MX2015002438A

MX2015002438A - Melon resistente a multiples virus.

Info

Publication number: MX2015002438A
Application number: MX2015002438A
Authority: MX
Inventors: Tarek Joobeur; Eleni Bachlava; Joseph J King; Francois P M Bertrand; Vries Jeroen S De; Petrus J Kraakman
Original assignee: Seminis Vegetable Seeds Inc
Priority date: 2012-08-23
Filing date: 2013-08-21
Publication date: 2015-06-22
Also published as: WO2014031770A3; WO2014031770A2; MX2018015712A; US11019777B2; CA2881639C; CA2881639A1; US9913439B2; US20140059712A1; EP2887796A2; MX378815B; MX369795B; US20200060112A1; EP2887796A4

Abstract

La invención hace referencia a una planta de melón y partes de esta, lo que incluye semillas y fruto, la cual es resistente al virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) y al virus del mosaico de la sandía (WMV); la planta de melón también puede comprender además resistencia al virus del mosaico del pepino (CMV) y/o exhibir adicionalmente una medida de grado Brix de = 9,5 °Bx, pulpa de color naranja y/o una relación de ancho/largo del fruto = 0,5; también se producen métodos para producir dicha planta.

Description

MELÓN RESISTENTE A MÚLTIPLES VIRUS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Las presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense IM.° 61/692643 presentada el 23 de agosto de 2012 y que se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.

INCORPORACIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS El listado de secuencia, el que forma parte de la presente descripción, incluye un archivo en formato digital de 13KB creado el 20 de agosto de 2013 y de nombre SEMB006WO_ST25.txt que comprende las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de la presente invención presentado a través de EFS-Web. El objeto del Listado de secuencias se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención hace referencia al campo de reproducción vegetal. Más específicamente, hace referencia a métodos para producir melones resistentes a múltiples virus y a plantas producidas a partir de ellos.

ANTECEDENTESDELAINVENCIÓN Los melones son apreciados como frutas a nivel mundial y a menudo son ingeridos como productos frescos. Los melones son miembros de la familia de cucúrbitas ( Cucurbitaceae ), una clase de planta trepadora anual que también incluye zapallo, calabaza y pepino. Tienen hojas grandes y anchas, tallos cubiertos con espinas claras y pequeñas flores amarillas. Los frutos en sí mismos tienen pulpa suave con una cavidad central que contiene semillas rodeada por una piel protectora gruesa.

En líneas generales, los melones se dividen taxonómicamente en dos grupos: sandías (especie Citrul/us lanatus) y melones (especie Cucumis meló L.). C. meto incluye una amplia variedad de cultivares que producen frutos de forma, apariencia exterior y color de pulpa diferentes que incluyen melones tales como melón de invierno, cantalupo (incluyen los tipos Western Shipper, norteamericano y Charentais), melones casaba, melones hami, melones verdes, melones Navajo Yellow, melones piel de sapo, melones de navidad, melones de azúcar, melones ambrosía, bailan, galla, ogen, persas y sharlyn.

Determinados virus son capaces de Infectar melones y ocasionar daños en las cosechas y pérdidas en muchas variedades. Ejemplos de patógenos virales que pueden tener impacto en el cultivo del melón incluyen el virus del mosaico del pepino (CMV), virus del mosaico de la sandía (WMV) y virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la Invención provee una planta de melón que comprende resistencia al virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) y al virus del mosaico de la sandía (WMV), en el que la planta comprende adicionalmente al menos un rasgo seleccionado del grupo que consiste en: producción de frutos con una relación entre ancho y largo de al menos 0,5, producción de frutos con pulpa de color anaranjado, pulpa de color verde o pulpa de color blanco, exhibición de grado Brix > 9,5 °Bx, exhibición de resistencia al CMV, exhibición de resistencia al MNSV, exhibición de resistencia al PRSV y exhibición de resistencia a oídio.

En una modalidad, la invención provee dicha planta de melón en la que el al menos un rasgo es una relación de al menos 0,5 entre ancho y largo. En otras modalidades, la planta de melón comprende al menos un rasgo seleccionado del grupo que consiste en color de pulpa anaranjado, color de pulpa verde y color de pulpa blanco. En otra modalidad de la planta de melón, el al menos un rasgo es Brix > 9,5 °Bx. En incluso otra modalidad el al menos un rasgo es resistencia a CMV. En incluso otra modalidad el al menos un rasgo es resistencia a oídio. En otras modalidades, el al menos un rasgo es resistencia a MNSV o resistencia a PRSV.

Adicionalmente, la invención provee una parte de tal planta de melón en la que la parte de la planta es seleccionada del grupo que consiste en: una semilla, una raíz, una hoja, un tallo, polen, un óvulo, una antera, un pistilo y una célula. La invención también provee un cultivo tisular de células de la planta de melón que pueden regenerarse. En una modalidad particular, el cultivo tisular puede comprender células o protoplastos de una parte de planta seleccionada del grupo que consiste en: embrión, meristemo, cotiledón, polen, hoja, antera, raíz, punta de la raíz, pistilo, flor y semilla.

Otro aspecto de la invención provee dicha planta de melón, la cual es endogámica. De manera alternativa, la planta de melón puede ser un híbrido.

Un aspecto adicional de la invención provee un método de determinación del genotipo de una planta de melón que comprende resistencia al virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) y al virus del mosaico de la sandía (WMV), en el que la planta comprende adicionalmente al menos un rasgo seleccionado del grupo que consiste en: producción de frutos con una relación entre ancho y largo de al menos 0,5, producción de frutos con pulpa de color anaranjado, pulpa de color verde o pulpa de color blanco, exhibición de grado Brlx > 9,5 °Bx, exhibición de resistencia al CMV, exhibición de resistencia al MNSV, exhibición de resistencia al PRSV y exhibición de resistencia a oídio, y el método comprende la obtención de una muestra de ácidos nucleicos de dicha planta y la detección de una variedad de polimorfismos en dichos ácidos nucleicos.

La Invención también provee un método de identificación de una planta de melón que exhibe resistencia al virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) y al virus del mosaico de la sandía (WMV) que comprende: la detección de al menos un alelo de una marcador asociado a la resistencia a WMV y ZYMV en una primera planta de melón, en la que el marcador se encuentra genéricamente ligado en un intervalo de 10 centIMorgans (cM) del marcador NU0219106 o NU0219710 en el cromosoma 11 del melón. En una modalidad de tal método, el marcador se ubica en un intervalo cromosómico definido por los marcadores terminales NU0219106 y NU0219710 del cromosoma 11 de melón y que los Incluye. En otra modalidad, el marcador se ubica en un intervalo cromosómico definido por los marcadores terminales NCMEL00838077 y NU0NU0220333 del cromosoma 11 de melón y que los Incluye. En modalidades particulares del método, el marcador es seleccionado del grupo que consiste en: NU0219106, NU0218916, NU0219099, NU0218656, NCMEL008383076, NCMEL008383077, NU0218779, NCMEL008383075, NCMEL008383078, NU0220333, NU0219293, NU0218835, NU0244142 y NU0219710.

En algunas modalidades, la detección comprende la detección de al menos una forma aléllca de un polimorfismo de nucleótldo simple mediante PCR, análisis de polimorfismo conformaclonal de cadena simple, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante, análisis de polimorfismo de largo de fragmento de escisión, ensayo TaqMan y/o secuenciación de ADN.

Adiclonalmente, la invención provee un método de Identificación de una planta de melón que exhibe resistencia al virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV): la detección de al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia a ZYMV en una primera planta de melón, en la que el marcador se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 2 centiMorgans (cM) del marcador NU0218531 en el cromosoma 2 del melón. En determinadas modalidades, el marcador se ubica en un intervalo cromosómico definido por los marcadores terminales CMBR041 y NU0218531 del cromosoma 2 de melón y que los incluye. En modalidades particulares del método, el marcador se selecciona del grupo que consiste en CMBR041 y NU0218531.

El método puede comprender adiclonalmente la detección de al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia a CMV y al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia a WMV y ZYMV. Por lo tanto, en tal método se detecta al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia a CMV en la planta de melón en un intervalo cromosomal definido por los extremos NU0243358 o NU0218323 Inclusive en el cromosoma 12 de melón, o en un intervalo cromosomal definido por los extremos NU0219184 y NU0218323 Inclusive en el cromosoma 12 de melón, o en un Intervalo cromosomal definido por los extremos NU0220476 o NU0219006 inclusive en el cromosoma 2 de melón o en el que el marcador se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM de los marcadores NU0243358 o NU0219184 o NU0218323, o genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM de marcadores NU0220476 o NU0219006.

En determinadas modalidades de los métodos, se evalúa la resistencia mediante la exposición de la planta a WMV o ZYMV y la identificación de plantas con expresión reducida de síntomas de enfermedad respecto a las plantas de control.

En algunas modalidades de los métodos, se encuentra el al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia a WMV o ZYMV en la línea ME8094 de melón, de la que se depositó una muestra representativa de semilla con el número de acceso NCIMB 41653. Adicionalmente, la invención puede comprender la selección de la primera planta de melón de una población de plantas de melón con base en la presencia de dicho alelo de un marcador asociado a la resistencia a ZYMV o WMV. En modalidades particulares, el método también comprende el cruzamiento de una primera planta de melón seleccionada con una segunda planta de melón para obtener una planta de progenie de una generación posterior. Determinadas modalidades de los métodos de la invención comprenden además el retrocruzamiento de la planta de progenie de una generación posterior y al menos una generación posterior adicional de ella con un progenitor recurrente hasta que se produzca una planta de progenie retrocruzada que comprenda resistencia a WMV o ZYMV.

Otro aspecto de la invención provee un método para producir una planta de melón con resistencia a WMV y ZYMV que comprende las etapas de: (a) cruzamiento de una planta de línea ME8094 de melón, o de una progenie de ella que comprende resistencia a WMV y ZYMV derivada de dicha línea ME8094, con una segunda planta de melón con al menos un rasgo deseado, de la que se depositó una muestra representativa de semilla con el número de acceso NCIMB 41653 y (b) selección de al menos una primera progenie de planta de melón que resulta del cruzamiento que comprende resistencia a WMV y ZYMV, y al menos un rasgo deseado.

En algunas modalidades de dicho método, el rasgo deseado es seleccionado del grupo que consiste en: una relación entre ancho y largo de al menos 0,5, color de pulpa anaranjado, grado Brix > 9,5 °Bx, resistencia a CMV, resistencia a MNSV, resistencia a PRSV y resistencia al oídio. En otras modalidades, la selección de la primera progenie comprende la identificación de la presencia de al menos un primer marcador genético en la primera progenie genéticamente ligada a un locus que contribuye a la resistencia a WMV, ZYMV o CMV, en la que se mapea el marcador genéticamente ligado a un locus que contribuye a la resistencia a WMV o ZYMV en el cromosoma 11 y en la que se mapea un marcador genéticamente ligado a un locus que contribuye a la resistencia a CMV en el cromosoma 2 y/o 12. En modalidades particulares, la selección de la primera progenie comprende adicionalmente la selección de la progenie con base en la presencia de una variedad de marcadores genéticos de la segunda planta de melón presente en la progenie. Por lo tanto, en algunas modalidades, la invención provee un método en el que el marcador genético ligado a un locus que contribuye a la resistencia a WMV o ZYMV se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM del marcador NU0219106 o NU0219710 en el grupo de ligamiento 11 del melón. En modalidades adicionales, el marcador genético ligado a un locus que contribuye a la resistencia a CMV se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM del marcador NU0243358 o NU0218323 en el grupo de ligamiento 12 de melón o en un intervalo de 10 cM del marcador NU0220476 o NU0219006 en el grupo de ligamiento 2 del melón.

En determinadas modalidades, el marcador genético se selecciona del grupo que consiste en: NU0219184, NU0219714, NU0220980, NU0243527, NU0220836, NU0218164, NU0218516, NU0218074, NU0218603 y NU0220144. En otras modalidades, el marcador genético ligado a un locus que contribuye a la resistencia a CMV se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM del marcador NU0220476 o NU0219006 en el grupo de ligamiento 2 del melón. En aun otras modalidades, el marcador genético se selecciona del grupo que consiste en: NU0218624, NU0219047, NU0220488 y NU0220264. En modalidades particulares, el marcador genético ligado a un locus que contribuye a la resistencia a WMV o ZYMV es NU0218656 o NU0218779.

Modalidades adicionales de tal método comprenden la etapa de: (c) cruzamiento de la planta de progenie consigo misma o con una tercera planta para producir una planta de progenie de una generación posterior. Incluso otras modalidades comprenden adicionalmente las etapas de: (d) cruzamiento de la planta de progenie de una generación posterior consigo misma o con una segunda planta y (e) repetición de las etapas (c) y (d) por al menos 3-10 generaciones adicionales para producir una planta de melón endogámica derivada de la línea ME8094 de melón, de la que se depositó una muestra representativa de semilla con el número de acceso NCIMB 41653. En modalidades particulares, dicha planta de progenie de una generación posterior es seleccionada para cruzamiento con base en la presencia de resistencia a WMV o ZYMV y del rasgo deseado. En determinadas modalidades, la planta de progenie de una generación posterior es seleccionada en cada generación para cruzamiento con base en la presencia de resistencia a WMV o ZYMV y del rasgo deseado. El método puede comprender adlcionalmente la selección de la planta de progenie de una generación posterior mediante la identificación de la presencia de al menos un primer marcador genético en la primera progenie que se encuentra genéticamente ligado a un locus que contribuye a la resistencia a WMV y ZYMV. En algunas modalidades, la selección de la planta de progenie de una generación posterior comprende adicionalmente la selección de la progenie con base en la presencia de una variedad de marcadores genéticos de la segunda planta de melón presente en la progenie. En modalidades adicionales, se repite la etapa (e) una cantidad suficiente de generaciones para obtener una planta de melón endogámica que comprende resistencia a WMV y ZYMV, y que comprende adicionalmente los rasgos agronómicos de la segunda planta de melón.

Aun otro aspecto de la invención hace referencia a una planta de melón, o a una parte de ella, producida mediante dicho método. Una parte de dicha planta de melón, en la que la parte se selecciona del grupo que consiste en: un fruto, una hoja, una raíz, un tallo, polen, un óvulo, una célula y una semilla que también se provee, así como la semilla de melón híbrida producida mediante dicho método.

Por lo tanto, en determinadas modalidades, la invención provee una semilla de melón definida como producida por un método que comprende: el cruzamiento de la variedad ME8094, de la que se depositó con el número de acceso NCIMB 41653 una muestra representativa en NCIMB, Aberdeen, Escocia, o una progenie de ella, con una segunda variedad de melón, la detección del genotipo o fenotipo de resistencia a virus de una planta de progenie de una generación posterior y la cosecha de semillas de ella.

Una semilla endogámica de melón de la línea ME8094, de la que se depositó una muestra representativa en NCIMB con el número de acceso NCIMB 41653, es un aspecto adicional de la invención, al igual que una planta cultivada a partir de la semilla de ME8094 y una parte de la planta. En algunas modalidades, la parte de la planta se selecciona del grupo que consiste en: un fruto, una hoja, una raíz, un tallo, polen, un óvulo, una célula y una semilla.

Aun otro aspecto de la invención provee una planta de melón, o una parte de ella, con todas las características fisiológicas y morfológicas de una planta de la línea ME8094 de melón. También se provee un cultivo tisular de células de la planta que pueden regenerarse. En modalidades adicionales, la planta de la línea ME8094 de melón comprende adicionalmente una conversión de un locus simple. En otras modalidades, la planta comprende un transgén.

Otro aspecto de la invención provee un método para producir semillas de melón que comprende el cruzamiento de la planta de línea de ME8094 de melón consigo misma o con una segunda planta de melón. Por lo tanto, la invención también provee una semilla híbrida F1 producida mediante dicho método, así como una planta híbrida F1 producida mediante el cultivo de dicha semilla.

En aun otro aspecto, la invención provee un método de propagación vegetativa de una planta de melón que comprende las etapas de: (a) recolección de tejido capaz de ser propagado a partir de una planta de la línea ME8094 de melón, (b) cultivo de dicho tejido para obtener brotes proliferados y (c) enraizar dichos brotes proliferados para obtener plántulas enraizadas. Determinadas modalidades de este método comprenden adicionalmente cultivar plantas de dichas plántulas enraizadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es un diagrama del mapa genético del melón en el que se ilustran las posiciones relativas de ciertos rasgos de interés en los grupos de ligamiento (cromosomas) 1-12.

La figura 2 ilustra el nivel de síntomas de enfermedades virales conferido por los rasgos de resistencia presentes en la línea de melón ME8094 cuando se expuso a CMV, WMV o ZYMV, en comparación con otras líneas de melón seleccionadas. El eje Y indica la escala de graduación de los síntomas (1-10).

La figura 3 ilustra los títulos virales detectados mediante ELISA en la línea de melón ME8094 luego de haber sido expuesta a CMV, WMV o ZYMV, en comparación con otras líneas de melón seleccionadas.

Las figuras 4A a 4E son fotografías de frutos de las líneas ME8094 y BC2 de las que derivan. FIG. 4A: fruto de ME8094; FIG. 4B: fruto de C2_WSH-39-1083-AN*3/EXC-C210-ME-8094-1:0027.0018.0006; FIG. 4C: fruto de C2_WSH-39-1083-AN*3/EXC-C210-ME-8094- 1:0080.0088.0005; FIG. 4D: fruto de C2_WSH-39-1083-AN*3/EXC-C210-ME-8094- 1:0063.0007.0010.0147; FIG. 4E: fruto de C2_WSH-39-1083-AN*3/EXC-C210-ME-8094- 1:0018.0013.0002.0145.

