TW200846358A - HtrA1-PDZ and HtrA3-PDZ modulators - Google Patents

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200846358 九、發明說明： 【先前技術】 PDZ域為常見模組化蛋白質域，其藉由以序列特異性方 式與其生物搭配物之C-末端結合或在一些情況下與内部髮 夾形基元結合來介導多種特異性蛋白質-蛋白質相互作用 (Sheng， Μ·及 Sala， C. (2001) Annual Review of 24(1)，1-29)。PDZ域對其配位體之特異性最 初基於位置-2(使用標準化PDZ配位體命名法，其中C末端 φ 指定為殘基〇且以絕對值朝N末端增加之負整數對其餘殘基 編號）上Ser/Thr殘基（I型）或疏水性殘基（Π型）之存在分為兩 類。更多最近研究已提示PDZ域選擇性之決定子更複雜， 其中結合決定子可能由3至6個C-末端配位體殘基構成。舉 例而言 ’ Erbin-PDZ之結合概況極具特異性 ([D/E][T7S]WVC00H)且ZO卜PDZ1之結合概況類似 ([R/K/S/T][T/S][W/Y][V/I/L]C00H)，但對最後四個配位體 殘基中之三個展現增加之混亂性。Erbin-PDZ與ZOl-PDZl φ 亦使用調節結合親和力之位置-3之上游的輔助性配位體相 互作用（Appleton，Β· A·，Zhang，Y·，Wu，P·，Yin，J. P·， Hunziker，W·，Skelton，N. J·，Sidhu，S. S·&Wiesmann，C· (2006) J. 5沁/· Ckm. 281(31)，22312-22320)。此外，特異 性蛋白質-蛋白質相互作用對該等含PDZ蛋白質之生物功能 而言很重要（Zhang，Y,，Yeh，S·，Appleton，Β· A·，Held，H. A·，Kausalya，P. J·, Phua，D. C. Y·，Wong，W· L·，Lasky，L· A·，Wiesmann，C·，Hunziker，W·及 Sidhu，S· S. (2006) J. 128788.doc 200846358 5ζ·Μ· CTzem·，281(31): 22299-311)。

在人類中，絲胺酸蛋白酶之Htr A家族具有四個與細菌高 溫要求 A蛋白酶（high-temperature requirement A protease, Htr A)具有廣泛同源性之已知成員。在正常溫度條件下此 細菌蛋白酶充當伴隨蛋白質，且其對在蛋白質水解功能介 導變性蛋白質降解之高溫下之存活至關重要。雖然所有人 類HtrA蛋白質共有同源胰蛋白酶樣絲胺酸蛋白酶（serine protease，SP)域及 C-末端 PDZ域，但 HtrAl 及 HtrA3 在 N-末 端區中亦含有分泌信號序列以及胰島素樣生長因子結合蛋 白質域及Kazal型SP抑制劑域。HtrAl最初鑑別為用致癌病 毒SV40轉染後在人類纖維母細胞系中受到下調之基因 (Zumbrunn, J.ATrueb, B. (1996) FEES Lett 398(2-3), 187-192)。此後，HtrAl牽涉於多種惡性腫瘤中。與正常組織 相比，HtrAl在癌瘤中受到下調，且過度表現使得腫瘤生 長及增生受到抑制（Baldi，A·，De Luca，A·，Battista，T·， Felsani，A,，Baldi，F·，Catricala，C·，Amantea，A·，Noonan， D. M·，Albini，A·，Natali，P. G·，Lombardi，D·及 Paggi，M. G· (2002) 21(43)，6684-6688)。相反，HtrAl在骨關 節炎關節之軟骨中受到上調且可造成發展出此類及其他關 節炎疾病（Hu，S.-I·，Carozza，M·，Klein，M·，Nantermet，P·， Luk，D·及 Crowl，R. (1998) «/.召/〇/· CAem. 273(51)， 34406-34412)。HtrAl亦牽涉於澱粉樣前驅蛋白質加工中 (Grau，S·, Baldi，A·，Bussani，R·，Tian，Χ·5 Stefanescu，R·， Przybylski，M·，Richards, P·，Jones，S. A·，Shridhar，V·， 128788.doc 200846358

Clausen，Τ·及 Ehrmann，Μ· (2005) PAMS 102(17)，6021-6026) ’且因此可在阿兹海默氏病（Alzheimer’s disease)中 起作用。最近，已在患有導致HtrAl表現增加之濕型年齡 相關黃斑變性的患者中鑑別出HtrAl之啟動子區中之單核 苷酸多態現象，從而證實HtrAl在該疾病之發病機理中之 關鍵作用（DeWan，A·，Liu，M·，Hartman，S·，Zhang，S.S·-

M·，Liu，D. T. L·，Zhao，C·，Tam，Ρ· 0· S·，Chan，W. M·， Lam, D. S. C·，Snyder，M,，Barnstable，C·，Pang，C. P·及 Hoh, J. (2006) Science 314(5801), 989-992 ； Yang, Z., Camp，N. J·，Sun，H.，Tong，Z·，Gibbs，D·，Cameron，D. J·， Chen，H,，Zhao，Y·，Pearson，E·，Li，X·，Chien，J·，DeWan， A·，Harmon，J·，Bernstein, P. S·，Shridhar，V·，Zabriskie，N. A.，Hoh，J·，Howes，K.及 Zhang，K. (2006) iSc/ence 314(5801)，992-993)。HtrA3在胎盤發育中起作用（Nie等 人，Biol Reprod· 2006年 2月；74(2):366-74)且與 HtrAl — 起亦牵涉於子宮内膜癌中（Bowden等人，Gynecol Oncol. 2006年 10月；103(1):253-60)。 已展示HtrAl在小鼠中與TGF-β家族蛋白質結合且提出 其介導TGF-β信號轉導之抑止（Oka，C.，Tsujimoto，R.， Kajikawa，M·，Koshiba-Takeuchi，K·，Ina，J·，Yano，M·， Tsuchiya，A.，Ueta，Y·，Soma，A·，Kanda，H，，Matsumoto，M· 及 Kawaichi，M. (2004) Deve/opmeni 131(5)，1041-1053)。 雖然TGF-β抑止依賴於HtrAl之蛋白酶活性，但PDZ域似乎 在調控蛋白酶活性中起直接作用。來源於TGF-β家族成員 128788.doc 200846358 之C-末端之肽（諸如Col3al)與HtrAl之PDZ域結合且刺激蛋 白酶活性（Murwantoko，Yano，M·，Ueta，Y·，Murasaki，A·， Kanda，H·，Oka，C·及 Kawaichi，Μ. (2004)价oc/zem /381(第 3部分），895-904)。Hti*A3亦展示可比蛋白酶及TGF-β信號 抑制活性（Tocharus，J·，Tsuchiya，A·，Kajikawa，M·，Ueta， Y·，Oka，C.及 Kawaichi，M_ (2004) Growth and Differentiation 25Ί-2Ί。 上述歸因於HtrAl及HtrA3之重要分子功能，尤其彼等經 由HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ與配位體之間的蛋白質-蛋白 質相互作用所介導之功能提示HtTAl PDZ及HtrA3 PDZ域 代表重要治療標靶。因此，將有利地闡明配位體與HtrAl 或HtrA3 PDZ域之間的相互作用之機制態樣且提供靶向調 節其相關功能活性之組合物及方法。本發明提供該益處及 其他益處。 【發明内容】 本發明提供用於調節HtrAl及HtrA3蛋白質中每—者之 PDZ域之活性的組合物及使用該等組合物之方法。由於與 HtrA1及HtrA3相關之重要功能，因此本發明之組合物及方 法存在顯著的臨床及治療實用性。本發明部分基&係、 HtrAl PDZ域及HtrA3 PDZ域之結合搭配物（配位體）之 >析 及表徵，該分析產生如本文所述之新穎及意外之結果。 兩群針對HtrAl PDZ域及HtrA3 PDZ域中每一者夕 位體獨立地由噬菌體呈現文庫產生，其中與M13 胃 之C-末端或Ν-末端融合之肽代表需要游離羧基之狀# ^ + 128788.doc 200846358 及不需要游離叛基之肽結合子。本文描述包含游離魏基末 端或不包含游離羧基末端之HtrA1 PDZ域或HtrA3 PDZ域 之肽配位體。該等結果證明，不同於需要具有游離羧基末 端以能夠與PDZ結合之大多數其他PDZ域之配位體，一組 HtrAl PDZ域配位體及HtrA3 PDZ域配位體分別能夠在無 游離羧基末端之情況下與HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域結 合。無游離羧基末端之配位體代表作為多肽之N末端或内 部序列之N-末端及/或内部HtrAl PDZ域配位體或HtrA3 PDZ域配位體序列。 如下所述，藉由量測一系列肽配位體之相對親和力評估 其結合特異性。對例示性肽配位體之個別殘基進行丙胺酸 掃描分析以闡明各配位體位置處不同殘基之能量貢獻。亦 進行分子建模以使特定例示性配位體與HtrAl PDZ域及 HtrA3 PDZ域中之每一者對接以基於結構進一步評估結合 特異性。亦使用基於噬菌體之組合掃描法來鑑別HtrAl PDZ域中在能量上有助於配位體PDZ相互作用之殘基，從 而提供關於HtrAl PDZ域與其配位體相互作用之結構及能 量組分之進一步洞察。 在一實施例中，本發明提供與HtrAl PDZ域特異性結合 之分離多肽，其中多肽包含在相對於C-末端之位置-2處具 有色胺酸之序列。在一態樣中，多肽進一步在位置〇處包 含小胺基酸。在另一態樣中，位置0處之胺基酸係選自白 胺酸及纈胺酸。在另一態樣中，多肽進一步在位置-1處包 含包括大體積側鏈之胺基酸。在另一態樣中，位置-1處之 128788.doc -10- 200846358 胺基酸係選自色胺酸、異白胺酸及苯丙胺酸。在另一態樣 中，位置-1處之胺基酸為色胺酸。在另一態樣中，多肽在 位置-3處進一步包括蘇胺酸或異白胺酸。在另一態樣中， 位置-4處之胺基酸帶電。在另一悲樣中，位置-4處之胺基 酸係選自麩胺酸、離胺酸、精胺酸及天冬胺酸。在另一態 樣中，位置-4處之胺基酸係選自離胺酸及精胺酸。 在另一實施例中，本發明提供與HtrAl PDZ域特異性結 合之分離多肽，其中相對於C-末端之位置0處之胺基酸係 選自白胺酸及纈胺酸；其中位置-1處之胺基酸係選自色胺 酸、異白胺酸及苯丙胺酸；其中位置-2處之胺基酸為色胺 酸；其中位置-3處之胺基酸係選自蘇胺酸及異白胺酸；且 其中位置-4處之胺基酸係選自麩胺酸、離胺酸、精胺酸及 天冬胺酸。在一態樣中，位置0處之胺基酸為白胺酸；位 置-1處之胺基酸為色胺酸；位置-3處之胺基酸係選自蘇胺 酸及異白胺酸；且位置-4處之胺基酸係選自離胺酸及精胺 酸。 在另一實施例中，本發明提供與HtrAl PDZ域特異性結 合之分離多肽，其中多肽包含選自表1中所列出之HtrAl PDZ域結合肽之序列的序列。在一態樣中，多肽包含序列 DIETWLL(SEQ ID NO: 3)、GWKTWIL(SEQ ID NO: 4)、 DSRIWWV(SEQ ID NO: 5)或 WDKIWHV(SEQ ID NO: 6)。 在一態樣中，多肽包含序列DSRIWWV(SEQ ID NO: 5)。 在另一實施例中，本發明提供與HtrAl PDZ域特異性結 合之分離多肽，其中多肽直接與至少一個特異性HtrAl- 128788.doc 11 200846358 PDZ域殘基相互作用。在一態樣中，分離多肽之C-末端羧 酸酯基與至少一個選自Ile383、Ile385及Gly384之HtrAl PDZ域殘基配位。 在另一態樣中，分離多肽之位置-1處之胺基酸與至少一 個選自Tyr382、Arg386及Ile418之HtrAl PDZ域殘基動態相 互作用。在另一態樣中，分離多肽之位置-2處之色胺酸與 至少一個選自 Ala445、Met387及 Gln446之 HtrAl PDZ域殘 基相互作用。在另一態樣中，分離多肽之位置-3處之胺基 酸與至少一個選自Ile415及Arg386之HtrAl PDZ域殘基相 互作用。在另一態樣中，分離多肽與至少一個選自 Tyr382、Ile383、Gly384、Met387 及 S389 之 HtrAl PDZ域 殘基相互及/或配位。 在另一實施例中，本發明提供與HtrAl PDZ域特異性結 合之分離多肽，其中多肽包含在相對於酸性胺基酸之位 置-2處具有色胺酸之序列。在一態樣中，多肽包含式XI-X2-W-X3-X4之序列，其中XI係選自纈胺酸及白胺酸；其 中X2係選自絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、丙胺酸及纈胺酸； 其中X3係選自甘胺酸、絲胺酸、苯丙胺酸及白胺酸；且其 中X4為酸性胺基酸。在另一態樣中，X3為甘胺酸及X4係 選自麩胺酸及天冬胺酸。 在另一實施例中，本發明提供與HtrAl PDZ域特異性結 合之分離多肽，且其包含包括選自表1、2及3中所列出之 胺基酸序列之肽的胺基酸序列的C-末端、N-末端或内部胺 基酸序列。在一態樣中，C末端胺基酸序列係選自 128788.doc -12· 200846358 DIETWLL(SEQ ID NO: 3)、GWKTWIL(SEQ ID NO: 4)、 DSRIWWV(SEQ ID NO: 5)及 WDKIWHV(SEQ ID NO: 6) 〇 在另一實施例中，本發明提供包含與任何上述多肽競爭 結合HtrAl PDZ域之胺基酸序列的分離多肽。在另一實施 例中，本發明提供與任何上述多肽結合HtrAl PDZ域上同 一抗原決定基之分離多肽。 在另一實施例中，本發明提供變異HtrAl PDZ域。在一 態樣中，提供包含HtrAl PDZ變異序列之分離多肽，其中 • 至少一個選自以下各殘基之HtrAl PDZ域殘基係經另一胺 基酸取代：Ile383、Ile385、Gly384、Tyr382、Arg386、 Ile418、Ala445、Met387、Gln446、Ile415、Arg386、 Ser389、Lys380、Lys381、G1411、Tyr413、Ile414、 Val417、Thr421 及 Pi*o422。在另一態樣中，Ile418 係經另 一胺基酸取代。在另一態樣中，該另一胺基酸為丙胺酸。 在另一實施例中，本發明提供包含與任何上述Htr A1 PDZ域變異體競爭結合HtrAl PDZ域之配位體之胺基酸序 _ 列的分離多肽。在另一實施例中，本發明提供與任何上述 HtrAl PDZ域變異體結合HtrAl PDZ域之配位體上同一抗 原決定基之分離多肽。 在另一實施例中，本發明提供使用上述HtrAl PDZ域變 異體多肽及HtrAl PDZ域結合多肽之方法。在一態樣中， 本發明提供鑑別能夠調節HtrAl PDZ域-配位體相互作用之 化合物之方法，其包含使包含HtrAl PDZ域、HtrAl PDZ 域之片段及/或其功能等效物及至少一種上述HtrAl PDZ域 128788.doc •13- 200846358 結合多肽之樣品與候選化合物接觸，及㈣與不存在候選 化合物之情況下相比’存在候選化合物之情況™】 PDZ域-配位體相互作用之量；由 田此與在不存在候選化合物

之情況下之量相比，存在候選仆人 、 甘隹佚&化合物之情況下HtrAl PDZ 域-配位體相互作用之量的變化表 夂κ衣明候選化合物為能夠調 節HtrAl PDZ域-配位體相互作用之化合物。

在另-態樣中，本發明提供合理設計取域·配位 體相互作用之調節劑之方法，其包含設計調節劑以包含或 模擬位於相對於C·末端或相對於肽中之酸性殘基之位置^ 處之色胺酸的功能，其中該調節劑能夠與HtrAi 域特 異性結合。在一態樣中，肽係位於羧基末端。在另一態樣 中，位置0處之胺基酸係選自白胺酸及纈胺酸，位置處 之胺基酸係選自色胺酸、異白胺酸及苯丙胺酸，位置_3處 之胺基酸係選自蘇胺酸及異白胺酸，且位置_4處之胺基酸 係選自麩胺酸、天冬胺酸、離胺酸及精胺酸。在另一態樣 中’位置0處之胺基酸係選自白胺酸及纈胺酸，位置_丨處 之胺基酸為色胺酸，位置_3處之胺基酸係選自蘇胺酸及異 白酸’且位置_4處之胺基酸係選自麩胺酸及天冬胺酸。 在另一態樣中，本發明提供治療與HtrAl蛋白質活性之 調控異常相關之病理學病狀的方法，其包含向有需要之個 體投與有效量之上述HtrAl PDZ域配位體。在另一態樣 中’本發明提供治療與HtrAl蛋白質活性之調控異常相關 之病理學病狀的方法，其包含向有需要之個體投與有效量 之HtrAl PDZ域-配位體調節劑，其中該調節劑能夠調節 128788.doc -14- 200846358

HtrAl PDZ域與任何上述HtrAl PDZ域結合多肽之間的相 互作用。在另一態樣中，本發明提供治療與HtrA1蛋白質 活性之調控異常相關之病理學病狀的方法，其包含向有需 要之個體投與有效量之上述變異HtrA1 pDZ域多肽，其中 該變異HtrAl PDZ域多肽能夠調節HtrA1 pDZ域與mrAi PDZ域配位體之間的相互作用。在某些態樣中，調節為抑 制HtrAl PDZ域與配位體之間的相互作用。在某些態樣 中，調節為增強HtrAl PDZ域與配位體之間的相互作用。 ♦ 在某些態樣中，病理學病狀係選自惡性及良性腫瘤或癌 症、非白血病及淋巴樣惡性疾病、神經退化性病症、發炎 性及免疫病症及眼内新血管疾病。在某些態樣中，病理學 病狀係選自癌症（包括（但不限於）卵巢癌及子宮内膜癌）、 阿茲海默氏病、類風濕性關節炎及年齡相關（濕型）黃斑變 性。 在另一悲樣中，本發明提供治療與Htr A丨蛋白質活性之 調控異常相關之病理學病狀的方法，其包含向有需要之個 籲體投與有效量之任何上述HtrAl PDZ域結合蛋白質與^^八！ PDZ域之相互作用的促效劑。在另一態樣中，本發明提供 ✓口療與HtrAl蛋白質活性之調控異常相關之病理學病狀的 方法，其包含向有需要之個體投與有效量之任何上述 HtrAl PDZ域結合蛋白質與HtrAl pDZ域之相互作用的拮 抗劑。在某些態樣中，病理學病狀係選自惡性及良性腫瘤 或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病、神經退化性病症、 發炎性及免疫病症及眼内新血管疾病。在某些態樣中，病 128788.doc -15- 200846358 理學病狀係選自癌症（包括（但不限於）卵巢癌及子宮内膜 癌）、阿茲海默氏病、類風濕性關節炎及年齡相關（濕型）黃 斑變性。 在另一實施例中，本發明提供使用一或多種上述多肽、 聚核苷酸及/或抗體偵測樣品中HtrAl或HtrAl PDZ域之存 在、量或功能的方法。 在一實施例中，本發明提供與HtrA3 PDZ域特異性結合 之分離多肽，其中多肽包含在相對於C-末端之位置-1處具 有色胺酸之序列。在一態樣中，多肽具有整體疏水性特 徵。在另一態樣中，多肽進一步在位置0處包含選自纈胺 酸、異白胺酸及丙胺酸之胺基酸。在另一態樣中，多肽進 一步在位置-3處包含選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸。在另 一態樣中，位置0處之胺基酸係選自纈胺酸、異白胺酸及 丙胺酸；且其中位置-3處之胺基酸係選自甘胺酸及絲胺 酸。在另一態樣中，位置0處之胺基酸為纈胺酸；且位置-3處之胺基酸係選自甘胺酸及絲胺酸。 在另一實施例中，本發明提供與HtrA3 PDZ域特異性結 合之分離多肽，其中多肽包含選自表1及表3中所列出之 HtrA3 PDZ域結合肽之序列的序歹。在一態樣中，多肽包 含序列 PGRWV(SEQ ID NO: 7)、SGKGIWV(SEQ ID NO: 8)、GFWV(SEQ ID NO: 9)、IFDGRWI(SEQ ID NO: 10)、 FGRWV(SEQ ID NO: 11)、RSWWV(SEQ ID NO: 12)、 FGRWI(SEQ ID NO: 13)、FGRWL(SEQ ID NO: 14)、 GRWV(SEQ ID NO: 15)、WV，FLRWV(SEQ ID NO: 16)、 128788.doc -16- 200846358 FERWV(SEQ ID NO: 17) - FYRWV(SEQ ID NO: 18)、 FGAWV(SEQ ID NO: 19)及 FARWV(SEQ ID NO: 20)。在一 態樣中，多肽包含序列FGRWV(SEQ ID NO: 11)。 在另一實施例中，本發明提供與Hti*A3 PDZ域特異性結 合之分離多肽，其中多肽直接與至少一個特異性HUA3-PDZ域殘基相互作用。在一態樣中，HtrA3 PDZ域結合多 肽之C-末端羧酸酯基與至少一個選自Phe356、Ile357及 Gly35 8之HtrA3 PDZ域殘基配位。在另一態樣中，HtrA3 PDZ域結合多肽之位置-1處之色胺酸與至少一個選自 Glu390及Ala392之HtrA3 PDZ域殘基相互作用。在另一態 樣中，HtrA3 PDZ域結合多肽之位置-2處之胺基酸與HtrA3 PDZ域殘基Gln423相互作用。在另一態樣中，HtrA3 PDZ 域結合多肽之位置-3處之胺基酸與HtrA3 PDZ域殘基 Arg360相互作用。在另一態樣中，HtrA3 PDZ域結合多肽 與至少一個選自 Phe356、Ile357、Gly358、Glu390、 Ala392、Gln423及Arg3 60之HtrA3 PDZ域殘基相互作用及/ 或配位。 在另一實施例中，本發明提供與HtrA3 PDZ域特異性結 合之分離多肽，其中多肽包含在一或多個疏水性殘基之後 具有保守酸性殘基之序列。在一態樣中，多肽包含序列 WVL。在另一態樣中，多肽包含序列GVVVDEWMLSLL (SEQ ID NO: 21)、GVVVDEWVLSLL(SEQ ID NO: 22)、 ELLVDGYVLELL(SEQ ID NO: 23)或 GVVVNEWVLSLL (SEQ ID NO: 24)。 128788.doc 17 200846358 在另一實施例中，本發明提供與HtrA3 PDZ域特異性結 合之分離多肽，其中多肽包含選自表2中所列出之HtrA3 PDZ域結合序列之序列。 在另一實施例中，本發明提供與HtrA3 PDZ域特異性結 合之分離多肽，且其包含包括選自表1、2及3中所列出之 胺基酸序列之肽的胺基酸序列的C-末端、N-末端或内部胺 基酸序列。在一態樣中，C-末端胺基酸序列係選自 PGRWV(SEQ ID NO: 7) ^ SGKGIWV(SEQ ID NO: 8)、 GFWV(SEQ ID NO: 9) ^ IFDGRWI(SEQ ID NO: 10)、 FGRWV(SEQ ID NO: 11)、RSWWV(SEQ ID NO: 12)、 FGRWI(SEQ ID NO: 13)、FGRWL(SEQ ID NO: 14)、 GRWV(SEQ ID NO: 15)、WV，FLRWV(SEQ ID NO: 16)、 FERWV(SEQ ID NO: 17) > FYRWV(SEQ ID NO: 18)、 FGAWV(SEQ ID NO: 19)及 FARWV(SEQ ID NO: 20)。 在另一實施例中，本發明提供包含與任何上述HtrA3 PDZ域結合多肽競爭結合Hti*A3 PDZ域之胺基酸序列的分 離多肽。在另一實施例中，本發明提供包含與任何上述 HtrA3 PDZ域結合多肽結合HtrA3 PDZ域上同一抗原決定 基之胺基酸序列的分離多肽。 在另一實施例中，本發明提供分離變異HtrA3 PDZ域多 肽。在一態樣中，分離多肽包含Htr A3 PDZ變異序列，其 中至少一個選自 Phe356、Ile357、Gly358、Glu390、 Ala392、Gln423 及 Airg360 之 HtrA3 PDZ域殘基係經另一胺 基酸取代。在另一態樣中，分離變異多肽之Glu390及/或 128788.doc -18- 200846358

