TW200843766A - Treatment of melanoma - Google Patents

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200843766 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明大體而言係關於用於治療個體黑色素瘤之方法及 組合物。更特定言之，本發明係關於諸如4-胺基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基）-1Η-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1H)-酮之 ~ 化合物及其互變異構體、鹽及混合物在治療黑色素瘤及製 •備用於治療黑色素瘤之藥劑中的用途。 【先前技術】 毛細管延伸至幾乎所有人體組織且為組織供應氧及養分 以及移除廢物。在一般情況下，毛細管内層之内皮細胞不 分裂且因此，在成年人中毛細管之數目或尺寸通常並不增 加。然而，在某些正常情況下，諸如組織受損時或在月經 週期之某些時期中，毛細管開始快速增生。自預先存在之 血管形成新毛細管之此過程稱為血管生成或新血管生成。 參見 Folkman，J. Scientific American 275，150-154 (1996)。 創傷癒合期間之血管生成為成人生命期間病理生理性新血 [./ 管生成之實例。創傷癒合期間，額外毛細管提供氧及養分 的供應，促進肉芽組織且幫助移除廢物。癒合過程終止 後，毛細管通常復原。Lymboussaki，A· ’’Vascular Endothelial Growth Factors and their Receptors in Embryos, Adults, and in Tumors” Academic Dissertation, University of Helsinki, Molecular/Cancer Biology Laboratory and Department of Pathology，Haartman Institute，（1999) o 血管生成在癌細胞生長中亦起重要作用。已知一旦癌細 129126.doc 200843766 胞巢達到一定尺寸，約1至2 mm之直徑，癌細胞必須擴大 血液供應以在擴散不足以供應癌細胞以足夠氧及養分時使 腫瘤長得更大。因此，期望血管生成之抑制使癌細胞生長 停止。 受體酪胺酸激酶（RTK)為調節發育細胞生長及分化、成 人組織之重塑及再生的跨膜多肽。Mustonen，T·等人，J· Cell Biology 129，895-898 (1995) ; van der Geer，P.等人， Ann Rev. Cell Biol. 10，251-337 (1994)。已知稱為生長因 子或細胞激素之多肽配位體活化RTK。信號轉導RTK包含 受體外域中之配位體結合及構形改變，從而引起其二聚 化 〇 Lymboussaki，A. ’’Vascular Endothelial Growth Factors and their Receptors in Embryos，Adults, and in Tumors” Academic Dissertation， University of Helsinki， Molecular/Cancer Biology Laboratory and Department of Pathology, Haartman Institute，（ 1999) ; Ullrich，A·等人， Cell 61，203-212 (1990)。配位體與RTK之結合在特定酪胺 酸殘基處引起受體轉磷酸化且隨後活化催化域以使細胞質 基質填酸化。同前。 兩個RTK亞族對血管内皮具特異性。此等亞族包括血管 内皮生長因子（VEGF)亞族及Tie受體亞族。V類RTK包括 VEGFRl(FLT-l)、VEGFR2(KDR(人類）、Flk-Ι(小鼠））及 VEGFR3(FLT-4)。Shibuya，M.等人，Oncogene 5，519-525 (1990) ; Terman，Β·等人，Oncogene 6, 1677-1683 (1991); Aprelikova，Ο.等人，Cancer Res. 52，746-748 (1992) 〇 129126.doc 200843766 癌症為包含許多驅動腫瘤細胞增殖之遺傳缺陷之疾病。 因此’同時抑制多個細胞信號轉導路徑之策略可產生更有 利之治療結果。RTK過度表現及/或活化突變常出現於腫瘤 細胞中且涉及於腫瘤生長中。Blume_ Jensen，P及Hunter， T·，’Oncogenic Kinase Signaling，” Nature，411，第 355_65 頁（2001) ; Carmeliet，P·，"Manipulating Angiogenesis in Medicine，” J· intern· Med.，255，第 538-61 頁（2004)。大部 分RTK包含與配位體結合有關之胞外域及介導自磷酸化、 引發信號轉導事件級聯之下游信號轉導分子之募集的細胞 内激酶域。存在超過3〇個涉及於癌症中之RTK，例如III型 (PDGFR、CSF-1R、FLT3 及 c-KIT)、IV型（FGFR1-4)及 V型 (VEGFR1-3)RTK。 黑色素瘤為黑色素細胞之惡性腫瘤，該等細胞產生皮膚 色素黑色素。黑色素瘤通常發生於皮膚中，但可能發生在 黏膜表面上或在體内可發現黑色素細胞之任何部位。根據 特徵外觀及行為，可將黑色素瘤分為：丨）淺表擴展性黑色 素瘤（SSM)、2)結節性惡性黑色素瘤、3)肢體末端雀 斑性黑色素瘤（ALM)、4)雀斑性惡性黑色素瘤（LMM)及5) 黏膜雀斑性黑色素瘤（MLM)。SSM為最常見類型之黑色素 瘤且通常呈現為數種顏色之皮膚上暗色、平坦或略微高起 之標記。在癌症早期徑向階段，癌症經由表皮擴展且治癒 預後為良好的。一旦SSM進入垂直生長階段，其即擴展至 真皮及下層結構中且變得更危險且難以治癒。題為最具 侵襲性之黑色素瘤類型，其快速產生且同時向上及向内生 129126.doc 200843766 八通吊呈現為皮膚上均勻黑色小結，不過其他顏色為 可月匕的。ALM為另-具侵襲性之黑色素瘤形式，其更常發 生在暗色皮膚患者中。其可為褐色、黑色或顏色多樣化且 可為平坦或結狀。LMM為最不常見之黑色素瘤且通常發生 在老年人之鼻及頰上。病灶為平坦的，可為棕褐色、褐

色、黑色或其他顏色，且可長得很大（3 cm-6 cm)。LMM 擴展緩k且不傾向於轉移。MLM在外觀上類似於a讀且

(j 存在於多個黏膜位點，’包括口腔、食道、肛門、陰道及 膜田黑色素瘤保持在局部時，藉由外科手術將其切除 且治癒率常為良好的。然而，一旦黑色素瘤轉移至原發性 錢以外，例如淋巴系統及諸如中樞神經系統、肝或肺之 更遠位點’其極難治療。2_年在美國，估計超過62,000 例新黑色素瘤發生且超過7,9⑻名患者死於黑色素瘤。 近來已在％〇 01/29025、WO 01/62251 及 W0 01/62252 中 揭示各種啊基取代化合物，且近來已在w〇⑽糊中 揭示各種苯并咪唑基化合物。據報導此等化合物能夠抑 制、、調控及/或調節受體類型及非受體路胺酸激酶之信號 轉導。所揭7F之化合物中有一些含有與〇弓卜朵基或苯并味唑 基鍵結之噎琳酮片段。 4-經基喧相及基㈣^生物之合成揭示於大量參 考文獻中’ s亥等參考文獻如本文中完全閣述般以全文引用 的方式併入以達成所有目的。舉例而言，UkrWts等人揭 示3-(苯并咪唑_2_基)_4_羥基_2_側氧基#二氫喧啉之合 成。L等人，Tet. Lett. 42, 7747-7748 (1995); 129126.doc -10- 200843766

Ukrainets，I.等人，Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii， 2，239-241(1992)。Ukrainets亦揭示其他4-羥基喹啉酮及諸 如1H-2-側氧基-3-(2-苯并味嗤基）-4-經基喧淋之硫基類似 物的合成、抗痙攣及抗甲狀腺活性。Ukrainets，I·等人， Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii， 1， 105-108 (1993)，Ukrainets，I·等人，Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinii，8，1 105-1 108 (1993); Ukrainets，I·等人，Chem· Heterocyclic Comp· 33, 600-604,（1997)。

各種啥琳衍生物之合成揭示於W〇 97/48694中。揭示此 等化合物能夠與核激素受體結合且可用於刺激骨母細胞增 殖及骨生長。亦揭示該等化合物可用於治療或預防與核激 素受體家族相關聯之疾病。 喹啉之苯環經硫基取代之各種喹啉衍生物揭示於w〇 92/18483中。揭示此等化合物可用於醫藥調配物中且用作 藥劑。 已揭示喹諾酮（Quin〇l〇ne)及香豆素（c〇umarin)衍生物可 用於與藥物及醫藥調配物無關之多種應用中。描述供光可 聚合組合物中使用或用於發光性質之喹諾酮衍生物之製備 的參考文獻包括··頒予0kam〇t〇等人之美國專利第 5,801，212號；JP 8-29973 ; JP 7-43896 ; JP 6-9952 ; JP 63- 該等參考文獻均如 入本文以達成所有 258903 ; EP 797376 ;及 DE 23 63 459， 本文中完全闡述般以全文引用的方式併 目的〇 以下文獻中揭示可用於抑制血管生 成及血管内皮生長 因 129126.doc 200843766 子受體酪胺酸激酶且可用於抑制其他酪胺酸及絲胺酸/蘇 胺酸激酶之各種喹啉酮苯并咪唑化合物，包括4_胺基-5-氟 -3-[5-(4- 甲基 略嗓 -1·基 ）- 1H-苯并咪 π坐 —2-基] 喧琳 ·2(1Η)_ 酮或其互變異構體：美國專利第6,605,617號；美國專利第 6,756,383號；申請之美國專利申請案第1〇/116，117號（2〇〇3 年2月6曰以US 2003/0028018公開）；美國專利申請案第 10/644,055號（2004年5月13日公開，美國專利申請公開案 第2004/0092535號）；美國專利申請案第10/983,174號；美 國專利申請案第10/706,328號（2004年11月4日以2004/0220196 公開）；美國專利申請案第1〇/982,757號（2005年6月3曰以 2005/01 3 7399公開）；及美國專利申請案第1〇/982,543號 (2005年9月22日以2005/0209247公開），該等文獻各自如本 文中完全闡述般以全文引用的方式併入本文且達成所有目 的。 儘管治療腫瘤及癌症之方法近來已有所發展，但對治療 癌症之新方法且尤其治療黑色素瘤之新方法及組合物仍存 在顯著需要。 【發明内容】 本發明提供治療黑色素瘤且尤其轉移黑色素瘤之方法。 本發明進一步提供化合物、其互變異構體、其鹽及其混合 物在使用治療黑色素瘤之醫藥調配物及藥劑中的用途。 在一態樣中，本發明提供治療諸如人類黑色素瘤患者之 個體黑色素瘤之方法。黑色素瘤可為皮膚黑色素瘤或真皮 外黑色素瘤。在一些實施例中，提供一種治療轉移黑色素 129126.doc •12- 200843766 瘤之方法。該方法包括向個體投與有效量之結構!之化合 物之互變異構體、該化合物之醫藥學上可接受 之鹽、該互變異構體之醫藥學上可接受之鹽，或其混合 物。結構I具有下式：

其中， Α為具有以下結構之一的基團：

其中，

U R1係選自Η或具有⑴個碳原子之直鏈或分支鏈烧基。 在本發明之方法之多個實施例中在投與如本文所揭示 之化合物後’個體黑色素瘤之生長受到抑制，疾病衰退或 穩定，或者在投藥後個體黑色素瘤之尺寸及/或範圍減 在一些實施財，Rl為甲基，且結構！之化合物具有結 構 IA ·· 129126.doc -13- 200843766

本文中結構ΙΑ之化合物亦稱為”化合物1"、"TKI258"或 4-胺基-5-氣-3-[6-(4-甲基派唤-1 -基）-1Η-苯弁ϋ米11坐-2-基]_ 1Η-啥淋-2-酮。 f 在一些實施例中，R1為氫，且結構I之化合物具有結構 IB ：

ί / 結構IB之化合物在本文亦稱為’’化合物2”或4-胺基-5-氟- 3-[6-(哌嗪-1-基）-1士苯并咪唑-2-基卜1^1-喹啉-2-酮。 . 在一些實施例中，R1為甲基，且結構I之化合物具有結 構1C : 129126.doc -14- 200843766 Ο

• IC ο 結構IC之化合物在本文亦稱為"化合物3”或4-胺基-5-氟- 3-[6-(4-甲基_4_氧離子基哌嗪基）_m-苯并咪唑基]_ 1H-啥琳-2-嗣。 f、 在一些實施例中，化合物為結構I、ΙΑ、IB或ic之化合 物且向個體投與化合物或互變異構體之乳酸鹽。 在一些實施例中，黑色素瘤表現野生型或突變型纖維母 細胞生長因子受體1、2、3及/或4。在其他實施例中，黑 色素瘤表現野生型或突變型c_Kit。在其他實施例中，黑色 素瘤表現纖維母細胞生長因子受體1及2、1及3、1及4、2 及3、2及4、3及4或1、2及3或1、2、3及4。在可根據本文 ^ ; 所揭示之方法治療之某些黑色素瘤中，表現野生型或突變 型FGFR1、FGFR2、FGFR3或FGFR4中之一或多者。可藉 由本文所揭示之方法治療之某些黑色素瘤表現野生型或突 變型c-Kit。在其他實施例中，黑色素瘤表現野生型Raf、 • 突變型Raf、野生型Ras、突變型Ras、野生型^忖及/或突 變型c-Kit蛋白。 夕種不同類型之黑色素瘤可根據本發明之方法來治療， 該等黑色素瘤包括（例如）淺表擴展性黑色素瘤、結節性惡 129126.doc •15- 200843766 性黑色素瘤、肢體末端雀斑性$多