La figura 5 ilustra los resultados de ensayos adicionales para rasgos de cada una de las dos familias GAL BC3 evaluadas que presentan la introgresión del QTL11 de ZYMV/WMV (alelos de donante homocigoto (DN) y progenitor recurrente (RP) junto a las líneas endógenas no convertidas (FS)), respectivamente.

La figura 6 ilustra los datos de la Tabla 11 (ensayo de la conversión MABC AMA-188-DECO-AN que porta la introgresión del QTL11 de ZYMV/WMV) en forma de gráfica. Los resultados de alelos de donante homocigoto (DN) y progenitor recurrente (RP) se encuentran junto a las líneas endogámicas sin convertir (FS). Se evaluó una familia BC4 para determinar rasgos fenotípicos mencionados. Se ilustran diferencias de mínimos cuadrados y mínimos cuadrados promedio.

La figura 7. Fotografías que ilustran tamaño/forma usual y cicatrización en extremos de floración de los melones que presentan introgresiones en la región genómica del QTL12 de CMV.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención provee métodos y composiciones para producir plantas de melón resistentes a múltiples virus que exhiben resistencia al virus del mosaico de la sandía (WMV) y al virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV), y al virus del mosaico del pepino (CMV), al tiempo que exhiben uno o más rasgos aceptables desde el punto de vista agronómico tales como contenido Brix elevado, color de pulpa del fruto deseado (por ejemplo, anaranjado, verde o blanco), forma de fruto deseable (relación entre largo y ancho), fruto no pentámero y ausencia de flores andromonolcas, entre otras. Se proveen adicionalmente métodos de reproducción y selección de líneas de melón resistentes a múltiples virus, así como plantas, semillas y frutos de dichos melones resistentes a múltiples virus. También se describen en la presente marcadores moleculares ligados a locus de rasgos cuantitativos (QTL) que contribuyen a la resistencia a virus de dicha planta.

Sorprendentemente, los inventores lograron desarrollar métodos y composiciones que permiten, por primera vez, producir plantas con resistencia a múltiples virus y evitar o minimizar los rasgos perjudiciales que, hasta el momento, han sido asociados a dicha resistencia viral. Los ejemplos de rasgos perjudiciales que se han asociado a intentos de obtener resistencia a virus individuales Incluyen plantas débiles con frutos pentámeros poco reticulados e Insípidos, poca reticulación, poca producción de frutos, necrosis foliar y andromonoecla. En contraste, la invención provee métodos y composiciones que permiten la combinación de la resistencia a múltiples virus con la capacidad de producir una cosecha de melón comerclalmente aceptable a partir de una única línea.

La capacidad de producir plantas resistentes a virus también se ve obstaculizada por dificultades en la determinación de fenotipos y por la limitada capacidad de repetición de la determinación del fenotipo de la resistencia a virus. Esto incluye problemas asociados a la heredabilldad limitada de algunos fenotipos de resistencia. Por ejemplo, respecto al CMV, pueden ocurrir reacciones Inestables a la enfermedad en ensayos secuenclales en determinadas líneas de reproducción vegetal.

La invención representa un avance importante en la téenica debido a que provee, en determinadas modalidades, métodos y composiciones que posibilitan la introgresión o resistencia a virus y combinaciones de virus seleccionados en un contexto genético comerclalmente aceptable. En modalidades específicas de la invención, se Identifica un QTL que confiere resistencia a WMV y ZYMV definido por el intervalo limitado por los marcadores NU0218779 y NU0218835 en el mapa (véase la Tabla 4), los que corresponden a 44,6-49 cM en el cromosoma 11 de melón. También se identifica en la presente un QTL que confiere resistencia al CMV y se ubica en el cromosoma 12 en el Intervalo limitado por los marcadores NU0243358 y NU0218323 que abarca el intervalo de 39,7-44,47 cM.

Adicionalmente, se identifica en la presente un segundo QTL que confiere resistencia a CMV que se ubica en el cromosoma 2 en el intervalo limitado por los marcadores NU0220476 y NU0219006 que abarca el intervalo de 80,1-118,5 cM.

Además, también se mapeó el gen zym-1 que especifica la resistencia a ZYMV y se observó que los marcadores CMBR041 (Díaz et ái, BMC Plant Biol. 11:111, 2011), NU0218808, NU0218497, NU0218113, NU0244013, NU0244734, NU0220855, NU0244741, NU0220997, NU0220034, NU0220178, NU0218179, NU0243740 y NU0218531 correspondientes al intervalo de ~3,2-5,7 cM en el mapa genético del cromosoma 2 de melón se encontraban estrechamente ligados a dicho gen.

Mediante el uso de los marcadores correspondientes provistos en la presente y/u otros marcadores que pueden ligarse a ellos, un experto en la téenica podría utilizar marcadores genéticos para la introgresión de rasgos de resistencia a virus y para su combinación (apilamiento) en líneas de melón y variedades híbridas comercialmente relevantes.

Conforme a la invención, es posible llevar a cabo la introgresión de los QTL identificados en contextos genéticos de melón diferentes. Por lo tanto, es posible producir una planta de melón con cualquier genotipo que comprende adicionalmente la resistencia viral deseada, lo que incluye WMV, ZYMV y CMV, mediante los métodos de la invención y a partir de las fuentes genéticas identificadas en la presente o disponibles en la técnica. De manera adicional, dichas plantas pueden ser producidas para comprender otros rasgos deseados, por ejemplo, rasgos de calidad de fruto y agronómicos de élite, según se desee.

Son conocidas en la técnica fuentes de resistencia particular, aunque se carece de la capacidad de combinar dichas fuentes en una forma comercialmente relevante, tal como se describe en la presente. Un ejemplo son las líneas de melón derivadas de la fuente PI 414723 con resistencia a uno o más de ZYMV, CMV o WMV, tal como «Hannah's Choice Fl» (Henning etál., 2005, Hort. Sci 40: 492 - 493). Aunque la fuente provee resistencia viral, la heredabilidad de la resistencia viral suele ser compleja, la posición genética de la resistencia suele desconocerse, el rasgo de resistencia suele asociarse a rasgos perjudiciales y existen problemas con la especificidad patogénica. Por ejemplo, ZYMV se presenta en tres patotipos designados 0, 1 y 2. El rasgo de resistencia a ZYMV del acceso PI 414723 especificado por el gen zym-1 confiere resistencia al patotipo 0, pero no provee resistencia alguna contra el patotipo 2. Asimismo, la infección con patotipo 1 puede resultar en necrosis a gran escala en plantas que presentan el rasgo de resistencia a ZYMV a partir del acceso PI 414723. El locus de resistencia a WMV/ZYMV descrito en la presente provisto en el cromosoma 11 es valioso debido a que provee resistencia a dos virus, resistencia elevada a WMV, bajos títulos virales o ningún título viral luego de la inoculación viral mecánica y una fuente de resistencia a ZYMV no asociada a la necrosis foliar usual del gen zym-1 previamente identificado.

Respecto a su genética subyacente, la resistencia a ZYMV a partir del acceso PI 414723 es poligénica (Danin-Poleg et ál., Euphytica 93:331-337, 1997), lo que significa que son necesarios múltiples locus para conferir la resistencia. Esto obstaculiza los esfuerzos de mejora vegetal, dado que sólo una parte de las plantas de progenie en un programa de reproducción presenta todos los genes necesarios para conferir un nivel adecuado de resistencia o parte de ellos. Además, la resistencia a ZYMV en el acceso PI 414723 está ligada a la andromonoecia (plantas que presentan tanto flores hermafroditas como macho). Dado que es deseable que las líneas de reproducción de melón de élite sean líneas monoicas (plantas con flores macho y hembra separadas) y las líneas parentales no requieren un proceso tedioso y costoso de emasculación manual para evitar la autopollnlzación, se considera que la andromonoecia es una característica no deseable. Además, los frutos de híbridos F1 monoicos carecen del extremo de floración no deseado y de esa forma producen frutos de mejor calidad.

Otro problema asociado a la resistencia al virus originada en PI 414723 es la falta de caracterización adicional de dichos rasgos de resistencia respecto a WMV. Contrario a la observación de Henning et ál. ( supra ) de que PI 414723-4, una línea de PI 414723 seleccionada por su resistencia, es resistente a WMV, otros investigadores no pudieron confirmar la presencia de resistencia a WMV en PI 414723 (por ejemplo, Díaz et ál. 2003, Plant Dis. 87:960-964). Adicionalmente, el rasgo de resistencia a WMV de acceso PI 414723 no confiere resistencia a algunos WMV aislados (Anagnostou etál, 2003, J. Euphytica 116:265-270) y, por lo tanto, no sirven como fuente de resistencia amplia a WMV.

Se ha descrito la resistencia a WMV, tal como el rasgo recesivo en C. meto de acceso TGR-1551 (Díaz-Pendón etál. 2005 Phytopathology 95 :840-846, y Díaz etál., supra). Al igual que la resistencia a WMV que se origina en PI 414723, la resistencia a WMV de TGR-1551 no confiere resistencia a algunos aislados de WMV (véase la Tabla A). Por lo tanto, el acceso TGR-1551 de C. meto es menos deseable como donante del rasgo de resistencia a WMV en programas de reproducción. La incorporación de una fuente previamente conocida de resistencia a CMV también puede resultar problemática para la reproducción de dicha resistencia debido a que se encuentra ligada a un rasgo no deseado que resulta en frutos pentámeros, tal como se describe a continuación. Así, el QTL recientemente descrito de resistencia a CMV también resulta muy beneficioso para la reproducción del melón.

TABLA A Grados de enfermedad relativos (escala 1-10) v los arados de ELISA de ciertas líneas de melón cuando se exponen a patógenos mencionados fes decir, aislados vírales) Mapeo genético de locus que controlan la resistencia a virus En la Tabla 1 se enumeran virus de Interés, fuentes (donantes) de resistencia y poblaciones de mapeo utilizados para identificar los locus que controlan la resistencia a virus. En la Tabla 2 se encuentra un resumen de parámetros genéticos relativos a los rasgos de resistencia a virus identificados. Los parámetros genéticos mencionados en la Tabla 2 incluyen el grupo de ligamiento y la ubicación proyectada en el cromosoma de los locus de resistencia, los efectos aditivos (efecto ad.) y de dominancia (efecto dom.) del alelo favorable en cada locus, el porcentaje de varianza fenotípica (Modelo R 2) justificado por el genotipo en cada locus y los fenotipos promedio de las familias en las poblaciones de mapeo con genotipos homocigotos para el alelo desfavorable (fenot. homocig. desfav.), heterocigotos (fenot. hetocig.) y homocigotos para el alelo favorable (fenot. homocig. fav.). Las escalas de calificación fenotípica utilizadas para cada virus son: 1 a 3 = resistente, 4 a 6 = resistencia intermedia, 7 a 9 = susceptible. Los fenotipos específicos asociados a cada valor numérico de calificación difieren para cada virus con base en manifestaciones específicas de las enfermedades, pero las 3 categorías generales de resistencia, resistencia intermedia y susceptibilidad son coherentes.

TABLA 1 Información de alelos, rasgos v fuentes de resistencia a virus a utilizarse para identificar los locus que controlan la resistencia a virus en melón í Generación hace referencia a la generación de progenie de una población de mapeo dada.

Se mapeó la resistencia a CMV, WMV y ZYMV a partir de la fuente Mbnr992 (Tabla 1), la que se desarrolló mediante la autopolinizaclón de ME8094. Mbnr992 porta resistencia a CMV, WMV y ZYMV. La herencia de la resistencia a CMV y ZYMV de Mbnr992 es recesiva. La herencia de la resistencia a WMV de Mbnr992 es principalmente dominante, aunque los heterocigotos podrían demostrar resistencia intermedia de acuerdo con las condiciones climáticas y el nivel de presión viral. Al utilizar Mbnr992 como donante de resistencia para reproducción, las poblaciones de segregación demostraron una correlación elevada de la resistencia tanto a WMV como a ZYMV. Esto sugirió un ligamiento estrecho de los locus (o de un único locus) que controlan la resistencia a dichos dos virus, lo que fue confirmado mediante ensayos adicionales de mapeo.

Se mapeó la resistencia a CMV a partir de dos fuentes, Mbnr992 y PI161375 (véase la Tabla 1). Se discutió Mbnr992 anteriormente. Se determinaron el fenotipo y el genotipo de una población RIL F6 del cruzamiento Mbnr992 x GA35Pmt para mapear la ubicación genética del rasgo de resistencia. La línea parental GA35Pmt es susceptible a CMV, WMV y ZYMV. PI161375 es resistente a CMV y MNSV (la resistencia a MNSV es conferida por el locus ns . Se determinaron el genotipo y el fenotipo de una población RIL F6 del cruzamiento PI61375 x Vedrantis. La línea progenitora Vedrantais es una línea endogámica tipo Charentais susceptible a CMV y MNSV.

Se identificaron los QTL de resistencia a CMV en poblaciones de Mbnr992 x GA35Pmt y PI161375 x Vedrantais. Ambas poblaciones presentan un QTL en el cromosoma 12. El análisis de alelos que incluyó >1000 plantas F2 de Mbnr992 x Virgos (una derivada resistente a CMV de PI161375 x Vedrantais) confirmó el alelismo de los efectos principales para la resistencia a CMV de las dos fuentes (Mbnr992 y PI161375). El mapeo y el análisis de alelos confirman un QTL común en el cromosoma 12. También se identificó un segundo QTL de resistencia a CMV en el cromosoma 2 en el cruce Mbnr992 (Tabla 2).

TABLA 2 Parámetros genéticos de locus seleccionados que controlan la resistencia a virus en melones La Tabla 3 ¡lustra ejemplos de estrategias de reproducción vegetal consideradas con determinadas modalidades representativas para producir plantas de melón de élite híbridas F1 que comprenden rasgos agronómicos de interés que incluyen la resistencia a múltiples virus (apilados). PM indica una fuente de resistencia a oídio en el melón. Asimismo, WMV, ZYMV y CMV indican los rasgos de resistencia a virus correspondientes. Por ejemplo, CMV12 indica la presencia en una planta progenitora de un rasgo genético que confiere resistencia a CMV y que se ubica en el grupo de ligamiento 12 del melón. También puede contemplarse la inclusión de otros rasgos agronómicos deseables tales como resistencia adicional a enfermedades, color de pulpa anaranjado o verde del fruto, fruto redondeado y Brix mejorado, entre otros, en las plantas híbridas F1 resultantes. Un trabajador con experiencia podría ajustar la estrategia de reproducción vegetal según fuera necesario, por ejemplo, al observar resistencia a la enfermedad y otros rasgos deseados para un mercado o región geográfica de cultivo de melones.

TABLA 3 Ejemplo de estrategia de reproducción de rasaos oue pueden combinarse para producir un melón híbrido F1 resistente a múltiples virus.

Líneas de melón mejoradas con resistencia a múltiples virus Se describe la resistencia a patógenos particulares, tales como CMV, WMV y ZYMV. Para ZYMV y WMV, el acceso resistente PI 414723 fue registrado por Pitrat y Lecoq (1984, Euphytica 33: 57) y Anagnostou etál, 2003 {J. Euphytica 116: 265-270). La resistencia se puede heredar pero se asocia a la andromonoecia, lo cual no es deseable en las líneas de melones utilizadas en la reproducción (Pitrat et ál., PhytopathoL 70:958-961, 1980). Además, PI 414723 exhibió un fenotipo necrótico tras ser infectado con el patotipo 1 de ZYMV. Usualmente se asocia la necrosis con resistencia a la enfermedad, por lo tanto, una infección fuerte con el patotipo 1 podría llevar a la reducción del desarrollo de la planta y pérdida de rendimiento.

A diferencia de los problemas anteriores, la presente invención provee resistencia a ZYMV y no está vinculada a la característica de andromonoeica. Por lo que este hallazgo facilita la producción de una línea monoica homocigota resistente a ZYMV que se puede utilizar como donante en los programas de reproducción para la introgresión de estos rasgos en nuevos cultivares.

A diferencia de PI414723, se halló que la línea del melón ME8094 descrita en la presente es completamente resistente al patotipo 1 de ZYMV y no exhibe necrosis. ME8094 no exhibió síntomas tras la infección ni contenía títulos virales de ZYMV, como lo demostró ELISA.

Además, se descubrió que la resistencia a ZYMV estaba estrechamente ligada a la resistencia a WMV en ME8094. Se desarrolló una población F2 a partir de ME8094 cruzada con una línea endogámica susceptible. La población consistía en 255 individuos que se propagaron en ausencia de selección. Se determinaron los fenotipos de resistencia a ZYMV y WMV en la progenie F3 derivados de esta población. Un subgrupo de 56 familias F3 fue completamente resistente a ZYMV, consistente con un único locus recesivo. Esto es un avance significativo ya que el melón tiene 12 cromosomas y si los rasgos de resistencia residen en distintos cromosomas, muchos descendientes de una cruza no heredarán los alelos de resistencia. La invención, por lo tanto, provee, en una modalidad, plantas con resistencia a ZYMV estrechamente ligada a la resistencia a WMV. Esto hace que sea más fácil mejorar dichos rasgos mediante autofecundación, retrocruzamiento y selección. También es más fácil apilar rasgos de esta manera. Por lo que se pueden utilizar las plantas que comprenden dicha resistencia provistas por la invención, las que incluyen ME8094 y cualquier progenie de esta, como una línea donante universal para la resistencia a ZYMV, WMV y/o CMV. De manera ventajosa, una planta de la presente invención se puede caracterizar por el hecho de que los rasgos ZYMV y WMV están tan estrechamente ligados que la distancia genética entre los dos locus es menor a 6 cM, 5 cM, 4 cM, 3 cM, 2 cM, 1 cM, 0,1 cM o 0,01 cM, o la distancia genética es esencialmente igual a 0 cM.

