TW200846476A - Method of testing the presence or absence of crossing between wild rose and horticulture rose - Google Patents

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200846476 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 技術領域 本發明係關於一種檢定野生種玫瑰有無與園藝種玫塊 5 雜交之方法。 t先前技術3 背景技術 於花卉產業中，具有新穎性狀之花卉經常受到珍愛， 因此，此種開花植物的開發在產業上甚為重要。主要是透 10過利用交配之品種改良，而育種出具有各種性狀之品種。 然而，採用交配之品種改良所能利用之基因資源限於可交 配之近親植物，能夠導入之顏色及性狀常會受限，單一植 物種具有多種多樣顏色及性狀練稀有的。若以顏色為 例，藍色的玫瑰與康乃馨、黃色的牽牛花與天竺葵等均無 15 法以採用交配之品種改良來開發。 然而，若使用基因重組，則可跨越物種的阻礙而將各 種基因導入至任意植物，透過人為改變植物之代謝等而可 實現多采多姿的性狀。例如，於無法在花瓣中產生飛燕草 素之玫瑰或康乃馨中，使合成飛燕草素所必需之類黃嗣1， 20 5'-氫氧化酶基因表現，藉此產生飛燕草素而製作出自然界 所沒有的藍色花朵（Tanaka 2006>。 但是’此種人為製作出之基因重組植物的研究開發、 栽培及流通等在日本國内被要求遵守「有關限制使用基因 重組生物等以確保生物多樣性之法律」（嗔他基納法）。其他 5 200846476 = 同的法律，基因重组植物在野外之栽培等受 ^制。特減花粉具有可孕性且在日本國内存有多種可 =父之近親野生種的植物，被賦予針對雜交性(即，基因從 土因重Μ植物擴散至近親野生種）之可能性進行評估 5務。 像是玫瑰般在我國有多數近親野生種自生，且該等為 多花且富有結實性時，園藝種與近親野生種之間有無雜交 之解析量龐大’因此需要確立—種簡便且正確之解析技 術。迄今為止的報告中，已有利用小形隨體(mi娜atdme) 10作為分子標記者(Debener2〇〇3,2〇〇6)被報導出。此外，亦可 藉由利用流式細胞儀之倍數性決定所作的鑑定法來解析。 然而’該等紐均有正確性、關性及簡便性不足的問題。 此外，現今之玫瑰園藝種係使8種左右的野生種人為地雜交 而製得者，因此不易獲得可區別園藝種與野生種之DNA標 15 記0 本舍明中成為指標基因之KSN基因係一種取自單瓣月 季（办似c/z狀α)且與玫瑰之四季開花性相關的 基因’該基因係於單季開花之玫瑰的KSN基因中插入約9kb 之轉位子而產生者。已有報告指出，透過轉位子之插入， 20該基因之表現受到抑制，莖頂中花芽之形成抑制被解除， 因此而促進花芽形成，成為四季開花性(岩田氏等，公開編 號2006-149202)。 已查出園藝種玫瑰係同型地(homozygous)具有業經插 入轉位子之該基因。另一方面，野生種玫瑰原則上係同型 200846476 地具有不含轉位子之KSN基因。 此外’月季花(及)為玫瑰園藝種之祖先的 野生種之一且開花一季，單瓣月季花（i?⑽a ㈣·$ 似)是它的突變種且四季開花。 5專利文獻1日本特開2006-149202號公報 【明内容J 發明之揭示 檢疋玫瑰野生種中有無雜交玫瑰園藝種之方法至今雖 亦有報告，但卻欠缺汎用性。雖然也有其他可考慮之方法， 10但欠缺簡便性及正確性。因此現正需求一種可解決該等缺 點，且對於如玫瑰般具有結實性又存有多數近親野生種之 植物可檢定是否野生種已與園藝種雜交之方法。 為了調查基因重組植物之基因擴散可能性，而針對魔 大個體數檢定有無雜交時，特別是需要可以簡便地檢定出 15野生種玫瑰是否以業經基因導入之園藝種玫瑰作為花粉親 而雜交。因此，本發明意欲提供―種可簡便檢定出受測體 之野生種玫瑰是否已與業經基因導入之園藝種玫瑰的花粉 雜交之方法。 it㈣A為了達成上述課題而進行各種研討的結 果’思及野生種玫瑰只有在已與園藝種玫瑰雜交時才會檢 測出具有轉位子之KSN基因，進Μ現可以具有轉位子之 KSN基因作為《錢成前_題，㈣成本發明。 因此，本發明提供-種檢測受挪對象之野生種玫瑰是 否已與園藝種玫瑰雜交之方法，其係調查該受測對象玫瑰 7 200846476 中是否存在著具有轉位子之KSN基因，若該KSN基因存 在，則判定該受測對象玫瑰已與園藝種玫瑰雜交。 一般在基因重組植物之生物多樣性影響評估試驗中， 玫瑰園藝種與野生種雜交時，園藝種之花粉飛散而與周邊 5野生種雜交是問題所在。因此，本發明之方法在典型上來 說，母方為野生種玫瑰，父方為園藝種玫瑰。此外，典型 上，該園藝種玫瑰業經導入基因之基因重組玫瑰，此時之 基因可列舉如與顏色相關之基因，例如，源自堇菜科三色 堇之類黃酮3，，5，-氫氧化酶基因。 10圖式簡單說明 第1圖顯示以PCR法檢測KSN基因之結果。pCR所測出 含有内含子（intron)之KSN基因及GAPDH基因（内生性控制 組)之專一性增幅產物的位置係以箭號表示。 C實施方式3 15 本發明之最佳實施型態 園藝種輿野峰籀 通常園藝種玫瑰為4倍體(4x)且四季開花。相對於此， 野生種玫瑰通常為2倍體(2x)且單季開花。 園藝種玫瑰被分類如雜種香水月季、大花月季及迷你 20 玫瑰等，且一般而言，均同型地具有業已插入轉位子之KSN 基因。亦即，本發明中所稱之園藝種玫瑰意指：同型地具 有業已插入轉位子之KSN基因的玫瑰。 另一方面，野生種玫瑰原生於日本者有野薔薇(及^^ mw/ny/ora)、照葉野薔薇(及aya w/cAwrd⑽“）、原生種玫瑰 200846476 (及〇如、刺薔薇(及〇如acicw/arb)、樺太薔薇(及〇似 i/avi^7ca a/pairzs)、光葉薔薇(及osa /wc/ae)、東薔薇、山照 葉薔薇、山薔薇(Rosa sambucina)、碩包薔薇(兄ferack加α)、 琉球野薔薇(如似心此/⑽加）、金樓子(如似/aev/g^a)、山椒 5 畜薇[Rosa hirtula)、高尊、熹薇（Rosa suavis ssp· nipponensis)、$^ 繁薔薇(Rosa multiflora adenochaeta)、森書 薇（Rosa jasminoides)、富 士薔薇（H〇sa luciae var fujisanensis)、§：薔薇(Rosa Uiciae Franchet et Roschebnme 似办印·)、小野薔薇（及⑽α 0鬚以尬而·⑽）或都薔薇（及⑽β 10 Mdz>2〇)等，通常同型地具有未插入轉位子之 KSN基因。亦即，本發明中所稱之野生種玫瑰意指：同型 地具有未插入轉位子之KSN基因的玫瑰。 指標基因 本發明之方法中，指標基因須符合下述條件·· ’ 15 (1)指標基因必須存在於園藝種玫瑰且不存在於天然的 野生種玫瑰中。 (2)園藝種玫瑰為4倍體(4x)，成為雜交指標之基因在4 條相同染色體中之必須存在至少3個，且宜存在於全部4條 相同染色體中。園藝種玫瑰為4倍體(4χ)，另一方面，天然 20野生種玫瑰為2倍體(2χ)。因此，由園藝種玫瑰產生之配子 (gamete)通常為2χ，野生種玫瑰則是乂，兩者雜交的結果， 所產生之雜種為3倍體㈤。由此得知，園藝種玫魂之相同 基因中’雜交之指標基因至少必須存在3條，但若慮及不能 否認園藝種玫瑰亦有會因不平均之減數分裂而產倍體 9 200846476 (x)之配子，為了落實檢定’指標基因宜存在於全部4條之相 同染色體中。 (3)與指標基因之驗基序列的部分序__序列不存 在於染色體之其他部分。 >為了檢定欠測植物是否存有指標基因，通常需要增幅

