TW200916482A - Bone morphogenetic protein (BMP)-binding domains of proteins of the repulsive guidance molecule (RGM) protein family and functional fragments thereof, and use of same - Google Patents
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Description
200916482 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於排斥性導引分子（RGM)蛋白質家族成員之 #形態發生蛋白(BMp)結合區域以及源自其之多肽片段及 融合蛋白的鐘別及用途。本發明之結構域（亦即肽片段及 融5蛋白）適用作用於個體主動或被動免疫之藥劑或適用 作用於在來源或進程中涉及該RGM家族成員及與此分子相 關之細胞受體（諸如尤其為新生素及/或BMP)之疾病或醫學 病況的診斷劑及治療劑。本發明另外係關於針對本發明之 結合區域且針對源自其之多肽之單株及多株抗體且係關於 用於產生本發明之多肽、融合蛋白及抗體之方法。 【先前技術】 RGM蛋白質家族成員之功能首先係由Monnier，P.P.等 人’ Nature，419, 392-395, 2002描述。此家族包括三個先 前已知之成員，其稱作RGM A、RGM B(亦稱作DRAGON) 及Kulvl il ’力、稱作鐵調素調節蛋白（liemojuvelin)) (Niederkofler V.等人，J. Neurosci. 24，808-18，2004)。此 等者為經由脂質錨（糖基磷脂醯肌醇（GPI)錨）與質膜結合之 醣蛋白。此蛋白質家族成員與其他蛋白質不具有廣泛序列 同源性，且結構特徵已基本上於以下區域中得以鑑別·· N 端信號肽；RGD序列；GDPH胺基酸序列處之蛋白水解裂 解位點；假性血友病因子域（vWF D)之結構同系物；c端附 近之疏水序列；及C端GPI錨一致序列（亦參見圖2)。
在人類體内，定位染色體15上RGM A、染色體5上RGM 134305.doc 200916482 B及染色體1上RGM C之編碼序列。觀測到以下特徵表現模 式：RGM A及B尤其表現於成人大腦及脊髓中，RGM C特 別表現於骨骼肌、肝及心肌中，且RGM B亦表現於軟骨組 織中。 最初將RGM蛋白質鑑別為候選蛋白，其在局部解剖神經 元突出物形成中起重要作用（Stahl B.等人，Neuron 5: 735-43, 1990 ; Mueller B.K.等人，Curr. Biol. 6, 1497-1502, 1996 ; Mueller, Β·Κ. in Molecular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation, H. Fujisawa 編輯，Japan Scientific Societies Press，215-229，1997)。RGM蛋白質起 到排斥或抑制生長神經纖維之作用的能力為在其分離、選 殖及表徵中起重要作用之關鍵功能特徵。在簡單細胞測試 系統中，已容易地證明該能力。RGM蛋白質在兩個不同細 胞檢定中具有排斥或抑制效應。在塌陷（collapse)測試中， 添加RGM蛋白質來使神經纖維生長。RGM與RGM受體之 結合引發神經元生長錐之所有膜元件發生收縮之強烈反 應。使最初膨脹之手樣生長錐轉化為細絲。在RGM存在 下，神經纖維保持受抑制且強烈收縮，且無法再持續生 長。 RGM蛋白質藉由與RGM受體新生素結合而發揮其部分 作用（Rajagopalan S.等人，Nat. Cell· Biol· 6, 756-62, 2004)。新生素與結腸直腸癌缺失（DCC)受體緊密相關。兩 種受體皆為免疫球蛋白超家族成員，且具有胞外、跨膜及 細胞内域。兩者皆已被描述為另一配位體神經突起導向因 134305.doc 200916482 子（netriiD-l之受體，但僅新生素而非Dcc與rgm蛋白質結 合。此等受體之胞外域係由四個免疫球蛋白樣域、繼之以 六個纖維結合蛋白重複域組成。 對RGM A在神經系統中之功能已得到最佳理解，且其在 極低濃度下對神經纖維生長之抑制作用係顯著的。對生長 之人類及成年大鼠中樞神經系統之損傷導致rgm蛋白質在 損害部分處積聚（Schwab J.M.等人，Arch. Neurol.，第62 卷 ’ 1561-1568，2005 ; Schwab J.M.等人，Eur. J. Neurosci 21，387-98，2005)。因此防止受損神經纖維新的生長，視 損害部位之位置而定導致永久、較嚴重或較不嚴重之功能 缺損。RGM抑制神經纖維生長之此活性係藉由與受體新生 素結合而受介導（Rajagopalan S.等人之上述引文）。相同受 體經由神經突起導向因子-1之結合而介導，且介導刺激神 經纖維生長之相反效應。若藉由多株抗體中和大鼠脊髓中 損害部位處之RGM A蛋白質，則神經纖維在損傷部位上再 生且形成新突觸接觸，從而導致顯著的功能改良（Hata κ .， 等人，J. Cell. Biol. 173, 47-58, 2006)。 最近之發現指出，RGM蛋白質亦在中樞及周圍神經系統 中’在鐵代謝調控中，在腫瘤疾病及炎症過程中以及在骨 絡及軟骨組織形成中起重要作用。 RGM家族之蛋白質之神經突生長抑制域已自w〇 2007/039256得知。RGM A之顯著抑制活性定位於（例如）序 列範圍260-290中。 亦已知RGM A、B及C能夠與各種BMP家族成員相互作 134305.doc 200916482 用。BMP為涉及於許多生理及病理生理過程中之TGF-β配 位體超家族之成員。BMP經由專門信號轉導路徑發揮其功 能，該路徑以BMP配位體與兩種類型之絲胺酸/蘇胺酸激 酶受體組合之結合為起始。先前已證明BMP-2、-4、-5、 -6及-12與RGM之相互作用（參見例如Babitt，J.L.等人， Nature Genetics, 2006，第 48卷，5，53 1-539 ; Babitt，J.L. 等人，J. Biol. Chem.，2005 ’ 第 280 頁，33, 29820-29827 ; Babitt，J.L.等人’ The Journal of Clinical Investigation, 2007，第 117卷，7, 1933-1939 ; Samad，T.A.等人，J. Biol. Chem.，2005，弟 280卷 ’ 14，14122-14129 ;及 Halbrooks 等 人 ’ J. Molecular Signaling 2, 4, 2007(以電子形式出版））。 此前未曾描述RGM蛋白質之BMP結合區域。 因此’本發明之目標為RGM蛋白質之BMP結合區域之定 位及其表徵。 【發明内容】 令人驚奇的是’上述目標已藉由分離及表徵人類RGM蛋 白質（尤其為RGM A)之BMP結合區域及其活性多肽片段而 達成。 【實施方式】 I·通用術語之解釋 除非本文中另有定義’否則關於本發明所使用之科學及 技術術語應具有普通熟習此項技術者通常所理解之含義。 該等術語之含義及範疇應清楚明瞭，然而在存在任何潛在 歧義之情形下’本文中所提供之定義優先於任何辭典或外 134305.doc 200916482 來定義此外除非上下文另有需要，否則單數術語應包 括複數且複數術語應包括單數。在本中請案中，除非另有 所述，否則使用，，或”意謂，，及/或"。此外，使用術語"包括” 以及其他形式並不具限制性。又，除非另外特別說明，否 則諸如，，元件，，或”組分，，之術語涵冑包含一個單位之元件及 組分以及包含一個以上亞單位之元件及組分。
-般而言，本文中所述之與細胞及組織培養、分子生物 f、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜 父有關所使用之名法及其技術為此項技術中所熟知及常 用之彼等命名法及技術。除非另有所指，否則本發明之方 法及技術一般係根據此項技術中所熟知之習知方法及如貫 穿本》兄明書所引用及討論之各種一般及更為具體之參考文 獻中所述之方法執行。酶促反應及純化技術係、根據製造商 說明書’如此項技術中通常所實行或如本文中所述般執 订本文中所述之與分析化學、合成有機化學及醫藥化學 有關所使用之命名法及其實驗室料與技術為此項技術中 :熟知及常用之彼等者。標準技術係用於化學合成、化學 刀析、醫藥製備、調配及傳遞以及患者治療。 為使本發明彳更易於理解，所選擇之術語係如下定義。 本文中所使用之術語”多肽”係指任何胺基酸聚合鏈。術 語”肽”與”蛋白f’，可與術語多肽互換使用且亦係指胺基酸 聚合鏈。術語"多肽，，涵蓋天然或人造蛋白質、蛋白質片段 及蛋白質序列之多肽類似物。多肽可為單體或聚合的。 術語"經分離蛋白質"或”經分離多肽”為就衍生起源或來 134305.doc 200916482 源而言與其天然狀態下所伴隨之天然相關組份不相關、大 -不3來自相同物種之其他蛋白質、係由來自不同物種 之細胞所表現或非天然產生之蛋白質或多a。因此，可將 化子口成付之或於不同於其天然源自於之細胞之細胞系統 中合成得之的多肽與其天然、相關組份,,分離„。亦可藉由使 用此項技術中所熟知之蛋白質純化技術來分離而使蛋白質 大體上不含天然相關組份。 ，本文中所使用之術語"回收"係指藉由（例如）使用此項技 術中所熟知之蛋白質純化技術來分離而使化學物質(諸如 多肽）大體上不含天然相關組份的過程。 在本發明之範噚内，術語"受體，，特別係指與細胞膜結合 之表面分子，該等表面分子能夠與（例如）可溶之配位體相 :作用且由於此相互作用能夠誘發(例如)導入細胞内部之 k號或信號級聯（亦稱作"信號轉導 ”配位體”係指天然(亦即活體内產生)或合成之”受體"之 低刀子或回分子結合搭配物。配位體較佳在胞外環境中為 可自由移動的。 免疫原’’係指適用於誘發針對免疫原之抗體之形成的糖 基化或非糖基化形式之本發明之肽片&。免疫原（半抗原 形式）與巨分子受質之結合可為有利的。 ”抗原決定基”或抗原決定子係指（例如）決定著抗體特異 性,,原(諸如蛋白質)之區域。若此抗原決定基係在蛋白 質區段中新近形成的或（例如）由於諸如蛋白質與配位體之 相互作用之外部影響而表現於可及分子表面上，則將其稱 134305.doc 200916482 為”新抗原決定基”。尤其為，術語"抗原決定基'’或π抗原決 定子π包括能夠與免疫球蛋白或τ細胞受體特異性結合之任 何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括 分子之化學活性表面分組，諸如胺基酸、糖側鏈、填醯基 或磺醯基，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵 及/或特定電荷特徵。抗原決定基為抗原為抗體所結合之 區域。在某些實施例中，抗體在其於蛋白質及/或巨分子 之複雜混合物中優先識別其靶抗原時，將該抗體稱為特異 性地結合抗原。 本文中所使用之術語”中和”係指在結合蛋白特異性地結 合革巴蛋白時中和乾蛋白之生物活性。較佳地，中和結合蛋 白為與RGM A、RGM Β或RGM C分子結合導致抑制該 RGM分子之生物活性的中和抗體。較佳地，中和結合蛋白 結合RGM且使RGM生物活性降低至少約20%、40%、 60%、80%、85%或更多。中和結合蛋白對RGM之生物活 性的抑制可藉由量測此項技術中所熟知之RGM生物活性之 一或多種指示劑來評估。 術語”活性”包括以下活性，諸如抗體對抗原之結合特異 性/親和力，該抗體例如與RGM抗原結合之抗RGM抗體； 及/或抗體之中和效能，該抗體例如與RGM A結合抑制 RGM A之生物活性之抗RGM A抗體。 蛋白質或抗體之"結構域’’係指由結構元件（諸如ex螺旋及/ 或β摺疊元件）形成之界定於蛋白質内之複雜結構。 除非另有所指，否則術語”本發明之RGM蛋白質”涵蓋 134305.doc -12- 200916482 RGM分子家族成員之BMp結合區域，以及源自其之多肽， 尤其為RGM A、RGM B及RGM C。尤其為，包括"刺激 "BMP信號轉導路徑之功能性多肽月段。本發明之多肽亦 可涵蓋"抑制性活性"多肽，尤其彼等與新生素結合或具有 抑制神經纖維生長之活性（藉助於本文中所述之神經突生 長測試來說明）之多肽。 本發明之結構域或多肽之"結合"在最廣泛之意義上係理 解為（例如）視情況限於隨時間變化之與結合搭配物（諸如 BMP或新生素）任何類型之相互作用。結合可為特異性或 非特異性的，較佳為特異性的。該結合係使用合適結合檢 定（諸如本文實驗部分中所描述之結合測試）來偵測。尤其 為，可（例如）藉由形成共價或非共價相互作用（諸如離子 及/或疏水性相互作用）使本發明之結構域或多肽與特定結 合搭配物接觸。詳言之，該相互作用可足以調節（亦即正 性或負性影響），以便促進或部分或完全抑制由結合搭配 物所介導之特徵，諸如生物功能，例如結合搭配物與第三 搭配物之相互作用。 本發明之結合為"特異性的'尤其當不同結合搭配物或 不同結合搭配物種類之數量在數值上受到限制時更是如 此。詳言之，不應進行超過1〇種，諸如丨、2、3、4或5種 不同結合搭配物或苑合搭配物種類之結合。舉例而古， BMP表示結合搭配物種類。當儘管發生與多種結合搭配物 之相互作用，但僅就有限數目之結合搭配物而言在上述意 義上相互作用具有足夠強度來影響生物功能時，特異性同 134305.doc •13. 200916482 樣存在。舉例而言，當含有尤其選自BMP-2、BMP-4、 BMP-5、BMP-6及BMP-12之至少一種BMP的本發明之結構 域或多肽尤其與BMP-2及/或BMP-4結合及/或與新生素結 合時存在特異性。 ”抑制”或’’抑制性活性”多肽為彼等在本文中所述之神經 細胞生長測試中降低或完全抑制神經細胞生長之多肽。 對於給定多肽而言，上述"刺激”及"抑制”活性可彼此獨 立地指定，然而，較佳地為始終存在BMP信號路徑”刺激π 活性，且僅視情況存在神經細胞生長”抑制”活性。 ”BMP信號轉導”刺激活性為可由至少一種選自ΒΜΡ-2、 BMP-4、BMP-5、BMP-6及BMP-12之BMP蛋白所引發之活 性。當藉由本文中所述之活體外結合測試所說明的本發明 之BMP結合多肽與至少一種選自BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6及BMP-12之BMP分子相互作用時，存在此刺激 活性。 除非另有所指，否則”RGM”表示RGM A、RGM B及 RGM C，尤其為 RGM A。 ”新生素”與”新生素受體π為同義術語，且尤其係指哺乳 動物新生素，尤其為人類新生素。 ΒΜΡ結合區域或ΒΜΡ結合多肽與另一胺基酸序列之”官 能鍵聯”尤其係理解為允許該區域或該多肽與至少一個選 自 BMP-2、BMP-4、BMP-5、ΒΜΡ-6 及 ΒΜΡ-12 之 BMP 分子 及/或新生素結合之共價（例如）肽鍵。 術語”調控”與”調節可互換使用，且如本文中所用，係 134305.doc -14- 200916482 指所關注分子之活性（例如RGM A之生物活性）之變化或改 變。調節可為所關注分子之特定活性或功能量值之增加或 減低。例示性分子活性及功能包括（但不限於）結合特徵、 酶促活性、細胞受體活化及信號轉導。 相應地’本文中所使用之術語"調節劑"為一種能夠改變 所關注分子之活性或功能（例如RGM A之生物活性）之化合 物。舉例而言，調節劑可引起分子之特定活性或功能量值 與在無該調節劑之情況下所觀測到之活性或功能量值相比 發生增加或減低。在某些實施例中’調節劑為減低分子之 至少一種活性或功能量值之抑制劑。例示性抑制劑包括 (但不限於）蛋白質、肽、抗體、肽體、碳水化合物或小有 機分子。肽體係描述於（例如）WOO 1/83 525中。 本文中所使用之術語”促效劑”係指一種當與所關注之分 子接觸時引起該分子之特定活性或功能量值與在無該促效 劑之情況下所觀測到之活性或功能量值相比發生增加之調 節劑。所關注之特定促效劑可包括（但不限於）rgm a多肽 或與RGM A結合之多肽、核酸、碳水化合物或任何其他分 子。 本文t所使用之術語”拮抗劑”或”抑制劑，，係指一種當與 所關注分子接觸時引起該分子之特定活性或功能量值與在 無該拮抗劑之情況下所觀測到之活性或功能量值相比發生 減低之調節劑。所關注之特定拮抗劑包括彼等阻斷或調節 RGM A之生物或免疫活性之拮抗劑^ RGM a之拮抗劑及抑 制劑可包括（但不限於）與11(；}]^ A結合之蛋白質、核酸、碳 134305.doc -15- 200916482 水化合物或任何其他分子。 本文中所使用之術語"有效詈"伤扣 a双罝係拍足以起到以下作用之 療法用量：降低或改善病症或其— -乂夕種症狀之嚴重性 及/或持續時間；防止病症進展；引起病症消$;防止盥 病症相關之-❹種症狀之復發、發展、發作或進展^貞 測病症；或增強或改良另一疼牛（你丨Λ 縻法（例如預防或治療藥劑）之 預防或治療效應。 本文中所使用之術語"樣本”係在最廣泛之意義上加以使 用。本文中所使用之"生物樣本，，包括（但不限於）任何量之 來自生物或以前生物之物f。該等生物包括（但不限於）人 類、小鼠、大鼠、猴、X、兔及其他動物。該等物質包括 (但不限於）血液、血清、尿液、滑液、細胞、器官、組 織、骨髓、淋巴結及脾。 II.本發明之專屬標的 本發明之第-標的係關於糖基化形式或尤其非糖基化形 式的較佳源自哺乳動物RGM(例如人類、大鼠或小鼠，或 家禽（例如雞））之排斥性導引分子（RGM)之骨形態發生蛋白 (BMP)結合區域或結合肽片段。除非另有說明，否則術語" 結合區域”涵蓋源自RGM之與至少一種BMp結合之任何多 肽0 一較佳實施例係關於源自根據SEQ ID N〇: 2之人類RgM A、根據SEQ ID NO: 4之人類RGM B或根據SEQ m N〇: 6 之人類RGM C之BMP結合區域。該等結合區域尤其涵蓋具 有達至170個（例如達至125，達至1〇〇，達至8〇，達至， 134305.doc -16- 200916482 達至50，達至40，達至30，達至20或達至10個）來自 RGM(特定言之為RGM(諸如尤其為RGM A)之關於vWF域 之N端或關於神經纖維生長抑制域（OID)之C端）之胺基酸序 列範圍或來自可由序列比對產生之RGM B及RGM C之對應 序列範圍的較佳鄰接胺基酸基團之長度的胺基酸序列。 本發明之標的尤其係關於具有約30至1 50個鄰接胺基酸 基團之長度之BMP結合區域，以及其官能衍生物及含有至 少一個與至少一個額外之不同胺基酸序列官能鍵聯之BMP 結合區域的融合蛋白。 本發明之標的亦係關於BMP結合區域，其特徵為根據 SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8之以下部分序列中之至少一 者： X1C(K/R)IX2(K/R)CX3(S/T/A)(E/D)(F/Y)X4SX5T(SEQ ID NO: 7) 其中又1至乂5表示任何給定之胺基酸基團；或 X6 CX7ALRX8YAX9CTX10RTXn(SEQ ID NO: 8)， 其中X6至Xn表示任何給定之胺基酸基團； 或下式之部分序列： (SEQ ID NO: 7)-連接 1-(SEQ ID NO: 8)， 其中連接1表示SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8橋接胺基酸 序歹彳，其含有10至45個（例如13至28個）任何給定之鄰接胺 基酸基團。 尤其為， X!表示Pro或Gin ; X2表示Leu或Gin ; 134305.doc -17- 200916482 X3表示Asn或Thr ; X4表示Val或Trp ; X5表示 Ser、Ala或 Leu ; X6表示Phe或Leu ; X7表示 Ala、Lys 或 Arg ; X8表示Ser或Ala ; X9表示Leu或Gly ; X10表示Arg或Gin;且/或 Xn表示Ala或Ser。 列出SEQ IQ NO: 7之以下特定實例： PCKILKCNSEFWSAT、 QCRIQKCTTDFVSLT、 QCKILRCNAEYVSST。 列出SEQ IQ NO: 8之以下特定實例： FCAALRSYALCTRRTA、 FCKALRAYAGCTQRTS、 LCRALRSYALCTRRTA。 列出連接1連接子之以下特定實例： SGSHAPASDDTPE、 SHLNSAVDGFDSE、 LSLRGGGSSGALRGGGGGGRGGGVGSGG。 BMP結合區域之實例包括根據SEQ ID NO: 2之胺基酸位 置30至180範圍内、根據SEQ ID NO: 4之胺基酸位置80至 230範圍内或根據SEQ ID NO: 6之胺基酸位置20至150範圍 134305.doc -18 - 200916482 内的胺基酸序列或其功能性 笙έ士人f a,n 啊玍素文體結合片段。亦將此 4、，，口 δ Q域（及源自其之片 ^ 一 ）私為冋親和力bmp結合區 域。坪言之，高親和力BMP結 古 〇σ[^域亦可具有與新生素之 南親和力相互作用，且因此亦可稱為高親和力新生素姓人 區域。另-方面，低親和力新生素結合區域之一實例為： 述於觸簡/G39256(該揭示案明確地以引用的方式併入 本文中)中之根據SEQ ID N0: 2之刪A片段218_284。不 受限於此，（例如）當〜(解離常數）> i _，諸如2至1〇 _ 時，存在低親和力結合；（例如）當％ < ι〇 ηΜ，諸如⑴ ηΜ日守’可存在南親和力結合。 高親和力BMP結合區域之實例為含有以下者之彼等者： 以下SEQ ID NO: 2胺基酸序列中之一者： 約47至約168，或約41至約168之胺基酸位置， 約47至約90，或約41至約90之胺基酸位置，或 約75至約121之胺基酸位置；
或以下SEQ ID NO: 4胺基酸序列中之—者： 約94至約209之胺基酸位置， 約94至約137之胺基酸位置，或 約122至約1 68之胺基酸位置； 以下SEQ ID NO: 6胺基酸序列中之一者： 約36至約1 72之胺基酸位置， 約36至約94之胺基酸位置，或 約80至約125之胺基酸位置； 或其功月&性BMP結合片段（例如以上序列中之一者之片 134305.doc -19- 200916482 段），該等結合區域或結合片段之C端及/或N端可在不損失 BMP結合能力之情況下縮短ϊ、2、3、4、5、6、7、8、 9、1〇、12、15個或達至20個胺基酸基團（可在本文中所述 之結合測試中偵測）。 本發明之結構域之其他特定實例為含有來自根據SEQ m NO: 2之約位置47至約168之序列範圍、來自根據seq出 NO: 4之約位置94至約209之序列範圍或來自根據犯(^ ID NO: 6之約位置36至172之序列範圍的至少1〇個鄰接胺基酸 基團（例如 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32 、 33 、 34 、 35 、 36 、 37 、 38 、 39 、 40 、 41 、 42 、 43 、 44 或45個鄰近基團）的bmp結合區域或其結合片段。 此係參考SEQ ID NO: 2進一步例示於附著於本說明書末 之表A中。 以下提及胺基酸位置60至120範圍内之合適片段的非限 制性數目之實例（給出第一及最後之胺基酸殘基）： 60-120, 61-120, 62-120, 64-120, 65-120, 66-120, 67-120, 68-120, 69-120, 70-120; 60-119, 61-119, 62-119, 64-119, 65-119, 66-119, 67-119, 68-119, 69-119, 70-119; 60-118， 61-118， 62-118， 64-118， 65-118， 66-118， 67-118, 68-118, 69-118, 70-118; 6〇-117, 61-117, 62-117, 64-117, 65-117, 66-117, 67-117, 68-117, 69-117, 70-117; 134305.doc -20- 200916482 60-116, 61-116, 62-116, 64-116, 65-116, 66-116, 67-116, 68-116, 69-116, 70-116; 60-115, 61-115, 62-115, 64-115, 65-115, 66-115, 67-115, 68-115, 69-115, 70-115; 60-114, 61-114, 62-114, 64-114, 65-114, 66-114, 67-114, 68-114, 69-114, 70-114; 60-90, 61-90, 62-90, 64-90, 65-90, 66-90, 67-90, 68-90, 69-90, 70-90; 60-89, 61-89, 62-89, 64-89, 65-89, 66-89, 67-89, 68-89, 69-89, 70-89; 60-88, 61-88, 62-88, 64-88, 65-88, 66-88, 67-88, 68-88, 69-88, 70-88; 60-87, 61-87, 62-87, 64-87, 65-87, 66-87, 67-87, 68-87, 69-87, 70-87; 60-86, 61-86, 62-86, 64-86, 65-86, 66-86, 67-86, 68-86, 69-86, 70-119; 60-85, 61-85, 62-85, 64-85, 65-85, 66-85, 67-85, 68-85, 69-85, 70-85; 60-84, 61-84, 62-84, 64-84, 65-84, 66-84, 67-84, 68-84, 69-84, 70-84; 60-83, 61-83, 62-83, 64-83, 65-83, 66-83, 67-83, 68-83, 69-83, 70-83; 60-82, 61-82, 62-82, 64-82, 65-82, 66-82, 67-82, 68-82, 69-82, 70-82; 134305.doc -21 - 200916482 60-81, 61-81， 62-81， 64-81， 65-81， 66-81， 67-81， 68-81, 69-81, 70-81; 60-80, 61-80, 62-80, 64-80, 65-80, 66-80, 67-80, 68-80, 69-80, 70-80; 60-79, 61-79, 62-79, 64-79, 65-79, 66-79, 67-79, 68-79, 69-79, 70-79; 60-78, 61-78, 62-78, 64-78, 65-78, 66-78, 67-78, 68-78, 69-78; 60-77, 61-77, 62-77, 64-77, 65-77, 66-77, 67-77, 68-77; 60-76, 61-76, 62-76, 64-76, 65-76, 66-76, 67-76; 60-75, 61-75, 62-75, 64-75, 65-75, 66-75; 60-74, 61-74, 62-74, 64-74, 65-74; 60-73, 61-73, 62-73, 64-73; 60-72, 61-72, 62-72; 60-71, 61-71; 60-70; 60-69 。 類似片段可類似地基於圖1之序列比對，由SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 6之對應部分推論出。 本發明之另一標的係關於位於（例如）關於OID之C端之 BiMP結合區域（參見圖2)。此等結合區域（及源自其之片段） 亦稱作低親和力BMP結合區域，此係因為在相當之測試條 件下，其結合親和力相對於上述高親和力BMP結合區域可 為較低。 -22- 134305.doc 200916482 因此，本發明之標的亦係關於BMP結合區域，其特徵為 根據SEQ ID NO: 26及SEQ ID NO: 27之以下部分序列中之 至少一者： LX20LC(V/L)X21GCP(SEQ ID NO: 26)， 其中X2〇及乂21表示任何給定之胺基酸基團；或 tax22x23 x24c(k/h)ex25(l/m)pv(e/k)dx26y(f/y)(q/h) (A/S)CVFD(V/L)LX27(T/S)G(SEQ ID NO: 27) > 其中x22至乂27表示任何給定之胺基酸基團； 或以下式之部分序列： (SEQ ID NO: 26)-連接 2-(SEQ ID NO: 27)， 其中連接2表示含有10至45(例如約19至38)個任何給定 之鄰接胺基酸基團之SEQ ID NO: 26及SEQ ID NO: 27橋接 胺基酸序列。 尤其為， X20表示 Tyr 或 Gin ; X21 表示 Arg、Asn或 Gly ; X22表示 Arg、Asn 或 Val ; X23 表示 Ala、Thr 或 Arg ; X24表示 Lys、Gin 或 Leu ; X25 表示 Lys 或 Gly ; X26表示Leu' lie或Aia;且/或 X27表示 Thr或 lie。 列出SEQ IQ NO: 26之以下特定實例： LYLCLRGCP 、 134305.doc -23- 200916482 LQLCVNGCP 、 LQLCVGGCP 〇 列出SEQ IQ NO: 27之以下特定實例： TAVAKCKEKLPVEDLYYQACVFDLLTTG、
TANTQCHEKMPVKDIYFQSCVFDLLTTG、 TARRLCKEGLPVEDAYFHSCVFDVLISG 〇 列出連接2連接子之以下特定實例： LNQQIDFQAFHTNAEGTGARRLAAASPAPTAPETFPYE、 LSERIDDGQGQVSAILGHSLPRTSLVQAWPGYTLE、 PSQRLSRSERNRRGAITID 〇 本發明之低親和力結構域之實例為含有至少1 〇個來自根 據SEQ ID NO: 2之約位置316至約3 86之序列範圍、來自根 據SEQ ID NO: 4之約位置350至約421之序列範圍或來自根 據SEQ ID NO: 6之約位置314至369之序列範圍的鄰接胺基 酸基團之BMP結合區域或其結合片段。 上述"含有至少1 〇個胺基酸基團之結合片段"之實例為彼 等含有（例如）來自上述肽或序列範圍中之一者之10-50、 10-40、10-30、10-25、10-20 或 10-15 個、尤其 10、11、 12、13、14或15個鄰接胺基酸基團的片段。 本發明之標的尤其係關於與至少一個選自61^?-2、：6]^?-4、BMP-5、BMP-6及BMP-12之BMP結合、尤其與BMP-2 及/或BMP-4結合之BMP結合區域；及亦與新生素結合之 BMP結合區域。 本發明之另一標的係關於根據以上定義之BMP結合區域 134305.doc -24- 200916482 之抗原性多肽片段。詳言之，可用於產生免疫球蛋白分子 且調節RGM與BMP受體分子之結合（尤其部分或完全促效 或拮抗）且視情況調節與新生素受體之結合（尤其部分或完 全拮抗前述者）之抗原性多肽片段代表本發明之標的。實 例為含有至少10個（例如10-30、10-25、10-20或10-15，例 如10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 或 45個） 源自SEQ ID NO: 2或類似地源自SEq ID N〇: 4*SEQ m NO. 6之上述肽或附屬表a中所述之肽中之一者的鄰接胺基 酸基團之抗原性多肽片段。 本發明之另一標的係關於根據以上定義之BMp結合區域 之用途，或根據以上定義之多肽片段之用途，其係用於產 生針對RGM之多株抗赢清或單株抗體，其中該抗血清或該 抗體尤其調節、較佳部分或完全拮抗尺〇1^與新生素受體之 結合。 本發明之標的亦係關於用於診斷或治療用途的根 定義之針對RGM之多株抗血清或單株抗體。