…、巴素瘤、雀斑性惡性黑色 素瘤及黏膜雀斑性黑色素瘤。原F ^ ^ 尽I丨生黑色素瘤亦可為皮膚 '、、、色素瘤或真皮外黑色素瘤。直. 〃皮外原發性惡性黑色素瘤 t括眼部黑色素瘤及軟組織之透明細胞肉冑。其他適應症 t括可涉及RTK標…關性的罕見黑色素瘤或癌前病 k。本發明之方法亦可用於治療已轉移m素瘤。 Γ Ο 治療黑色素瘤之方法進-步包括與如本文所定義之化合 物起才又與一或多種用於治療黑色素瘤之抗癌藥物。舉例 而3 ’用於治療黑色素瘤、尤其轉移性黑色素瘤之抗癌藥 物可選自以下各物：烷基化抗癌藥物，諸如達卡巴嗪 (daCarbazine)、替莫唑胺（tem〇z〇1〇mide)、二氣曱二乙胺 (mechlorethamine)及亞硝基脲（nitr〇s〇ureas)(諸如卡莫司汀 (camustine)、洛莫司汀（1〇mustine)及福莫司汀 (fotemustine));紫杉烷，諸如太平洋紫杉醇（pacHtaxel)& 夕烯紫杉醇（docetaxel);長春花（vinca)生物驗，諸如長春 驗（vinblastine)，拓撲異構酶（t〇p〇isonierase)抑制劑，諸如 伊立替康（irinotecan);沙利度邁（thalidomide);抗癌抗生 素’諸如鏈脲黴素（streptozocin)及放線菌素 D(dactin〇mycin);或鉑抗癌藥物，諸如順鉑（cisplatin)及 卡鉑（carboplatin)。本發明之化合物可添加至多化學治療 方案中’該等方案諸如Dartmouth方案、CVD(順始、長春 驗及達卡巴唤）及BOLD(博來黴素（bleomycin)、長春新驗 (vincristine)、洛莫司汀及達卡巴嗪）。在一些實施例中， 抗癌藥物係選自干擾素，諸如（但不限於）干擾素a_2a、干 129126.doc -16 - 200843766 合使用 擾素n聚乙二醇化干擾素’諸如聚乙二醇化干擾素& 2b。諸如介白素_2之介白素亦可與本文所揭示之化合物組 在本文所述之治療黑色素瘤之方法中，化合物之治療有 效量可在每公斤個體體重約〇·25 mg至約30 mg之範圍内。 在-些實施例中’化合物之治療有效量可在約Μ 至

約30 mg/kg、約！ mg/kg至約3〇 mg/kg、約i至約乃 mg/kg、約i mg/kg至約15 mg/kg或約ι或2叫⑽至 、、勺10 mg/kg之範圍内。在其他實施例中，向個體投與之化 合物之量在約25至約1500毫克/天且較佳約1〇〇或2〇〇毫克/ 天至約500或600毫克/天之範圍内。 在一些實施例中，本文所述之治療黑色素瘤之方法進一 步包含投與式I、ΙΑ、IB或1C之化合物作為治療週期之部 分。治療週期包括：投藥階段，在此期間定期向個體投與 式I、IA、汨或…之化合物；及休息日，在此期間不投與 化合物。舉例而言，治療週期可包含歷時7天、14天、21 天或28天每天投與一定量之式〗化合物，接著7或14天不投 與化合物。在一些實施例中，治療週期包含歷時7天每天 投與一定量之化合物，接著7天不投與化合物。治療週期 可重禝一或多次，例如2、4或6次，以提供治療療程。更 般而5，/〇療療私係指藉由本發明之方法使個體進行黑 色素瘤治療的時間&。因此，治療療程可指個體接受每天 或間歇劑ΐ之本文所揭示之化合物的時間段以及延續一或 多個治療週期之時間段。此外，化合物可在治療週期之投 129126.doc 17 200843766 藥1¾段期間每天投與一次、兩次、二4 一-人或四次。在其他實 施例中，該等方法進一步包含在治療 、“長期間母天或每隔 一天投與一定量之化合物一次、兩次、一 人 二次或四次。 因此，本發明進一步提供用於治療 — 席黑色素瘤之方法，其 包含向患有癌症之個體投與具有式卜IA、汨或…之化八 物、其醫藥學上可接受之鹽、其互變異構體或互變異構體 之醫藥學上可接受之鹽，其中第一治療週期中投與之化合 物之量為每天25 mg’且所投化合物之量隨各後續治療週

ϋ 期而增加直至每天向個體投與15〇〇 mg化合物或在個體中 觀測到劑量限制性毒性。通常在該等方法中，第一治療週 期後所投化合物之量隨各後續治療週期而加倍。舉例而 言，第一治療週期可包括向個體投與25毫克/天且後續治 療週期可包含向個體投與5〇毫克/天。在一些實施例中， 治療週期包含歷時7天每天投與相同量之化合物，接著7天 不投與化合物。 在一態樣中，本發明提供結構I、ΙΑ、IB及/或1C之化合 物、该化合物之互變異構體、該化合物之醫藥學上可接受 之鹽、該互變異構體之醫藥學上可接受之鹽，或其混合物 在製備用於本發明之任何方法之任何實施例中的藥劑或醫 藥調配物中之用途。 在另一態樣中’本發明提供一種套組，其包括容器，該 容器包含結構1、认、IB及/或1C之化合物、該化合物之互 k異構體、該化合物之醫藥學上可接受之鹽、該互變異構 體之醫藥學上可接受之鹽，或其混合物。該套組可包括用 129126.doc -18- 200843766 於治療黑色素瘤之另一化合物。該套組可進一步包括用於 進行本發明之任何方法之書面指導說明。在一些實施例 中’可包括呈紙質文件形式之書面說明，其與套組容器分 開’而在其他實施例中，書面說明可寫於附著於套組容器 之標籤上。 本發明之其他目標、特徵及優點將經由以下實施方式及 圖式而變得顯而易見。 【實施方式】 (、 本發明提供治療黑色素瘤、尤其轉移黑色素瘤之方法。 本發明亦提供化合物（例如，結構I、IA、IB及1C之化合 物）、其互變異構體、鹽及混合物在製備用於治療黑色素 瘤之藥劑或醫藥調配物中之用途。雖然不希望受理論束 缚，但咸信所揭示之化合物在黑色素瘤治療中之驚人有效 作用係由化合物之雙重活性引起。認為本發明之化合物藉 由阻斷VEGFR、FGFR及PDGFRp抑制表現一或多個FGF受 體之黑色素瘤細胞及抑制與黑色素瘤相關之血管生成來發 ^ 揮對黑色素瘤之抗腫瘤作用。本文所揭示之化合物亦可有 效對抗野生型或突變型Raf或Ras基因型之黑色素瘤。 在本申請案全文中使用以下縮寫及定義·· bFGF為代表基本纖維母細胞生長因子之縮寫。 C-Kit亦稱為幹細胞因子受體或肥大細胞生長因子受 體。 ” CSF-1R”為群落刺激因子1受體之縮寫。 "FGF"為與 FGFR1、FGFR2、FGFR3 及 fgfr4 相互作用 129126.doc •19- 200843766 之纖維母細胞生長因子的縮寫。 亦稱為bFGFR之代表與纖維母細胞生長因子 FGF相互作用之酪胺酸激酶的縮寫。相關受體酪胺酸激酶 包括FGFR2、FGFR3及FGFR4。此等激酶中之一或多者常 在黑色素瘤中表現（參見實例）。 nFlk-l’f為代表胎肝酪胺酸激酶1之縮寫，亦稱為激酶插 • 入域酪胺酸激酶或KDR(人類），亦稱為血管内皮生長因子 受體-2 或 VEGFR2(KDR(人類），Flk-Ι (小鼠））。 () 71^-1’’為代表加5樣酪胺酸激酶-1之縮寫，亦稱為血管 内皮生長因子受體-1或VEGFR1。 "FLT-3”為代表fms樣酪胺酸激酶-3之縮寫，亦稱為幹細 胞酪胺酸激酶I(STK I)。 ’’FXT-4”為代表fmS樣酪胺酸激酶-4之縮寫，亦稱為 VEGFR3。 ’’MIA”代表黑色素瘤抑制活性。如本文所用之MIA蛋白 係指在GenBank資料庫中如以寄存編號NP_006524公開可 1/ 得並由GenBank寄存編號NM_006533下所列之cDNA編碼的 12 kDa可溶性蛋白及包含MIA蛋白之至少10個連續殘基的 . 哺乳動物同系物或其片段。已顯示MIA蛋白藉由與纖維結 合蛋白及昆布胺酸（lam ini η)分子結合藉此防止細胞-基質相 互作用而涉及於黑色素瘤細胞自胞外基質之脫離中 (Brockez L.等人，Br. /· 743:256268 (2000))。 治療之前及之後所量測之MIA蛋白的存在或濃度可用以測 定哺乳動物個體對用黑色素瘤抑制劑治療之反應。 129126.doc •20- 200843766 ΠΜΕΚ1”為代表在由Raf-MEKl-ERK形成之模組中 MAPK(有絲分裂原活化蛋白激酶）信號轉導路徑中絲胺酸 蘇胺酸激酶的縮寫。MEK1使ERK(胞外調節激酶）磷酸化。 "PDGF”為代表血小板衍生生長因子之縮寫。PDGF與酪 胺酸激酶PDGFRa及PDGFRP相互作用。 ”Rafn為MAPK信號轉導路徑中絲胺酸/蘇胺酸激酶。 • nRTKn為代表受體酪胺酸激酶之縮寫。 nTie-2n為代表具有Ig及EGF同源域之酪胺酸激酶的縮 〇 寫。 nVEGF"為代表血管内皮生長因子之縮寫。 n VEGF-RTK”為代表血管内皮生長因子受體酪胺酸激酶 之縮寫。 一般而言，對諸如氫或Η之某一元素之提及意欲包括該 元素之所有同位素。舉例而言，若結構I之化合物上之基 團脫去或顯示為Η，則確定此包括氫或Η、氘及氚。 短語”具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈烷基”係指不含 〇 有雜原子且包括1至6個碳原子之非環狀烷基。因此，該短 語包括直鏈烷基，諸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基及 . 己基。該短語亦包括直鍵烧基之分支鍵異構體，包括（但 不限於）以下各基團：-CH(CH3)2、-CH(CH3)(CH2CH3)、 -ch(ch2ch3)2、-c(ch3)3、-ch2ch(ch3)2、-ch2ch(ch3)(ch2ch3) 、-ch2ch(ch2ch3)2、-ch2c(ch3)3、-ch(ch3)ch(ch3)(ch2ch3) > -CH2CH2CH(CH3)2 ' -CH2CH2CH(CH3)(CH2CH3) ^ -CH2CH2C(CH3)3 、-ch(ch3)ch2ch(ch3)2及其類似基團。在一些實施例 129126.doc -21 - 200843766 中，烷基包括具有1至6個碳原子之直鏈及分支鏈烷基。在 其他實施例中，烷基具有丨至4個碳原子。在其他實施例 中，烷基為具有1至2個碳原子之直鏈烷基（甲基或乙基）。 在其他實施例中，烧基僅具有1個碳原子且為甲基（_CH3)。 • ”醫藥學上可接受之鹽”包括與無機鹼、有機鹼、無機 酸、有機酸或鹼性或酸性胺基酸形成之鹽。本發明包括 (例如）諸如納鹽或鉀鹽之鹼金屬鹽，諸如鈣鹽、鎂鹽或鋁 鹽之鹼土金屬鹽及銨鹽作為無機鹼之鹽。本發明包括（例 f， 如）與二甲胺、二乙胺、吡啶、曱基吡啶、乙醇胺、二乙 醇胺或三乙醇胺形成之鹽作為有機鹼之鹽。無機酸之鹽包 括（例如）鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽及磷酸鹽。 本發明包括（例如）甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、反丁烯 二酸鹽、乙二酸鹽、酒石酸鹽、順丁烯二酸鹽、乳酸鹽、 #棣酸鹽、丁二酸鹽、蘋果酸鹽、曱烷磺酸鹽、苯磺酸鹽 及對甲苯磺酸鹽作為有機酸之鹽。本發明包括（例如）精胺 酸鹽、離胺酸鹽及鳥胺酸鹽作為鹼性胺基酸之鹽。酸性胺 U 基酸鹽包括（例如）天冬胺酸鹽及麵胺酸鹽。 結構I之化合物易於使用以下實例部分所述及以下文獻 • 所揭不之程序來合成，該等文獻如本文完全闡述般各以全 • 文引用的方式併入本文且以達成所有目的：美國專利第 6,605,617號、美國專利申請案第1〇/644,〇55號（以u s· 2004/0092535公開）、美國專利申請案第1〇/983，i74號（以 U.S· 2〇〇5/0261307公開）、美國專利申請案第1〇/726,328號 (以U.S· 2004/0220196公開）、美國專利申請案第1〇/982,757 129126.doc -22- 200843766 號（以U.S· 20050137399公開）、美國專利申請案第 10/982,543號（以U.S. 2005/209247公開）及PCT專利申請案 第？(：171182006/019349號（以，〇 2006/125130公開）。 結構I之化合物、該化合物之互變異構體、該化合物之 醫藥學上可接受之鹽、該互變異構體之醫藥學上可接受之 鹽及其混合物可用以製備藥劑及醫藥調配物。該等藥劑及 醫藥調配物可用於本文所述之治療方法中。 醫藥調配物可包括上述任何實施例中之任何化合物、互 變異構體或鹽以及諸如本文所述之彼等載劑的醫藥學上可 接受之載劑。 本發明亦提供可藉由將一或多種本發明之化合物或其醫 I學上可接受之鹽、其互變異構體或其混合物與醫藥學上 可接文之載劑、賦形劑、黏合劑、稀釋劑或其類似試劑混 合而製備之組合物以治療或改善與轉移腫瘤相關之病症。 本發明之組合物可用以產生用以治療如本文所述之轉移腫 瘤的調配物。該等組合物可呈（例如）顆粒、散劑、錠劑、 膠囊、糖衆、检劑、注射液、乳液、醜劑、懸浮液或溶液 之形式。本發明之組合物可經調配以用於多種投藥途徑： 例如經口投藥、經鼻投藥、經直腸投藥、皮下注射、靜脈 内注射、肌肉内注射或腹膜内注射。以下劑型係以實例形 式給出，且不應將其理解為限制本發明。 對於經口、經頰及舌下投藥而言，散劑、懸浮液、顆 粒、錠劑、丸劑、膠囊、膠囊鍵（gelcap)及囊片為可接受 之固體劑型。此等劑型可（例如）藉由將一或多種本發明之 129l26.doc -23- 200843766 化合物、其醫犖風 + 一 梁予上可接受之鹽、互變異構體或混合物與 二種/4、加劑（諸如，澱粉或其他添加劑）混合來製備。 口適之，加劑為蔗糖、乳糖、纖維素糖、甘露糖醇、麥芽 •醇葡艰糖、；殿粉、填脂、海藻酸鹽、甲殼素、聚葡萄 胺糖果膠、黃蓍膠、阿拉伯膠、明膠、膠原蛋白、酪蛋 &成或半合成聚合物或甘油酯。視情況，口 片丨型可3有其他有助於投藥之成份，諸如非活性稀釋劑 或諸如硬月曰酸鎂之潤滑劑，或諸如對羥基苯甲酸酯或山梨 酉文之防腐剤，或諸如抗壞血酸、生育酚（t〇c〇phe⑺1)或半胱 胺酸之抗氧化劑，崩解劑，黏合劑，增稠劑，緩衝劑，甜 味劑，調味劑或芳香劑。錠劑及丸劑可經此項技術中已知 之合適塗佈物質進一步處理。 用於經口投藥之液體劑型可呈醫藥學上可接受之乳液、 糖漿、關、懸浮液及溶液之形式，其可含有諸如水之非 活性稀釋劑。醫藥調配物及藥劑可使用諸如（但不限於） 油、水、醇及此等物質之組合之無菌液體製備成液體懸浮 液或溶液。可添加醫藥學上合適之界面活性劑、懸浮S、 乳化劑以用於經口或非經腸投藥。 如上所述，懸浮液可包括油。該油包括（但不限於）花生 油、芝麻油、棉籽油、玉米油及橄欖油。懸浮液製劑亦可 含有脂肪酸之酯，諸如油酸乙酯、豆蔻酸異丙酯、脂肪酸 甘油酯及乙醯化脂肪酸甘油酯。懸浮液調配物可包括醇， 諸如（但不限於）乙醇、異丙醇、十六醇、甘油及丙二醇。 諸如（但不限於）聚（乙二醇）之醚、諸如礦物油及石蠟脂之 129126.doc -24· 200843766 石油經及水亦可用於懸浮液調配物中。 1 ;丄“又藥而言’醫藥調配物 劑及視情況I仙几人k ^ 了為含有適當溶 从 化合物之喷霧劑或氣霧劑m 物諸如(但不限於)穩定劑、抗微生物劑叶二:、化合 貝“面活性劑、生物可用性改質劑 劑調配物之推推濟丨^r 4 a 氣務 煙之低濟點=财包括β縮空氣、氛、二氧化碳或基於 用般包括水性懸浮液或油性懸浮液，其可使 ”相或濕潤劑及懸浮劑來製備 呈溶液狀態或呈懸浮液Η 射形式了 # ^ ^ " / y玉，其用洛劑或稀釋劑來製備。 so u ion)或專張生理食越水、，容洛。七去7 #)1 . „ ,, „ 水冷液。或者可將無菌油用作溶 〇 。較佳地’油或脂肪酸為非揮發性的， 天然或合成油、脂肪酸、單甘油醋、二甘油醋或三、甘油 酉旨。 對於注射而言，醫藥調配物及/或藥劑可為適於經如上 所述,適合溶液復水之粉末。其實例包括（但不限於）經冷 凍乾燥、旋轉乾燥或喷霧乾燥之粉末、非晶形粉末、顆 粒、沈殿物或微粒。對於注射而言，該等調配物視情況可 含有穩定劑、PH值改質劑、界面活性劑、生物可用性改質 劑及其組合。 對於直腸技藥而言，醫藥調配物及藥劑可呈用於在腸、 乙狀結腸及/或直腸中釋放化合物之栓劑、軟膏、灌腸 劑、鍵劑或乳膏的形式。直腸栓劑係藉由將一或多種本發 129126.doc -25- 200843766 之化口物或化合物之醫藥學上可接受之鹽或互變異構體 ”例如可可脂或聚乙二醇之可接受媒劑混合來製備，該媒 劑在正常儲存溫度下以固態形式存在，且在體内、諸如在 直腸中適於釋放藥物之彼等溫度下以液態形式存在。油亦 • τ用於製備軟明膠類型調配物及栓劑。水、生理食鹽水、 • 右疑糖及相關糖之水溶液及甘油可用於製備懸浮液調配 • 物，其亦可含有諸如果膠、卡波姆（carbomer)、甲基纖維 素、經丙基纖維素或羧甲基纖維素之懸浮劑以及緩衝劑及 f、 防腐劑。 除上述彼等代表性劑型外，醫藥學上可接受之賦形劑及 載劑一般為熟習此項技術者所知，且因此包括於本發明 内。該等賦形劑及載劑描述於（例如）nRemingt〇ns Pharmaceutical Sciences1» Mack Pub. Co.5 New Jersey (1991)，其如本文中完全闡述般以全文引用的方式併入本 文以達成所有目的。 如下所述，本發明之調配物可設計成短效、快速釋放、 」 長效及持續釋放調配物。因此，醫藥調配物亦可經調配以 達成控制釋放或緩慢釋放。 本發明之組合物亦可包含（例如）微胞或脂質體，或其他 包埋形式，或可呈延長釋放形式投與，以提供長期儲存及/ 或遞送效果。因此，醫藥調配物及藥劑可壓縮成球粒或柱 狀體且以儲槽式注射劑形式或以植入物（諸如，支架）形式 植入肌肉内或皮下。該等植入物可採用已知之惰性材料， 諸如聚矽氧及生物可降解聚合物。 129126.doc -26- 200843766 特定劑量可根據疾病病狀、個體年齡、體重、整體健康 狀況、性別及飲食、給藥時間間隔、投藥途徑、排泄速率 及藥物組合來調節。含有有效量之以上任何劑型完全處於 常規實驗之範圍内，且因此完全處於本發明之範疇内。 治療有效劑量可視投藥途徑及劑型而變。本發明之較佳 化合物為展示高治療指數之調配物。治療指數為毒性效應 與治療效應之間的劑量比，以]11：)5()與EDm之間的比率表 示。ld^為使群體之50%死亡之劑量且eD5q為對群體之

