможно, поскольку у таких мышей клетки NK не экспрессируют нативную форму рецептора Fc и, кроме того, известно, что мыши SCID некомпетентны для NK-опосредованной ЗАКЦ из-за тяжелой формы тройного иммунодефицита. Следовательно, модели подкожного ксенотрансплантата у мышей SCID являются непригодными для имитации ЗАКЦ-опосредованного действия гликомодифицированных антител в организме человека.

Claims

1. Применение антитела анти-CD20 типа I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанное антитело анти-CD20 типа I вводят совместно с антителом анти-CD20 типа II, причем указанным антителом анти-CD20 типа I является ритуксимаб, указанным антителом анти-CD20 типа II - гуманизированное антитело B-LyI, включающее вариабельную область тяжелой цепи (VH) SEQ ID No 7 и вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID No 20, причем по меньшей мере 40% или более олигосахаридов Fc областей антител анти-CD20 типа II в составе композиции являются нефукозилированными, а раком, экспрессирующим CD20, является не-Ходжкинская лимфома.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело анти-CD20 типа II имеет повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

3. Применение антитела анти-CD20 типа I для лечения рака, экспрессирующего CD20, отличающееся тем, что указанное антитело анти-CD20 типа I вводят совместно с антителом анти-CD20 типа II, причем указанным антителом анти-CD20 типа I является ритуксимаб, указанным антителом анти-CD20 типа II - гуманизированное антитело B-LyI, включающее вариабельную область тяжелой цепи (VH) SEQ ID No 7 и вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID No 20, причем по меньшей мере 40% или более олигосахаридов Fc области этого антитела анти-CD20 типа II являются нефукозилированными, а раком, экспрессирующим CD20, является не-Ходжкинская лимфома.

4. Применение антитела анти-CD20 типа I для лечения рака, экспрессирующего CD20 по п.3, отличающееся тем, что указанное антитело анти-CD20 типа II имеет повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).