本發明之另一標的係關於含有選自根據以上定義之BMP 結合區域、操作性地連接（亦即在N端或C端處）至選自單價 或多價載體多肽之第二多肽式楚-a ^ 夕狀故弟—生物活性多肽之至少一 種弟一生物活性多狀的融人Ια 办 砂σ蛋白。多價載體尤其含有至少 一種尤其來自哺乳動物（諸如 、帝如尤其源自人類免疫球蛋白） 免疫球蛋白Fc或Fc"分子，复由 其中其兩個多肽鏈中之每—者 134305.doc -25- 200916482 操作性地連接至根據以上定義之相同或不同bMP結合區 域。 本發明之另一標的係關於根據以上定義之BMP結合區域 之用途，或根據以上定義之多肽片段之用途，其係用於產 生針對RGM之多株抗血清或單株抗體，其中該抗血清或該 抗體調節RGM與新生素（亦即新生素受體）之結合。 本發明之標的亦係關於一種用於診斷或治療用途的根據 以上定義之針對RGM之多株抗血清或單株抗體。 本發明之標的亦係關於根據以上定義之多株抗血清或單 株抗體之用途，其係用於產生用以診斷或治療由新生素受 體（新生素）與RGM或RGM片段相互作用所介導之疾病或疾 病階段的藥劑，該等疾病或疾病階段尤其為選自以下者之 疾病或疾病階段： a) 顱骨、大腦及脊髓之機械損傷； b) 選自神經退化性疾病、炎症或自體免疫疾病之慢性疾 病； c) 神經几再生、軸突出芽、神經突延伸及神經元可塑性之 病症； d) 腫瘤疾病及腫瘤轉移。 本發明之標的另外係關於根據以上定義之BMp結合區域 或根據以丨定義之融合蛋白之用㊣，其係用於產生用以診 斷或治療由RGM或11(3馗片段與相關受體（新生素或BMp)之 相互作用不良或文損所介導之疾病或疾病階段的藥劑，該 等疾病或疾病階段尤其係選自以下者： 134305.doc -26- 200916482 W由過度神經突出芽及/或病理性突觸 病狀及慢性疼痛狀、'w ύ (之精神病 … 厚届狀况中的變性神經突生成過程. b)與不良鐵代謝相關之疾病； Ο與受損之骨生長相關之疾病； d) 與軟骨退化性改變相關之疾病； e) 與椎間盤及椎體受損害相關之疾病； 0與》周控異常、不党控制之細胞遷移過程相關之疾病。 本發明之另一標的係關於根據以上定義之BMP結合區域 或其結合片段之用途，或根據以上定義之融合蛋白之用 途’其係用於產生用以診斷或治療可藉由刺激或擴增腿p 信號路徑（藉由與BMP-2、請_4、BMp_5、BMW及/或 BMPH2]結合，尤其與BMp_u/或ΒΜρ·4結合）而治療之 疾病或疾㈣段 '尤其用以治療涉及受損之骨生長之疾病 或用以治療骨折的藥劑。 本發明之另-標的係關於根據以上定義之ΒΜρ結合區域 或其結合片段之用途，或根據以上定義之融合蛋白之用 途，其係用於產生用以診斷或治療自體免疫疾病之藥劑， 該等自體免疫疾病尤其為彼等選自以下者之疾病：強直性 脊椎炎、抗磷脂症候群、愛迪生氏病（Addis〇n,s disease)、 自體免疫性溶金性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫性淋 巴增生症候群（ALPS)、自體免疫性血小板減少性紫癖 (ATP)、貝赛特氏症（Beh?et，s disease)、大皰性類天疮瘡、 心肌病、乳糜瀉、疱疹樣皮炎、慢性疲勞免疫功能障礙症 候群（CFIDS)、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病 134305.doc -27- 200916482 (CIDP)、瘢痕性類天疱瘡、系統性硬化症（crest症候 群）、冷凝集病、克羅恩氏病（Cr〇hn，s disease)、皮膚血管 炎、Degos病、皮肌炎、青少年皮肌炎、盤狀紅斑狼瘡^ 原發性混合性冷球蛋白血症、纖維肌痛、古德帕斯氏症候 群（Goodpasture’s syndrome)、格雷夫斯病（Graves, disease)、格林巴利症候群（Guillain_Ban^ syndr〇me)、橋 本曱狀腺炎（Hashimoto's thyroiditis)、特發性肺纖維化、 特發性血小板減少性紫癜（ITP)、免疫球蛋白A腎病、胰島 素依賴型糖尿病、青少年型關節炎、川崎病（Kawasaki disease)、扁平苔蘚 '膜性腎小球腎炎、梅尼埃病 (MhUre's disease)、混合性結締組織病、多灶性運動神經 病、多發性硬化症 '重症肌無力、尋常型天疱瘡、惡性貧 血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺體症候群、風濕性 多肌痛、多肌炎、皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血症、原 發性膽汁性肝硬化、牛皮癬、雷諾現象（Raynaud,s phenomenon)、萊特氏症候群（Reiter，s syndr〇me)、風濕 熱、類風濕性關節炎、結節病、硬皮病、休格連氏症候群 (SjGgren’s syndrome)、僵人症候群、系統性紅斑狼瘡、高 安氏動脈炎（Takayasu’s arteritis)、顳動脈炎/巨細胞動脈 炎、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、脈管炎、白斑病及韋格納 肉芽腫病（Wegener’s granulomatosis);或 脫髮病，尤其選自斑禿、全禿、普禿、雄激素源性充 髮、休止期脫髮 '生長期脫髮及化學療法誘發性先髮。 本發明之標的亦係關於根據以上定義之BMP結合區域用 I34305.doc -28- 200916482 作用於偵測或鑑別rgm結合配位體之靶的用途。 本發明之另一標的係關於根據以上定義之BMP結合區域 之用途，或根據以上定義之片段之用途，其係用作用於主 動或被動免疫之免疫原。 本發明之另-標的係關於—種可藉由以抗原量之根據以 上疋義之Β Μ P結合區域或根據以上定義之多肽片段使哺乳 動物免疫而獲得的多株抗血清。 本發明之軚的亦係關於一種視情況為人類化形式之針對 根據以上疋義之ΒΜΡ結合區域或針對根據以上定義之多肽 片¥又之單株抗體，《單株抗RGM a抗體，該抗體與a :結合係藉由如上所定義之瞻結合區域，或藉由如上所 疋義之其多肽片段來調節；或其抗原結合片段。 本發明之標㈣關於含有至少—種選自以下者之活性組 伤的醫藥學上可接受之載劑的藥劑： a)根據以上定義之ΒΜρ結合區域、根據以上定義之多狀片 段或根據以上定義之融合蛋白； b)根據以上疋義之單株抗體或多株抗體。 根據本U特別合適者為用於鞘内、靜脈内、皮下、口 服或非經腸、經皮、古典 久 故卜 月内（intraosseal) '經鼻、體外 及吸入投藥之藥劑。 、尽發明之其他藥劑適用於治療骨折，且於液體、半固體
或口體載射含有至少一種根據以上定義之B 或根據以上定義之时蛋自。 域 本毛明之其他藥劑適用於治療鐵代謝紊亂（例如慢性病 134305.doc •29· 200916482
L^L f I ,、、月少年血色素沉著症）且於液體、半固體或固體 載d中3有至少一種根據以上定義之BMp結合區域或根據 以上定義之融合蛋白。 本毛月之另一標的係關於一種含有操作性地連接至至少 一種調控核酸序列的根據以上定義之BMP結合區域、根據 以上定義之融合蛋白或根據以上定義之多肽片段的至少一 種編碼核酸序列之表現載體。 本發明另外係關於以下項： -具有至少一種根據以上定義之載體之重組微生物。 -產生根據以上定義之單株抗體之融合瘤細胞株。培養根 據以上定義之融合瘤細胞株，且將所產生之蛋白產物自培 養物分離。 -用於產生根據以上定義之BMP結合區域或根據以上定義 之多肽片段或融合蛋白之方法，其中培養根據以上定義之 重組微生物且將所產生之蛋白產物自培養物分離。 本發明之另一標的為一種用於產生根據以上定義之單株 抗體之方法，其中培養根據以上定義之融合瘤細胞株且將 所產生之蛋白產物自培養物分離。 本發明之另一標的係關於根據以上定義之BMp結合區域 或根據以上定義之融合蛋白之用途，其係用於產生用以刺 激RGM受體（尤其新生素）或選自BMp_2、BMp_4、BMp_ 5、BMP-6及 BMP-12之 BMP之藥劑。 最後，本發明係關於根據以上定義之單株抗體用於產生 用以阻斷RGM受體（諸如尤其為新生素）之活化之藥劑的用 134305.doc •30- 200916482 途。 III·關於實施本發明之其他資訊 1·多肽 本發明之標的尤其係關於RGM家族蛋白質之BMP結合區 域及源自此等結構域之肽片段。儘管已根據本發明研究 RGM A及其結合區域以及源自其之片段，但本發明之標的 亦係關於同源蛋白質（諸如尤其為RGM家族之同源成員， 尤其為RGM B及RGM C)之相應結構域及片段。 在本發明之範疇内，特定揭示之RGM域或多肽之”功能 性等效物"或類似物為與之不同之多肽，諸如具有關於根 據 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 6之蛋白質 之BMP結合區域小於100%之同源度、但仍具有所需生物 活性的多肽。詳言之，此等功能性等效物應能夠與至少— 種BMP結合且/或於本文中所述之結合測試中展示結合， 且亦視情況於本文中所述之神經纖維生長測試中展示抑制 效應’且以統計顯著性(p <= 〇.〇5)部》或完全抑制神經纖 根像尽發明，將”功能性等效物"尤其理解為突變體，其 在上述特定序列之至少一個序列位置中含有不同於所特二 指定之胺基酸之胺基酸，但仍具有本 a '疋 4又甲所扣疋之生物 性中之一者。因此，”功能性等效物”涵蓋可經由—或夕 胺基酸添加、取代、刪除及/或反轉獲得之突變體\ =個 所述變化可發生於任何序列位置，只 ’其中 受具屋生具有根墙 發明之特徵概況之突變體即可。當突變體 栗本 文多肽之 134305.doc -31 200916482 間的反應性模式定性匹配時，亦即（例如）觀測到相同生物 效應，但其表現水平變化很大時，尤其存在功能等效性。 以下為胺基酸基團之合適取代基之實例。 初始基團 取代實例 Ala Ser Arg Lys Asn Gin ； His Asp Glu Cys Ser Gin Asn Glu Asp Gly Pro His Asn ； Gin lie Leu ； Val Leu lie ； Val Lys Arg ; Gin ; Glu Met Leu ； lie Phe Met ; Leu ; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp ; Phe Val lie ； Leu 以上含義之π功能性等效物”亦為所述多肽之前驅物，以 及該等多肽之官能衍生物及鹽。將術語”鹽”理解為意謂根 據本發明之蛋白質分子之羧基鹽以及胺基之酸加成鹽。羧 基鹽可以本身已知之方式製備，且包括無機鹽，例如鈉 鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽及鋅鹽，以及與有機鹼（例如胺 類，諸如三乙醇胺、精胺酸、離胺酸、哌啶及其類似物） 形成之鹽。酸加成鹽，例如與無機酸（諸如鹽酸或硫酸）形 成之鹽，及與有機酸（諸如乙酸及草酸）形成之鹽同樣為本 發明之標的。本發明多肽之”官能衍生物”亦可使用已知技 134305.doc -32- 200916482 術於官能胺基酸側基或其N末端或c末端處提供。該等街 生物包括（例如）羧酸基團之脂族醋、可藉由與氨或與第j 胺或第二胺反應獲得之缓酸基團之醯胺、藉由與醯基反應 製備之游離胺基之，醯基衍生物或藉由與醯基反應製備之 游離羥基之<9-醯基衍生物。 當然，，，功能性等效物”亦包括可自其他生物體獲得之多 肽’以及天然:產生之變異體。舉例而纟，同源序列範圍區 域可藉由序列比較而確定’且等效酶可根據本發明之特定 要求來確定。 ’’功能性等效物"亦為具有上述多肽序列中之一者或源自 其之功能性等效物及在功能性N端或c端鍵聯中之至少一 個額外之不同異源序列（亦即顯著相互功能損害之融合蛋 白部分）的融合蛋白。該等異源序列之非限制性實例包括 酶及免疫球蛋白。 根據本發明所涵蓋之”功能性等效物，，包括特定揭示之蛋 白質（亦即肽）之同系物。此等功能性#效物（例如）根據 Pearson 及 Lipman，Pr〇c 刪K ^ ⑽Α) μ⑻， 1988, 2444-2448所研發之演算法計算，與特定揭示之序列 中之一者具有至少4〇%或至少5〇%，或至少6〇%，例如75% 或尤其為至少85%，例如9〇%、95%或99%的同源性。根據 本發明之同源多肽之同源性百分比尤其意謂胺基酸基團相 對於本文中特定描述之胺基酸序列中 < —者的總長度之一 致性百分比。 除非另有說明，否則根據本發明，”所衍生,,之胺基酸序 134305.doc -33- 200916482 列意謂具有一致性為至少80% ’或至少9〇% ’尤其為 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97°/。、98%及 99%之 初始序列的序列。 兩個序列之間的"一致性"或”同源性”意謂在各自整個序 列長度上胺基酸基團之一致性，例如藉由使用來自 InforMax(USA)之 Vector NTI Suite 7.1 軟體，應用 Clustal 法 (Higgins D.G·及 Sharp, P.M., Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, Comput. Appl. Biosci. April 1989, 5(2): 151-1),使用以下參數設定來進 行比較而計算出的一致性。 多重比對參數： 空位開放罰分 10 空位擴展罰分 10 空位分離罰分範圍 8 空位分離罰分 斷開 比對延遲之一致性％ 40 殘基特異性空位 斷開 親水性殘基空位 斷開 過渡權重 0 成對比對參數： FAST演算法 接通 K-元組大小 1 空位罰分 3 窗口大小 134305.doc -34· 200916482 最佳對角線數 5 =能之蛋白質糖基化的情形下，等效物涵蓋去糖基化 或糖基化形式及可藉由改變糖基化模式獲得之經修飾形式 的上述類型之蛋白質。 ★本發明之肽之同系物可藉由筛檢突變體(例如經截短之 突變體）之組合庫而鑑別。舉例而言，多樣化肽變異體庫 可藉由核酸水平之組合性突變，諸如藉由合成募核繼 :物之酶促連接反應而建立。存在許多可用於由簡併寡核 普S义序列建立潛在同系物庫的方法。可於DNA合成儀中進 订簡併基因序列之化學合成且接著可將合成基團接合於合 L表見載體中。簡併基因組之使用允許能將所需組編碼成 潛在蛋自質序列之所有相可於混合物巾製備。用於合成 簡併寡核苷酸之方法為熟習此項技術者所知（例如，
Narang，S.A. (1983) Tetrahedron 39: 3 ; Itakura等人（1984)
Annu. Rev. Bi〇chem 53: 323 ;⑽咖等人 〇984)
198. 1056 ’ Ike 等人（1983) Nucleic Acids Res. 11:477)。 2·核酸 本發明之另一標的係關於諸如尤其根據SEq ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3及SEQ ID NO: 5之上述BMP結合區域及多肽 之編碼核酸序列以及編碼上述肽片段之核酸序列或源自其 之部分序列。 所有根據本發明之核酸序列（單鏈及雙鏈DNA及RNA序 列’例如cDNA及mRNA)本身經由（例如）藉由雙螺旋之個 別重登、互補核酸結構單位之片段縮合，由核苷酸結構單 134305.doc -35- 200916482
位化學合成而已知。寡核苦酸之化學合成可以已知方式， 例如根據胺基填酸醋法（Voet，Voet，第2版，Wiley Press New York, 896-897)進行。使用DNA聚合酶之Klenow片段 及連接反應以及通用選殖法來添加合成寡核苷酸及填充空 位係描述於 Sambrook 等人（1989), Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 中o 除非另有說明，否則根據本發明，”所衍生”之核酸序列 意謂初始序列具有至少80%或至少90%，尤其為91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及99%之一致性 之序列。 兩個核酸之間的”一致性”意謂整個各別核酸長度上核苦 酸之一致性，尤其為藉由使用來自InforMax(USA)之Vector NTI Suite 7.1軟體，應用Clustal法進行比較而計算出之一 致性（參見上文）。 本發明之標的亦係關於編碼以上肽中之一者及其功能性 等效物且可（例如）使用合成核苷酸類似物獲得之核酸序 列。 本發明係關於編碼本發明之肽或其生物活性區段之經分 離核酸分子，以及可（例如）用作用以鑑別或擴增本發明之 編碼核酸之雜交樣本或引子的核酸片段。 本發明之核酸分子亦可含有編碼基因區之3'及/或夕端之 未轉譯序列。 ”經分離”之核酸分子係自存在於核酸天然來源中之其他 134305.doc -36- 200916482 核酸分子分離，且若其係使用重組技術產生，則亦可美本 上不含其他細胞材料或培養基，或若其係化學合成，則可 不含化學前驅物或其他化學物質。
本發明之核酸分子可使用分子生物學之標準技術及根據 本發明提供之序列資訊來分離。舉例而言，可藉由使用特 定揭示之全序列中之一者或其片段作為雜交樣本且使用標 準雜父技術（诸如（例如）描述於Sambrook，J·，Fritsch EF 〆' 及 Maniatis，T.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 第 2版 ’ Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY, 1989 中之彼等技 術）將cDNA自合適cDNA庫分離。此外，包括本發明之序 列中之一者或其區段的核酸分子可藉由聚合酶鏈反應，使 用基於此序列產生之寡核苷酸引子來分離。以此方式擴增 之核酸可於合適載體中選殖且以DN A序列分析來表徵。本 發明之寡核苷酸亦可使用標準合成法，例如使用DNA合成 儀來產生。 本發明亦涵蓋與特定描述之核苷酸序列互補的互補核酸 分子或其區段。 本發明之核苷酸序列允許產生可用於鑑別及/或選殖其 他細胞類型及生物體中之同源序列的樣本及引子。該等樣 本或引子通常包括在嚴格條件下雜交本發明之核酸序列正 義鍵或相應反義鏈之至少約12個，較佳至少約25個，例如 約40、50或75個連續核苷酸的核苷酸序列範圍。 本發明之其他核酸序列係源自本發明之RGM域及肽之編 134305.doc •37· 200916482 碼序列且因添加、跑左 ί入或刪除個別或多個核苷酸而 不同，但繼續編碼具有所需特徵概況之肽。 根據本發明亦涵蓋包括所謂沉默突變或與特別指定之序 列相比對應於特定起源生物體或宿主生物體之密碼子使用 而、a修飾之核酸序列’以及天然產生之變異體（例如剪接 變異體或等位基因變異體)。本發明之標的亦係關於可藉 由保守核«取代（亦即以相同電荷、大小、極性及/或溶 解性之胺基酸置換所論及之胺基酸）獲得之序列。 一本發明之標的亦係關於就序列多態現象而言源自特定揭 7、乜馱之刀子。此等遺傳多態現象可由於天然變化而存 在於-定群體之個财。此等天然變化通常導致基因之核 苷酸序列的1至5%之變化。 本發明亦涵蓋與上述編碼彳列雜交或與其互補之核酸序 列。此等聚核芽酸可藉由對染色體庫或劇八庫取樣而定 位且可視情況使用合適引子，藉由pcR來增殖，且接著 使用合適樣本自其分離。另一種可能性為使用本發明之聚 核普酸或載體來轉化合適微生物，使微生物增殖，因而使 聚核普酸增殖且隨後將其分離。亦可化學合成本發明之聚 核苷酸。 能夠"雜交"聚核苷酸之特性意謂聚核苷酸或寡核苷酸在 厭袼條件下與基本上互補之序列結合，同時在此等條件下 在非互補搭配物之間不發生非特異性結合的能力。為此目 的，序列應為70-100。/。，尤其為9〇_1〇〇%，例如、 96〇/〇、97%、98〇/〇或99%互補。將彼此特異性結合之互補序 134305.doc -38- 200916482 列的特性（例如）用於北方或南方墨點技術或用於PCR或RT-PCR中之引子結合。通常將於30個鹼基對之長度處開始之 寡核苷酸用於此目的。（例如）在北方墨點技術中"在嚴格條 件下"意謂諸如對於溶離非特異性雜交之c D n a樣本或寡核 苷酸而言，在50-7(TC，較佳60_65。(：之溫度下，使用洗 液，例如具有0.1% SDS2〇lxSSC 緩衝劑（2〇xSsc: 3 Μ NaC卜0.3 Μ檸檬酸鈉，ρΗ值為7 〇)。如先前所述，僅高 度互補之核酸保持彼此結合。嚴格條件之設定為熟習此項 技術者所知且係描述於（例如）Ausubei等人，current Protocols in Molecular Biology, john wiley & s〇nSj N γ (1989)，6.3.1-6.3.6 中。 本發明之另一態樣係關於”反義”核酸。反義核酸包括與 編碼正義π核酸互補之核苷酸序列。反義核酸可與整個編 碼鏈互補，或僅與其片段互補。在另一實施例中，反義核 酸分子與核苷酸序列之編碼鏈之非編碼區反義。術語"非 編碼區"係指稱為5’及3’未轉譯區之序列區段。 反義券核苦酸可具有（例如）約5、1 〇 ' 15、20、25、 30、35、40、45或50個核苷酸之長度。本發明之反義核酸 可使用於此項技術領域中已知之方法藉由化學合成及酶促 連接反應而建構。反義核酸可使用天然產生之核苷酸或經 不同修飾之核苷酸而化學合成，該等核苷酸具有使得其增 加分子之生物穩定性或增加反義與正義核酸之間產生之雙 鏈體之物理穩定性的組態。（例如）可使用硫代磷酸酯衍生 物及經。丫。定取代之核《。可用以|生反義核酸之經修飾 134305.doc •39- 200916482 核苦酸的實例包括5 -氟尿响咬、5 _溴尿嘴咬、5 -氣尿脅 。定、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、各乙醯胞嘧啶、％ (叛基羥基甲基）尿嘧啶、5_羧基甲基胺基甲基_2-硫代尿 苦、5 -竣基曱基胺基曱基尿嘯咬、二氫尿^密。定、半乳 糖基Q核苷、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1 _甲基鳥嘌呤、j _ 曱基肌苷、2,2-二曱基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-曱基鳥 嗓呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-曱基 鳥嗓呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-曱氧基胺基甲基_2_硫 尿嗜。定、β-D-甘露糖基Q核苷、5，-甲氧基羧基甲基尿嘴 咬、5_甲氧基尿嘧啶、2-曱基硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿 嘴咬-5-氧基乙酸（v)、〇SyW(WybUt〇X〇Sine)、假尿嘧咬、q 核普、2-硫胞η密咬、5-甲基-2-硫尿鳴η定、2-硫尿鳴。定、‘ 硫尿。密啶、5-甲基尿嘧咬、尿嘧咬_5-氧基乙酸曱基酯、尿 °密°定-5-氧基乙酸（ν)、5-曱基-2-硫尿嘧啶、3-(3-胺基_3-#- 2-竣基丙基）尿嘧啶、（acp3)w及2,6-二胺基嘌呤。反義核酸 亦可藉由使用已以反義方向次選殖核酸之表現載體而以生 物學方法產生。 3.表現構築體及載髏 本發明之另一標的係關於含有在調控核酸序列之遺傳控 制下編碼本發明之RGM肽或功能性等效物或免疫球蛋白之 核酸序列之表現構築體；以及包含此等表現構築體中之至 少一者之載體。 本發明之該等構築體較佳包括特定編碼序列5，上游之啟 動子，及終止子序列及視情況3,下游之其他常見調控元 134305.doc •40- 200916482 件，且詳言之，其各自係操作性地連接至編碼序列。"操 作性地連接，，意謂使得調控元件各自能夠恰當地實現其於 編碼序列表現中之功能之啟動子、編碼序列、終止子及視 情況其他調控元件的順序布置。可操作性地連接之序列之 實例為導㈣列以及強化子、聚腺苷酸化信號及其類似 物。其他調控元件包括可選擇之標誌、擴增信號、複製起 點及其類似物。合適調控序列係描述於（例如）G〇eddel, Gene Expression Technology： Methods in Enzymology 185,
Academic Press, San Diego, CA (1990)中。 除人工調控序列以外，可在實際結構基因之前存在天然 調控序列。若需要則可藉由遺傳修飾來消除此天然調控， 且基因表現增加或減低。然而，基因構築體亦可具有較簡 單的結構；亦即不於結構基因前插入額外調控信號，且不 移除天然啟動子以及其調控。而是使天然調控序列以使得 不再發生調控之方式突變，且使基因表現增加或減低。核 酸序列可以一或多個複本形式含於基因構築體中。 以下為可使用之啟動子實例：cos、tac、trp、tet、 trptet、lpp、iac、lpplac、lacIq、T7、T5、T3、邑心、訌c、 ara、SP6、λΡΙΙ或λΡ[啟動子，其有利地用於革蘭氏陰性菌 中；除amy及SP〇2革蘭氏陽性啟動子以外之ADC1、 Mrct、AC、P-60、CYC1或GAPDH酵母啟動子；植物啟動 子 CaMV/35S、SSU ' OCS、lib4、usp、STLS1、B33 或非 植物啟動子或泛素或菜豆蛋白啟動子。使用誘導型啟動 子’例如光誘導型及尤其溫度誘導型啟動子，諸如匕匕啟 134305.doc 41 200916482 利丁付别旱父佳。大體上，可使 j便用所有天然啟動子以及其調 控序列。亦可有利地使用合成啟動子。 所述調控序列意欲允許核酸序列之把表現及蛋白質表 現m生物體μ ’此可意謂（例如）基因被表現或 僅於誘導後被表現或基因即刻被表現及/或過度表現。 調控序列或因子可較佳地正性影響表現，從而增加或減 低表現。因此，可藉由使用強轉錄信號作為啟動子及/或 強化子"在轉錄水平上有利地進行調控元件之擴增。然 而，亦可能（例如）藉由增強mRNAi穩定性來擴增轉譯。 藉由將合適啟動子與合適編碼核苷酸序列及終止子或聚 腺苷酸化佗號融合來產生表現卡匣。為此目的，常見重組 及選殖技術係如（例如）以下文獻所述使用：T Maniatis、 E.F. Fritsch 及 J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor，NY (1989)及 T.J. SUhavy，M.L. Berman及 L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring
Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY (1984)及 Ausubel, F.M.等人，Current Protocols in Molecular
Biology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience (1987)。 為於合適宿主生物體中表現，有利地將重組核酸構築體 (亦即基因構築體）插入宿主特異性載體中，其允許基因於 宿主中之最佳表現。載體為熟習此項技術者所熟知且係 (例如）描述於 Cloning Vectors(Pouwels，P.H.等人編， 134305.doc • 42- 200916482
Elsevier, Amsterdam-New York-〇xford，1985)中。除質體以 外，亦將載體理解為意謂熟習此項技術者已知之所有其他 載體，例如嗟菌體；諸如SV40、CMV、桿狀病毒及腺病 毒之病毒；轉座子；IS元件；噬菌粒；黏質體及直鏈或環 狀DNA。此等載體可於宿主生物體中自主複製或用染色體 複製。 以下為合適表現載體之實例： 常見融合表現載體，諸如pGEX(Pharmacia Biotech Inc;
Smith, D.B.及 Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40)、 pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)及 pRlT 5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中將麩胱甘肽8_轉移酶 (GST)、麥芽糖E結合蛋白或蛋白質a與重組革巴蛋白融合。 非融合蛋白表現載體，諸如pTrc(Amann等人（1988) Gene 69: 301-315)及 pET lld(Studier 等人，Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185,
Academic Press, San Diego, CA (1990), 60-89)。 於醸酒酵母（51. cereWhae)中表現之酵母表現載體，諸如 pYepSecl(Baldari 等人（1987) Embo J· 6: 229-234)、 pMFa(Kurjan 及 Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943)、 pJRY88(Schultz 等人（1987) Gene 54: 113-123)及 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。適用於其他真菌 (諸如絲狀真菌）之載體及建構該等載體之方法包括彼等於 以下文獻中詳述之載體及方法：van den Hondel， C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991)nGene transfer systems and 134305.doc -43- 200916482 vector development for filamentous fungi," Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy 等人編 ’ 1-28, Cambridge University Press: Cambridge ° 可用於在經培養之昆蟲細胞（例如Sf9細胞）中表現蛋白質 之桿狀病毒載體包括pAc系列（Smith等人（1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165)及 pVL 系列（Lucklow及 Summers (1989) Virology 170: 31-39)。 植物表現載體，諸如彼等於以下文獻中詳述之載體： Becker, D.，Kemper, E.，Schell，J.及 Masterson，R. (1992)， "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border," Plant Mol. Biol. 20: 1 195-1197 及 Bevan, M.W. (1984) ’ "Binary agrobacterium vectors for plant transformation,” Nucl. Acids Res. 12: 871 1-8721。 哺乳動物表現載體，諸如pCDM8(Seed，B. (1987)， Nature 329: 840)及 pMT2PC(Kaufman 等人（1987)，EMBO J. 6: 187-195)。 原核及真核細胞之其他合適表現系統係描述於 Sambrook，J.，Fritsch，E.F.及 Maniatis，T.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY，1989之第 16及 17章中。 4.重組宿主生物體 藉由使用本發明之載體，可產生（例如）使用至少一種本 發明之載體轉化且可用於產生本發明之結構域或多肽的重 134305.doc -44 - 200916482 組生物體。有利地將上述本發明之重組構築體引入合適宿 主系統中且使其表現。較佳使用為熟習此項技術者已知之 常見選殖及轉染方法，例如共沈澱、原生質體融合、電穿 孔、反轉錄病毒轉染及其類似者，以便使所述核酸於特定 表現系統中表現。合適系統係描述於（例如）Current
Protocols in Molecular Biology，F, Ausubel 等人編 Wiley
Interscience，New York i997 或 Sambr〇〇k等人，M〇lecular