De manera Inesperada, la resistencia a WMV produjo, conforme a la invención provista, otras ventajas además del vínculo a la resistencia a ZYMV. La resistencia a WMV del acceso PI 414723 (Anagnostou et áí., 2003, J. Euphytica 116:265-270) no confería resistencia a algunas cepas aisladas de WMV y, por lo tanto, no puede servir como fuente abarcadora de resistencia para este rasgo de resistencia. De manera similar, según sugiere el trabajo de Diaz-Pendon etál (2005, Phytopatho/. 95:840-846), TGR1551 todavía puede cargar partículas del virus, aunque no muestre efectos patológicos respecto a WMV y, según el trabajo al que se hace referencia, no parece exhibir un amplio espectro de resistencia. A diferencia de las plantas que comprenden tales rasgos de resistencia al virus de PI414723 y TGR1551, se descubrió que las plantas de melón podrían producirse como ME8094, lo cual daba un espectro de resistencia más amplio y no exhibía síntomas tras la infección ni contenía títulos virales de WMV, como lo demostró ELISA. Además, se demostró que la capacidad de herencia de resistencias a virus para ZYMV, WMV y CMV de la línea ME8094 era ventajosamente elevada. Por lo tanto, el rasgo puede ser ¡ntrogresado en un contexto genético deseado, tal como se describe en la presente. La introgresión de, por ejemplo, marcadores de resistencia al virus ZYMV y WMV de ME8094, acompañados por rasgos agronómicos deseables que incluyen la largo y el ancho de los frutos, el tamaño de la cavidad, la firmeza, Brix, el color de la piel y la pulpa, tal como se describen en el Ejemplo 4 y las Figuras 4A a 4E.

Por lo tanto, la resistencia viral provista en la presente representa un avance significativo en la téenica. Por ejemplo, la resistencia a ZYMV no está vinculada al rasgo andromonoico desfavorable. Asimismo, se demostró la resistencia contra todas las cepas aisladas conocidas de ZYMV. De manera adicional, la resistencia a ZYMV está vinculada a la resistencia a WMV. Esto resulta en mayor velocidad y reducción del costo en el desarrollo de plantas que cargan con ambas especificidades de resistencia. En cuarto lugar, se confirió la resistencia y no se detectó la presencia del virus.

Los inventores de la presente han provisto plantas de melón en las que se han combinado con éxito las fuentes de resistencia a ZYMV y WMV, al igual que a CMV. Un ejemplo es la línea endogámica ME8094, la cual se ha demostrado que presenta fuerte resistencia a CMV (demostrado mediante DAS-ELISA por la cepa aislada V6 de a-CMV, por ejemplo, ver la Figura 3 y Tabla A), lo que resulta en una media del índice de enfermedad que es incluso menor al índice de la línea "resistente" 71GR 1551. Con respecto a la resistencia a ZYMV, se ha demostrado que ME8094 no se ve afectada por la infección con el patotipo 1 de ZYMV (por ejemplo, ver Figuras 2 a 3 y Tabla A), a diferencia de todas las demás variedades evaluadas. En una prueba de campo con poblaciones de virus de campo de ZYMV, WMV y CMV, no se hallaron plantas susceptibles en el acceso ME8094. No se conoce ninguna otra variedad que presente una resistencia a todos estos virus.

La resistencia identificada exhibió un modo diferente de herencia para cada especificidad de resistencia. La resistencia a ZYMV se localizó en un locus recesivo y la resistencia a WMV se localizó en un locus dominante. La resistencia a CMV se localizó en dos locus aditivos. Los rasgos adicionales de resistencia a la enfermedad pueden hibridarse en una planta que comprenda tal resistencia, lo que incluye las líneas de progenie de ME8094, en particular dada la alta capacidad de heredar la resistencia al virus. Esto incluye resistencia a CYSDV (virus del amarilleo de las cucurbitáceas, por ejemplo, EP 1800535, EP 1962578), CVYV (virus del amarilleo de las venas de las cucurbitáceas, por ejemplo, WO 2010/025747), PRSV (virus de la mancha anular de la papaya, por ejemplo, Brotman etál., TAG \ 10:337-345, 2005), MNSV (virus de la mancha necrótica del melón, por ejemplo, WO 2003/066900), y/o oídlo, entre otros.

Un análisis QTL con respecto a los locus de resistencia viral halló que las resistencias a WMV y a ZYMV se localizaban en el mismo grupo de ligamiento, mientras que la resistencia a CMV se difundía en 2 locus, en distintos grupos de ligamiento. Por lo tanto, los rasgos podían ser localizados en varios locus de rasgos cuantitativos específicos (QTL). Además, se estableció que la resistencia a ZYMV no está ligada a la andromonoecia, lo que permitía la posibilidad de obtener plantas monoicas resistentes, mientras que el rasgo de CMV de resistencia a QTL12 no se encontraba estrechamente ligado al rasgo no deseado del fruto pentámero.

Estos datos experimentales demostraron que los rasgos de resistencia a ZYMV y WMV, y CMV, pueden transferirse a otras variedades de melón mediante el acceso ME8094 de melón como donante de una región o regiones genéticas específicas, independientes de la andromonoecia. Por lo tanto, en determinadas modalidades, la presente invención provee una planta de melón de la línea ME8094 y semillas de esta y una progenie de ME8094 y semillas de esta, que comprende dicha resistencia a ZYMV y WMV, tal como se encuentra en ME8094, así como marcadores asociados y métodos para tal reproducción asistida con marcadores.

El experto entenderá que los rasgos heredados en forma individual sólo se observan en toda la población tras producir una población segregada (por ejemplo, F2) y que, normalmente, la mejora de rasgos requiere retrocruzamiento y autofecundación.

Los Inventores de la presente, basados en los hallazgos precedentes, fueron capaces de desarrollar plantas de melón que comprenden los locus de resistencia mencionados, en las que dichos locus no se hallan en su contexto genético natural.

Producción de variedades de melón multirresistente Los inventores de la presente han identificado determinados rasgos de resistencia a la enfermedad de la planta localizados, por ejemplo, de la siguiente manera: 1. un locus para la resistencia a CMV en el grupo de ligamiento 12. 2. un locus para la resistencia a CMV en el grupo de ligamiento 2. 3. un locus para la resistencia a WMV en el grupo de ligamiento 11. 4. un locus para la resistencia a ZYMV en el grupo de ligamiento 11.

En una modalidad de un método para producir una variedad de melón resistente a múltiples virus, se puede proveer una primera línea de melón endogámica con los alelos de CMV (y opcionalmente PM) y una segunda línea de melón endogámica con los alelos de WMV y ZYMV. El cruzamiento de las dos líneas resulta en un híbrido y la expresión de los alelos recesivos se puede lograr mediante la autofecundación, lo que también resulta en una fijación exitosa de la combinación de los rasgos de resistencia. Otros rasgos de resistencia a la enfermedad, por ejemplo, el conferir resistencia a uno o más virus, como CYSDV, también pueden hibridarse en una línea resistente a ZYMV, WMV y CMV.

En modalidades adicionales, los rasgos agronómicos deseados en cuanto al color de la pulpa del fruto, el nivel Brix y la relación de largo respecto al ancho, entre otros, también pueden incorporarse en líneas de progenie derivadas de una planta provista en la presente y/o mediante los métodos descritos en la presente.

Los números definitivos de cromosomas todavía no han sido asignados a los cromosomas del melón en los que se localizan varios de los locus que confieren la resistencia. Sin embargo, se pueden designar los cromosomas mediante referencias a los grupos de ligamiento (por ejemplo, GL 12, 2 y 11) en los que se localizan estas y otras regiones genómicas.

La expresión grupo de ligamiento se utiliza en la presente para hacer referencia a una unidad genómica calculada, basada en el mapeo genético por recombinación, en la que se localizan los alelos de resistencia y la que tiene el mismo nivel jerárquico que un cromosoma. Se halló que estos grupos de ligamiento contenían algunos rasgos que han sido estudiados en el dominio público. Se halló que el GL 12, el que alberga el locus principal para la resistencia de CMV, está ligado a los rasgos PM y de fruto pentámero. Por último, se halló que GL 11, el que alberga los locus tanto para la resistencia de WMV como de ZYMV, está ligado al rasgo Fom-2 y no al andromonoico. Se puede utilizar el rasgo Fom-2 como marcador y, por lo tanto, también se puede utilizar para asistir en la selección de plantas que comprenden la introgresión de interés.

Además de las plantas, la invención provee, de manera adicional, semillas de las plantas de la Invención. Estas semillas se caracterizan por desarrollarse en plantas de la invención. Se pueden obtener dichas semillas tras la autofecundación, el cruzamiento o el retrocruzamiento de la planta de la invención. La invención provee además plantas, o partes de plantas, que se originan de tales semillas. La invención provee además frutos, o partes de frutos, que se originan de la planta originada de tales semillas.

La invención provee además un método para transferir los locus genéticos asociados a la resistencia hacia melones novedosos sin conferir rasgos perjudiciales tales como andromonoecia.

La presente invención provee además un método para producir plantas de una línea de melón resistente a ZY V, WMV y/o CMV. En una modalidad el método comprende las siguientes etapas: a) cruzamiento de una planta de una línea de reproducción de melón receptor, que no presenta la resistencia deseada, con una planta de una línea de reproducción de melón donante que sí presenta la resistencia deseada, b) recolección de semillas que resultan del cruzamiento de la etapa (a), c) regeneración de las semillas en plantas, d) provisión de una o más generaciones de retrocruzamiento mediante el cruzamiento de plantas de la etapa (c) o sus descendientes (opcionalmente autofecundados) con una o más plantas de dicha línea de reproducción de melón receptor para proveer plantas retrocruzadas, e) autofecundación de plantas de la etapa (d) y cultivo de la semilla autofecundada en plantas, f) repetición opcional de dichas etapas de retrocruzamiento y autofecundación de las etapas (d) y/o (e), g) identificación y selección de las plantas cultivadas en plantas de la etapa (e) o (f) que exhiben la resistencia deseada.

En una modalidad, la identificación y selección de plantas en la etapa (g) se lleva a cabo conforme a los métodos enumerados más adelante.

Determinación de resistencia Se pueden detectar las plantas resistentes mediante un análisis que determina la presencia del virus en el material vegetal. Los virus pueden ser detectados por ELISA, mediante métodos estándar con anticuerpos disponibles en el comercio para tratar los distintos virus y moho, como los que se pueden obtener de Plant Research International (PRI, Wageningen, Países Bajos), Agdia Inc. (Elkhart, IN, EUA), Neogen Europe Ltd. (Auchincruive, Ayr, Escocia), Monogram Biosdences Inc. (antes conocido como ViroLogic Inc., South San Francisco, CA, EUA). Es adecuado, en general, un protocolo del método sándwich de doble anticuerpo ELISA (DAS-ELISA). De manera alternativa, se pueden realizar bioensayos para las distintas enfermedades.

La susceptibilidad o la resistencia a CMV se pueden detectar, por ejemplo, mediante la germinación de semillas de melón y el cultivo de sus plántulas conforme a las condiciones estándar en un invernadero sobre una mesa de trabajo. Los controles susceptibles pueden incluir, por ejemplo, Vedrantais y PMR5, mientras que en los controles resistentes se pueden utilizar pepino de Freeman, ME8094 y Virgos. Generalmente se pueden incluir plantas inoculadas en forma simulada. Normalmente se mantiene una temperatura de 20 °C durante el día y a una temperatura de 18 °C durante la noche. Durante períodos con baja intensidad luminosa, las plántulas pueden cultivarse bajo luz artificial durante 16:8 horas, día y noche, respectivamente. Es importante mantener la temperatura correcta para que el ensayo tenga éxito. Deben evitarse temperaturas particularmente altas y, durante la inoculación y durante el ensayo la temperatura generalmente se mantiene por debajo de los 20 °C. Como inoculo se puede utilizar plantas PMR5 o Vedrantais susceptibles con virus grave del mosaico en las hojas. Generalmente, la preparación del inoculo se realiza en hielo para conservar la virulencia del virus. Las hojas infectadas son aplastadas en la forma adecuada con agua de la canilla o con una solución amortiguadora adecuada con un mortero y mano (generalmente enfriado) y ½ cucharada de té con polvo de carborundo por 10 mi de suspensión vegetal. Las plantas son inoculadas en la forma adecuada 2 o 3 días después de trasplantar las plántulas, cuando se observa la primera hoja verdadera con extensión plena de los cotiledones. Se puede realizar una reinoculación entre 8 y 10 días después de la primera inoculación. La inoculación puede implicar el frotamiento de la mezcla de inoculación tanto en los cotiledones como en la primera hoja de la planta con un trozo de esponja o con el pulgar y dedo índice. Los resultados se pueden calificar 8 días después de la inoculación (DPI), cuando las plantas exhiben síntomas adecuados, opcionalmente 12 DPI, de ser deseado, y por último, 14 DPI. Los primeros síntomas de susceptibilidad a CMV son lesiones que pueden verse en los cotiledones. Además, entre 6 y 10 días DPI, las hojas superiores exhiben mosaico claro y/o clorosis y el crecimiento de las plantas infectadas se verá reducido. Puede ser deseado que al menos 90 % de las plantas de control susceptibles sean infectadas para las calificaciones de susceptibilidad. Puede ser benéfico que al menos 90 % de las plantas de control resistentes no exhiban síntomas. Se pueden calificar múltiples plantas individualmente, en múltiples repeticiones y múltiples entornos (regiones geográficas), para determinar el fenotipo de la línea dada.

Se puede detectar WMV mediante la germinación de semillas de melón y el cultivo de sus plántulas conforme a las condiciones estándar en un invernadero sobre una mesa de trabajo. Los controles susceptibles pueden incluir, por ejemplo, Vedrantais y PMR5, mientras que en los controles resistentes se pueden utilizar TGR 1551, ME8094 y PI124112. Generalmente, las plántulas se cultivan a 22 °C/20 °C día/noche. Las condiciones del ensayo incluyen una temperatura de 25 °C durante el día y la noche. Durante períodos con baja Intensidad luminosa, las plántulas generalmente se encuentran bajo luz artificial 16:8 horas, día y noche, respectivamente. Para la inoculación se pueden utilizar plantas susceptibles con virus grave dei mosaico en las hojas. Generalmente, la preparación del inoculo se realiza en hielo para conservar la virulencia del virus. Las hojas infectadas son aplastadas en la forma adecuada con agua de la canilla o con una solución amortiguadora adecuada con un mortero y mano (generalmente enfriado) y Vi cucharada de té con polvo de carborundo por 10 mi de suspensión vegetal. Las plantas son inoculadas en la forma adecuada 2 o 3 días después de trasplantar las plántulas, cuando se observa la primera hoja verdadera con extensión plena de los cotiledones. Se puede realizar una reinoculación entre 8 y 10 días después de la primera inoculación. La inoculación puede implicar el frotamiento de la mezcla de inoculación tanto en los cotiledones como en la primera hoja de la planta con un trozo de esponja o con el pulgar y dedo índice. Los resultados se pueden calificar 7 a 10 DPI, cuando las plantas exhiben síntomas adecuados. Se puede realizar una segunda observación 3 días después del primer control, y una tercera observación 14 DPI. Los síntomas incluyen un mosaico verde grave en las hojas.

ZYMV, por ejemplo, se puede detectar mediante la germinación de semillas de melón y el cultivo de sus plántulas conforme a las condiciones estándar en un invernadero sobre una mesa de trabajo. Los controles de susceptibilidad pueden incluir, por ejemplo, Vedrantais y PMR5, mientras que se pueden utilizar PI414723, ME8094 y PI175109 como controles de resistencia. Generalmente, las plántulas se cultivan a 22 °C/20 °C día/noche. Las condiciones del ensayo incluyen una temperatura de 25 °C durante el día y la noche. Durante períodos con baja intensidad luminosa, las plántulas generalmente se encuentran bajo luz artificial 16:8 horas, día y noche, respectivamente. Para la inoculación se pueden utilizar plantas susceptibles con virus grave del mosaico en las hojas. Las hojas infectadas son aplastadas con agua de la canilla o con una solución amortiguadora estándar con un mortero y mano enfriados. Las plantas pueden desempolvarse con una capa de carborundo o se puede agregar ½ cucharada de té con polvo de carborundo por cada 10 mi de suspensión del inoculo. Generalmente, la preparación del inoculo tiene lugar en hielo para conservar la virulencia del virus. La etapa de la planta de primera inoculación en forma adecuada es 2 o 3 días luego de trasplantar las plántulas, cuando puede observarse la primera hoja verdadera y los cotiledones han crecido plenamente. La etapa de la planta de reinoculación en forma adecuada es 7 a 10 días después y la primera hoja verdadera puede ser inoculada. En cuanto a ella, la mezcla de inoculación se puede frotar tanto en los cotiledones como en la primera hoja de la planta con una esponja. La primera observación es 7 DPI, cuando las plantas exhiben síntomas adecuados, y la segunda observación es 12 DPI, en caso de ser deseado. La tercera observación es 14 DPI. Los primeros síntomas de ZYMV entre 6 y 10 días DPI, la parte superior de las hojas muestra un mosaico amarillo claro, manchas verde oscuro o incluso necrosis de la hoja y se ve reducido el crecimiento de las plantas infectadas. Al menos 90 6% de las plantas de control susceptible deberían estar infectadas. Al menos 90% de las plantas de control resistente no deberían exhibir síntomas.