Ala392係經另一胺基酸取代。在某些態樣中，該另一胺基 酸為丙胺酸。 在另一實施例中，本發明提供包含與任何上述變異 HtrA3 PDZ域多肽競爭結合HtrA3 PDZ域之配位體之胺基 酸序列的分離多肽。在另一實施例中，本發明提供與任何 上述變異HtrA3 PDZ域多肽結合HtrA3 PDZ域之配位體上 同一抗原決定基之分離多肽。 在另一實施例中，本發明提供使用上述HtrA3 PDZ域變 異多肽及HtrA3 PDZ域結合多肽之方法。在一態樣中，本 發明提供鑑別能夠調節HtrA3 PDZ域-配位體相互作用之化 合物之方法，其包含使包含HtrA3 PDZ域、HtrA3 PDZ域 之片段及/或其功能等效物及至少一種上述Hti:A3 PDZ域結 合多肽之樣品與候選化合物接觸，及測定與不存在候選化 合物之情況下相比，存在候選化合物之情況下，HtrA3 PDZ域-配位體相互作用之量；由此與在不存在候選化合物 之情況下之量相比，存在候選化合物之情況下HtrA3 PDZ 域-配位體相互作用之量的變化表明候選化合物為能夠調 節HtrA3 PDZ域-配位體相互作用之化合物。 在另一態樣中，本發明提供合理設計HtrA3 PDZ域-配位 體相互作用之調節劑之方法，其包含設計調節劑以包含或 模擬位於相對於C-末端之位置-1處或相對於肽中白胺酸之 位置-2處之色胺酸的功能，其中該調節劑能夠與HtrA3 PDZ域特異性結合。在另一態樣中，位置〇處之胺基酸係 選自纈胺酸、異白胺酸及丙胺酸，位置-1處之胺基酸為色 128788.doc -19- 200846358 胺酸，且位置-3處之胺基酸係選自甘胺酸及絲胺酸。在另 一態樣中，位置0處之胺基酸為纈胺酸，位置-1處之胺基 酸為色胺酸，且位置-3處之胺基酸係選自甘胺酸及絲胺 酸。在另一態樣中，調節劑包含胺基酸序列WVL。 在另一態樣中，本發明提供治療與Htr A3蛋白質活性之 調控異常相關之病理學病狀的方法，其包含向有需要之個 體投與有效量之上述HtrA3 PDZ域配位體。在另一態樣 中，本發明提供治療與Htr A3蛋白質活性之調控異常相關 之病理學病狀的方法，其包含向有需要之個體投與有效量 之HtrA3 PDZ域-配位體調節劑，其中該調節劑能夠調節 HtrA3 PDZ域與任何上述HtrA3 PDZ域結合多肽之間的相 互作用。在另一態樣中，本發明提供治療與Htr A3蛋白質 活性之調控異常相關之病理學病狀的方法，其包含向有需 要之個體投與有效量之上述變異HtrA3 PDZ域多肽，其中 該變異Htr A3 PDZ域多肽能夠調節Htr A3 PDZ域與Htr A3 PDZ域配位體之間的相互作用。在某些態樣中，調節為抑 制Htr A3 PDZ域與配位體之間的相互作用。在某些態樣 中，調節為增強HtrA3 PDZ域與配位體之間的相互作用。 在某些態樣中，病理學病狀係選自惡性及良性腫瘤或癌 症、非白血病及淋巴樣惡性疾病及胎盤功能障礙。在某些 態樣中，病理學病狀為癌症（包括（但不限於）子宮内膜 癌）。 在另一態樣中，本發明提供治療與Htr A3蛋白質活性之 調控異常相關之病理學病狀的方法，其包含向有需要之個 128788.doc -20- 200846358 體投與有效量之任何上述HtrA3 PDZ域結合蛋白質與HtrA3 PDZ域之相互作用的促效劑。在另一態樣中，本發明提供 治療與Htr A3蛋白質活性之調控異常相關之病理學病狀的 方法，其包含向有需要之個體投與有效量之任何上述 HtrA3 PDZ域結合蛋白質與HtrA3 PDZ域之相互作用的拮 抗劑。在某些態樣中，病理學病狀係選自惡性及良性腫瘤 或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病及胎盤功能障礙。在 某些態樣中，病理學病狀為癌症（包括（但不限於）子宮内膜 癌）。 在另一實施例中，本發明提供使用一或多種上述多肽、 聚核苷酸及/或抗體偵測樣品中HtrA3或HtrA3 PDZ域之存 在、量或功能的方法。 在另一實施例中，本發明提供編碼任何上述HtrAl PDZ 域結合多肽、HtrA3 PDZ域結合多肽、變異HtrAl PDZ域 或變異HtrA3 PDZ域分離聚核苷酸或其互補序列。在另一 實施例中，本發明提供包含一或多種該等聚核苷酸之載 體。在另一實施例中，本發明提供包含一或多種該等載體 之宿主細胞。在另一實施例中，本發明提供製造多肽之方 法，其包含在聚核苷酸得以表現之條件下培養該等宿主細 胞及視情況回收及/或純化多肽。在另一實施例中，本發 明提供表現一或多種該等聚核苷酸之轉殖基因非人類哺乳 動物。在一態樣中，該轉殖基因非人類哺乳動物進一步具 有至少一個經不活化HtrAl或HtrA3基因。 在另一實施例中，本發明提供與上述HtrAl PDZ域結合 128788.doc -21 - 200846358 多肽、HtrA3 PDZ域結合多肽、變異HtrAl PDZ域或變異 HtrA3 PDZ域中之一或多者特異性結合之抗體。在另一實 施例中，本發明提供包括一或多種本發明之分子之套組。 在一態樣中，該套組包含上述HtrAl PDZ域結合多肽、 HtrA3 PDZ域結合多肽、變異HtrAl PDZ域或變異HtrA3 PDZ域中之至少一者。在一態樣中，該套組包含至少一種 編碼上述HtrAl PDZ域結合多肽、HtrA3 PDZ域結合多 肽、變異HtrAl PDZ域或變異Hti*A3 PDZ域中之一者的分 # 離聚核苷酸。在另一態樣中，該套組包含至少一種與上述 HtrAl PDZ域結合多肽、HtrA3 PDZ域結合多肽、變異 HtrAl PDZ域或變異HtrA3 PDZ域中之至少一者特異性結 合的抗體。 【實施方式】 本發明提供能夠調節HtrAl或HtrA3蛋白質之PDZ域與其 細胞結合搭配物之間的結合相互作用的分子及鑑別及使用 該等分子的方法。在一態樣中，該等分子由使得鑑別出能 ® 夠以不同親和力與HtrAl PDZ或HtrA3 PDZ域結合之肽結 合子的組合方法產生。如本文所述，該等結合子分子之鑑 別及HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域與其各別結合搭配物之 間的結合相互作用之結構動力學進一步提供鑑別其他能夠 與HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域結合之調節劑之方法。鑒 於HtrAl及Htr A3在多種細胞及生理學過程中之重要性，因 此該等調節劑在（諸如）預防性、治療性及/或診斷性環境中 將具有顯著的實用性。 128788.doc -22- 200846358 一般技術 除非另有指示，否則本發明之實施將使用分子生物學 (包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學及免 疫學之習知技術，該等技術在此項技術之技術範疇内。該 等技術詳細解釋於以下文獻中，諸如’’Molecular Cloning: A Laboratory Manual”，第 2版，（Sambrook等人，1989); "Oligonucleotide Synthesis” （Μ· J· Gait 編，1984); ”Animal Cell Culture”（R· I· Freshney編，1987) ; "Methods in Enzymology” (Academic Press，Inc·) ; "Current Protocols in Molecular Biology”（F· M· Ausubel 等人編，1987 及週期 性更新）；”PCR: The Polymerase Chain Reaction"，（Mullis 4 人編 ’ 1994) ; "A Practical Guide to Molecular Cloning，， (Perbal Bernard V.? 1988) 〇 本發明中所使用或描述之募核苷酸、聚核苷酸、肽、多 肽及小分子可使用此項技術中已知之標準技術產生。 定義 當提及分子時"分離"係指已自其自然環境之組分中鑑別 出且分離及/或回收之分子 、一 〜刀丁 具目然％ i兄之 >可染物組分為 干擾診斷性或治療性使用之物質。 如本文所使用之"控制序列"為使得可操作性連接之編碼 :列此夠在特定宿主生物體中表現之dna序列。原核控制 序列包括啟動子、握价了 # 輛縱子序列及核糖體結合位點。直核 制序列包括啟動子、取脸Φ人 ”极控 ^ ΛΚ腺"示呤化信號及強化子。 Ϊ使核酸與另一核酸成及丨占 1序歹j處於功能關係中時，其為，，可 128788.doc -23- 200846358 :連接"。舉例而言，當啟動子或強化子影響序列之 轉料1其與編碼序料操作性連接，或當核糖體結合 位點經定位以有利於轉料，則其與編碼序列可摔作性連 接。"可操作性連接"通常意謂所連接之職序列田比鄰，且 在分泌性前導序歹彳& ,丨軎、、W T ^ 月J ¥斤幻之h兄下，田比鄰且在讀取相（㈣峋 phase)中。然而，強化子不必毗鄰。

活彳肽或其片段保留活性多狀之原生或天然存在之 對應物之生物活性。生物活性係指由活性多肽之原生或天 然存在之對應物介導之功能。舉例而言，結合或蛋白質一 蛋白質相互作用構成生物活性。 術語，，抗體”及”免疫球蛋白，，在廣義上可互換使用且包括 單株抗體（例如，全長或完整單株抗體）、多株抗體、多價 抗體、多特異性抗體（例如，雙特異性抗體，只要其展現 所要生物活性）且亦可包括某些抗體片段（如本文中更詳細 描述）。 任何脊椎動物物種之抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基 酸序列指定為稱為κ與λ之兩種明顯不同類型中之一種。 抗體（免疫球蛋白）視其重鏈之怪定域之胺基酸序列而定 可指定為不同種類。存在5種主要的免疫球蛋白種類： IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中數種可進一步分為亞 類（同型），例如IgG-1、IgG-2、IgA-1、IgA-2等。對應於 不同免疫球蛋白種類之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及 μ。不同種類之免疫球蛋白之亞單元結構及三維構形為吾 人所知且通常描述於（例如）Abbas等人，Cellular and Mol· 128788.doc -24 - 200846358

Immunology，第4版，（20〇〇)中。抗體可為由該抗體與一 或多種其他蛋自質或肽共價或非共價缔合所形成之較^融 合分子之部分。 抗體可為嵌合抗體、人類抗體、人化抗體及/或親和力 成熟抗體。 "抗體片段"僅包含完整抗體之一部分，&中該部分較佳 保留當存在於完整抗體中時通常與該部分相關之功能中之 至少種、較佳大多數或所有功能。 如本文所使用之術語”單株抗體”係指獲自大體上同源性 抗體之群體之抗體，亦即除可能少量存在之天然發生之突 變外，構成該群體之個別抗體一致。單株抗體具有針對單 一抗原之高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子 (抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑不同，各單株抗 體係針對抗原上之單一決定子。 本文之單株抗體尤其包括”嵌合"抗體，其中重鏈及/或輕 鏈之-部分與來源於特定物㈣屬於特定抗體種類或亞類 之抗體中的相應序列—致或同源，同時該或該等鏈之其餘 部分與來源於另-物種或屬於另—抗體種類或亞類之抗體 中的相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段，只要其 展現所要生物學活性即可（美國專利第4,816,567號；及 Morrison等人 ’ 夕以· 81685卜6855 (1984)) 〇 非人類（例如，鼠類）抗體之"人化，，形式為含有來源於非 人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。極大程度上，人 128788.doc -25- 200846358 化抗體為人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中接受者高變 區之殘基經具有所要特異性、親和力及容量之非人類物種 (供體抗體）（諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物）高 變區之殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之構架 區（FR)殘基經相應之非人類殘基置換。此外，人化抗體可 包含接受者抗體或供體抗體中不存在之殘基。進行該等修 飾以進一步改良抗體之效能。一般而言，人化抗體將包含 大體上所有至少一個且通常兩個可變域，其中所有或大體 上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環，且所有 或大體上所有FR為人類免疫球蛋白序列之fr。人化抗體 視情況亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區（Fc)，通常 為人類免疫球蛋白之恆定區。更多詳情，請參見J〇nes等 人 ’ Nature 321:522_525 (1986) ; Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)，及 Presta，Curr· Op. Struct. Biol 2:593-596 (1992)。亦參見下列回顧文章及其中所引用之來 考文獻：Vaswani及Hamilton，义默j//er幻;，乂⑽卿次 ImmunoL 1:105-1 15 (1998) ； Harris, Biochem, S〇〇, 23:1035-1038 (1995); Hurle 及 Gross，CWr,

Op. Biotech. 5:428-433 (1994) ® n人類抗體”為具有與人類所產生之抗體之胺基酸序列相 對應的胺基S文序列的抗體及/或使用本文所揭示之任何製 造人類抗體之技術製得的抗體。人類抗體之該定義特別排 除包含非人類抗原結合殘基之人化抗體。製造人類抗體之 方法為此項技術中所熟知且包括轉基因小鼠（xen〇m〇use) 128788.doc -26- 200846358 技術作為一非限制性實例（例如，如w〇 96/33735中所述）。 ”親和力成熟”抗體為在其一或多個CDR中具有一或多個 變異之抗體，與不具有彼等變異之親本抗體相比，彼等變 異使仔抗體對抗原之親和力得以提高。較佳親和力成熟抗 體將對靶抗原具有奈莫耳或甚至微微莫耳親和力。親和力 成熟抗體可由此項技術中已知之程序製備。Marks等人， 出 10:779-783 (1992)描述藉由 VH 及 VL域改組 貝現之親和力成#。CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發 _ 由下列文獻描述：Barbas等人， 91:3809-3813 (1994) ; Schier 等人，G⑼e 169:147-155 (1995)，Yelton等人 ’ J· i55:i994_2〇〇4 (ip%) ·，

Jackson 等人，乂 ⑽〇/ 154(7):331〇-9 (1995);及

Hawkins等人，J. Mo/·价〇/· 226:889-896 (1992)。 ’’經抗原決定基標籤標記之”多肽係指與”標籤多肽”融合 之嵌合多肽。該等標籤提供抗體可針對其製造或獲得但大 體上不干擾多肽活性之抗原決定基。為降低抗標蕺抗體與 _ 内源性抗原決定基之反應性，該標籤多肽通常具有唯一 性。合適的標籤多肽通常具有至少6個胺基酸殘基，通常 為約8個與50個胺基酸之間，較佳8個與20個胺基酸之間。 抗原決定基標籤序列之實例包含A型流感病毒之HA、GD 及 c_myc、聚 His及 FLAG 〇 如本文可互換使用之，，聚核苷酸，，或，，核酸，，係指具有任何 長度之核苷酸之聚合物且包括（但不限於）DNA及RNA。核 皆酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷峻 128788.doc -27- 200846358 或驗基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或合 成反應併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修錦 之核皆酸’諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可 在裝配聚合物之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸 之序列可由非核苷酸組分中斷。聚核苷酸可在合成後經進 一步修飾’諸如藉由與標記接合。其他類型之修飾包括 (例如）巾自’用類似物取代一或多個天然存在之核苦酸； 核苦酸間修飾，諸如具有不帶電鍵聯者（例如膦酸甲酯、 石粦酸二g曰、磷醯胺酸醋（ph〇Sph〇amidate)、胺基甲酸醋等） 及具有V電鍵聯者（例如硫代填酸酯、二硫代鱗酸酯等）、 δ有懸垂口P刀者（諸如蛋白質（例如核酸酶、毒素、抗體、 信號肽、ply-L-離胺酸等）、具有嵌入劑者（例如吖啶 (acridine)、補骨脂素（ps〇raien)等）、含有螯合劑者（例如金 屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等）、含有烧化劑者、 具有經修飾鍵聯者（例如α變旋異構核酸等）以及聚核苷酸 之未經修飾形式。另外，糖中通常存在之任何羥基均可 (例如）經膦酸酯基、磷酸酯基置換，經標準保護基保護或 經活化以製備與其他核苷酸之其他鍵聯；或可與固體或半 固體支撐物接合。5,及3,末端〇Η可經磷酸化或經胺或具有 1至20個碳原子之有機蓋帽基團部分取代。其他羥基亦可 經衍生化成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中通 常已知之核糖或脫氧核糖的類似形式，包括（例如）2,_〇_甲 基-核糖、2’-0-烯丙基_核糖、2，_氟_核糖或2，_迭氮基_核 糖、碳環狀糖類似物、變旋異構糖、差向異構糖（諸如 128788.doc •28- 200846358 阿拉伯糖、木糖或來蘇糖（lyx〇ses)、哌喃糖、呋喃糖、景 天庚酮糖（sedoheptuloses))、非環狀類似物及非鹼性核^ 類似物，諸如甲基核糖核苦。一或多個磷酸二酿鍵可經替 代性鍵聯基團置換。該等替代性鍵聯基團包括（但不限= 於S) 如下實施例，其中磷酸酯基經P(0)s("硫代酸酯"）、/(Us (”二硫代酸酯"）、（0)NR2(”醯胺化物"）、ρ(〇)Κ、 P(〇)〇R|、CO或CH2("甲縮搭”）置換，其中各，獨立地 為Η或視需要含有醚鍵（_〇_)之經取代或未經取代之烷基（1_ 2〇C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基“Μ办1)。 無需聚核苷酸中之所有鍵聯均相同。前述描述適用於本文 所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。 如本文所使用之”募核苷酸”泛指短的、通常為單鏈、通 常為合成的聚核苦酸，其長度通常（但不必）小於約2〇〇個核 苷酸。術語”寡核苷酸，，及，，聚核苷酸，，並不相互排斥。以上 有關來核皆酸之描述同樣且完全適用於募核普酸。 術語”肽’’泛指經由肽基鍵連接之連續且相對短的胺基酸 序列。肽通常（但不必）具有約2至50個胺基酸、4-4〇個胺基 酸或10-30個胺基酸之長度。雖然術語”多肽”泛指肽之較長 形式，但兩個術語在本文中之某些情況下可互換使用及已 互換使用。 術語”胺基酸”及”殘基”在本文中可互換使用。 多肽之”區”為2個或2個以上胺基酸之連續序列。在其他 實施例中，區至少具有約3、5或1 〇個連續胺基酸中之任一 者。”C-末端區”或其變異體係指包含u個最靠近多肽之〇 128788.doc -29、 200846358 末端定位之殘基的多肽區域。’’N-末端區”或其變異體係指 包含1-5個最靠近多肽之N末端定位之殘基的多肽區域。多 肽之”内部11區係指既不位於多肽之N-末端亦不位於多肽之 C-末端的多肽區域。 "PDZ域"，亦稱為DHR(DLG同源區）或GLGF重複，為最 初描述為在95 kDa突觸後緻密蛋白質（PSD-95)、果蠅 腫瘤抑制子盤-大及緊密接合蛋白質閉合帶-1 (zonula occludens-1，ZO-1)中之保守結構元件之蛋白質 • 域，其可見於一大且多樣的蛋白質組中，包括HtrAl蛋白 質及HtrA3蛋白質。PDZ域通常與位於相互作用蛋白質之 羧基末端之短羧基末端肽序列結合。PDZ域通常包含2個α 螺旋及6個β摺疊片。 "HtrAl PDZ域”、"HtrAl PDZ”及其變化形式係指部分或 整個 SEQ ID NO: 1 之序列（KKYIGIRMMSLTSSKAKELK DRHRDFPDVISGAYIIEVIPDTPAEAGGLKENDVIISINGQ SVVSANDVSDVIKRESTLNMVVRRGNEDIMITVIPEEIDP 鲁 （SEQ ID NO: 1);參見圖1)，其直接或間接參與細胞HtrAl PDZ-配位體相互作用。 ”HtrA3 PDZ域"、"HtrA3 PDZn及其變化形式係指部分或 整個 SEQ ID NO: 2 之序列（KRFIGIRMRTITPSLVDELK ASNPDFPEVSSGIYVQEVAPNSPSQRGGIQDGDIIVKVNG RPLVDSSELQEAVLTESPLLLEVRRGNDDLLFSIAPEVVM (SEQ ID NO: 2);參見圖1)，其直接或間接參與細胞HtrA3 PDZ-配位體相互作用。 128788.doc -30- 200846358 配位體”係指能夠與蛋白質或其他分子上之特異性位點 結合相互作用之天然存在或合成的分子或部分。HtrAi PDZ域配位體為與HtrA i PDZ域特異性相互作用之分子或 部分。HtrA3 PDZ域配位體為與HtrA3 PDZ域特異性相互 作用之分子或部分。配位體之實例包含蛋白質、肽及小有 機及無機分子。 融3蛋白質”係指具有兩個共價連接在一起之部分之多 肽，其中各部分來源於不同蛋白質。該兩個部分可經由單 個肽鍵直接連接或經由含有一或多個胺基酸殘基之肽連接 子連接。一般而言，該兩個部分及連接子將彼此處於閲讀 構架中且使用重組技術產生。 "病症"或"病理學病狀”為將受益於用本發明之物質/分子 或方法治療之任何病狀。其包括慢性及急性病症或疾病， 包括使哺乳動物易患所討論之病症之彼等病理學病狀。本 文中待治療之HtrAl相關病症之非限制性實例包括惡性及 良性腫瘤或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病、神經退化 性病症、發炎性及免疫病症及眼内新企管疾病。HUA3相 關病症之非限制性實例包括惡性及良性腫瘤或癌症、非白 血病及淋巴樣惡性疾病及胎盤功能障礙。 術^癌症及癌性”係指或描述哺乳動物中通常以不受