5〇%治療有效之劑量。LD5G&ED5(^f、藉由標準醫藥程序在 動物細胞培養物或實驗動物中測定。 在本發明之上下文中”治療，，意謂緩解與病症或疾病有關 之症狀，或抑制、停止或反轉彼等症狀進一步進展或惡 化，或預防疾病或病症。此外，在本發明之上下文中，，= 療”意謂皮膚、皮下或内臟黑色素瘤生長之抑帝卜皮膚、 皮下或内臟黑色素瘤尺寸之減小，皮膚、皮下或内臟病灶 數目之減少，或皮膚、皮下或内臟病灶尺寸之減小。此 外在本發明之上下文中"治療”意謂疾病反應之生物標記 物的改欠’例如黑色素瘤抑制活性蛋白之循環量減少。舉 例而言’在治療患有黑色素瘤之患者之上下文中，成功治 療可包括供給黑色素瘤或患病組織之毛細管增生減少與 因黑色素瘤之癌性生長、毛細管增生或患病組織相關之症 ㈣解’毛細管增生抑制或停止，或黑色素瘤進展或黑色 素瘤細胞生長或轉移抑制或停止，或黑色素瘤衰退或部分 或完全減輕、疾病穩定或黑色素瘤患者之整體存活率增 I29126.doc -27- 200843766 加。 治療亦可包括與其他療法組合 物。與〇 杈與本發明之醫藥調配

ϋ 物舉例而言，本發明之化合物及醫藥調配物可在 術程序及/或放射療法之前、期間或之後投與。本^ 化合物亦可與用於治療黑色素瘤之其他抗癌藥物結计 與。抗癌藥物意謂由諸如腫瘤學家或其他醫師之熟習此^ 技術者用於治療惡性腫瘤及癌性生長的彼等藥劑。因此，、 本文所揭示之抗癌藥物及化合物（例如，結構卜ια、汨及

之化合物)可同時、分別或連續投與。合適之組合及投 樂方案可由熟習腫瘤學及醫學技術者確定。 X 本發明之化合物及韻物尤其適用於組合療法此係因 為已顯示或期望其在與諸如以下各藥之抗癌藥物組合使用 時展示累加或大於累加或協同效應：紫杉烧、亞硝基腺、 銘化合物、烧基化劑、拓撲異構酶I及II抑制劑、長春花生 物驗、抗癌抗生素，·干擾素、介白素韻放射治療。因 在心樣中，本發明提供包括結構I之化合物及其互 變異構體、鹽及/或混合物以及抗癌藥物之醫藥調配物。 該等組：可單獨或一起包裝於套組中以用於同時、單獨或 連續投藥。本發明亦提供該等化合物、互變異構體、鹽及/ 或混合物在產生該等調配物及藥劑中之用途。 在另〜、樣t本發明提供一種治療轉移黑色素瘤之方 法。β亥方法包括向有需要之個體投與一或多種選自以下各 藥之抗癌藥物：達卡巴嗪（DITC-DOME)、替莫唑胺 (TEMODAR)、卡莫司汀⑺CNu，bicnu)、洛莫司汀 129126.doc •28- 200843766 (CCNU，CEENU)、福莫司汀、太平洋紫杉醇（TAXOL)、多 烯紫杉醇（TAXOTERE)、長春鹼（VELBAN)、伊立替康 (CAMPTOSAR)；沙利度邁（THALIDOMID);鏈脲黴素 (ZANOSAR);放線菌素D(COSMEGEN);二氯甲二乙胺 (MUSTARGEN);順鉑（PLATINOL-AQ)、卡鉑（PARAPLATIN) 、甲磺酸伊馬替尼（GLEEVEC)、索拉非尼（sorafenib) (BAY43-9006，NEXAVAR)、舒尼替尼（sutent)(SU1248, AVASTIN)或埃羅替尼（erlotinib)(TARCEVA)。本發明之化 合物可添加至多化學治療方案中，該等方案諸如 Dartmouth方案、CVD(順翻、長春驗及達卡巴唤）及BOLD (博來黴素、長春新鹼、洛莫司汀及達卡巴嗪）。適合與本 文所揭示之化合物組合使用之其他化學治療劑包括Lens及 Eisen，五xperi P/mrmacoi/zer，2003 4(12): 2205-221 1 中 所討論之彼等化學治療劑。在一些實施例中，抗癌藥物係 選自干擾素，諸如（但不限於）干擾素cx_2a、干擾素α-2b(INTRON-A)、聚乙二醇化干擾素，諸如聚乙二醇化干 擾素a-2b。諸如介白素-2(Proleukin)之介白素亦可與本文 所揭示之化合物組合使用。 本發明之化合物可用以治療多種個體。合適之個體包括 動物，諸如哺乳動物及人類。合適之哺乳動物包括（但不 限於）靈長類動物，諸如（但不限於）狐猴、猿及猴；齧齒動 物，諸如大鼠、小鼠及豚鼠；家兔及野兔；牛；馬；豬； 山羊；綿羊；有袋類動物；及食肉動物，諸如貓科動物、 犬科動物及熊科動物。在一些實施例中，個體或患者為人 129126.doc -29- 200843766 施例中，個 些實施例中 類。在其他實 或大鼠。在一 物’且在一些此類實施例 哺乳動物。 體或患者為齧齒動物， ，個體或患者為除人_ 中，個體或患者為除人 諸如小鼠 以外之動 類以外之 應瞭解用於本發明之有機化合物可展示互變異構現象 由於本說明書中之化學結構僅可表示可能互變異構來戈之 一，因此，應瞭解本發明涵蓋所繪結構之任何互變異構带 式。舉例而言，下文以一種互變異構體互變異構體^顯八 結構IA :

結構IA之其他互變異構體互變異構體Ib及互變異構體^ 顯示如下：

129126.doc -30- 200843766

參考以下實例將更易瞭解由此大體描述之本發明，該等 實例係例示性提供且並不意欲限制本發明。 實例 在本申請案全文中關於化學術語使用以下縮寫： Γ

ΑΤΡ ： 三磷酸腺苷

Boc ： N-第三丁氧羰基 BSA ： 牛血清白蛋白 DMSO : 二甲亞砜 DTT ： DL-二硫蘇糖醇 DMEM ： 達貝科氏改良之伊格爾氏培養基（Dulbecco’s modification of Eaglefs medium) ED5〇 ： 有效治療群體之50%之劑量 EDTA : 乙二胺四乙酸 EGTA ： 乙二醇四乙酸

EtOH ： 乙醇 FBS ： 胎牛血清

Hepes · 4-(2-經乙基）-1 -旅嗪乙烧石黃酸 HPLC ： 高壓液相層析 IC5〇值： 引起所量測之活性減少50%之抑制劑濃度 KHMDS ： 雙（三甲基矽烷基）醯胺鉀 129126.doc -31 - 200843766 LC/MS ： 液相層析/質譜分析 MOPS ： 3-(N-嗎啉基）_丙烷磺酸 PBS : 磷酸鹽緩衝生理食鹽水 PMSF ： 苯基甲烷磺醯氟 RIPA ： 含有（例如）50 mM Tris-HCl (pH 7·4)、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、5 f

pg/ml抗蛋白酶、5 pg/ml亮抑蛋白酶肽、1 % Triton x-100、1 %脫氧膽酸鈉、0.1% SDS之 細胞溶解緩衝液 SDS ： 十二烷基硫酸鈉 TBME ： 第三丁基甲基醚 THF : 四氫σ夫喃