Producción de plantas de melón resistentes Una primera etapa en la producción de melones resistentes a virus comprende usualmente el cruzamiento de una planta de una línea de melón, en la que el rasgo de resistencia al virus se encuentra presente en la progenltora 1 (Pi) o una planta descendiente de ella que cuenta con todas las características de resistencia a la enfermedad, y el uso de una planta de una línea de reproducción de melón a la que se han de ¡ntrogresar los rasgos de resistencia como progenitora 2 (P2). En general, una línea endogámlca PL es la progenltora donante y P2 es la progenitora receptora. Dicho cruzamiento resultará en una población de descendientes o progenie F: que contiene dos grupos de cromosomas homólogos obtenidos de ambos progenitores. La primera etapa resultará en una población híbrida Fi.

No es necesario realizar un análisis genotípico o fenotípico de la progenie del primer cruzamiento en el que se cruzan las endogámlcas, ya que todas las plantas de la población Fi tienen el mismo genotipo. La población vegetal resultante (que representa los híbridos Fi) puede autofecundarse para producir semillas F2, pero puede retrocruzarse para producir una población BCi con una planta de la línea progenltora P2 como progenitor recurrente. Luego, las semillas B o las semillas F2 o las plantas que crecen a partir de ellas pueden ser analizadas para determinar el rasgo de resistencia mediante la realización de bioensayos de resistencia, tal como se describen en la presente. En tal segregación de BCi o F2, este análisis fenotípico puede asistir en la selección de aquellas plantas que sean las más indicadas para su uso en otras reproducciones. Con el fin de evitar la necesidad de esperar por los resultados de un análisis fenotípico de BCi o F2, puede establecerse y analizarse la presencia de un QTL asociado a la resistencia de interés con un marcador ligado a este para seguir el rasgo mediante los métodos de reproducción asistida con marcador (MAB) o selección asistida con marcador (MAS). Tal análisis genotípico para determinar la presencia del rasgo de resistencia puede agilizar en gran medida el proceso de reproducción. De ser deseado, las semillas BCi o F2 u otra semilla de progenie obtenidas mediante los métodos de la invención, o las plantas que crecieron a partir de ellas, pueden ser analizadas para determinar la presencia del rasgo mediante métodos genotípicos y fenotíplcos, tal como se describió en la presente.

La transferencia de los locus genéticos para la resistencia se puede lograr mediante cruzamiento. Durante el cruzamiento de plantas, se observarán en general muchas ¡ntrogresiones. De manera alternativa, la transferencia se puede lograr mediante la modificación genética. Ambos métodos resultan en una planta recombinante en la que se intercambia ei ADN presente originalmente en una ubicación específica en el cromosoma por ADN de otra planta (es decir materno por paterno o viceversa).

Para obtener los locus genéticos en un contexto deseado, se puede introgresar el segmento en el grupo o los grupos de ligamiento específicos asociados a la resistencia dentro del genoma de una planta de una línea de reproducción de melón, mediante una o más etapas de cruzamiento y retrocruzamiento, tal como se describió anteriormente, y la selección a partir de la progenie de aquellas plantas que exhiben características agronómicamente deseables, tales como, de modo no taxativo, resistencia a insectos, características valiosas de frutos que incluyen el nivel Brix, el color de la pulpa, la forma del fruto, el rendimiento, etc., en combinación con los rasgos de resistencia de ZYMV, WMV y CMV, y, por ejemplo, opcionalmente, resistencia de PM. Esto resultará en una situación en la que el alelo de resistencia ya no se encuentra en su contexto genético natural sino introgresado en el contexto genético de la línea de melón de interés.

En otro aspecto de la invención, se produce una línea de élite mediante etapas consecutivas de retrocruzamiento hasta el progenitor recurrente para que la línea sea una élite cada vez más pura y endogámica (línea endogámica). De manera alternativa, o en combinación, se aplica la téenica de dobles haploides. Por lo tanto, la presente invención también provee métodos para producir líneas de élite que presentan resistencia a ZYMV, WMV y/o CMV. Las líneas de élite se pueden producir mediante métodos de ia invención para que comprendan una o más ¡ntrogresiones que confieran la resistencia al virus deseada. Un ejemplo de introgresión supone la introgresión de un QTL hallado en el acceso ME8094 de melón.

De manera opcional, las plantas de melón descritas anteriormente se pueden autofecundar para proveer líneas endogámicas esencialmente homocigotas para los alelos que confieren la resistencia. De manera alternativa, o en combinación, se aplica la técnica de dobles haploides.

Además, se pueden utilizar las plantas de melón opcionalmente endogámicas o doble haploides obtenidas mediante los métodos de retrocruzamiento descritos anteriormente y de autofecundación opcional y/o producción de DH, para producir híbridos mediante el cruzamiento con plantas de otras líneas de melón, opcionalmente endogámicas, u otras líneas de melón de élite. Por lo tanto, la invención también provee un método para producir híbridos mediante el cruzamiento de una planta de melón obtenida mediante un método de la invención con una planta de una línea de melón endogámica o de élite. Estos híbridos pueden ser homocigotos o heterocigotos para los alelos que confieren la resistencia a ZYMV, WMV y/o CMV. El híbrido puede ser homocigoto para los alelos que confieren resistencia a ZYMV, WMV y/o CMV ya que entonces la expresión del fenotipo es óptima. Sin embargo, en el caso de rasgos de resistencia dominantes, no se requiere la homocigosidad para el alelo.

La invención también hace referencia a las plantas, o partes de las plantas, obtenidas mediante un método de la invención. La parte o partes de las plantas contempladas se pueden seleccionar del grupo que consiste en: un fruto, una hoja, una raíz, un tallo, polen, un óvulo, una célula y una semilla.

Estas plantas de la invención se caracterizan por que exhiben resistencia a ZYMV y WMV, pueden además comprender resistencia a CMV, y pueden comprender al menos otro rasgo agronómico seleccionado de: color de pulpa deseado (por ejemplo naranja, verde o blanco), > 9,5 °Bx, una relación de largo (es decir, distancia del pedúnculo al extremo florecido del fruto, proximal a distal) a ancho de menos de alrededor de dos a uno (es decir, relación ancho respecto a largo de > 0,5), tal como una relación de largo respecto a ancho de alrededor de uno a uno, y resistencia a oídio in(PM) causada por Podosphaera xanthü Estas plantas pueden ser seleccionadas de la progenie Ft o F2, o de las etapas de retrocruzamiento y/o autofecundación de la progenie Fi o F¾ o de cualquier etapa posterior de autofecundación o retrocruzamiento. La invención también comprende las semillas de las plantas mencionadas anteriormente. Además, la invención comprende los frutos, o parte de los frutos, de las plantas mencionadas anteriormente.

Además, la invención hace referencia a las líneas de melón y las líneas de melón endogámicas obtenidas mediante el método de la invención a través de múltiples etapas típicas de la reproducción vegetal, que incluyen, de modo no taxativo, un cruzamiento inicial de dos plantas de melón, al menos una de las cuales contiene alelos favorables a las resistencias a virus que se describieron en la presente, selección recurrente y autopolinización de plantas en generaciones secuenciales (por ejemplo, Fl, F2, F3, ..., Fn) tras el cruzamiento o retrocruzamiento de Fl, F2, retrocruzamiento de la progenie 1 ("BC1"), BC2, BC3, BC4,...BCn con el progenitor recurrente y autofecundación opcional para producir líneas homocigotas. De manera alternativa, o en combinación, se puede aplicar la téenica de dobles haploides.

Además, la invención hace referencia a los híbridos obtenidos mediante el cruzamiento de las líneas de melón endogámicas de la invención con diferentes líneas de melón endogámicas o líneas de élite. La invención también comprende las semillas de dichos híbridos.

El establecimiento de la introgresión adecuada en plantas descendientes de la invención se puede controlar en varias etapas (del método mencionado anteriormente) mediante el análisis del genoma de las plantas para determinar la presencia de los alelos de resistencia definidos en la presente. Se puede analizar la población en una cantidad de maneras distintas. Por ejemplo, se puede analizar la población mediante un ensayo de resistencia, tal como se describió anteriormente.

Tales ensayos son conocidos en la téenica. De manera alternativa, se puede utilizar la selección asistida con marcador.

En modalidades de métodos para detectar la presencia de un marcador en una planta de melón, el método también puede comprender las etapas de proveer un ollgonucleótido o pollnucleótido capaz de hibridar en condiciones de hibridación estrictas a una secuencia de ácido nucleico asociada a dicho alelo o de un marcador ligado a dicho alelo, poner dicho ollgonucleótido o polinucleótldo en contacto con ácido nucleico genómlco opcionalmente digerido de una planta de melón, y determinar la presencia de hibridación específica de dicho ollgonucleótido o polinucleótido a dicho ácido nucleico genómico. El método también puede comprender el análisis de RFLP y/o secuenciación del ADN.

El método se puede llevar a cabo en una muestra de ácido nucleico obtenida de dicha planta de melón, aunque también se pueden emplear métodos de hibridación in sltu. De manera alternativa, y en una modalidad adicional, una vez que se haya determinado la secuencia de nucleótldos del alelo, el experto en la técnica puede diseñar sondas de hibridación específicas u oligonucleótidos capaces de hibridar en condiciones de hibridación estrictas a la secuencia de ácido nucleico de dicho alelo y puede utilizar tales sondas de hibridación en métodos para detectar la presencia de un alelo de la invención en una planta de melón.

La presente invención también hace referencia a una semilla de melón denominada ME8094, una muestra de dicha semilla ha sido depositada en NCIMB, Aberdeen, Escocia con la referencia de depositante ME8094 y el número NCIMB de acceso 41653, y a una planta de melón, o partes de ella, producida mediante el cultivo de dicha semilla, y al polen y los óvulos de la planta que creció de ella. La invención hace referencia a una planta de melón, o partes de ella, que presenta todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta de melón que creció a partir de la semilla depositada, a un cultivo tisular, tal como un cultivo de células de protoplastos de un tejido seleccionado del grupo que consiste en hojas, polen, embriones, raíces, puntas de la raíz, anteras, flores, frutos y semillas de células que pueden regenerarse, de una planta de melón de la línea ME8094, en la que el tejido regenera plantas capaces de expresar todas las características morfológicas y fisiológicas de la línea ME8094. Además, la invención hace referencia a una planta de melón regenerada a partir de dicho cultivo tisular, capaz de expresar todas las características morfológicas y fisiológicas de la línea ME8094.

La presente invención también hace referencia a un método para producir una semilla de melón híbrida que comprende cruzar una primera planta de melón progenitora endogámica con una segunda planta de melón progenitora endogámica, o con otra planta de melón distinta, y cosechar la semilla de melón híbrida resultante, cuando dicha primera o segunda planta de melón progenitora es la planta de melón que creció a partir de la semilla depositada. La presente invención también hace referencia a una semilla de melón híbrida producida mediante este método, a una planta de melón híbrida, o partes de ella, producida posteriormente al cultivar la semilla de melón híbrida tal como fue producida con el método, así como también semillas de melón producidas posteriormente al cultivar dicha planta de melón híbrida, y a la planta de melón, o partes de ella, producida posteriormente a partir de dicha semilla.

La presente invención también hace referencia a un método para producir una planta de melón derivada de ME8094 que comprende: a) cruzar una planta de la línea ME8094, una muestra de dicha semilla depositada en NCIMB, Aberdeen, Escocia con el número de acceso NCIMB 41653 y referencia de depositante ME8094, con una segunda planta de melón para proporcionar la progenie de semilla de melón, b) cultivar dicha progenie de semilla de melón, en condiciones de crecimiento vegetal, para proporcionar dicha planta de melón derivada de ME8094. Este método puede opcional y adicionalmente comprender la etapa de: c) cruzar dicha planta de melón derivada de ME8094 con sí misma u otra planta de melón para proporcionar una progenie de semilla de melón adicional derivada de ME8094, d) cultivar dicha progenie de semilla de melón de la etapa (c) en condiciones de crecimiento vegetal, para proporcionar plantas de melón adicionales derivadas de ME8094, e) repetir las etapas de cruzamiento y cultivo de (c) y (d) de 0 a 7 veces para generar más plantas de melón derivadas de ME8094.

La invención también hace referencia a una planta de melón, o partes de ella, como se describieron en la presente, en la que la planta o partes de ella han sido transformadas de manera que su material genético contenga uno o más transgenes ligados de forma operativa a uno o más elementos reguladores.

Definiciones El término "melón", tal como se emplea en la presente, hace referencia a plantas de la familia de cucúrbitas que presentan frutos grandes y generalmente redondos que tienen un interior pulposo y muchas semillas, las cuales se encuentran embebidas en la pulpa o rellenan el centro del fruto, que pertenecen a diferentes especies en la familia de Cucurbitaceae tales como Cucumis meb L. (melón), Cucumis satdíivus (pepino) y Citruiius /anatus (sandía). Cuando se hace una referencia a "melón", tal como se utiliza en la presente, también se contemplan las plantas de estas especies de melón. El término incluye la referencia a Cucumis meto L.

Cucumis meto L. (C. meto) incluye ambos accesos silvestres así como también una gran cantidad de cultivares y, generalmente, se subdivide en las subespecies agrestis y meto. Luego, este último se subdivide una vez más en las variedades botánicas canta/upensis, chito, conomon, fíexuosus, inodorus, momordica, reticuiatus y texanus. Se cree que el acceso ME8094 de melón representa un cucumis meló.

El término "planta Cucumis meló', tal como se utiliza en la presente, hace referencia a una planta de cualquier variedad de melón, tal como se definió anteriormente. En determinadas modalidades, la expresión hace referencia a plantas de melón de las variedades Cucumis meló var. cantalupensis, Cucumis meto var. conomon, Cucumis meló var. retlculatus y Cucumis meto var. ¡nodorus, tales como, por ejemplo, los cultivares o tipos comerciales "Amarillo Oro", "Sharlyn", "Cantalupo", "Casaba", "Crenshaw", "Earl" (melón japonés), "Galia", "honey ball', "melón verde", "Jenny Lind", "Ogen", "Piel de sapo", "Rocky Ford" de pulpa verde, "melones de navidad", "Tendral", Easter Shippery Western Shipper y "melón de invierno".

El término "familia" se refiere a un nivel taxonómico por debajo del orden (es decir, la familia Cucurbitaceae).

El término "firmeza" se refiere a la fuerza (kgf) que se necesita para penetrar la piel con un penetrómetro digital manual.

El término "género" se refiere a un nivel taxonómico por debajo de la familia (es decir, el género Cucumis o Cltrullus).

El término "especie" se refiere a un nivel taxonómico por debajo del género (por ejemplo, Cucumis meto (melón) o Citrullus lanatus (sandía)).

El término "subespecie" se refiere a un nivel taxonómico por debajo de la especie (por ejemplo, Cucumis meto subesp. meto, o Cltrullus lanatus subesp. vulgaris (sandía)).

El término "variedad" se refiere a varietas y su abreviación "var." y hace referencia a una variedad botánica (un nivel taxonómico por debajo de la especie o subespecie). Como se usa en la presente, el término "variedad" no equivale específicamente al término "variedad" según se define en el convenio de la UPOV (la variedad UPOV equivale en el presente a un "acceso"). Dentro de la especie Cucumis meto, el término "grupo" suele usarse para referirse a las diferentes variedades, y en este contexto estos términos son equivalentes e intercambiables. Las siguientes variedades se reconocen generalmente dentro de C meto. El grupo chito (melón mango); el grupo conomon {Cucumis meto var. conomon),· el grupo fíexuosus (pepino armenio), el grupo inodorus {Cucumis meto var. inodorus; melón casaba o verde); el grupo reticulatus {Cucumis meto var. reticu/atus; sinónimos: melón escrito, melón rugoso, cantalupo americano, cantalupo falso); y el grupo cantalupensis {Cucumis meto var. cantalupensis; sinónimos: cantalupo verdadero o cantalupo europeo).

El término "acceso" describe (una planta que representa) la categoría menor taxonómica y, por lo tanto, equivale al término "variedad" según se define en el convenio de la UPOV y conforme a la norma 26(4) del convenio sobre la patente europea. El término "cultivar" describe un acceso cultivado y se utiliza en la presente para describir a una planta que presenta un estado biológico diferente del estado "salvaje", donde estado silvestre se refiere al estado original no cultivado o natural de una planta o acceso. El término "cultivar" Incluye, de forma no taxativa, cultivares tradicionales, seminaturales, semisalvajes, con malezas, autóctonos, material para cruzamientos, material de investigación, líneas de reproductor, poblaciones sintéticas, híbridos, poblaciones de plantel fundador/base, líneas endogámicas (progenitores de cultivares híbridos), poblaciones segregantes, plantel mutante/genétlco, cultivares de clase de mercado y avanzados/mejorados. Los ejemplos de cultivares incluyen accesos cultivados tales como Charentais, Cantalupo italiano (del grupo cantalupensis; galia, ananás (del grupo reticulatus); amarillo, branco, crenshaw, casaba negro, piel de sapo, rochet, tendrá! (del grupo conomon) y el melón de invierno (del grupo inodorus).