。癌症之實例 、肉瘤及白血 病該等癌之更特定實例包括鱗狀細胞癌、 非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌 胞癌、小細胞肺癌、 黑素瘤、腹膜癌、肝 128788.doc -31 - 200846358 細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、 卵巢癌、肝臟癌症、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、 結腸直腸癌、子宮内膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝 臟癌症、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、肝癌（hepatic carcinoma)及各種類型之頭頸癌。 如本文所使用之"神經退化性病症"包括（但不限於）哺乳 動物中通常以神經組織之退化或神經組織中細胞間通信之 退化為特徵的中樞及/或周圍神經系統之疾病或病症。神 經退化性病症之實例包括（但不限於）神經退化性疾病（包括 (但不限於）路易體病（Lewy body disease)、脊髓灰質炎後 症候群（postpoliomyelitis syndrome)、Shy-Draeger症候群 (Shy-Draeger syndrome)、 撖欖橋腦小腦萎縮 (olivopontocerebellar atrophy)、帕金森氏病（Parkins〇n，s disease)、多系統萎縮、紋狀體黑質退化（striat〇nigral degeneration))、τ蛋白病（tauopathies)(包括（但不限於）阿茲 海默氏病（Alzheimer disease)及核上麻痹））、朊病毒疾病 (包括（但不限於）牛海綿樣腦病（bovine spongiform encephalopathy)、綿羊癢病（scrapie)、克羅伊茨費爾特-雅 各布症候群（Creutzfeldt-Jakob syndrome)、克魯病（kuru)、 蓋-施氏病（Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、慢性 消耗性疾病及致死性家族性失眠症）、延髓性麻癖、運動 神經元疾病及神經糸統異質性退化性病症（nervous system heterodegenerative disorders)(包括（但不限於）嘉拿芬氏病 (Canavan disease)、亨廷頓氏病（Huntington’s disease)、神 128788.doc -32- 200846358 經元堪樣質脂褐素沈積病（neur〇nal ceroid-lipofuscinosis)、亞歷山大病（Alexander，s disease)、妥瑞氏 症候群（Tourette、syn(jrome)、緬克斯氏捲髮症候群 (Menkes kinky hair Syndrome)、柯凱因氏症候群（c〇ckayne syndrome)、哈勒沃登-施帕茨症候群（Halerv〇rden -Spatz syndrome)、拉福拉病（laf〇ra disease)、雷特症候群（Rett syndrome) 肝豆狀核變性（hepatolenticular degeneration)、萊希-尼亨症候群（Lesch_Nyhan syndrome) 及 Unverricht-Lundborg 症候群（Unverricht -Lundborg

Syndr〇me))、癡呆（包括（但不限於）畢克氏病（Pick，s disease)及脊髓小腦性共濟失調）。 如本文所使用之”眼内新血管疾病”包括（但不限於）增生 性視網膜病（例如，糖尿病性視網膜病）、黃斑變性（例如， 年齡相關黃斑變性（AMD)或”乾型，，黃斑變性）、新生血管性 月光眼及移植角膜組織及其他組織之免疫排斥反應。 年齡相關黃斑變性（AMD)為老年成年人之嚴重的不可逆 視力損失之最常見原因（Nati〇nal S〇ciety t0 prevent Blindness 1980)。其特徵在於大量臨床及病理學發現，諸 如稱為脈絡膜疣之淺黃色斑點、視網膜色素上皮（RpE)破 裂、脈絡膜新血管生成（CNV)及盤狀黃斑變性。疾病之表 現症狀分為兩種形式：非滲出性（乾型）及滲出性（濕型或新 血官）。脈絡臈疣為乾型形式之特徵性病變，而新血管生 成為濕型形式之特徵。盤狀AMD為新血管病變之纖維化階 段。 128788.doc •33- 200846358 AMD之發病率隨年齡增長顯著增加。參見，例如 Leibowitz等人，The Framingham Eye Study monograph: an ophthalmological and epidemiological study of cataract， glaucoma, diabetic retinopathy，macular degeneration, and visual acuity in a general population of 2631 adults，1973-1975. Swrv 24(增刊）：335-610 (1980);及 Klein 等人，Prevalence of age related maculopathy. The Beaver Dam Eye Study. Ophthalmology 99:933-43 (1992)。雖然疾 病之濕型形式不多見，但其造成80%-90%的與AMD相關的 嚴重視力損失（Ferris 等人，102:1640-2 (1984))。存在估計100-120萬佔優勢的濕型AMD病例。雖 然尚不知AMD之病因；但顯然患AMD之風險隨年齡增長 而增加。其他已知風險因素包括家族病史及吸煙。推定風 險因素亦包括氧化應力、糖尿病、酒精攝入及日光曝露 (Damico DJ. Diseases of the retina. N Engl J Med 1994; 331:95-106 (1994);及 Christen WG等人，276:1147- 51 (1996))。 乾型AMD之特徵在於RPE及布魯赫氏膜（Bruch’s membrane)之變化。認為因年齡及其他風險因素而受損之 RPE使脂褐質及細胞殘骸沈積於布魯赫氏膜上。該等變化 經檢眼鏡檢查可見為脈絡膜疣，其分散於整個黃斑及視網 膜後極。亦存在可變程度之RPE萎縮及色素沈著。乾型 AMD可無征狀或伴隨有可變且通常最小程度之視力損失且 視為發展出濕型AMD之前奏。 128788.doc 34· 200846358 濕型AMD之特徵在於黃斑區之cNV。脈絡膜毛細管增生 且穿透布魯赫氏膜到達RPE且可延伸至視網膜下腔。新形 成之毛細管之滲透性增加導致漿液或血液在RpE及/或感覺 神經視網膜下或感覺神經視網膜内累積。當窩變得腫脹或 脫落時，導致視力下降，可能跟著發生纖維性化生及構 造，從而導致稱為盤狀瘢痕之視網膜下塊狀物增大，此構 成末期AMD且與永久性視力損失相關（D,Amic〇 Dj. #心y ·/咖33 i :95] 〇6 (1994))。濕型AMD之老年治療性物理治 鲁療包括光動力療法（Photodynamic therapy，PDT，例如用 VISUDYNE) 〇 如本文所使用之”發炎性及免疫病症”包括（但不限於）由 異常免疫機制及/或異常細胞激素信號轉導所引起之病 症。發炎性及免疫病症之實例包括（但不限於）自體免疫疾 病、免疫缺乏症候群及過敏症。本文中"自體免疫疾病”為 由個體自身組織所產生且針對該等組織之非惡性疾病或病 症。本文中自體免疫疾病尤其不包括惡性或癌性疾病或病 狀，尤其不包括B細胞淋巴瘤、急性淋巴母細胞性白血病 (ALL)、慢性淋巴細胞性白血病（CLL)、毛細胞白血病及慢 性骨髓母細胞白血病。自體免疫疾病或病症之實例包括 (但不限於）發炎反應，諸如發炎性皮膚病，包括牛皮癣及 皮炎（例如’異位性皮炎）；全身性硬皮病及硬化症·與發 炎性腸病相關之反應（諸如克羅恩氏病（Cr〇hn,s 及 潰瘍性結腸炎）；呼吸窘迫症候群（包括成人呼吸窘迫症候 群（ARDS));皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結腸炎/ I28788.doc •35· 200846358 絲球體腎炎；過敏性病狀，諸如濕疹及哮喘及其他涉及τ 細胞浸潤及慢性發炎反應之病狀；動脈粥樣硬化；白細胞 黏附缺陷；類風濕性關節炎；全身性紅斑狼瘡（sle)(包括 (但不限於）狼瘡性腎炎、皮膚狼瘡）；糖尿病（例如，〗型糖 尿病或胰島素依賴性糖尿病）；多發性硬化症；雷納氏症 候群（Reynaud’s syndrome);自體免疫性曱狀腺炎；橋本甲 狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis);過敏性腦脊趨炎；修格 蘭氏症候群（Sjogren’s syndrome);青少年發作糖尿病 (juvenile onset diabetes);及通常可見於結核病、肉狀瘤 病、多發性肌炎、肉芽腫及脈管炎中與由細胞激素及T淋 巴細胞介導之急性及延遲性過敏相關之免疫反應；惡性貧 血（阿狄森氏病（Addison’s disease));涉及白血球渗出之疾 病；中樞神經系統（CNS)發炎性病症；多器官損傷症候 群；溶血性貧企（包括（但不限於）冷球蛋白血症 (cryoglobulinemia)或庫姆斯氏陽性貧血症（c〇〇mbs p〇shive anemia));重症肌無力；抗原抗體複合物介導之疾病；抗 腎小球基膜病（anti-glomerular basement membrane disease);抗磷脂症候群；過敏性神經炎；葛瑞夫茲氏病 (Graves’ disease);蘭伯特-伊頓肌無力症候群（Lamber卜

Eaton myasthenic syndrome);大皰性類天疱瘡（pemphig〇id bullous);天疱瘡；自體免疫性多内分泌腺病變；萊特爾 氏病（Reiter s disease)，僵人症候群（stiff-man syndrome); 白塞氏病（Behcet disease);巨細胞動脈炎；免疫綜合性腎 炎；IgA腎病；IgM多發性神經病；免疫性血小板減少性紫 128788.doc -36- 200846358 癜（ITP)或自體免疫性血小板減少症等。 本發明之HtrAl PDZ域及HtrA3 PDZ域調節化合物可與 一或多種其他藥劑組合使用以治療或預防一或多種η&αι 相關病症或HtrA3相關病症。舉例而言，如一般技術者廣、 瞭解’本發明之多肽可與一或多種細胞毒性劑、化學治療 劑、生長抑制劑、消炎劑、抗血管生成劑及物理治療組合 使用來治療或預防一或多種HtrAl相關病症或HtrA3相關病 症。 • 如本文中所使用之術語π細胞毒性劑，，係指抑制或阻止細 胞功能及/或導致細胞破壞之物質。該術語意欲包括放射 性同位素（例如，At2】1、I131、I125、γ9〇、Re186、Rei88、

Sm 、12、P32及1^之放射性同位素）；化學治療劑，例 如甲胺蝶呤（methotrexate)、阿黴素（adriamicin)、長春生 物驗（vinca alkaloids)(長春新驗（vincristine)、長春花驗 (vinblastine)、依託泊苷（etoposide))、多柔比星 (doxorubicin)、美法侖（meiphalan)、絲裂黴素C(mitomycin 鲁 C)、苯丁 酸氮芥（chlorambucil)、道諾黴素（daunorubicin) 或其他插入劑、酶及其片段（諸如核酸分解酶）、抗生素及 毒素（諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或 酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體），以及下文所揭 示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑描述於下文 中。殺腫瘤劑引起腫瘤細胞之破壞。 "化學治療劑”為適用於治療癌症之化合物。化學治療劑 之實例包括：烧化劑，諸如硫替派（如0_勾及 128788.doc -37- 200846358

CYTOXAN®環填醯胺；烷基磺酸鹽，諸如白消安 (busulfan)、 英丙舒凡（improsulfan)及旅泊舒凡 (piposulfan);氮丙咬，諸如苯嗤多巴（benzodopa)、卡巴酉昆 (carboquone)、米特多巴（meturedopa)及尤利多巴 (uredopa);伸乙基亞胺及曱基密胺，包括六甲蜜胺 (altretamine)、三伸乙基密胺（triethylenemelamine)、三伸 乙基填酸胺（trietylenephosphoramide)、三伸乙基硫代填醢 胺（triethiylenethiophosphoramide)及三 甲密胺 (trimethylolomelamine);多聚乙醯（aeetogenin)(尤其布拉 他辛（bullatacin)及布拉他辛酮（bullatacinone)) ; Δ-9-四氫 大麻盼(delta-9-tetrahydrocannabinol)(屈大麻齡 (dronabinol)，MARINOL®) ; β-拉帕酮（beta-lapachone); 拉帕醇（lapachol); 秋水仙鹼（colchicine); 樺木酸 (betulinic acid);喜樹驗（camptothecin)(包括合成類似物拓 朴替康（topotecan)(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊諸替康 (irinotecan) ， CAMPTOSAR®)、乙酿基喜樹驗 (acetylcamptothecin)、斯考普萊叮（scopolectin)及 9·胺基喜 樹驗（9-aminocamptothecin));苔蘚蟲素（bryostatin);卡利 斯塔叮（callystatin) ； CC-1065(包括其阿多來新 (adozelesin)、卡折來新（carzelesin)及比折來新（bizelesin) 合成類似物）；足葉草毒素（podophyllotoxin);足葉草酸 (podophyllinic acid);替尼泊甙（teniposide);念珠藻環肽 (cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);海兔毒 素（dolastatin);多卡米辛（duocarmycin)(包括合成類似物， 128788.doc -38 - 200846358

KW-2189 及 CB1-TM1);艾權素（eleutherobin);盤克斯塔叮 (pancratistatin)；沙考的汀（sarcodictyin);海綿素 (spongistatin);氮芥（nitrogen mustard)，諸如苯丁 酸氮芥 (chlorambucil)、萘氮芬（chlornaphazine)、環鱗醢胺、雌氮 芥（estramustine)、異環鱗醢胺（ifosfamide)、二氣甲二乙胺 (mechlorethamine)、 鹽酸二氯曱二乙胺氧化物 (mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法命、新氮芥 (novembichin)、膽固醇苯乙酸氮芬(phenesterine)、松龍苯 芥（prednimustine)、氯乙環石粦醢胺（trofosfamide)、尿哺咬 氮芥（uracil mustard);硝基脲，諸如亞确脲氮芥 (carmustine)、氯脲黴素（chlorozotocin)、福莫司汀 (fotemustine)、環己亞硝脲（lomustine)、嘴σ定亞石肖脲 (nimustine)及拉甯司汀（ranimnustine);抗生素，諸如稀二 快抗生素（例如，刺抱黴素（calicheamicin)，尤其刺孢黴素 γΐΐ及刺孢黴素coll(參見，例如，Agnew，C/zem /W/·五乂 A2g/·，33:183-186 (1994));達米辛（dynemicin)，包括達米 辛A ;艾斯帕米辛（esperamicin);以及新制癌菌素 (neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白嫦二炔抗生素發色 團）、克拉斯米辛（aclacinomysin)、 放線菌素 (actinomycin)、奥斯拉米辛（authramycin)、偶氮絲胺酸 (azaserine)、 博萊黴素（bleomycin)、 放線菌素 C(cactinomycin)、卡拉比辛（carabicin)、洋紅黴素 (carminomycin)、嗜癌黴素（carzinophilin)、克羅米辛 (chromomycinis)、放線菌素（<^〇1^11〇1117(^11)、道諾黴素、 128788.doc -39- 200846358

地托比星（detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、 ADRIAMYCIN®多柔比星（包括嗎琳基-多柔比星 (morpholino-doxorubicin)、 氰基嗎琳基多柔比星 (cyanomorpholino-doxorubicin)、2-口比口各琳基-多柔比星及 去氧多柔比星（deoxydoxorubicin))、 表柔比星 (epirubicin)、依索比星（esorubicin)、伊達比星 (idarubicin)、麻西羅黴素（marcellomycin)、絲裂黴素 (mitomycin)(諸如絲裂黴素 C)、黴紛酸（mycophenolic acid)、諾加黴素（nogalamycin)、橄欖黴素（olivomycins)、 培洛黴素（peplomycin)、潑非黴素（potfiromycin)、嘌呤黴 素（puromycin)、奎那黴素（quelamycin)、羅多比星 (rodorubicin)、鏈黑菌素（streptonigrin)、鏈脲黴素 (streptozocin)、殺結核菌素（tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、淨司他汀（冗111〇31壮1^11)、佐柔比星（2〇1^1^(^11); 抗代謝物，諸如曱胺蝶呤及5-氟尿嘴σ定（5-fluorouracil)(5-FU);葉酸類似物，諸如傣諾特呤（denopterin)、曱胺蝶 呤、蝶羅呤（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate);嗓呤類 似物，諸如氟達拉濱（fludarabine)、6-魏基嘌呤（6-mercaptopurine)、°塞咪嗓呤（thiamiprine)、硫鳥 ϋ票吟 (thioguanine) ; 5密σ定類似物，諸如環胞苦（ancitabine)、阿 紮胞芽（azacitidine)、6-氮雜尿普（6-azauridine)、卡莫氟 (carmofur)、阿糖胞苦（cytarabine)、雙去氧尿苦 (dideoxyuridine)、去氧氣尿普（doxifluridine)、依諾他濱 (enocitabine)、敗尿核苦（floxuridine);雄激素，諸如卡魯 128788.doc -40- 200846358 睾艱J (calusterone)、丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄烧 (mepitiostane)、睾内酉旨（testolactone);抗腎上腺素，諸如 胺基苯乙派 σ定酮（aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、

曲洛司坦（trilostane);葉酸補充劑，諸如夫羅林酸（frolinic acid);醋葡酸内酯（aceglatone);酸麟醯胺葡糖甙 (aldophosphamide glycoside);胺基果糖酸（aminolevulinic acid);伊利盧拉（eniluracil);胺苯 σ丫咬（amsacrine);倍思 塔布（bestrabucil); 比生群（bisantrene); 艾達曲克 (edatraxate)；得弗伐胺（defofamine)；秋水仙胺 (demecolcine)；地 ϋ丫 酉昆(diaziquone);艾弗利散 (elfornithine);依利醋銨（elliptinium acetate);埃坡黴素 (epothilone)；乙環氧咬（etoglucid);硝酸鎵（gallium nitrate);經基脲（hydroxyurea);香兹糖（lentinan);羅尼達 寧（lonidainine);類美登素（maytansinoid)，諸如美登素 (maytansine)及胺沙托辛（ansamitocins)； 丙肺月宗 (mitoguazone);米托蒽酉昆（mitoxantrone);莫比達摩 (mopidanmol)；石肖拉維林（nitraerine); 喷司他汀 (pentostatin)；凡那明（phenamet)；比柔比星 (pirarubicin);洛索蒽覼（losoxantrone) ; 2-乙基醯肼（2-ethylhydrazide);普魯苄肼（procarbazine) ; PSK® 多餹複合 物（JHS Natural Products, Eugene, OR)；丙亞胺 (razoxane);根黴菌素（rhizoxin);西佐糖（sizofiran);螺鍺 (spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸（tenuazonie acid);三 128788.doc -41 - 200846358