Tris ： 2-胺基-2-(羥甲基）丙烷-1，3-二醇 化合物之純化及特徵化 藉由高效液相層析（HPLC)使用具有2690分離模組之 Waters Millenium層析系統（Milford, Massachusetts)表徵本 發明之化合物。分析管柱為來自Alltech之4.6x250 mm的 Alltima C-18逆相管柱（Deerfield，Illinois)。使用通常以 5% 乙腈/95%水開始且經40分鐘之時段進展至100%乙腈的梯 度溶離。所有溶劑均含有0.1°/。三氟乙酸（TFA)。藉由在220 或254 nm下紫外光（UV)吸收來偵測化合物。HPLC溶劑係 來自 Burdick and J ac ks on (Muskeg an 5 Michigan)或 Fisher Scientific(Pittsburg，Pennsylvania)。在某些情況下，純度 係藉由薄層層析（TLC)使用玻璃或塑膠襯底之矽膠板（諸 129126.doc -32- 200843766 如，Baker-Flex矽膠1B2-F可撓性薄板）來評定。TLC結果 易於在紫外光下或藉由採用熟知之碘蒸氣及其他各種染色 技術在視覺上偵測。 在以下兩種LCMS儀器之一者上執行質譜分析：Waters 系統（Alliance HT HPLC及Micromass ZQ質譜分析儀；管 柱：Eclipse XDB-C 1 8，2· 1 X50 mm ;溶劑系統··於水中之 5_95°/〇乙腈（含有0.05% TFA);流動速率：0.8毫升/分鐘； 分子量範圍：150-850 ;進樣錐電壓：20 V ;管柱溫度： 40°C)或 Hewlett Packard 系統（1100 系列 HPLC ;管柱： Eclipse XDB-C18，2.1x50 mm ;溶劑系統：於水中之 1-95%乙腈（含有0.05% TFA);流動速率：0·4毫升/分鐘；分 子量範圍：150-850 ;進樣錐電壓：50 V ;管柱溫度： 30°C)。全部質量均以質子化母離子之質量來報導。 在Hewlet Packard儀器上執行GCMS分析（使用質量選擇 性偵測器5973之HP6890系列氣相層析儀；注射器體積：1 pL ;初始管柱溫度：50°C ;最終管柱溫度·· 250°C ;勻變 時間：20分鐘；氣體流動速率：1毫升/分鐘；管柱：5%苯 基甲基矽氧烷，型號HP 190915-443，尺寸：30.0 mx25 μηΐχ〇.25 μιη) ° 使用 Flash 40層析系統及KP-Sil，60A(Biotage，Charlottesville， Virginia)或藉由HPLC使用C-18逆相管柱來進行製備型分 離。用於Flash 40 Biotage系統之典型溶劑為二氯曱烷、曱 醇、乙酸乙酯、己烷及三乙胺。用於逆相HPLC之典型溶 劑為不同濃度之乙腈及水（含有〇·1°/❶三氟乙酸）。 129126.doc -33 - 200843766 4-胺基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基）_1H-苯并咪唑-2-基】-1H-喹啉-2-酮之合成

A. 5-(4-甲基-哌嗪-1_基）-2-硝基苯胺之合成 程序A Γ

hnwn_ h2n^^ci h2n^^n^ 將5-氯-2-硝基苯胺（500 g，2.898 mol)及1-甲基哌嗪（871 g，8.693 mol)置放於配備有冷凝器之2000 mL燒瓶中且經 N2淨化。將燒瓶置於100°C油浴中且加熱直至如藉由HPLC 測定5-氣-2-硝基苯胺完全反應（通常隔夜）。在HPLC證實5-氯-2-瑣基苯胺消失後，在機械攪拌下將反應混合物直接傾 倒（仍為溫熱）至2500 mL室溫之水中。攪拌所得混合物直 至其達到室溫且接著將其過濾。將因此所得之黃色固體添 加至1000 mL水中且攪拌30分鐘。過濾所得混合物且將所 得固體用TBME(500 mL，2次）洗滌且接著使用橡膠壩在真 空下乾燥1小時。將所得固體轉移至乾燥盤中且在真空烘 箱中於50°C下乾燥至恆重以產生670 g(97.8%)呈黃色粉末 狀之標題化合物。 129126.doc -34- 200843766

程序B 將5-氯-2-硝基苯胺（308·2 g，m〇1)添加至配備有頂置 式授拌為、冷次是為、進氣口、加料漏斗及溫度計探針之 5000 mL四頸圓底燒瓶中。接著將燒瓶用a淨化。在攪拌 下將1-甲基哌嗪（758.1 g，840 mL，7· 5 7 mol)及200標準強度 之乙醇（508 mL)添加至反應燒瓶中。將燒瓶再次用乂淨化 且在N2下維持反應。將燒瓶在加熱套中加熱至97。^(+/_5。〇 之内部溫度且維持在該溫度下直至如藉由HpLC測定反應 、 完成（通常約4〇小時）。在反應完成後，停止加熱且在攪拌 下使反應物冷卻至約20°C至25°c之内部溫度，且將反應物 攪拌2至3小時。除非已發生沈澱，否則將5_(扣甲基·哌嗪_ 1-基）-2-硝基苯胺之晶種（〇·2〇 g，〇·85 mm〇1)添加至反應混 合物中。經約1小時之時段將水（2,45〇 mL)添加至攪拌反應 混合物中，同時將内部溫度維持在約2〇t至3〇。〇範圍内之 溫度。水添加完成後，在“它至別它之溫度下將所得混合 物攪拌約1小時。接著將所得混合物過濾且用水（3x2 56 L) # 洗滌燒瓶及濾餅。在真空下在約5(rc下在真空烘箱中將金 黃色固體產物乾燥至416 g(98.6%產率）之恆重。

程序C 將5-氣-2-硝基苯胺（401 g，2.32 m〇1)添加至配備有頂置 式攪拌裔、冷凝益、進氣口、加料漏斗及溫度計探針之i 2 L四頸圓底燒瓶中。接著將燒瓶用淨化。在攪拌下將^ 甲基哌嗪（977 g，1·08 L，9·75 瓜〇1)及1〇〇% 乙醇（65〇 mL)添 加至反應燒瓶中。將燒瓶再次用K淨化且在％下維持反 129126.doc -35- 200843766

應。將燒瓶在加熱套中加熱至97°C(+/-5°C)之内部溫度且 維持在該溫度下直至如藉由HPLC測定反應完成（通常約40 小時）。反應完成後，停止加熱且在攪拌下使反應物冷卻 至約80°C之内部溫度，且經由加料漏斗經1小時之時段將 水（3.15 L)添加至混合物中，同時將内部溫度維持在 82°C(+/-3°C)。水添加完成後，停止加熱且經不少於4小時 之時段使反應混合物冷卻至20-25°C之内部溫度。接著在 20-30°C之内部溫度下將反應混合物再攪拌一小時。接著 將所得混合物過濾且用水（1 X 1 L)、50%乙醇（1 X 1 L)及95% 乙醇（lxl L)洗滌燒瓶及濾餅。將金黃色固體產物置放於乾 燥盤中且在真空下在約5(TC下在真空烘箱中乾燥至546 g(99%產率）之恆重。 B. [6-(4-甲基-旅嗓·1·基）-lH-苯并咪峻_2_基]•乙酸乙酯之 合成

程序A

將5000 mL四頸燒瓶配備攪拌器 ϋ 、溫度計、冷凝器及進 129126.doc • 36 - 200843766 氣口 /出氣口。向經裝備之燒瓶中饋入265·7 g(i」2 mol· 1.0當量）之5_(4_甲基-派嗓-i_基）_2_硝基苯胺及2125 mL 200標準強度之EtOH。將所得溶液用％淨化15分鐘。接 著，添加 20.0 g 5% Pd/C(50% H20 w/w)。將反應物在 40-50°C (内部溫度）下劇烈攪拌，同時使出鼓泡通過混合物。 每小時藉由HPLC針對5_(4·甲基-派嗪小基琐基苯胺之 消失來監測反應。典型反應時間為6小時。

在所有5-(4-甲基-哌嗪-1-基>2-硝基苯胺自反應物中消 失後’將溶液用&淨化15分鐘。接著，添加440.0 g(2.25 mol)呈固體狀之3-乙氧基-3-亞胺基丙酸乙酯鹽酸鹽。將反 應物在40-50°C(内部溫度）下攪拌直至反應完成。藉由以 HPLC跟蹤二胺基化合物之消失來監測反應。典型反應時 間為1 -2小時。反應完成後，將其冷卻至室溫且經石夕藻土 過濾材料襯墊過濾。將矽藻土過濾材料用無水Et〇H(2x25〇 mL)洗務且將滤液在減壓下濃縮以提供稠厚褐色/橙色油狀 物。將所得油狀物溶解於850 mL 〇·37%之HO溶液中。接 著整份添加固體NaOH(25 g)且沈澱形成。將所得混合物攪 拌1小時且接著過濾。將固體用H2〇(2x4〇〇㈤“洗滌且在 50C下在真空烘箱中乾燥以提供251.7 g(74.i%)呈淺黃色 粉末狀之[6-(4-甲基-哌嗪-1-基）_1^苯并咪唑_2_基]_乙酸 乙酉旨。

程序B 將5000 mL之四頸夾套燒瓶配備機械攪拌器、冷凝哭 溫度探針、進氣口及油鼓泡器 向所裝備之燒瓶中饋 入 129126.doc -37- 200843766 300 g(l，27 mol)5_(4-甲基-派嗪·14)_2_ 硝基苯胺及 24〇〇 mL 200標準強度之EtOH(該反應可用95%乙醇進行或已用 95%乙醇進行且對此反應而言無需使用2〇〇標準強度之乙 醇）。將所得溶液攪拌且用N2淨化15分鐘。接著，將22 7泛 5% Pd/C(50°/〇 ΗζΟ w/w)添加至反應燒瓶中。將反應容器用 %淨化15分鐘。用％淨化之後，藉由維持通過燒瓶之緩慢 但怪疋之氫氣流來將反應容器用Η:淨化。將反應物在45_ 55°C (内部溫度）下攪拌同時使Η:鼓泡通過混合物直至如藉 由HPLC測定5-(4·甲基-哌嗪_1-基）-2-硝基苯胺完全耗盡。 典型反應時間為6小時。 在所有5-(4-甲基-σ辰嗓-1-基）_2_硝基苯胺自反應物中消 失後’將溶液用Ν2淨化1 5分鐘。因為二胺中間物對空氣敏 感，所以應小心以避免其曝露於空氣中。經約30分鐘之時 段將500 g(2.56 mol)3 -乙氧基-3-亞胺基丙酸乙酷鹽酸鹽添 加至反應混合物中。在45-5 5°C(内部溫度）下在N2下攪拌反 應物直至如藉由HPLC測定二胺完全耗盡。典型反應時間 為約2小時。反應完成後，將反應物趁熱經由石夕藻土襯墊 過濾。接著將反應燒瓶及矽藻土用200標準強度之EtOH (3χ；285 mL)洗滌。將濾液組合於5〇〇〇 mL燒瓶中，且在真 空下將約3 3 00 mL·乙醇移除以產生撥色油狀物。將水（$ 3 〇 mL)添加至所得油狀物中且接著添加1 μ HCL(350 mL)， 且擾拌所得混合物。將所得溶液劇烈搜拌同時經約2〇分鐘 之時段添加30% NaOH(200 mL)，保持内部溫度在約25-30°C，同時使pH值在9與10之間。將所得懸浮液攪拌約4小 129126.doc -38- 200843766 時同時保持内部溫度在約20_25t。將所得混合物過滤且 用H2〇(3x3〇〇 mL)洗滌濾餅。在5〇t：下在真空下在真空烘 粕中將所收集之固體乾燥至恆重以提供345.9 g(9〇.l%)呈 淺κ色粉末狀之[6_(4_曱基_哌嗪]_基卜丨^苯并咪唑_2_ 基]乙S文乙g曰。在一替代處理程序中，將濾液組合且在真 空下將乙醇移除直至移除至少約9〇%。接著將中性pH值之 水添加至所得油狀物中，且使溶液冷卻至約Ot：。接著在 快速攪拌下緩慢添加2〇% NaOH水溶液以使pH值至9.2(用 pH計讀取）。接著如上所述將所得混合物過濾且乾燥。該 替代處理程序提供淡棕褐色至淡黃色產物，產率高達 97% 〇 降低[6-(4-甲基-哌嗪_1β基）_111-苯并咪唑基】乙酸乙酯 之水含量之方法 將先前已處理且乾燥至約8-9% H2〇之水含量的[6-(4-甲 基-哌嗪_1-基）-1Η·苯并咪唑-2-基]-乙酸乙酯（12〇·7公克）置 放於2000 mL圓底燒瓶中且溶解於純乙醇（5〇〇 mL)中。使 用方疋轉蒸發為在加熱下將琥珀色溶液濃縮為稠厚油狀物直 至所有/容劑移除。將該程序重複兩次以上。將因此所得之 稠厚油狀物留在燒瓶中且置放於真空烘箱中，於5〇t下加 熱隔夜。卡爾費休分析（Kad Fisher analysis)結果指示水含 量為5·25%。在以下實例之程序中，藉由此方法獲得之降 低之水含I提供增加之產率。對於此乾燥過程而言，可使 用諸如甲苯及THF之其他溶劑替代乙醇。 C· 4·胺基氟-3-[6-(4-甲基·哌嗪q•基）1Η-苯并咪唑_2_ 129126.doc -39- 200843766

基】-1H-喹啉_2-酮之合成 程序A

L) 在配備有冷凝器、機械攪拌器、溫度探針之5〇〇〇 mL燒 瓶中將[6-(4-甲基-哌嗪-1-基卜丨化苯并咪唑_2_基]_乙酸乙 酯（250 g，820 mmol)(如上所述經乙醇乾燥）溶解於THF (3 800 mL)中且用氬軋淨化。將2_胺基_6-氟_苯甲腈（95 3 ^ 700 mmol)添加至溶液中，且使内部溫度升至4〇。〇。當所 有固體溶解且溶液溫度達到钧它時，經5分鐘之時段添加 固體KHMDS(376.2 g，1890 mmol)。當鉀驗添加完成時， 獲得不均勻之黃色溶液且内部溫度已升至62它。6〇分鐘之 時段後，内部溫度降回至4(rc，且藉由HpLC測定反應完 成（無起始物質或未環化之中間物存在）。接著藉由將稠厚 反應混合物傾倒至H2〇(6〇〇〇 mL)中來使其反應中止且攪拌 所得混合物直至其達到室溫。接著，將混合物過濾且將濾 塾用水（1GGG mL，2次）洗條。將亮黃色固體置放於乾燥盤 中且在真空烘箱中於5(rc下乾燥隔夜以提供15以 (47.9%)所需之4.胺基_5_氟|[6_(4_甲基_略嗓小基）秦苯 并咪唑_2_基]-1H·喹啉_2_酮。