El término "Brix" ("°Bx") se usa en la presente para cuantificar la relación entre la masa de sólidos disueltos, como la sacarosa respecto al agua en un líquido. Más específicamente, una medida del nivel Brix de un fruto de melón puede realizarse conforme a métodos conocidos en la téenica, por ejemplo, el uso de un medidor de sacarosa o un refractómetro. Por ejemplo, una medida de 10 °Bx corresponde a 10 gramos de sólidos disueltos, incluyendo sacarosa, por cada 100 gramos de líquido.

El término "donante" se utiliza para indicar la fuente de material hereditario que otorga resistencia según se define en la presente. Por ejemplo, los rasgos de resistencia a los ZYMV, WMV y CMV que se discuten en la presente solicitud se originan a partir de una planta de melón donante designada ME8094 (acceso NCIMB 41653) o progenie de ella.

El término "cruzamiento", como se utiliza en la presente, hace referencia a la fertilización de plantas (o gametos) hembra por parte de plantas (o gametos) macho. El término "gameto" se refiere a la célula reproductiva (óvulo o esperma) que se produce en plantas mediante la meiosis a partir de un gametofito y que participa en la reproducción sexual, durante la cual dos gametos de sexos opuestos se unen para formar un cigoto. El término generalmente incluye un polen (incluso el esperma) y un óvulo. Por lo tanto, "cruzamiento" en general se refiere a la fertilización de los óvulos de un individuo con polen de otro individuo, mientras que "autofecundación" se refiere a la fertilización de los óvulos de un individuo con polen del mismo individuo. El cruzamiento se suele usar en el cultivo de plantas y resulta en una mezcla de información genómica entre las dos plantas que equivale a recibir cromosomas homólogos de tanto la madre como el padre. Esto resultará en una nueva variedad. La autofecundación de una planta homocigota resultará en una planta genéticamente similar ya que no se introducen nuevas variaciones genéticas.

Cuando se menciona el cruzamiento en el contexto de lograr la introgresión de una región o segmento genómico, los expertos entenderán que para lograr la introgresión de solo parte del un cromosoma de una planta en el cromosoma de otra planta, es necesario que partes arbitrarias de los genomas de ambas líneas progenitoras se recombinen durante el cruzamiento debido a la ocurrencia de instancias de entrecruzamiento en la producción de gametos en las líneas progenitoras. Por lo tanto, los genomas de ambos progenitores deberán combinarse en una única célula mediante un cruzamiento que, luego de la producción de gametos a partir de dicha célula y la fusión de estos en la fertilización, darán como resultado un evento de introgresión.

Como se utilizan en la presente, los términos "introgresión" e "introgresado" se refieren a procesos tanto naturales como artificiales mediante los cuales se mueven genes individuales, segmentos de cromosomas o cromosomas enteros de un individuo, especie, variedad o cultivar al genoma de otro individuo, especie, variedad o cultivar mediante el cruzamiento de dichos individuos, especies, variedades o cultivares. En el cultivo de plantas, el proceso suele implicar la autofecundación o el retrocruzamiento al progenitor recurrente para proporcionar una planta más homocigota que posea, esencialmente, las características del progenitor recurrente además del gen o rasgo introgresado.

El término "introgresión" se refiere al resultado de un evento de introgresión.

El término "retrocruzamiento" se refiere al proceso por el que la planta que resulta de una cruza entre dos líneas progenitoras se cruza, en repetidas ocasiones, con una de sus líneas progenitoras, donde la línea progenitora que se usa en el retrocruzamiento se denomina progenitor recurrente. La repetición del retrocruzamiento resulta en el reemplazo de fragmentos de genomas del progenitor donante con los del recurrente. Se pueden utilizar métodos de retrocruzamiento con la presente invención para mejorar o introducir una característica en la planta endogámica. La planta de melón parental que proporciona el gen con la característica deseada se denomina progenitor no recurrente o donante. Esta terminología se refiere ai hecho de que el progenitor no recurrente se usa una sola vez en el protocolo de retrocruzamiento y por lo tanto no es recurrente. La planta progenitora a la que se transfieren el o los genes del progenitor no recurrente se denomina progenitor recurrente, ya que se usa para varias rondas del protocolo de retrocruzamiento. En un protocolo de retrocruzamiento típico, la planta endogámica original de interés (el progenitor recurrente) se cruza con una segunda planta endogámica (el progenitor no recurrente) que posee el gen individual de interés que será transferido. La progenie resultante de esta cruza se cruza luego una vez más con el progenitor recurrente y este proceso se repite hasta obtenerse una planta donde básicamente todas las características morfológicas y fisiológicas deseadas del progenitor recurrente se recuperan en la planta convertida, junto con el gen individual transferido del progenitor no recurrente.

El término "autofecundación" se refiere al proceso de autofertilización en el que un individuo se poliniza o fertiliza con su propio polen. La autofecundación repetida resulta, eventualmente, en descendencia homocigota.

Como se utiliza en la presente, el término "homocigota" significa una condición genética que existe cuando se encuentran alelos idénticos en los locus correspondientes de cromosomas homólogos.

Como se utiliza en la presente, el término "heterocigota" significa una condición genética que existe cuando se encuentran alelos diferentes en los locus correspondientes de cromosomas homólogos.

El término "recombinación" o "recombinar" se refiere al intercambio de información entre dos cromosomas homólogos durante la meiosis. En una planta "recombinante", se intercambia el ADN que se encuentra originalmente en un lugar específico dentro del cromosoma, por ejemplo, ligado a un gen/locus, por ADN de otra planta (es decir, maternal por paternal o vice versa). Para intercambiar únicamente el material necesario y mantener la información original de valor en el cromosoma hasta donde sea posible, se necesitarán, en general, dos eventos de entrecruzamiento o recombinación flanqueantes. En un doble recombinante, este intercambio tiene lugar en ambos lados de un gen/locus. Una forma de encontrar recombinantes dobles así es analizar una población de plantas F2. Esta población debe ser grande, ya que la doble recombinación no ocurre frecuentemente. Como alternativa, los recombinantes dobles pueden ser el resultado de retrocruzamientos repetidos. La frecuencia de la doble recombinación es el producto de las frecuencias de los recombinantes individuales (por ejemplo, un recombinante en un área de 10 cM puede encontrarse con una frecuencia de 10 %, los recombinantes dobles se encuentran con una frecuencia de 10 % x 10 % = 1 %).

Como se utiliza en la presente, el término "progenie" implica uno o más descendientes genéticos.

Como se utiliza en la presente, el término "población" significa un conjunto de plantas genéticamente heterogéneas derivadas de un progenitor común compartido.

Un "evento de recombinación" se refiere a un evento de entrecruzamiento mitótico o meiótico, así como un evento transgénico.

Como se utiliza en la presente, el color de la pulpa de un fruto de melón puede definirse mediante comparación con una tabla de colores de referencia, como la RHS, como saben los expertos. En ciertas modalidades el color de la pulpa puede denominarse "naranja" y se define como correspondiente los colores 9A - 35B o 40A - 44C según la tabla de colores RHS.

Como se utiliza en la presente, el término "híbrido" significa cualquier descendiente de una cruza entre dos individuos diferentes genéticamente. De forma más general, el término se refiere a la cruza entre dos líneas de reproducción (de élite o endogámicas) que se reproducirán fieles al progenitor de la semilla.

El término "línea de reproducción", como se utiliza en la presente, se refiere a una línea de un melón cultivado con características de valor comercial o agronómicamente deseables, a diferencia de las variedades silvestres o autóctonas que son producto de la selección natural. El término se refiere también a una línea de reproducción de élite o línea élite que representa una línea de plantas esencialmente homocigota y usualmente retrocruzada y endogámica utilizada para producir semillas híbridas Fi (comerciales). Las características agronómicamente deseables incluyen, de forma no taxativa, la resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, características valiosas de frutos, rendimiento, etc. Una línea de reproducción es, usualmente, una línea endogámica y puede ser una línea de élite.

Como se utiliza en la presente, el término "endogámica pura" o "endogámica" se refiere a una planta o línea de plantas sustancialmente homocigota obtenida mediante autofecundaciones repetidas.

Como se utiliza en la presente, el término "alelo(s)" significa cualquiera de una o más formas alternativas de un locus o gen, donde todos los alelos se relacionan con al menos un rasgo o característica. En una célula u organismo diploide, las dos copias de un gen ocupan locus correspondientes en un par de cromosomas homólogos. Cada copia puede ser un alelo distinto.

Un "gen" se define en la presente como una unidad hereditaria (usualmente señalada por una secuencia de ADN) que ocupa una ubicación específica en un cromosoma y que contiene las instrucciones genéticas para una contribución a rasgos o características fenotípicas potenciales en una planta.

Un "locus" se define en la presente como la posición que un gen específico ocupa en un cromosoma de una especie vegetal específica.

De forma similar a la unidad genética "gen", en que la expresión fenotípica depende de múltiples factores ¡mpredecibles, la unidad genética "QTL" denota una región del genoma que se relaciona a un rasgo cuantificable fenotípicamente.

El término "contexto genético natural" se utiliza en la presente para referirse al contexto genético original de un alelo o QTL. Por otro lado, un método que implique la transferencia de ADN que comprende el alelo o QTL, o una parte de este que confiera la característica que se encuentra en el alelo o QTL, a la misma posición en el cromosoma correspondiente de otra línea o variedad de melón, resultará en que dicho alelo o QTL, o dicha parte de estos, no se encuentre en su contexto genético natural.

Como se utiliza en la presente, el término "grupo de ligamiento" se refiere a todos los genes o rasgos genéticos que se encuentran en un mismo cromosoma. Dentro del grupo de ligamiento, aquellos locus que estén lo suficientemente cerca presentarán vínculos en cruzas genéticas. Dado que la probabilidad de entrecruzamiento aumenta con la distancia física entre genes en un cromosoma, los genes cuya ubicación esté lejos de la de otros dentro de un grupo de ligamiento podrán no presentar enlaces directos detectables en pruebas genéticas. Los genes están "ligados indirectamente" mediante locus con posiciones intermedias. El término "grupo de ligamiento" se usa principalmente para referirse a locus genéticos que presenten comportamientos vinculados en sistemas genéticos donde las asignaciones cromosómicas no se hayan hecho aún. Por lo tanto, en este contexto el término "grupo de ligamiento" es sinónimo a (la entidad física de) un cromosoma.

Como se utiliza en la presente, los términos "marcador molecular genómico", "marcador molecular" o "marcador" se refieren a un indicador que se utiliza en métodos para visualizar diferencias en las características de secuencias de ácidos nucleicos. Son ejemplos de dichos indicadores los marcadores de polimorfismo de largo de fragmentos de restricción (RFLP), marcadores de polimorfismo de largo de fragmentos amplificados (AFLP), polimorfismos de nucleótido simple (SNP), mutaciones de inserción/deleción (INDEL), marcadores de microsatélites (SSR), regiones amplificadas caracterizadas por secuencias (SCAR), marcadores de secuencias polimórficas amplificadas y cortadas (CAPS) o marcadores de isoenzimas o combinaciones de los marcadores descritos en la presente que definen una ubicación genética y cromosómica específica. También se pueden utilizar téenicas de secuenciación de ADN para determinar el alelo que se encuentra en un marcador de interés dado. Los marcadores genómicos moleculares se utilizan en los conocidos procesos de MAB (retrocruzamiento asistido por marcadores) y MAS (selección asistida por marcadores), donde la velocidad y eficiencia del proceso de reproducción puede mejorarse sustancialmente al utilizar información técnica en la posición del gen o alelo de interés.

El término "transformado" se usa en la presente como sinónimo para la transferencia de genes aislados y clonados al ADN, usualmente el genoma o ADN cromosomal, de otro organismo mediante técnicas de ingeniería genética, usualmente con la asistencia de un vector u otro sistema de transformación genética.

Los términos "resistente" y "resistencia" incluyen la resistencia a infecciones tanto parcial como total. Una planta de melón susceptible a patógenos puede ser no resistente o puede presentar niveles bajos de resistencia a infecciones por el patógeno. La resistencia incluye también un portador sin síntomas, pero usualmente se refiere a la ausencia, o al menos un bajo título, de partículas virales en la planta, observables, por ejemplo, con anticuerpos al ocurrir la infección. En ciertas modalidades, las plantas de la invención presentan resistencia a las enfermedades esencialmente como las presenta el acceso ME8094 así como una o más de las líneas párenteles de su linaje.

El término "planta de melón receptora susceptible a patógenos" se utiliza en la presente para denominar una planta de melón que recibirá ADN obtenido de una planta de melón donante que comprende el alelo de resistencia al patógeno. Dicha planta de melón receptora susceptible a patógenos puede o no ya comprender uno o más alelos para (la misma u otra) resistencia, en cuyo caso el término denomina una planta que recibirá un alelo de resistencia adicional.

Como se utiliza en la presente el término "parte de planta" Indica una parte de la planta de melón, incluyendo organelos, células individuales y tejidos celulares, como células vegetales Intactas en plantas, grupos de células y cultivos de tejidos a partir de los cuales se pueden regenerar las plantas de melón. Se incluyen, de forma no taxativa, dentro de los ejemplos de partes de plantas células individuales, protoplastos y tejidos de polen, óvulos, hojas, embriones, raíces, puntas de raíces, anteras, flores, frutos, tallos, brotes y semillas, así como polen, óvulos, hojas, embriones, raíces, puntas de raíces, anteras, flores, frutos, tallos, brotes, esquejes, rizomas, semillas, protoplastos, callos y similares.

Como se utiliza en la presente, el término "virus del mosaico amarillo del calabacín", abreviado "ZYMV", se refiere a un potyvirus portado por áfidos que afecta a todas las cucurbitáceas, incluyendo calabazas, zapallos, calabacines, zapallitos, melones, sandías, pepinos, pepinillos y varias cucúrbitas. Provoca un grave mosaico foliar, amarillamiento y eventualmente síntomas de deformación tipo "cordón de zapato" en las hojas. Se detiene el crecimiento de los frutos y estos se tuercen y deforman con protuberancias que impiden su comercialización. En cultivos artificiales la plantas dejan de producir frutos comerciables dentro de 1 a 2 semanas después de la infección y pueden ocurrir pérdidas financieras graves.

Como se utiliza en la presente, el término "virus del mosaico de la sandía", que se abrevia "WMV", (anteriormente conocido como "WMV- 2") también es un potyvirus transmitido por áfidos que puede infectar y producir síntomas en todas las cucúrbitas cultivadas comercialmente. Este virus causa síntomas más suaves en el follaje de la mayoría de las plantas infectadas, como el zapallo, y los productores han notado una disminución en los síntomas del follaje luego de la fertilización. La distorsión de los frutos y la pérdida de color siguen siendo un problema en variedades como la calabaza amarilla. El rango de huéspedes para el WMV-2 no se limita a las cucúrbitas, lo cual deja abierta la posibilidad de la transmisión durante el invierno del virus a diferentes especies leguminosas como el trébol. A fines de temporada son comunes las infecciones mixtas de cucúrbitas con CMV y WMV-2.

Como se utiliza en la presente, el término "virus de la mancha anular de la papaya", que se abrevia "PRSV" (antes conocido como "WMV-1") se transmite por áfidos y solo infecta cucúrbitas. Este virus puede infectar todos los cultivos comerciales de cucúrbitas. El follaje de las plantas afectadas presenta importantes mosaicos y distorsión y un dentado de las hojas muy acentuado. Los frutos también presentan malformaciones con sobrecrecimiento tuberoso.

Como se utiliza en la presente, el término "virus del mosaico del pepino" que se abrevia "CMV", es un virus patógeno vegetal de la familia Bromovirídae. Es el miembro tipo del género de virus vegetales Cucumovirus. Este virus se encuentra en todo el mundo y tiene un muy amplio rango de huéspedes. De hecho, tiene uno de los rangos de huéspedes más amplios de todos los virus vegetales conocidos (191 huéspedes en 40 familias). Puede transmitirse de planta a planta tanto de forma mecánica mediante la sabia como por medio de áfidos que lo portan en el estilete. También puede transmitirse en semillas y mediante las malezas parasíticas Cuscuta sp. (cuscuta). Desde que se reconoció el CMV por primera vez, se ha encontrado que infecta una gran variedad de otras plantas que incluye otros vegetales como zapallos, melones, pimientos, porotos, tomates, zanahorias, apios, lechugas, espinacas y remolachas, varias malezas y muchas plantas ornamentales y de jardín. Los síntomas que se presentan con este virus incluyen moteado o mosaico de hojas, amarillamiento, manchas anulares, retraso del crecimiento y distorsión de las hojas, las flores y los frutos.

Información de depósito Se realizó un depósito de la línea ME8094 de C. meló que se divulgó anteriormente en la presente y a la cual se hace referencia en las reivindicaciones en NCIMB, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia, Reino Unido. La fecha del depósito fue el 4 de setiembre de 2009 y el número de acceso para esas semillas depositadas de la línea de melón ME8094 es el número de acceso NCIMB 41653. Se eliminaron todas las restricciones sobre este depósito y se pretende que este cumpla con todos los requisitos de la sección 37 del C.F.R., §1801-1809. El depósito se mantendrá en las instalaciones por un período de 30 años, o 5 años después de la última solicitud, o mientras la patente esté vigente, cualquiera sea el período más largo, y será remplazado, de ser necesario, durante dicho período.