亞胺醌（triaziquone) ; 2,2^2^-三氯三乙基胺；單端孢黴烯 族毒素（trichothecene)(尤其T-2毒素、弗納庫林 A(verracurin A)、桿孢菌素 A(roridin A)及胺癸叮 (anguidine));烏拉坦（urethan);去乙醯長春醯胺 (vindesine)(ELDISINE® ， FILDESIN®);達卡巴嗪 (dacarbazine);甘露醇氮齐（mannomustine);二漠甘露醇 (mitobronitol);二溴衛矛醇（mit〇lactol);雙溴丙基哌嗪 (pipobroman);曱托辛（gacytosine);阿糖胞苷（丨’Ara-C”）； 硫替派（thiotepa);紫杉醇（taxoid)，例如TAXOL®太平洋 紫杉醇（Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J·); ABRAXANE™無十六醇聚氧乙烯醚之經白蛋白工程化之 太平洋紫杉醇奈米粒子調配物（ABRAXANETM Cremophor-free， albumin-engineered nanoparticle formulation of paclitaxel ， American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)及 TAXOTERE® 多 西他赛 (doxetaxel)(Rh6ne-Poulenc Rorer，Antony，France);克羅南 布（chloranbucil) ·，吉西他濱（gemcitabine)(GEMZAR®) ; 6-硫鳥嗓呤（6-thioguanine);魏基嗓呤（mercaptopurine);甲 胺蝶呤；舶類似物，諸如順舶(cisplatin)及卡銘 (carboplatin);長春花驗（vinblastine)(VELBAN®);始；依 託泊苷（VP-16);異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼 (vincristine)(ONCOVIN®) ·，奥沙利始（oxaliplatin);盧考 弗 文（leucovovin)； 長 春瑞賓（vinorelbine) (NAVELBINE®);諾凡特龍（novantrone)；依達曲沙 128788.doc -42- 200846358

(edatrexate);道諾黴素；胺基蝶呤；伊班膦酸鹽 (ibandronate);拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氟曱基鳥 胺酸（difluorometlhylornithine，DMFO); 類視色素，諸如 視黃酸（retinoic acid)；卡培他濱（capecitabine) (XELODA®);任何以上治療劑之醫藥學上可接受之鹽、 酸或衍生物；以及兩種或兩種以上治療劑之組合，諸如 CHOP(環填醯胺、多柔比星、長春新鹼及潑尼松龍 (prednisolone)之組合療法之縮寫）及FOLFOX(奥沙利鉑 (oxaliplatin)(ELOXATINTM)與5-FU及盧考弗文組合之治療 方案之縮寫）。其他化學治療劑包括適用作抗體藥物接合 物之細胞毒性劑，諸如類美登素（maytansinoid)(例如， DM1)及阿瑞他汀（auristatin)(例如，MMAE 及 MMAF)。 該定義中亦包括起調控、減少、阻斷或抑制可促進癌症 生長之激素之效應的作用且通常為系統性或全身性治療之 形式的抗激素劑。其本身可為激素。實例包括抗雌激素及 選擇性雌激素受體調節劑（SERM)，包括（例如）他莫西芬 (tamoxifen)(包括 NOLVADEX® 他莫西芬）、EVISTA® 雷洛 西芬（raloxifene)、屈洛昔芬（droloxifene)、4-經基他莫西 芬（4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬（trioxifene)、雷洛昔芬 鹽酸鹽（keoxifene)、LY117018、歐納氏酮（onapristone)及 FARESTON® 托瑞米芬（toremifene);抗黃體酮（anti-progesterone);雌激素受體下調劑（ERD);起抑止或制止 卵巢之作用之藥劑，例如黃體素釋放激素（LHRH)促效 劑，諸如LUPRON®&ELIGARD®乙酸亮丙瑞林（leuprolide 128788.doc -43- 200846358 acetate)、乙酸戈舍瑞林（goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林 (buserelin acetate)及曲特瑞林（tripterelin);其他抗雄激 素，諸如氟他胺（flutamide)、尼魯米特（nilutamide)及必卡 他胺（bicalutamide);及抑制調控腎上腺中雌激素產生之酶 芳香酶之芳香酶抑制劑，諸如4(5)-咪嗤、胺基苯乙旅σ定酮 (aminoglutethimide)、MEGASE® 乙酸曱地孕酮（megestrol acetate)、AROMASIN® 依西美坦（exemestane)、弗米斯坦 (formestanie)、法偏嗤（fadrozole)、RIVISOR® 伏氯唾 (vorozole)、FEMARA⑧來曲唑（letrozole)及 ARIMIDEX® 瑞 寧德（anastrozole)。此外，化學治療劑之該定義包括：雙 膦酸鹽，諸如氣屈膦酸鹽（clodronate)(例如，BONEFOS® 或 OSTAC®)、DIDROCAL® 依替膦酸鹽（etidronate)、NE-58095、ZOMETA⑧唑來膦酸/唑來膦酸鹽、FOSAMAX®阿 侖膦酸鹽（alendronate) 、 AREDIA㊣帕米膦酸鹽 (pamidronate)、SKELID® 替魯膦酸鹽（tiludronate)或 ACTONEL®利塞膦酸鹽（risedronate);以及曲沙他濱 (troxacitabine)(l，3-二氧戊環核苷胞嘴咬類似物）；反義募 核苷酸，尤其抑制基因在牽涉於異常細胞增生中之信號轉 導路徑中之表現的反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體（EGF-R);疫苗，諸如 THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN® 疫苗 、LEUVECTIN®疫苗及 VAXID®疫苗 ； LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH;拉帕替尼對曱苯磺酸鹽（lapatinib ditosylate)(ErbB- 128788.doc -44- 200846358 2與EGFR雙重脱^ °私酸激酶小分子抑制劑，亦稱為 GW572016) ； η λ 壬何以上治療劑之醫藥學上可接受之鹽、 酸或衍生物。 生長抑制劑"春A j 田在本文中使用時，其係指活體外或活體 内抑制細胞生長之化合物或組合物。在某些實施例中，該 等化合物或組合物抑制腫瘤細胞生長。因A，生長抑制劑 γ在^中顯著降低細胞（例如，腫瘤細胞）之百分比之 某背丨生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期進程（在不同 於s期之其他時期）之藥劑，諸如誘導⑴阻滞及μ期阻滯之 藥劑。典型Μ期阻斷劑包括長春鹼類(長春新鹼及長春 鹼）、紫杉烷（1&\&此）及拓撲異構酶„抑制劑（諸如多柔比 星、表柔比星、柔紅黴素、依託泊苷及博萊黴素）。阻滞 G1之彼等藥劑亦作用於8期阻滯中，例如DNA烷化劑，諸 如他莫西芬、潑尼松、達卡巴嗪、氮芬 (mechlorethamine)、順鉑、甲胺喋呤、5_氟尿嘧啶及 C。其他資訊可見於 The Molecular Basis of Caneei·， Mendelsohn and Israel編，第 1章，Murakami等人之標題為

Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugsrf (WB Saunders: Philadelphia，1995)，尤其第 13頁。紫杉烧 (太平洋紫杉醇及多西紫杉醇（docetaxel))均為來源於紫杉 樹之抗癌藥。來源於歐洲紫杉之多西紫杉醇 (TAXOTERE®，Rhone-Poulenc Rorer)為太平洋紫杉醇 (TAXOL®，Bristol-Myers Squibb)之半合成類似物。太平 洋紫杉醇及多西紫杉醇促進由微管蛋白二聚體組裝微管且 12S788.doc -45- 200846358 藉由阻止解聚作用而使微管穩定，此導致對細胞有絲分裂 之抑制。”多柔比星"為葱環黴素類抗生素。多柔比星之化 學全名為（8S-順）-10-[(3-胺基-2,3,6-三去氧-α-L-來蘇糖基-六哌喃糖基）氧基]-7,8,9,10-四氫-6,8,11-三羥基-8-(羥基乙 酸基）-1-甲氧基-5,12 -蔡二嗣。 如本文所使用之"抗血管生成劑π為阻止或抑制血管生成 之藥劑。該等抗血管生成劑包括此項技術已知之藥劑，例 如VEGF之抗體（例如，抗VEGF中和抗體或片段（例如，人 化 Α4·6·1、AVASTIN®(Genentech，South San Francisco, CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3 等及 Lucentis⑧）。參 見，例如美國專利 6,582,959、6,884,879、6,703,020 ; WO 98/45332 ； WO 96/30046 ； WO 94/10202 ； EP 0666868B1 ； 美國專利申請案 20030206899 、 20030190317 、

20030203409 及 20050112126 ; Popkov等人，Jowrna/ 〇/ Immunological Methods 288:149-164 (2004) ; WO

2005 0123 59)、VEGF受體之抗體、阻斷VEGF受體信號轉 導之小分子（例如 PTK787/ZK2284 、 SU6668 、 SUTENT®/SU1 1248(蘋果酸舒尼替尼（sunitinib malate))、 AMG706)及原生血管生成抑制劑，例如血管生長抑素 (angiostatin)、内皮生長抑素（endostatin)等。參見，例如 Klagsbrun 及 D’Amore，尸53:217-39 (1991) ; Streit 及 Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例如，表3所列之惡性黑素瘤之抗血管生成療法）； Ferrara 及 Alitalo， Nature Medicine 5(12): 1359-1364 128788.doc -46- 200846358 (1999) ; Tomm等人，〇ncoge似，22:6549 6556 (2〇〇3八例 如，表2所列之抗血管生成因子）；及Sat〇 〇此〇/·，8:200-206 (2003)(例如，表i列舉臨床試驗中所用 之柷血官生成劑）。如本文所使用之”治療”係指努力改變所 /〇療之個體或細胞之自然過程且可出於預防之目的或在臨 床病理學期間進行的臨床介入。所要治療效果包括預防疾 病發作或復發、舒緩症狀、減少疾病之任何直接或間接病 理性結果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減輕疾 病病況及預後好轉或改善。在一些實施例中，使用本發明 之調節化合物延緩疾病或病症之發展。 π有效量π係指在所需劑量下且歷時必需之時間有效達成 所要的治療或預防結果之量。本發明之物質/分子、促效 劑或拮抗劑之”治療有效量，，可根據以下因素變化：諸如個 體之疾病病況、年齡、性別及體重，及物質/分子、促效 劑或拮抗劑於個體中引發所要的反應之能力。治療有效量 亦為物質/分子、促效劑或拮抗劑之治療有益作用超過其 任何有毒或有害作用的量。"預防有效量"係指在所需劑量 下且歷時必需之時間有效達成所要的預防結果的量。由於 預防劑量係在患病之前或在疾病早期用於個體，因此預防 有效里通常（但不必）小於治療有效量。

HtrAl PDZ域·配位體或HtrA3 ρι>ζ域-配位體相互作用之 調節劑 本發明提供活體内HtrAl PDZ域-配位體相互作用咬 HtrA3 PDZ域配位體相互作用之調節劑及鑑別該等調節叫 128788.doc •47、 200846358 之方法。一種調節HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域與其配位 體之間相互作用之方法為抑制該相互作用。任何破壞 HtrAl PDZ域-配位體相互作用或HtrA3 PDZ域-配位體相互 作用之分子均可為候選抑制劑。熟習此項技術者熟知之篩 選技術可鑑別該等分子。抑制劑之實例包括：（1)小有機及 無機化合物，（2)小肽，（3)抗體及衍生物，（4)與HtrAl PDZ域配位體或HtrA3 PDZ域配位體密切相關之肽，（5)核 酸適體（aptamers)。 ’’HtrAl PDZ域-配位體相互作用抑制劑”包括任何可部分 或完全阻斷、抑制或中和HtrAl PDZ域與其配位體之間相 互作用的分子。可用作該等抑制劑之分子包括結合HtrAl PDZ域之肽，諸如表1、2及3中所列之肽結合子（例如且尤 其為肽DIETWLL(SEQ ID NO: 3)、GWKTWIL(SEQ ID NO: 4)、DSRIWWV(SEQ ID NO: 5)或 WDKIWHV(SEQ ID NO: 6))、抗體（Ab)或抗體片段、内源性HtrAl PDZ域配位體之 片段或變異體、同源（cognate)含HtrAl PDZ多肽；含HtrAl PDZ多肽之變異體（例如，其中HtrAl PDZ域序列包含一或 多個取代在位置 Ile383、Ile385、Gly384、Tyr382、 Arg386、Ile418、Ala445、Met387、Gln446、Ile415、 Arg386、Ser389、Lys380、Lys381、G1411、Tyr413、 Ile414、Val417、Thr421 及 Pro422(根據人類 HtrAl 蛋白質 胺基酸序列編號），例如經一個胺基酸諸如Ala或其功能相 等物取代）、肽、及小有機分子。 nHtrA3 PDZ域-g己位體相互作用抑制劑”包括任何可部分 128788.doc -48· 200846358 或完全阻斷、抑制或中和HtrA3 PDZ域與其配位體之間相 互作用的分子。可用作該等抑制劑之分子包括結合Htr A3 PDZ域之肽，諸如表1、2及3中所歹ij之肽結合子（例如且尤 其為肽PGRWV(SEQ ID NO: 7)、SGKGIWV(SEQ ID NO: 8)、GFWV(SEQ ID NO: 9)、IFDGRWI(SEQ ID NO: 10)、 FGRWV(SEQ ID NO: 11)、RSWWV(SEQ ID NO: 12)、 FGRWI(SEQ ID NO: 13)、FGRWL(SEQ ID NO: 14)、 GRWV(SEQ ID NO: 15)、WV、FLRWV(SEQ ID NO: 16)、 FERWV(SEQ ID NO: 17)、FYRWV(SEQ ID NO: 18)、 FGAWV(SEQ ID NO: 19)、FARWV(SEQ ID NO: 20)、 GVVVDEWMLSLL(SEQ ID NO: 21)、GVVVDEWVLSLL (SEQ ID NO: 22)、ELLVDGYVLELL(SEQ ID NO: 23)、or GVVVNEWVLSLL(SEQ ID NO: 24))、抗體（Ab)或抗體片 段、内源性HtrA3 PDZ域配位體之片段或變異體、同源含 Htr A3 PDZ多肽；含Htr A3 PDZ多肽之變異體（例如，其中 HtrA3 PDZ域序列包括一或多個位置Phe356、Ile357、 Gly358、Glu390、Ala392、Gln423 及 Arg360(根據人類 HtrAl蛋白質胺基酸序列編號）處之取代，例如用諸如Ala 之胺基酸或其功能等效物取代）、肽及小有機分子。 小分子Htr A1 PDZ域或Htr A3 PDZ域調節劑 小分子可為HtrAl PDZ域-配位體相互作用及/或HtrA3 PDZ域-配位體相互作用之適用調節劑。抑制任一相互作用 之小分子為潛在適用之抑制劑。小分子調節劑之實例包括 小肽、肽樣分子，較佳可溶性及合成非肽基有機或無機化 128788.doc -49- 200846358 合物。”小分子”係指具有較佳小於約5 kD、較佳小於約4 kD且較佳小於0.6 kD之分子量之組合物。小分子可為核 酸、肽、多肽、擬肽、碳水化合物、脂質或其他有機或無 機分子。化學及/或生物混合物，諸如真菌、細菌或海藻 提取物之文庫為此項技術中所已知且可用任何檢定法篩 選。合成分子文庫之方法之實例已經描述（Carell等人，

Angewandte Chemie International Edition· 33:2059-2061 (1994) ; Carell 等人，Angewandte Chemie International Edition. 33:2061-2064 (1994) ; Cho 等人，Sciewe· 261:1303-5 (1993) ; DeWitt等人，Proe S 儿 90:6909-13 (1993) ; Gallop等人，Chm. 37:1233-51 (1994) ； Zuckermann 等人，J Med Chem. 37:2678-85 (1994)) 〇 化合物文庫可以以下各方式呈現：溶液中（Houghten等 九，Biotechniques· 13:412-21 (1 992))，或珠粒上（Lam 等 人，⑶re· 354:82-84 (1991))，晶片上（Fodor 等人， TVaiwre. 364:555-6 (1993))，細菌、孢子（Ladner 等人，美國 專利第 5,223,409 號，1993))，質體（Cull 等人，/Vocr dead Sc/ i/ S A 89:1865-9 (1992))或噬菌體上（Cwirla 等 A J Proc Natl Acad Sci USA. 87:6378-82 (1990) ； Devlin # K ^ Science. 249:404-6 (1990) ； Felicif A ^ J Mol Biol. 222:301-10 (1991) ; Ladner 等人，美國專利第 5,223,409 號，1993 ; Scott及 Smith，Science. 249:386-90 (1990))。無 細胞檢定包含使HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域與已知結合 128788.doc -50- 200846358 子化合物（諸如一或多種本文所述之結合子肽）接觸以形成 檢定混合物，使該檢定混合物與測試化合物接觸，及測定 測試化合物與HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域或結合子化合 物相互作用之能力，其中測定測試化合物與HtrAl PDZ域 或HtrA3 PDZ域或結合子化合物相互作用之能力包含測定 HtrAl PDZ域/結合子複合物或HtrA3 PDZ域/結合子複合物 之可偵測特徵是否受到調節。舉例而言，如由所形成之複 合物之量所確定，HtrAl PDZ域與結合子化合物之結合相 互作用可指示測試化合物是否能夠調節HtrAl PDZ域與結 合子化合物之間的相互作用。類似地，如由所形成之複合 物之量所確定，HtrA3 PDZ域與結合子化合物之結合相互 作用可指示測試化合物是否能夠調節HtrA3 PDZ域與結合 子化合物之間的相互作用。複合物之量可由此項技術中已 知之方法評估，其中一些已在本文中描述，例如ELISA(包 括競爭結合ELISA)、酵母雙雜交、Biacore®檢定及鄰近 (榮光共振能量傳遞、酶-受質）檢定。 多肽/肽及抗體HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域調節劑 本發明之一態樣係關於HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域與 其細胞及/或生理學結合搭配物之間的相互作用之分離肽/ 多肽調節劑。本文所述之結合子肽及由本文所述之方法獲 得之肽調節劑亦適合用作產生該相互作用之抗體調節劑之 免疫原。在一實施例中，調節劑（諸如肽及抗體）可藉由適 當純化流程使用標準蛋白質純化技術自細胞或組織來源分 離。在另一實施例中，調節劑係藉由重組DNA技術製造。 128788.doc -51 - 200846358 替代重組表現，調節劑可使用標準肽合成技術化學合成。 本發明之HtrAl PDZ域結合子肽及jjtrA3 PDZ域結合子 肽包括表1、2及3中所述之肽。本發明亦提供突變型或變 異蛋白貝，其任何殘基可由該等肽之相應殘基變化而來同 時仍編碼維持調節活性之肽。在一實施例中，結合子肽/ 多肽/配位體之變異體與參考結合子肽/多肽/配位體之序列 具有至少 5G%、6G%、7G%、8G%、9G%、95%、㈣、99% 之胺基酸序列-致性。—般而言，基於業内公認之結合檢 定定量單位/量度，變異體展現大體上與參考結合子肽/多 肽/配位體相比相同或較高之結合親和力，例如至少乃 倍、0.8倍、0.9倍、1.〇倍、倍或15倍的參考結合子肽/ 多肽/配位體之結合親和力。 本發明之變異體通常包括序列中之特定位置處之殘基已 經其他胺基酸取代之變異體，且進—步包括在親本蛋白質/ 肽之兩個殘基之間插入一或多個其他殘基之可能性以及自 親本序列缺失—或多個殘基或向親本序列中添加—或多個 殘基之可能性。本發明涵蓋任何胺基酸取代、插入或缺 失。在某些境況下，取代為如本文所述之保守取代。 ”胺基酸序列-致性百分比（％)"係定義為當比對兩個序 列時，與參考（親本）多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基 酸殘基之百分比。為確定胺基酸一致性％，比對序列且2 要日守引入間隙以達成最大序列一致性％ ;保守取代不視為 ^列-致性之部分。確^_致性百分比之胺基酸序列比對 程序為熟習此項技術者所熟知。通常使用可公開獲得之電 128788.doc -52· 200846358 腦軟體（諸如BLAST、BLAST2、AUGN2或心㈣如 (DNASTAR)軟體）比對肽序列。熟習此項技術者可確定用 於量測比對之適當參數，包括達成與所比較之全長序列最 大比對所需之任何算法。 當比對胺基酸序列時，可如下計算給定胺基酸序列八與 給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性％(或者，可表述為 給定胺基酸序列A具有或佔有給定胺基酸序列特定胺 基酸序列一致性％): 胺基酸序列一致性％ = Χ/Υ· 1 〇〇 其中： X為由Α與Β之序列比對程式或算法比對計分為一致性匹 配之胺基酸殘基之數目 且 γ為B中胺基酸殘基之總數目。 若胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等， 則A對B之胺基酸序列一致性％將不等於8對八之胺基酸序 列一致性％。 經”分離"或”純化”之肽、多肽、蛋白質或生物活性片段 係自其自然環境之組分中分離及/或回收而來。污染物組 分包括通常將干擾多肽之診斷或治療用途之物質，且可包 括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質性物質。具有較佳以 非所要污染物質（污染物）之乾重計小於3〇%、較佳小於 20%、10%且較佳小於5%污染物之製劑視為大體上經分離 的纟二刀離之重組產生之肽/多肽或其生物活性部分較佳 128788.doc •53- 200846358 大體上不含培養基，亦即，培養基佔肽/多肽製劑之體積 較佳小於20%，較佳小於約1 0%且較佳小於約5%。污染物 之實例包括細胞殘骸、培養基及活體外合成肽/多肽期間 所使用及所產生之物質。 保守取代在表A中以”較佳取代”為題頭展示。若該等取 代使得生物活性變化，則可引入如表A命名為’’例示性取代’’， 或如下文參考胺基酸類別進一步描述之更多實質性變化且 篩選產物。