程序B

蒸餾設備、溫度探針、N 將5000 mL四頸夾套燒瓶裝備 129126.doc 200843766 進氣口、加料漏斗及機械攪拌器。將[6_(4_甲基-哌嗪 基）-1Η-苯并咪唑-2-基>乙酸乙酯（173 〇 g，57〇 mm〇1)饋入 反應器中，且將反應器用％淨化15分鐘。接著在擾拌下將 無水THF(2600 mL)饋入燒瓶中。在所有固體已溶解後，必 要時使用熱藉由蒸餾（真空或大氣壓）將溶劑移除（較高之溫 度有助於移除水）。移除1000 mL溶劑後，停止蒸餾且將天 應物用&淨化。接著將1〇〇〇 mL無水11117添加至反應容器 中，且當所有固體溶解時，再次進行蒸餾（真空或大氣壓） 直至再移除1 〇〇〇 mL溶劑。將添加無水THF及移除溶劑之 過程重複至少4次（第四次蒸餾時，移除溶劑之6〇%，而在 月ίΐ 3次蒸餾中僅移除4〇〇/0)，此後移出i 品用於卡爾費 休分析以測定水含量。若分析顯示樣品含有小於〇.2〇%之 水，則如下一段落所述繼續反應。然而，若分析顯示大於 0.20%之水，則繼續上述乾燥過程直至達成小於〇 2〇%之水 含量。 在使用先前段落描述之程序達成小於〇 2〇%或約〇 2〇%之 水含量後’將蒸餾裝置替換為回流冷凝器，且向反應物中 饋入2-胺基-6·氟—苯甲腈（66·2 g，47〇 在一些程序中 使用〇·95當量）。接著將反應物加熱至38-42°C之内部溫 度田内部溫度已達到3 8-42°C時，經由加料漏斗經5分鐘 之時段將 KHMDS 溶液（1313 g，1·32 mo丨，2〇% kHMDS 於 THF中）添加至反應物中，在添加期間保持内部溫度在約 38-5〇 C。當卸驗添加完成時，將反應物授拌3 5至4·5小時 (在二實例中將其攪拌30至60分鐘且反應可在此時間内 129126.doc -41 - 200843766 完成），同時保持内部溫度在38_42t。接著將反應之樣品 移出且藉由HPLC分析。若反應未完成，則經5分鐘之時段 將額外KHMDS溶液添加至燒瓶中且將反應物在爪批下 攪拌45-60分鐘（所添加之KHMDS溶液之量係由以下條件確 • 疋若1PC比率<3·50 ’則添加〗25 mL ;若l〇.〇2ipc比率 >3.50，則添加56 mL ;若2〇 〇ypc比率Μ，則添加％ mL。IPC比率等於‘胺基_5_氟_3_[6_(4_甲基-派嗪小基> 1H-苯并咪唑-2-基]·1H_喹啉_2_酮所對應之面積除以未環 f 化中間物所對應之面積）。一旦反應完成（IPC比率>20)，使 反應器冷卻至25-30〇C之内部溫度，且經15分鐘之時段將 X (3 50 mL)饋入反應裔，同時保持内部溫度在。。（在 一替代情形中，在40。〇下進行反應且在5分鐘内添加水。 更快之中止減少在此期間形成之雜質之量）。接著將回流 冷凝器替換為蒸餾裝置且需要時使用熱藉由蒸餾（真空或 大氣壓）將溶劑移除。移除15〇〇 mL溶劑後，停止蒸餾且將 、 反應物用乂淨化。接著將水（1660 mL)添加至反應燒瓶中 ^ 同時保持内部溫度在2〇_3〇γ：。接著在2〇-3〇t下將反應混 合物攪拌30分鐘，接著使其冷卻至5_1〇r之内部溫度且接 纟將錢拌1小時。將所得懸浮液㈣，且將燒瓶及濾餅 用水（3x650 mL)洗滌。在真空下在5〇r下在真空烘箱中將 因此所得之固體乾燥至恆重以提供1〇3·9 g(42 6%產率）呈 貝色粕末狀之4-胺基-5-氟-3-[6-(4-曱基-哌嗪基）^士苯 并咪唑-2_基]_111_喹啉_2_酮。

程序C 129126.doc -42- 200843766

(608 g，2.01 mol)(經乾燥）及2-胺基-6-氟-苯曱腈（274 g， 2-01 mol)饋入位於加熱套上且配備有冷凝器、機械攪拌 • 器、進氣口及溫度探針之12 L四頸燒瓶中。將反應容器用 %淨化，且將甲苯（7·7 L)饋入反應混合物中同時將其攪 {; 拌。將反應容器再次用Ν2淨化且維持在Ν2下。將混合物内 部溫度升高直至達到63°c(+/-3°c)之溫度。將混合物之内 部溫度維持在63°C(+/-3°C)下，同時在減壓（380+/-10托， 蒸餾頭1=40°(：(+/-10°〇)下自燒瓶蒸餾約2.6[曱苯（使用卡 爾費休分析來檢查混合物中之水含量。若水含量大於 0·03%，則再添加2·6 L甲苯且重複蒸餾。重複此過程直至 達成小於0·03%之水含量）。在達到小於〇 〇3%之水含量 後，停止加熱且在Ν2下使反應物冷卻至} 丨9它之内部溫 I / 度。接著在N2下以一定速率將THF中之第三丁醇鉀（2〇%於 THF中，3.39 kg、6·04莫耳之第三丁醇鉀）添加至反應物中 以使反應物之内部溫度保持在2(rc以下。在第三丁醇鉀添 加完成後，在低於2〇°C之内部溫度下將反應物攪拌3〇分 鐘。接著使溫度升至25°C且將反應物攪拌至少丨小時。接 著使溫度升至3(TC且將反應物攪拌至少3〇分鐘。接著使用 HPLC檢查起始物質之消乾樁、、兄冰 貝< β粍If况來監測反應完成情況（通常 2-3小時内，兩種起始物質均已鉍素 貝J匕耗盡（UHPLC面積0/〇計小於 129126.doc •43- 200843766 0·5%))。若2小時後反應未完成，則適時再添加〇·〇5當量之 第二丁醇鉀且直至HPLC顯示反應已完成才結束該過程。 反應完成後，將650 mL水添加至經攪拌之反應混合物中。 接著將反應物溫至50°C之内部溫度且在減壓下將THF自反 應混合物中蒸餾除去（以體積計約3 L)。接著使用加料漏斗 將水（2.6 L)逐滴添加至反應混合物中。接著將混合物冷卻 至室溫且攪拌至少1小時。接著將混合物過濾且將濾餅用 水（1.2 L)、70%乙醇（1·2 L)及95°/〇乙醇（1.2 L)洗滌。將亮 黃色固體置放於乾燥盤中且在真空烘箱中於5〇r下乾燥直 至獲得恆重以提供674 g(85.4%)所需之4-胺基-5-氟-3-[6-(4-曱基-哌嗪-1-基）_丨^苯并咪唑_2_基]-1H-喹啉-2-酮。 4-胺基-5-氟-3-[6-(4-甲基·哌嗪-1-基）-iH-苯并咪唑-2-基】- 1H-喹啉_2_酮之純化 將裝備有冷凝器、溫度探針、乂進氣口及機械攪拌器之 3 000 mL四頸燒瓶置放於加熱套中。接著向燒瓶中饋入4_ 胺基-5-氟-3-[6-(4-甲基-哌嗪-1-基）·1Η_苯并咪唑_2_基μ 1Η-喹啉-2_酮（101·0 g，0·26 mol)，且將黃色固體懸浮於 95%乙醇（1〇〇〇 mL)中且攪拌。在一些狀況下，使用8: • 溶劑比率。接著在攪拌下經約1小時之時段將懸浮液加熱 • 至溫和回流（約76°C之溫度）。接著將反應物攪拌45-75分 鐘’同時回流。此時，將熱自燒瓶移除且使懸浮液冷卻至 25-30°C之溫度。接著將懸浮液過濾且將濾墊用水（2χ5〇〇 mL)洗務。接著將黃色固體置放於乾燥盤中且在真空烘箱 中於50。(：下乾燥直至獲得恆重（通常16小時）以獲得97.2 129126.doc -44- 200843766 g(96.2%)呈黃色粉末狀之純化產物。 D· 4_胺基-5-氟_3·丨6_(4_甲基-哌嗪基）_1H苯并咪唑 基】-1H-喹啉_2-_之乳酸盥之製備

D,L·乳酸 EtOH, H20

ϋ 將3000 mL四頸夾套燒瓶配備冷凝器、溫度探針、乂進 氣口及機械攪拌器。將反應容器用乂淨化至少15分鐘且接 著向其中饋入4-胺基-5-氟-3-[6-(4-曱基-略嗪_1_基）_；^-苯 并米嗤-2-基]喧琳-2 -酮（484 g，1·23 mol)。製備 d，L_ 乳酸（243.3 g、ι·72 mol單體-參見以下段落）、水（339 mL) 及乙醇（1211 mL)之溶液且接著將其饋入反應燒瓶中。以 中等速率開始攪拌且將反應物加熱至68-72X：之内部溫 度。將反應物之内部溫度維持在68-72°C下歷時15-45分鐘 且接著停止加熱。經由10-20微米玻璃料過濾所得混合 物’將濾液收集於12 L燒瓶中。將該12 L燒瓶裝備内部溫 度探針、回流冷凝器、加料漏斗、進氣口、出氣口及頂置 129126.doc -45- 200843766 式攪拌器。接著將濾液以中等速率攪拌且加熱至回流⑼ 78°C之内部溫度）。在維持溫和回流的同時，經⑽分鐘 之時段將乙醇（3,596 mL)饋入燒槪中。接著在卜心分鐘内 使反應燒瓶冷卻至約64_7〇。。範圍内之内部溫度且維持此 溫度約30分鐘之時段。針對晶體來檢查反應器。若不存在 晶體，則將4-胺基-5ϋ[6_(心甲基·派唤小基）_ih_苯并 咪嗤-2-基]*啥琳_2-綱（484叫，〇1莫耳％)之乳酸鹽之晶 體添加至燒瓶中，且在64_70t：下將反應物攪拌3〇分鐘， 接著再次針對晶體來檢查燒瓶。一旦出現晶體，即將攪拌 減小至較低速率且在64_7(rc下將反應物再攪拌9〇分鐘。 接著經約2小時之時段使反應物冷卻至約〇t：，且經由25_ 5〇微米燒結過濾器過濾所得混合物。將反應器用乙醇（484 mL)洗滌且攪拌直至内部溫度為約〇。〇。使用冷乙醇來洗滌 濾餅且再重複此程序2次。在真空下在50°C下在真空烘箱 中將所收集之固體乾燥至恆重以產生510.7 g(85.7%)4-胺 基5-氟_3_[6-(4-甲基-派唤小基）_1只_苯并咪嗤_2_基卜1H_ 圭琳2酮之頁色乳酸鹽晶體。在過滤過程中通常使用橡膠 &或惰性條件。雖然乾燥固體似乎並不極具吸濕性，但濕 濾'餅傾向於吸取水且變黏。多加防範以避免濕濾餅長時間 曝露於大氣。 商業乳酸一般含有約8-12% w/w之水，且除單體乳酸外 亦含有二聚體及三聚體。乳酸二聚體與單體之莫耳比率一 般為約1.0:4.7。商業級乳酸可用於前段所述之過程中，此 係因為單乳酸鹽優先自反應混合物中沈澱。 129126.doc -46- 200843766 代謝物之鑑別 自如併入本文之參考文獻所述之2週毒物學研究在彙隹 之大鼠血漿中鑑別且表徵4_胺基_5_氟_3_[6_(4_甲基_娘 1-基）_1H-苯并咪唑_2_基ΗΗ_嗤琳_2_酮（化合物㈣兩種代

謝物。所鑑別之兩種代謝物為下文所示之哌嗪沁氧化物化 合物（化合物2)及Ν-脫甲基化合物（化合物3)。

化合物2

Ν Ν

Η 化合物3 4-胺基-5_氣-3-丨6-(4-甲基-4-氧離子基旅唤-1-基）-ΐ Η-苯并 味哇_2_基】喹啉-2(1Η)-酮（化合物2)及4-胺基-5-氟-3-(6-哌 唤-1-基-1H-苯并咪唑基）喹啉-2(1H)-酮（化合物3)之合成 為證實所鑑別之化合物1代謝物之結構，獨立合成該等 代謝物。 化合物1之N-氧化物代謝物化合物2係如以下流程所示來 合成。將化合物1在乙醇、二甲基乙醯胺及過氧化氫之混 129126.doc -47- 200843766 合物中加熱。反應完成後，將化合物2藉由過濾分離且用 乙醇洗滌。必要時，產物町進一步藉由管柱層析法純化。

化合物1之N-脫甲基代謝物化合物3係如以下流程所示來 合成。將5-氣-2-硝基苯胺用哌嗪處理以產生4，隨後將4用 Γ 丁氧羰基（Boc)基團保護以產生5。還原硝基接著與3_乙氧 基-3-亞胺基丙酸乙酯縮合產生6。使用雙（三甲基矽烷）胺 基鉀作為鹼使6與6-氟鄰胺基苯甲腈縮合產生7。將粗7用 HC1水溶液處理隨後純化以產生呈黃色/褐色固體狀之所需 代謝物。 (j

1. H2, Pd/C

Oh (Boc)20 〇2N)0l

Oboc

F

KHMDS nhhci Etol、0Et

7

F

檢定程序 酪胺酸激酶 129126.doc -48- 3 200843766 藉由提供ATP及含有用於磷酸化之酪胺酸胺基酸殘基之 合適肽或蛋白質，且採用針對磷酸根部分基團轉移至酪胺 酸殘基之檢定法來量測諸多蛋白酪胺酸激酶之激酶活性。 使用桿狀病毒（Baculovirus)表現系統（InVitrogen) ’在Sf9 昆蟲細胞中表現對應於FLT-l(VEGFRl)、VEGFR2、 VEGFR3、Tie-2、PDGFRa、PDGFRP及 FGFR1 受體之細胞 • 質域的重組蛋白，且可經由Glu抗體相互作用（針對具有