Aunque la anterior invención ha sido descrita con ciertos detalles mediante ilustraciones y ejemplos para facilitar su claridad y comprensión, será evidente que pueden realizarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención que solo se verán limitadas por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Todas las referencias citadas en la presente se incorporan expresamente a este documento mediante esta referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Marcadores geneticos de los grupos de ligamiento de C. meló 02. 11 v 12 Se desarrolló un mapa genético de consenso para C. meló que comprende marcadores genéticos en los cromosomas (es decir, "grupos de ligamiento") 1 a 12. Se diagrama un mapa genético para el melón en la figura 1 y en la Tabla 4 se presentan marcadores para los cromosomas 02, 11 y 12, incluyendo aquellos que están ligados a uno o más rasgos que confieren resistencia a WMV, ZYMV y CMV.

TABLA 4 Marcadores genéticos en cromosomas de melón ligados a rasaos de resistencia a virus de interés Los marcadores presentados en la Tabla 4 pueden utilizarse, por ejemplo, mediante selección asistida por marcadores (MAS) para identificar plantas de melón que comprenden resistencia a uno o más de WMV, ZYMV y CMV, entre otros virus que comprenden, por ejemplo, rasgos de resistencia a virus obtenidos por introgresión de líneas donantes resistentes a los virus como ME8094 (NCIMB 41653) u otras líneas donantes resistentes a virus. La Tabla 5 presenta información sobre secuencias y SNP asociados para QTL de melones resistentes a virus.

TABLA 5 Información sobre SNP v secuencias para los marcadores geneticos seleccionados ligados a la resistencia a virus de melones EJEMPLO 2 Identificación de marcadores genéticos ligados a rasaos de resistencia a WMV v ZYMV.

Se identificaron marcadores genéticos en el cromosoma de melón 11 los cuales están ligados con el locus de QTL que otorga resistencia a WMV y ZYMV. Estos dos rasgos de resistencia a virus se mapean cerca en el cromosoma 11. Se determinó el fenotipo de seis poblaciones F2 segregantes derivadas de cruzas de PMR45 (un melón del tipo Western Shipper disponible comercialmente) y cinco líneas de élite del tipo Charentais de ME8094 para buscar resistencia a ZYMV y WMV como se muestra en la Tabla 6 para identificar y validar la presencia del locus QTL "W/z" para el cromosoma de melón 11 que confiere dicha resistencia. Se determinó el genotipo de 120 plántulas de cada una de las seis poblaciones utilizando marcadores ligados al locus W/z (lo que resultó en 6 a 11 marcadores polimorfos en diferentes poblaciones F2) Además, se determinó el fenotipo para ZYMV de 172 líneas de una población de mapeo F5 derivada de una cruza entre Mbnr992 x GA35PMT (Tabla 6) y se determinó el genotipo de la población utilizando 134 marcadores TaqMan que cubrieron el genoma del melón.

TABLA 6 Poblaciones segregantes F2 v F5 para las cuales se determinó el genotipo para ZYMV v/o WMV v sus linajes. * se usaron 163 individuos para mapeo de intervalos no paramétricos; se usaron 143 individuos para mapeo de intervalos binarios.

El análisis se llevó a cabo utilizando regresión de marcador individual, mapeo de intervalos no paramétricos y/o mapeo de intervalos binarios. Rápidamente, la población segregante F2 indicó que la ubicación más probable para el locus W/z es el intervalo de NU0218779 (o NU0218656) a NU0218835 (44,6 a 49,0 cM en el grupo de ligamiento 11, como se muestra en la Tabla 4). Solo una de las seis poblaciones de mapeo (VC5 x ME8094) indicó una asociación del WMV con los marcadores anteriores a este intervalo (NU0219106 a 39,0 cM); sin embargo, esta población presentó una distorsión considerable de las proporciones de segregación de fenotipos esperadas en las generaciones F1 y F2 y, por lo tanto, no se consideró acertada. Esto llevó a una reducción adicional del intervalo genético identificado que comprende W/z, ya que anteriormente el locus se mapeó en el intervalo entre 38,97 y 53,44 cM y estudios de cultivo adicionales refinaron el intervalo aún más a entre 40,92 y 51,02 cM.

La resistencia a WMV y ZYMV se mapeó a partir de la fuente Mbnr992 (Tabla 1). La Mbnr992 se desarrolló mediante autopolinización de ME8094. La Mbnr992 presenta resistencia a CMV, WMV y ZYMV. La herencia de la resistencia a ZYMV por Mbnr992 es recesiva. La herencia de la resistencia a WMV por Mbnr992 es mayoritariamente dominante, aunque los heterocigotas pueden presentar resistencia intermedia dependiendo de las condiciones y la presión del virus.

Cuando se utilizó Mbnr992 como donante de resistencia para el cultivo, las poblaciones segregantes demostraron una correlación de resistencia muy elevada tanto para WMV como ZYMV, lo que sugiere un estrecho ligamiento de locus (o un único locus) que controlan la resistencia a estos dos virus. Se determinó el fenotipo de una población RIL F6 de Mbnr992 x GA35Pmt para la resistencia a los virus y se determinó el genotipo para marcadores a lo largo del cromosoma de melón. La línea parental GA35Pmt es susceptible a WMV, ZYMV y CMV. A partir de estos datos, el locus de resistencia a ZYMV se mapeó en el cromosoma 11, entre aproximadamente 44 y 53 cM, y se observo un ligamiento estrecho, o cosegregación, de un locus que controla la resistencia a WMV. Para verificar si el WMV se encuentra en la misma región que el ZYMV se realizaron dos estudios. En el primer experimento, se seleccionó un grupo de individuos recombinantes en la región ZYMV de entre 67 líneas de la población RIL Mbnr992/GA35PMT y se realizó un análisis para WMV. Se tomaron los resultados de plantas individuales y los resultados de promedio de mínimos cuadrados (LSM) para WMV basados en promedios de gráficas se utilizaron para realizar el análisis QTL. El análisis QTL mostró que el mayor pico de QTL fue en el grupo de ligamiento 11, en la misma región en que se había mapeado previamente el ZYMV, lo que demuestra que el locus de resistencia a WMV comparte su ubicación con el locus de resistencia a ZYMV.

Luego se realizó un segundo experimento para identificar la ubicación del locus WMV. En este estudio se analizó una población BC4F2 en busca de resistencia a WMV y se midió la resistencia a ZYMV en las plantas que sobrevivieron el análisis de WMV. Se determinó el genotipo de las plantas con todos los marcadores polimorfos de la supuesta región WMV/ZYMV. Se usaron en total 276 plantas, 191 de las cuales estuvieron disponibles para obtener también datos de resistencia al ZYMV. Los marcadores NU021906 (p<0,01), NU0218656 (p<0,01), NU0219710 (p<0,01) y NU0219542 (p<0,05) se correlacionaron considerablemente con el rasgo de resistencia a WMV, mientras que el marcador NU0218656 se correlacionó con el rasgo de resistencia al ZYMV (p<0,01). Dos de los marcadores requirieron análisis de seguimiento y eventualmente se eliminaron de los análisis adicionales. Estos marcadores fueron NU0218779 y NU0218514. El análisis mostró que el rasgo de resistencia al WMV derivado de la fuente Mbnr992 (es decir, ME8094)se encuentra en la misma región que el rasgo de resistencia al ZYMV. El marcador NU0218656 presentó el ligamiento más estrecho con el rasgo de resistencia al WMV, seguido por el NU0219710. El resultado más importante para la resistencia al ZYMV se encontró en el marcador NU0218656. Por lo tanto, los dos rasgos presentan una ubicación conjunta.

La resistencia al ZYMV también se mapeó para la fuente PI414723 que porta el gen zym-1. Se determinó el genotipo y el fenotipo de una población RIL F6 de Vedrantais x PI414723 para la resistencia a ZYMV. La línea progenitora Vedrantais es una línea endogámica tipo Charentais susceptible a ZYMV. A partir de esta información, se identificó un único locus (supuestamente zym-D en el cromosoma 2, posición 3, 2-5, 7 cM. Los marcadores para este locus se convirtieron a un formato de determinación de genotipos de alto rendimiento, se validó en germoplasma de programas de cultivo y también puede usarse para la selección asistida por marcadores de zym-1. La herencia de la resistencia zym-1 al ZYMV es recesiva.

La ubicación de la resistencia a WMV/ZYMV a partir de Mbnr992 y el gen zym-1 a partir de PI414723 en los cromosomas 11 y 2, respectivamente, demuestra la herencia independiente de estos dos genes de resistencia al ZYMV. El locus de resistencia a WMV/ZYMV en el cromosoma 11 es especialmente valioso debido a que provee resistencia dual a dos virus, resistencia elevada a WMV, bajos títulos virales o ningún título viral luego de la inoculación viral mecánica (algo que hasta ahora no era posible en melones) y una fuente de resistencia al ZYMV que no está asociada a la necrosis foliar usual del gen zym-1 previamente identificado. Las figuras 2 a 3 y Cuadro A ilustran grados de enfermedades y pruebas ELISA que demuestran la eficacia del rasgo de resistencia a ZYMV/WMV que se identificó en ME8094.

Una población de mapeo F5 de la cruza Mbnr992 x GA35PMT indicó que el marcador NU0218779 que se encuentra en 44,6 cM es el más estrechamente ligado al rasgo de resistencia a ZYMV y WMV, con un efecto adicional de a = 3,83, conforme al análisis de regresión de marcador único. Los análisis de mapeo de intervalos binarios y no paramétricos indicaron que el pico de QTL se encuentra en 46,8 y 45,7 cM y que el intervalo 1-LOD es de 43,25 a 48,75 y de 44,25 a 48,25, respectivamente. Estos intervalos concuerdan con los resultados antedichos para cinco de las poblaciones F2 segregantes. Los marcadores en el intervalo de mapa genético unidos por NU0219106 y NU0219710 (en el grupo de ligamiento 11, como se muestra en la Tabla 4) pueden utilizarse, entre otros, en MAS para identificar las plantas que presentan resistencia a WMV y ZYMV. Otros marcadores localizados a este intervalo en el mapa genético del melón pueden utilizarse de forma similar, como, por ejemplo, marcadores disponibles al público (por ejemplo, ver S.E. Martín, "Caracterizatión Etnobotónica Agro-Morfológica, Sensorial, Físico-Química, Nutricional y Molecular de Las Variedades Locales de Melón de Vlllaconejos;" Tesis de doctorado, Universidad Politéenica de Madrid, 2010).

EJEMPLO 3 Interrupción del ligamiento del CMV OTL12 con el rasgo de fruto pentámero El intervalo genómlco del CMV QTL12 flanqueado por los marcadores NU0243358 - NU0220836 (39,77 - 46,89 cM como se menciona en la Tabla 4) confiere resistencia al CMV, sin embargo, el fenotipo de fruto pentámero se mapea en una ubicación similar en el genoma de C. meló y este rasgo no deseable puede encontrarse, por ejemplo, en líneas de melón que comprenden una introgresión a partir de ciertas líneas de melón como PI161375 y líneas derivadas de esta. El factor genético que lleva al fenotipo del fruto pentámero en el melón se ha caracterizado previamente y se ha mapeado en LG XII del mapa compuesto de melón ICuGI (Périn et á!. TAG 104:1017-1034, 2002). Este arrastre por ligamiento que resulta en la presencia del rasgo no deseable de fruto pentámero, sin embargo, no se ha observado luego de la introgresión del intervalo cromosomático de ME8094 para resistencia al CMV. Así, el uso de rasgos de resistencia al CMV derivados de ME8094 en conjunto con reproducción asistida por marcadores permite la introgresión de resistencia al CMV a la vez que evita la inclusión del rasgo de fruto pentámero.

EJEMPLO 4 Fenotipo de la línea donante ME8094 vs. líneas derivadas de BC2 que portan la Introgresión de interés.

Se plantaron entre cuatro y seis plantas de cinco linajes (Tabla 7) en un Invernadero. Las líneas derivadas BC2 descritas se derivaron de la cruza de WSH-39-1083-AN de élite con el progenitor donante EXC-C210-ME-8094-1. En la generación BC1 una se seleccionó una línea aleatoria que presentaba introgresión del donante en la región genómlca de interés como se muestra en la Tabla 7. Esta línea se llevó a la generación BC2 y se autofecundó por al menos una generación subsecuente para permitir la fijación de la introgresión del donante. Los marcadores moleculares se usaron únicamente para seleccionar la introgresión del donante en las tres regiones genómicas indicadas; por lo tanto, no se sabe qué otras reglones del genoma podrían presentar introgreslones de donante.

Se dispusieron en orden (no aleatorio) plantas de los cinco linajes en dos filas adyacentes del invernadero, lejos de almohadillas de enfriamiento para evitar diferencias de temperatura durante el crecimiento. Se recolectó Información de 2 frutos para cada planta al alcanzar la madurez de cosecha. Los fenotipos registrados fueron: largo y ancho del fruto, largo y ancho de cavidades, firmeza, Brix (sólidos solubles) y color de piel y pulpa. Los datos sobre coloración se registraron con un colorímetro manual y los fenotipos de color finales que se presentaron son claridad, pureza de color y matiz. Se recolectaron cuatro medidas de color independientes de la piel y otras cuatro de la pulpa de cada fruto de melón (la ubicación en la piel y la pulpa fue consistente para todos los frutos). Además, se tomaron dos medidas de Brix y firmeza para cada fruto con un refractómetro y un penetrómetro digital manual, respectivamente. Los frutos representativos de este estudio se presentan en las figuras 4A a 4E.

TABLA 7 Resumen de las líneas ME8094 v BC2 derivadas de estas que presentan las introqresiones indicadas en el locus de interes e Nn J La tabla 8 presenta datos de fenotipos para frutos de cada linaje. También se muestra la desviación media y estándar para cada genotipo y rasgo. Estos datos confirman que el donante ME8094 tiene frutos más alargados que las líneas derivadas de BC2 que presentan introgresiones de donante. El largo del fruto de la línea ME8094 fue, en promedio, 221,07 mm, mientras que el de las líneas BC2 varió entre 122,08 y 174,14 mm. De forma similar, el tamaño de cavidad fue mayor en la línea ME8094. Los frutos de melón de la línea ME8094 también presentaron mayor firmeza (8,62 kgf) que 3 de las 4 líneas derivadas de BC2 (entre 4,76 y 5,75 kgf). El contenido de líquidos solubles (Brix) fue muy bajo para los frutos de la línea ME8094 (3,96 °Brix) en comparación con los frutos de las líneas derivadas de BC2 (entre 7,94 y 9,55 °Brix). Las figuras 4A a 4E muestran los diferentes colores y formas de fruto de la línea ME8094 en comparación con las líneas de élite derivadas de BC2 que presentan introgresiones de donantes en partes del genoma.

TABLA 8 Valores de fenotipos por planta para cada una de las 4 a 6 plantas para las que se determinó el fenotipo para cada linaje EJEMPLO 5 Validación de los marcadores OTL2 en líneas con OTL12 fijado para la introgresión ME8094: Se llevó a cabo un estudio para validar la presencia del factor genético CMV que se identificó en la región genómica de 95,88-118,45 cM en el grupo de ligamiento 2 (LG2) en la línea ME8094. Se analizaron un total de 16 líneas derivadas de BC2 del cruzamiento de WSH-39-1083-AN con ME8094. Ocho entradas portaban la introgresión ME8094 solo en el intervalo CMV QTL12 (QTL2-/QTL12+) y 8 entradas portaban tanto CMV QTL2 como QTL12 (QTL2+/QTL12+). Se analizaron doce plántulas por replicación y 12 replicaciones de cada una de las 16 entradas, así como las líneas de control de enfermedad Virgos, Paco, Pastis-2, MR1, TopMark, Vedrantais, y las líneas parentales ME8094 y WSH-39-1083-AN en un diseño de bloque completamente aleatorio.

Debido a la gran cantidad de plantas, las replicaciones 1 a 6 se sembraron e inocularon en distintos puntos de tiempo que las replicaciones 7 a 12. Se recolectaron los datos de grados de la enfermedad (en una escala del 1 al 9, 1: resistente, 9: susceptible) para todas las replicaciones 9, 15 y 22 días después de la inoculación. El análisis se llevó a cabo utilizando JMP v9 (JMP Software; SAS Institute, Cary, NC, E.U.A.); y los mínimos cuadrados promedio se derivaron utilizando la probabilidad máxima restringida para las replicaciones 1 a 6 y 7 a 12 de forma separada, así como también entre todas las replicaciones (Tabla 9). Los grupos de separación por promedio indican entradas con grados de enfermedad considerablemente diferentes. Se observaron diferencias considerables entre los dos puntos de tiempo, probablemente debido a las diferencias en la inoculación ya que las replicaciones 7 a 12 fueron atacadas de forma más uniforme y severa por el CMV, pero los promedios de todas las entradas fueron clasificados de forma similar para todas las replicaciones.