Cloning: A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor，NY, 1989。 原則上，所有生物體均適用作宿主生物體，該等生物體 允許表現本發明之核酸、其等位基因變異體、功能性等效 物或其衍生物。將"宿主生物體，，理解為意謂（例如）細菌、 真菌 '酵母或植物或動物細胞。較佳生物體為細菌，諸如 埃希氏菌屬，例如大腸桿菌；鏈黴菌屬；桿菌屬或假單胞 菌屬，真核微生物，諸如釀酒酵母或麯黴屬 (Aspergillus);及來自動物或植物之高等真核細胞，例如 Sf9、CHO或 HEK293 細胞。 可藉由使用標誌基因來選擇成功轉化之生物體，該等標 誌基因同樣含於載體或表現卡匣中。該等標誌基因之實例 為抗生素抗性基因及可催化發色團反應且引起經轉化細胞 染色之酶的基因。接著可使用自動細胞揀選來選擇此等標 誌基因。可使用適當含抗生素之培養基來選擇由载體成功 轉化且攜有相應抗生素抗性基因（例如G4丨8或勻黴素）之微 134305.doc -45- 200916482 生物。存在於細胞表面之標誌蛋白可用於藉助於親和力層 析進行之選擇。 若需要，亦可使基因產物於轉殖基因生物體中表現該 等轉殖基因生物體諸如轉殖基因動物，尤其為小鼠及綿羊 或轉殖基因植物。 本發明之另一標的係關於用於重組產生本發明之rgm域 或多肽或其功能性生物活性片段之方法，其中培養產生肽 之重組宿主生物體且視情況誘導多肽之表現，且將此等多 肽一培養物为離。若需要時，亦可以此方式以商業規模產 生肽》 可根據已知方法培養重組宿主且使之醱酵。可（例如）於 TB或LB培養基中且在2〇至4〇。(：之溫度下及6至9之pH值下 使細菌增殖。合適培養條件係於（例如）以下文獻中詳述： T. Maniatis，E.F. Fritsch及 J. Sambrook，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor，NY (1989) ° 若多肽未分泌至培養基中，則接著浸潰細胞且使用已知 蛋白質分離方法自溶胞物中收集產物。視情況可使用高頻 率超音波、高壓（例如使用弗氏壓碎器（French pressure cel丨)），藉由滲透溶解（osmolysis)，經由清潔劑、水解酶或 有機溶劑之作用，藉由均化作用或藉由若干所列方法之組 合來浸潰細胞。 可使用已知層析法，例如分子篩層析（凝膠過濾）（諸如Q 瓊脂糖層析）、離子交換層析及疏水性層析且藉由使用其 134305.doc -46- 200916482 他常見方法’諸如超濾、結晶、鹽析、滲析及天然凝膠電 泳來純化肽。合適方法係描述於（例如）C〇0per，F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [Biochemical Procedural Methods]，Verlag Walter de Gruyter，Berlin, New York或
Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York，Heidelberg，Berlin 中。 對於分離重組肽而言，特別合適的為使用以給定核苷酸 序列擴展cDNA且因此編碼經修飾多肽或融合蛋白之載體 系統或寡核苷酸，其係（例如）用於較簡單的純化。用作錨 之所謂”標籤”為合適修飾之實例，例如稱作六聚組胺酸錨 之修飾；或可鑑別為抗體之抗原之抗原決定基（描述於例 如 Harlow，E.及 Lane，D，1988, AnUb〇dies: a Lab〇r_y
Manual，Cold Spring Harbor Press (New γ〇Γ]〇中）。此等錨 可用以將肽附接於諸如聚合物基質之固定基質上，該基質 可例如填充至層析柱中或用於微量滴定盤或一些其他基板 上。 同時’此等錯可用於鑑別肽。對於鑑別肽而言，可單獨 使用或與錨組合使用常見標誌（諸如螢光染料）、在與受質 反應後形成可偵測反應產物之酶標記或放射性標記’，、以用 於肽之衍生化。 5·免疫球蛋白 5.1定義 本發明之標的係關於與本發明之RGM蛋 /等效物特異性結合之單 貝飞/、何生物 之早株或多株抗體，亦即對本發明之 134305.doc -47- 200916482 RGM蛋自質或其衍生物/等效物具有肖異性之抗體。本發 明之標的另外係關於此等抗體之部分，尤其其抗原結合部 亦P與本發明之RGM蛋白質或其衍生物/等效物結合 之抗體片段。 本發明之抗體較佳係以使得其對與本發明之蛋白質 或〃衍生物/等效物之特異性結合具有給定結合動力學性 質(例如高親和力、低解離、低解離速度(k〇ff)、強中和活 性）之方式選擇。 因此可提供對本發明之RGM蛋白質或其衍生物/等效 物具有Kd=1〇-6_i〇·!2 M範圍内之親和力的抗體。 根據另一態樣，可對本發明之抗體進行選擇使得其以 〇，1 s或更低之k〇ff速度常數與RGM蛋白質或其衍生物/等 效物結合。 抗體較佳為經分離抗體。根據另一態樣，抗體為中和抗 體。本發明之抗體尤纟包括IS及重組抗冑。本發明之抗 體可含有完全源自單一物種之胺基酸序列；因此，例如人 類抗體可為大鼠抗體或小I抗體。根據其他實施例，抗體 可為瓜5抗體或CDR移植抗體或其他形式之人類化抗體。 術語’，抗體”係指由四條多肽鏈（亦即兩條重（H)鏈及兩條 輕⑹鏈）形成之免疫球蛋白分子。該等鏈—般係由雙硫鍵 彼此連接。各重鏈係由重鏈可變區（本文中縮寫為或 VH)及重鏈恆定區組成。重鏈恆定區係由三個結構域 CHI、CH2及CH3形成。各輕鏈係由輕鏈可變區（本文中縮 寫為LCVR或VL)A輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區係由 134305.doc -48- 200916482 域形成。VH及VL區可進一步分為稱為互補判定區（CDR) 之高變區且散布有稱為框架（FR)區之保守區。各VH及VL 區係由三個CDR及四個FR形成，其係以以下順序自N端至 C 端定位：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。 術語抗體之’’抗原結合部分"（或簡稱為"抗體部分”）係指 對本發明之RGM蛋白質或其衍生物/等效物具有特異性之 抗體之一或多個片段，其中該或該等片段仍能夠特異性結 合RGM蛋白質或其衍生物/等效物。已展示可由完全抗體 之片段確定抗體之抗原結合功能。在術語抗體之”抗原結 合部分”的意義上結合片段之實例包括：（i)Fab片段，亦即 由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；（ii)F(ab')2片 段，亦即含有於鉸鏈區經由雙硫橋彼此連接之兩個Fab片 段的二價片段；（iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；（iv)由 抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；（v)由VH域或VH、 CHI、CH2、DH3 或 VH、CH2、CH3 組成之 dAb 片段（Ward 等人（1989) Nature 341: 544-546);及（vi)經分離之互補判 定區（CDR)。儘管Fv片段之兩個結構域（亦即VL及VH)係由 不同基因編碼，但可根據重組方法使用合成連接子將兩個 結構域接合在一起，藉助於重組方法其可產生VL及VH區 會合形成單價分子之單一蛋白質鏈（稱為單鏈Fv(ScFv);參 見例如 Bird 等人（1988) Science 242: 423-426 ;及 Huston 等 人（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)。該等 單鏈抗體亦涵蓋於術語抗體之”抗原結合部分”内。同樣包 134305.doc • 49- 200916482 括其他瓜式之單鏈抗體，諸如”雙功能抗體,ι。雙功能抗體 為VH及乳域表現於單—多肽鏈上之二價雙特異性抗體， 但使用極短而使得兩個結構域無法於同—鏈上會合之連接 子，藉此迫使結構域與不同鏈之互補結構域配對且形成兩 個抗原、，.σ σ位點（參見例如H〇lliger，ρ·等人（I"3) Fr〇c.
Natl· Acad· Sci. USA 90: 6444-6448 ; p〇ljak, R.J.等人 (1994) Structure 2: 1121-1123)。 此外h體或其抗原結合部分可為較大免疫黏附分子之 部分’該免疫黏附分子係藉由使抗體或抗體部分與一或多 種額外蛋白質或肽共價或非共價締合而形成。該等免疫黏 附分子包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區產生四聚scFy分子 (Kipdyanov，S.M.等人（1995) ”Human antib〇dies and hybridomas”6: 93_101)及使用半胱胺酸基團、標誌肽及C端 聚組胺酸標籤產生二價及生物素化scFv分子（Kipriyan〇v， S.Μ.荨人（1994) Mol. Immunol. 31: 1047-1058)。 可藉由使用習知技術（諸如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶 消化）而由完整抗體產生抗體部分（諸如？吐及F(ab，）2片 &)。亦可藉由使用標準化重組DNA技術而獲得抗體、抗 體部分及免疫黏附分子。”對本發明之RGM蛋白質或其衍 生物/等效物具有特異性之經分離抗體”涵蓋基本上不含具 有不同抗原特異性之其他抗體的對本發明之RGM蛋白質或 其衍生物/等效物具有特異性之抗體。 術s吾”中和抗體”描述與給定抗原結合導致抑制抗原之生 物活性之抗體。抗原生物活性之此抑制可藉由使用合適活 134305.doc -50- 200916482 體外或活體内檢定量測抗原生物活性之一或多種指示劑而 評定。 術語”單株抗體”描述源自融合瘤之抗體（例如由使用融合 瘤技術，諸如根據Kahler及Milstein之標準化融合瘤方法 產生之融合瘤分泌的抗體）。因此將對本發明之rgm蛋白 質或其衍生物/等效物具有特異性且源自融合瘤之抗體稱 為單株抗體。 術語”重組抗體"描述使用重組方式表現、產生或分離之 抗體’諸如使用轉染至宿主細胞内之重組表現載體表現之 抗體；自重組組合性抗體庫分離之抗體；自使用人類免疫 球蛋白基因轉殖基因化之動物（例如小鼠）分離之抗體（參見 例如 Taylor，L.D.等人（1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287- 6295);或以將給定免疫球蛋白基因序列（諸如人類免疫球 蛋白基因序列）與其他DNA序列組合之一些其他方式表 現、產生或分離之抗體。重組抗體包括（例如）嵌合、CDR 移植及人類化抗體。 術語”人類抗體”描述可變區及恆定區對應於或源自人類 生殖系免疫球蛋白序列之抗體，諸如（例如）Kabat等人描述 之抗體（參見 Kabat 等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest ’ 第五版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第 91-3242號）。然 而’本發明人類抗體可（例如）在CDR及詳言之CDR3中含有 並不藉由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼（例如藉由活體 外隨機或位點特異性突變或藉由活體内體細胞突變引入之 134305.doc -51 - 200916482 犬變）之胺基酸基團。本發明重組人類抗體具有可變區且 亦可含有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之恆定區（參見 Kabat， E.A.等人（1991) Sequences of Proteins of
Immunological interest，第五版，u s Department of
Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。然而’根據某些實施例，使該等重組人類抗體經 受活體外突變（或若使用用人類Ig序列轉殖基因化之動物， 則經受體細胞活體内突變），使得重組抗體VH及VL區之胺 基酸序列為並非天然存在於活體内人類抗體生殖系譜中之 序列’即使其關於或源自於人類生殖系之VH及VL序列。 根據某些實施例，該等重組抗體為選擇性突變或回復突變 或兩者之結果。 術語”回復突變”係指以同源生殖系抗體序列之相應生殖 系殘基取代人類抗體之體細胞突變胺基酸中之一些或所有 的方法。將本發明人類抗體之重鏈及輕鏈序列分別與 VBASE資料庫中之生殖系序列比較來鑑別具有最大同源性 之序列。本發明人類抗體之差異藉由在編碼該等不同胺基 酸之指定核苦酸位置處突變而歸因於生殖系序列。應研究 以此方式鐘別為回復突變之候選之各胺基酸對抗原結合的 直接或間接重要性’且在突變後損害所需人類抗體特徵之 胺基酸不應包括於最終人類抗體中。為保持回復突變之胺 基酸數儘可能小，儘管不同於下一生殖系序列但與第二生 殖系相應胺基酸序列相同之胺基酸位置可保持不變，其限 制條件為第二生殖系序列與本發明人類抗體序列至少關於 134305.doc -52- 200916482 所論及之胺基酸兩側的1 〇個且較佳關於12個胺基酸相同或 共線。可在抗體最佳化之任何給定階段中進行回復突變。 術語”嵌合抗體’’涵蓋分子之個別部分源自不同物種之抗 體。因此，嵌合抗體為（但不限於）例如含有來自一個物種 之重鏈及輕鏈可變區之序列’然而其中來自VH及/或VL之 一或多個CDR區序列經另一物種之CDR序列取代的抗體。 該等抗體可含有來自小鼠之重鏈及輕鏈之可變區，其中一 或多個小鼠CDR(例如CDR3)經人類CDR序列取代。 術語"人類化抗體"描述含有來自非人類物種（例如小鼠、 大鼠、兔、雞、路聪、山羊）之重鏈及輕鏈可變區序列， 然而其中VH及/或VL序列中至少一部分經修飾為"人類樣" (亦即更接近人類生殖系中可變序列）的抗體。一種類型之 人類化抗體為CDR移植抗體，其中相應非人類CDR序列係 藉由將人類CDR序列插入非人類VH及VL序列中而經取 代。 量測抗體結合動力學之一種方法係基於所謂表面電漿共 振。術語π表面電漿共振，，係指使得藉由使用Biacore system，例如（Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)，藉助於生物感應基質偵測蛋白質濃 度之變化而分析生物特異性相互作用的光學現象。關於其 他資訊’參見J6nss〇n，U.等人（1993) Ann. Bioi. Clin. 51: 19-26，J6nsson，U.等人（1991)31〇【6〇111^1^ 11:620- 627 ; Johnsson，B.等人（1995) j M〇l. Recognit. 8: 125. 131，及 Johnnson，B.等人（1991) Anal. Biochem. 198: 268- 134305.doc -53- 200916482 277 ° 術語”Keff”描述將抗體與抗體/抗原複合物解離之解離速 度常數。 術語”Kd"描述給定抗體_抗原相互作用之解離常數。 本發明抗體之結合親和力可藉由使用標準化活體外免疫 檢疋（諸如£1^18八或則&〇〇代分析）來評估。 5.2免疫球蛋白之產生 5_2.1多株抗體之產生 本發明係關於針對本發明RGM域及多肽之多株抗體及產 生其之方法。 為此目的’使具有至少一種本發明之RGM蛋白質或其衍 生物/等效物之宿主免疫且自宿主回收回應免疫之含抗體 血清。 若所使用之RGM多肽並非免疫原性或僅為弱免疫原性， 則可藉由將其與載體偶合，較佳與諸如匙孔螺血氰蛋白 (KLH)、血藍蛋白（lph)、牛血清白蛋白（BSA)或印白蛋白 (OVA)之載體蛋白偶合而增加其免疫原性。熟習此項技術 者可使用一般已知之許多偶合選擇。與戊二醛之反應（例 如）可（例如）藉由於水或水溶劑中以合適肽或肽混合物培育 RGM蛋白質而實現。此反應可在周圍溫度下（亦即通常在 室溫下）便利地進行。然而，進行冷卻或略微加熱可為適 用的。反應一般在數小時（例如2小時之反應時段）内提供在 典型範圍内之所需結果。戊二醛濃度一般在卯以至％範圍 内’有利地10叩111至1%，較佳100 ppm至0.5%之範圍内。 134305.doc -54- 200916482 反應參數最佳化在熟習此項技術者之技術範圍内。 示抗原以外，組合物一般含有其他助劑物質，詳言之常 於免，之佐劑（例如弗氏佐劑（F_d、咖讀〇)。詳言 _I&I弗氏佐劑用於第—免疫法，而所有其他免疫法 所、不70王弗氏佐劑進行。免疫混合物係藉由向助劑物 貝中添加較佳上述組份 伤/吧合物形式之抗原（免疫原）而產 生。通常，抗原為乳化的。 土齧齒動物或兔特別適用作宿主。將免疫混合物注射（較 =皮下注射）至此等或其他合適宿主中。可使用免疫檢 —"競爭性使用針對宿主1gG及經標記rgm蛋白質之 料抗金清來敎抗體力價。從而在免疫末確定給定宿主 :否適σ於抗體回收。若（例如）進行四次免疫，則可在第 三次免疫後測定抗體力價，且接著可自具有充分抗體力價 之動物回收抗體。 為回收所產生之抗體’較佳在數週或數月中自宿主抽取 血液。接著對宿主抽也。可以本身已知之方式自因此回收 之血液收集含有所需抗體之血清。若需要，可以熟習此項 技術者已知之方式進一步純化因此獲得之全血清來富集抗 體部分及詳言之含於其中之識別RGM蛋白質之抗體。 根據此方法之一特定實施例，自血清中選擇至少—種特 異性識別用作免疫原之RGM蛋白質或其衍生物/等效物之 抗體二在此上下文t，”特異性”意謂抗體對免疫原具有比 對誶言之免疫原相關之其他蛋白質高的結合親和力。 5·2.2單株抗體之產生 134305.doc •55- 200916482 根據本發明可使用之免疫球蛋白可藉由本身已知之方法 獲知·。因此’融合瘤技術使得產生所欲抗原之單特異性抗 體。此外’藉由諸如抗體庫之活體外篩檢等重組抗體技術 同樣可產生該等特異性抗體。 因此’例如可免疫一具有所欲抗原之動物。此活體内方 法亦可包括確立一系列來自動物淋巴細胞或脾細胞之融合 瘤且選擇分泌特異性結合抗原之唯一抗體之融合瘤。待免 疫之動物可為，例如小鼠、大鼠、兔、雞、路駝或綿羊， 或可為上述動物之轉殖基因形式，例如在抗原刺激後產生 人類抗體之具有人類免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠。可 免疫之其他類型動物包括使用人類外周單核血細胞重構 (敢合hu-PBMC-SCID小鼠）或使用淋巴細胞或其前驅體重 構之具有嚴重聯合免疫缺陷（SCID)之小鼠；以及已投與致 死量之全身輻射，接著使用來自嚴重聯合免疫缺陷（SCID) 小鼠之骨髓細胞且接著接收功能性人類淋巴細胞移植來保 濩輻射之小鼠（所謂Trimera系統）。待免疫之另一類型動物 為在基因組中已（例如小鼠）藉由同源重組消除（"剔除，，）編 碼所欲抗原之内源性基因，使得以抗原免疫後此動物將抗 原鑑別為外來物。對於熟習此項技術者而言可清楚得知， 根據本方法所產生之多株或單株抗體之特徵化及選擇可藉 由已知篩檢法’包括（但不限於）ELISA技術而實施。 根據另一實施例，使用抗原來篩檢重組抗體庫。重組抗 體庫可表現於例如噬菌體表面，酵母細胞表面或細菌細胞 表面上重組抗體庫可為例如scFv庫或Fab庫。根據另一 134305.doc -56 - 200916482 實施例，抗體庫可表現為rNA蛋白融合。 產生本發明抗體之另一方法包含活體内與活體外方法之 組合。舉例而言，抗原可藉由以抗原免疫活體動物且接著 使用活體外抗原篩檢自動物淋巴細胞產生（例如使用重鏈 及/或輕鏈）之重組抗體庫或單結構域抗體庫而作用於抗體 譜。根據另一方法，抗原可藉由以抗原免疫活體動物活體 且接著使由動物淋巴細胞產生之重組抗體庫或單結構域抗 體庫經受親和力成熟而作用於抗體譜。根據另一方法，抗 原可藉由抗原免疫活體動物且接著選擇分泌所欲抗體之個 別產生抗體之細胞，且自此等所選細胞收集重鏈及輕鏈可 變區之cDNA(例如使用PCR)，且使重鏈及輕鏈可變區活體 外表現於哺乳動物宿主細胞中（稱作所選淋巴細胞抗體法 (SLAM))，從而使得進一步選擇且操縱所選之抗體基因序 列而作用於抗體譜。此外，可藉由表現哺乳動物細胞中之 重鏈及輕鏈之&體基因且選擇分泌具有所需結合親和力之 抗體之哺乳動物細胞來選擇單株抗體。 根據本發明，提供RGM結合區域或多肽形式之所定義抗 原用於篩檢及反篩檢。因此，根據本發明可 所定義根據本發明所f特徵概況〇株抗體及單株抗體。 可使用本發明方法產生各種類型之抗體。其基本上包括 人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體及CDR移植抗體以及其 抗原結合部分。 在活體内方 產生本發明抗體之方法係特別描述如下 法、活體外方法或其組合之間進行區分。 134305.doc -57- 200916482 活體内方法： 以產生活體内產生之抗體之細胞起始，可使用標準化技 術產生單株抗體，該等標準化技術諸如K6hler及Milstein 最初描述之融合瘤技術（1975, Nature 256: 495-497)(亦參 見 Brown等人（1981) J. Immunol 127: 539-46; Brown等人 (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83 ; Yeh等人（1976) PNAS 76: 2927-31 ;及 Yeh 等人（1982) Int· J. Cancer 29: 269-75)。產生單株抗體融合瘤之技術為眾所熟知（一般參見 R.H. Kenneth, Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980) ； E.A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54: 387-402 ; M.L. Gefter等人（1977) Somatic Cell Genet·, 3: 23 1-3 6)。為此目的，將不死化細胞株（通常為骨髓瘤）與 已經本發明之RGM蛋白質或其衍生物/等效物免疫之哺乳 動物淋巴細胞（通常為脾細胞、淋巴結細胞或外周血淋巴 細胞）融合’且_檢所得融合瘤細胞之培養物上清液以鑑 別產生對本發明之RGM蛋白質或對其衍生物/等效物具有 特異性之單株抗體的融合瘤。為此目的，可將許多已知方 案中之任何給定方案用於淋巴細胞與永生化細胞株之融合 (亦參見 G. Galfre 等人（1977) Nature 266: 550-52;上文引 用之 Gefter等人 Somatic Cell Genet·;上文引用之Lerner， Yale J. Biol. Med.，及上文引用之 Kenneth, Monoclonal Antibodies)。此外，熟習此項技術者意識到同樣可使用之 該等方法之許多變型。不死化細胞株（例如骨髓瘤細胞株） 134305.doc -58- 200916482 通常源自與淋巴細胞相同之哺乳動物物種。舉例而言， 可藉由將來自以本發明之免疫原性製劑免疫之小鼠的淋巴 細胞與永生化小鼠細胞株融合來確立鼠類融合瘤。較佳不 死化細胞株為對含有次黃嘌呤、胺基喋呤及胸苷之培養基 (HAT培養基）敏感之小鼠骨髓瘤細胞株。許多骨髓瘤細胞 株中任何給定骨髓瘤細胞株可以標準方式用作融合搭配 物，例如P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63-Ag8.653 或Sp2/〇-Agl4 骨髓瘤株。此等骨髓瘤細胞株可自美國典型培養物保藏所 (ATCC)Rockville，MD獲得。通常，使用聚乙二醇（pEG)將 HAT敏感小鼠骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞融合。接著使用 HAT養基選擇由融合產生之融合瘤細胞，藉此殺死未融 5及非產生性融合之骨髄瘤細胞（未融合之脾細胞在數天 後死亡’此係因為其未發生轉化）。特異性識別本發明之 RGM蛋白質或衍生物/等效物之產生單株抗體之融合瘤細 胞係藉由關於該等抗體篩檢融合瘤培養上清液，（例如）藉 由使用標準ELIS A檢定選擇能夠特異性結合本發明之rgm 蛋白質或其衍生物/等效物之抗體而經鑑別。 視所需抗體類型而定，將各種宿主動物用於活體内免 疫。可使用自身表現内源性形式之所關注抗原之宿主。或 者’可使用使關於内源性形式之所關注抗原缺陷之宿主。 已展不（例如）已藉由在給定内源性蛋白之相應内源性基因 處同源重組而使其為缺陷型之小鼠（亦即基因敲除小鼠）對 使其免疫之蛋白質產生體液性反應，且因此可用於產生針 對該蛋白質之高親和力單株抗體（參見例如，R〇es, j等人 134305.doc -59- 200916482 (1995) J. Immunol. Methods 183: 231-237 ; Lunn，Μ P 等人 (2000) J. Neurochem. 75: 404-412)。 對於產生針對本發明之RGM蛋白質或其衍生物/等效物 之非人類抗體而言，許多非人類哺乳動物適用作抗體產生 之宿主。其包括小鼠、大鼠、雞、駱駝、兔及山羊（及其 基因敲除形式），不過對於融合瘤產生而言，小鼠係較户 的。此外，對於產生基本上針對人類抗原之具有雙重特異 性之人類抗體而言，可使用表現人類抗體譜之非人類宿主 動物。該等非人類動物包括下文中更詳細描述之攜有人類 免疫球蛋白轉殖基因（嵌合hu-PBMC-SCID小鼠）之轉殖美 因動物（例如小鼠）及人類/小鼠輻射嵌合體。 根據一實施例，以本發明之RGM蛋白質或其衍生物/等 效物免疫之動物為非人類哺乳動物，較佳為小鼠，使用人 類免疫球蛋白基因使該非人類哺乳動物轉殖基因化，使得 該非人類哺乳動物在抗原刺激後產生人類抗體。通常，將 具有人類生殖系組態之重鏈及輕鏈之免疫球蛋白轉殖基因 插入該等動物，該等動物已以使其重鏈及輕鏈之内源性基 因座失活之方式經修飾。若以抗原(例如以人類抗體)刺激 該等動物’則產生源自人類免疫球蛋自序列之抗體（亦即 亡類抗體）。人類單株抗體可使用標準化融合瘤技術由該 等動物之漱巴細胞產生。關於使用人類免疫球蛋白轉殖基 因化之小鼠及其用於產生人類抗體之用途的其他描述，參
見例如 US 5,939,598 ' wo 96/33735、W0 96/34096、WO 5,545,806、 98/24893 及 WO 99/53〇49(Abgenix 化^及^^ 134305.doc -60- 200916482 US 5,569,825、US 5,625,126、US 5,633,425、US 5,661，016、US 5,770,429、US 5,814,318、US 5,877,397及 WO 99/45962(Genpharm Inc.);亦參見 MacQuitty，J.J.及 Kay，R.M. (1992) Science 257: 1 188 ; Taylor，L.D.等人 (1992) Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295 ; Lonberg，N.等人 (1994) Nature 368: 856-859 ; Lonberg, N.及 Huszar，D. (1995) Int. Rev. Immunol. 13: 65-93 ; Harding, F.A.及 Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764: 536-546 ； Fishwild，D.M. 等人（1996)NatureBiotechnologyl4:845-851 ; Mendez, M.J.等人（1997) Nature Genetics 15: 146-156 ; Green, L_L.及 Jakobovits，A. (1998) J. Exp. Med. 188: 483-495 ； Green, L.L. (1999) J. Immunol. Methods 231: 11-23 ; Yang, X.D.等人（1999) J. Leukoc. Biol. 66: 401-410 ; 及 Gallo，M.L.等人（2000) Eur. J. Immunol. 30: 534-540。 根據另一實施例，經本發明之RGM蛋白質或其衍生物/ 等效物免疫之動物可為以人類外周單核血細胞或淋巴細胞 或其前驅體重構之具有嚴重聯合免疫缺陷（SCID)之小鼠。 稱為嵌合hu-PBMC-SCID小鼠之該等小鼠在抗原刺激後產 生所表明之人類免疫球蛋白反應。關於此等小鼠及其用於 抗體產生之用途之其他描述 參見例如Leader, K.A.等人 (1992) Immunology 76: 229-234; Bombil，F.等人（1996) Immunobiol. 195: 360-375 ; Murphy，W.J.等人（1996) Semin. Immunol. 8: 233-241 ; Herz，U.等人（1997) int. Arch. Allergy Immunol. 1 13: 150-152; Albert, S.E.等人 134305.doc -61 - 200916482 (1997) J· Immunol. 159: 1393-1403 ; Nguyen，Η.等人（1997) Microbiol. Immunol. 41: 901-907 ; Arai，K.等人（1998) j. Immunol. Methods 217: 79-85 ; Yoshinari, K.及 Arai，K. (1998) Hybridoma 17: 41-45 ; Hutchins，W.A.等人（1999) Hybridoma 18: 12 1 -129 ; Murphy, W_J_ #A(1999)Clin. Immunol. 90: 22-27 ; Smithson，S.L.等人（1999) Mol. Immunol. 36: 113-124 ; Chamat，S.等人（1999) J, Infect. Diseases 180: 268-277 ;及 Heard, C.等人（1999) Molec. Med. 5: 35-45 ° 根據另一實施例，以本發明之RGM蛋白質或其衍生物/ 等效物免疫之動物為已經投與致死量之全身輻射，接著使 用來自具有嚴重聯合免疫缺陷（SCID)之小鼠之骨髓細胞且 接著接收功能性人類淋巴細胞移植來防止輻射之小鼠。使 用稱為Trimera系統之此嵌合類型以藉由以所關注之抗原使 小鼠免疫且接著使用標準化融合瘤技術產生單株抗體而產 生人類單株抗體。關於此等小鼠及其用於抗體產生之用途 之其他描述參見例如Eren, R.等人（1998) Immunology 93: 154-161 ; Reisner，Y.及 Dagan，S. (1998) Trends Biotechnol. 16: 242-246 ; Ilan, E.等人（1999) Hepatology 29: 553.562 ; 及 Bocher，W.O.等人（1999) Immunology 96: 634-641。 活體外方法： 作為藉由免疫及選擇產生本發明抗體之替代方法，可藉 由以本發明之RGM蛋白質或其衍生物/等效物篩檢重組性 組合免疫球蛋白庫來分離特異性結合至RGM蛋白質或其衍 134305.doc -62- 200916482 生物/等效物之免疫球蛋白庫成員來鑑別且分離本發明抗 體。用於建立且篩檢呈現庫之套組為可購得的（例如the Recombinant Phage Antibody System from Pharmacia，目 錄號27-9400-01 ;及來自Stratagene之SurfZAP®噬菌體呈 現套組，目錄號24〇612)。在許多實施例中，呈現庫為 scFv庫或Fab庫。先前已描述篩檢重組抗體庫之噬菌體呈 現技術。可以特別有利的方式用於產生且篩檢抗體呈現庫 之方法及化合物之實例可見於McCafferty等人之WO 92/01047、US 5,969，108及EP 589 877(特別描述scFv呈 現）；Ladner 等人之 US 5,223,409 > US 5,403,484 > US 5,571，698、US 5,837,500 及 EP 436 597(描述例如 pill 融 合）；Dower 等人之 WO 91/17271、US 5,427,908 > US 5,580,717及丑卩527 839(特別描述？&1)呈現）；\^1^61'等人之 WO 92/20791及EP 368 684(特別描述可變免疫球蛋白域序 列之選殖）；〇1^出118等人之118 5,885,793及£? 589 877(特 別描述使用重組庫來分離針對人類抗原之人類抗體）； Garrard等人之WO 92/09690(特別描述噬菌體表現技術）； Knappik等人之WO 97/08320(描述HuCal人類重組抗體 庫）；Salfeld等人之WO 97/29131(描述針對人類抗原（人類 腫瘤壞死因子〇〇之重組人類抗體產生及重組抗體之活體外 親和力成熟）；及Salfeld等人之美國臨時申請案第 60/126,603號及基於其之專利申請案（同樣描述針對人類抗 體（人類介白素-12)之重組人類抗體之產生及重組抗體之活 體外親和力成熟）。 134305.doc •63- 200916482 篩檢重組抗體庫之其他描述可見於以下科技出版物，諸 如 Fuchs 等人（1991) Bio/Technology 9: 1370-1372 ; Hay 等 人（1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85 ; Huse等人 (1989) Science 246: 1275-1281 ; Griffiths 等人（1993) EMBO J 12: 725-734 ; Hawkins 等人（1992) J Mol. Biol. 226: 889-896 ; Clarkson等人（1991) Nature 352: 624-628 ; Gram 等人（1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad等人（1991) Bio/Technology 9: 1373-1377 ; Hoogenboom 等人（1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137 ; Barbas 等人（1991) PNAS 88: 7978-7982 ; McCafferty 等人 Nature (1990) 348: 552-554 ;及 Knappik等人（2000) J. Mol· Biol. 296: 57-86。 作為使用噬菌體呈現系統之替代方法，可使重組抗體庫 表現於酵母細胞或細菌細胞表面上。產生且篩檢表現於酵 母細胞表面上之庫之方法係描述於WO 99/36569中。產生 且篩檢表現於細菌細胞表面上之庫之方法係於WO 98/49286中更詳細描述。 所關注抗體一旦經自組合庫鑑別，即使用標準化分子生 物學技術’例如藉由PCR擴增來自在篩檢庫期間分離之呈 現包（例如噬菌體）之DNA來分離編碼抗體輕鏈及重鏈之 DNA。熟習此項技術者熟悉可用以產生PCR引子之抗體輕 鏈及抗體重鏈之基因的核苷酸序列。此等類型之序列中之 許多係描述於（例如）Kabat，E.A,等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，u.S Department of Health and Human Services, NIH公開宰第 134305.doc -64- 200916482 91-3242號及人類生殖系序列之VBASE資料庫中。 本發明抗體或抗體部分可藉由於宿主細胞中重組表現免 疫球蛋白輕鏈及免疫球蛋白重鏈之基因而產生。為重組表 現抗體’以一或多種攜有編碼抗體免疫球蛋白輕鏈及免疫 球蛋白重鏈之DNA片段之重組表現載體轉染宿主細胞，使 得宿主細胞中之輕鏈及重鏈經表現且較佳分泌至培養宿主 細胞之培養基中。可自此培養基回收抗體。使用標準化重 組DN A方法來獲得抗體重鏈及抗體輕鏈之基因，將此等基 因插入重組表現載體中且將該等載體引入宿主細胞中。該 方法係描述於（例如）Sambr〇〇k，Fritsch及Maniatis (編），
Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，（1989) ; Ausubel，f.M.等人（编），
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates，（l989);及 B〇ss 等人之 us 48i6,397 中。 編碼所關注抗體之VH及VL區段之DNA片段一經獲得，
έ吾”操作性地連接” 意謂將兩個DNA片段以藉由
之方式接合 可藉由將編碼VH區 在此情況下，術 藉由兩個DNA片 之DNA與編碼重鏈恆定區（CH1、 134305.doc -65· 200916482 CH2及CH3)之另一 DNA分子操作性地連接來將編碼VH區 之經分離DNA轉化為全長重鏈之基因。人類重鏈恆定區之 基因序列為眾所熟知（參見例如Kabat, E.A.等人（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版， U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案 第91-3242號），且可使用標準化PCR擴增來獲得跨越此等 區域之DNA片段。重鏈恆定區可為由IgGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD組成之恆定區，由IgGl或 IgG4組成之恆定區較佳。為獲得重鏈Fab片段之基因，可 將編碼VH之DNA與僅編碼重鏈恆定區CH1之額外DNA分子 操作性地連接。 藉由將編碼VL之DNA與編碼輕鏈恆定區CL之額外DNA 分子操作性地連接可將編碼VL區之經分離DNA轉化為全 長輕鏈之基因（以及Fab輕鏈之基因）。人類輕鏈之恆定區基 因序列為眾所熟知（參見Kabat, E.A.等人（1991) Sequences of Proteins of immunological Interest，第十五版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第 91-3242號），且可使用標準化PCR擴增來獲得跨越此等區 域之DNA片段。輕鍵恒定區可為恆定/c或λ區，恒定/c區 較佳。 為產生scFv基因*可將編碼VH及VL之DNA片段與編碼 可撓性連接子之額外編碼片段（例如胺基酸序列（Gly4-Ser)3)操作性地連接，使得VH及VL序列表現為連續單鏈蛋 白質，VL及VH區經由可撓性連接子接合在一起（參見Bird 134305.doc -66- 200916482 等人（1988) Science 242: 423-426 ; Huston等人（1988) Proc
Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 ;及 McCafferty 等人， Nature (1990) 348: 552-554)。 可藉由使用上述方法將對本發明之尺(3]^蛋白質或其衍生 物/等效物具有特異性之VH及VL單結構域自單結構域庫分 離。可使用具有所需特異性之兩個VH單結構域鏈（具有或 不具有CH1)，或兩個VL鏈或由一個VH鏈及一個VL鏈組成 之對來結合本發明之RGM蛋白質或其衍生物/等效物。 為表現本發明之重組抗體或抗體部分，可將編碼部分或 全長輕鏈及重鏈之DNA插入表現載體中，藉此將基因與轉 錄及轉譯控制序列操作性地連接。在此上下文中，術語" 操作性地連接，，意謂將抗體基因以載體内之轉錄及轉譯控 制序列滿足其調控抗體基因轉錄及轉譯之所欲功能的方式 於載體内接合。 選擇表現載體及表現控制序列使得其與用於表現之宿主 細胞相容。可將抗體輕鏈之基因及抗體重鏈之基因插入不 同載體中’或將兩個基因插入相同表現載體中（其為一般 情況）。使用標準化方法（例如接合抗體基因片段與载體之 互補限制介面，或若不存在限制介面則接合純端）來將抗 體基因插入表現載體中。表現載體可在輕鏈及重鏈序列插 入鈉攜有恆定抗體區之序列u舉例而言，在一方法中，藉 由將序列插入已編碼重鏈及輕鏈恆定區之表現載體中來將 VH及VL序列轉化為全長抗體基因，藉此將載體内之區 段與CH區段操作性地連接且亦將載體内之vl區段與cl區 134305.doc -67- 200916482 段操作性地連接。另外或其他，重組表現載體可編碼簡化 自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至 載體中’藉此將閱讀框架中之信號肽連接至抗體鏈基因之 N端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽（亦即來 自非免疫球蛋白之信號肽）。除抗體鏈基因以外，本發明 之表現載體可具有控制宿主細胞内抗體鏈基因表現之調控 序列。術語’’調控序列"涵蓋啟動子、強化子及控制抗體鏈 基因轉錄或轉譯之其他表現控制元件（例如聚腺苷酸化信 號）。該等調控序列係描述於（例如）G〇eddel; Gene Expression Technology： Methods in Enzymology 185,
Academic Press，San Diego，CA (1990)中。熟習此項技術 者已知表現载體之設計（包括選擇調控序列）可視諸如待轉 化之宿主細胞之選擇，蛋白質之所需表現強度等因素而 定。於哺乳動物宿主細胞中表現之較佳調控序列包括於哺 乳動物細胞中產生強蛋白質表現之病毒元件，諸如源自下 列病毒之啟動子及/或強化子，細胞巨大病毒（C]vlV)(諸如 CMV啟動子/強化子）、猿猴病毒4〇(SV4〇)(諸如SV4〇啟動 子/強化子）、腺病毒（例如腺病毒主要晚期啟動子 (AdMLP))及多形瘤。關於病毒調控元件及其序列之其他描 述，參見例如Stinski之US 5，168,062、Bell等人之us 4,51〇,245 及 Schaffner 等人之 US 4,968,615 ^ 除抗體鍵基因及§周控序列以外，本發明之重組表現載體 可含有額外序列，諸如調控宿主細胞中載體複製之序列 (例如複製起始點）及可選擇之標誌基因。可選擇之標誌基 134305.doc •68· 200916482 因簡化已引入載體之宿主細胞之選擇（參見例如us 4,399,216、US 4,634,665 及 US 5，179,017，均為 Axel 等 人）。舉例而言，可選擇之標誌基因通常使已引入載體之 伯主細胞而t受諸如G4 1 8、勻黴素或甲胺喋呤之活性物質。 較佳可選擇之標誌基因包括二氫葉酸還原酶（DHFR)基因 (用於使用甲胺嗓吟選擇/擴增之dhfr-宿主細胞）及新基因 (用於G418選擇）。 為表現輕鏈及重鏈，使用標準化技術將編碼重鏈及輕鏈 之表現載體轉染至宿主細胞中。各種形式之"轉染"涵蓋通 常用以將外源性DNA引入原核或真核宿主細胞中之許多技 術’例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE葡聚糖轉染及其類 似者。儘管理論上可能在原核或真核宿主細胞中表現本發 明抗體’但於真核細胞且詳言之哺乳動物宿主細胞中之抗 體表現較佳，因為恰當摺疊且免疫活性抗體組合且分泌至 該等真核細胞且詳言之哺乳動物細胞中之機率大於分泌至 原核細胞中之機率。關於抗體基因之原核表現，已報導該 等表現對於產生高產率活性抗體而言無效（B〇ss，M A.及 Wood, C.R. (1985) Immunology Today 6: 12-13)= 對於表現本發明之重組抗體為較佳之哺乳動物宿主細胞 包括CHO細胞（包括dhfr- CHO細胞，其係描述於Urlaub及 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77： 4216-4220 中’且與描述於（例如）R.J. Kaufman及 P.A· Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621中之DHFR可選擇之標記一起使 用）、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。當將編碼抗 134305.doc -69- 200916482 體基因之重組表現載體引人哺乳動物宿主細胞中時，藉由 養佰主、.、田胞直至抗體於宿主細胞中表現，或較佳地抗體 被y刀泌至宿主細胞所生長之培養基中來產生抗體。藉由使 用用於純化蛋白質之標準化方法而自培養基中回收抗體。 亦可使用宿主細胞來產生完整抗體之部分，諸如Fab片 段或scFv分子。當然，本發明涵蓋先前所述程序之變化。 牛例而σ ’可此需要以編碼本發明之抗體輕鏈或重鏈（但 並非兩者）之DNA轉染宿主細胞。若存在並非結合所關注 抗原必需之輕鏈或重鏈，則可使用DNA重組技術部分或完 全移除編碼該輕鏈或該重鏈或此兩者之DNA。藉由該經截 紐之DNA分子表現之分子同樣包括於本發明之抗體中。此 外’可藉由使用標準化化學方法將本發明之抗體與第二抗 體交聯而產生雙功能抗體，其中一條重鏈與一條輕鏈構成 本發明之抗體’且另一條重鏈及輕鏈對不同於所關注抗原 之抗原具有特異性。 在重組表現本發明之抗體、其抗原結合部分之一較佳系 統中，於dhfr— CHO細胞中藉由磷酸鈣介導之轉染引入編 碼抗體重鏈及抗體輕鏈之重組表現載體。在重組表現載體 内’抗體重鏈及抗體輕鏈之基因各自與調控CMV強化子 /AdMLP啟動子元件操作性地連接來達成強基因轉錄。重 組表現載體亦攜有DHFR基因，藉助於該DHFR基因可藉由 使用曱胺喋呤選擇/擴增來選擇經載體轉染之CHO細胞。 培養所選經轉化宿主細胞使得表現抗體重鏈及抗體輕鏈， 且自培養物回收完整抗體。使用標準化分子生物學技術來 134305.doc -70· 200916482 產生重組表現載體，轉染宿主細胞，選擇轉化子，培養宿 主細胞且自培養基回收抗體。因此，本發明係關於藉由於 合適培養基中培養本發明之宿主細胞直至合成本發明之重 組抗體來合成本發明之重組抗體之方法。該方法亦可包括 將重組抗體自培養基分離。 作為藉由嗟菌體呈現篩檢重組抗體庫之替代方法，可使 用熟習此項技術者已知之其他方法來篩檢較大組合庫來鐘 別本發明之抗體。如Szostak及Roberts之WO 98/31700中及
Roberts，R.W·及 Szostak，J.W. (1997) Proc. Natl, Acad. Sci. USA 94: 12297-12302中所述’在一種類型之替代表現系統 中，以RNA蛋白融合形式表現重組抗體庫。在此系統中， 藉由合成mRNA(在其3,端具有肽基受體抗生素嘌呤黴素）之 活體外轉譯於mRNA與其編碼之肽或蛋白質之間產生共價 融合。因此，可基於經編碼肽或蛋白質（例如抗體或其部 分）之特徵’諸如抗體或其部分與本發明之RGM蛋白質戋 其衍生物/等效物之結合而由mRNA複合混合物（例如組合 庫）富集特異性mRNA。編碼抗體或其部分且由筛檢該等庫 回收之核酸序列可（例如在哺乳動物宿主細胞中）以所述方 式使用重組方式表現，且亦可藉由進一步篩檢於初始選擇 之序列中插入突變之mRNA肽融合，或藉由使用以上述方 式使重組抗體活體外親和力成熟之其他方法而經受進一步 親和力成熟。 活體内及活體外方法之組合： 本發明之抗體亦可藉由使用活體内與活體外方法之組合 134305.doc 71 200916482 產生諸如首先使本發明之RGM蛋白或其衍生物/等效 物活體内作用於宿主動物體内之抗體譜以刺激產生結合 RGM蛋白質或衍生物/等效物之抗體，且接著使用一或多 種活體外技術來進行進一步抗體選擇及/或抗體成熟（亦即 最佳化）的方法。根據一實施例，該組合法可由以下組 成：首先以|發明之RGM蛋白質或其衍生物/等效物使非 人類動物(例如小鼠、纟鼠、兔、雞、駱駝、山羊或其轉 殖基因形式或嵌合小鼠)免疫來刺激對抗原之抗體反應， 且接著使用來自淋巴細胞（藉由RGM蛋白質或其衍生物/等 效物作用活體内刺激）之免疫球蛋白序列，產生且篩檢噬 菌體呈現抗體庫。此組合程序之第一步驟可以以上關於活 體内方法所述之方式進行，而此程序之第二步驟可以以上 關於活體外方法所述之方式進行。使非人類動物超免疫， 以及隨後活體外篩檢由經刺激淋巴細胞產生之噬菌體呈現 庫之較佳方法包括彼等BioSite Inc.描述之方法；參見例如 WO 98/47343、WO 91/17271、⑽ 5,427,9〇8 及 us 5,580,717 。 根據另一實施例，該組合法可由以下組成：首先以本發 明之RGM蛋白質或其衍生物/等效物使非人類動物（例如小 鼠、大鼠、兔、雞、駱駝、山羊或其基因敲除及/或轉殖 基因形式或嵌合小鼠）免疫來刺激對RGM蛋白質或其衍生 物/等效物之抗體反應，且藉由筛檢融合瘤（例如由經免疫 動物產生）選擇產生具有所需特異性之抗體之淋巴細胞。 將抗體或單結構域抗體之基因自所選純系分離（使用標準 134305.doc -72- 200916482 化選殖法，諸如逆轉錄酶聚合酶鏈反應）且使其經受活體 外親和力成熟以改良所選抗體之結合特徵。此程序之第一 步驟可以以上關於活體内方法所述之方式進行，而此程序 之第二步驟可以以上關於活體外方法所述之方式進行，詳 言之藉由使用如WO 97/29Π1及WO 〇〇/56772中所述之活 體外親和力成熟方法進行。 在其他組合法中，重組抗體係藉由使用熟習此項技術者 已知之程序，如所選淋巴細胞抗體法（SLaM)及如us 5,627,052 ' WO 92/0255 1 Λ Babcock, J.S.^A(1996) Proc. Natl· Acad· Sci. USA 93: 7843-7848中所述由個別淋巴細胞 產生。在此方法中，首先以本發明之11(}]^蛋白質或其衍生 物/等效物使非人類動物（例如小鼠、大鼠、兔、雞、駱 ^ 山羊或其轉殖基因形式或故合小鼠）活體内免疫以刺 激對RGM蛋白質或其衍生物/等效物之免疫反應且接著藉 由使用抗原特異性溶血性斑塊檢定選擇所關注之個別分泌 '"體之細胞。為此目的’可使用諸如生物素之連接子將 RGM蛋白質或其衍生物/等效物或所關注之結構相關分子 與綿羊紅血球偶合，藉此使得使用溶血性斑塊檢定鑑別分 泌具有合適特異性之抗體之個別細胞。鑑別分泌所關注之 才充夕 <細胞後，藉由逆轉錄酶PCR自細胞回收輕鏈及重鏈 可’文歧之cDNA ;且接著在諸如c〇S或CIIO細胞之哺乳動 、、田胞中此等可變區可聯合合適恒定免疫球蛋白區 ({歹!| 韦5 ΐ. 貝惺定區）表現。接著可（例如）藉由繁殖經轉染細 胞以分離本 表現具有所需特異性之抗體的細胞而使活體内選 1343〇5.d, •73- 200916482 白轉染的宿主細胞 步活體外操縱經擴 擇之以源自淋巴細胞之經擴增免疫球蛋 經受進一步活體外分析及選擇。可進— 增之免疫球蛋白序列。 6·藥劑 6.1通用資訊 活性物質之本發明蛋白 配位體，諸如抗RGM蛋 序列及視情況醫藥學上 本發明之標的亦係關於含有作為 質（RGM蛋白質；RGM蛋白質結合 白質抗體）或編碼RGM蛋白質核酸 可接受之載劑的藥劑。本發明之醫藥組合物亦可含有至少 -種額外治療劑’例如—或多種用於治療本文中所述疾病 中之一者之額外治療劑。 醫藥學上可接受之載劑包括所有溶劑、分散介質、包 衣、抗微生物劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物，其限 制條件為其為生理上可相容的。 醫藥學上可接文之載劑包括（例如）水、生理食鹽水溶 液1酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、乳糖、右旋糖、嚴糖、 山梨糖醇、甘露醇、激粉、阿拉伯膝、填酸妈、海藻酸 鹽、黃切、明膠、石夕酸妈、微晶纖維素、聚乙稀鱗。定 5 ’截、准素水、糖毁及曱基纖維素。調配物亦可包括醫 藥子上可接受之載劑或常見佐劑，諸如潤滑劑，例如滑 石、硬脂酸鎂及礦物油；濕潤劑；乳化劑及懸浮劑；防腐 劑，諸如笨曱酸曱基酯及苯甲酸丙基羥基酯；抗氧化劑； 杬刺激劑，螯合物形成劑；包衣劑；乳液穩定劑；成膜 劑，凝膠形成劑；氣味掩蔽劑；調味劑；樹脂；水膠體； 134305.doc -74- 200916482 溶劑；增溶劑；中和劑；滲透促進劑；顏料；第四銨化合 物；濕化劑及潤膚劑；油膏、乳膏或油基；聚矽氧衍生 物；分散劑；穩定劑；殺菌劑；栓劑基質；錠劑佐劑，諸 如黏合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑或包衣；推進劑；乾 燥劑；遮光劑；增稠劑；蠟；軟化劑及白油。關於此之設 計係基於熟習此項技術者之知識，如（例如）以下文獻中所 述：Fiedler，Η·Ρ·，Lexikon der Hilfsstoffe fiir Pharmazie，
Kosmetik und angrenzende Gebiete [Lexicon of Adjuvants for Pharmaceutical, Cosmetic, and Related Areas]，第 4 版，Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag，1996。亦參見
Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis [Hager's
Handbook of Pharmaceutical Practice], Springer Verlag, Heidelberg。 醫藥組合物可適用於（例如）非經腸投藥。為此目的，較 佳將活性物質（例如抗體）製備為具有Oj-250 mg/mL活性物 質含量之可注射溶液形式。可以燧石玻璃或小瓶、安瓿或 填充注射益中液體或康乾形式之劑型來提供可注射溶液。 緩衝劑可含有L _組胺酸（1 _ 5 〇 mM，較佳5-10 mM)且可具 有5.0-7.0，較佳6.0之pH值。其他合適緩衝劑包括㈠旦不限 於）琥珀酸鈉、擰檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀緩衝劑。 可使用氣化鈉將溶液之張力調節至〇·3〇〇 ηιΜ之濃度（對 於液體劑型而言較佳為丨5〇 mM)。對於凍乾劑型而言，可 併入低溫保護劑’諸如蔗糖（例如0-10%，較佳0.5· 1.0 /〇(w/w))。其他合適低溫保護劑包括海藻糖及乳糖。對 134305.doc •75· 200916482 於珠乾劑型而言，可併入填充劑，諸如甘露醇(例如!_ 10%，較佳2-4%(w/w))。亦可使用液體以及;東乾劑型之穩 定劑，諸如L-甲硫胺酸（例如51_5〇福，較佳5_ι〇 ,。 其他合適填充劑包括甘胺酸及精胺酸。亦可使用界面活性 劑’例如聚山梨醇醋80(例如㈡〇5%，較佳〇 〇〇5_ 〇.㈣(w/w))。其他界面活性劑包括聚山梨醇醋2〇及呵界 面活性劑。 本發明之組合物可呈現為許多形式。此等形式包括液 體、半固體及固體劑型，諸如液體溶液(例如可注射及可 輸注溶液、洗劑、滴眼劑及滴耳劑）、脂質體、分散液或 懸转；及固體形式，諸如粗粉、粉末、顆粒、錠劑、片 劑、藥囊、扁囊劑、糖衣藥丸、諸如硬明膠膠囊及軟明膠 膠囊之膠囊、栓劑或陰道投藥形式；或半固體投藥形式， 諸如油膏、乳貧、水凝膠、糊劑或膏藥。亦可使用植入式 分配器來投與本發明之活性物質。較佳形式視預期投藥類 型及治療應用而疋。通常可注射或可輪注溶液形式之組合 物係較佳的一種合適之投藥途徑之實例為非經腸(例： 静脈内、皮下、腹膜内、肌肉内）。根據一較佳實施例， =性物質係藉由靜脈内輸液或注射來投與。根據另一較佳 貫施例，活性物質係藉由肌肉内或皮下注射來投與。 治療組合物通常必須為無菌的且在製造及儲存條件下為 穩定的。可將組合物調配為溶液、微乳液、 :二 體結構或適於高活性物質濃度之其他有序結構之形式= 心m量之活性化合物（諸如抗體）視情況與上述成份 134305.doc •76· 200916482 中之-者或組合-起引人合適溶劑中且接著進行無菌過據 而產生無菌可注射溶液。分散液—般係藉由將活性化合物 引入含有基本分散介質及視情況其他必需成份之無菌媒劑 :而製備。當使用無菌柬乾粉末來產生無菌可注射溶液 時，真空乾燥及噴霧乾燥為自先前經無菌過據之溶液獲得 活性成份粉末及視情況其他所需成份之較佳製造方法。可 藉由使用諸如Μ脂之包衣來維持恰當的溶液流動特徵且 對於分散液而言，維持所需粒徑或使用界面活性劑。可注 射組合物之長期吸收可藉由向組合物中引入延遲吸收之藥 劑（例如單硬脂酸鹽及明膠）來達成。
可使用熟習此項技術者已知之許多方法來投與本發明之 活性物質，不過對於許多治療應用而言，皮下注射、靜脈 内注射或輸注為較佳投藥類型。熟習此項技術者意識到投 藥途徑及/或類型視所需結果而定。根據某些實施例，活 性化合物可使用保護化合物使之免於快速釋放之載劑來製 備，諸如控釋調配物，包括植入物、經皮膏藥及微囊封傳 遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙 烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯 及聚乳酸。用於製備該等調配物之方法一般為熟習此項技 術者所知；參見例如 Sustained and Controlled Release
Drug Delivery Systems，J.R_ Robinson編，Marcel Dekker，
Inc·，New York，1978 o 根據某些實施例’本發明之活性物質可（例如）於惰性稀 釋劑或可同化可食性載劑中經口投與。亦可將活性物質 134305.doc -77- 200916482 Y及若需要時其他成份）囊封於硬或軟明膠膠囊中，壓成錠 3、.直接"』、、加至食物中。對於口服治療投藥，活性物質可 :、賦形劑混合且以咀嚼錠、口腔錠、膠囊、酏劑、懸浮 液二糖漿及其類似物之形式使用。若經由除非經腸以外之 途仅來投與本發明之活性物質，則可能必需選擇來自防止 活性物質失活之材料之包衣。 本發明活性物質可與—或多種適用於治療上述疾病之額 外治療劑一起投與。 本發明之醫藥組合物—般含有治療有效量或預防有效量 之至少-種本發明之活性物質。可（例如）視所需治療或需 要治療性治療抑或預防性治療而定來選擇且調節給藥方 案。舉例而言，可視治療情況需要投與單一劑量、隨時間 刀配之數-人刀開劑量或增加或減低之劑量。特別有利的為 调配單冑置形式之非經腸組合物，以便簡化投藥且確保 劑量均一性。 主治醫師可容易地指^最適用於特定治療及特定活性物 質之投藥形式、投藥類型及劑量。 本發明之活性物質之治療或預防有效量可例如（但不限 =)在0.1-20 mg/kg，較佳wo mg/kg範圍内。當然，此等 量可視待減輕之病狀性質及嚴重性而變化。 6.2疫苗 、可將本發明之刪蛋白質及其衍生物/等效物用作給待 療患者接種疫苗之免疫原。 為此目的，合適疫苗-般為含有至少一種本發明之rgm 134305.doc -78- 200916482 蛋白質及/或至少一種根據本發明之其衍生物/等效物的醫 藥組合物。該組合物亦可含有生理上可接受之載劑及視情 況其他之佐劑，例如免疫刺激物。 儘管原則上可視需要選擇合適載劑，但載劑類型一般視 投藥途徑而定。因此，可將本發明之疫苗特別調配為適用 於非經腸（例如靜脈内、肌肉内及皮下）投藥之形式。在此 等情況下，載劑較佳含有水、生理食鹽水溶液、醇、脂 肪、堪及/或緩衝劑。 可於本發明之疫苗中使用任何給定數目之免疫刺激物。 舉例而言，可併入佐劑。大多數佐劑含有諸如氫氧化鋁或 礦物油之物質’以及源自脂質A、百曰咳桿菌（B〇rdeteUa pertussis)或結核分枝桿菌（Myc〇bacterium之 蛋白質，該蛋白質經設計用以保護抗原不被快速破壞。合 適佐劑一般為可購得的，例如完全或不完全弗氏佐劑； AS-2，鋁鹽，諸如氫氧化鋁（視情況為凝膠形式）或磷酸 銘，約鹽、鐵鹽或鋅鹽；醯化酿胺酸之不溶懸浮液；酿化 糖；陽離子或陰離子衍生之多醣；聚磷氮烯；生物可降解 微球體或單磷酸類脂A。亦可使用諸如gm_csf或介白素 2、介白素7或介白素12之細胞激素作為佐劑。 7·治療方法 7.1治療神經元疾病 自先前技術已知在中枢神經系統損傷中在病變部位觀測 到RGM蛋白質之積聚（參見Schwab等人之上述引文）。同 時，此防止神經纖維之新生長。藉由使用多株rgm A特異 134305-doc -79· 200916482 眭柷體中和大鼠脊髓損傷模型中之RGM A導致再生及功能 敗復（HaU Κ·等人，J. Cell Biol. 173: 47-58, 2006)。對神 矣二纖維生長之損害或抑制效應係藉由使RGM A與受體分子 新生素結合而介導（Conrad S.等人，J. Biol. Chem. 282: 16423_16433，2007)。因此，對ROM與受體分子新生素之 間的相互作用之調節（尤其抑制）將適用於抑制rGM對神經 纖維生長之抑制活性。 7.2腫瘤疾病之治療 長期以來’已有跡象表明腫瘤疾病病原學及/或進程中 涉及新生素。舉例而言’ Meyerhardt等人在〇ncogene (1997) 14，11 29-1136中報導可在超過五十種不同癌細胞株 中偵測到新生素，該等癌細胞株包括神經膠母細胞瘤、神 經管胚細胞瘤及神經母細胞瘤細胞株以及結腸直腸癌、乳 癌、騰腺癌及子宮頸癌之細胞株。亦於食道癌中觀測到新 生素之過度表現（Hue等人’ Clinical Cancer Research (2001) 7，2213-2221)。最近對211肺部腺癌患者體内3588 個基因之表現概況的系統分析提供關於腫瘤疾病病原學及 進程中涉及新生素的額外資訊（Berrar等人，j c〇mpUt
Biol. (2005) 12 (5)，534-544)。 由於亦已知RGM由於其能夠藉由結合於與腫瘤細胞相關 之新生素受體來防止細胞死亡故具有潛在腫瘤促進效應 (Matsunaga等人，Nature Cell Biol. 6，749-755，2004)，故 可藉由調節RGM-新生素相互作用，尤其藉由使用特異性 抗R G Μ抗體干擾相互作用來提供用於腫瘤疾病治療之新治 134305.doc -80· 200916482 療方法。 另方面，活化新生素受體之人類rgM A蛋白質片段可 抑制新生考》陪k '、W性腫瘤細胞之腫瘤細胞遷移或癌轉移。對腫 瘤細胞遷移$ ^ & <此抑制作用可以類似於抑制神經纖維生長之 方式發生。神經纖維亦以侵襲性方式生長，但與腫瘤細胞 般以又控侵襲性方式生長。此為最近將hRGM八鑑 '、尘I奇金氏淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma)中之潛在 腫瘤抑制ϋ子候選物所證實（Feys等人，如酬〇1〇咖 2〇〇7’ 第92卷，913_2〇)。 7.3治療鐵代謝疾病 亦稱作鐵調素調節蛋白之RGM 〇對於人類及動物體内之 鐵代4丨具有基本重要性。青少年血色素沉著症為表現為生 物體内鐵超負荷形式之遺傳性、相對罕見的鐵代謝疾病。 此疾病係由鐵調素調節蛋白分子突變所引起（參見等 人，The J〇urnai 〇f ciinicai investigati〇n (2〇〇5)，115, 2091)。因此，投與本發明之功能性RGm蛋白質或其活性 結構域為一種用於緩解該等鐵代謝疾病之可行治療方法。 對於慢性病貧血而言，炎性或惡性過程導致（例如）某些細 胞激素（諸如腫瘤壞死因子α)之大幅上調（Weiss M d_及 Goodnough, L.T., New Engl. J. Med. 352: 1011-ΐ〇22, 2005)。此等細胞激素為鐵代謝之最重要調控子（亦即肽激 素海帕西啶（hepcidin))之有效誘導物，且將海帕西啶之過 度產生或積t視為’(¾性病貧血發病機制之重要原因。最近 小鼠之活體内資料表明與Fc共軛之RGm C(Fc鐵調素調節 134305.doc -81 - 200916482 蛋白）抑制海帕西啶表現且升高血清鐵含量（Babitt，J.L.等 人，The Journal of Clinical Investigation，2007，第 117 卷，7，193 3-1939)。RGM蛋白質與BMP蛋白質之相互作用 為此調節中之重要因素（Babitt, J.L.等人，Nature Genetics, 2006，第48卷，5，531-53 9)。因此，可將與BMP蛋白質相 互作用之與Fc共輛之RGM C或RGM C、RGM A或[RGM] B 之與F c共輛的片段用作治療慢性病貧血之治療劑。 7.4促進骨組織形成 可自先前技術獲得以下資訊··亦以名稱DRAGON已知之 蛋白質RGM家族成員（亦即RGM B)涉及於骨骼形態發生 中。舉例而言，Samad等人在JBC Papers 2005，第280卷， 14122-14129中描述DRAGON與骨形態發生蛋白（BMP)I型 及II型受體之間的相互作用。因此，有可能藉由投與本發 明之RGM多肽來達成骨骼生長促進效應，且從而構成一種 用於治療骨骼生長病症或骨骼損傷之新治療方法。所有三 種RGM蛋白質（RGM A、B、C)與BMP家族之各成員相互作 用且增加BMP信號路徑之活化（Babitt，J.L.等人，Nature Genetics，2006，第 48卷，5, 53 卜539 ; Babitt，J.L.等人，J. Biol. Chem·，2005，第 280卷，33，29820-29827 ； Babitt, J.L.等人，The Journal of Clinical Investigation, 2007 ’ 第 117卷，7，1933-1939 ; Samad，T.A.等人，J. Biol· Chem.， 2005，第 280 卷，14, 14122-14129 ; Halbrooks 等人 ’ J. Molecular Signaling 2, 4: 2007(電子形式出版））。 7.5治療自體免疫疾病 134305.doc • 82- 200916482 本發明之活性物質可用於治療自體免疫疾病之跡象見於 以下公開内容中：Urist等人，Pr〇g cun Bi〇i〜 m5 ’ 第 187 卷：77_96 ; L〇rie^Luyten，印化此 & Growth Factor Reviews 2005 ,第 16卷，287 298。 8.診斷方法 將根據以上定義之RGM蛋白質及衍生物/等效物以及針 對前述者之抗體特別稱作本發明之診斷劑。 因此’本發明允許藉由㈣對於疾病為典型之抗原或抗 體來達成對以上定義之醫學病狀的改良之定性或定量測 定。 該測定較佳係使用免疫學方法進行。大體上此可使用 任何刀析或0斷測试方法(其中使用抗體)來達成。此等測 試方法包括凝集及沈殿技術、免疫檢定、免疫組織化學法 及免疫墨點技術（例如西方墨點法或點潰墨法）。亦包括活 體内方法（諸如成像處理）。 免疫檢定中使用為有利的。灶ώ . i . 一 ^ 巩肀性免疫檢定（亦即抗原 及經標記抗原（示縱劑）赫泰 爭抗體結合）以及夾心免疫檢定 (亦即特異性抗體與抗原 尽之結合）係使用通常經標記之第二 抗體來偵測。此等檢定可我仏紐^ . 了為均質的’亦即不分為固相及液 相，且為異質的（亦即例如使用盥4 使用與固相結合之抗體將經結 口、之標記與未經結合之樟八 °己刀離；。可視標記及量測方法 而定對給定類別指定各種里 ”質及均負免疫檢定格式，例如 放射免疫檢定（RIA)、酶聯姓A… 聯、、、。免疫吸附劑檢定（ELISA)、螢 光免疫檢定（FIA)、發井备产 尤免疫檢定（LIA)、時間解析 134305.doc -83- 200916482 fia(trfia)、免疫活化（IMAC)、酶倍增免疫測試 (EMIT)、t匕濁免疫檢定（TIA)及免疫pCR(I pCR)。 對於本發明之抗原測定而言競爭性免疫檢定係較佳的。 標記抗原（示縱劑）與待定量之樣本抗原競爭與所用抗體結 合。樣本中之抗原量(亦即抗原量)可使用標準曲線根據所 替代之示縱劑的量求出。 在可用於此目的之標記中，酶被證明為有利的。舉例而 言’可使用基於過氧化酶（尤其辣根過氧化酶）、驗性麟酸 酶及叫半乳糖㈣之系統。特異性受質可用於此等酶， 其反應（例如）可以光度計追縱。合適受質系統係基於對石肖 基苯基鱗酸鹽（潰^冬^十朵基碟酸鹽/硝基藍 四嗤鹽（BCHVNBT)、用於驗性鱗酸酶之^ _蔡紛AS — TS磷酸鹽；2,2-次偶氮基_雙_(3_乙基苯并噻唑啉·“黃 酸）(ABTS)、鄰伸苯基二胺（QPT)、3’3.，5’5,_四τ基聯苯胺 (丁_、_@香月安、5_胺基水楊酸、3_二甲基胺基苯甲 酸（DMAB)及用於過氧化酶之3_甲基_2_苯并嗟峻琳踪 (ΜΒΤΗ);鄰硝基苯基仙_半乳料（⑽pG)、對琐基苯 基-P-D-半乳糖苦及用於叫半乳糖㈣之4_甲基伞苯基 (umbelHpheny丨）+D-半乳糖芽（MUG)。在許多情況下，此 等受質系統可以即用形式（例如以旋劑形式）構得，其亦可 含有諸如適用之緩衝劑及其類似物之其他試劑。 可以本身已知之方式將標記與肽或抗體偶合，以產生示 縱物。此外，可利用經有效地㈣以與蛋白質共軛之許多 標記，例如生物素、抗生物素蛋白、超親合素（extravidin) 134305.doc -84- 200916482 或抗生蛋白鏈菌素共軛之酶、順丁烯二醢亞胺活化之酶及 其類似物。此等標記可與待㈣本發明使用之分子直接反 若為分離目的，選擇異質免疫檢定格式，例如使用與載 體偶合之抗獨特型抗體（諸如針對兔lgG之抗體），則可使 抗原-抗體複合物與受質結合。以相應抗體塗覆之基板（尤 其微量滴定盤）為已知的且可購得的。 本發明之另—標的係關於含有至少—種上述抗體及額外 組伤之免疫檢定組。此等組為用於進行本發明之測定之藥 劑之集合，-般為經包裝單元之形式。此等藥劑較佳係以 基本上即用之形式提供，以便儘可能地簡化操作。在一個 有利的配置中’免疫檢定係以套組形式提供。套組一般包 括用於獨立提供組份之若干個容^。所有組份可以用於稀 釋之濃縮物或用於溶解或懸浮之錢物形式於即用稀釋液 中提供；可將個別組份或所有組份冷; 東或儲存在周圍溫度 下直至使用。較佳地’血清較佳在(例如)_2〇。。下經快速冷 康，為此在該等情況下在使用前免疫檢定較佳必須保持: 冷凍溫度下。 免疫檢定可包括之額外組份包括以下項：標準蛋白質、 示蹤劑、對照血清、微量滴定盤(較佳經抗體塗覆）、緩衝 劑(例如用於測試、洗滌受質或與受質反應)及酶受質自 身。 免疫檢定之-般原理以及在實驗室及臨床中用作助劑之 抗體的產生及用途係描述於（例如）An仙^ 134305.doc -85- 200916482