/基因，為此，使用與部分標的基因互補之！對引子的pCR ^車乂為便利。此時，與該引子雜合之序列若存在於標的基 口之外，即使疋在原本的標的基因不存在，仍可獲得判斷 該基因係存在之結果。因此，此一要件在與引子設計之關 10聯上甚為重要。 之指標基闵 滿足前述要件之基因可列舉如業經插入轉位子之KSN 基因。被指出係與玫瑰之四季開花性相關之基因，KSN基 因（日本公開公報20〇6_ 149202)已明確得知其在野生種中係 15作為編碼519胺基酸之完整基因存在，在園藝種中則是於内 含子部分插入有約9吐之轉位子。即，該轉位子不存於野生 種中且必定存在於園藝種中，因此含有該轉位子之KSN基 因滿足前述（1)之要件。 此外’含有該轉位子之KSN基因存在於園藝種玫瑰之4 2〇個基因全部，因此，該基因滿足前述要件(2)。 含有該轉位子之KSN基因又可透過引子之選擇而滿足 前述要件(3)。 引手及探針 KSN基因（序列編號：1)及被插入其中之轉位子鹼基序 200846476 列（序列編號：2)係已為人所知者。插入有該轉位子之ksn 基因僅專一性地存在於園藝種玫瑰中。為了以PCR檢測出 、 插有該轉位子之KSN基因，必須成對地使用一個具有與序 、 列編號1所示序列相同或實質上互補之序列的引子以及另 5 一個具有與序列編號所示序列相同或實質上互補之序列的 引子。再者，引子須滿足一般的條件，任一引子均是大小 呈10鹼基以上（宜15鹼基以上）且50鹼基以下（宜30鹼基以下） φ 之募核苷酸。 從本發明之目的來看，轉位子中應增幅之領域並未特 10別受限，但引子對不宜兩者均與該轉位子以外之部分雜 合。滿足此種要件之引子對之例可列舉如前置引子： CATATTATGGCATAGGGTGTGGC(序列編號：3)及反置引 子：TGTAATCTGTAGGAGATCCCATGC(序列編號·· 4)。 檢測指標基因 15 從玫瑰抽提DNA、以PCR等作增幅以及增幅產物之檢 φ 測可依照常法進行。 實施例 以下，依照實施例來敘述發明之詳情。只要沒有特別 指定，分子生物學上的手法係依照Molecular Cloning(；CoM ^ 20 Spring Harbor Laboratory Press, 2001) > Plant Physiol. (2003) - 132， 1652-1663 o 參考例 1·以RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)解 析來取得玫瑰園藝種之專一性某因 為了判定野生種玫瑰有無與園藝種玫瑰雜交，嘗試利 11 200846476 用RAPD解析檢測基因多型，取得僅專一性存在於園藝種玫 瑰之基因。以DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)，依照製造 者所推薦之方法，各自從野生種(都薔薇)及園藝種(Lavande 及WKS82)之葉抽提出基因組DNA(geiK>mic DNA)。再調整 5由抽提出之基因組DNA 10ng、任意引子（貝克斯社製