• 表A 原始殘基 例示性取代 較佳取代 Ala(A) val、leu、ile val Arg(R) lys、gin、asn lys Asn(N) gin、his、asp、lys、arg gin Asp(D) glu、asn glu Cys(C) ser、ala ser Gln(Q) asn、glu asn Glu(E) asp 、 gin asp Gly(G) ala ala His(H) asn、gin、lys、arg arg He(I) leu、val、met、ala、phe、正白胺酉曼 leu Leu(L) 正白胺酸、ile、val、met、ala、phe ile Lys(K) arg、gin、asn arg Met(M) leu、phe、ile leu Phe(F) leu、val、ile、ala、tyr tyr Pro(P) ala ala Ser(S) thr ' cys cys Thr(T) ser ser Trp(W) tyr、phe tyr Tyr(Y) trp ^ phe ^ thr ^ ser phe Val(V) ile、leu、met、phe、ala、正白胺酸 leu 肽/多肽之生物性質之實質性修飾係藉由選擇在其對維 持以下情形之作用方面顯著不同之取代來實現：（a)取代區 域中多肽骨架之結構，例如摺疊片或螺旋構形；（b)分子中 -54- 128788.doc 200846358 靶位點處之電荷或疏水性；或（C)側鏈體積。基於共同側鏈 性質將天然存在之殘基分為以下群組： (1) ¾丨l 水性·正白胺酸、met、ala、val、leu、ile ; (2) 中性親水性：cyS、ser、thr ; (3) 酸性：asp、glu ; (4) 驗性· asn、gin、his、lys、arg ; (5) 影響鏈取向之殘基：gly、pr〇 ;及 (6) 方族· trp、tyr、phe。 非保守性取代將需要該等類別中之一者之成員交換為另 一類別。

HtrAl PDZ域-配位體相互作用或仙八3 ?〇2域_配位體相 互作用之抗體調節劑之變異體亦可基於此項技術中已知之 資訊在大體上不影響抗體活性之情況下製備。舉例而言， 抗體變異體在抗體分子中可具有至少一個經不同殘基置換 之胺基酸殘基。就抗體而言，雖然取代突變誘發最關注之 位點通常包括高變區，但亦涵蓋構架區（FR)變異。 就抗體而言，一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體 (例如人化抗體或人類抗體）之一或多個高變區殘基。選擇 用於進一步研發之所得變異體相對於產生其之親本抗體通 常將具有經改良之生物學性質。一種用於產生該等取代變 異體之便利方法涉及使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言 之’使數個高變區位點（例如，6-7個位點）突變以在各位點 處產生所有可能之胺基酸取代。當如此所產生之抗體與封 裝於各粒子中之Ml3之基因III產物融合時，其由絲狀噬菌 128788.doc •55- 200846358 體粒子呈現。隨後就如本文所揭示之抗體之生物學活性 (例如，結合親和力）篩選噬菌體呈現之變異體。為鑑別用 於修飾之候選鬲變區位點，可進行丙胺酸掃描突變以鑑別 顯著有助於抗原結合之高變區殘基。另外或其他，其可有 盈於分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別抗體與抗原 之間的接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基為根據本文詳述 之技術進行取代之候選殘基。一旦產生該等變異體，則使 使變異體組經受如本文所述之篩選，且可在一或多個相關 檢定中選擇具有優良性質之抗體用於進一步研發。 編碼抗體之胺基酸序列變異體之核酸分子係由多種此項 技術已知之方法製備。該等方法包括（但不限於）自天然來 源分離（在天然存在之胺基酸序列變異體之情況下），或由 早期製備之變異體或抗體之非變異體形式的募核苷酸介導 (或位點特異性）之突變誘發、PCR突變誘發及序列盒突變 誘發製備。 可希望在本發明之免疫球蛋白多肽之Fc區中引入一或多 處胺基酸修飾，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含 在一或多個胺基酸位置（包括鉸鏈半胱胺酸位置）處包含胺 基酸修飾（例如取代）之人類Fc區序列（例如人類IgG 1、 IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區）。 在一實施例中，Fc區變異體可呈現改變之新生兒Fc受體 (FcRn)結合親和力。該等變異Fc區可包含Fc區之以下胺基 酸位置中任一或多處之胺基酸修飾：238、252、253、 254 、 255 、 256 、 265 、 272 、 286 、 288 、 303 、 305 、 307 、 128788.doc -56- 200846358 309 、 311 、 312 、 317 、 340 、 356 、 360 、 362 、 376 、 378 、 380 、 382 、 386 、 388 、 400 、 413 、 415 、 424 、 433 、 434 、 435、436、439或447，其中？(：區中殘基之編號為如^5&1 中EU指數之編號。與FcRn之結合減弱之Fc區變異體可包 含Fc區之以下胺基酸位置中任一或多處之胺基酸修飾： 252 、 253 、 254 、 255 、 288 、 309 、 386 、 388 、 400 、 415 、 433、43 5、436、439或447，其中Fc區中殘基之編號為如 Kabat中EU指數之編號。或者，以上所提及之Fc區變異體 Φ 可呈現增強之與FcRn之結合且包含Fc區之以下胺基酸位置 中任一或多處之胺基酸修飾：238、256、265、272、 286 、 303 、 305 、 307 、 311 、 312 、 317 、 340 、 356 、 360 、 362 、 376 、 378 、 380 、 382 、 413 、 424或434 ，其中 Fc區中 殘基之編號為如Kabat中EU指數之編號。 與Fc(R之結合減弱之Fc區變異體可包含Fc區之以下胺基 酸位置中任一或多處之胺基酸修飾：238、239、248、 249 、 252 ' 254 、 265 、 268 、 269 、 270 、 272 、 278 、 289 、 • 292 、 293 、 294 、 295 、 296 、 298 、 301 、 303 、 322 、 324 、 327 、 329 、 333 、 335 、 338 、 340 、 373 、 376 、 382 、 388 、 389 、 414 、 416 、 419 、 434 、 435 、 437 、 438或439 ，其中 Fc區中殘基之編號為如Kabat中EU指數之編號。 舉例而言，Fc區變異體可呈現減弱之與Fc(RI之結合且 包含Fc區）之以下胺基酸位置中任一或多處之胺基酸修 飾：23 8、265、269、270、327或329，其中Fc區中殘基之 編號為如Kabat中EU指數之編號。 128788.doc -57- 200846358

Fc區變異體可呈現減弱之與Fc(RII之結合且包含Fc區）之 以下胺基酸位置中任一或多處之胺基酸修飾：238、265、 269 、 270 、 292 、 294 、 295 、 298 ' 303 、 324 、 327 、 329 、 333 、 335 、 338 、 373 、 376 、 414 、 416 、 419 、 435 、 438或 439，其中Fc區中殘基之編號為如Kabat中EU指數之編號。 所關注之Fc區變異體可呈現減弱之與Fc(RIII之結合且包 含Fc區）之以下胺基酸位置中任一或多處之胺基酸修飾： 238 、 239 、 248 、 249 ' 252 、 254 、 265 、 268 > 269 、 270 、 272 、 278 、 289 、 293 、 294 、 295 、 296 、 301 、 303 、 322 、 327 、 329 、 338 、 340 、 373 、 376 、 382 、 388 、 389 、 416 、 43 4、43 5或437，其中Fc區中殘基之編號為如Kabat中EU指 數之編號。 具有改變（亦即，提高或減弱）之Clq結合及/或補體依賴 性細胞毒性（CDC)之Fc區變異體描述於WO 99/51642中。 該等變異體可包含Fc區之以下胺基酸位置中任一或多處之 胺基酸取代：270、322、326、327、329、331、333 或 334。關於Fc區變異體，亦請參見Duncan及Winter 322:73 8-40 (1988);美國專利第5,648,260號、美國專利第 5,624,821 號及 WO 94/29351。 載體構造 可使用標準合成及/或重組技術獲得編碼本文所述之肽 及多肽之聚核苷酸序列。可自適當來源細胞分離且定序所 要聚核苷酸序列。抗體之來源細胞將包括抗體產生細胞， 諸如融合瘤細胞。或者，可使用核苷酸合成儀或PCR技術 128788.doc •58- 200846358 合成聚核苷酸。一旦獲得編碼肽或多肽之序列，即可將其 插入能夠在宿主細胞中複製且表現異源聚核苷酸之重組載 體中。出於本發明之目的，可使用可獲得且為此項技術中 所已知之多種載體。適當載體之選擇將主要視待插入載體 中之核酸的大小及待經該載體轉型之特定宿主細胞而定。 各載體視其功能（異源聚核苷酸之擴增或表現或兩者）及其 與其所駐留之特定宿主細胞之相容性而定含有多種組分。 載體組分通常包括（但不限於）：複製起點（尤其當將載體插 入原核細胞中時）、選擇標記基因、啟動子、核糖體結合 位點（RBS)、信號序列、異源核酸插入及轉錄終止序列。 含有來源於與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列 的質體載體通常與該等宿主聯合使用。該載體通常帶有複 製位點以及能夠在經轉型細胞中提供表型選擇之標記序 列。舉例而言’通常使用來源於大腸桿菌（五· co/〇物種之 質體pBR3 22轉型大腸桿菌。pBR322含有編碼安比西林 (ampicillin，Amp)及四環素（tetracycline，Tet)抗性之夷 因，且因此提供鑑別經轉型細胞之容易方式。pBR322、 其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修_以 含有可由微生物使用以供表現内源蛋白質之啟動子。 此外，含有與宿主微生物相容之複製子及控制序列的喔 菌體載體可與該等宿主聯合用作轉型載體。舉例而言，可 利用諸如XGEM.TM·-11之噬菌體製備可用於轉型諸如大腸 桿菌LE392之易感宿主細胞的重組载體。 根據可由熟習此項技術者確定之特定情形之需要，本發 128788.doc -59- 200846358 明中可使用組成性或誘導性啟動子。熟知大量由多種潛在 宿主細胞識別之啟動子。可藉由經由限制酶消化自來源 DNA移除啟動子且將所分離之啟動子序列插入所選載體中 使所選啟動子與編碼本文所述之多肽之順反子D遍可操作 性連接1使用原生啟動子序列與多種異源啟動子兩者指 導靶基因之擴增及/或表現 '然而，因與原生靶多肽啟動 子：比：異源啟動子通常允許所表現靶基因之較高轉錄及 較南產量，故其較佳。

適於用於原核宿主之啟動子包括ph〇A啟動子、β_半乳糖 苦酶及乳糖啟動子㈣、色胺酸㈣啟動子线及雜交啟 動子（諸如⑽或的啟動子）。然、而，在細菌中具有功能之1 他啟動子（諸如其他已知細菌心菌體啟動子）亦為合適 的。已公開其核㈣序列，從而使得熟練工人能夠使用連 接子或轉接子（adaptQrs)使其與編碼餘輕鏈及重鏈之順反 子可操作性連接（Siebenlist等人（198〇)㈣2〇 2的）以提供 任何所需之限制位點。 a 在-些實施例中，重組载體中之各順反子包含指導所表 現多肽跨膜遷移之分泌信號序列組分。信號序列通常可為 载體之組分’或其可為插人載體中之標乾多肽DNA之部 分。出於本發明之目的所選擇之信號序列應為由宿主細胞 識別且加工（亦即，由信號肽酶裂解）之信號序列。對於不 識別且加工異源多肽之原生信號序列的原核宿主細胞而 言，使信號序列經(例如)選自由以下各序列組成之群之原 核信號序列取代：驗性⑽酶、青黴素酶、ipp或執穩定 128788.doc 200846358 性腸毒素 II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA 及 MBP。 適於表現多肽之原核宿主細胞包括（但不限於）古細菌 (Archaebacteria)及真細菌（Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性 (Gram-negative)生物體或革蘭氏陽性（Gram -positive)生物 體。適用細菌之實例包括埃希氏桿菌屬（Escherichia)(例如 大腸桿菌）、桿菌屬（Bacilli)(例如枯草芽孢桿菌（万 、腸細菌（Enter〇bacteria)、假單胞菌 (Pseudomonas)物種（例如綠膿桿菌（户叹⑹叫、鼠傷寒 々、門氏杯菌（Salmonella typhimurium)、黏質沙雷菌 (Seiratia maixescans)、克雷伯氏菌屬（KlebsieUa)、變形桿 菌屬（Proteus)、志贺桿菌屬（Shigella)、根瘤菌屬 (Rh1Z〇bia)、透明顫菌屬（Vitre〇sciUa)或副球菌屬 (Paracoccus) ^在一些實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。 宿主細胞較佳應分泌最低量之蛋白質水解酶，且可能需要 將其他蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。 肽或多肽製備 將宿主細胞用上述表現載體轉型或轉染，且在酌情改良 以供誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所要序列之基因 之習知營養培養基中培養。 轉木係指實際上表現或不表現任何編碼序列之宿主細胞 對表現載體之吸收。—般技術者已知多種轉染方法，例如

CaPCU沈澱及電穿孔。者 牙孔田佰主細胞内出現對該載體之操作 之任何指示時，通常認為轉染成功。 128788.doc • 61 - 200846358 轉型意謂將DNA引入原核宿主中，以便應可作為毕色 體外元件或由染色體成分複製。視所使用之宿主細胞而 疋，使用適於料細胞之標準技術進行轉型。對含有實質 細胞壁障壁之細菌細胞而言，通常使用採用氯化鈣之鈣處 H㈣方法㈣聚乙二醇/D则。所使用之另一技 術為電穿孔。此項技術中已知其他技術。 使用於產生本發明之多肽之原核細胞在此項技術中已知 且適於培養所選宿主細胞的培養基中生長。合適培養基之 實例包括盧氏肉湯（LuHa brGth，LB)加必需養分補充物。 在較佳實施例中，培養基亦含有基於表現載體之構造而選 擇之選擇劑，其用以選擇性允許含有表現载體之原核細胞 長舉例而5，將女比西林添加至培養基中以使表現安 比西林抗性基因之細胞生長。 除碳、氮及無機磷酸鹽源外，亦可包括單獨或以與另一 補充物或培養基之混合物（諸如複合氮源）之形式引入之適 當濃度的任何必需補充物。培養基視情況可含有一或多種 選自由以下各物組成之群的還原劑：麩胱甘肽、半胱胺 酉文胱胺、巯基乙酸酯、二硫赤藻糖醇及二硫蘇糖醇。 在合適溫度下培養原核宿主細胞。對大腸桿菌生長而 言’例如，較佳溫度在約2(rc至約39^、更佳約251至約 37°C之範圍内，甚至更佳在約3(rc下。培養基之pH值主要 視宿主生物體而定可為約5至約9範圍内之任何？只值。對大 腸桿菌而言，pH值較佳為約6.8至約7,4，且更佳為約7〇。 若在表現載體中使用誘導性啟動子，則在適於活化啟動 128788.doc -62· 200846358 子之條件下誘導蛋白質表現。舉例而言，若使用ph〇A啟動 子來控制轉錄，則可在磷酸鹽限制培養基中培養經轉型宿 主細胞以供誘導。如此項技術中所已知，可根據所採用之 載體構築體使用多種其他誘導物。 在微生物中表現之本文所述之多肽可分泌於宿主細胞之 周質中且自其中回收。蛋白質回收通常涉及通常藉由諸如 滲壓衝擊、超音波處理或細胞溶解之方式破壞微生物。一 旦細胞裂解，即可藉由離心或過濾移除細胞殘骸或全細 _ 胞。可（例如）由親和性樹脂層析進^一步純化蛋白質。或 者’蛋白質可轉運至培養基中且自其中分離。可自培養物 中移除細胞，且將培養物上清液過濾且濃縮以進一步純化 所產生之蛋白質。可使用通常已知之方法進一步分離及鐘 別所表現之多肽’該等方法諸如經免疫親和性或離子交換 柱分級分離；乙醇沈澱；逆相HPLC ;經二氧化石夕或諸如 DEAE之陽離子交換樹脂層析;層析聚焦 (chromatofocusing) ; SDS-PAGE ;硫酸銨沈澱；使用（例 ❿ 如）Sephadex G-75之凝膠過濾；疏水性親和性樹脂；使用 固定於基質上之合適抗原之配位體親和力及西方墨點檢定 (Western blot assay) 〇 除原核宿主細胞外，此項技術中亦充分確立真核宿主細 胞系統。合適宿主包括（但不限於）哺乳動物細胞株，諸如 CHO ;及昆蟲細胞，諸如以下所述之細胞。 多肽/肽純化 可純化所產生之多肽/肽以獲得對進一步檢定及使用而 128788.doc -63- 200846358 言大體上均質之製劑。可採用此項技術中已知之標準蛋白 質純化方法。下列程序為合適純化程序之實例但不意欲受 此限制：經免疫親和性或離子交換柱分級分離；乙醇沈 澱；逆相HPLC ;經二氧化矽或諸如DEAE之陽離子交換樹 脂層析；層析聚焦；SDS-PAGE ;硫酸銨沈澱；及使用（例 如）SephadexG-75之凝膠過濾、。

HtrAl PDZ域及HtrA3 PDZ域調節劑之鑑別及表徵：一般 方法 • 例如結合肽之候選HtrAl PDZ域及HtrA3 PDZ域調節劑 可由許多此項技術中已知之方法鑑別。調節劑之調節特徵 可藉由測定調節劑調節HtrAl PDZ域與其細胞結合搭配物 或HtrA3 PDZ域與其細胞結合搭配物之間的相互作用之能 力來評估。一個重要特徵為結合親和力。所關注之候選調 節劑（例如肽）之結合特徵可以許多此項技術中已知之方式 中之任一種評估。 方法中之起始步驟可包括產生一或多種包含所關注之序 ® 列之候選肽，隨後使其在適於測定其HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域結合特徵之條件下呈現。舉例而言，可使用與諸如 p3或p8之鞘蛋白之蛋白質融合體使候選肽在例如絲狀噬菌 體（噬粒）之噬菌體或噬粒的表面上呈現為肽之羧基末端（C-末端）呈現文庫。C-末端呈現在此項技術中為已知的。參 見，例如 Jespers 等人，价幻；（W Γ)· 13:378-82及 WO 00/06717。可使用該等方法製備本發明之融合基因、 融合蛋白質、載體、重組噬菌體粒子、宿主細胞及其文 128788.doc -64- 200846358 庫。如本文所述，在一些實施例中，其可適用於使候選肽 在噬菌體或噬粒之表面上呈現為肽之胺基末端（N-末端）呈 現文庫。N-末端噬菌體（噬粒）呈現之方法包括彼等本文中 所述之方法及彼等此項技術中熟知之方法，例如，如美國 專利第5,750,373號（及其中所引用之參考文獻）中所述。表 徵由該等方法獲得之結合子分子之方法亦為此項技術中所 已知，包括彼等以上所引用之參考文獻中所揭示之方法 (&3?61^等人，\¥0 00/06717及美國專利第5,750,3 73號）及 如本文所述之方法。 (i) HtrAl PDZ域或Htr A3 PDZ域之結合噬菌體之分離 使具有所呈現之候選HtrAl PDZ域結合肽或HtrA3 PDZ 域結合肽之噬菌體呈現文庫與HtrAl PDZ域蛋白質或融合 蛋白質或HtrA3 PDZ域蛋白質或融合蛋白質活體外接觸以 確定文庫中與HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域標靶結合之彼 等成員。可使用熟習此項技術者已知之任何方法檢定活體 外蛋白質結合。舉例而言，可進行1、2、3或4輪或4輪以 上結合選擇，此後分離個別噬菌體且視情況以噬菌體 ELISA分析。可使用噬菌體ELISA測定肽呈現噬菌體粒子 與經固定PDZ|&蛋白質之結合親和力（Barrett等人，dna/ Biochem. 204:357-64 (1992)) °