Glu抗原決定基標籤之構築體）或藉由金屬離子層析法（針對 f) 具有His6(SEQ IDNO:l)標籤之構築體）來純化。各檢定法 中，將測試化合物在DMSO中連續稀釋且接著與合適之激 酶反應緩衝劑加ATP混合。添加激酶蛋白及合適之標記生 物素之肽受質，產生50-100 μΐ^之最終體積，將反應物在 室溫下培育1-3小時，且接著藉由添加25-50 μί之45 mM EDTA、50 mM Hepes(pH 7.5)來中止反應。將經中止之反 應混合物（75 μΙ〇轉移至塗佈抗生蛋白鏈菌素之微量滴定盤 (Boehringer Mannheim)中且培育1小時。使用標記銪之抗 磷酸酪胺酸抗體PT66，採用DELFIA隨時間解析之螢光系 統（Wallac或PE Biosciences)量測填酸化肽產物，但其中修 . 改DELFIA檢定緩衝劑為補充有1 mM MgCl2以用於抗體稀 釋。在Wallac 123 2 DELFIA螢光計或PE Victor II多重信號 讀出器上讀取隨時間解析之螢光。採用非線性迴歸法，使 用XL Fit數據分析軟體計算達成50%抑制之各化合物濃度 (IC50)。 在 50 mM Hepes pH 7·0、2 mM MgCl2、10 mM MnCl2、 129126.doc -49- 200843766 1 mM NaF、1 mM DTT、1 mg/mL BSA、2 μΜ ATP及 0·20-0·50 μΜ相應標記生物素之肽受質中檢定FLT-1、 VEGFR2、VEGFR3、FGFR3、Tie-2 及 FGFR1激酶。卩1^-1、VEGFR2、VEGFR3、Tie-2 及 FGFR1 激酶分別以 0·1 pg/ml、0.5 pg/ml或 0·1 pg/ml添加。對於PDGFR激酶檢 定，使用120 pg/ml酶以及與上文相同之緩衝條件，其中例 ' 外為將ATP及肽受質濃度改變成1.4 μΜ ATP及0.25 μΜ生 物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID ΝΟ:2)肽受質。 fl 重組及活性酪胺酸激酶Fyn及Lck可購得且係自Upstate

Biotechnology購得。用於各檢定之測試化合物係在DM SO 中連續稀釋且接著與合適之激酶反應緩衝劑加10 ηΜ 33Ρ γ 標記之ATP混合。添加激酶蛋白及合適之標記生物素之肽 受質以產生150 μί之最終體積。將反應物在室溫下培育3-4小時且接著藉由轉移至含有100 mM EDTA與50 μΜ未標 記之ΑΤΡ之100 μι中止反應緩衝劑的塗佈抗生蛋白鏈菌素 之白色微量滴定盤（Thermo Lab systems)而中止反應。培育 〇 1小時後，將抗生蛋白鏈菌素培養盤用PBS洗滌且每孔添加 200 μί Microscint 20閃爍計數液體。將培養盤密封且使用 . TopCount計數。採用非線性迴歸法，使用XL Fit數據分析 軟體計算達成50%抑制之各化合物濃度（IC50)。

Fyn、Lck及c-ABL之激酶反應緩衝劑含有5〇111]\4丁148-HC1 pH 7.5、15 mM MgCl2、30 mM MnCl2、2 mM DTT、2 mM EDTA、25 mM β-磷酸甘油酯、0,01% BSA/PBS、0.5 μΜ之合適肽受質（標記生物素之Src肽受質：針對Fyn及 129126.doc -50- 200843766

Lck，使用生物素-GGGGKVEKIGEGTYGVVYK-NH2(SEQ ID NO :3))、1 μΜ未經標記之ATP及1 nM激酶。 藉由提供ATP及含有用於磷酸化之酪胺酸胺基酸殘基之 肽或蛋白質且採用針對磷酸根部分基團轉移至酪胺酸殘基 之檢定法來量測c-Kit及FLT-3之激酶活性。購買對應於c-Kit及FLT-3受體之細胞質域的重組蛋白（Proquinase)。用於 • 測試時，將例如4-胺基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基）-1Η-苯并咪唑-2-基]喹啉-2(1 Η)-酮之例示性化合物在DMSO中 ^ I 稀釋且接著與下述激酶反應緩衝劑加ΑΤΡ混合。添加激酶 蛋白（c-Kit或FLT-3)及標記生物素之肽受質（生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2(SEQ ID NO:2)))以產生 100 pL 之最終體積。將此等反應物在室溫下培育2小時且接著藉 由添加 50 μί 45 mM EDTA、50 mM HEPES(pH 7.5)來中 止。將經中止之反應混合物（75 μί)轉移至抗生蛋白鏈菌素 塗佈之微量滴定盤（Boehringer Mannheim)中且培育1小 時。使用銪標記之抗磷酸酪胺酸抗體PT66用DELPHI A隨 C/ 時間解析之螢光系統（Wallac或PE Biosciences)量測峨酸化

肽產物，其中修改為DELFIA檢定緩衝劑補充有1 mM • MgCl2以用於抗體稀釋。在Wallac 1232 DELFIA螢光計或 PE Victor II多重信號讀出器上測定隨時間解析之螢光值。 採用非線性迴歸使用XL Fit數據分析軟體計算達成50%抑 制之各化合物濃度（IC50)。 將 FLT-3 及 c-Kit 激酶在 50 mM Hepes pH 7·5、1 mM NaF、2 mM MgCl2、1〇 mM MnCh及 1 mg/mL BSA、8 μΜ 129126.doc 51 200843766 ATP及1 μΜ相應標記生物素之肽受質（生物素-GGLFDDPSYVNVQNL-NH2 (SEQ ID ΝΟ:2))中檢定。FLT-3 及c-Kit激酶之檢定濃度為2 ηΜ。將最終濃度為1 μΜ之磷 酸化肽受質與銪標記之抗磷酸酪胺酸抗體（PT66)(Perkin Elmer Life Sciences，Boston，ΜΑ)—起培育。使用隨時間 • 解析之螢光偵測銪。使用非線性迴歸計算IC50。 • 由第三方廠商使用以下方法之每一者檢定FGFR2及 FGFR4。 ζ \ 才法 d :如下採用 KinaseProfiler(Upstate/Millipore)直接 輻射測量檢定。在25 μι最終反應體積中，將FGFR2或 FGFR4(人類，5-10 mU)與 8 mM MOPS pH 7.0、0.2 mM EDTA、2.5-10 mM MnCl2、0.1 mg/mL聚（Glu，Tyr)4:l、10 mM乙酸錢及約500 cpm/pmol比活度之[γ 32P-ATP](濃度視 需要而定）一起培育。藉由添加MgATP混合物開始反應。 在室溫下培育40分鐘後，藉由添加5 μι 3%磷酸溶液來中 止反應。接著將10 μί反應物點樣於Filtermat Α上且在75 〇 mM磷酸中洗滌3次，歷時5分鐘，且在曱醇中洗滌1次，接 著乾燥且閃爍計數。

才法5 : Millipore Z*-LYTE激酶檢定（Invitrogen)係基於 螢光共振能量傳遞法且如下加以採用。在50 mM HEPES pH 7,5、0.01% BRIJ-35、10 mM MgCl2、4 mM MnCl2、1 mM EGTA、2 mM DTT 中製備 2X FGFR2 或 FGFR4/Tyr 04肽 混合物。最終10 μι激酶反應物由50 mM HEPES pH 7.5、 0·01% BRIJ-35、10 mM MgCl2、2 mM MnCl2、1 mM 129126.doc -52- 200843766 EGTA、1 mM DTT 中之 0.3-2.9 ng FGFR2 或 2.4-105 ng FGFR4及2 μΜ Tyr 04肽組成。激酶反應物培育1小時後， 添加5 pL 1:3 2稀釋之顯色試劑B。 MIA蛋白 西才差淼分# :針對如本文所述之MIA蛋白檢定CHL-1 細胞或血浆。收集全血以在BD microtainerR分離管（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中製備血聚。將CHL-1 細胞 在攝酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS，Mediatech，Inc·，Herndon， VA)申洗滌兩次且在冰上於含有新鮮1 mM苯甲基績醯氟、 完全小型蛋白酶抑制劑混合物錠劑（2錠劑/25毫升溶解緩衝 劑）（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim，Germany)及 IX填 酸酶抑制劑混合物 II(Sigma-Aldrich，St· Louis，MO)之 RIP A 緩衝劑（50 mM Tris HCl(pH 7.4)、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、2 mM原釩酸鈉、20 mM焦磷酸鹽、 1% Triton X-100、1%脫氧膽酸鈉及0.1% SDS)中溶解20分 鐘。將溶解產物收集於離心管中，在4°C下以14K RPM旋 轉 20 分鐘，且經由 QIAshredder 管（QIAGEN，Inc·，Valencia, CA)過濾。使用BCA檢定根據廠商之方案（Pierce, Rockford，IL)來測定蛋白質濃度。藉由標準方法使用 Novex® 18% Tris-甘胺酸凝膠（Invitrogen，Carlsbad，CA)加 工樣品以用於西方墨點法。將MI A用羊多株抗體（R & D Systems，Minneapolis，MN)债測，1:1000稀釋於含有 5。/〇奶 粉之TBST(含有0.1% Tween®20之Tris緩衝生理食鹽水， Fisher Scientific，Hampton，NH)中且在4°C下培育隔夜。二 129126.doc -53- 200843766 次抗體為1:5000稀釋之辣根過氧化物酶連接之抗羊抗體 (Vector Laboratories，Burlingame，CA)。使用增強化學發 光（Amer sham Bio sciences，Pi scataway，NJ)觀測蛋白條帶。 藉由β肌動蛋白偵測（Sigma_Aldrich，St. Louis，MO)證實同 等負載及轉移。來自兩個商業來源之人類重組MI A蛋白 (MW 12-kDa)用作陽性對照（Axxora，LLC，San Diego, CA及 ProSpec-Tany TechnoGene，LTD，Rehovot，Israel) 〇 ML4五ZJM撿定：將等量之人類黑色素瘤及結腸直腸癌 細胞（每一細胞株約250,000個細胞）接種於組織培養盤上且 48小時後收集各細胞株之培養基。藉由商業單步驟ELIS A 套組根據廠商之方案（Roche Diagnostics Corporation， Indianapolis，IN)量測培養基或血黎:中之MIA含量。使用在 3-37 ng/mL範圍内之標準曲線計算測試樣品中之MIA濃 度。當MIA濃度超過最高標準濃度時，將樣品1:5稀釋且再 次檢定以具有在標準曲線線性範圍内之結果。使用司徒頓 t檢驗（Student t-test)(雙尾分布，兩樣品不等變異數）評估 數據，使用PS0.05作為顯著程度。 統計分析 使用Microsoft Excel(Redmond，WA)執行線性迴歸。使 用司徒頓t檢驗量測兩個治療組之間的統計顯著性。使用 單向變方分析（ANOVA)進行多重比較且使用司徒頓-紐曼-柯爾檢驗（Student-Newman KeuTs test)(SigmaStat? San Rafael，CA)進行比較不同治療方式之事後檢驗（posttest) 。 對於 存活研 究而言 ，使 用時序 檢驗來 測定各 種治療 129126.doc -54· 200843766 組與媒劑組之存活曲線之間的顯著性（Prism，San Diego, CA)。將在研究結束時處死之健康狀態正常之小鼠視為長 期存活者且在此分析中檢查。將ρ<〇·05之差異視為統計上 顯著的。 黑色素瘤細胞株之西方分析。將黑色素瘤細胞株用冷 ’ PBS洗滌，自培養盤中收集且在4°C下於含有蛋白酶及磷酸 酶抑制劑混合物（Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)及 1 mM PMSF(Sigma)之 RIPA 緩衝劑（20 mM Tris，pH 8 ; 135 ζχ mM NaCl ; 2 mM EDTA pH 8 ; 10%#&;l%TritonX- 100 ; 0.1% SDS ; 0.1%脫氧膽酸鈉）中溶解1小時。將蛋白 溶解產物以14000 rpm離心10分鐘且收集所得上清液。使 用 BCA檢定（Pierce Chemical Company，Rockford，IL)來測 定蛋白含量。將總蛋白在Novex Tris-甘胺酸SDS-PAGE凝 膠（In vitro gen)上進行電泳且將蛋白質轉移至0·45 μΜ硝酸 纖維素膜（Invitrogen)。為债測FGFR-1、2、3及4之蛋白含 量，將總蛋白（100 pg)在Novex Tris-甘胺酸SDS-PAGE凝膠 〇 (Invitrogen)上進行電泳且將蛋白質轉移至0.45 μΜ硝酸纖 維素膜（Invitrogen)。在4°C下將膜在含有5%脫脂奶粉之 . TBS-T(0.1% Tween 20)(阻斷緩衝劑）中阻斷最少1小時且接 著與一次抗體一起在阻斷緩衝劑（總蛋白）或經過濾之含有 5% BSA之TBS-T(磷酸基-蛋白）中培育3-4小時或隔夜。將 二次抗小鼠或抗兔抗體在阻斷緩衝劑中在室溫下培育1小 時。將膜用TBS-T(0.1% Tween20)洗滌3x15分鐘，接著在 曝露於Kodak膠片後進行ECL西方债測（Amersham 129126.doc -55- 200843766