Common Primer Set (ΟΜΝ·ΑΟΟ))2μΜ、dNTP 混合物 0.4mM、ΙχΕχ Taq Buffer及Takara Ex Taq 0.05U所構成之 PCR反應液。 以94°C反應5分鐘後，進行94。〇1分鐘、55^1分鐘、 10 72°C2分鐘的反應共25循環，最後以72°C反應7分鐘。將所 得PCR產物供予0.8%瓊脂凝膠電泳，比較野生種與園藝種 間之泳動圖案。將僅在園藝種中專一性地測得的帶紋(band) 從壤脂凝膠中切出’以GENECLEAN Turbo Kit(伏那西可株 式會社)依照製造者所推薦之方法進行純化。最後將該等以 15 pCR2.1 TOPO vector (INVITROGEN)依照製造者所推薦之 方法進行次選殖，藉由序列解析來進行定序。 解析各增幅斷片之序列。製作出含有位在各斷片兩端 之共通引子(Comment primer)序列且係2〇mer左右的寡引子 (Oligo primer)，探討僅在園藝種(Lavende、WKS82)中專一 20性測得增幅產物之寡引子的組合。以都薔薇、Lavende及 WKS82之各基因組DNA 10ng作為模板，調整由各寡引子 2μΜ、lxdNTP混合物及Ex Taq Buffer 0·05μΜ構成之PCR反 應液。以94°C反應5分鐘後，進行94°C 1分鐘、55°C 1分鐘、 72C2分鐘的反應共25循環’最後以72°C反應7分鐘。將所 200846476 得PCR產物供予〇·8%瓊脂凝膠電泳，探討僅在園藝種專一 性檢測出增幅產物的寡引子組合。結果，選出被認為僅在 園藝種賦予帶紋之寡引子組合，進行下述參考例2所示實 驗。 5 參-考例2 ·以檢測專一性基因作為指標刺断德伙有無雜交^ 針對使野生種玫瑰人工受粉園藝種玫瑰的花粉而獲得 之個體，就參考例1所取得且被認為是圜藝種特有的寡引子 組合所檢測的專一性基因作為指標，檢測有無雜交。以 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)並依照製造業者所推薦之 10方法，從所取得各後代之葉抽提基因組DNA。 接者’以其作為模板’將引子2μΜ、dNTP混合物 0.4mM、lxExTaqBuffer及ExTaq0.05U供予反應。以94。〇 反應5分鐘後’進行94°C1分鐘、55°C1分鐘、72°C2分鐘之 反應共25循環，最後再以72°C反應7分鐘。將所得PCR產物 15供予〇·8%瓊脂凝膠電泳，確認有無專一性帶紋測出。然而， 即使疋個體形態明確顯示出中間性狀，亦無法獲得其與有 無測出專一性帶紋間之關連性。由此可推測出，此次獲得 之RAPD標記並非是4條相同染色體全部都内含者，而是源 自於僅存於園藝種4條相同染色體中之部分染色體上的基 20因序列。亦即，判斷其不適合作為有無雜交之指標。 實羞i例1·KSN基因作為指標判定後代有無雜夺 使野生種玫瑰受粉園藝種玫瑰之花粉，針對所得個 體，檢測含有轉位子之KSN基因（w〇2〇〇4/〇7〇〇36)作為指標 (已知該KSN基因係在具有四季開花性之玫瑰中專一性地 13 200846476 測得），以檢定有無雜交。於本基因上設計正鏈引子，且在 被插入之轉位子上設計反鏈引子，製作成可從有無轉位子 插入來進行判斷。 以DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)並依照製造業者所 5 推薦之方法，從人工交配所獲得之各後代的葉片抽提基因 組DNA。接著，以其作為模板，製作由前置引子KSN1F3 : 5’-CAT ATT ATG GCA TAG GGT GTG GC-3’(序列編號：3) 及反置引子KSNlnsR3 : 5，-TGT AAT CTG TAG GAG ATC CCATGC-5’(序列編號：4)各〇·2μΜ、dNTP 混合物0.2 mM、 10 1χΕχ Taq Buffer及Ex Taq 0.625U構成之共2.5ml的反應液， 再供予反應。以94°C反應5分鐘後，進行94°C 1分鐘、55°C 1 分鐘、72°C2分鐘之反應共25循環，最後再以72°C反應7分 鐘。將所得PCR產物供予〇·8%瓊脂凝膠電泳，確認有無檢 測出約1.2kb之專一性帶紋。此外，已確認測出帶紋之個體 15形態顯示出園藝種與野生種之中間性狀。 如前述’針對可從形態上判斷是園藝種玫瑰與野生種 玫瑰之雜交種的個體，可確認其存有含轉位子之KSN基 因。由此可知，不具有含轉位子之KSN基因的個體並非園 藝種玫瑰與野生種玫瑰之雜交種。若鑑於此一特徵，使用 2〇不具有含轉位子之KSN基因的品種作為母系時，只要確認 後代個體有無含有轉位子之KSN基因，即可判定是否為雜 交個體。

以判斷野生種玫瑰是否能成為本發明檢測方法之受測 14 200846476 對象為目的，評估各野生種玫瑰中有無含轉位子之ksn基 因存在。野生種玫瑰係使用野薔薇、照葉野#薇、原生二 薔薇、刺薔薇、樺太薔薇、山薔薇、琉球野薔薇、金櫻子、 山椒薔薇、筑紫薔薇、森薔薇、富士薔薇、數蓄薇及都蓄 5薇，依照實施例1所記載之方法，檢定有無含轉位子之KSN 基因（W02004/070036)存在。 結果，所有野生種玫瑰均未檢測出含轉位子之ksn基 因的專一性增幅產物（預測增幅尺寸：約丨.2 kb)。另一方面， 作為内生性控制組之GAPDH基因則在全野生種中檢測出 10增幅產物。因此，未發現該等野生種玫瑰中有含轉位子之 KSN基因存在。 k上述内谷可判斷，以含轉位子之KSN基因作為指標 之本發明方法係以野生種玫瑰作為受測對象，而可適於應 用。 15實施例驗證人斤得後代有無輿圊藝艚玫斑雜夺 針對母系為野生種玫瑰且父系為園藝種玫瑰之後代個 體，使用本發明之檢測方法評估有無雜交。 依疋法於野生種近開花前去雄(emasculation)並覆袋 後’在雖蕊充分成熟之時間點且於晴天早晨，使宿主 2〇 (wks82)或基因重組體 之花粉附著。之後’再度進行覆袋以防止附著其他花粉， 調查有無種子形成。此外，就花粉而言，回收開裂前之花 藥後’於裝有二氧化矽凝膠之乾燥器内以室溫放置丨天，使 用隔天從開裂之花藥回收的新鮮花粉。 15 200846476 就雜交母株而言，野生種使用野蓄薇（R.邮刪〇m Thunb. ex Murray)、照葉野薔薇(R· wichuraiana )及原 生種裔微（R.rugosa Thunb. ex Murray)。 於交配後經過2個月以上時間點，針對無生理絲且& ' 5結果之果實確認有無種子形成。再回收所得種子，以ye低 . 溫處理3個月後進行播種。為了確認該等有無與宿主或基因 重組體雜交及有無導入基因之傳達，依照實施例丨之方法， 以PCR法進行解析。 此外，種子冒經低溫處理時，通常約丨個月程度即可見 修 10到發芽’但即使經過3個月，其中亦僅有一部分發芽。於此，

再回收一部分未發穿之播種種子，使用種子作相同之解 析。使用 Nucleon PHYTOPURE for PLANT DNA EXTRACTION KIT(Amersham Biosciences)，依照製造業者 推薦之方法從再回收之種子抽提基因組dna。其次，以 15 Midi Kit(QIAGEN)使其增幅後，以有無已插入轉 位子之KSN基因作為指標的PCR解析，針對有無與宿主或 基因重組體雜交及有無傳達導入基因進行解析。此外，使 ® 用甘油駿-3_殊酸脫氫酶(GAPDH)基因作為内生性控制組。 因專^一性引子 20 Rh GAPDH-237F: 5，-TGT CAT CTC TGC CCC AAG - TAAGG-3,(序列編號：5)