在就候選物與已知HtrAl PDZ域結合子或HtrA3 PDZ域 結合子分別競爭結合HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域之能力 對其加以評估之情形下，提供適當結合競爭條件。舉例而 言，在一實施例中，可在一或多種濃度之已知HtrAl PDZ 128788.doc -65- 200846358 域結合子或HtrA3 PDZ域結合子存在下進行篩選/選擇/生 物淘選。在另一實施例中，接著可在競爭性ELIS A檢定中 在已知HtrAl PDZ域結合子或HtrA3 PDZ域結合子存在下 評估自文庫分離之候選結合子。 (ii) HtrAl PDZ 域或 HtrA3 PDZ 域之製備 可使用習知合成或重組技術便利地以含有該域之蛋白質 片段或融合多肽形式製備HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域。 融合多肽適用於噬菌體（噬粒）呈現，其中在表現研究、細 胞定位、生物鑑定、ELISA(包括結合競爭檢定）等中HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域為乾抗原。HtrAl PDZ域或HtrA3 ?0乙域”嵌合蛋白質”或”融合蛋白質”包含與非PDZ域多肽 融合之HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域。非PDZ域多肽大體上 不與PDZ域同源。HtrAl PDZ域融合蛋白質或HtrA3 PDZ域 融合蛋白質可包括整個PDZ域之任何部分，包括任何數量 之生物活性部分。隨後可根據已知方法使用親和性層析法 及與非PDZ域多肽結合之捕集試劑純化融合蛋白質。可使 HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域與親合性序歹ij、例如GST(麩 胱甘肽S-轉移酶）序列之C-末端融合。該等融合蛋白質有 利於使用（例如）與固體支撐物結合及/或附著於固體支撐物 (例如，用於肽篩選/選擇/生物淘選之基質）之麩胱甘肽來 純化重組HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域。其他例示性融合 體呈示於表B中，包括該等融合體之一些常見用途。 融合蛋白質可使用重組方法容易地產生。可將編碼 HtfAl PDZ域（或其部分）或HtrA3 PDZ域（或其部分）之核酸 128788.doc -66· 200846358 與非PDZ域編碼核酸在PDZ域N-末端、^末端或内部同框 融合。亦可由習知技術’包括自，DNA合成儀合成融合基 因。PCR擴增亦適用，其使用在兩個連續基因片段之間產 生互補懸垂物之錨定引子’該等基因片段接著可黏接且再 擴增以產生攸合基因序列（Ausubel等人，Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, New York 1987)。可購得許多有利於同框亞選殖HtrAi pdz域或 HtrA3 PDZ域為融合蛋白質之載體。 Φ 表B適用非PDZ域融合多肽 融合搭配物 活體外 —- 活體内 人類生長激素(hGH) 放射免疫檢定 無 P-葡糖醛酸酶(GUS) 比色、螢光或化學發光 比色（用X-gluc進行組織 化學染色） 綠色螢光蛋白質(GFP)及 相關分子(RFP、BFP、 YFP域等） 螢光 ' ~ 螢光 螢光素酶(螢火蟲） 生物發光 生物發光 氯黴素乙醯轉移酶(CAT) 層析、微分萃取、螢光或免疫 檢定 無 p-半乳糖苷酶 比色、螢光、化學發光 比色(用X-gal進行組織化 學染色）、活細胞中之生 物發光 分泌鹼性磷酸酶(SEAP) 比色、生物發光、化學免 無 HIV 之 Tat 調節向細胞質及細胞核中之傳 送 調節向細胞質及細胞核 中之傳送 作為HtrAi PDZ域或HtrA3 PDZ域融合體之一實例 GST-HtrAl PDZ融合體可自所關注之基因以下列方式製 備。用所關注之全長基因作為模板，使用PCR使用引入方 便的限制酶位點以有利於亞選殖之引子擴增編碼PDZ域之 DNA片段。將各擴增片段用適當限制酶消化且選殖至諸如 pGEX6P-3或pGEX-4T-3之經類似消化之質體中，該質體含 128788.doc -67- 200846358 有GST且經設計以使得亞選殖片段將與GST同框且與啟動 子可操作性連接，從而產生編碼GST-HtrAl PDZ融合蛋白 質或GST-HtrA3 PDZ融合蛋白質之質體。 為產生融合蛋白質，通常使含有適當表現質體之大腸桿 菌培養物在LB肉湯中例如在約37 °C下生長至對數中期 (Α_=1·0)，且可用IPTG誘導。藉由離心使細菌成糰粒， 將其再懸浮於PBS中且藉由超音波處理溶解。將懸浮液離 心，且由親和性層析法經0.5 ml麩胱甘肽-瓊脂糖自上清液 • 純化GST-HtrAl PDZ域融合蛋白質或GST_HtrA3 PDZ域融 合蛋白質。 對熟習此項技術者而言將顯而易見，許多變化將實現所 分離HtrAl PDZ域蛋白質或HtrA3 PDZ域蛋白質之目標且 可用於本發明中。舉例而言，HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ 域與抗原決定基標籤之融合體可如上所述構造且使用該等 標籤親合性純化HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域。HtrAl PDZ 域或HtrA3 PDZ域蛋白質/肽亦可在無任何融合體之情況下 ® 製備；另外，替代使用微生物載體產生蛋白質，可改為使 用活體外化學合成。可使用其他細胞產生HtrAl PDZ域或 HtrA3 PDZ域蛋白質/肽，諸如其他細菌、哺乳動物細胞 (諸如COS)或桿狀病毒系統。亦可使用多種產生多種融合 體之聚核苷酸載體。HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域融合蛋 白質之最後純化通常將視融合搭配物而定；例如，聚組胺 酸標籤融合體可以鎳管柱加以純化。 (iii)確定所呈現之肽之序列 128788.doc • 68 - 200846358 可使與具有所要特徵之HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域結 合（且視情況不與無關序列結合）之噬菌體（噬粒）經受序列 分析。在宿主細胞中擴增呈現候選結合肽之噬菌體（噬粒） 粒子，分離DNA且使用任何適當的已知定序技術對基因組 (編碼候選狀）之適當部分定序。 鑑別HtrAl PDZ域-配位體相互作用或HtrA3 PDZ域-配位 馥相互作用之調節劑之其他方法 另一鑑別HtrAl PDZ域-配位體結合或HtrA3 PDZ域-配位 體結合之調節劑之方法為併入合理藥物設計；亦即理解且 利用PDZ相互作用之生物學。在該方法中，確定PDZ配位 體中之關鍵殘基，同時視情況確定最佳肽長度。隨後，設 計具有所掌握資訊之小分子；例如，若發現色胺酸為與 PDZ域結合之關鍵殘基，則將製備且測試含有色胺酸殘基 之小分子作為抑制劑。通常2、3、4或5個胺基酸殘基將確 定為結合之關鍵，且將製備含有該等殘基或殘基側鏈之候 選小分子抑制劑。隨後就抑制HtrAl PDZ域-配位體或 HtrA3 PDZ域-配位體相互作用之能力使用此項技術中熟知 之方案（例如，競爭性抑制檢定）篩選測試化合物。 調節HtrAl PDZ域-配位體結合相互作用或HtrA3卩02域-配位體結合相互作用之化合物適用於治療與HtrAl PDZ域 或HtrA3 PDZ域之結合相互作用調控異常相關之疾病及病 狀。與HtrAl PDZ域相互作用之調控相關之疾病及病狀包 括惡性及良性腫瘤或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病、 神經退化性病症、發炎性及免疫病症及眼内新血管疾病。 128788.doc -69- 200846358 與HtrA3 PDZ域相互作用之調控相關之疾病及病狀包括惡 性及良性腫瘤或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病及胎盤 功能障礙。 \.確定HtrAl PDZ域結合多肽或HtrA3 PDZ域結合多肽中 之關鍵殘基 (a) 丙胺酸掃描 可使用對HtrAl PDZ域結合肽序列或HtrA3 PDZ域結合 肽序列進行之丙胺酸掃描來確定配位體中各殘基對PDZ結 # 合之相對貢獻。為確定PDZ配位體中之關鍵殘基，用單一 胺基酸、通常丙胺酸殘基取代殘基，且評估對PDZ域結合 之影響。參見 US 5,580,723、US 5,834,250 及實例。 (b) 截短（缺失系列）

HtrAl PDZ域結合肽或HtrA3 PDZ域結合肽之截短不僅 可闡明結合關鍵殘基，而且亦可確定達成結合之最小肽長 度。在一些情況下，截短將揭露比原生配位體更緊密結合 之配位體；該肽適用於調節HtrAl PDZ域·· PDZ配位體相 ® 互作用或HtrA3 PDZ域：PDZ配位體相互作用。 較佳地，製備一系列HtrAl PDZ域結合肽截短形式或 HtrA3 PDZ域結合肽截短形式。一個系列將依次截短胺基 末端胺基酸；在另一系列中，截短將在羧基末端處開始。 如在丙胺酸掃描之情況下，肽可在活體外合成或由重組方 法製備。 (c) 合理調節劑設計 基於自丙胺酸掃描及截短分析獲得之資訊，熟習此項技 128788.doc -70- 200846358 術者可設計且合成小分子或選擇富含可能調節結合之化合 物之小分子文庫。舉例而言，基於如實例中所述之資訊， 可設計調節劑肽以包括2個適當間隔之疏水性部分。 (d)結合檢定 形成HtrAl PDZ域結合肽與HtrAl PDZ域之複合物或 HtrA3 PDZ域結合肽與HtrA3 PDZ域之複合物有利於將複 合形式與其未複合形式及雜質分離。HtrAl PDZ域：結合 配位體複合物或Htr A3 PDZ域：結合配位體複合物可於溶 液中形成或其中一個結合搭配物與不可溶支撐物結合。複 合物可（例如）使用管柱層析法自溶液中分離，且當與固體 支撐物結合時可藉由過濾、離心等使用熟知技術分離。使 含PDZ域之多肽或其配位體與固體支撐物結合有利於高產 量檢定。 可就在存在及不存在候選結合化合物之情況下調節（例 如，抑制）結合子多肽與HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域之相 互作用之能力篩選測試化合物，且可在諸如微量滴定板、 試管及微離心管之任何合適容器中實現篩選。亦可製備融 合蛋白質以有利於測試或分離，其中融合蛋白質含有另一 允許該等蛋白質中之一種或兩種與基質結合之域。舉例而 言，可使GST-PDZ結合肽融合蛋白質或GST-PDZ域融合蛋 白質吸附於麩胱甘肽瓊脂糖珠粒（SIGMA Chemical，St. Louis，MO)或經麩胱甘肽衍生化之微量滴定板上，隨後使 其與測試化合物或測試化合物及未吸附HtrAl PDZ域蛋白 質或HtrA3 PDZ域蛋白質或PDZ結合肽組合，且將混合物 128788.doc -71 - 200846358 在允許形成複合物之條件（例如，在鹽及pH值之生理條件 下）下培育。培育後，洗滌珠粒或微量滴定板孔以移除任 何未結合之組分，在珠粒之情況下固定基質，且直接或間 接測定複合物。或者，可使複合物與基質解離，且使用標 準技術測定結合含量或活性。 在篩選檢定中亦可使用其他固定蛋白質於基質上之融合 多肽技術。可使用生物素-抗生物素蛋白或生物素-抗生蛋 白鏈菌素系統固定HUAI PDZ結合肽或HtrAl PDZ域或 # HtrA3 PDZ結合肽或HtrA3 PDZ域。可使用諸如生物素-N-經基-丁二酸亞胺（NHS; PIERCE Chemicals，Rockford，IL) 之許多試劑實現生物素化且固定於經抗生蛋白鏈菌素塗佈 之96孔板（PIERCE Chemical)之孔中。或者，可將與HtrAl PDZ域結合肽或HtrAl PDZ域或與HtrA3 PDZ域結合肽或 HtrA3 PDZ域反應但不干擾結合肽與其靶分子之結合的抗 體衍生化於板之孔中，且使未結合之HtrAl PDZ域或結合 子肽或未結合之HtrA3 PDZ域或結合子肽藉由抗體接合捕 • 集於孔中。偵測該等複合物之方法，除關於經GST-固定之 複合物所述之方法外，亦包括使用與結合子肽或HtrA1 PDZ域或HtTA3 PDZ域反應之抗體之複合物之免疫偵測。

(e)結合之檢定：競爭ELISA 為評估肽、蛋白質或其他HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域 配位體之結合親和力，可使用競爭結合檢定，其中評估配 位體結合HtrAl PDZ域或Htr A3 PDZ域之能力（及必要時， 結合親和力），且將其與已知結合PDZ域之化合物之能力比 128788.doc -72- 200846358 較。 已知許多方法且可用於鑑別結合分子（例如，肽、蛋白 質、小分子等）之結合親和力；例如，結合親和力可使用 競爭ELISA測定為IC5〇值。IC5G值係定義為阻斷HtrAl PDZ 域與配位體結合或HtrA3 PDZ域與配位體結合之50%之結 合子濃度。舉例而言，在固相檢定中，可藉由用中性鏈親 和素、抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素塗佈微孔板（較佳 經處理以高效吸附蛋白質）製備檢定板。隨後經由添加牛 # 血清白蛋白（BSA)或其他蛋白質（例如，脫脂乳）之溶液阻 斷非特異性結合位點，且隨後較佳用含有諸如Tween-20之 洗滌劑之緩衝液洗滌。製備經生物素標記之已知HtrAl PDZ結合子或HtrA3 PDZ結合子（例如，與GST或另一此類 分子融合以有利於純化及偵測之噬菌體肽）且使其與板結 合。製備欲用HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域測試之分子之 連續稀釋液且使其與所結合之結合子接觸。洗滌塗佈有固 定結合子之板，隨後向孔中添加各結合反應物且簡短培 • 育。進一步洗滌後，通常用識別非PDZ融合搭配物之抗體 及識別初級抗體之經標記（諸如辣根過氧化物酶（HRP)、鹼 性磷酸酶（AP)或諸如螢光素之螢光標籤）次級抗體偵測結 合反應。隨後用適當受質（視標記而定）使板顯色且（諸如） 使用光譜光度計板讀取器量化信號。可使用最小二乘法擬 合將吸收信號擬合為結合曲線。因此，可量測各種分子抑 制PDZ域與已知PDZ域結合子結合之能力。 上述檢定之許多變化形式對一般技術者而言將顯而易 128788.doc -73 - 200846358 見。例如，替代抗生物素蛋白-生物素基系統，可使PDZ域 結合子與受質化學連接或簡單吸附。 噬菌體呈現期間可見之PDZ域肽配位體 PDZ域肽配位體，甚至彼等以相對較低之親和力（例如， 與一致序列相比）結合之配位體，為HtrAl PDZ域-配位體 相互作用或Htr A3 PDZ域-配位體相互作用之潛在適用抑制 劑，包括實例（及表1、2及3)中描述之彼等配位體。 競爭性結合ELISA為測定各噬菌體呈現之PDZ域結合肽 之功效之適用方法。 ?>·適體 適體為可用於識別及特異性結合幾乎任何分子之短寡核 苷酸序列。可使用指數富集配位體系統進化（SELEX)方法 (Ausubel 等人，Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons，New York (1987) ; Ellington及 Szostak， Nature. 346:818-22 (1990) ; Tuerk 及 Gold， SckNce· 249:505-10 (1990))尋找該等適體。適體具有許多診斷及臨 床用途；就幾乎任何已在臨床上或診斷上使用抗體之用途 而言，亦可使用適體。另外，適體一旦經鑑別後即可較低 廉地製造且可以多種格式容易地應用，包括以醫藥組合物 形式投藥、生物鑑定及診斷測試（Jayasena，C7h C/zem. 45:1628-50 (1999))。 在上述競爭性ELISA結合檢定中，候選適體之篩選包括 將適體併入檢定中及測定其調節HtrAl PDZ域··配位體結合 或Htr A3 PDZ域：配位體結合之能力。 128788.doc -74- 200846358 I抗體（Ab) 任何調節（例如，抑制）配位體：HtrA1 PDZ域結合或配位 體：HtrA3 PDZ域結合之抗體可分另ij為HtrAl PDZ域-配位體 相互作用或HtrA3 PDZ域-配位體相互作用之調節劑（例 如，抑制劑）。合適抗體之實例包括多株Ab、單株八1>、單 鏈Ab、抗獨特型Ab、嵌合Ab或該等抗體或其片段之人化 形式。抗體可來自任何合適來源，包括合成來源及任何可 產生免疫反應之物種。 篩選方法 本發明涵蓋篩選化合物以鑑別調節HtrAl PDZ域-配位體 相互作用或HtrA3 PDZ域-配位體相互作用之化合物的方 法。設計篩選檢定以鑑別與HtrAl PDZ域及/或配位體或 HtrA3 PDZ域及/或配位體結合或複合或以其他方式干擾 HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域與細胞因子之相互作用之化 合物。一種測定候選化合物為調節劑之能力之方法為評估 在本文中所揭示的諸如任何結合子肽（例如，實例中所述 之高親和力結合子）之已知HtrAl PDZ域結合子或已知 HtrA3 PDZ域結合子存在下候選化合物在競爭性抑制檢定 中之活性。該等篩選檢定將包括適於高產量篩選化學品文 庫從而使其尤其適於鑑別小分子藥物候選物之檢定。 可以多種格式進行檢定，包括蛋白質-蛋白質結合檢 定、生物化學篩選檢定、免疫檢定及細胞基檢定，此在此 項技術中已充分表徵。 調節劑之所有檢定之共同之處在於，需要使藥物候選物 12B788.doc -75- 200846358 與HtrAl PDZ域（或其等效物）及/或參與HtrAl PDZ域與結 合配位體之結合相互作用之結合配位體，或與HtrA3 PDZ 域（或其等效物）及/或參與HtrA3 PDZ域與結合配位體之結 合相互作用之結合配位體在足以允許該兩個組分相互作用 之條件下接觸且歷時足以允許該兩個組分相互作用之時 間。 在結合檢定中，相互作用為結合且可分離或偵測反應混 合物中所形成之複合物。在一特定實施例中，將候選物質 或分子藉由共價或非共價連接固定於固相上，例如微量滴 定板上。非共價連接通常藉由用物質/分子之溶液塗佈固 體表面且乾燥來實現。或者，可使用對待固定之物質/分 子具有特異性之經固定親和力分子、諸如抗體（例如單株 抗體）將其錨定於固體表面。藉由將可經可偵測標記加以 標記之未固定組分添加至經固定組分（例如，含有所錨定 組分之塗佈表面）進行檢定。當反應完成時，（例如）藉由洗 滌來移除未反應組分，且偵測錨定於固體表面上之複合 物。當最初未固定之組分帶有可偵測標記時，固定於表面 上之標記之偵測表明發生複合。當最初未固定之組分不帶 有標記時，可（例如）藉由使用特異性結合經固定複合物之 經標記抗體來偵測複合。 若候選化合物與HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域或者HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域之結合搭配物相互作用但不與其結 合，則可由债測蛋白質-蛋白質相互作用之熟知方法檢定 其與多肽之相互作用。該等檢定包括慣用方法，諸如交 128788.doc -76- 200846358 聯、共免疫沈澱及經由梯度或層析管柱共純化。另外，如 Chevray^ Nathans, Proc. Natl. Acad· Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991)所揭示，可藉由使用Fields及同事所述之酵母 基遺傳系統監測蛋白質-蛋白質相互作用（Fields及Song， Nature (London), 340:245-246 (1989) ; Chien等人，Proc· Natl· Acad. Sci. USA，88:9578-9582 (1991))。許多諸如酵 母GAL4之轉錄活化劑由兩個物理離散之模組化域組成， 一個充當DNA結合域，另一個充當轉錄活化域。前述公開 案中所述之酵母表現系統（通常稱為”雙雜交系統”）利用該 性質且採用兩個雜交蛋白質，在其一個中靶蛋白質與 GAL4之DNA結合域融合，且在另一個中候選活化蛋白質 與活化域融合。在GAL4活化啟動子控制下之GALl-lacZ報 導基因之表現係依賴於GAL4活性經由蛋白質-蛋白質相互 作用之重構。用β-半乳糖苷酶之發色受質偵測含有相互作 用多肽之群落。使用雙雜交技術鑑別兩個特定蛋白質之間 的蛋白質-蛋白質相互作用之完整套組（matchmaker™) 可購自Clontech。該系統亦可經擴展以定位參與特異性蛋 白質相互作用之蛋白質域以及精確定位對該等相互作用而 言關鍵之胺基酸殘基。 在任何上述篩選方法中，通常希望藉由測定候選化合物 與HtrAl PDZ域及已知高親和力結合子（諸如本文所述之結 合子中之一種）或HtrA3 PDZ域及已知高親和力結合子（諸 如本文所述之結合子中之一種）結合之能力來評估其調節 能力。 I28788.doc -77- 200846358 可基於本文所述之資訊，尤其與配位體内之個別殘基及 部分對HtrAl PDZ域-配位體結合相互作用或配位體内之個 別殘基及部分對HtrA3 PDZ域-配位體結合相互作用之貢獻 及重要性或HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域序列本身相關之 資訊，由已知結合子之組合文庫及/或突變產生候選化合 物。 可如下測試干擾HtrAl PDZ域與結合配位體或HtrA3 PDZ域與結合配位體之相互作用之化合物：通常在允許 PDZ域與配位體相互作用及結合之條件下且歷時允許該相 互作用及結合之時間製備含有HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ 域及配位體之反應混合物。為測試候選化合物抑制結合相 互作用之能力，在不存在及存在測試化合物之情況下進行 反應。另外，可將安慰劑添加至第三反應混合物中以充當 陽性對照。如上文所述監測測試化合物與存在於混合物中 之HtrAl PDZ域及/或結合配位體或存在於混合物中之 HtrA3 PDZ域及/或結合配位體之間的結合（複合物形成）。 在對照反應中但不在含有測試化合物之反應混合物中形成 複合物表明測試化合物干擾HtrAl PDZ域與結合配位體之 相互作用或HtrA3 PDZ域與結合配位體之相互作用。 如本文所述，本發明之物質/分子可為肽。獲得該等肽 之方法在此項技術中為熟知的且包括篩選肽文庫中靶抗原 之結合子。在一實施例中，合適靶抗原包含HtrAl PDZ域 或HtrA3 PDZ域（或其包含HtrAl PDZ域配位體或HtrA3 PDZ域配位體之結合位點之部分），其在本文中詳細描述。 128788.doc -78 - 200846358 肽之文庫在此項技術中為熟知的且亦可根據此項技術已知 之方法製備。參見，例如Clark等人，美國專利第 6,121，416號。與異源蛋白質組分（諸如噬菌體鞘蛋白）融合 之肽文庫在此項技術中為熟知的，例如，如Ciark等人， 上述中所述。在一實施例中，具有阻斷HtrA1 pDZ域蛋白 質-蛋白質相互作用或HtrA3 PDZ域蛋白質-蛋白質相互作 用之能力之肽包含任何本文所揭示之結合子肽之胺基酸序 列。在另一實施例中，具有阻斷HtrAl PDZ域蛋白質-蛋白 • 質相互作用或HtrA3 PDZ域蛋白質-蛋白質相互作用之能力 之肽包含由如上所述的調節劑篩選檢定獲得之結合子肽之 胺基酸序列。在一實施例中，肽具有與一或多種本文所揭 示之結合子肽（參見實例）競爭結合Htr A1 PDZ域或Htr A3 PDZ域之能力。在一實施例中，肽與本文所揭示之一或多 種結合子肽（參見實例）所結合之HtrAl PDZ域上之同一抗 原決定基結合或HtrA3 PDZ域上之同一抗原決定基結合。 可藉由篩選肽之突變體以獲得所關注之特徵（例如，靶結 ^ 合親和力增強、藥物動力學增強、毒性降低、治療指數提 尚等）產生第一肽結合子之變異體。突變誘發技術在此項 技術中為熟知的。此外，掃描突變誘發技術（諸如基於丙 胺酸掃描之技術）尤其可有助於評估肽内個別胺基酸殘基 之結構及/或功能重要性。 可藉由在活體外或活體内檢定中測試物質/分子之調節 能力進行本發明之候選物質/分子（諸如包含本文所揭示之 結合子肽之胺基酸序列的肽）調節HtrAl PDZ域活性或 128788.doc -79- 200846358