Laboratory Manual(Harlow，E.及 Lane, D.編，Cold Spring
Harb〇r Laborat〇ry，Cold Spring Harbor，NY，1988)中。 9.篩檢法 本發明之標的另外係關於用於偵測RGM受體（新生素及/ 或BMP)之效應因子之方法，其中以rGM蛋白質或多肽來 培月懷疑為效應因子之樣本，且分析檢定中效應因子_ RGM蛋白質複合物之形成。 該等效應因子可具有促效、部分促效、拮抗或反向促效 效應此等者可為合成低分子物質、合成肽、天然或合成 抗體分子或天然物質。 本發明之該等方法一般係作為活體外篩檢過程進行，藉 助於該等活體外篩檢過程，可自許多不同物質中撿選出對 於以後使用顯現為最有前景的物質。 舉例而。，藉由利用組合化學，可建立含有許多潛在活 性物負之大範圍物質庫。可自組合物質文庫自動選取具有 所需活性之物質樣本。使用篩檢自動儀來有效地評估個別 檢定’該等筛檢自動儀係於微量滴定盤上提供。因此，本 發明亦關於篩檢方法，亦即初級及次級篩檢方法，其中較 佳地使用下述方法中之至少一者。若使用若干方法，則此 可在相同或不同時間，對待分析物f之單—樣本或各個樣 本進行。 進行亥等方’i：《種有效技術為閃爍鄰近檢定，或簡稱 SPA’其在活性物檢領域中為已知的。用於進行此檢 定之套組及組份可（例如）自A聽sham Ph贿aeia Bi〇tec_ 134305.doc -86 - 200916482 得。該方法係以將溶解或與膜結合之受體固定在含有閃爍 物質之小螢光微球體（fluoromicrosphere)上之原理來運 作。若放射性配位體（例如）與經固定受體結合，則刺激閃 爍物質發光，此係因為閃爍物質與放射性配位體之空間鄰 近度為指定的。 進行該等方法之另一有效技術為FlashPlate®技術，其於 活性物質篩檢領域中為已知的。用於進行此檢定之套組及 組份可（例如）自NEN Life Science Products購得。操作原理 同樣係基於經閃爍物質塗覆之微量滴定盤（96孔或384孔）。 可使用此等方法鑑別之物質或物質混合物之部分同樣為 本發明之標的。 參考以下非限制性產生及應用實例更詳細地描述本發 明。 實驗部分 1. 一般程序 SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳 使蛋白質在SDS聚丙烯醯胺凝膠中根據其分子量分離（4-20% 參甘胺酸凝膠：Invitrogen EC6025BOX; 10-20% 三（經 曱基）曱基甘胺酸（Tricine)凝膠 ：Invitrogen # EC6625BOX)。使用還原劑將樣本與NuPage SDS樣本緩衝 劑（4 X)混合。在95 °C下，於Thermomixer中培育1 0分鐘後， 使用參甘胺酸或三（羥甲基）甲基甘胺酸SDS電泳緩衝劑 (Invitrogen)使樣本在125 V下顯影。使用SeeBlue或 SeeBlue Plus 2(Invitrogen)作為分子量標準蛋白質。將凝 134305.doc -87- 200916482 膠以庫馬斯染劑（coomassie stain)染色或轉移至硝基纖維 素（硝基纖維素膜濾紙夹層（Invitrogen # LC2001))。 庫馬斯染色 對於以聚丙稀醯胺凝膠偵測蛋白質而言，在凝膠電泳後 以庫馬斯染劑將蛋白質染色。將凝膠在膜（0.2 μιη孔）上之 SimplyBlue Safestain 染色溶液（invitr〇gen)中，或在膠狀庫 馬斯染劑（0.25%庫馬斯藍R25〇/L，45%甲醇，1〇%乙酸）中 染色1小時。使用去離子水或脫色液（4〇%甲醇，丨〇%乙酸） 進行脫色直至蛋白質條帶清晰可見。 西方墨點法 將濾紙及硝基纖維素使用2〇%曱醇以N〇vex轉移缓衝劑 /又/貝1 0刀雀里。點墨係在室溫下於^^⑽以腔室中經2小時之時 段以恆定電流（1〇〇 mA)進行。 點潰墨法 將2 gL於TTBS緩衝劑中各種濃度之蛋白質輕擦於乾燥 确基纖維素膜上。使用以下稀釋物： 稀釋物： a) 100 pg/mL 、 =200ng/斑點 b) 50 pg/Ml ^ =100ng/斑點 c) 10 pg/mL - =20 ng/斑點 d) 5 pg/’mL ^ s l〇ng/斑點 e) 1 pg/mL ' =2 ng/斑點 0 500 pg/mL ; s 1 ng/斑點 將樣本輕擦於膜上後，將膜在室溫下乾燥1〇分鐘，隨後 134305.doc • 88 - 200916482 開始免疫偵測方案。 HEK 293F細胞RGM A片段之轉染及表現 將Invitrogen研發之用於轉染HEK 293F細胞之方案用於 此目的。將細胞經2-3天之時段培養於jTree style 293表現 培養基中，且接著在40〇xg下離心且丟棄上清液。將細胞 離心塊再懸浮於培養基中且調節為28 mL新製培養基中 3 X 1 07個細胞。將細胞離心塊轉移至丨25 mL錐形燒瓶 (Erlenmeyer flask)中且在 37°C 及 8% (：02下，在 150 rpm 之 回轉式震盪器上於培育器中培育直至產生轉染混合物。 如下製備具有293fectin DNA複合物之轉染混合物： (1) 將30 pg DNA以Opti-MEM I稀釋至1〇〇〇以之總體積且 混合（使用1000 μί Opti-MEM I作為對照）。 (2) 將 35 μί 293fectin(Invitrogen # 12347-019 ; 1 mL)以
Opti-MEM I稀釋至1000 pL之總體積，加以混合且在 室溫下培育5分鐘。 (3) 將來自步驟1之DNA混合物及293fectin溶液轉移至新 測試管中且小心混合’並在室溫下培育25分鐘後添加 至錐形燒瓶中之細胞中。 如上所述’在37°C、8% C〇2下’在150 rpm之回轉式震 蓋器上於培月益中以此轉染混合物培育細胞歷時4 0至4 8小 時。藉由以4 0 0 X g離心1 〇分鐘收集細胞上清液。 使用Ni螯合物親和力（NUNTA)來純化蛋白質 使用 Ni-NTA Superflow珠粒（Qiagen # 1018611)。藉由將 珠粒懸浮液在1 3,500 rpm下離心將珠粒在鱗酸鹽緩衝生理 134305.doc -89- 200916482 食鹽水（PBS)溶液（invitr〇gen)中洗滌3分鐘。丟棄上清液， 且將珠粒再懸浮於新製PBS中。將·叫珠粒懸浮液用於 3 0 mL細胞培養物上清液中。將珠粒在4它下於震盪器 rpm)上以細胞培養物上清液培育隔夜，且在培育後加以離 心（1〇分鐘，3000 rpm)以使珠粒粒化。丟棄上清液，且將 珠粒以PBS洗滌三次。使用25〇 溶離緩衝劑（pBs，16〇 mM NaCl ’ 150 mM咪唑）將經結合之蛋白質自珠粒溶離。 在室溫下於震盪器上培育3〇分鐘後，藉由離心（3分鐘， 1 3,500 rpm)將珠粒粒化。收集上清液。使經溶離之蛋白質 在-2 0 °C下冷珠以供進一步分析。 免疫偵測 對於硝基纖維素上固定蛋白質之免疫偵測，藉由在室溫 或4 C下於TTBS(0.1 % Tween 20，Tris經緩衝生理食鹽水溶 液（TBS))中1小時培育墨點隔夜來阻斷蛋白質之非特異性 結合。第一抗體係在室溫下以TTBS中1〇叫/社之濃度使 用歷時2小時之時段。將墨點於TTBS中洗滌三次且以第二 抗體（與鹼性磷酸酶共軛之抗小鼠IgG抗體；Sigma)於TTBS 中稀釋為1:5000 ’接著在室溫下培育1小時。將墨點於 TTBS中洗滌三次且藉由以染色溶液覆蓋墨點經3分鐘之時 段以AP受質NBT/BCIP(Roche，1個錠劑溶解於1〇 mL純水 中）進行顯影。藉由將純水添加至墨點中來終止染色反 應。 測試方法1 :使用SH-SY5Y細胞說明RGM肽於神經突生長 檢定中之效應 134305.doc -90- 200916482 SH-SΥ5 Y細胞為人類神經母細胞瘤細胞。胚細胞瘤為在 組織及器官形成期間產生之胚胎腫瘤。胚細胞瘤細胞之起 源通常為不明的，此係因為在早期胚胎狀態中，許多細胞 之分化仍未成熟；亦即胚細胞瘤細胞為異質細胞群體。稱 為神經胚細胞之神經母細胞瘤細胞源自於來自自主神經組 織之神經脊（胚胎狀態之結構），且實際上在未成熟期停 滯。在此狀況下，細胞源自於神經上皮瘤細胞株SK-N-SH 之純系繼代培養物，該等細胞係於1970年於患神經母細胞 瘤轉移之4歲女孩骨髓活組織檢查中分離得之。 [http: "www.dsmz.de/human_and_animal_cell_lines] 811-8丫5丫細胞之培養基（丑€八(：(：第9403 03 04號） 250 mL 50% EBSS(Invitrogen) 250 mL 50% F12(Ham)NUT MIX + Glutamax I(Invitrogen) 50 mL 10% FBS(JRH BiosciencesX熱失活） 5 mL 1% NEAA(Sigma)(100x) 5 mL 1 %盤尼西林(penicillin)/鏈黴素(Invitrogen) 將培養基使用Nunc 500 mL過濾器無菌過濾且儲存在4°C 下之冰箱中直至使用。使用前，將培養基於水浴中加熱至 37。。。 SH-SY5Y細胞為於單層中缓慢黏著生長且從未達到 100%長滿（最大80%)之上皮神經元樣細胞。細胞培養物每 週兩次分裂1:3。將細胞分離需要在培育室中與胰蛋白酶 一起培育1-3分鐘。 由於此為仍未成熟之前驅細胞的群體，故可能使用視黃 酸分化細胞使得一定百分比之細胞獲得神經突樣延伸。為 此目的，視測試而定將培養物直接於培養皿或燒瓶中與10 134305.doc -91- 200916482 μΜ視黃酸一起於培養基中培育3天。 此外以hRGM Α片段塗覆微量滴定盤（96孔）（含有經膠原 蛋白I塗覆之盤）。以PBS洗滌兩次後，接種細胞。18_24小 時後，將培養物固定且染色。在定量分析中，將生長於 hRGM A片段上之SH-SY5Y細胞與單獨生長於膠原蛋白I上 之SH-SY5Y比較。自動量測細胞之神經突長度且將其用於 分析。 測試方法2 :使用NTera-2細胞說明RGM肽於神經突生長 測試中之效應 將人類多能性癌細胞株NTera2(DSMZ ACC527)建立為細 胞培養物模型。神經突自細胞聚集體生長且形成環繞特定 聚集體之神經突冠。 NTera-2細胞為人類胚胎畸胎癌細胞。癌瘤為癌性腫 瘤，而畸胎瘤或畸胎癌為由各種分化及未分化組織組成之 生殖細胞的混合性腫瘤，且因此與SH-SY5Y培養物相同， 包含異質群體。腫瘤通常以各種類型呈囊封形式存在，諸 如毛髮、皮膚、牙齒、肌肉及神經組織之腫瘤。腫瘤通常 源於卵巢、睪丸、腹腔或大腦。細胞株係自獲自22歲男性 白種人之轉移性畸胎癌的Tera-2細胞株選殖。 [http://de.wikipedia.org/wiki/] [http://www.dsmz.de/human_ and_animai_celi_lines] NTera-2細胞為形成單層之上皮黏著生長細胞。NTera-2 細胞由於其含有之較大數目之顆粒，故可易於自其他細胞 分化。以每週兩次1:5分裂來培養細胞。可對於神經元細 134305.doc -92- 200916482 胞使用視黃酸來分化此混合培養物之細胞。 生長用培養基 500 mL 杜貝科氏改質伊格培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM) 50 mL 10%FBS(熱失活） 10 mL 5%馬血清(HS)(熱失活） 將培養基使用Nunc 500 mL過濾器無菌過濾，且儲存在 4 °C之冰箱中直至使用。使用前，將培養基於水浴中加熱 至 37°C。 NTera-2之分化 為分化細胞，必需向細胞株培養基中引入抗生素，此係 因為細胞保留在相同培養瓶中歷時三週之事實。先前，已 使未分化之培養物脫胰蛋白酶且使用Neubauer計數室測定 細胞數。將2,500,000個細胞連同25 mL培養基一起轉移至 新培養瓶中。在弱光條件下再向培養基中添加25 pL視黃 酸（10 μΜ)。將培養物以等分試樣（1 0 M)儲存在冰箱中，且 在使用前在22°C下再懸浮於Thermomixer中。 用於分化之培養基 500 mL 杜貝科氏改質伊格培養基(DMEM) 50 mL 10%FBS(熱失活） 10 mL 5%馬血清(HS)(熱失活） 5 mL 1%盤尼西林/鏈黴素 將培養物儲存在37°C、5% C02充氣下之培育室中，且在 週始及週末改變培養基。隨時間進展細跑不再以單層形式 生長，而是形成無需光學顯微鏡輔助，以細胞層上光點形 式可見之小細胞凝集堆。為進一步培養，藉由吸出舊培養 基，以10 mL PBS洗滌，接著向視黃酸中添加25 mL新製培 134305.doc -93- 200916482 養基來更換培養基。三週後，細胞分化且備用於實驗。 NTera-2之培養盤塗覆 基於坨養皿之]^1^1<&_2細胞生長係藉由以聚丄·離胺酸/昆 布胺酸塗覆來促進。 將不同培養盤格式用於測試。對於分離蛋白質而言，6 孔坧養盤對於回收足夠數量而言為必需的。對於分離 及免疫螢光而言，24孔培養盤為適當的，而檢定主要係於 96孔培養盤中建立。如表中所*，對應於孔之容量使用不 同體積之塗料及洗液。 首先將聚死-離胺酸溶液（100 pg/mL)置放於孔中且在室 溫下培育15分鐘。接著將溶液吸出且將孔以pBs洗滌3次歷 時5-10分鐘。接著使用無菌Millipore水進行洗滌步驟。 洗條後’將昆布胺酸溶液（20 pg/mL)吸入孔中，且將培 養盤在37 C、5% C02充氣下於培育室中培育2小時。再次 以PBS洗條3次歷時5-1〇分鐘，且最後以具有或不具有盤尼 西林/鏈黴素之神經基質培養基置換PBs。 培養盤類型 聚-L-離胺酸或昆布胺酸 PBS 6孔 1 mL 2 mL 24孔 250 μί 500 pL 24孔+玻璃焙卷般 350 pL 500 μί 96孔 50 pL 100 μί 使用NTera-2使神經突外生長 分化3週後，使培養物於6個培養瓶中1:6分裂，以便選 擇神經元細胞。此時，培養基不再與視黃酸組合。在其後 兩天内及在第三天收集細胞，且神經元細胞已較佳地沈降 於其他非神經元細胞上，但並不黏著得太強以便使其可易 134305.doc -94- 200916482 於作為頂層被敲落。為此目的’將培養基移除且以約1〇 mL PBS洗滌，並向燒瓶中再添加1〇机pBs。在側面輕拍 瓶時細胞逐漸自基質移開。“，由於非神經元細胞應保 持黏著，故視覺檢查有時係在光學顯微鏡下進行。神經元 細胞係由其明亮發光之邊緣及完全球形之形狀而被鑑別。 若神經元細胞過穩固地生長，則其在被敲落後之較短時間 内保留神經突。將3個燒瓶各自中之PBS細胞溶液於5〇 mL 離心管中組合且將細胞在室溫下在1〇〇〇 rpm下離心5分 鐘。接著將上清液吸入2個試管中，且將離心塊再懸浮於 1〇 mL神經基質培養基中，亦即組合成1〇 mL。使用 Neubauer計數室來測定細胞數。神經基質培養基為用於進 一步培養先前分化之NTera-2細胞之專門培養基。 培養基 100 mL 神經基質培養基υ 2 mL 2%Β27補充劑 1 mL 1% 2 mM L-麵胺酿胺 1 mL 1 %盤尼西林/鏈徵素 υ神經基質培養基（Gibco/Invitrogen 211 03-049) 使用分化NTera-2形成聚集體 為形成細胞聚集體，在細胞計數測定後，將溶解於神經 基質培養基中之經敲落分化細胞（參見先前部分）以神經基 質培養基稀釋至每毫升約I百萬個細胞之濃度。將2〇爪[之 此細胞懸浮液轉移至無菌100 mL拋棄式震盪燒瓶中且在恆 定攪拌下，在37°C及5% C02充氣下於培育室中培育隔夜。 重要的是不超過20 mL之體積，此係因為否則不能發生液 134305.doc •95· 200916482 體之旋轉且細胞不能形成令人滿意的聚集體。 將以聚離胺酸/昆布胺酸塗覆之96孔培養盤另外以hRGM A片段塗覆。以PBS洗滌2次後，接種NTera聚集體。18-24 小時後，將培養物固定且染色。在定量分析中，將生長於 hRGM A片段上之NTera聚集體與單獨生長於聚離胺酸/昆 布胺酸上之NTera聚集體比較。根據Lingor等人（J. Neurochem, 2007，以電子形式公開）所述之方法自動量測 NTera聚集體之神經突長度。 藉由添加不同濃度之待測試物質來分析RGM肽及片段之 抑制效應。或者，以受質形式來提供RGM片段。 測試方法3 : RGM A新生素結合測試 a) 材料. • 免疫培養盤：Cert. MaxiSorp F96(Nunc，439454) • 重組人類 RGM A, R&D Systems; Prod. # 2495-RM(260 pg/mL) • 重組人類新生素-Fc，Abbott; Ludwigsnafen(ALuT 1514/122 ; 425 pg/mL) • 與過氧化酶共軛之親和力純化小鼠抗人類IgG-Fc片段 AK(Jackson Immuno Research，代號：209-035-098(0.8 mg/mL)) • 顯影劑受質：ImmunoPure TMB受質套組（Pierce, # 34021) • 硫酸（Merck # 4.803 54.1000) b) 方法： 134305.doc -96- 200916482 1. 將RGMA與免疫培養盤結合： • 50 mM Na2C03 中之2,5 pg/mL RGM A(R&D)(每孔 50微 升） • 在37°C下培育1小時 2. 洗滌步驟： • 以PBS/0.02% Tween 20(每孔100微升）洗滌3次 3. 阻斷非特異性結合位點 • 以PBS/0.02% Tween中之3% BSA(每孔200微升）阻斷 • 在37°C下培育1小時 4. 新生素結合： • 添加1% BSA PBS/0.02% Tween中稀釋之新生素（初始 濃度為1 pg/mL) • 在37°C下培育1小時 5. 洗滌步驟： • 以 PBS/0.02% Tween 20(每孔 100 pL)洗滌 3次 6. 經結合新生素之抗體偵測 • 添加與HRP結合之小鼠抗人類IgG-Fc片段AK(PBS/1% BSA中1:2500稀釋）(每孔50微升） • 在37°C下培育1小時 7. 洗滌步驟： • 以PBS/0.02% Tween 20洗滌3次（每孔100微升） 8. 顯影 • 添加每孔50微升顯影受質（ImmunoPure TMB substrate, Pierce) 134305.doc -97- 200916482 • 在室溫下培育1-30分鐘 • 使用每孔50 μΐ^ 2.5 M H2S04中止反應 測試方法4 :用以測定RGMA與BMP-2及BMP-4之間之相 互作用的活體外相互作用測試 相互作用測試係如下所述進行： 變型A :固定BMP-2或BMP-4蛋白質且偵測各種RGMA-Fc 融合蛋白之結合 1. 培養盤： • Immunoplate Cert. MaxiSorp F96(Nunc, 439454) 2. 塗覆： 重組人類 BMP-2，目錄號：355-BM, Company: R&D Systems ; 重組人類 RGM A，R&D Systems; Prod. # 2495-RM，或 重組人類 BMP-4，目錄號：314-BM，Company: R&D Systems ;
• 濃度：10 pg/mL .?
I • 所使用之體積：Na2C〇3中2.5 pg/mL ;添加：每孔50 微升 • 在濕室中在37°C下1小時 3. 洗滌步驟： • 以 PBS/0.02% Tween 20洗滌 3 次 4. 阻斷： • PBS/0.02% Tween 中 3% BSA，在濕室中在 37°C 下 1 小 時；添加：每孔200微升 134305.doc -98- 200916482 5. RGMA肽： RGMA-Fc片段， • 1 Kg/mL初始濃度，接著使用PBS/0.02% Tween20稀釋 為1:2 • 在室溫下培育1小時 • 在濕室中在37°C下1小時 6. 洗滌步驟： • 以 PBS/0.02% Tween 20洗滌 3 次 7. 抗體： 生物素抗人類Fc(R&D-Systems)，目錄號：709065 ; 1 mg/mL ； • 0.6% BAS/PBS-T(0.02% Tween)中 1:200 • 添加：每孔50微升 • 在濕室中在37°C下1小時 8. 第二抗體：Strep. POD(Roche);目錄號：1 1089153001 • 500 U ; 0.6% BAS/PBS-T(0.02% Tween)中 1:5000 • 添加：每孔50微升 • 在濕室中在37°C下1小時 9. 洗滌步驟： • 以 PBS/0.02% Tween 20洗滌 3次 i 0.受質：
ImmunoPure TMB受質套組；Pierce，# 34021 • 顯影時段：約1-30分鐘 • PBS/0.02% Tween 20之1:1混合物；添加：每孔50微升 134305.doc -99- 200916482 11.停止： • 2.5 M H2S04 ;添加：每孔50微升 變型B :固定各種RGMA-Fc融合蛋白且偵測BMP-2或 BMP-4蛋白質之結合 1. 培養盤：
Immunoplate Cert. MaxiSorp F96(Nunc, 439454) 2. 塗覆： RGMA-Fc 片段 • 所使用之體積：Na2C03中2.5 pg/mL ;添加：每孔50 微升 • 在濕室中在37°C下1小時 3. 洗滌步驟： • 以 PBS/0.02% Tween 20 洗滌 3 次 4. 阻斷： • PBS/0.02% Tween 中 3% BSA，在濕室中在 37°C 下 1 小 時 ' · 添加：每孔200微升，培育：在濕室中在37°C下1小時 5. BMP肽： 重組人類 BMP-2，目錄號：355-BM, Company: R&D Systems ;或 重組人類 RGM A, R&D Systems ; Prod. #2495-RM， 重組人類 BMP-4，目錄號：314-BM, Company: R&D Systems ；
各情況下之濃度：10 pg/mL 134305.doc -100- 200916482 稀釋步驟：在各情況下，以PBS/0.02°/。Tween 20以1:2稀釋 6. 洗滌步驟： • 以 PBS/0.02% Tween 20洗蘇 3次 7. 抗體： 抗人類BMP-4生物素抗體；目錄號：BAM75 72，1% BSA-PBS-T 中 1:200 8. 洗滌步驟： • 以 PBS/0.02% Tween 20洗蘇 3 次 9. 第二抗體：
Strep. POD(Roche) 目錄號：1 1089153001 ； 500 U ； 0.6% BAS/PBS-T(0.02°/〇 Tween)中 1:5000 • 添加：每孔50微升 • 於濕室中在37t：下1小時 10. 洗滌步驟： • 以 PBS/0.02。/。Tween 20洗滌 3次 " 11.受質：
ImmunoPure TMB受質套組；（Pierce, # 34021) • 顯影時段：約1-30分鐘 • PBS/0.02% Tween 20之1:1混合物；添加：每孔50微升 12.停止： • 2.5 M H2S04 ;添加：每孔50微升 變型C :藉由MAB 4A9抑制全長人類RGM A與BMP-4之 結合 134305.doc -101 - 200916482 1. 培養盤：Immuno Plate Cert. Maxi Sorp F96(Fa.NUNC, 439454) 2. 塗覆： 重組人類BMP-4，目錄號：314-BP 來源：R&D Systems 濃度：1 〇 pg/ml 所使用之體積：Na2C03中2.5 pg/ml/每孔50微升 在濕室中在37°C下培育1 h 3. 洗滌：以 PBS/0.02% Tween 20洗滌 3次 4. 阻斷：PBS/0.02% Tween中3% BSA，在濕室中在37°C下 培育1 h ;每孔200微升 5. hRGM A ： # 788 RGMA (47-422) 290 pg/ml ALU 2821/1 17 11.12.07 片段 0.5 pg/ml恆定（50 μΐ) + MAB4A9 起始濃度：10 pg/mi，1:2稀釋（50 μΐ) 6. 洗滌：3xPBS/0.02% Tween20 7. 第一偵測抗體： 生物素抗人類Fc 1 mg/ml
Jackson Immuno Research(目錄號：709-065-149) 於 1.5% BSA/PBS-T 中以 1:1000稀釋，每孑L75 μΐ 在濕室中在37°C下培育1 h 8. 洗蘇：以 PBS/0.02% Tween20洗蘇 3次 9. 第二偵測工具： 134305.doc -102- 200916482 與抗生蛋白鏈菌素偶合之過氧化酶（Roche)
目錄號：11089153001，500 U 1.5% BSA/PBS-T 中 1:5000(0.02% Tween) 每孔75微升 在濕室中在37°C下培育1 h 10. 洗滌：以 PBS/0.02% Tween 20 洗滌 3 次 11. 受質：Immuno Pure TMB 受質套組（Pierce,#34021) 顯影時間：1 -30 min 1:1混合 12. 停止：2.5 M H2S04 2.產生實例 產生實例1 :於哺乳動物細胞中產生RGM A蛋白質片段 對於活性RGMA之表徵而言，使以下RGMA分子以Fc融 合蛋白形式表現於哺乳動物細胞（HEK293)中： - 41-168/Xa ； - 47-90 ； - 47-168 ； - 316-386 ； - 1-450 。 為此目的，選殖編碼特定分子至載體pcDNA3.1(+)Zeo IgK/Xa/hlgG λ he 257-Stop) x Hindlll/EcoRI/ 磷酸酶 (Invitrogen)中之DNA。為此目的，使用PCR由RZPD純系 (純系 AL136826(DKFZp434D0727);公開之RZPD序列： BC015886、AL136826)擴增編碼特定片段區之DNA。為此 目的，使用源自所公開RGMA序列（經公開序列： 134305.doc -103 - 200916482 NM_020211)之下列寡核苷酸引子。 在各情況下，針對上述RZPD純系pSport-1 DKFZp434D0727，使用此等引子及AccuPrime聚合酶進行 PCR。在純化PCR產物、以Hindlll/EcoRI消化且溶離所得 條帶後，將所需片段接合於pcDNA3.1(+)Ze〇 IgK/Xa/hlgG λ he 257-Stop) x Hindlll/EcoRI/磷酸酶中。使用所獲得之 產物來轉化NEBTurbo細胞（Invitrogen)或TOP10細胞 (Invitrogen)。藉助於定序檢驗所得純系之所獲得序列的正 確性。 41-168/Xa ： AM 131 ： GGGGAAGCTT7TCCCCGCAGCCACCTCC(SE〇 ID NO: 17) (以胺基酸起始之hRGMA正義引子）；具有 Hindlll區段之 AM 132 ： GGGGGAATTCAAACGACCTTCGAT(7rCCCCG AAGAGGCCACAGTG(SEQ ID NO: 18) hRGMA反義引子直至具有因子Xa及EcoRI介面 之胺基酸2)26« 轉化為NEBTurbo細胞； 質體名稱：pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGMA 41-168/Xa/Xa/ hlgG λ he 257-Stop(無 att) 47-90 ： AM 169 ： GGGGAAGCTTCCGTGCAAGATCCTCAAGTG CAAC(SEQ ID NO: 19) 1343051.doc -104- 200916482 以具有Hindlll區段之胺某醢iM 7忐始之hRGMA 正義引子 AM 171 ： CCCCGAATTCAAGGCCGTCCGCCGCGCSEQ ID NO: 20) hRGMA反義引子直至具有EcoRI介面之胺基酸 A90 轉化為TOP10細胞，實驗室期刊（Laboratory journal) ALU2163/5 質體名稱：pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGMA 47-90/Xa/hIgG λ he 257-Stop(無 att) 47-168 ： AM 169 : GGGGAAGCTTCCGTGCAAGATCCTCAAGTGC AAC(SEQ ID NO: 19) 以具有Hindlll區段之胺基酸7起始之hRGMA 正義引子 AM 175 ： CCCCGAATTCAAGrCCCCGAAGAGGCCACAG TG(SEQ ID NO: 21) hRGMA反義引子直至具有EcoRI介面之胺基酸 D168 轉化為TOP 10細胞， 質體名稱：pcDNA3.1( + )Zeo IgK/hRGMA 47-i68/Xa/hIgG λ he 257-Stop(無 att) 316-386 ：
AM 181 ： GGGGAAGCTTCTGCGGGGCTGCCCCC(SEQ 134305.doc -105- 200916482 ID NO: 22) 以具有Hindlll區段之胺基酸U26起始之 hRGMA正義引子 AM 182 ： CCCCGAATTCAAGCCCGTGGTGAGGAGGTCG (SEQ ID NO: 23) hRGMA反義引子直至具有EcoRI介面之胺基酸 G386 轉化為TOP10細胞， 質體名稱:pcDNA3.1(+)Zeo IgK/hRGMA 166-386/Xa/ hlgG λ he 257-Stop(無 att) 1-450 ：
Mey 744 ： ATGCAGCCGCCAAGGGAGAG(SEQ ID NO: 24) 具有起始jrC之hRGMA引子