Rh GAPDH-724R: 5，-CAA CAT CCT CAT CGG TGT AAC CC-3 (序列編號：6) 結果示於表1及表2。無論是以宿主或基因重組體作為 16 200846476 I粉親’結果率均極低。以PCR法解析所得實生苗，雖測 出含轉位子之KSN基因而指認宿主或基因重組體與野生種 之雜父，但未測出源自基因重組體之導入基因。再者，再 回收未發芽之播種種子並觀察種子之充實度，結果幾乎都 5是「死種(種子無内容物）」，可確認正常胚之個體僅有極少 數。同樣以P C R法對該等進行解析，雖測出含轉位子之K s N 基因而指認出宿主或基因重組體與野生種之雜交，但並未 測出源自基因重組體之導入基因。由此推測，是因為基因 重組體之花粉細胞中未含有導入基因等理由，使得導入基 10 因未傳達給後代。 因此推測，即使本基因重組體與野生種(野薔薇、照葉 野薔薇、原生種薔薇)雜交，由於重組體之花粉細胞中未含 導入基因等理由，導入基因亦無傳達到後代的可能性。 此外，照葉野薔薇則是所有的種子均未能確認正常胚。 15 如前述，藉由使用本發明之檢定方法，可極為簡便地 評估野生種玫瑰有無與圜藝種玫瑰雜交。此外，一般而言， 在基因重組體之花粉細胞中因未含導入基因等理由而導致 導入基因不會傳達給後代時，常會使雜交之解析伴隨困 難。但是，若使用本發明之檢定方法，即可簡便地判斷有 20 無雜交。因此，依照本發明之檢定方法，先判斷有無雜交， 判斷已有雜交時，則進一步調查有無導入基因之傳達，藉 此可推測導入基因是否存在於雜交親本之生殖細胞中。 17 200846476 表1·與野生種(野嗇薇、照葉野嗇薇、原生種玫瑰)採人工交配之結 果率及發芽個體之導入基因檢測率 宿主(WKS82) ί 1 因重組體(WKS82/13(M-1) 結果數/ 交配花數 結果率 (%) 總種 子數 雜交 個體數 /發芽數 雜交率 (%) 結果數 /交配花數 結果率 (%) 總種 子數 雜交 個體數 /發芽數 雜交率 (%) 導入基因 檢測個體數 /發芽數 導入基因 之檢測率 (%) 野薔薇 18/251 7.1 27 1/2 50.0 45/256 17.6 65 3/3 100.0 0/3 \/uJ 0.0 照葉野薔薇 23/260 8.8 44 1/1 100.0 11/260 4.2 24 0/0 — 一 原生種玫瑰 2/74 2.7 263 0/0 一 5/79 6.3 427 3/3 100.0 0/3 0.0 宿主(WKS82) 基因重組體fWKS82/130-m 結果數 /交配花數 結果率 (%) 總種 子數 雜交 個體數 /發芽數 雜交率 (%) 結果數 /交配花數 結果率 (%) 總種 子數 雜交 個體數 /發芽數 睢交率 %) 導入基因 檢測個體數 /發芽數 導入基因 之檢測率 (%) 野薔薇 18/251 7.1 27 1/2 50.0 34/255 13.3 59 1/4 25.0 0/4 0.0 照葉野薔薇 23/260 8.8 44 1/1 100.0 14/261 5.4 44 0/0 — 0/0 原生種玫瑰 2/74 2.7 263 0/0 — 4/71 5.6 283 0/0 — 0/0 — 5表2.與野生種(野薔薇、照葉野薔薇、原生種玫瑰)人工交配所獲得 種子中之導入基因檢測率

宿主(WKS82) 基因重組體(WKS82/130-4-1) u回收 種子數 雜交種子數 /2)解析種子數 雜交率 (%) D回收 種子數 雜交種子數 /2)解析種子數 雜交率 (%) 導入基因 檢測種子數 /解析種子數 導入基因之 檢測率 (%) 野薔薇 23 11/12 91.7 58 10/10 100.0 0/10 0.0 照葉野薔& 43 0/0 — 24 0/0 - 0/0 一 原生種玫瑰 257 30/33 90.9 271 28/30 93.3 0/30 0.0 宿主丨 ：WKS ；82) 基因重組體(WKS82/130-9-1) 結果數 /交配花數 結果率 (%) 總種 子數 雜交 個體數 /發芽數 雜交率 (%) 結果數 /交配花數 結果率 (%) 總種 子數 雜交 個體數 /發芽數 雜交率 (%) 導入基因 檢測個體數 /發芽數 導入基因 t檢測# (%) 野薔薇 18/251 7.1 27 1/2 50.0 34/255 13.3 59 1/4 25.0 0/4 0.0 照葉野薔薇 23/260 8.8 44 1/1 100.0 14/261 5.4 44 0/0 — 0/0 一 原生種玫瑰 2/74 2.7 263 0/0 一 4/71 5.6 283 0/0 — 0/0 — * 1)，2):死種（種子無内容物者)、不^抽“Di^A者▲以PCR解析^ 法確認控制基因之增幅者均從本解析之對象中除外，因而產生種^ 10 總數與解析種子數間之差異。 18 200846476

瑰有益二發明之檢定方法，於自然條件下評估野生種玫 鬼有”〜、園藝種玫魂雜交。 5 10 15 20 if座^ 在距離伤主或基因重組體^加距離處配置 驗係於）’調查自㈣件下與野缝之雜交性。本試 /二主及基因重'組體與野藝薇同時期開花的條件下實 ^驗HP本試驗開始前既已開花之野薔薇的花朵，則在 试驗開叫全部去除，再配置於預定位置。 =驗結束後經過3個月的時間點，針對未生理落果且 : 果的果實確認有無種子形成。再將所得種子回 ，以4C低溫處理3個月後進行播種。為了確認該等有益 雜父到宿主或基因重組體及有無傳達到導 施例】之方法，以卿法進行解析。 依…貝 結果顯示於表3。從任一地點採集到之種子所獲得之實 ^苗均未測出含轉位子之刪基因，未觀察龍主或基因 重組體與野薔薇雜交。 因此，此-事實暗示到，在自然條件下本基因重組體 與野生種(野薔薇)沒有雜交之可能性，抑或即便有，可能性 也是極低的。 如前述，藉由使用本發明之檢定方法，可極簡便地評 估野生種玫瑰有無與園藝種玫瑰雜交。此外，一般而士， 在基因重組體之花粉細胞中因未含導人基因等理由而；致 導入基因不會傳達給後代時，常會使雜交之解析伴隨困 19 200846476 難仁7C本發明之檢定方法可簡便地判斷有無雜交，因 此卩使疋針對有無因雜交而傳達導入基因的部分， 容易地進行解析。