HtrA3 PDZ域活性之能力的測定，所述檢定在此項技術中 已充分確立，例如，如Martins等人（乂 5M/· C/zem. 278(49):49417-49427 (2003))及 Faccio 等人（丄 Biol Chem· 275(4):2581-2588 (2000))中所述。

HtrAl PDZ域結合子及HtrAl PDZ域-配位體相互作用之調 節劑或HtrA3 PDZ域結合子及HtrA3 PDZ域-配位體相互作 用之調節劑之用途的實例 如本文所述之HtrAl PDZ域肽結合子或HtrA3 PDZ域肽 • 結合子之鑑別及表徵分別提供對HUA1蛋白質或HtrA3蛋白 質的細胞功能之有價值之見解且提供用於調節該等重要細 胞蛋白質與其結合搭配物之間的活體内相互作用之組合物 及方法。舉例而言，可利用該等肽及其同源物來干擾涉及 HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域之活體内結合相互作用。同 源物可基於其相對於本文所提供之經充分表徵之肽之結合 及/或功能特徵便利地產生。可進一步利用該等肽來闡明 構成HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域活體内複合物之細胞及 ® 生理學多肽。實際上，如本文所述之意外結果所示，可將 HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域之結合搭配物定位於多肽之 習知C-末端區以及迄今未知之N-末端區及/或内部區域。 如本文所述（參見，例如實例），可進一步使用HtrAl PDZ域或Hti*A3 PDZ域之經充分表徵之高親和力肽結合子 來闡明HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域本身之重要結構特 徵。與此相關之知識提供基於HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ 域序列本身之修飾開發調節劑。本發明提供如本文所揭示 128788.doc -80- 200846358 具有增強或降低之與HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域結合搭 配物結合之能力的HtrAl PDZ域變異體及HtrA3 PDZ域變 異體。可類似地鑑別其他變異體。 可使用基於本文所述之配位體肽開發之HtrAl ?0冗域_結 合搭配物調節劑或HtrA3 PDZ域-結合搭配物調節劑達成所 關注之調節作用。舉例而言，該操作可包括抑制HtrAl PDZ域與其同源結合蛋白質之間的締合或抑制HtrA3 PDZ 域與其同源結合蛋白質之間的締合。在另一實例中，該操 # 作可包括經由（例如）誘發作為調節劑與HtrAl PDZ域或 HtrA3 PDZ域結合之結果之細功能或經由由調節劑增強 HtrAl PDZ域與其同源結合蛋白質之間的缔合或由調節劑 增強HtrA3 PDZ域與其同源結合蛋白質之間的締合的促效 作用。

HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域之調節劑之其他用途包括 與HtrAl或Hti*A3及其締合搭配物相關之疾病之診斷檢定， HtrAl PDZ域或 HtrA3 PDZ域及 HtrAl PDZ域或 HtrA3 PDZ • 域之配位體在融合蛋白質中分別用作受質之純化柄及錨。 如本文所述之能夠以不同親和力與HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域結合之結合子的鑑另ij提供活體内調節生物學上重要 之蛋白質-蛋白質相互作用的適用途徑。如此項技術中已 充分確立，HtrAl蛋白質牽涉於重要生物學過程中，包括 (例如）加工澱粉樣前驅體蛋白質，且HtrAl之下調已牽涉 於癌症發展中（亦即，尤其子宮内膜癌、卵巢癌及黑素 瘤），而HtrAl之上調已牽涉於關節炎及年齡相關（濕型）黃 128788,doc -81 - 200846358 斑退化中。如此項技術中已充分確立，舰3蛋白質牵涉 :重要生物學過程中，包括胎盤發育，且HtrA3之調控異 常已牽涉於癌症發展中（亦即，尤其子宮内膜癌）。祕、】 及HtrA3蛋白質各自含有pDZ域，其為據報導在蛋白質-蛋 白、，。口相互作用令至關重要之域。因&，能夠調節該等相 互作用之分子之鑑別指出治療及/或診斷應用之途徑及在 不存在該等分子及相互作用之知識之情況下不會成為可能 之策略。可使用此項技術已知之適#投藥途徑，例如經由 微量注射、觸角足肽或脂質轉染試劑，將調節化合物(例 如’抑制型或促效型）傳送至活細胞中以充當舰域 特異性或HtrA3 PDZ域特異性料調節劑以調節且在一些 情況下驗證HtrA1 PDZ域.配位體相互作用或·Α3観域· 配位體相互作用在特定組織、細胞、器官或病理學病狀中 之生理學重要性。存在監測舰配位體相互仙及調節該 相互作用之生理效應的合適檢定。此並不要求pDz 域或HtrA3 PDZ域之生理學配位體由噬菌體呈現發現僅 要求調節劑對PDZ域具有特異性且具有破壞該配位體與 觀域之相互作用之足夠親和力。最後，#同任何與疾病 過程相關聯之蛋白質，必須確定藥物將如何影響蛋白質以 達成治療效益。可將諸如肽/配位體之調節化合物傳送至 活細胞或動物模型中，該等模型為確輯關注之調節化合 物對HtrA1 PDZ域-配位體相互作用pDz域·配位體 相互作用之破壞是否提供與治療效益之期望相符之結果的 疾病模型（亦即’模擬疾病之某些性質）。 128788.doc -82- 200846358 活體内偵測蛋白質-蛋白質（或肽）相互作用之方法在此項 技術中為已知的。舉例而言，可使用Michnick等人在美國 專利第6,270,964 B1號及第6,294,330 B1號中所述之方法分 析含HtrAl PDZ域蛋白質或含HtrA3 PDZ域蛋白質（包括本 文所述之任一者）與同源配位體或合成肽（包括本文所述之 任一者）之相互作用。此外，可使用該等方法評估諸如合 成肽之分子活體内調節HtrAl PDZ域蛋白質與其同源配位 體或HtrA3 PDZ域蛋白質與其同源配位體之結合相互作用 之能力。 治療性/預防性應用 具有增加或降低HtrAl PDZ域或HtrA3 PDZ域蛋白質活 性之性質之化合物係適用的。該活性之增加可以多種方式 發生，例如藉由向有需要之個體投與有效量之一或多種本 文所述之調節劑。 ”拮抗劑”或”負調節劑”包括部分或完全阻斷、抑制或中 和HtrAl PDZ域及/或其内源配位體或HtrA3 PDZ域及/或其 内源配位體之生物活性之任何分子。類似地，”促效劑”或 ’’正調節劑”包括模擬或增強HtrAl PDZ域及/或其内源配位 體或HtrA3 PDZ域及/或其内源配位體之生物活性之任何分 子。可充當促效劑或拮抗劑之分子包括本文所述之HtrAl PDZ域-結合子/配位體相互作用或HtrA3 PDZ域-結合子/配 位體相互作用之調節劑，包括（但不限於）抗體或抗體片 段、HtrAl PDZ域/配位體/結合子、肽、小有機分子等或 HtrA3 PDZ域/配位體/結合子、肽、小有機分子等之片段 128788.doc -83 - 200846358 或變異體》 本土明提供基於發現各種能夠與HtrA i pDz域或HtrA3 Z域特異性相互作用之結合分子及鐘別HtrA 1 pDZ域與 配位體結合肽之間的或Htl<A3舰域與配位體結合狀之間 的結合相互作用之獨特特徵的各種方法。 晰可採用各種物質或分子(包括肽等)作為治療劑。該等物 貝或刀子可根據已知方法調配以製備醫藥學上適用之組合 物：由此將其產物以與醫藥學上可接受之載劑媒劑之混合 物形式、，且δ。藉由以冷凍乾燥調配物或水溶液形式混合具 有所要純度之活性成分與可選生理學上可接受之載劑、賦 形劑或穩定劑（Remington，s PharmaceuticaI 版，Osol，A.編（1980))製備治療調配物以供儲存。可接受

之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受 者而e為無毒的，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽 及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量（少 於約10個殘基)多a ;蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或 免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶_;胺基 酸，諸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺 酉文，單醣，雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖 或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖醇，諸如甘露糖醇:戈山 梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；及/或非離子型界面活 性劑，諸如 tween™、PLURONICS™ 或 PEG 〇 菌。此係藉由在冷凍 過渡谷易地實現。 待用於活體内投藥之調配物必須盔 乾燥及復水之前或之後經無菌過據膜 128788.doc -84- 200846358 通常將本文之治療調配物置放於具有無菌接取口之容器 中’例如具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈内溶液袋 或小瓶。 投藥途徑與已知方法一致，例如經由靜脈内、腹膜内、 腦内、肌肉内、眼内、皮下、動脈内或病灶内途徑注射或 輸液、局部投藥或經由緩釋系統投藥。 本發明之醫藥組合物之劑量及所要藥物濃度可視預想之

特定用途而變化。適當劑量或投藥途徑之確定完全在一般 醫師之技術範圍内。動物實驗為人類療法提供確定有效劑 里之可罪指導。有效劑量之物種間之縮放可根據 J. ^ Chappell, W. ^The use of interspecies scaling in toxicokinetics^ In Toxicokinetics and New DrBg Devel〇pment，Ya⑶bi# 人編，pergaman ρ_，n㈣ 1989 ’第42-96頁所規定之原則進行。 當採用本發明之物質或分子之活體内投藥時，正常劑量 視投藥途徑而定可自每天每公斤哺乳動物體重物叫變 化至至多每天每公斤哺乳動物體t⑽mg或⑽mg以上、 ㈣h每公斤約i叫㈣mg。關於較劑量及傳送方 :之::導提供於，獻：；參見’例如美國專利第…口 6。 :"洛’Μ4號或第5’225,212號。預期不同調配物將對 不同療化合物及不同病症有效，靶向一 少r遂〆办丨丄、 種口口 ε或組織之 技柰（例如）可能需要以不同於 傳送。 另或組織之方法 病或病 當在具有適於治療需要投 與物質或分子之任何疾 128788.doc -85- 200846358 症之釋放特徵的調配物中需要物質或分子之緩釋投藥時， 涵蓋使物質或分子微囊化。已用人類生長激素（rhGH)、干 擾素-(rhIFN-)、介白素-2及MN rgpl20成功進行用於緩釋 之重組蛋白質的微囊化。Johnson等人，八^.71^(^，2:795-799 (1996) ； Yasuda, Biomed. Ther^ 27:1221-1223 (1993)； Hora等人，召8:755-758 (1990) ; Cleland， ’’Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems/1 in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach， Powell及Newman編，（Plenum Press: New York，1995)，第 439-462 頁；WO 97/03692 ； WO 96/40072 ； WO 96/07399 及美國專利第5,654,010號。 由於聚乳酸-共乙醇酸（PLGA)聚合物之生物相容性及廣 泛範圍之生物可降解性，使用該聚合物來開發該等蛋白質 之緩釋調配物。PLGA之降解產物乳酸及乙醇酸在人體内 可快速清除。此外，該聚合物之降解性可由數月調節至數 年，視其分子量及組成而定。Lewis，"Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer，’’ 於 M· Chasin及 R. Langer(編），Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York，1990)，第 1-41頁。 醫藥組合物 本發明之調節劑分子/物質可併入一些實施例中適於醫 藥用途之組合物中。該等組合物通常包含核酸分子、肽/ 128788.doc -86 - 200846358 蛋白質、小分子及/或抗體，及可接受之載劑，例如醫藥 學上可接受之載劑。"醫藥學上可接受之載劑”包括任何及 所有與醫藥投藥相容之溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑 及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物（Gennar〇, Remington: The science and practice of pharmacy. Lippin- cott，Williams & Wilkins, Philadelphia，PA (2000))。該等 載劑或稀釋劑之實例包括（但不限於）水、生理食鹽水、菲 令氏溶液（Finger’s solution)、右旋糖溶液及5%人類血清白 蛋白。亦可使用脂質體及非水性媒劑，諸如不揮發性油 (fixed 01ls)。除在習知介質或藥劑與活性化合物不相容之 情況下，涵盍使用該等組合物。補充活性化合物亦可併入 該等組合物中。 \，一般考慮 醫藥組合物係經調配以與所欲投藥途徑相容，該等途徑 包括靜脈内、皮内、皮下 '經口(例如吸入)、經皮(亦即局 部）、經黏膜及直腸投藥。用於非經腸、皮内或皮下應用 之溶液或懸浮液可包括：滅菌稀釋劑，諸如注射用水、生 理食鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或 其他合成溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲 酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸 如乙二胺四乙酸（edta);緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸樣酸睡 或碟酸鹽；及張力調節劑’諸如氯化納或右旋糖。pH可用 酸或鹼諸如鹽酸或氫氧化鈉來調整。可將非經腸製劑密封 於由玻璃或塑料製成之安親（ampules)、拋棄式注射器或多 128788.doc -87 - 200846358 劑量小瓶中。 1，可注射調配物 適於注射之醫藥組合物包括無菌水溶液（可溶於水之情 况下）或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液 之無菌散劑。就靜脈内投藥而言，合適之载劑包括生理食 鹽水、抑菌水、十六醇聚氧乙稀縫el™ (B ASF，Parsippany 叫或鱗酸鹽緩衝生理食鹽水（pBs)。在所有情況下，組 口物必須無菌且應為流體以便使用注射器投藥。該等組合 物應=製造及儲存期間穩定且必驗防腐以免受諸如細菌 及真囷之微生物污染。載劑可為含有(例如)水、乙醇、多 几醇（諸如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇）及合適混合物 /合刈或刀政"貝。適當流動性可（例如）藉由使用諸如卵 磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由 使用界面活性劑來維持。各種抗菌劑及抗真_，例如對 匕基苯甲酉夂酉曰、氯丁醇、苯紛、抗壞血酸及硫柳汞，可含 有微生物污染°組合物中可包括等張劑’例如糖、諸如甘 露糖醇、山梨糖醇之多元醇及氯化鈉。可延遲吸收之組合 物包括諸如單硬脂酸鋁及明膠之藥劑。 無囷可注射溶液可兹山|^ 曰 了猎由將所茜置之活性化合物（例如， t發明之任何調節劑物質/分子）根據需要與一種成分或成 "之^合一起併入適當溶劑中’接著殺菌來製備。分散液 通常It由將活性化人你彳i 人士 口物併入含有鹼性分散介質及其他 成分之無菌媒劑中爽制# ^ ,, /4+ ^ 製備。用於製備無菌可注射溶益 菌散劑之製備方法包括 之…、 匕括由無囷洛液真空乾燥及冷凍乾燥以 128788.doc -88 - 200846358 得到含有活性成分及任何所要成分之散劑。 Ί>. 口服組合物

口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用载劑 裝於明膠膠囊中或壓縮成鍵劑。出於經口治療性投率= 的，可使活性化合物與賦形劑合併且以錠劑、含片；= 之形式使用。口服組合物亦可使用流體載劑製備以用二 ，水’其中流體载劑中之化合物係經口施用。彳包括 學上相容之黏合劑及’或佐劑物質。錠劑、丸劑、膠： 含片及其類似物可含有下列成分中 :、 浙 > "人1 裡4具有類似性 貝之化“勿·黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠； 賦形劑’諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、 PRIMOGEL或玉米澱粉；、潤㈣，^ @㈣

STEROTES;助流劑，諸如膠狀二氧化石夕；甜味劑，諸L 庶糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水揚酸甲酯或橙 味調味劑。 4 ·吸入用組合物 就吸入投藥而言，化合物可自含有合適推進劑（例如，

諸如二氧化碳之氣體）之噴霧器或加壓容器中以氣霧 霧形式傳送。 I ^全身性投藥 亦可經黏膜或經皮全身性投藥。就經黏膜或經皮投藥而 &，選擇可滲透標靶障壁之滲透劑。經黏膜滲透劑包括洗 滌劑、膽汁鹽及梭鏈孢酸（fusidic acid)衍生物。就經黏膜 投藥而言，可使用鼻用噴霧或栓劑。就經皮投藥而言，可 128788.doc -89- 200846358 將活性化合物調配為軟膏、油膏、凝膠或乳霜。 化合物亦可以用於直腸傳送之栓劑（例如，與諸如可可 油及其他甘油酯之基質—起）或保留灌腸劑形式製備❶ 6.載劑 在一實施例中，用保護化合物以免自身體快速消除之載 劑來製備活性化合物，諸如控釋調配物，包括植入物及微 囊化傳送系統。可使用生物可降解或生物相容性聚合物， 諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、％乙醇酸、膠原蛋白、聚 原酸_及聚乳酸。該f物f可在商業上自alza

Corporation(Mountain View, CA)^N〇VA Pharmaceuticals, Ine· (Lake，CA)獲得或由熟習此項技術者製備。亦可使用 脂質體懸浮液作為醫藥學上可接受之載劑。該等懸浮液可 根據熟習此項技術者已知之方法製備，諸如(咖咖等 人’美國專利第4,522,811號，1985)中。 Ί ·單位劑量 可產生王單位劑型之口服調配物或非經腸組合物以有利 於投藥及劑量均-性。單位劑型係指就待治療之個體而言 k δ作為單劑畺之物理離散單元，其含有治療有效量之 活性化合物以及所需之醫藥載劑。單位劑型之規格係由以 下If A確疋且直接依賴於以下情形：活性化合物之獨特特 徵及特疋的所要治療效應及混配活性化合物之固有限制。 、、基因療法級合物 核§文刀子可插入載體中且用作基因療法載體。可藉由 (例如）靜脈内注射、局部投藥（Nabel及Nabel，美國專利第 128788.doc -90· 200846358 5,328,470 號，199句或立體注射（stere〇tactic injeetiQn) (Chen等人，proc Natl Acad Sci u s A 913054 7 (i994)) 將基因療法載體傳送至個體。基因療法載體之醫藥製劑可 包括可接受之稀釋劑或可包含基因傳送媒劑包埋於其中之 緩杈釋放基質。或者，當例如反轉錄病毒載體之完整基因 傳送載體可由重組細胞完好產生時，醫藥製劑可包括一或 多種產生基因傳送系統之細胞。 劑量 醫藥組合物及方法可進一步包含治療HtrA1蛋白質相關 或Htr A3蛋白質相關（特定言之Htr A1 PDZ域相關或Htr A3 PDZ域相關）之病狀中通常應用之其他治療活性化合物。 在/台療或預防需要Htr A1 PDZ域·配位體調節或HtrA3 PDZ域-配位體調節之病狀中，適當劑量含量通常將為每天 母公斤患者體重約〇·01 mg至500 mg，其可以單次或多次 劑量投與。劑量含量較佳將為每天每公斤約〇 · 1 mg至約 250 mg ;更佳為每天每公斤約〇.5 mg至約1〇〇 mg。合適劑 量含量可為每天每公斤約〇·〇1 mg至250 mg，每天每公斤 約0·05 mg至100 mg或每天每公斤約〇」mg至50 mg。在該 範圍内’劑量可為每天每公斤0.05 mg至〇 5 mg、〇·5 mg至 5 mg或5 mg至50 mg。就經口投藥而言，該等組合物較佳 以旋劑形式提供，該等錠劑含有1 ·〇毫克至〗〇〇〇毫克活性 成分’尤其 1·0、5·0、1〇,〇、15.0、20,0、25.0、50.0、 75.0、 1〇〇·〇、ι50·〇、2〇〇·〇、250.0、300.0、400·〇、 500.0、 600·0、750.0、800.0、900·0 及 1000.0 毫克活性成 128788.doc -91 · 200846358 分以達成對待治療之患者的劑量之 可以每天1至4-欠，，社一 用-以化合物 、 人較仏母天一或兩次之方案投與。 …、而針對任何特定患者之特定劑量含量 …該等—= 度、年齡、“:：之代謝穩定性及持續作用時間長 士 重、…體健康狀況、性別、飲食、投藥槿々 及呀間 '排泄速率、藥物組合…’ 受療法之主體。 肖疋扃狀之嚴重程度及經

組合物之套組 組合物（例如，醫華έ人4 在套組、容器^^^ 同投藥說明書-起包括 组mnn #以套組形式供應時， ::不/組分可封裝在單獨容器中且在使用之前即刻 組分之功能。獨封衣可許可長期儲存而不損不活化性