Mey 745 ： GCAGAACACAGGGAGCAGGGC(SEQ ID NO: 25) hRGMA反義引子直至胺基酸無停止） 為比較目的，使用額外RGMA以類似方式產生以下Fc融 合蛋白，然而其產生不單獨描述： - 266-284 ； - 70-120 ； - 110-169 ； - 169-422 ； - 266-335 ； 134305.doc -106- 200916482 - 47-422 Myc His ° 以質體轉染HEK293F細胞（DSMZ號ACC 3 05)，且如上所 述分離所表現之融合蛋白。 使用上述方法進行蛋白質分析及濃度測定。 3.工作實例
工作實例1 :關於BMP-4之活艎外相互作用檢定；比較各 種RGMA片段與RGMA 所測試之融合蛋白： RGMA-Fc 47-168-Fc ("片段0") 218-284-Fc (”片段2") 266-335-Fc (”片段3Π) 169-422-Fc ("片段6”） 測試係以融合蛋白（1 mg/mL)固定，根據以上測試方法4 變型B進行。使用抗BMP-4生物素抗體偵測BMP-4之結 合。 將結果圖示於圖3中。除令人驚奇地與47-168片段之較 顯著結合以外，亦觀測到BMP-4與RGMA之顯著結合。
工作實例2 :關於BMP-4及BMP-2之活艎外相互作用檢 定；比較RGMA片段47-168與RGMA 所測試之融合蛋白： RGMA-Fc 47-168-Fc ("片段0”） 測試係以融合蛋白（1 mg/mL)固定，根據以上測試方法4 134305.doc -107- 200916482 變型B進行。分別使用抗BMP-4及抗BMP-2生物素抗體來 偵測BMP-4及BMP-2之結合。 將結果圖示於圖4中。除令人驚奇地與47-168片段之較 顯著結合以外，亦觀測到BMP-4及BMP-2與RGMA之顯著 結合。在各情況下，BMP-2與BMP-4大致同等強烈地被結 合。 工作實例3 :關於BMP-4之活體外相互作用檢定；比較各 種RGMA片段 所測試之融合蛋白： 47-90-Fc (#785) 47-168-Fc (#786) 316-386-Fc (#790) 169-422-Fc (#769) 70-120-Fc (#779) 110-169-Fc (#780) 266-335-Fc (#789) 47-422Myc-HIS (#801) 測試係以BMP-4(1 mg/mL)固定，根據以上測試方法4變 型A進行。使用抗人類Fc或抗Myc抗兔（Invitrogen)抗體偵 測融合蛋白之結合。 將結果圖示於附圖5中。 觀測到本發明片段# 785、# 786及# 790之顯著濃度依賴 性結合，其中# 786結合最強烈。 工作實例4 :關於BMP-4之活體外相互作用檢定；比較各 134305.doc -108- 200916482 種結合RGMA片段 所測試之融合蛋白· 47-90-Fc (#785) 47-168-Fc (#786) 316-386-Fc (#790) 測試係以BMP-4( 1 mg/mL)固定，根據以上測試方法4變 型A進行。使用抗人類抗體來偵測融合蛋白之結合。 將結果圖示於圖6A、B及C中。結果確證例示性實施例3 之觀測結果。 工作實例5 :於神經織維生長測試中研究合成RGM A片段 在神經突生長測試（參見以上測試方法1及2)中，使用人 類NTera神經細胞或人類SH-SY5Y細胞來測試根據產生實 例1產生之以下所列RGMA片段之抑制活性： 47-168-Fc (#786) 316-386-Fc (#790)。 將結果圖示於圖7A(關於SH-S Y5 Y)及7B(關於NTera) 中 。 47-168-Fc(#786)展示顯著較高之活性。 明確參考本文說明部分中所引用之文獻之揭示内容。 工作實例6:與hRGM A片段47 - 168結合之單株抗體4A9 之產生及表徵 除非另有說明，否則應用抗體產生及表徵之標準方法。 a)產生及免疫墨點法 以全長人類RGM A蛋白質使大鼠免疫。 134305.doc -109- 200916482 將Sprague-Dawley大鼠以人類RGM A免疫且皮下加強注 射。以完全弗氏佐劑中25 pg之初始注射及不完全弗氏佐 劑中25 pg之加強注射為開始，每3週對動物進行注射。在 融合前四天對選定用於融合之大鼠皮下注射生理食鹽水中 之25 pg h RGM A。移取經免疫動物之脾且製備單細胞懸 浮液。自培養物收集SP2/0骨髓瘤細胞且加以洗滌。使用 標準技術（Kohler及Mil stein, 1 97 5)將脾細胞與腫瘤細胞以 5:1之比率混合且使用50% PEG 3000來融合。將融合細胞 以每孔2.5XI05個脾細胞之密度接種於96孔培養盤中之選擇 性培養基中。將融合物在37°C下培育7-10天。當觀測到宏 觀群落時，移出上清液且以hRGM A ELIS A測試。 藉由限制稀釋法來次選殖產生具有所需特徵之mAb之融 合瘤。使用經hRGM A轉染之HEK 293細胞，藉由ELISA及 FAC檢定含次純系之上清液與hRGM A之結合。 在使用全長人類RGM A及其段篩檢融合瘤後，分離 厘八8 4?9，此係因為在西方墨點圖（圖8八）上其識別片段47-168(色帶5)。此抗體在固相ELISA檢定中阻斷BMP-4與全 長人類RGM A之相互作用（圖8B)。 b) 4 A9之抗原決定基定位 抗體固定： 為精確地描述MAB 4A9之抗原決定基，進行抗原決定基 定位實驗。為此目的，使4A9與經CNBr活化之瓊脂糖樹脂 結合。向20 mg瓊脂糖樹脂中添加缓衝劑A( 100 mM NaHC03，500 mM NaCl，pH值為 8)中之約 5-6 nmol 4A9溶 134305.doc -110- 200916482 液（141 pL 5.76 mg/ml)，且在室溫下加以混合4 h。在將抗 體共扼樹脂以緩衝劑B(l〇〇 mM NaHC03，1〇〇 mM NaCl， PH值為8)洗滌三次後，將hRGM a片段47-168 fc( 1.1 8 mg/ml，1.5 nm〇l)與2〇〇 緩衝劑B一起添加至樹脂中。將 混合物在4°C下於旋轉器上培育隔夜。將含有抗體4A9及抗 原hRGM A 47-168之樹脂以緩衝劑B洗滌三次且用於使用 胰蛋白酶之抗原決定基切除。 抗原決定基切除： 為此目的，將含MAB及抗原之樹脂懸浮於200 μί緩衝劑 Β 中。將 20 pg騰蛋白酶（promega，Madison WI)以 0.1 pg/μΐ 之濃度溶解於200 μΐ再懸浮緩衝劑（5〇 mM HOAc)中。分別 使用0.6 及0.35 胰蛋白酶，以ι:1〇〇及1:200酶：抗原比 率（w/w)進行抗原裂解。於gc烘箱中在37°C下在旋轉下進 行反應歷時7.5小時。消化後，將樹脂以緩衝劑b洗滌2 次。 抗原決定基釋放： 藉由以三份200 μΐ等分之2〇/0曱酸洗滌樹脂來釋放仍與 ΜΑΒ結合之剩餘抗原肽，且分別收集各溶離部分（溶離物 1、2及3)。預期所溶離之部分含有構成μαΒ 4Α9抗原決定 基之肽。 藉由質譜分析（MS)進行之肽分析：
在脫鹽後’使來自胰蛋白酶消化之經溶離部分經受質譜 分析。基質輔助雷射脫附（MALDI)MS
Pro(Applied Biosystems，Foster City，CA)使用 a-氰基-4-羥 134305.doc -Ill 200916482 基肉桂酸（CHCA)基質（飽和，在50%乙腈中，0.3% TFA)進 行。使用 Agilent 6510 QTOF MS 來進行 LC-ESI-MS/MS。 使用8 μΐ注射液，且對滿足指定MS信號標準之前3個離子 進行 MS/MS。使用 MASCOT(Matrix Science)搜尋資料，然 而大多數資料係手動解譯的。 儘管所有洗滌液及溶離物部分最初係以LC-MS/MS分析 且許多係藉由MALDI-MS分析，但所獲得之資料對應於溶 離物1部分。 結果： 在胰蛋白酶抗原決定基切除實驗之溶離物1部分中，鑑 別hRGM A片段47-168之肽50-89及96-126。人類RGM A中 MAB 4A9肽之定位係展示如下。以粗體標示hRGM A之片 段47-168。對鑑別為經MAB 4A9保護之肽之兩個肽加下劃 線。精確的抗原決定基可定位於此等肽中之一者内，其他 肽係經由雙硫鍵連接。 >hRGMA-NP_064596
MQPPRERLWTGRAGWMGMGRGAGRSALGFWPTLAFLLCSFPAATSPCKILKCNSEF
WSATSGSHAPASDDTPEFCAALRSYALCTRRTARTCRGDIAYHSAVHGIEDLMSQHN
CSKDGPTSQPRLRTLPPAGDSQERSDSPEICHYEKSFHKHSATPNYTHCGLFGDPHL
RTFTDRFQTCKVQGAWPLIDNNYLNVQATNTPVLPGSAATATSKLTIIFKNFQECVD
QKVYQAEMDELPAAFVDGSKNGGDKHGANSLKITEKVSGQHVEIQAKYIGTTIWRQ
VGRYLTFAVRMPEEWNAVEDWDSQGLYLCLRGCPLNQQIDFQAFHTNAEGTGARRL
AAASPAPTAPETFPYETAVAKCKEKLPVEDLYYQACVFDLLTTGDVNFTLAAYYALE
DVKMLHSNKDKLHLYERTRDLPGRAAAGLPLAPRPLLGALVPLLALLPVFC C)經由肽掃描進行之抗原決定基定位 使用跨越區域51-168、15個胺基酸長度之嵌套重疊肽來 鑑別MAB 4A9之抗原決定基。藉由ELISA來評定肽之結 112· 134305.doc 200916482 合，且為此，將聚苯乙烯培養盤以肽塗覆。接著以MAB 4A9來探測肽，且使用過氧化酶共軛抗大鼠fc抗體及TMB 受質藉由ELISA來觀測結合。 觀測MAB 4A9之一個反應性肽且將此肽展示如下。 51 LKCNSEFWSA TSGSHAPASD DTPEFCAALR SYALCTRRTA RTCRGDLAYH SAVHGIEDLM SQHNCSKDGP TSQPRLRTLP PAGDSQERSD SPEICHYEKS FHKHSATPNY THCGLFGD 168 MAB 4A9與以粗體加下劃線字母突出之肽結合。此肽位 於胺基酸60-80内且與藉由抗原決定基切除及質譜分析鑑 別之肽中之一者相當一致。 工作實例7 :使用BRE-Luc檢定來評估h RMG A對BMP信 號轉導之促效或拮抗效應 a) 材料 • 以200 pg/ml來提供三種化合物： 片段# 785 ; 片段# 786及 片段# 788(IgK/hRGM A 47 - 422/Xa裂解位點/Fc)。 • 重組h BMP-2(來自CHO細胞；#355-BM)及單株抗人類 BMP2/4抗體（#MAB3552)係獲自 R&D Systems Europe， Lille，France。 • Bright-Glo榮光素酶檢定套組係購自Promega。 b) 細胞培養： 將 BMP 反應性 C3H10-B12(Logeart-Avramogl〇u D， Bourguignon Μ，Oudina K，Ten Dijke P，Petite Η，An assay for the determination of biologically active bone 134305.doc -113 - 200916482 morphogenetic proteins using cells transfected with an inhibitor of differentiation promoter-luciferase construct. Anal Biochem 2006;349:78-86)以每平方公分4xl04個細胞 之密度塗覆於96孔培養盤中，且在加濕、37°C、5% C02/95°/〇空氣環境下於BME(BME =伊格氏基本培養基）(補 充有10% FBS)中培養24 h。將細胞以PBS沖洗兩次且在含 有各所測試AS化合物或抗人類BMP2/4抗體（0.01至1〇,〇〇〇 ng/ml)、不具有或具有 rhBMP-2(50 ng/ml)之 BME/0.5% (w/v)BSA下培養24 h，隨後檢定所含螢光素酶活性。所有 實驗係以一式三份進行且在兩個獨立時間下重複。 C)結果： 在固相£1^18入實驗中，^[八8 4八9完全防止全長人類尺(31^ A與BMP-4結合，此構成如下之明證：存在於人類 RGM A片段内之4A9域對於與BMP-4相互作用而言為重要 的。 在細胞檢定中，將在以不同濃度（0至5〇 ng/ml)<rhBMp_ 2處理C3H-B12後產生之螢光素酶活性的劑量依賴性反應 展示於圖9中。 使用BRE-Luc檢定藉由將C3H_B12暴露於不同濃度之測 試化合物歷時24小時且監控各別細胞螢光素酶活性之變化 來測定所測試多肽對BMP信號轉導之促效效應（圖1〇)。三 種所測試化合物中之任一者均猶古钵旅放+ φ ^
當與 rhBMP-2(50 BMP-2誘發之螢光素 134305.doc 114· 200916482 在使用10 pg/ml化合物時展現達到rhBMP-2誘發之活性之 88%及93%抑制的螢光素酶活性劑量依賴性抑制。片段# 78 6及#7 8 8展示與用作61^1?-2拮抗劑對照之抗1'116河？-2抗體 類似之抑制效應。對於片段#786及#788及抗BMP-2 Ab而 言，50%抑制（ED50)值之等效劑量分別為100 ng/ml、約80 ng/ml及約 50 ng/ml。 d)結論. 測試化合物不獨立地誘發BMP信號轉導路徑且因此不能 被認為是BMP促效劑。相對而言，當與rhBMP-2組合時， 其中之兩者（片段#786及#788)以劑量依賴性方式抑制 rhBMP-2誘發之活性。該等化合物與BMP-2蛋白質之複合 物形成會損害BMP-2與細胞膜受體之結合且隨後防止BMP 介導之信號轉導。然而，考慮用於此實驗之細胞模型，無 法排除測試化合物對BMP-2信號轉導路徑之直接胞内抑制 效應。 134305.doc -115- 200916482 p* Γ\ (糾与 όζαι bws^^o^^goTol^WSI-s^n^^vwo^'DII^IV^ :p. 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圖8A展不關於單株抗體4A9之免疫墨點實驗結果。MAB 134305.doc -120- 200916482 4A9識別人類RGM A片段47-168(色帶5)。4八9亦與額外 hRGM A片段70-120(色帶2)及片段47-90(色帶4)結合且識 別全長hRGM A(47-422)(色帶6及9)。以色帶1指示分子量 標準。圖8B展示ELISA實驗之結果，其中全長hRGM A與 hBMP-4之相互作用以劑量依賴性方式為MAB 4A9所完全 抑制。 圖9展示在以不同濃度之rhBMP-2(0至50 ng/ml)處理 C3H-B 1 2後所產生的螢光素酶活性之劑量依賴性反應。 圖10展示如藉由將C3H-B 12暴露於不同濃度之測試化合 物歷時24小時且監控各別細胞螢光素酶活性之變化所測 定，使用BRE-Luc檢定hRGM A之肽片段對BMP信號轉導 之拮抗效應。 134305.doc • 12】- 200916482 序列表 <110>德商亞培公司 <120>排斥性導引分子(RGM)蛋白質家族之蛋白質之骨形態發生蛋白(BMP)·結合區域及其功能性片段及 其用途 <130> M/48272 <140> 097134226 <141> 2008-09-05 <150> 07115856.2 <151> 2007-09-06 <160> 27 <170> Patent In version 3.3 1135^ <210> <211> <212> <213> <220> <221> CDS <222> (1)..(1353) <400> 1 atg cag ccg cca agg gag agg eta gtg gta aca ggc ega get gga tgg 48
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Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro 20 25 30 acc etc gee ttc ett etc tgc age ttc ccc gca gee acc tee ccg tgc 144
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Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly lie Glu Asp Leu Met Ser Gin 100 105 110 cac aac tgc tee aag gat ggc ccc acc teg cag cca ege ctg ege aeg 384
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Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu He 130 135 140 tgc cat tac gag aag age 111 cac aag cac teg gee acc ccc aac tac 480
Cys His 丁yr 6lu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr 145 150 155 160 ai：g ca。i ic ggg gac cca cac clc agg ac‘i i tc acc gac 528
Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp 165 170 175 ege ttc cag acc tgc aag gtg cag ggc gee tgg ccg etc ate gac aat 576
Arg Phe Gin Thr Cys Lys Val Gin Gly Ala Trp Pro Leu lie Asp Asn 180 185 ]90 aat tac ctg aac gtg cag gee acc aac aeg cct gtg ctg ccc ggc tea 624
Asn Tyr Leu Asn Val Gin Ala Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser 195 200 205 134305-序列表.doc 200916482 \ £Cg gcc act gcc acc age aag etc acc ate ate t tc aag aac ttc cag 672 Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr lie lie Phe Lys Asn Phe Gin 210 215 220 gag tgt gtg gac cag aag gtg tac cag get gag atg gac gag etc ccg 720 Glu Cys Val Asp Gin Lys Val Tyr Gin Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro 225 230 235 240 gcc gcc tie gtg gat ggc tet aag aac ggt ggg gac aag cac ggg gcc 768 Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala 245 250 255 aac age ctg aag ate act gae aag gtg tea ggc cag cac gtg gag ate 816 Asn Ser Leu Lys lie Thr Glu Lys Val Ser Gly Gin His Val Glu He 260 265 270 cag gcc aag tac ate ggc acc acc ate gtg gtg ege cag gtg ggc ege 864 Gin Ala Lys Tyr lie Gly Thr Thr lie Val Val Arg Gin Val Gly Arg 275 280 285 tac ctg acc ttt gcc gtc ege atg cca gag gaa gtg gtc aat get gtg 912 Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val 290 295 300 gag gac tgg gac age cag ggt etc tac etc tgc ctg egg ggc tgc ccc 960 Glu Asp Trp Asp Ser Gin Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro 305 310 315 320 etc aac cag cag ate gac t tc cag gcc t tc cac acc aat get gag ggc 1008 Leu Asn Gin Gin lie Asp Phe Gin Ala Phe Hi s Thr Asn Ala Glu Gly 325 330 335 acc ggt gcc ege agg ctg gca gcc gcc age cct gca ccc aca gcc ccc 1056 Thr G】y Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro 340 345 350 gag acc t tc cca tac gag aca gcc gtg gcc aag tgc aag gag aag ctg 1104 Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu 355 360 365 ccg gtg gag gac ctg tac lac cag gcc tgc gtc t tc gac etc etc acc 1152 Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gin Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr 370 375 380 aeg ggc gac gtg aac t tc aca ctg gcc gcc tac tac geg ttg gag gat ]200 Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu G5u Asp 385 390 395 400 gtc aag atg etc cac tee aac aaa gac aaa ctg cac ctg tat gag agg 1248 Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg 405 410 415 act egg gac ctg cca ggc agg geg get geg ggg ctg ccc ctg gcc ccc i29o Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro 420 425 430 egg ccc etc ctg ggc gcc etc gtc ccg etc ctg gcc ctg etc cct gtg 1344 Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Aia Leu Leu Pro Vat 435 440 445 tie tgc tag 1353 Phe Cys 450 <210> 2 <211> 450 <212> PRT <2n>智人 <400> 2
Met Gin Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp 15 10 15 134305-序列表.doc 200916482
Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro 20 25 30
Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys 35 40 45
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Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp 85 90 95
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Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu lie 130 135 140
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Arg Phe Gin Thr Cys Lys Val Gin Gly Ala Trp Pro Leu lie Asp Asn 180 185 190
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Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr lie He Phe Lys Asn Phe Gin 210 215 220
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Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala 245 250 255
Asn Ser Leu Lys lie Thr Glu Lys Val Ser Gly Gin His Val Glu He 260 265 270
Gin Ala Lys Tyr lie Gly Thr Thr lie Val Val Arg Gin Val Gly Arg 275 280 2S5
Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val 290 295 300
Glu Asp Trp Asp Ser Gin Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro 305 310 315 320 134305-序列表.doc 200916482
Leu Asn Gin Gin lie Asp Phe Gin Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly 325 330 335
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Phe Cys 450 <210> 3 <211> 1437 <212> DNA <213>智人 <220>
<221> CDS <222> (1)..(1437) <400> 3 atg ata agg aag aag agg aag cga age geg ccc ccc ggc cca igc ege
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Leu Gly Leu Leu His Ala Gly Asp Cys G3n Gin Pro Ala Gin Cys Arg 85 90 95 ate cag aaa tgc acc aeg gac tic gtg tcc ctg act tet cac ctg aac lie Gin Lys Cys Thr Thr Asp Phe Val Ser Leu Thr Ser His Leu Asn 4- 48 96 144 192 240 288 134305-序列表.doc 336 200916482 100 105 no tct gcc gti gac ggc m gac tct gag ttt tgc aag gcc tig cgt gcc 3S4 Ser Ala Va) Asp Gly Phe Asp Ser Glu Phe Cys Lys Ala Leu Arg Ala 115 120 125 tat get ggc tgc acc cag ega act tea aaa gcc tgc cgt ggc aac ctg 432 Tyr Ala Gly Cys Thr Gin Arg Thr Ser Lys Ala Cys Arg Gly Asn Leu 130 135 140 gta tac cat tct gcc gtg ttg ggi ate agt gac etc atg age cag agg 480 Val Tyr His Ser Ala Val Leu Gly lie Ser Asp Leu Met Ser Gin Are 145 150 155 160 aat tgt tcc aag gat gga ccc aca tcc tct acc aac ccc gaa gtg acc 528 Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Ser Thr Asn Pro Glu Val Thr 165 170 175 cat gat cct 【gc aac tat cac age cac get gga gcc agg gaa cac agg 576 His Asp Pro Cys Asn Tyr His Ser His Ala Gly Ala Arg Glu His Arg 180 185 190 aga ggg gac cag aac cct ccc agt tac ett Itt tgt ggc ttg ttt gga 624 Arg Gly Asp Gin Asn Pro Pro Ser Tyr Leu Phe Cys Gly Leu Phe Gly 195 200 205 gat cct cac etc aga act ttc aag gat aac ttc caa aca tgc aaa gta 672 Asp Pro Hi s Leu Arg Thr Phe Lys Asp Asn Phe Gin Thr Cys Lys Val 210 215 220 gaa ggg gcc tgg cca etc ata gat aat aat tat ett tea gtt caa gtg 720 Glu Gly Ala Trp Pro Leu lie Asp Asn Asn Tyr Leu Ser Val Gin Val 225 230 235 240 aca aac gta cct gig gtc cct gga tcc agt get act get aca aat aag 768 Thr Asn Val Pro Val Val Pro Gly Ser Ser Ala Thr Ala Thr Asn Lys 245 250 255 ate act att ate ttc aaa gcc cac cat gag tgt aca gat cag aaa gtc 816 lie Thr He Ile Phe Lys Ala His His Glu Cys Thr Asp Gin Lys Val 260 265 270 tac caa get gtg aca gat gac ctg CC£ gcc gcc 111 gtg gat ggc acc 864 Tyr Gin Ala Val Thr Asp Asp Leu Pro Ala Ala Phe Val Asp Gly Thr 275 280 285 acc agt ggt ggg gac age gat gcc aag age ctg cgt ate gtg gaa agg 912 Thr Ser Gly Gly Asp Ser Asp Ala Lys Ser Leu Arg I]e Val Glu Arg 290 295 300 gag agt ggc cac tat gtg gag atg cac gcc ege tat ata ggg acc aca 960 Glu Ser Gly His Tyr Val Glu Met His Ala Arg Tyr He Gly Thr Thr 305 310 315 Ώ.0 gtg ttt gtg egg cag gtg ggt ege tac ctg acc ett gcc ate cgt atg 1008 Val Phe Val Arg Gin Val Gly Arg Tyr Leu Thr Leu Ala lie Arg Met 325 330 335 cct gaa gac ctg gcc atg tcc tac gag gag age cag gac ctg cag ctg 1056 Pro Glu Asp Leu Ala Met Ser Tyr Glu Glu Ser Gin Asp Leu Gin Leu 340 345 350 tgc gtg aac ggc tgc ccc ctg agl gaa ege ate gat gac £gg cag ggc 1104 Cys Val Asn Gly Cys Pro Leu Ser Glu Arg He Asp Asp Gly Gin Gly 355 360 365 cag gtg tel gcc ate ctg gga cac age ctg cct ege acc tcc ttg gtg 1152 Gin Val Ser Ala lie Leu Gly His Ser Leu Pro Arg Thr Ser Leu Val 370 375 380 cae gcc teg cct ggc tac aca cts act gcc aac ael caa tgc cat 1200 Gin Ala Trp Pro Gly Tyr Thr Leu Glu Thr Ala Asn Thr Gin Cys His 385 390 395 400 gag aag atg cca gtg aag gac ate tat ttc cag tcc tgt gtc ttc gac 1248 134305-序列表.doc 200916482