貫，毯J列5·驗莖_直原生野生種玫瑰採取之藉早有|雜夺到同 藝種玫瑰 表—之雜交率及導入基因之fy

' "^ 因亨組體(WKS82/130-4-TT 使用本發明之檢定方法，評估自然條件下原生之野生 種玫瑰有無與園藝種玫瑰雜交。 10 依照實施例3之方法，以已插入有轉位子之KSN基因的 有無作為指標進行PCR解析，藉此，從原生之野生種玫瑰 鲁 所採得之種子驗證有無與園藝種玫瑰雜交。此外，内生性 控制組則使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因。 結果及者容 15 茲將結果示於第1圖及表4。 針對從共17個地方所採集到之約1800個種子進行解 — 析，所有種子均未檢測出含轉位子之KSN基因的專一性增 幅產物（預測增幅尺寸：約1.2kb)。另一方面，作為内生性 控制組之GAPDH基因則在所有個體中測得增幅產物。 20 200846476 依據兩述結果，從原生之野生種玫瑰採集到之所有種 子均判斷未與園藝種雜交。 如前述，藉由使用本發明之檢定方法，可及為簡便地 評估野生種玫瑰有無與園藝種玫瑰雜交。 生野生種玫瑰採集到之種子的解析結果

=2) ·死種(種子气内谷物者）、不能抽提DNA者及以pcR解析益 從本解析之對象中除外，因而產生“ L·. 10 弟1圖顯示以PCR法檢測KSN基因之結果。pcr所測出 含有内含子（intron)之KSN基因及GAPDH基因（内生性控制 組)之專一性增幅產物的位置係以箭號表示。 【主要元件符號說明】 (無） 21 200846476 序列表 〈110>檢定野生種玫瑰中有無與園藝種玫瑰雜交之方法 <120〉 <130>1073356 <160>6 <210>1 <211>519

<212>DNA <213>Rosa sp. <22〇>

<221>CDS <222>(1)..(516) 〈223>玫瑰KSN基因之核苷酸序列 〈40〇>1 atg gca aga atg teg gaa cct tta gtt gtt gga aga gtc ata gga gat 48 Met Ala Arg Met Ser Glu Pro Leu Val Val Gly Arg Val lie Gly Asp 15 10 15 gtt ett gat tac ttt acc cca act act aaa atg att gtc act tac age 96 Val Leu Asp Tyr Phe Thr Pro Thr Thr Lys Met lie Val Thr Tyr Ser 20 25 30 acc aaa etc gtc ttc aat gga cat gag etc ttc cca tet gca gtc acc 144 Thr Lys Leu Val Phe Asn Gly His Glu Leu Phe Pro Ser Ala Val Thr 35 40 45 gcc aaa cct aga gtt gag att caa gga ggc gac atg aga tea ttc ttc 192 Ala Lys Pro Arg Val Glu lie Gin Gly Gly Asp Met Arg Ser Phe Phe 50 55 60 act ctg gtg atg aca gac cca gat gtt cct ggc cct agt gat cct tat 240 Thr Leu Val Met Thr Asp Pro Asp Val Pro Gly Pro Ser Asp Pro Tyr 65 70 75 80 ttg aag gag cac ctg cac tgg att gtg aca gac att cca ggc acc aca 288 Leu Lys Glu His Leu His Trp lie Val Thr Asp lie Pro Gly Thr Thr 85 90 95 gat gtt aca ttt gga aga gag atg gtg age tac gag atg cca agg cca 336 Asp Val Thr Phe Gly Arg Glu Met Val Ser Tyr Glu Met Pro Arg Pro 100 105 110 aac ata gga ate cac agg ttt gtg ttt gtt ett ttc aag cag aaa ega 384 Asn lie Gly lie His Arg Phe Val Phe Val Leu Phe Lys Gin Lys Arg 115 120 125 agg cag teg gtg aac cca cct tet tea agg gat cac ttc aac acc ega 432 Arg Gin Ser Val Asn Pro Pro Ser Ser Arg Asp His Phe Asn Thr Arg 130 135 140 age ttc gca gee gaa aac gac etc ggt ett cct gtt get gee gtt tac 480 Ser Phe Ala Ala Glu Asn Asp Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val Tyr 145 150 155 160 ttc aat geg cag aga gaa aeg gca gca aga aga ege tag 519