Estos resultados muestran que todas las líneas que portaban tanto CMV QTL2 como QTL12 (QTL2+/QTL12+) tenían una resistencia considerablemente más alta al CMV 22 días después de la inoculación al ser comparadas con las líneas que portaban introgresión ME8094 solo en el intervalo CMV QTL12 (QTL2-/QTL12+), con la excepción de la entrada 12. Para la entrada 12 es posible que otro locus menor que controla la resistencia al CMV pueda segregar en el entorno, lo que lleva a un mayor nivel de resistencia. La entrada 13 también exhibió mayores niveles de resistencia que lo que se observó en general y comparado con otras entradas QTL2+/QTL12+ en este estudio, lo cual también puede deberse a otro locus menor que controla la resistencia al CMV derivado de ME8094 que puede estar presente en esta familia BC2 en particular.

Por lo tanto, cuando QTL12 se fija para la introgresión donante ME8094 es posible identificar diferencias estadísticamente considerables entre las líneas que portan y las líneas que no portan la introgresión QTL2 ME8094.

TABLA ¾ Mínimos cuadrados promedio v grupos separados por promedio para los arados de enfermedad 22 días después de la inoculación para todas las entradas v controles.

MSG: Grupos de separación por promedio.

EJEMPLO b Mapeo adicional de ZYMV/WMV OTL en el grupo de ligamiento 11 Como se muestra en el ejemplo 2, el intervalo del mapa genético limitado por NU0219106 y NU0219710 en el grupo de ligamiento 11 del mapa genético del melón (39,0 - 53,4 cM) porta alelos para la resistencia al WMV y al ZYMV como en las líneas ME8094 y Mbnr992. También se descubrió que el marcador NU0218779 a 44,6 cM está ligado de forma más estrecha a los rasgos de resistencia a ZYMV y WMV. Este ejemplo proporciona mapeo genético adicional e Información fenotíplca asociada con la ¡ntrogresión del ZYMV/WMV QTL del grupo de ligamiento 11 y las porciones flanqueantes derivadas del donante del grupo de ligamiento 11.

La evaluación de las líneas que se desarrollaron a través de retrocruzamiento asistido por marcador demostraron diferencias considerables para varios rasgos fenotípicos debido al arrastre por ligamiento y efectos del entorno cuando se analizaron los melones Galia (GAL) y Amarillo (AMA) con gran ¡ntrogresión en la región ZYMV/WMV QTL1.

Dos de las líneas endogámicas convertidas con la reglón ZYMV/WMV QTL11 son GAL-188-DUFFE-AN y AMA-188-DECO-AN. Se obtuvieron las semillas BC3 y BC4 de las endogámicas convertidas GAL y AMA, respectivamente, se fijaron para la ¡ntrogresión ZYMV/WMV QTL11 para los alelos de donante homodgoto y progenitor recurrente y se analizaron junto con las líneas endogámicas sin convertir. Los dos ensayos se dispusieron en diseños RCBD con 10 replicaciones. Se evaluaron una cantidad de rasgos (por ejemplo tamaño del fruto, tamaño de la cavidad, rendimiento frutal, brix, firmeza, vigor, resistencia al oídio, escritura, suturas, tamaño de la cicatriz del extremo de floración, el color de la piel y la pulpa) y se recolectaron datos cuando se observó variación fenotípica entre entradas del experimento.

Se analizaron dos familias BC3 diferentes en el ensayo GAL (6 entradas en total), las cuales eran derivadas de la misma BC2, mientras que se analizó una familia BC4 en el ensayo AMA (3 entradas). La identificación al nivel del genoma mostró que el porcentaje de progenitores recurrentes para el linaje de AMA fue 94,95 % y que la línea BC4 convertida de AMA tenía una ¡ntrogresión donante en QTL11 que abarca la región de 8,37 a 49,01 cM (40,63 cM). El porcentaje de progenitores recurrentes para el segundo linaje de GAL fue de 93,94 % y la línea BC3 convertida de GAL tenía una ¡ntrogresión donante en QTL11 que abarcaba la región de 40,62 a 94,71 cM (54,09 cM). Las introgresiones donantes se seleccionaron inicialmente utilizando dos marcadores informativos en el intervalo QTL11 a 38,89 y 44,63 cM, y por lo tanto abarcaron una región genómica de 5,66 cM.

Los resultados del ensayo GAL se muestran en la Tabla 10 y en la figura 5. Se identificaron diferencias considerables entre líneas que portaban los alelos donantes y líneas que portaban el alelo progenitor recurrente en QTL11 para ambas familias BC3 en cuanto a largo del fruto, largo de la cavidad, rendimiento frutal y madurez y para una familia BC3 en cuanto a brix y ancho de la cavidad, lo que implica que la introgresión del alelo donante en QTL11 puede dar como resultado un fruto con mayor largo, madurez posterior, menor rendimiento frutal y menor brix. Para cuatro de estas ocho comparaciones no hubo diferencias considerables entre los fenotipos de las líneas no convertidas y la línea que portaba el alelo progenitor recurrente en QTL11, mientras que para las otras comparaciones estas líneas variaron considerablemente. Además, tres comparaciones entre líneas de la segunda familia BC3 no mostraron una diferencia considerable entre las líneas convertidas, pero sí diferencias considerables en comparación con el control endogámico sin convertir en cuanto a brix, ancho del fruto y ancho de la cavidad, lo que implica que las introgresiones donantes restantes en el entorno de las líneas convertidas (~5-6 % del genoma como se indicó anteriormente) pueden ser responsables por las diferencias en ancho del fruto y brix.

TABLA 10 Ensayo de la conversión GAL-188-DUFFE-AN MABC que porta la introaresión ZYMV/WMV 0TL11 (alelos de donante homodaoto fDN^ v progenitor recurrente ÍRP^ al lado de las líneas endooámicas sin convertir (FS). Se evaluaron dos familias BC3 diferentes para determinar los rasaos fenotípicos mencionados. Se ¡lustran los mínimos cuadrados promedio v las diferencias de los mínimos cuadrados.

Los resultados del ensayo AMA se muestran en la Tabla 11 y en la figura 6. Se encontraron diferencias considerables días después del trasplante probablemente debidas al entorno de las líneas convertidas; largo de la cavidad y posiblemente ancho del fruto, ancho de la cavidad y brix. En cuanto al rendimiento frutal, largo del fruto y vigor, las diferencias considerables probablemente se debieran a la introgresión donante en QTL11 aunque las diferencias del entorno también eran claras en cuanto a rendimiento frutal y largo del fruto. La introgresión QTL11 dio como resultado mayor rendimiento frutal, menor largo del fruto y menor vigor. Las líneas que portaban la introgresión donante en QTL11 también parecían ser más susceptibles al oídio que las líneas con la introgresión de RP o las líneas sin convertir, aunque no se analizó la importancia estadística de esta observación.

TABLA 11 Ensayo de la conversión AMA-188-DECO-AN MABCC que porta la introaresión ZYMV/WMV OTL11 falelos de donante homociaoto (DNt y progenitor recurrente f RP) al lado de las líneas endoaámicas sin convertir fFST Se evaluó una familia BC4 para determinar ios rasaos fenotípicos mencionados. Se ilustran los mínimos cuadrados promedio v las diferencias de los mínimos cuadrados.

DAT: días después del trasplante En resumen, se identificaron las diferencias estadísticamente considerables entre las líneas analizadas lo que sugirió que las regiones QTL11 y/o flanqueantes alrededor de este locus pueden conducir a fenotipos no deseados en las líneas GAL y AMA. Sin embargo, debido a que estas diferencias corresponden a distintos rasgos en los dos ensayos (GAL: mayor largo del fruto, madurez posterior, menor rendimiento frutal y menor brix; AMA: mayor rendimiento frutal, menor largo del fruto y menor vigor) se concluyó que cualquiera de estos efectos depende del tipo de melón (aunque no es probable) o se debe a factores genéticos que no están muy estrechamente ligados al locus ZYMV/WMV en QTL11. Los datos de identificación genética mostraron que las introgresiones donantes en las líneas estudiadas cubrían regiones genómicas de 54,09 cM y 40,63 cM en los linajes GAL y AMA respectivamente.

Simultáneamente a estas evaluaciones, se desarrollaron líneas que portan introgresiones cortas de ZYMV/WMV QTL11, para identificar eventos de reproducción óptimos que no conduzcan a fenotipos no deseados. Se analizaron las líneas isogénicas que portaban introgresiones fijas de los alelos del donante y progenitor recurrente en la región ZYMV/WMV QTL11 de los linajes derivados de BC2 del cruzamiento WSH-39-1083-AN x ME8094 (Tabla E). Cada familia comprende una región introgresada de parte de la región genómica QTL11 más probable. El ensayo se llevó a cabo en un diseño de parcela dividida con 10 replicaciones. Se determinó el fenotipo de cinco frutos recolectados de las 10 parcelas de plantas para determinar una cantidad de rasgos relevantes que exhibieron variación fenotípica entre las entradas del experimento. Para este locus, se recogieron datos sobre tamaño del fruto, rendimiento frutal, brix, firmeza y madurez. Los mínimos cuadrados promedio se estimaron usando el modelo mixto correspondiente en JMP y las diferencias de los mínimos cuadrados se derivaron utilizando el método t de Student.

TABLA E Genotipos en el OTL11 de ZYMV/WMV de las líneas isocrónicas ensayadas: las introoresiones donantes se extienden de 2.2 a 9.1 cM. Los marcadores subrayados o resaltados en tono oscuro exhiben el intervalo más probable en el que se encuentra el rasgo Los resultados demuestran que las diferencias considerables se identificaron solo con respecto a la largo y ancho del fruto (Tabla 12), pero en diferentes familias el alelo donante confirió un aumento o disminución en el tamaño del fruto y también un aumento o disminución concurrente en el grado brix. La variación en el tamaño del fruto no es algo inesperado en las línea BC2 que probablemente todavía porten una cantidad considerable de genoma donante (ME8094 tiene un tamaño drásticamente distinto al de las líneas de melones de élite) y regiones genómicas heterocigotas. En general, las diferencias entre las líneas isogénicas de las cinco familias analizadas fueron incongruentes y no revelan ninguna tendencia incluso después de tomar en cuenta que se analizaron distintos eventos para cada familia.

TABLA 12 Mínimos cuadrados promedio v diferencias de los mínimos cuadrados de los datos fenotípicos recolectados de cinco familias derivadas de BC2 con introaresión ZYMV/WMV OTL11 fiia para los alelos del donante homociaoto ( DN) o el progenitor recurrente homociaoto f RP).

DAT : días después del trasplante Estos resultados llevan a la conclusión que ningún fenotipo no deseado se encuentra asociado con estos eventos cortos que se desarrollan en la reglón genómica ZYMV/WMV QTL11 (Tabla E). Se analizaron dos de estos eventos de reproducción que abarcan 3,12 y 5,95 cM, respectivamente, en el locus ZYMV/WMV QTL11 (Tabla F) con los bioensayos de ZYMV y WMV correspondientes para confirmar la eficacia (resistencia a los dos virus). Ambos eventos fueron resistentes al ZYMV y al WMV, lo que implica que ambos eventos pueden utilizarse para la selección asistida por marcador y retrocruza miento de este locus, y que la región más probable de este QTL puede reducirse al Intervalo de 44,6 a 48,0 cM (entre los marcadores NU0218779 y NCMEL008383078).

TABLA F Representación de los datos de identificación v la información de alelos de dos eventos que presentan la introaresión ME8094 en ei locus OTL11 de ZYMV/WMV que carecen de arrastre por ligamiento (fenotipo perjudicial! v que demostraron ser resistentes a ZYMV v WMV EJEMPLO 7 Maneo adicional de CMV OTL en el grupo de ligamiento 12 Como se plantea por ejemplo en el Ejemplo 3, el intervalo del mapa genético entre NU0243358 y NU0220836 en el grupo de ligamiento 12 del genoma del melón (39,8 a 46,8 cM) controla la resistencia al CMV. Sin embargo, se descubrió que las líneas que portan la introgresión ME8094 en esta región genómica tienen una forma irregular y mayores cicatrices del extremo de floración (figura 7). Por lo tanto, se inició un esfuerzo para mapear detalladamente esta región genómica y desarrollar líneas que portaran introgresiones más cortas en esta región.

Para mapear CMV QTL12 en detalle, se ¡nieló un estudio con 28 entradas de las cuales 20 eran líneas con eventos de recombinación en la región QTL12 región (líneas derivadas de BC2 del cruzamiento de WSH-39-1083-AN con el donante de rasgos ME8094) y 8 eran controles resistentes y susceptibles. El experimento se llevó a cabo en un diseño RCBD y tuvo 10 replicaciones. Las replicaciones 1 a 5 se sembraron el 5/7/2011 y las replicaciones 6 a 10 se sembraron el 11/7/2011; las plántulas se inocularon el 13/7, 19/7 o 20/7 dependiendo de la germinación de la semilla. Se determinó el grado de enfermedad de las plántulas 6, 9 y 14 días después de la inoculación (dpi) y se calculó el área debajo de la curva de progreso de la enfermedad (AUDPC). Las replicaciones 1 a 5 y las replicaciones 6 a 10 se trataron como los puntos de tiempo 1 y 2, respectivamente, y se utilizó un modelo mixto para entender si los mínimos cuadrados promedio pueden derivarse a través de 10 replicaciones para cada entrada. El análisis estadístico mostró que la entrada al momento de la Interacción en el punto de tiempo era altamente importante; por lo tanto, los cuadrados mínimos promedio se derivaron de forma separada para cada uno de los dos puntos de tiempo (Tablas G y H). Se retiró una entrada debido a una muy baja germinación que resultó en la falta de un gran número de datos. Los mínimos cuadrados promedio de las entradas clasificaron de forma relativamente similar con respecto a los controles con la excepción de la entrada 20; por lo tanto, los resultados fueron coherentes entre los puntos de tiempo 1 y 2.

TABLA G Genotipos v fenotipos ( mínimos cuadrados promedio de AUDPC v calificación de 14 do! para cada uno de los dos momentos anteriormente descritos) de las entradas disponibles con eventos de recombinacién en el intervalo de OTL12 de CMV v controles TABLA H Genotipos v fenotipos (mínimos cuadrados promedio de AUDPC v calificación de 14 dpi oara cada uno de los dos momentos anteriormente descritos^ de las entradas disponibles con eventos de recombinación en el intervalo de OTL12 de CMV v controles El resaltado más oscuro corresponde a las introgresiones ME8094 en ubicaciones de marcadores dadas y el resaltado más claro, a introgresiones del progenitor recurrente WSH-39-1083-AN. La ubicación putativa del factor genético que controla el CMV se encuentra en el intervalo de NU0243358 y NU0218323.

Debe mencionarse que las líneas que se clasificaron como susceptibles (por ejemplo las filas 1 a 3, 9, 11 a 16, 21 y Vedrantais en la Tabla G) tenían fenotipos muy consistentes con los grados de enfermedad de 7 a 9 a los 6, 9 y 14 dpi y, por lo tanto, AUDPC de 79 a 88 para la mayoría de las plántulas a través de las replicaciones. Sin embargo, todas las líneas que clasificaron como resistencia intermedia (por ejemplo las filas 5 a 8, 10, 17 a 19 en la Tabla G) tenían un grado de enfermedad variable lo que dio como resultado una AUDPC de 0 a 88 y, por lo tanto, mayores errores estándar. Esto se debió principalmente a menores grados de enfermedad (resistente o de resistencia intermedia) durante 6 y 9 dpi y grados progresivamente mayores (susceptibles) durante la clasificación a los 14 dpi, que se habían observado anteriormente e implican la necesidad de evaluar el material del CMV después de la etapa de plántula. Debido a los valores altamente variables de la AUDPC que se usaron para calcular los mínimos cuadrados promedio, también se derivaron los mínimos cuadrados promedio para el grado de enfermedad a 14 dpi, los cuales eran coherentes (Tablas G y H).

La comparación de las 19 líneas que portaban los eventos de recombinación para QTL12 lleva a la conclusión que la región probable del factor genético que confiere resistencia al CMV en el grupo de ligamiento 12 se encuentra entre NU0243358 y NU0218323, abarcando el intervalo genético de 39,77 a 44,47 cM en el mapa genético del melón como se ilustra de forma esquemática en la Tabla H.

Luego, se desarrollaron las líneas de melón que comprendían introgresiones más cortas de la línea progenitora resistente en la región genómica mapeada en detalle de CMV QTL12 para usar en reproducción adicional y estas líneas se evaluaron para determinar si contenían fenotipos no deseados. Se estudiaron las familias derivadas de BC3 del cruzamiento WSH-39-1083-AN x ME8094 luego de desarrollar líneas isogénicas que portaban introgresiones fijas de los alelos del donante y del progenitor recurrente en la región CMV QTL12 (Tabla I). Cada familia había sido sometida a un evento de recombinación único que cubría parte de la región genómica QTL12 más probable (¡lustrado en la Tabla I). El ensayo se llevó a cabo en un diseño de parcela dividida con 10 replicaciones. Se determinó el fenotipo de cinco frutos recogidas de las 10 parcelas de plantas en cuanto a tamaño de cicatriz del extremo de floración, largo y ancho del fruto, ya que se identificaron anteriormente como arrastre putativo debido a la introgresión CMV QTL12, pero se evaluaron visualmente rasgos adicionales y se recolectaron datos de grado de brix de familias seleccionadas. Se estimaron los mínimos cuadrados promedio utilizando el modelo mixto correspondiente en JMP y las diferencias de los mínimos cuadrados se derivaron usando el método t de Student. No se encontraron diferencias considerables entre líneas isogénicas para ningún rasgo, con solo una excepción (ancho del fruto de la familia 6) como se muestra en la Tabla 13.