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Val Ser Leu Gly Leu Thr Cys Leu lie Leu lie Va丁 Phe Leu 465 470 475 8 了人 47叩智 <210> <211> <212> <213> <400> 4
Met lie Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Ala Pro Pro Gly Pro Cys Arg 15 10 15
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Leu Giy Leu Leu His Ala Gly Asp Cys Gin Gin Pro Ala Gin Cys Arg 85 90 95 lie Gin Lys Cys Thr Thr Asp Phe Val Ser Leu Thr Ser His Leu Asn
iΛΛ 1nc 1 1 A I \ju i WJ i i v
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Tyr Ala Gly Cys Thr Gin Arg Thr Ser Lys Ala Cys Arg Gly Asn Leu 130 135 140
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Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Ser Thr Asn Pro Glu Va) Thr 165 170 175
His Asp Pro Cys Asn Tyr His Ser His Ala Gly Ala Arg Glu His Arg 180 185 190 -6- 134305-序列表.doc 200916482
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Glu Ser Gly His Tyr Val Glu Met His Ala Arg Tyr lie Gly Thr Thr 305 310 315 320
Val Phe Val Arg Gin Val Gly Arg Tyr Leu Thr Leu Ala He Arg Met 325 330 335
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Val Ser Leu Gly Leu Thr Cys Leu lie Leu lie Val Phe Leu 465 470 475
<210> 5 <211> 1281 <212> DNA -7- 134305-序列表.doc 200916482 <213>智人 <220〉 <221> CDS <222> (1)..(1281) <400> 5 atg ggg gag cca ggc cag tcc cct agi ccc agg tcc tcc cat ggc agt 48 Met Gly Glu Pro Gly Gin Ser Pro Ser Pro Are Ser Ser His Gly Ser 1 5 10 15 ccc cca act eta age act etc act etc ctg ctg etc etc tgt gga cat 96 Pro Pro Thr Leu Ser Thr Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Cys Gly His 20 25 30 get cat tet caa tgc aag ate etc ege tgc aat get gag tac gta teg 144 Ala His Ser Gin Cys Lys lie Leu Arg Cys Asn Ala Glu Tyr Val Ser 35 40 45 tcc act ctg age ct t aga Egt ggg ggt tea tea gga gca ett ega gga 192 Ser Thr Leu Ser Leu Arg Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ala Leu Arg Gly 50 55 60 gga gga gga gga ggc egg ggt gga ggg gtg ggc tet ggc ggc etc tgt 240 Gly Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Val Gly Ser Gly Gly Leu Cys 65 70 75 80 ega gcc etc ege tcc tat geg etc tgc act egg ege acc gcc ege acc 288 Arg Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr 85 90 95 tgc ege Egg gac etc gcc ttc cat teg geg gla cat ggc ate gaa gac 336 Cys Arg Gly Asp Leu Ala Phe His Ser Ala Val His Gly lie Glu Asp 100 105 110 ctg atg ate cag cac aac tgc tec ege cag ggc cct aca gcc cct ccc 384 Leu Met lie Gin His Asn Cys Ser Arg Gin Gly Pro Thr Ala Pro Pro 115 120 125 ccg ccc egg ggc ccc gcc ett cca ggc geg ggc tcc ggc etc cct gcc 432 Pro Pro Arg Gly Pro Ala Leu Pro Gly Ala Gly Ser Gly Leu Pro Ala 130 135 140 ccg gac cct tgt gac tat gaa ggc egg ttt tcc egg ctg cat ggt egt 480 Pro Asp Pro Cys Asp 丁yr Glu Gly Arg Phe Ser Arg Leu His Gly Arg 145 150 155 160 ccc ccg ggg tie ttg cat tgc get tcc ttc ggg gac ccc cat gtg ege 528 Pro Pro Gly Phe Leu His Cys Ala Ser Phe Gly Asp Pro His Val Arg 165 170 175 tic v u w V U k cac ♦ 11 cac ολο t nr· r>n * n t r> UWM i ^ V te V 1 V λο ο ίτηο VMM get v w k 576 Ser Phe His His His Phe His Thr Cys Arg Val Gin Gly Ala Trp Pro 180 185 190 eta ctg gat aat gac t tc etc ttt gtc caa gcc acc age tcc ccc atg 624 Leu Leu Asp Asn Asp Phe Leu Phe Val Gin Ala Thr Ser Ser Pro Met 195 200 205 geg ttg ggg gcc aac get acc gcc acc egg aag etc acc ate ata ttt 672 Ala Leu Gly Ala Asn Ala Thr Ala Thr Arg Lys Leu Thr He lie Phe 210 215 220 aag aac atg cag gaa tgc at t gat cag aag gtg tat cag get gag gtg 720 Lys Asn Met Gin Glu Cys lie Asp Gin Lys Val Tyr Gin Ala Glu Val 225 230 235 240 gat aat ett cct gta gcc lit gaa gat ggt tet ate aat gga ggt gac 768 Asp Asn Leu Pro Val Ala Phe Glu Asp Gly Ser lie Asn Gly Gly Asp 245 250 255 ega cct ggg gga tcc agt ttg teg att caa act get aac cct Sgg aac 816 Arg Pro Gly Gly Ser Ser Leu Ser 11e Gin Thr Ala Asn Pro Gly Asn 260 265 270 134305-序列表.doc 864 200916482 cat gtg gag ate caa get gee tac att ggc aca act ata ate att egg
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Gly Leu Phe Val Leu Trp Leu Cys Me Gin 420 425 <210> 6 <211> 426 <212> PRT <213>智人 <400> 6
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Ala Met Ala Phe Ser Ala Glu Gin Asp Leu Gin Leu Cys Val Gly Gly 305 310 315 320 fv<; Pro Prn Ser Oln Arg Leu Ser Ar? Ser Glu Ar? Asn Arp Ar〇 Πίν - 325 一 w 330 ^ ^ 335 · 、 Ala He Thr lie Asp Thr Ala Arg Arg Leu Cys Lys Glu Gly Leu Pro 340 345 350
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Arg Ala Phe Leu Pro Asp Leu Glu Lys Leu His Leu Phe Pro Ser Asp 385 390 395 400
Ala Gly Val Pro Leu Ser Ser Ala Thr Leu Leu Ala Pro Leu Leu Ser -10- 134305-序列表.doc 200916482 405 410 415
Gly Leu Phe Val Leu Trp Leu Cys lie G】n 420 425 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <2Π>人造 <220> —致序列 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (1).. (1) <223> Xaa為任何胺基酸 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa 為 K 或 R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa 為 Lys (K)或 Arg (R) <220> <221> MISC FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa為任何胺基酸 <220> <221〉 MISC一FEATURE <222> (6).,(6) <223> Xaa 為 K 或 R <220> <221> MISC.FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa為任何胺基酸 <220> <221> MISC FEATURE <222> (9)..(9) <223> kaa 為 Ser， Thr 或 Ala <220> <221> <222> <223>
ΙΙΤΓ>Λ· Γ'Γ't ΓΓίΓ* JVlidifEAiVJIUi (10):.(10) Xaa為E或D <220> <221> <222〉 <223> MISC.FEATURE (11)..(11) Xaa為F或Y <220> <221> MISC.FEATORE <222> (12)..(12) <223> Xaa為任何胺基酸 <220> <221> MISC.FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa為任何胺基酸 <400> 7 Xaa Cys Xaa lie Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Thr 15 10 15 134305-序列表.doc -11 · 200916482 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213>人造 <220> <223> —致2 <220〉 <221〉MISC一FEATURE <222> (1). . (1) <223> Xaa為任何胺基酸 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa為任何胺基酸 <220〉 <221〉 MISC一FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa為任何胺基酸 <220〉 <221> MISC—FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa為任何胺基酸 <220〉 <221> MISC.FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa為任何胺基酸 <220> <221> MISC一FEATURE <222> (16)..(16) <223> Xaa為任何胺基酸 <400> 8
Xaa Cys Xaa Ala Leu Arg Xaa Tyr Ala Xaa Cys Tbr Xaa Arg Thr Xaa 15 10 15 <210> 9 <211> 933 <212> DNA <2丨3>人造 <220> <223〉 hRGMA 47-90 Fc 質體 <220〉 <22)> CDS <222> (1)..(933) <220> <221> misc feature <222> (1)..(55) <223> 鼠類U k鍵V-J2-C信號肽 <220> <221> misc feature <222> (1031..(234) <223> RGMA 47-90 <220> <221 > misc feature <222> (250)..(260) <223> 因子Xa 12- 134305-序列表.doc 200916482 <220> <221> misc_feature <222> (260..(933) <223> Fc <400> 9 atg gag aca gac aca etc ctg eta tgg gta ctg ctg etc tgg gtt cca 48 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 ggt tcc act ggt gac gC£ gcc cag ccg gcc agg ege geg ege cgt acg 96 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30 aag ct t ccg tgc aa£ ate etc aag tgc aac tct gag ttc tgg age gcc 144 Lys Leu Pro Cys Lys lie Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Ti*p Ser Ala 35 40 45 acg teg ggc age cac gcc cca gcc tea gac gac acc ccc gag ttc t£t 192 Thr Ser Gly Ser Hi s Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys 50 55 60 gca gcc ttg ege age tac gcc ctg tgc acg egg egg acg gcc ttg aat 240 Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Leu Asn 65 70 75 80 tct gca gat ate gag ££a ega atg gat cca ccg tgc cca gca cct gaa 288 Ser Ala Asp He Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 85 90 95 etc ctg ggg Ega ccg tea gtc t tc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 336 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 100 105 110 acc etc atg ate tec egg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 384 Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 115 120 125 gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 432 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 130 135 140 gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg egg gag gag cag tac aac 480 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 145 150 155 160 age acg tac cgt £tg gtc age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg 528 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 165 170 175 ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tec aac aaa gcc etc cca 576 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro ISO 185 j9〇 gcc ccc ate gag aaa acc ate tec aaa gcc aaa ggg cag ccc ega gaa 624 Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 195 200 205 cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tec egg gag gag atg acc aag aac 672 Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 210 215 220 cag gre age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc i tc tat ccc age gac ate 720 Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 225 230 235 240 gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 768 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 245 250 255 acg cc t ccc p t σ ctg gac t cc gac p〇r tec t t r 1 t r r t r t a t age a ao 816 Thr Pro Pro VaT Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 260 265 270 etc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc 864 13- 134305-序列表.doc 912 200916482
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 275 280 285 tcc gtg atg cat gag get ctg cac aac cac tac aeg cag aag age etc Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 290 295 300 933 tcc ctg tet ccg ggt aaa tga Ser Leu Ser Pro GTy Lys 305 310 <210> 10 <211> 310 <212> PRT <213>人造 <220> <223>合成構築體 <400> 10
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro ! 5 】0 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30
Lys Leu Pro Cys Lys lie Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe 丁rp Ser Ala 35 40 45
Thr Ser Gly Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys 50 55 60
Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Leu Asn 65 70 75 80
Ser Ala Asp lie Glu Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 85 90 95
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 100 105 110
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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 丁rp Tyr Val Asp Gly 130 135 140
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Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp 165 170 175
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 180 185 190
Ala Pro lit Glu Lys Thr ί)ε Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 195 200 205
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 14· 134305·序列表,doc 200916482 210 215 220
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 225 230 235 240
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 245 250 255
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 丁rp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys 275 280 285
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 290 295 300
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 305 310 <210> 11 <211> 1167 <2I2> DNA <213>人造 <220> <223> hRGMA47，168Fc 質體 <220> <221> CDS <222> (1)..(1167) <220> <221> misc feature <222> (103·). .(468) <223> hRGMA 47-168 <220> <221> misc_feature <222> (496T..(1167) <223> Fc <400〉 11 atg gag aca gac aca etc ctg ctB tgg gta cig cip rrc tpp pti cca
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Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr
65 70 75 SO tgc egg ggt gac ctg gcc tac cac teg gcc gtc cat ggc ata gag gac
Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly lie Glu Asp 85 90 95 -15- 48 96 144 192 240 134305-序列表.doc 288 336 200916482 etc atg age cag cac aac tgc tee aag gat ggc ccc acc teg cag cca
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 260 265 270 ate gag aaa acc ate tee aaa gee aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 275 280 285 gtg tac acc ctg ccc cca tee egg gag gag atg acc aag aac cag gtc
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val 290 295 300 age ctg acc Igc ugic aaa ggc t ίu iai ucu dgc gac aic gee gig
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val 305 310 315 320 gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aeg cct 6lu 丁rp Glu Ser Asn 6ly Gin Pro G】u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 325 330 335 ccc gtg ctg gac tee gac ggc tee ttc ttc etc tat age aag etc acc
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu « 370 375 380 tet ccg ggt aaa tga Ser Pro Gly Lys 385 134305-序列表.doc -16- 384 432 480 528 576 624 672 720 768 816 864 912 Λ/ΓΛ 100S 1056 1104 1152 1167 200916482 <210> 12 <211> 388 <212> PRT <213>人造 <220> <223>合成構築體 <400> 12
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu 丁rp Val Pro 】 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30
Lys Leu Pro Cys Lys lie Leu Lys Cys Asn Ser G】u Phe Trp Ser Ala 35 40 45
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Ala Ala Leu Arg Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr 65 70 75 80
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Arg Leu Arg Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gin Glu Arg Ser Asp 115 120 125
Ser Pro Glu lie Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala 130 135 140
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu v )80 185 190
Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 195 200 205
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 245 250 255 17- 134305-序列表.doc 200916482
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 260 265 270 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 275 280 285
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val 290 295 300