Phe Asn Ala Gin Arg Glu Thr Ala Ala Arg Arg Arg 165 170 <210>2 <211>8925 <212>DNA <213>Rosa sp. <220〉 〈221〉 〈222〉 〈223>玫瑰KSN基因之核苷酸序列 〈40〇>2 tgtaagtaca ttggcctatt accattcaac atatgatttc ccactacgac gaggaaaccg 60 gagcttcaag gaagcaaaga gaaagatcac aagatcggtt cttgaagaca agatcaagtc 120 aaatcgagtc actgatcttg agtttaatgt gtattcattc catattggtt ggtataaatc 180 taaattgata tgeatategg ttgtattaag tcaataatcc ettatgeatt aaaatggttt 240 ttaacatgca tatcaatttg agaccttgtt aggaaagtat cgattgcaca ttcaaaaact 300 gttttaaatc tttctatatt tatcttaatc aattatcaag aaaagatttg attgaggggg 360 agtttttctc ccttataaaa aggtttcaaa actaaagttt tgtgtagggt ttttgacggc 420 tgaaactggt ttctctttga acttcttgtt ttgttcaaat cgttttcgaa aaaccctctt 480 taattgtttc atgtattact ttgcataatc ttttacatcc actctcaaga tcagtgattc 540 aattgagtga aaggaaggct gaagattgat tgcctggaat gttgaatcta gagttagaat 600 ggttgtaaaa caagttagca tttgttgcta agaaaaggtg tttgttgtga acaacactac 660 ttgtattctg taaactctag tgtttaatat tggattgatt tttcgtgttg gctacgttaa 720 aagccacgca gtgaagtttc ctcagtggag aggtttacac tgcgttagca aatcttcgtg 780 tcatgtatca tactttcttt gattaaactc ttgagaaaaa gtattttatc aacactggtt 840 ccatctagta ttttcaattg gcatcagagc gggttctaga accttctaga gatcccagga 900 aagatggaac attcacgtga tagggctact gggggatcta taaatagtcc tccctggttc 960 gaaggtggat gtgaaaaata cactcaatgg aagatttaca tgaaatcata cctctatgct 1020 caagatgaac acgtgtggaa catcgtagaa aatggctgga gtgtacctat gacaaaagca 1080 aaagaagaag gcgcttccac taccactccc aaaccaagga aggactggac tgaggaagaa 1140 gttcgtaact tgcaagcaga tttcaaagcg aagaacagca tcttcacagc cctatcggag 1200 cgggaaaaac tgaggataag tcattgtgag actgccaagc aggcatggga tctcctacag 1260 attacatacg aaggaaataa aaaggtacgt gcacagaaac tgcaagcact gatttttgaa 1320 ttcgaaacca tgactatggc agatgatgga accgtggatg acttccatgg tagaattctt 1380 aaaatctccg gtcagtgtcg cagtctagga gcaccttttg atgaagataa aatagtcaaa 1440 aagatactca gggctctgcc ggaaaaattt cactcaaagg ttacgagcat agaggactct 1500 tttgatatag atgattatcc acttgatgag ctcatcggaa atttgaaaac ctatgagatg 1560 atgttaaaac ctgagaagaa aaacaagggc gtagccttca aagcagtgaa agaaattgaa 1620 gaggaagaag gatcactaga tcttgctcta ctgacgaagg aattcaaaaa atttctcaaa 1680 agcaagaact cctctaaaaa cacgaatgct cccagaagga ataaccatat tggcagtggt 1740 aacaacagtg actacaatag taagaatgga agaggaaact tcaaaggaaa tcactcaagg 1800 aaaccaaaat gctatgaatg tggtggtttc ggtcacattt ctactgactg tggaaatagg 1860 aagcttggaa acagcaacaa caagtcactc ctttcaactt ggagtgatga tgaatctcaa 1920 gaaattgaaa atgtggctct tgtctcatca ttgttgcctg attctgaaag tgatgagtat 1980 ttctctgatg atgatgaaac aaatgttcgc tgcaaacaac tctacaaagc ttcaaaggcc 2040 actctgatta gaaacttgag cttggaaaaa gaagtagatt tcctgaggac tgaaaaagaa 2100 aaggtggaga aactattcga atcctcacaa tctgcatgga aactggagaa aagcaaactc 2160 gtgagtgaat cggcagatct acaaggtgac caaaagatac tgacgtggaa gactgaaaag 2220 aatgagtatc tcaacaagat caaacttcta gaactggatg ttaaaggaca aagagccctg 2280 aacttggaac tgttagcgaa aaatgagtct ctacaacatg agttaaaatt aactcaagaa 2340 agattcatga agtttgatat cagctccact tccatgtcca agttacttgg atcaggaaaa 2400 gctcctcatg atacatgtgg gctaggatac actggagaag attccaaaag caccaaattc 2460 200846476

gtacgtgcct caaaaccatc tgtagagcag atagatgtct cccttgatga tcatgtcaaa 2520 agtgtaaggg aaggtaattc aaaccaacat catcaggtaa aacttgacca agaatccccc 2580 actggtcaac acaggtacgc aaaccctaga acctttgttc ctacttgtca tcactgtggt 2640 aagattggcc atatcagacc tagatgtaat gaacggtttt taaacttaca attttctcaa 2700 gaaaaatgta ctgtcgaaac cttacaggtt gagcttaaag aacaaaagga actcattaac 2760 aaattaactg aaattgtttc tcaaaagaat cctcaaactg aaagaagaaa agatgtctgg 2820 accagaaaaa ttaaaagcaa aaatcattgg tcccctgttg gtgaaactga tgatacatgt 2880 ctttttgttt gtgctagcaa aattcatcaa cgctctcaca ttgaggcaac ttgtttggta 2940 gctttaactg catttgctga caaacgacga gatttttggt atgttgacag tggttgttct 3000 agacacatga ctggagacaa aacctggttt acttcatttg aggatgaaaa tacctctgga 3060 tcagtcacgt ttggagatgg gaggaaagct aacattctag ctcgaggtac agtaaacact 3120 ccaggtatac ctaaccttaa aaatgtgtta tttgttgaag gattaactgc aaatctgatt 3180 agcgtcagcc atttggctga tgactatgaa gatgtgtggt ttaacaaaca gagatgtttg 3240 gtcctaaatc agaaaggtga aggtatcatg ggaggtatga gatctgttga taactgttat 3330 catattcaag caaatgaatc ttctagtttg cagtcttgtt tgtctgttaa atccacagag 3360 gaaacctttg aactttggca cagaaagatg ggacatatca actatcagga cttgctgaaa 3420 ttatcttcca aacaatgtgt ccgaggcttg ccaaatttaa aaggtaaaac tgacaagatg 3480 tgtggagact gcaaggttgg aaagcaaact aaggcacctc acagaatggt aaattctgcg 3540 acaacctcac aagtattgga actattacac atggatctca tgggaccagc tcaatctgaa 3600 agtcttggag gtaagagcta catactagta gttgtagatg atttctcaag atacacctgg 3660 gtaaacttct tgaaagacaa aactgaaacg tttgagtcct ttaagaactt gagtcaaaaa 3720 ttaatcattg agaaacaatc atctaataac tgtttagtga gaataagatc agataatgga 3780 actgagttta aaaatgcctc tttttctaac tactgtcatg agcttggtgt gtcacatgag 3840 ttctcagctc caataacccc tcaacaaaat gggatagtgg aaaggaaaaa tagggtactg 3900 ctagacatgg ctcgagtatt actacacgct gcaggtttaa gcaaaaactt ttgggctgan 3960 gcgatcagca ctgcttgcta cacaataaat agagtattcc ttanaccang aaatgatcaa 4020 actgcttacg agctgtggaa aggtaanaag ccaaatgtta aacactttca tgttntnggc 4080 agtccttgtt acattctacg agatagagaa caccttggta agtttgatgc tagaactgat 4140 gatngtgtgt tcttggggta ttctctgaac agcagagcat atagggttta caataaaaga 4200 actcgtgttg ttatggaatc cattaatgtt tctattgatg atcaatgtgt gaaacaggaa 4260 gtaacatttg cagatacctc acccttctcg gtcacacctt cacagaatac tgaaacatca 4320 tntgaggaag aggaagagga aatccatgac aacatttttg aaccagctnc cacccaaagn 4380 agagggttca agcaagttca aaaagatcac tccactcaag atatcatcgg caatctaaca 4440 gatggtccga tgacaaggag aaaggctgca gttcaggtaa gtccctntga ggtaagtgaa 4500 ggaaatgtat tactgtgttt cattaccgaa aatttggtaa gcatgaacat tatatctcat 4560 tttggttttg tgtccattat tgaaccnaaa aatattaagg cagccttgtt ggatgataac 4620 4 200846476