TABLA I Genotipos en el OTL12 de CMV de las líneas ¡soqenicas en ensayo. Se ¡lustra la región mapeada en detalle del OTL en las líneas resaltadas v los marcadores en las posiciones 43.38 v 44.47 cM son los más estrechamente ligados al rasgo TABLA 13 Mínimos cuadrados promedio v diferencias de los mínimos cuadrados de los datos fenotíoicos recolectados de familias derivadas de BC3 con la ¡ntroareslón CMV OTL12 fiia para los alelos del donante homoclaoto RN1 o el progenitor recurrente (RP1. El progenitor recurrente también se incluyó en dos entradas del ensayo. Los fenotipos del tamaño de la cicatriz del extremo de floración largo del fruto v ancho del fruto se presentan en mm.

Se concluye que ningún fenotipo no deseado se encuentra asociado con estas introgresiones "cortas" en la región genómica CMV QTL12 (Tabla I). Por lo tanto, se analizaron tres líneas seleccionadas que comprendían una región introgresada que abarcaba un intervalo de 3,3 a 9,1 cM (Tabla J) con el bioensayo correspondiente para confirmar la eficacia (resistencia al CMV). Se determinó que los eventos eran de resistencia intermedia, resistentes y altamente resistentes (Tabla J). Esto se debe probablemente a que CMV QTL12 tiene un efecto moderado y a que el QTL menor adicional conferido por ME8094 probablemente se encuentre presente en estas líneas derivadas de BC2. Las líneas que comprenden la región introgresada, por ejemplo como muestran estas tres, son eficaces y no contienen fenotipos no deseados.

TABLA 3 Tres eventos que presentan la ¡ntroaresien ME8094 en el locus OTL12 de CMV aue carecen de arrastre por ligamiento tienen resistencia intermedia ÍIR3. son resistentes Las Tablas B, C y D a continuación proveen grados de evaluación de enfermedad y el área debajo de la curva de progreso de la enfermedad de las plantas de variedades de melón inoculadas con la cepa de CMV Indicada determinados 8, 15 y 30 días luego de la infección. (MDI-8, MDI-15, MDI-30). Las columnas de número de entrada y variedad en la Tabla B aplican como etiquetas correspondientes también para las columnas de datos de la Tabla C y Tabla D.

TABLA B Prueba de campo: ráemenos de plantas 4* tu i adulta * J cepas de CIIV, t mp* d# 4 puna» por cepa Inoculación en etapa de hojas 3 TABLA C CkW-SofwH P atoll poSong MDI-8 HK3I— 1S IHM— 30 AJJOPC Pare. MW-8 MDI-15 M0I-30 AUDPC-1 R#« lfi¾-8 DI-15 MDI-3Q 9.0 9,0 9,0 208 613 9.0 9,0 9,0 208 628 9,0 9,0 9,0 7.5 9,0 9,0 197601 M 9,0 9,0 186 616 9,0 9,0 9,0 4.3 9,0 9,0 172606 4.0 9,0 9,0 171 621 4,5 9,0 9,0 5.5 *0 9,0 182615 5.0 0 9,0 178 630 6,0 9,0 9,0 3.3 9.0 ¾0 165 609 1.0 9.0 9,0 148 «4 5,5 9,0 9,0 1.0 w 9,0 1156081,0 5.0 9.0 104 623 1,0 7,0 9,0 3.5 5.5 6.5 121611 4.0 5.5 6.0 110 626 3,0 7,5 7,0 1,0 5,3 9.0 ,0107602 1.0 7.0 9.0 126 617 1,0 3,5 9,0 3.0 7.5 6,3 126612 2.5 7.5 6,5 124 627 3,5 7,5 6,0 2.0 5.3 6,3 94 6071,0 4.0 6,5 74 622 3,0 6,5 60 1,0 2.0 7.5 60 603 1,0 1.0 7.0 45 618 1,0 3,0 8,0 1,0 ¨,3 6.3 75 604 1,0 4.0 6.0 71 619 1,0 4,5 63 1,0 1.5 5.5 39 610 1,0 1.0 5.0 30 625 1,0 2,0 63 1.3 1,0 1.0 2 605 1.5 1,0 1.0 4 620 1,0 1,0 1,0 1,0 1.3 1.3 5 614 1,0 1.5 1,0 6 629 1,0 1,0 1,5 TABLA D CMV-V33N PaoBpo Song MD(-8UD(-15MDI-30 AUOPC Ptot MOI-8 MOI-15 WDI-30 WOPC- 1 8,8 9,0 9,0 2065138,5 9,0 9,0 204 5 8.3 9,0 9,0 2025017,5 9,0 9,0 197 6,5 9,0 9,0 1895064,5 9,0 9,0 174 6,5 9,0 9,0 1895154,0 9,0 9,0 171 2.3 7,5 9,0 1415091,0 6,0 9,0 115 1* 8,5 9,0 1465081,0 8,0 9,0 137 2.5 5,5 7,5 1105111,0 3,0 8,0 75 1.0 8,3 9.0 1405021,0 7,5 9,0 132 1015121,0 3,0 3,5 41 10 3.3 5,8 5.3 4.3 6,5 4.3 1095072,0 4,0 2,5 52 1,0 6,8 8.0 1165031,0 4,5 7,0 84 1.5 4,0 5.3 69 5041,0 3,0 3,5 41 1,0 2,0 5.0 415101,0 1,0 2,0 8 2.0 1,0 2.0 15 5051,5 1,0 3,0 19 1,0 1,0 1.3 2 5141,0 1,0 1,0 0

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una planta de melón que comprende resistencia al virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) y al virus del mosaico de la sandía (WMV), en el que la planta comprende adlcionalmente al menos un rasgo seleccionado del grupo que consiste en: producción de frutos con una relación de ancho/largo de al menos 0,5, producción de frutos con pulpa de color anaranjado, pulpa de color verde o pulpa de color blanco, exhibición de grado Brix > 9,5 °Bx, exhibición de resistencia al CMV, exhibición de resistencia al MNSV, exhibición de resistencia al PRSV y exhibición de resistencia a oídio.

2.- La planta de melón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el al menos un rasgo es una relación de al menos 0,5 entre ancho y largo.

3.- La planta de melón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el al menos un rasgo es seleccionado del grupo que consiste en color de pulpa naranja, color de pulpa verde y color de pulpa blanco.

4.- La planta de melón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el al menos un rasgo es grado Brix > 9,5 °Bx.

5.- La planta de melón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el al menos un rasgo es resistencia al CMV.

6.- La planta de melón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el al menos un rasgo es resistencia al oídio.

7.- La planta de melón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el al menos un rasgo es resistencia al MNSV.

8.- La planta de melón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el al menos un rasgo es resistencia al PRSV.

9.- Una parte de la planta de melón de la reivindicación 1, en la que la parte de la planta es seleccionada del grupo que consiste en: una semilla, una raíz, una hoja, un tallo, polen, un óvulo, una antera, un pistilo y una célula.

10.- Un cultivo tisular de células de la planta de la reivindicación 1 que pueden regenerarse.

11.- El cultivo tisular de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende células o protoplastos de una parte de planta seleccionada del grupo que consiste en: embrión, merlstemo, cotiledón, polen, hoja, antera, raíz, punta de la raíz, pistilo, flor y semilla.

12.- La planta de melón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque es endogámica.

13.- La planta de melón de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque es un híbrido.

14.- Un método para determinar el genotipo de la planta de la reivindicación 1 que comprende: obtención de una muestra de ácidos nucleicos de dicha planta y detección en dichos ácidos nucleicos de una pluralidad de polimorfismos.

15.- Un método de identificación de una planta de melón que exhibe resistencia al virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) y al virus del mosaico de la sandía (WMV); dicho método comprende: la detección de al menos un alelo de una marcador asociado a la resistencia a WMV y ZYMV en una primera planta de melón, en la que el marcador se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 centiMorgans (cM) del marcador NU0219106 o NU0219710 en el cromosoma 11 del melón.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el marcador se ubica en un intervalo cromosómico definido por los marcadores terminales NU0219106 y NU0219710 del cromosoma 11 de melón y que los incluye.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el marcador se ubica en un intervalo cromosómico definido por los marcadores terminales NCMEL00838077 y NU0NU0220333 del cromosoma 11 de melón y que los incluye.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el marcador es seleccionado del grupo que consiste en NU0219106, NU0218916, NU0219099, NU0218656, NCMEL008383076, NCMEL008383077, NU0218779, NCMEL008383075, NCMEL008383078, NU0220333, NU0219293, NU0218835, NU0244142 y NU0219710.

19.- Un método de identificación de una planta de melón que exhibe resistencia al virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV); dicho método comprende: la detección de al menos un alelo de una marcador asociado a la resistencia ai ZYMV en una primera planta de melón, en la que el marcador se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 2 centiMorgans (cM) del marcador NU0218531 en el cromosoma 2 del melón.

20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el marcador se ubica en un intervalo cromosómico definido por los marcadores terminales CMBR041 y NU0218531 del cromosoma 2 de melón y que los incluye.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el marcador es seleccionado del grupo que consiste en CMBR041 y NU0218531.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el método comprende adlcionalmente la detección de al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia al CMV y al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia a WMV y ZYMV.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque se detecta al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia al CMV en la planta de melón en un intervalo cromosomal definido por los extremos NU0243358 y NU0218323 en el cromosoma 12 de melón y que los incluye, o en el que el marcador se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM de los marcadores NU0243358 o NU0218323.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque se detecta al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia al CMV en la planta de melón en un Intervalo cromosomal definido por los extremos NU0219184 y NU0218323 en el cromosoma 12 de melón y que los incluye, o en el que el marcador se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM de los marcadores NU0219184 o NU0218323.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque se detecta al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia al CMV en la planta de melón en un Intervalo cromosomal definido por los extremos NU0220476 y NU0219006 en el cromosoma 2 de melón y que los Incluye, o en el que el marcador se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM de los marcadores NU0220476 o NU0219006.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque se evalúa la resistencia mediante la exposición de la planta a WMV o ZYMV, y la identificación de plantas con expresión reducida de síntomas de enfermedad respecto a las plantas de control.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la detección comprende la detección de al menos una forma alélica de un polimorfismo de nucleótldo simple mediante PCR, análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante, análisis de polimorfismo de longitud de fragmento de escisión, ensayo TaqMan y/o secuendación de ADN.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque se encuentra al menos un alelo de un marcador asociado a la resistencia a WMV o ZYMV en la línea ME8094 de melón, de la que se depositó una muestra representativa de semilla con el número de acceso NCIMB 41653.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque comprende adlcionalmente la selección de la primera planta de melón de una población de plantas de melón con base en la presencia de dicho alelo de un marcador asociado a la resistencia a ZYMV o WMV.

30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende adicionalmente cruzar una primera planta de melón seleccionada con una segunda planta de melón para obtener una planta de progenie de una generación posterior.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende adicionalmente el retrocruzamiento de la planta de progenie de una generación posterior y al menos una generación posterior adicional de ella con un progenitor recurrente hasta que se produzca una planta de progenie retrocruzada que comprenda resistencia a WMV o ZYMV.

32.- Un método para producir una planta de melón con resistencia a WMV y ZYMV que comprende las etapas de: (a) cruzamiento de una planta de línea ME8094 de melón, o de una progenie de ella que comprende resistencia a WMV y ZYMV derivada de dicha línea ME8094, con una segunda planta de melón con al menos un rasgo deseado, de la que se depositó una muestra representativa de semilla con el número de acceso NCIMB 41653 y (b) selección de al menos una primera progenie de planta de melón que resulta del cruzamiento que comprende resistencia a WMV y ZYMV, y al menos un rasgo deseado.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque el rasgo deseado se selecciona del grupo que consiste en: una relación ancho/largo de al menos 0,5, color de pulpa naranja, grado Brix > 9,5 °Bx, resistencia al CMV, resistencia al MNSV, resistencia al PRSV y resistencia al oídio.

34.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la selección de la primera progenie comprende la identificación de la presencia de al menos un primer marcador genético en la primera progenie genéticamente ligada a un locus que contribuye a la resistencia a WMV, ZYMV o CMV, en la que se mapea el marcador genéticamente ligado a un locus que contribuye a la resistencia a WMV o ZYMV en el cromosoma 11 y en la que se mapea un marcador genéticamente ligado a un locus que contribuye a la resistencia a CMV en el cromosoma 12.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque la selección de la primera progenie comprende adicionalmente la selección de la progenie con base en la presencia de una variedad de marcadores genéticos de la segunda planta de melón presente en la progenie.

36.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el marcador genético ligado a un locus que contribuye a la resistencia a WMV o ZYMV se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM del marcador NU0219106 o NU0219710 en el grupo de ligamiento 11 del melón.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el marcador genético ligado a un locus que contribuye a la resistencia a CMV se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM del marcador NU0243358 o NU0218323 en el grupo de ligamiento 12 del melón.

38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque el marcador genético es seleccionado del grupo que consiste en: NU0219184, NU0219714, NU0220980, NU0243527, NU0220836, NU0218164, NU0218516, NU0218074, NU0218603 y NU0220144.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el marcador genético ligado a un locus que contribuye a la resistencia a CMV se encuentra genéticamente ligado en un intervalo de 10 cM del marcador NU0220476 o NU0219006 en el grupo de ligamiento 2 del melón.

40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque el marcador genético es seleccionado del grupo que consiste en: NU0218624, NU0219047, NU0220488 y NU0220264.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque el marcador genético ligado a un locus que contribuye a la resistencia a WMV o ZYMV es NU0218656, NCMEL008383076, NCMEL008383077, NCMEL008383075, NCMEL008383078 o NU0218779.

42.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque comprende adicionalmente la etapa de: (c) cruzamiento de la planta de progenie consigo misma o con una tercera planta para producir una planta de progenie de una generación posterior.

43.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque comprende adicionalmente la etapa de: (d) cruzamiento de la planta de progenie de una generación posterior consigo misma o una segunda planta y; (e) repetición de las etapas (c) y (d) por al menos 3 a 10 generaciones adicionales para producir una planta de melón endogámica derivada de la línea ME8094 de melón, de la que se depositó una muestra representativa de semilla con el número de acceso NCIMB 41653.

44.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque dicha planta de progenie de una generación posterior es seleccionada para cruzamiento con base en la presencia de resistencia a WMV o ZYMV, y el rasgo deseado.

45.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque dicha planta de progenie de una generación posterior es seleccionada en cada generación para cruzamiento con base en la presencia de resistencia a WMV o ZYMV, y el rasgo deseado.

46.- El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado además porque la selección de la planta de progenie de una generación comprende identificar la presencia de al menos un primer marcador genético en la primera progenie que se encuentra genéticamente ligado a un locus que contribuye a la resistencia a WMV y ZYMV.

47.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque la selección de la planta de progenie de una generación posterior comprende adicionalmente la selección de la progenie con base en la presencia de una variedad de marcadores genéticos de la segunda planta de melón presente en la progenie.

48.- El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque se repite la etapa (e) una cantidad suficiente de generaciones para obtener una planta de melón endogámica que comprende resistencia a WMV y ZYMV, y que comprende adicionalmente los rasgos agronómicos de la segunda planta de melón.

49.- Una planta de melón, o una parte de esta, producida mediante el método de la reivindicación 48.

50.- Una parte de una planta de melón de la reivindicación 49, en la cual la parte es seleccionada del grupo que consiste en: un fruto, una hoja, una raíz, un tallo, polen, un óvulo, una célula y una semilla.

51.- Una semilla de melón híbrida producida mediante el método de la reivindicación 48.

52.- Una semilla de melón definida como producida por un método que comprende: el cruzamiento de la variedad ME8094, de la que se depositó una muestra representativa en NCIMB, Aberdeen, Escocia, con el número de acceso NCIMB 41653, o una progenie de ella, con una segunda variedad de melón, la detección del genotipo o fenotipo de resistencia a virus de una planta de progenie de una generación posterior y la cosecha de semillas de ella.

53.- Una semilla de melón endogámica de la línea ME8094, de la que se depositó una muestra representativa en NCIMB con el número de acceso 41653.

54.- Una planta cultivada a partir de la semilla de la reivindicación 53.

55.- Una parte de la planta de la reivindicación 54.

56.- La parte de la planta de la reivindicación 55, caracterizada además porque dicha parte es seleccionada del grupo que consiste en: un fruto, una hoja, una raíz, un tallo, polen, un óvulo, una célula y una semilla.

57.- Una planta de melón, o una parte de ella, con todas las características fisiológicas y morfológicas de la planta de melón de la reivindicación 54.

58.- Un cultivo tisular de células de la planta de la reivindicación 54 que pueden regenerarse.

59.- La planta de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada además porque comprende adicionalmente una conversión de un locus simple.

60.- La planta de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada además porque comprende adicionalmente una transgén.

61.- Un método para producir semillas de melón, el cual comprende el cruzamiento de la planta de la reivindicación 54 consigo misma o una segunda planta de melón.

62.- Una semilla híbrida F1 producida mediante el método de la reivindicación 61.

63.- Una planta híbrida F1 producida mediante el cultivo de la semilla de la reivindicación 62.

64.- Un método de propagación vegetativa de una planta de melón que comprende las etapas de: (a) recolección de tejido capaz de ser propagado a partir de una planta de la reivindicación 54, (b) el cultivo de dicho tejido para obtener brotes proliferados y (c) enraizar dichos brotes proliferados para obtener plántulas enraizadas.

65.- El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque comprende adicionalmente cultivar plantas de dichas plántulas enraizadas.