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Va] 305 310 315 320
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 325 330 335
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Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30
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Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala 85 90 95
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Ser Gin Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu lie Cys His Tyr Glu Lys Ser 130 135 140
Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe 145 150 】55 160
Gly Asp lie Glu Gly Arg Leu Asn Ser Ala Asp lie Glu Gly Arg Met 165 170 175 / Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe i 180 185 190
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro 195 200 205
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 210 215 220
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Va] His Asn Ala Lys Thr 225 230 235 240
Lys Pro Arg Giu Glu Gin 丁yr Asn Ser Thr 丁yr Arg Vai v'ai Ser Vai 245 250 255 20- 134305-序列表.doc 200916482
Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 260 265 270
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser 275 280 285
Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 290 295 300
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Lea Thr Cys Leu Val 305 310 315 320
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 325 330 335
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 340 345 350
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 355 360 365
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 370 375 380
Asn Hi s Tyr 丁hr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 385 390 395 <210> 15 <211> 1014 <212> DNA <213>人造 <220> <223> hRGMA 316-386 Fc 質體 <220> <221> CDS <222> (1)..(1014) <400> 15 atg gag aca gac aca etc ctg eta tgg gta ctg ctg etc tgg git cca
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu 丁rp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro j $ i〇 ]5 ggt tcc act ggl gac geg gcc cag ccg gcc agg ege geg ege cgt aeg
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr V 20 25 30 aag ett ctg egg ggc tgc ccc etc aac cag cag ate gac ttc cag gcc
Lys Leu Leu Arg Gly Cys Pro Leu Asn Gin Gin lie Asp Phe Gin Ala 35 40 45 ltc cac ate aat gel gag ggc acc ggt gcc ege agg ctg gca gcc gcc
Phe His Thr Asn Ala Glu Gly Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala 50 55 60 age cct gca ccc aca gcc ccc gag acc ttc cca tac gag aca gcc gtg
Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val 65 70 75 80 gcc aag tcc aag gag aag ct2 ccg ets sae gac ctg tac 丨ac ca? pcc
Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gin Ala 85 90 95 -21 - 48 96 144 192 240 9.88 134305-序列表.doc 200916482 tgc gtc t tc gac etc etc acc aeg ggc ttg aat tet gca gat ate gag 336 Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Leu Asn Ser Ala Asp He Glu 100 105 110 gga ega atg gat cca ccg tgc cca gca cct gaa etc ctg ggg gga ccg 384 Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 115 】20 125 tea gtc t tc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tee 432 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 130 135 140 egg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac 480 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 145 150 155 160 cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc £tg gag gtg cat aat 528 Pro Glu Val Lys Phe Asn 丁卬 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 165 170 175 gee aag aca aag CC2 egg gag gag cag tac aac age aeg tac cgt gtg 576 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 180 185 190 gtc age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag 624 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 195 200 205 tac aag tgc aag gtc tee aac aaa gee etc cca gee ccc ate gag aaa 672 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 210 215 220 acc ate tee aaa gee aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc 720 Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 225 230 235 240 ctg ccc cca tee egg gag gag atg acc aag aac cag gtc age ctg acc 768 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 245 250 255 tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag 816 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 260 265 270 age aat 聊 cag ccg gag aac aac iac aag acc aeg cct ccc gtg ctg 864 Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 275 280 285 gac tee gac ggc tee ttc ttc etc tat age aag etc acc gtg gac aag 912 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 290 295 300 age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tee gtg alg cat gag 960 Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 305 310 315 320 get ctg cac aac cac tac aeg cag aag age etc tee ctg tet ccg ggt 1008 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 330 335 aaa tga 1014
Lys <210> 16 <211> 337 <212> PRT <2]3>人造 <220> <223>合成構築體 <400> 16 22- 134305-序列表.doc 200916482
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gin Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr 20 25 30
Lys Leu Leu Arg Gly Cys Pro Leu Asn Gin Gin lie Asp Phe Gin Ala 35 40 45
Phe His Thr Asn Ala Glu Gly Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala 50 55 60
Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val 65 70 75 80
Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gin Ala 85 90 95
Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr Gly Leu Asn Ser Ala Asp lie Glu 100 105 110
Gly Arg Met Asp Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 115 120 125
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser 130 135 140
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 145 150 155 160
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 165 170 175
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu G!u Gin Tyr Asn Ser Thr 丁yr Arg Val 180 185 190
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 195 200 205
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro A】a Pro lie Glu Lys 210 215 220
Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 225 230 235 240
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 245 250 255
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu 丁rp Glu 260 265 270
Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu ΟΟΛ
ί. I ^ i.U'J
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 290 295 300 -23- 134305-序列表.doc 200916482
Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 305 310 315 320
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 325 330 335
Lys <210> 17 <211> 28 <212> DNA <2]3>人造 <220> <223> PCR 引子 <400> 17 ggggaagctt ttccccgcag ccacctcc <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 18 gggggaattc aaacgacctt cgatgtcccc gaagaggcca cagtg <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400〉 19 ggggaagctt ccgtgcaaga tcctcaagtg caac
<210> 20 <21]> 26 <212> DNA xm、 a :止 <220> <223> PCR 引子 <400> 20 ccccgaattc aaggccgtcc gccgcg <210> 21 <2Π> 33 <212> DNA <213>人造 <220> <223> PCR 引子 <400> 21 CCCCgaattC αα£ t CCCC£a a^ag^CCaCa g l £ <210> 22 <211> 26 -24· 134305-序列表.doc 200916482 <212> DMA <213〉 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 22 ggggaagctt ctgcggggct gccccc <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 23 ccccgaattc aagcccgtgg tgaggaggtc g <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> ra引子 <400> 24 atgcagccgc caagggagag <2)0> 25 <211> 21 <212> DNA <213> 人造 <220> <223> PCR引子 <400> 25 gcagaacaca gggagcaggg c <210> 26 <2Π> <2]2> 9 PRT <213> 人造 <220> <223> 一致序列 <220> <221> ΜISC FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa為任何胺基酸 <220> <221> ΜI SC FEATURE <222> (5).7(5) <223> Xaa為Va丨或Leu <220> <221> MI SC一FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa為任何胺基酸 <400> 26 Leu Xaa Leu Cys Xaa Xaa Gly Cys Pro 134305-序列表.doc 200916482 <210〉 27 <211> 2S <212〉 PRT <213> 人造 <220> <223> 一致序列 <220> <221> MI SC FEATUKH <222> (3)..(5) <223> Xaa為任何胺基酸 <220〉 <221> ΜI SC FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa 為 Lys 或 His <220> <221> MISC FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa為任何胺基酸 <220> <221> MISC FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa 為 Leu 或 Met <220> <221> MISC FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa為任何胺基酸 <220> <221> MISC FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa為任何胺基酸 <220> <221> MISC FEATURE <222> (17)..(17) <223> Xaa 為 Phe 或丁yr <220〉 <221> MISC FEA'IURH <222> (18)..(18) <223> Xaa 為 Hi s 或 Gin <220> <221> MISC FEATURE <222> (19)7.(19) <223> Xaa yfrt； Ala ^ 〇c Γ <220> <22]> MISC FEATURE <222> (24)..(24) <223> Xaa 為 Val 或 Leu <220> <221> MISC FEATURE <222> (26)..(26) <223> Xaa為j壬何胺基酸 <220> <221> MISC FEATURE <222> (27)..(27) b <223> kaa 為 Thr 或 Ser <400〉 27
Thr
Pro Val Xaa Asp Xaa Ty 15
Ala Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Glu Xaa Xaa 5 10
Xaa Xaa Xaa Cys Val Phe Asp Xaa Leu Xaa Xaa Gly 20 25 -26- 134305-序列表.doc
Claims (1)
- 200916482 十、申請專利範圍： 1. 一種排斥性導引分子（RGM)之骨形態發生蛋白（BMP)結 合區域。 2. 如請求項1之BMP結合區域，其係源自哺乳動物之 RGM。 3. 如請求項1或2之BMP結合區域，其係源自根據SEQ ID NO: 2之人類RGM A、根據SEQ ID NO: 4之人類RGM B 或根據SEQ ID NO: 6之人類RGM C。 4. 如前述請求項中任一項之BMP結合區域，其位於具有達 至約1 70之長度及關於RGM A假性血友病因子（von Willebrand)域之N端的胺基酸序列範圍内。 5. 如請求項4之BMP結合區域，其具有約30至150個胺基酸 基團之長度；其官能衍生物及融合蛋白，其含有至少一 個與至少一個額外之不同胺基酸序列官能鍵聯之BMP結 合區域。 6. 如前述請求項中任一項之BMP結合區域，其特徵在於根 據SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO·· 8之以下部分序列中的至 少一者： X1C(K/R)IX2(K/R)CX3(S/T/A)(E/D)(F/Y)X4SX5T(SEQ ID NO: 7) 其中X1iX5表示任何給定之胺基酸基團；或 X6 CXvALRXsYAXpCTX^RTXnCSEQ ID NO: 8)-其中x6至xn表示任何給定之胺基酸基團； 或下式之部分序列： (SEQ ID NO: 7)-連接 1-(SEQ ID NO: 8)， 134305.doc 200916482 其中連接1表示含有13至28個任何給定之鄰接胺基酸基 團之SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8橋接胺基酸序列。 7. 如鈾述請求項中任一項之BMP結合區域，其含有SEQ ID Ν 0: 2胺基酸序列中之以下一者： 約47至約1 68之胺基酸位置； 約47至約90之胺基酸位置；或 約7 5至約121之胺基酸位置； 或SEQ ID NO: 4胺基酸序列中之以下一者： 約94至約209之胺基酸位置； 約94至約137之胺基酸位置；或 約122至約1 68之胺基酸位置； SEQ ID NO: 6胺基酸序列中之以下一者： 約36至約172之胺基酸位置； 約36至約94之胺基酸位置；或 約80至約125之胺基酸位置； 或其功能性BMP結合片段。 8. 如請求項1至3中任一項之BMP結合區域或其結合片段， 其含有來自根據SEQ ID NO: 2之約位置3 16至約386之序 列範圍、或來自根據SEQ ID NO: 4之約位置350至約421 之序列範圍或來自根據SEQ Π) NO: 6之約位置3 1 4至369 之序列範圍的至少10個鄰接胺基酸基團。 汝叫求項7之BMP結合區域或其結合片段，其含有來自 根據SEQ ID NO: 2之約位置47至約168之序列範圍、來自 根據SEQ ID NO: 4之約位置94至約209之序列範圍或來自 134305.doc 200916482 根據SEQ ID NO: 6之約位置36至172之序列範圍的至少10 個鄰接胺基酸基團。 10.如前述請求項中任一項之BMP結合區域，其結合至選自 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6 及 BMP-12 之至少一個 BMP ’且尤其結合至bmp-2及/或BMP-4。 11 _如請求項1 〇之BMP結合區域，其亦結合至新生素 (neogenin) ° 1 2. —種如前述請求項中任一項之bmp結合區域之抗原性多 肽片段。 13. 如請求項12之抗原性多肽片段’其可用於產生免疫球蛋 白分子’該等免疫球蛋白分子調節RGM與BMP及/或新 生素之結合。 14. 如請求項12或13之抗原性多肽片段，其含有至少1〇個具 有根據 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 6之 序列中之一者的肽之鄰接胺基酸基團。 15. —種融合蛋白，其含有至少一個選自如請求項1至u中 任項之BMP結合區域之第一活性多肽，其係操作性地 連接至選自單價或多價载體多肽之第二多肽或第二生物 活性多肽。 16. 如請求項15之融合蛋白，其中該多價载體含有至少一個 Fc或FC，其中其兩個多肽鏈中之每—者係操作性地連接 至明求項1至1〇中任一項之相同或不同結合區 域。 17. —種如請求項丨至u中任一項之BMp結合區域之用途， 134305.doc 200916482 或一種如請求項12至14中任一項之多肽片段之用途，其 係用於產生針對RGM之多株抗血清或單株抗體。 18.如靖求項17之用途，其中該抗血清或該抗體調節與 新生素（新生素受體）之結合。 19·-種如請求項17及18中任—項之定義的針對之多株 抗血清或單株抗體，其係用於診斷或治療用途。 20. 種如叫求項19之多株抗血清或單株抗體之用途，其係 用於產生用以診斷或治療由該新生素受體（新生素）與 RGM或RGM片&相互作用所介導之疾病或疾病階段之藥 劑。 21. 如請求項20之用途，其中該等疾病或疾病階段係選自： a) 顧骨、大腦及脊髓之機械損傷； b) 選自神經退化性疾病、炎症或自體免疫疾病之慢性 疾病， c) 神經元再生、軸突出芽、神經突延伸及神經元可塑 性之病症； d) 腫瘤疾病及腫瘤轉移。 22. —種如請求項！至n中任一項之BMp結合區域之用途， 或一種如請求項15及16中任一項之融合蛋白之用途，其 係用於產生用以診斷或治療由RGM或RGM片段與相關受 體（新生素或BMP)之相互作用不良或受損所介導之疾病 或疾病階段的藥劑。 23. 如請求項22之用途，其中該等疾病或疾病階段係選自： a)由過度神經突出芽及/或病理性突觸發生引起之精神 134305.doc 200916482 b) 病病狀及慢性疼痛狀 與受擾之鐵代謝相關 少年血色素沉著症； 況中的變性神經突生成過程 之疾病，如慢性病性貧血、 青 c) d) e) Ο 與受損之骨生長相關之疾病； 與軟骨退化性改變相關之疾病； 與椎間盤及椎體受損害相關之疾病 與調控異常、不受批岳|丨夕h hA 又衩制之細胞遷移過程相關之疾 病。 24,種如請求項中任一項之BMp結合區域或其結合 片段之用途，或一種如請求項15及16中任一項之融合蛋 白之用it，其係用於產生用α轉或治療可藉由刺激或 擴增BMP信號路徑（藉由與ΒΜρ_2、ΒΜρ_4 ' ΒΜρ·5、 ΒΜΡ-6及/或BMP-12結合，尤其與膽？_2及/或BMP—結 合）而治療之疾病或疾病階段的藥劑。 25 ·如叫求項24之用途，其係用於治療涉及受損之骨生長之 疾病，或用於治療骨折。 26. —種如請求項！至u中任一項之bmp結合區域或其結合 片段之用途’或一種如請求項丨5及丨6中任一項之融合蛋 白之用途’其係用於產生用以診斷或治療自體免疫疾病 之藥劑’該等自體免疫疾病尤其為彼等選自以下者之疾 病：強直性脊椎炎、抗磷脂症候群、愛迪生氏病 (Addison's disease)、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫 性肝炎、自體免疫性淋巴增生症候群（ALPS)、自體免疫 性血小板減少性紫癜（ATP)、貝赛特氏症（Beh?et,s 134305.doc 200916482 disease)、大皰性類天疱瘡、心肌病、乳糜瀉、疮療樣皮 炎、慢性疲勞免疫功能障礙症候群（CFIDS)、慢性炎症 性脫髓鞘性多發性神經病（CIDP)、瘢痕性類天疱瘡、系 統性硬化症（CREST症候群）、冷凝集病、克羅恩氏病 (Crohn’s disease)、皮膚血管炎、Degos病、皮肌炎、青 少年皮肌炎、盤狀紅斑狼瘡、原發性混合性冷球蛋白血 症、纖維肌痛、古德帕斯氏症候群（G〇〇dpasture，s syndrome)、格雷夫斯病（Graves，disease)、格林巴利症 候群（Guillain-Barr6 syndrome)、橋本甲狀腺炎 (Hashimoto’s thyroiditis)、特發性肺纖維化、特發性血 小板減少性紫癜（ITP)、免疫球蛋白A腎病、胰島素依賴 型糖展病、青少年型關節炎、川崎病（Kawasaki disease)、扁平苔蘚、膜性腎小球腎炎、梅尼埃病 (Μέηιέπ、disease)、混合性結締組織病、多灶性運動神 經病、多發性硬化症、重症肌無力、尋常型天疱瘡、惡 性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺體症候群、 風濕性多肌痛、多肌炎、皮肌炎、原發性無丙種球蛋白 血症、原發性膽汁性肝硬化、牛皮癬、雷諾現象 (Raynaud’s phenomen〇n)、萊特氏症候群 syndrome)、風濕熱、類風濕性關節炎、結節病、硬皮 病、休格連氏症候群（Sj5gren，s syndr〇me)、僵人症候 群系統性紅斑狼瘡、高安氏動脈炎（Takayasu,s —is)、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、潰瘍性結腸炎、葡 萄膜人脈管炎、白斑病及韋格納肉芽腫病（Wegener's 134305.doc 200916482 granulomatosis);或 /脫髮病’尤其選自斑禿、全禿、普禿、雄激素源性禿 髮休止期脫髮、生長期脫髮及化學療法誘發性禿髮。 種如°月求項1至11中任一項之BMP結合區域之用途， 其係用作偵測或鑑別RGM結合配位體之標乾。 、’ 種如喷求項1至1丨中任一項之BMp結合區域或如請戈 項12至14中任一項之片段之用途，其係用作主動或 免疫之免疫原。 29.種夕株抗血清，其可藉由以抗原量之如請求項i至j工 中任項之BMP結合區域或如請求項12至14中任一項之 多肽片段免疫哺乳動物而獲得。 3 0· —種針對如請求項丨至丨丨中任一項之BMp結合區域或針 對如請求項12至14中任一項之多肽片段之單株抗體·或 抗RGM A單株抗體，該抗體與RGM A之結合係藉由如請 求項1至11中任一項之BMP結合區域或藉由如請求項a 至14中任一項之多肽片段來調節；或其抗原結合片段， 其係視情況呈人類化形式。 31· —種藥劑，其含有至少一種選自下列各物之活性組份的 醫藥學上可接受之載劑： a) 如請求項1至11中任一項之BMP結合區域，或如請 求項12至14中任一項之多肽片段，或如請求項15及 16中任一項之融合蛋白， b) 如請求項29及30中任一項之單株或多株抗體。 3 2.如請求項3 1之藥劑，其係用於脊趙腔、靜脈内、皮下、 134305.doc 200916482 骨内（intraosseal)、經鼻、 口服或非經腸、經皮、皮下、 體外及吸入投藥。 3 3. —種用於治療骨折之藥惑丨，甘— 樂齊i其在液體、半固體或固體載 劑中含有至卜種如請求項1至η中任-項之B M p結合 區域或如請求項15及16_任—項之融合蛋白。 34.種表現載體，其含有至少一種編碼如請求項1至11中 任-項之BMP結合區域、如請求項15及16中任一項之融 合蛋白或如請求項12至！种任—項之多肽片段之核酸序 列，其係操作性地連接至至少—種調控核酸序列。 35. —種重組微生物，其具有至少一種如請求項“之載體。 36. —種融合瘤細胞株，其產生如請求項％之單株抗體。 3 7. —種方法，其係用於產生如請求項！至11中任一項之 BMP結合區域、如請求項15及16中任一項之融合蛋白或 如請求項12至丨4中任一項之多肽片段，其中培養如請求 項35之重組微生物且將所產生之蛋白產物自該培養物分 離。 i〆38. —種產生如請求項3〇之單株抗體之方法其中培養如請 求項36之融合瘤細胞株且將所產生之蛋白產物自該培養 物分離。 39. —種如請求項丨至16中任一項之BMp結合區域或如請求 項15及16中任一項之融合蛋白之用途，其係用於產生用 以刺激RGM受體（尤其新生素）或至少一個選自BMp_2、 BMP-4、BMP-5、BMP-6及 BMP-12之 BMP之藥劑。 40. —種如請求項30之單株抗體之用途，其係用於產生用以 阻斷RGM受體（諸如尤其為新生素）之活化之藥劑。 134305.doc
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