tggattagcg ccatgcaaga tgaactgaat cagtttacta ggaatgatgt atggtactta 4680 gtaccaaggc ctagtaagtg caatgttata ggaactaagt ggattttcag naatnaaagc 4740 gatgntaaag gnaacgtgat taggaataaa gccagactag ttgctcaggg atattcacag 4800 gtcgaaggac ttgactttga cgagactttt gctcctgtag ctaggttgga atctgttaga 4860 ttacttctat ccattgcttg tcatctccgg ttcaaattgt ttcaaatgga tgtcaaaact 4920 gcctttctga atggatttct tcaggaggaa gtttatgtag agcagcctcc aggtttccaa 4980 gatccacaca acctagatca tgtctaccgg ctcaagaaag ccctgtatgg gctaaagcag 5040 gctcctcgag cctggtatga gagactatcc actcatcttg tgggaaaagg gtatgctaga 5100 ggatccatag ataaaacatt gtttgtgaaa cgaaccaaaa atgacattgt cattgcccaa 5160 gtgtatgttg atgatattgt atttggttcc acttctaaat accttgtcaa agaatttcaa 5220 tctgtcatgg aaagtgaatt tgaaatgagc atgtgtggtg aactaacgta ttttcttgga 5280 ctgcaagtaa agcagataga cacaggtttg tttctctctc aatcaaaata cgctgagaac 5340 ctgatcaaga aattcggtct tgcttccaag aagacagtga ccaatcccat gagtacaact 5400 actaagttaa gcgaagatca tgaaggaaaa tcagttgatc cgactctcta tcgaagtatg 5460 atcgggagtt tgctctatct cactgccagc agacctgaca tctcttacag tgtgggtgtg 5520 tgtgctcgat ttcaagcaaa ccccaaagaa tctcacctgg acgctgtcaa aagaataatc 5580 cgctatgtgg caggtacagt taattgtggc cttttctata ccttcgacac taatgtagaa 5640 attgcaggat actctgatgc tgactgggga ggaaatttaa aggatcggaa aagcacttca 5700 gggggatgtt ttttcattgg caacaatctg gttgcctggc atagtaagaa acaaaactgc 5760 atatccttgt ctactgcaga agctgaatat gttgccgctg gaagttgctg cacacaaata 5820

ctttggatga agcaaatgct tcatgattat ggcatatctc aaggtaagtt gtctattttc 5880 tgtgacaaca ctagtgctat taacatcact aagaatcctg ttcaacactc tcgaacaaag 5940 cacattgatc tccgatatca ctttattagg gatttggttg aacaaaacat acttgagtta 6000 agctttgtgc ccactgaaaa tcaacttgct gatctgttca ctaagcctct tgacactgct 6060 aggtttgaaa tgttgaggaa tgccctaggg atatgttcta agcattaagg caaaatgatg 6120 actgtccact attgattgag aaaattgtga tcctagtatc ccttgatcac agtcactagt 6180 gaaatgtaca tattttcagt catgtatctt aatgttatca tgccttattc tggacaaatg 6240 aaattgtgta ctcatgttta gtcactgaat caagtaaccc tactatgcat cttcacctat 6300 agcctatgtg gtggcatgtt tccttttgtt ttctgtcaaa tgagattcag tgaagtagac 6360 gaactgcttc ttttgctcac ataactaatt ccctcttctc aaagtaatca ggtcctagtt 6420 gtggtgaact ttctaggatt tgtaanaaac ganaacggaa aattgtatcc catctctcaa 6480 agtaatcagg ccttagtcgt ggtgaacttt ctaangtttg caagaaacga gctggtgagt 6540 ggtctttgca cataacataa aatcatgcag acaactactc gagactctct ccatgganca 6600 tccttgttat gcttagtacc ctaagaacat ctgttctggg ggttgctgag aagagtcttg 6660 ttacatgagt aatatttgtc actaaatnaa ggagatcttt gactccanta nacatgtgct 6720 tgggaccatg attcctgctc cttnttagga gatttcatga gctttacttt agttctctta 6780 5 cttcactcct tntntatgac actaaaatct tttctaagcc ccacatcatg gttatattca 6840 cttctatcac aagtttactc cttaaggtct aactatgagt accaattctt attgttgaga 6900 gaatacatca tgcttcgtac tctgaactat gtgccttcca ctaagtgatc tgtgctctct 6960 gtgattaaac ttcgctatat tttctctcct cgatatgacc tatgcattca ttgccttgat 7020 acttgcaaag gaaacgatcc tctgatatac ttgcagattc tctgaatata ttttggctct 7080 tcgtttcctt ccttgatggt aatctgccta caattaattt ccataatgac tatgcctaag 7140 ttgaggggga gaagttatct gcatgcatat acctagggaa aataaattgt cataacttct 7200 ctccccattt gagccgttct cccaatcggt gtgttccttg gtcttcntaa aacctaactg 7260 ttcactacat atagcntctc ttgtctccct cggattttac tcttggttgt ctctgtgtgc 7320 aggttctttc acccactgct ctctcaccat ggttcgctca cagcaaacaa ctcgccttgg 7380 aggacatcgc cgcctgcctc ctccagaaga aggtcgtcag gcagctgcca gagccgggat 7440 tntccatccc ggcatgcatc gtacacgcag tcggagtcct cctcctcctg tctctctgga 7500 aagtctccgt gatcagattc tagtggctga ctggcgaatt gcttgcctca cgacggacat 7560 ggacgacatg cattctcttc tggttcgaac tcgtcatgcc ctgaccactc tcacacagga 7620 gatccggaac atgcagcgcc accctcccgg gtttgacgct cccggtccat cccatgccat 7680 gcaggagcct gtcgcaccag aggaaagctc ggattccatg gatgaagagg aatttctgga 7740 caccgtcacc aagctttgtg aggaatttga cgtgccctcc cattcaaagg gggagaagta 7800 acttgatttt tcttacttta tttctgtttc tgcattttta attttttttg gtgtgtaagt 7860 gcataagcac agatactctt aggatgcttg ctattattat tcttaagtaa tcgtattttg 7920 gctacttgga tccggaaaag gatggaaact gattccttac tccaagtagc accctttgtt 7980 tagtgattag tgtttatctg tgaaacctaa cttgcaggac aaaagatgaa aaatcatgcg 8040 ttgaatggga atgcccaaag ggggagattg taagtacatt ggcctattac cattcaacat 8100 atgatttccc actacgacga ggaaaccgga gcttcaagga agcaaagaga aagatcacaa 8160 gatcggttct tgaagacaag atcaagtcaa atcgagtcac tgatcttgag tttaatgtgt 8220 attcattcca tattggttgg tataaatcta aattgatatg catatcggtt gtattaagtc 8280 aataatccct tatgcattaa aatggttttt aacatgcata tcaatttgag accttgttag 8340 gaaagtatcg attgcacatt caaaaactgt tttaaatctt tctatattta tcttaatcaa 8400 ttatcaagaa aagatttgat tgagggggag tttttctccc ttataaaaag gtttcaaaac 8460 taaagttttg tgtagggttt ttgacggctg aaactggttt ctctttgaac ttcttgtttt 8520 gttcaaatcg ttttcgaaaa accctcttta attgtttcat gtattacttt gcataatctt 8580 ttacattcac tttcaagatc agtgattcaa ttgagtgaaa ggaaggctga agattgattg 8640 cctggaatgt tgaatctaga gttagaatgg ttgtaaaacc aagttagcat ttgttgctaa 8700 gaaaaggtgt ttgttgtgaa caacactact tgtattctgt aaactctagt gtttaatatt 8760 ggattgattt ttcgtgttgg ctacgttaaa agccacgcag tgaggtttcc tcagtggaga 8820 ggtttacact gcgttagcaa atcttcgtgt catgtatcat actttctttg attaaactct 8880 tgagaaaaag tattttatca acactggttc catctagtat tttca 8925 200846476 <210>3 〈211>23 <212>DNA 〈213>人工序列 〈220> <221> <222〉 〈223>前置引子 <400>3 catattatgg catagggtgt ggc <210>4 <211>24