Biosciences)。使用對FGFR-1具特異性之抗體（Novus Biologicals abl0646)、對FGFR-2具特異性之抗體（Novus Biologicals ab5476)、對 FGFR3 具特異性之抗體（Novus Biologicals abl0649)及對 FGFR-4 具特異性之抗體（Santa Cruz 016)進行西方分析。 細胞群落檢定（Clonogenic assay)。使用改良之雙層軟瓊 脂檢定以24孔盤格式執行細胞群落存活檢定。簡言之，底 層由0.2毫升/孔之伊思考夫氏改良達貝科氏培養基 (Iscoves’s Modified Dulbecco’s Medium，Invitrogen)組 成，該培養基補充有20%胎牛血清、〇·〇 1 % w/v慶大徽素 (gentamicin)及0.75%瓊脂。將人類黑色素瘤細胞株作為皮 下生長於NMRI nu/nu小鼠中之實體人類腫瘤異種移植物以 連續繼代繁殖。藉由機械分散及隨後在37。(：下在RPMI 1640培養基（Invitrogen)中用由IV型膠原酶（41 U/mL， Sigma)、DNase 1(125 U/mL，Roche)及 III 型玻尿酸酶（1〇〇 U/mL，Sigma)組成之酶消化培育3〇分鐘，產生單細胞懸浮 液。將細胞通過2〇〇 μιη及5〇 μπι篩網尺寸之篩網且用無菌 PBS洗滌兩次。將細胞（ΐ·5χ1〇4至6xl〇4)單獨接種於補充有 0.4%瓊脂之培養基中且塗於基層上且曝露於各種濃度之化 合物1，接著在加濕氣氛中37t及7.5%二氧化碳下培育8_ 20天。顯微鏡下監測細胞之群落生長（直徑>5〇 。在最 大群落形成時，使用自動影像分析系統（〇MNIC〇N 36〇〇, Biosys GmbH)執行計數。 藥物作用係根據藉由比較經處理之孔中平均群落數目與 129126.doc -56- 200843766 未經處理之對照中平均群落數目所得之群落形成百分比來 表示（將相對群落數目繪製為測試/對照17(：值[%]之曲線）。 EC5G、EC7G及EC9()值分別為抑制群落形成50%、70%及90% 所需之藥物濃度。作為各實驗之陽性對照，使用1000 pg/mL濃度之5-FU(Medac)實現小於對照之30%之群落存活 率。 活體内FGF介導之基質膠血管生成檢定。簡言之，將0·5 mL 基質膠（Becton Dickinson，Bedford，ΜΑ)與牛 2 pg bFGF(Chiron Corporation; Emeryville，CA)之混合物皮下植 入雌性BDF1 小鼠（Charles River，Wilmington，MA)中。在 基質膠植入後，每天經口給與媒劑或化合物1，歷時8天。 在基質膠塞自動物移除之後，藉由量測基質膠塞中血紅蛋 白含量來定量血管形成。藉由德氏程序（Drabkin、procedure) (Sigma Diagnostics，St· Louis，MO)根據廠商說明來量測血 紅蛋白含量。 動物。將自 Charles River Laboratories, Inc.(Wilmington, MA)獲得之免疫缺陷型Nu/Nu雌性小鼠（4-8週齡）置於無菌 過濾器頂之籠子中之障壁設備中，歷經12小時照明/黑暗 週期且隨意供應無菌齧齒動物食物及水。達成後，將皮下 ID晶片植入小鼠且接著在研究開始之前進行至少7天之氣 候適應過程。所有動物研究均係在由國際實驗動物評估和 認可管理委員會（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International)授權之設備中且 根據實驗動物管理與使用委員會（Institutional Animal Care 129126.doc -57- 200843766 and Use Committee)及實驗動物護理和使用指南（Gw/a The Care and Use of Laboratory Animals)(美徵風家研究委 員會（National Research Council))之全部準則來進行。 用於活艟内功效研究之細胞培養物。將人類黑色素瘤細 胞株A375M在具有10% FBS、1%維生素、非必需胺基酸 (NEAA)及丙_酸鈉之EMEM培養基中於37°C下具有5〇/〇 • C〇2之加濕氣氛中培養6代。將人類黑色素瘤細胞株CHL-1 在具有低麵醯胺酸+ 10% FBS之DMEM培養基中於37°C下具 f) 有5% C02之加濕氣氛中培養6代。 單藥劑化合物1在A375(突變型B-Raf)及CHL-1(野生型 B-Raf)模型中之活||内功效。在腫瘤細胞植入之日，將腫 瘤細胞收集且以2.5><107細胞/毫升再懸浮於11388(八375細 胞）或 50% HBSS + 50% 基質膠（CHL-1 細胞；Becton Dickenson and Company，Franklin Lakes，NJ)中。將細胞以 5xl06細胞/200微升/小鼠皮下接種於右腰窩中。 當平均腫瘤體積達到約200 mm3(細胞接種後12-15天） U 時，基於腫瘤體積將小鼠隨機化成具有9或10隻動物之 組’且每天以10、30、60或80 mg/kg經口投與媒劑或化合 • 物1。組之尺寸為每組9隻動物（A375研究）或每組10隻動物 . (CHL-1研究）。將化合物1(批次41)調配於5 mM檸檬酸鹽 中。使用 Study Director 1.4 軟體（Studylog Systems，Inc·， So· San Francisco, CA)每週評估腫瘤體積及體重2-3次。使 用式》[長度（mm)X寬度（mm)]2將腫瘤之測徑規量測結果轉 變為平均腫瘤體積（mm3)。腫瘤生長抑制（TGI)按[1-T/C]x 129126.doc -58- 200843766 100%計算，其中τ=測試組之平均腫瘤體積，且c=對照組 之平均腫瘤體積（單藥劑研究）。使用司徒頓雙尾1檢驗 (Excel軟體）評估治療組與媒劑組之平均腫瘤體積之比較。 在CHL-1研究中，亦量測由黑色素瘤細胞分泌之黑色素 瘤標記物黑色素瘤抑制活性（MIA)蛋白的血漿含量。 化合物1 +卡鉑+太平洋紫杉醇組合之活體内功效研究· . 將3x100 Α375Μ細胞或CHL-1細胞（具有50%基質膠/〇.丨毫升/ 小鼠之5 X 1 0細胞）皮下接種至雌性nU/nu小鼠（6_8週齡）之小 C 鼠右腰窩中。在平均腫瘤體積為200-250 mm3時開始治療 (研究第0天；n=10隻小鼠/組）。治療由以下各者組成：單 獨藥物媒劑，每天1次；卡鉑（5〇 mg/kg)+太平洋紫杉醇（2〇 或25 mg/kg ;每週1次x4週）；化合物1(30或50 mg/kg)，每 天1次，歷時4週；或化合物1及卡鉑+太平洋紫杉醇組合 療法（以所指示之劑量；第1天）。 使用 Study Director 1.4 軟體（Studylog Systems，Inc·，So. San Francisco，CA)每週評估腫瘤體積及體重2-3次。使用 式^[長度（mm)x寬度（mm)]2將腫瘤之測徑規量測結果轉變 為平均腫瘤體積（mm3)。根據[1-{(治療組之平均腫瘤體積· • 隨機選擇之腫瘤體積）/對照組之平均腫瘤體積-隨機選擇之 . 腫瘤體積}>< 100來計算腫瘤生長抑制（TGI)。當媒劑之平均 腫瘤體積為約1500-2000 mni時計算TGI。與治療開始時各 動物之腫瘤體積相比，將反應定義為完全反應（CR，無可 量測之腫瘤）或部分反應（PR，腫瘤體積減小50-99%)。 當預期之組合療法％腫瘤生長抑制（％T/Cexp=%T/C治療 129126.doc -59- 200843766 l x°/〇t/c治療2)/觀測之組合治療％ τ/ο(%τ/υ之比率大於 1時，確定為協同效應。當o/oT/Cexp/e/oT/Cobfl時，確定為 累加效應，afo/oT/Cexp/o/oT/CobsCip^時，確定為拮抗效 應。 FGF-R細胞捕捉ELISA檢定。第1天：細胞接種：將 HEK293細胞進行胰蛋白酶化，使用CASY計數器（Scharfe 系統）計數且將104細胞/孔塗於96孔盤（TPP # 92096)中100 μί DMEM 4.5 g/L葡萄糖、10% FBS、1% L-麩胺醯胺中。 f) 將細胞在37°C 5% C02下培育24 h。 第1天：細胞轉染及塗佈測試盤：如下使用Fugene-6-試 劑（Roche # 1 1814443001)將 HEK293細胞用pcDNA3·l-FGF-Rl、pcDNA3.1-FGF-R2、pcDNA3.1-FGF-R3、pcDNA3.1-FGF-R4或pcDNA3.1載體轉染。首先將Fugene-6_試劑（0.15 微升/ 孔）與 Optimem I(Gibco # 3 1985_047)(5 微升/孔）混 合，接著添加載體DNA(0.05微克/孔）。將此混合物在室溫 下培育15 min。隨後將5 ·2 μΐ^此混合物添加至細胞上。將 〇 細胞在37°c 5% C〇2下培育24 h。將FluoroNunc 96孔盤

(MaxisorpblackF96，Nιmc# 4371 1 1A)用2μg/mLα-FGF-, R1 AB(R&D Systems # MAB766)、a-FGF_R2 AB(R&D

Systems # MAB665)、a-FGF-R3 AB(R&D Systems # MAB766)或 a-FGF-R4 AB(R&D Systems # MAB685)AB 塗 佈。將FluoroNunc培養盤在4°C下培育隔夜。 第3天：化合物稀釋、細胞處理及細胞加工：將 FluoroNunc塗佈之培養盤用 200 μΐ^ 含有 0.05% Tween®20 129126.doc •60- 200843766 (Sigma # P-1379)之PBS/Ο洗滌3次，且在室溫下用200微升/ 孔含有 〇·〇5% TweenhO、30/〇 Top Block(VWR-International # 232010)之PBS/Ο阻斷2 h。隨後將培養盤用200 μί含有 0.05% Tween®20 之 PBS/Ο洗滌 3次。首先在 DMSO(Serva # 20385)中執行化合物之連續稀釋（10 mM之儲備溶液）。最 ' 終稀釋步驟在生長培養基中進行以達到細胞上0.2%之 • DMSO。將11·5 μί各稀釋液添加至細胞上，一式三份。在

37°C下進行處理40 min。將細胞於100微升/孔之ELISA溶 ζ\ 解緩衝劑（50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EGTA、5 mM EDTA、1% Triton、2 mM飢酸納、1 mM PMSF及蛋白酶抑制劑混合物Roche # 1 1873580001)中溶解 且將50 μί細胞溶解產物轉移至FluoroNunc塗佈之培養盤 中。接著將經塗佈之培養盤在4°C下培育5 h。將培養盤用 200微升/孔含有0.05% Tween®20之PBS/Ο洗滌3次。以50微 升 / 孔添加 α-pTyr-AP AB(Zymed PY20 # 03-7722)(1:10,000 於 0.3% TopBlock/PBS/0.05% TweenhO中）。將培養盤在 Ci 4°C下培育隔夜，用Thermowell™密封物密封。 第4天檢定結果顯示··將FluoroNunc培養盤用200 μί含 有0·05% Tween®20之PBS/0洗滌3次，且用Η20洗滌1次。 將 90 pL CDP-Star(Applied Biosystems # MS1000RY)添加 至各孔上。將培養盤在黑暗中於室溫下培育45 min，且接 著使用 TOP Count NXT 光度計（Packard Bioscience)量測發 光性。 結果 129126.doc -61 - 200843766 化合物1證明有效抑制FGFR激酶活性 使用ATP-競爭性結合檢定用如上所述經純化之酶測試化 合物1對抗一組不同RTK之特異性。發現化合物1高度有效 對抗一系列激酶，包括FLT3(1 nM)，具有對抗c-KIT(2 nM)、VEGFRl/2/3(10 nM)、FGFRl/3(8 nM)、PDGFRP(27 nM)及CSF-1R(36 nM)之奈米莫耳活性（參見表1A)。為證實 對抗類別III、IV及V RTK之選擇性，針對PI3K/Akt及 MAPK(K)路徑中之其他激酶來測試化合物1且發現其具有 可忽略之活性（IC5G>10 μΜ)(參見表1A)。 表1Α· 4-胺基-5-氟-3-[6-(4-甲基哌嗪-1-基）_111-苯并咪唑- 2-基]喹啉-2(1Η)_酮抗各種RTK之活性 RTK IC5〇 (μΜ) FLT3 0.001 c-KIT 0.002 CSF-1R 0.036 FGFR1 0.008 FGFR2 0.05 FGFR3 0.009 FGFR4 3 VEGFRl/Fltl 0.01 VEGFR2/Flkl 0.013 VEGFR3/FU4 0.008 PDGFRP 0.027 PDGFRa 0.21 TIE2 4 使用上文針對化合物2及3所述之程序量測諸多蛋白酪胺 酸激酶之激酶活性以提供表1Β中所示之IC5G值。 129126.doc -62- 200843766 表1B化合物2-3之IC50 化合物 Ι05〇(μΜ) VEGFRflt VEGFRflkl bFGFR PDGFR Flt3 c-kit 化合物2 0.004 0.009 0.005 0.010 0.0004 0.0002 化合物3 0.019 0.012 0.019 0.037 0.0001 0.0002 FGFR1-4在人類黑色素瘤細胞上之表現。檢查一組人類 原發性黑色素瘤腫瘤外植體（Oncotest腫瘤：1341/3、 1765/3、276/7、462/6、514/12、672/3、989/7)及細胞株 (CHL-1、HMCB、SK-Mel-2、A375M、G361、SK-Mel-28、SK-Mel-3 1)中FGFR1-4之蛋白含量以藉由西方分析概 述4個FGF受體之相對表現（圖1)。使用來自表現各FGFR之 瞬時表現之FGFR+ 293T細胞的蛋白溶解產物證實對各 FGFR之抗體特異性（未顯示數據）。 如圖1所示，所有黑色素瘤細胞在細胞上表現不同FGFR 模式。在黑色素瘤細胞上發現可評估含量之FGFR1 (除SK-Mel-28 夕卜）、FGFR2(除 MEXF 462 外）、FGFR3(除 G361 夕卜）。 FGFR4表現略顯較不一致，其中CHL-1、HMCB、A375M、 G361上表現高含量 FGFR4，276/7、514/12、672/3、989/7 上表現中等含量，SK-Mel-2、462/6、1765/3上表現低含 量，且8尺_]^^1-28、81^-]^^1-31及1341/3上表現不可偵測之 含量。 化合物1對抗黑色素瘤腫瘤細胞之活體外細胞群落評 估。評估化合物1對抗以下七個離體原發性黑色素瘤外植 體之軟瓊脂細胞群落活性：1341/3、1765/3、276/7、 129126.doc -63- 200843766 462/6、514/12、672/3、989/7。在此等實驗中，將腫瘤細 胞曝露於在0·001 nM至10 μΜ之濃度範圍内之各種濃度化 合物1。自相對EC5G值評估藥物反應（參見表2)。對化合物1 之大體反應性為以下次序：1765/3(2.58 μΜ)>989/7(2·54 μΜ)>1341/3(2.24 μΜ)>672/3(1.67 μΜ)>276/7(1.14 μΜ)>514/12 (1.05 μΜ)>462/6(0·70 μΜ) 〇 表2化合物1對抗黑色素瘤腫瘤細胞之細胞群落評估 MEXF IC5〇 1765/3 2.58 989/7 2.54 1341/3 2.24 672/3 1.67 276/7 1.14 514/12 1.05 462/6 0.70 Γ 化合物1抑制FGF介導之活體内血管生成。為判定化合 L· 物1是否會抑制bFGF介導之活體内血管生成，在bFGF驅動 之基質膠植入模型中評估其作用。在單獨基質膠（未補充 bFGF)下觀測到邊緣新血管生成，然而，在皮下基質膠植 入物中添加bFGF引起新血管生成之顯著誘發，此係藉由 測定基質膠塞中血紅蛋白含量來測定（圖2)。歷時8天每天 以3 -1 00 mg/kg之劑量的化合物1治療引起bFGF驅動之新血 管生成之劑量依賴性抑制（3 mg/kg之IC5G)。與媒劑相比， 所有劑量均引起統計上顯著之減少（ρ<〇·〇5)。有趣地，大 於1 0 mg/kg之所有劑量均小於在未補充之基質膠植入物下 129126.doc -64- 200843766 所觀測之基本血紅蛋白含量，此清楚地表明化合物丨有效 抑制bFGF驅動之活體内血管生成。 化合物1抗腫瘤功效研究：在具有類似？(}1?11表現概況但 B-Raf突變情形不同之兩個黑色素瘤腫瘤模型（A375m & Raf突變型及CHL-1B-Raf野生型）中進行單藥劑化合物上活 性或化合物1與卡鉑+太平洋紫杉醇組合之活性的標準檢 查程序。 化合物1作為單藥劑在A375黑色素瘤模型中之活性：化 合物1在Nu/NiH、鼠中之人類黑色素瘤A375M皮下異種移植 模型中顯示顯著腫瘤生長抑制。原發性腫瘤生長之分析顯 示於圖3中。在給藥之第3天、第5天、第21天及第25天， 80 mg/kg組中平均腫瘤生長與媒劑組相比存在顯著差異。 腫瘤生長抑制（TGI)之百分比係基於第25天之腫瘤體積。 以10、30、60及80 mg/kg經口投與化合物丨分別引起28%、 45°/〇、58%及69%之丁01。在任一組中未觀測到顯著體重減 輕（體重減輕不大於約5%)或毒性之其他臨床徵象。 化合物1作為單藥劑在CHL-1黑色素瘤模型中之活性： 化合物1在Nu/Nu小鼠中之人類黑色素瘤chl-1皮下異種移 植模型中顯示顯著腫瘤生長抑制。原發性腫瘤生長之分析 顯示於圖4中。在給藥之第8天-第25天，％、6〇及8〇 組中平均腫瘤生長與媒劑組相比存在顯著差異。TGI之百 分比係基於第25天之腫瘤體積。以1〇、3〇、6〇及8〇 mpk經 口投與化合物1分別引起64%、73%、89%及87%之TGI。在 任一組中未觀測到顯著體重減輕（體重減輕不大於約5%)或 129126.doc -65- 200843766 毒性之其他臨床徵象。 在第0天、第8天及第22天评估媒劑組、3〇 mg/kg組及8〇 mg/kg組中之血漿MIA含量（未顯示數據）。在第〇天所有組 中ΜΙΑ含量均為偵測臨限值或在偵測臨限值以下。直至第 8天，媒劑組中ΜΙΑ含量上升至7.7 ng/mL，而治療組中 MIA含量不可偵測。在第22天相對於媒劑組，腫瘤體積及 MIA含量亦為較低的。總而言之，在第8天及第22天經治 療之動物中血漿MIA含量為較低的（亦即，不可偵測），而 在媒劑對照中血漿MIA含量較高。 化合物1與卡鉑+太平洋紫杉酵組合之活性；在A375M 黑色素瘤模型中，每天單獨給與化合物1產生顯著腫瘤生 長抑制’其在統計學上不同於媒劑治療（74% TGI， Ρ<0·05)。每週卡鉑（50 rng/kg)及太平洋紫杉醇（20 mg/kg) 產生約45%之TGI ;(圖5及表3)。根據在此治療群中觀測到 之1 /1 0 4分反應’化合物1及卡鉑+太平洋紫杉醇之組合 治療擴大抗腫瘤活性（對媒劑之94% TGI，p<〇 〇〇1)且優於 單藥療法。根據在單藥劑及組合組中所觀測到之<5Q/❶體重 減#工（BWL) ’化合物丨（5〇 mg/kg)與卡鉑+太平洋紫杉醇之 組合療法一般具良好耐受性，且經分析為累加反應（參見 表2/3，亦即預期/觀測（E/O)約1)。 129126.doc •66- 200843766 表3組合治療中化合物1在A375M黑色素瘤模裂中之$ ^ 治療， n=10隻/組 第25 天平 均TV 第25 天％ TGI 第25天 與媒劑 比較之P 值 PR/CR 與初始 值比較 之％平 均BW 改變 臨床觀測 結果 759 0〇/〇 BAR ^ Mi 化合物1 50 mg/kg » 每曰1次 315 75% <•01 0% BAR 卡銘 50 mg/kg + 太平洋紫 杉醇 20 mg/kg， 每週1次 494 45% >.05 1% BAR TK1258 50 mg/kg+ 卡銘+太 平洋紫杉 醇 203 94% <•001 1PR -5% 1隻小鼠之 BWL>15% /第25天 觀測％ τ/c (〇) 0.42 腫