<212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221> 〈222> <223〉反置引子 <400>4 tgtaatctgt aggagatccc atgc <210>5 〈211〉23 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <221> <222〉 〈223>引子 〈40〇>5 tgtcatctct gccccaagta agg 〈210>6 〈211>23 <212>DNA <213〉人工序列 〈220> 23

24

23 200846476 <221> <222〉 <223〉引子 <400>6 23 caacatcctc atcggtgtaa ccc

8

Claims (1)

1. 200846476 十、申請專利範圍： 1·=種檢定受測對象之野生種玫瑰是否與園藝種玫瑰雜 交之方法，係調查該受測對象之野生種玫瑰是否存在含 有成為指標之轉位子(transpo s〇n)的KSN基因。 5 2·如巾μ專利範圍第丨項之方法，其係若受測對象之野生 種文鬼不存在含有成為指標之轉位子的KSN基因，則判 斷受測對象之野生種玫瑰未與園藝種玫瑰雜交。 3·如申請專利範圍第丨項之方法，其係若受測對象之野生 種玫瑰存在含有成為指標之轉位子的KSN基因，則判斷 10 文測對象之野生種玫瑰已與園藝種玫瑰雜交。 4_如申請專利範圍第i〜3項中任一項之方法，其中母系為 野生種玫瑰，父系為園藝種玫瑰。 5·如申請專利範圍第1〜4項中任一項之方法，其中該園藝 種玫瑰係已導入基因之玫瑰。 15 6·如申請專利範圍第1〜5項中任一項之方法，其中該基因 係與化色相關之基因。 7·如申請專利範圍第6項之方法，其中該與花色相關之基 因係源自堇菜科三色堇之類黃酮3’，5’·氫氧化酶基因。 8·如申請專利範圍第1〜7項中任一項之方法，其中該指標 2〇 基因之檢測係藉由雜交該基因之核酸來進行。 9·如申請專利範圍第1〜7項中任一項之方法，其係以pcr 之專一性增幅進行前述檢測。 10·如申請專利範圍第9項之方法，其係以前置引子： CATATTATGGCATAGGGTGTGGC(序列編號：3)及反置 200846476 引子：TGTAATCTGTAGGAGATCCCATGC(序列編號： 4)進行前述PCR。 U·如申請專利範圍第1〜10項中任一項之方法，其中該野生 種玫瑰係同型地(homozygous)含有不具轉位子之KSN 基因者。 12·如申請專利範圍第1〜11項中任一項之方法，其中該野生 種玫瑰為野薔薇、照葉野薔薇、原生種玫瑰、刺薔薇、 樺太薔薇、光葉薔薇、東薔薇、山照葉薔薇、山薔薇、 碩包薔薇、琉球野薔薇、金櫻子、山椒薔薇、高嶺薔薇、 筑紫薔薇、森薔薇、富士薔薇、藪薔薇、小野薔薇或都 薔薇。 13·如申請專利範圍第卜；^項中任一項之方法，其中該園蓺 種玫瑰係同型地具有業經插入轉位子之ksn基因者 14.如申請專利範圍第項中任一項之方法，其中該園蓺 15

   20 種玫瑰為雜種香水月季（紗汾W 、大—: 4匕季 (Fioribunda Rose)或迷你玫塊。 • -種計對、、係於檢定受測對象之野生種玫瑰是否與 園藝種玫瑰雜交的方法中，用以使含有將成為指標之轉 位子的ksn基a增幅者，且’該引子對係由具有與序列 編號1所示鹼基序列部分相同或實質上互補之鹼基序列 的引子 '及具有序列編號2所示驗基序列部分相同或實J 質上互補之鹼基序列的引子所構成者。 5 16·如申請專利第15項之引子對，其係由前置引子： CATATTATGGCATAGGGTGTGGC(序列編號：3)及反置 2 200846476 引子：TGTAATCTGTAGGAGATCCCATGC(序列編號： 4)所構成者。

   3 200846476 七、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無） 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：