機選擇之腫瘤體積）/(對照組之平均腫瘤體積-隨機選擇之 腫瘤體積）}χ 1〇〇] ; bar=歡快、敏捷、反應性；BWL==體 重減輕；統計檢驗=克-瓦二氏單因子等級變異數分析/鄭氏 法（Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks/Dunn’s);反應=CR(完全反應，無可量測之腫瘤）或 PR(部分反應，與治療開始時各動物之腫瘤體積相比’腫 瘤體積減小5〇-99%);累加反應=1·〇之E/Ο比率。 亦在CHL-1模型中評估與卡鉑+太平洋紫杉醇之組合療 法。如圖6及表4中可見，與單藥劑相比，在每天給與化合 物1(30 mg/kg)+每週給與卡鉑（50 mg/kg)+太平洋紫杉醇 (25 mg/kg)下腫瘤抑制顯著擴大（84% TGI)。化合物1與卡 鉑+太平洋紫杉醇之組合療法具良好耐受性且與卡鉑+太 129126.doc -67- 200843766 平洋紫杉醇顯著不同（p<.〇5，ANOVA/鄧氏法），但單獨化 合物1(3 0 mg / kg，每天1次）並不如此（ρ<·〇5，t檢驗）。然 而，在藥物反應之更詳細分析中，觀測到化合物1 +卡始 +太平洋紫杉醇在CHL-1黑色素瘤模型中大於累加反應（暗 示協同效應）（E/0>1)。 表4·化合物1及/或卡鉑+太平洋紫杉醇組合對抗雌性 Nu/Nu小鼠中BRaf WT CHL-1黑色素瘤腫瘤 治療 (n=10 隻 / 組） 第14天 平均Tv 最大％ TGI ;第 14天 與媒劑比 較之TGI P值；第 14天 與初始值 比較BW 之％平均 改變 臨床觀 測結果 觀測 T/C(0) 預期 T/C(E) 比率 (E/O) 媒劑 1567 8.1% 卡翻 50 mg/kg + 太 平洋紫杉醇 25 mg/kg » 每週1次 1693 -9.65% >.05 2.4% BAR 1.08 化合物1 30 mg/kg， 每天1次 884 52.51% >.05 4.3% BAR 0.56 化合物1 30 mg/kg + 卡 鉑+太平洋 紫杉醇 476 83.79% >.05 3.5% 1 BWL > 15% .030 0.61 2.00 腫瘤生長抑制（TGI) = [l-{(治療組之平均腫瘤體積TV - 隨機選擇之腫瘤體積）/對照組之平均腫瘤體積-隨機選擇 之腫瘤體積}x 100] ; BAR=歡快、敏捷、反應性；BWL = 體重減輕；克-瓦二氏單因子等級變異數分析/鄧氏法； E/0=1(累加反應）。E/0>1(協同效應） FGF-R細胞捕捉ELISA檢定：如下表5所示，化合物1抑 制FGF受體以及其他酪胺酸激酶之細胞磷酸化。 129126.doc -68- 200843766 表5 化合物1抑制RTK標靶之細胞磷酸化 標靶 細胞株 TKI258 nM IC5〇 FGFR1 經轉染之HEK293 166 FGFR2 經轉染之HEK293 78 FGFR3K650E* 經轉染之HEK293 55 FGFR4 經轉染之HEK293 1915 FLT3 RS4;11 AML 500 FLT3-ITD MV4;11 AML 1-5 VEGFR1 KM12L4a 結腸 <50 VEGFR2 HMVEC <10 PDGFRb KM12L4a 結腸 <50 *FGFR3K65 0E為在多發性骨髓瘤患者子集中可見之活化突 變。 諸如結構IB化合物及結構1C化合物的其他結構I化合物 係如上所述製備。可使用上文針對化合物1所述之方法進 行使用此等化合物之研究。此等研究將顯示此等化合物亦 適用於治療小鼠、人類及其他哺乳動物個體之黑色素瘤。 本說明書中所提及之所有公開案、專利申請案、頒予專 利及其他文獻均以引用的方式併入本文，該引用程度就如 同已特定地且個別地將各個公開案、專利申請案、頒予專 利或其他文獻以全文引用的方式併入一般。在以引用的方 式併入之正文中所含之定義若與本揭示案中之定義矛盾， 則將其排除在外。 應瞭解本發明並不限於本文中為達成說明之目的所述之 實施例，而涵蓋其處於本文件之範疇内的所有該等形式。 129126.doc •69- 200843766 【圖式簡單說明】 圖1顯示藉由西方墨點法表徵FGFR1_4在黑色素瘤細胞 上之表現。 圖2 :化合物1在卯(317驅動之基質膠塞檢定中展示有效 之抗血管生成活性。 圖3為顯示在A375M(B-Raf突變型）人類黑色素瘤異種移 植模型中化合物1對平均腫瘤體積之顯著抗腫瘤作用之 圖。 圖4為顯示在CHL_1(野生型B-Raf)人類黑色素瘤異種移 植模型中化合物1對平均腫瘤體積之顯著抗腫瘤作用之 圖。 圖5為顯示在仙/⑽小鼠中黑色素瘤A375M(BRaf突變型） 模型中化合物1、卡鉑及太平洋紫杉醇組合療法對平均腫 瘤體積之顯著抗腫瘤作用之圖。 圖6為顯示針對雌小鼠中cHL-丨黑色素瘤腫瘤每 天投與化合物1及/或每週給與卡鉑及太平洋紫杉醇對平均 腫瘤體積之顯著抗腫瘤作用之圖。 129126.doc -70-

Claims (1)

1. 200843766 十、申請專利範圍： 1.種冶療黑色素瘤之方法，其包含向患有黑色素瘤之個 體投與治療有效量之結構J化合物、該化合物之互變異構 該化合物之醫藥學上可接受之鹽、該互變異構體之 醫藥學上可接受之鹽或其混合物，其中該結構合物為

   其中， A為選自以下之基團：

   且

   R1係選自Η或具有⑴個碳原子之直鏈或分支鏈烷基。 2.如請求項1之方法，其中尺1為？基，且該結構他合物具 有結構IA

   129126.doc 200843766 3·如請求項1之方法，其中R1為氫，且該結構I化合物具有 結構ΙΒ

   Γ 4.如請求項1之方法，其中R1為甲基，且該結構I化合物具 有結構1C

   ί. 5.如請求項1之方法，其中向該個體投與該結構I化合物或 其互變異構體之乳酸鹽。 6·如請求項1之方法，其中該個體為人類。 7.如請求項1之方法，其中該黑色素瘤已轉移。 8 如請求項1之方法，其中該黑色素瘤為淺表擴展性黑色 素瘤、結節性黑色素瘤、肢體末端雀斑性黑色素瘤、雀 斑性惡性黑色素瘤或黏膜雀斑性黑色素瘤。 9.如請求項1之方法，其中該黑色素瘤為皮膚或真皮外黑 129126.doc 200843766 · 色素瘤。 10. 11. 12. 如請求項1之方法，其中該黑色素瘤為眼内黑色素瘤或 軟組織透明細胞肉瘤。 如明求項1之方法，其進一步包含投與一或多種用於治 療黑色素瘤之抗癌藥物。 如請求項11之方法，其中該一或多種抗癌藥物係選自由 乂下各物組成之群：烧基化抗癌藥物、亞硝基脲 (nitf〇s〇ureas)、紫杉烷（taxanes)、長春花卜inca)生物 驗、拓撲異構酶（t〇p〇is〇merase)抑制劑、抗癌抗生素及 翻抗癌藥物。 13·如請求項11之方法，其中該一或多種抗癌藥物係選自由 以下各物組成之群：達卡巴嗪（dacarbazine)、替莫σ坐胺 (temozolomide)、卡莫司汀（carinustine)、洛莫司、;丁 (lomustine)、福莫司汀（f〇temustine)、太平洋紫杉醇 (paclitaxel)、多稀紫杉醇（d〇Cetaxel)、長春鹼（vinblastine)、 伊立替康（irinotecan)、沙利度邁（thalidomide)、鏈脲黴 素（streptozocin)、放線菌素 D(dactinomycin)、二氯甲二 乙胺（mechlorethamine)、順鉑（cisplatin)及卡鉑 (carboplatin)、甲石黃酸伊馬替尼（imatinib mesylate)、索 拉非尼（sorafenib)、舒尼替尼（sutent)或埃羅替尼 (erlotinib) 〇 1 4·如請求項1 1之方法，其中該一或多種抗癌藥物係選自由 干擾素及介白素-2組成之群。 1 5 ·如清求項11之方法’其中該一或多種抗癌藥物係選自由 129126.doc 200843766 a干擾素a-2b、聚乙二醇化干擾素a_2b及介 白素-2組成之群。 16·如請求項1之方法’其中該化合物之治療有效量在約0.25 mg/kg至約3〇 mg/kg之範圍内。 如#求項1之方法，其中該化合物之治療有效量在約25 宅克/天至約丨5〇〇毫克/天之範圍内。 18·如明求項！之方法，其中該化合物之治療有效量在約ι〇〇 毫克/天至約600毫克/天之範圍内。 19·如晴求項！之方法，其中該黑色素瘤表現纖維母細胞生 長因子受體1、2、3及/或4。 20.如請求項1之方法，其中該黑色素瘤表現野生型Raf、突 變型Raf、野生型Ras、突變型Ras、野生型c-Kit或突變 型 c-Kit 〇

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