套組亦可於有利於執行諸如 測試的單獨容器中包括試劑。 ϋ 4 ϋ MU 診斷測試或組織分類之特定

MrT 試射在使得維持不同組分之Μ且 :不同組分不被容器之物質吸附或改變的任何類型：：！ 中供應。舉例而言，密封玻璃安瓶可含有已=_ 中性非反應性氣體下封之 或緩衝劑。安瓶可由任何合適物質物貝/分子及/ 聚合物，諸如聚碳酸_、聚苯乙料 如玻璃；、有機 通常用於容納試劑之其他物質。合金屬或任何 σ k谷裔、之其他實例包括 128788.doc -92- 200846358 可由與安瓿類似之物質製 之^ ^ &之間傾及^諸如銘或合全 竭部組成之包膜。其他容器包括試管、小瓶； 瓶、疏、注射器或其類似物。容、〜 a, a, 、匁…、圏接取口，諸 1 具有可由皮下注射針刺穿之塞子的瓶。#㈣ 兩個由在移除後允許組 -有 室。可胺叮“， “易移除之臈隔開之隔 至』移除膜可為玻璃、塑料、橡膠等。 說明材料

所套組亦可供應有說明材料。說明書可印刷於紙或其他基 貝上’及’或可以電子可讀媒體形式供應’諸如軟性磁 碟、CD-ROM、DVD_R〇M、zip磁碟、錄影帶、雷射碟片 (laserdisc)、錄音帶等。詳細說明書可不與套組物理相 關；改為可指導使用者至由套組之製造商或經銷商指定之 網際網路網站或以電子郵件形式供應給使用者。 包括以下實例以示例本發明之較佳實施例。熟習此項技 術者應瞭解，在隨後之實例中所揭示之技術代表由發明者 發現在實施本發明中作用良好之技術且因此可視為構成較 仫模式以供其實施。然而，根據本揭示案，熟習此項技術 者應瞭解’可在所揭示之特定實施例中進行許多改變且仍 獲得相似或類似結果而不悖離本發明之精神及範疇。 實例 實例1 ·· HtrAl及HtrA3 PDZ域之結合特異性概況

HtrAl、HtrA2及HtrA3胺基酸序列之比較（圖1)展示該等 HtrA蛋白質具有高度序列同源性，其中Pdz域内之一致性 大於30°/。。當期望該序列保守程度轉變為結構保守性時， 128788.doc -93- 200846358 可預期接近配位體結合位點之關鍵序列差異使得配位體特 異性出現差異。因此，使用噬菌體呈現肽文庫評估人類 HtrAl及HtrA3之PDZ域之結合特異性概況。 單獨使用 GST-HtrAl-PDZ、GST-HtrAl-(I415Q/I418A)-PDZ或GST-HtrA3-PDZ融合蛋白質來篩選與M13基因-8主 要鞘蛋白之C-末端融合之以高價格式呈現之隨機十肽文庫 (libC)(Held，Η. 及 Sidhu，S. S. (2004) Journal of Mo/ecw/ar 幻；340(3)及（b) 587-597)。亦使用 HtrAl- PDZ及HtrA3-PDZ GST融合蛋白質來篩選與M13主要鞘蛋 白之N-末端融合之12-mer肽文庫（libN)。用編碼所有20種 天然胺基酸之簡幷密碼子來構造文庫 (ATCGACAGCGCCCCCGGTGGCGGANNKNNKNNKNNK NNKNNKNNKNNKNNKNNKTGATAAACCGATACA (SEQ ID NO: 25))。募核苷酸係如先前所述使用等莫耳DNA簡 幷性設計（Sidhu，S· S·，Lowman，Η· B·，Cunningham，B. C·及 Wells，J. A. (2000) Methods Enzymol 328，333_ 363)。 該等文庫進一步包括允許呈現截短肽之終止密碼子。三 輪選擇後，使個別純系以96孔格式在補充有卡本西林 (carbenicillin)及M13-K07 之 500 pL 2 YT肉湯中生長，且 在噬菌體ELISA中直接使用培養物上清液來偵測與HtrAl 或HtrA3 PDZ特異性結合之肽。獲得各PDZ域之特異性結 合純系。使用含有噬菌體粒子之培養物上清液作為擴增含 有該等肽之DNA片段之PCR的模板。如先前所述將DNA片 128788.doc -94- 200846358

段定序（Vajdos，F. F·，Adams，C· W·，Breece，T. N·，Presta， L. G·，de Vos，A. M.及 Sidhu，S. S. (2002) Mo/ 扪〇/ 320(2)，415-428)。比對各文庫之獨特序列且分析同源性 (參見表1及2)。 128788.doc 95- 200846358

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htrAUPDZ -2 -3 -4 -5 6 5 4 3 2

No D 即I s n gvrgrr vnfrlvilfllvlllllilllrwgm lpwllfaallivpvre egserlpgelvavrsl llllvllllwlwvvlv veyvmvlvfvfvvgya eededeeeead-eew,dr gggg)gggggsssfllswwwwwwwwvaaatltv strstatttpllvmrv vvvyvvyvLLLVGSGL sgesagggaeeeeeed 12345678901234 2222222223333333 -—llllllll—1111111—111 6 11 4 11116

11 lx 11 11 IX

HtrA3-PDZ -2 -3 -4 -5 -6 -7 2 3

14一L L L L L L L L llllllll SSESNSNS L L L L L L LL i-v;:-;:':··'··.···:.,;"-: Μ y V V V L V MWWYWWWWW EEGEGEEEDDDNDDDDvvvvvvvvVVLVVyvF VVLVLVVV GGEGEGGG

NoIDQI E s η 21222324137138139140 2573 2 11 lx IX Ί— *疏水性殘基以粗體文本展示且酸性殘基係加灰色陰影。 如文本所述對位置加以任意編號。 就C-末端文庫選擇而言，HtrAl-PDZ與HtrA3-PDZ優選 具有總體疏水性特徵之配位體。類似地，先前已展示 HtrA2 PDZ域亦優選具有疏水性特徵之配位體（zhang等 人，（2007)，製備部分）。 就C-末端文庫選擇而言，HtrAi_pDz之特異性概況係由 域之C_末端處之4個殘基界定。該域之C·末端殘基（位置0) 呈現稍更優選白胺酸，綠胺酸為下-個最普遍之殘基。在 128788.doc -98- 200846358 位置-ι處，優選具有大體積側鏈之殘基（色胺酸、異白胺酸 及苯丙胺酸）。在位置-2處幾乎僅見色胺酸。位置-2處對疏 水性殘基之優選為II型PDZ域之標誌（Sheng，M.及Sala，C. (2001) 〇/ 24(1)，1_29)。位置- 3為蘇胺酸或異白胺酸，且在位置_4處優選帶電殘基（Giu、 Lys或Arg)。在所獲得之HtrAl-PDZ結合肽中之任何其他位 置處未觀察到任何優選。

如由C-末端文庫選擇結果所確定，HtrA3-PDZ特異性概 況係由域之C-末端處以及位置-3處之兩個殘基界定。該域 之C-末端殘基（位置〇)稍更優選纈胺酸，異白胺酸為下一個 所選擇之最普遍殘基。位置-1僅為色胺酸。雖然在許多π 型PDZ域中在位置-2處優選疏水性殘基，但HtrA3-PDZ展 示在位置-2處無優選且在該位置處通常選擇非疏水性胺基 酸。在位置-3處觀察到優選甘胺酸或絲胺酸。在由Libc選 擇所獲得之HtrA3-PDZ結合肽十在位置_4或任何其他位置 處未親察到任何優選。 利用N-末端文庫進行之結合選擇對mrA丨_pDz與A3_ PDZ兩者而言亦為成功的，且純系之定序分別揭示μ個及 8個獨特序列（表2)。序列之比對就L_選擇結果而言比 LibC選擇結果困難，因為後者因c_末端殘基充當錨定位置 而便利。就HtrAl-PDZ而言，LibN選擇序列之子集含有保 守w[D/E]序列（SEQIDN0:141)。有可能該保守區 中之酸性殘基可充當替代c-末端’從而有效使該酸性殘基 兩個殘基前處之色胺酸殘基在彼等序列中成為位置處之 128788.doc -99- 200846358 色胺酸。基於該基元（保持酸性殘基為位置〇)之所有序列之 比對並未揭示所有所選序列之一致序列，然而，提示在選 擇結果中可能存在超過一個一致序列。選自LibN及LibC文 庫篩選之序列之間不存在顯著相似性。 就HtrA3-PDZ而言，大部分N-末端選擇配位體含有W-V-L肽（參見表2)。基於該同源性對序列加以比對，以色胺酸 作為位置-1對殘基任意編號。在HtrA3-PDZ之多個選擇結 果中觀察到位於疏水性殘基之後的保守酸性殘基。 實例2 ··合成肽結合 為進一步改進HtrAl-PDZ域及HtrA3 PDZ域之結合特異 性，基於實例1中所獲得之資訊產生一組合成肽。使用標 準9-苐基甲氧基羰基（Fmoc)方案合成肽，用於三氟乙酸 (TFA)中之2·5%三異丙基矽烷及2·5% H20清除樹脂，且藉 由逆相高效液相層析純化。由液相層析/質譜（LC/MS)驗證 各肽之純度及質量。

HtrAl-PDZ或HtrA3-PDZ之肽之結合親和力使用溶液相 競爭ELISA測定為IC5G值。藉由將N-末端生物素化肽（就 HUA1-PDZ而言為生物素-GWKTWIL，且就HtrA3-PDZ而 言為生物素-RSWWV)固定於塗佈有NeutrAvidinTM(Pierce) (Rockford，IL)且用 BSA(Sigma)阻斷之 Maxisorp™板（Nalge NUNC Intemational)(Naperville，IL)上來製備檢定板。如 以下文獻所述製備具有與N-末端融合之麩胱甘肽S-轉移酶 (GST)之 HtrAl-PDZ及 HtrA3-PDZ構築體（Laura，R. P·，Witt， A. S·，Held，Η· A.，Gerstner，R·，Deshayes，K·，Koehler，Μ· 128788.doc -100- 200846358 F·，Kosik，K. S·，Sidhu，S. S.及 Lasky，L, A. (2002)

Ckm 277(15)，12906-12914)。將於 PBS、0.5% BSA、0.1% Tween 20(PBT緩衝劑）中之固定濃度之GST-HtTAl-PDZ(200 nM)或GST-HtrA3-PDZ(200 nM)與肽之連續稀釋液一起預 培育1小時，且隨後轉移至所製備之檢定板中。再培育1小 時後，將板用含有0.5% Tween 20之PBS洗滌，與在PBT緩 衝液中以1:10,000稀釋之HRP/抗GST抗體（Amersham Pharmacia Biotech) —起培育30分鐘，再次洗滌，且用 3,3’，5,5’-四曱基-聯苯胺/Η202(ΤΜΒ)過氧化物酶受質 (Kirkegaard and Perry Laboratories)偵測。IC50值係定義為 阻斷PDZ域與固定肽之結合之50%的肽濃度。某些合成肽 之所獲得之IC50值展示於表3中。

128788.doc 101 - 200846358 表3 :合成肽與HtrAl-PDZ及HtrA3-PDZ之結合之IC50值 肽ID 位置ί ~ ~~ (SEQIDNO) -10 -9 -8 -7 -6~^Λ~~5~~0~~Γ 1<：50

UtrAl-ΡΏΖ配位艘 Hl_cl (3) Hl_c2 (4) Hl—c3 (5) HI一c4 ⑹ Hl_c5 (142) HI 一 c3a(143) Hl_c3b (144) Hl_c3c(145) Hl_c3d (146) Hl_c3e(147) HI 一c3f(148) Hl_c3g(149) Hl_c3h(150) GM130(151) CoBal (152)

D dgdwlddddddade

LLVVFAVVVVVVVVL LIWHVWAWWWWWWVF WWWWDWWWWWWWMC T T I n R I I n A T1 Tx I I I V ekrkdrrrrarrrkp IWSDWSSSSSASSVG

Hl-nl (153) Hl-n2(154)

S E

G Gw w s R V V

G R L V Lw E s L L V Y ED

HtrA3-PDZ配位體 H3一cl (11) H3_c2 (12) H3_c3 (13) H3_c4 (14) H3_cla(155) H3_clb(15) H3—clc H3_cld H3_cle H3~clf H3_clg(16) H3_clh(17) H3_cli(156) H3_clj (18) H3_clk(157) H3_cll(158) H3_clm(159) H3_cln(19) H3_clo (20)

R w R R R R R G s G G G G F R F F F rrrrrrrar lerygggga fffffffff

vvilvvvvagvvvvfavvvWWWWWWWWWWWWWWWWAWW H3_nl (22) H3_n2 (160)

G V V V D E L V V D

L L L L s N L L V Vww EG μΜ 23·3 士 2.9 7·7 士 0.6 0.9±0.1 2.8 士 0.3 64·1 士 13.6 3.5 士 0.9 6·3土1 · 1 40.0 士 5.1 13.0 士 0.9 2.5 士 0.4 1.3 士0.1 2.8 士 0.3 >500 24.1 士 8.4 15.7 士 3.3 >500 241.6 土 169.10.6 土 0.1 0.6 士 0·1 1.0 土 0.1 2.9 士 0.3 72土 11 1.0 士 0·1 1.3 士 0.1 4.7 士 0.4 14.1 土 1·2 21·6 土 2.7 1.7 士 0.2 0.6 土 0·1 2.6 士 0.2 0.8 土 0·1 7.7 士 0.8 3.5 士 0.3 267士111 0.9士 0.1 1.1 土 0.2 202±45 18.6 士 5.9 $使所有肽之N-末端乙醯化。星號（*)指示C-末端藉由醯胺 化阻斷。結構研究所使用之肽以粗體文本展示，在該等肽 内之各位置處為單一丙胺酸取代。 128788.doc -102- 200846358 就HtrAl-PDZ而言，肽HI—c3(DSRIWWV)(SEQ ID NO: 5)與生物素-0\¥1^界11^(8£(5 10>^0: 4)競爭結合 GST-HtrAl-PDZ，其中IC50 為 0·9 士 0·1 μΜ，其為就與HtrAl-PDZ 結合所測試之合成肽中所獲得之最低IC50。亦使用等溫滴 定熱量測定來量測Hl_c3-HtrAl-PDZ相互作用之解離常 數。簡言之，在28°C下使用VP-ITC滴定量熱計（MicroCal) 進行ITC量測。以具有1 mM疊氮化鈉之PBS對樣品進行廣 泛滲析。各滴定實驗由25次向5.5 μΜ HtrAl-PDZ中注射10 pL肽注射液（284 μΜ)(單元體積為1·4 mL)組成。由胺基酸 分析測定肽及蛋白質之濃度。在空白滴定實驗中藉由向緩 衝液中注射10 pL肽來量測稀釋熱。使用Origin套裝軟體 (MicroCal)假定單個結合位點模型由實驗量測值（減去稀釋 熱後）之非線性最小平方擬合來測定結合熱及解離常數。 1.1土0.1 μΜ之所得值與競爭ELISA之資料具有良好一致性 (參見圖2)。另一在噬菌體選擇中鑑別出之肽（Hl_c2)以比 Hl—c3低之親和力（IC5〇為7·7 μΜ)與HtrAl-PDZ結合，雖然 在噬菌體淘選期間具有較高選擇頻率。藉由醯胺化阻斷C-末端（參見，例如表3中之肽Hl_c3h)消除在高達500 μΜ之 濃度下肽與生物素-GWKTWIL(SEQ ID NO: 4)競爭結合 HtrAl-PDZ之能力，表明末端羧酸酯基為結合所需。用丙 胺酸取代位置_1處之色胺酸導致結合降低7倍（參見，例如 表3中之肽H1 一c3b)，而丙胺酸取代位置-2處之色胺酸或位 置-3處之異白胺酸分別導致結合降低44倍及14倍（肽 HI—c3c及HI—c3d)。最佳肽在位置〇、-4、-5或-6(肽 128788.doc -103- 200846358

Hl—c3a、HI—C3e、Hl_c3f 及 HI—c3g)處之單一位置處之丙 胺酸取代對結合具有極少影響。肽Hl_cl與Hl_c5之比較 確認位置·1處之色胺酸之適度重要性且提示在位置-4處鹼 性殘基（例如，離胺酸及精胺酸）可提供優於酸性（例如，麩 胺酸或天冬胺酸）殘基之能量優點。 就HtrA3，PDZ而言，肽Η3—cl 與生物素-RSWWV(SEQ ID NO: 12)競爭結合 GST-HtrA3-PDZ，其中 IC50為 0·6 +/- 0·1 μΜ。類似於針對HtrAl-PDZ之研究結果，位置0容許任何 脂族側鏈（亦即，纈胺酸、異白胺酸、白胺酸及丙胺酸）， 其中優選纈胺酸（比較肽H3-C1、H3—c2、H3_c3、H3_c4及 H3_cla之結果），而位置〇處之較大體積之苯丙胺酸側鏈 (肽H3_c5)使結合降低14倍。藉由醯胺化阻斷羧酸酯基（肽 H3_cle)急劇降低結合親和力。與噬菌體呈現資料一致， 位置-1強烈優選色胺酸，且突變為丙胺酸導致親和力降低 超過400倍（參見，例如肽H3_clb)。顯著地，甚至在第一 位置處具有色胺酸之二肽亦以中等親和力與HUA3-PDZ結 合（參見，肽 H3—cld(WV)、H3一cle(WA)及 H3—clf(WG))。 -2或-3位置處之丙胺酸取代對配位體結合具有極少影響至 無影響（參見，肽H3_clc及H3_cld)。肽H3_c6-9進一步確 認-3及-4位置處之胺基酸一致性缺乏重要性。 先前報導已提示小鼠HtrAl與諸如III型膠原蛋白a3 C-前 肽（Col3al)之纖維狀前膠原蛋白質之C-末端結合以及與 Golgi 基質蛋白質（GM130)結合（Murwantoko，Yano，M·， Ueta，Y·，Murasaki，A·，Kanda，H·，Oka，C·及 Kawaichi，Μ· 128788.doc -104- 200846358 (2004) 381(第 3 部分），895-904)。合成對應於

Col3al之C-末端及GM130之肽。如上所述，在競爭結合檢 定中將Col3al之C-末端及GM130與HtrAl-PDZ之結合與生 物素 _GWKTWIL(SEQ ID NO: 4)加以比較。Col3al 及 GM130肽與生物素-GWKTWIL(SEQ ID NO: 4)競爭結合 GST-HtrAl-PDZ ，其中 IC50 值分別為 15·7±3·3 μΜ 及 24.1 士8.4 μΜ(表3)。該等值顯著高於對GWKTWIL(SEQ ID NO : 4)結合所觀察到之IC50值（7·7 +/- 0,6 μΜ)，表明 Col3al及GM13 0肽與GST-HtrAl-PDZ之結合顯著弱於所觀 察到之與優化肽配位體之結合。雖然結果展示HtrAl-PDZ 確實可與該優化肽配位體結合，但本文中所量測出之親和 力顯著弱於Murwantoko等人所報導之親和力（Col3al為0.3 μΜ且GM130為6.0 nM)。值得注意的是使用利用固定於固 體表面上之配位體進行之檢定測定先前親和力，此會因由 多價結合誘導之親合效應而導致親和力之高估（Harris等人 (2001) Biochemistry 40: 5921-5930 ; Harris及 Lim (2001) J· Cell Sci. 114: 3219_323 1 ; Laura及 Witt (2002) J, Biol· Chem· 277(15): 12906-14)。本文中所述之溶液相競爭檢定 更精確地估算單體結合親和力。 為進一步研究内部肽基元之識別，合成來源於HtrAl -PDZ及HtrA3-PDZ之N_末端文庫選擇之C-末端醯胺化肽， 且測試其與生物素標記C-末端肽競爭之能力。就HtrAl-PDZ而言，僅對兩種所測試之肽中之一種（肽HI—n2)偵測到 結合，且肽Hl_n2之親和力顯著弱於對於C-末端肽所觀察 128788.doc -105- 200846358 到之親和力（參見表3)。就Htr A3 -PDZ而言，兩種所測試之 肽（H3—nl及H3—n2)可偵測到結合，但與具有游離C-末端之 肽相比，該兩種肽以顯著降低之親和力結合（表3)。雖然肽 H3 一nl來源於在N-末端肽噬菌體選擇中具有最高選擇頻率 之序列，但HtrA3-PDZ之親和力比優化C-末端肽弱數百倍 (表3)。肽H3—n2以可比於非優化C-末端二肽（與肽H3—cle 及H3_clf相比）之親和力結合（表3)。總之，該等資料提示 雖然HtrAl-PDZ及HtrA3-PDZ域能夠與配位體識別槽中之 内部肽基元結合（且因此，該結合可能在生物學上相關）， 但優選C-末端配位體。 實例3 : HtrAl及HtrA3之PDZ域之結構 a.NMR分析 為更好地理解HtrAl-PDZ域與肽配位體之間的結合相互 作用，對 HtrAl_PDZ與肽 Hl_c3(DSRIWWV)(SEQ ID NO: 5)之間的複合物進行NMR分析。將編碼人類HtrAl殘基 3 80-480(對應於PDZ域）之DNA片段選殖於pET15b表現載體 (Novagen)之Ndel/BamHI位點中，產生具有相繼為N-末端 His-標籤及凝血酶裂解位點之融合體。使含有表現質體之 BLR(DE3) pLysS細胞在補充有 15N-氣化銨（>99%，Spectra Stable Isotopes)及 12C-及 /或 13Cc6-D-葡萄糖（>99%，Spectra Stable Isotopes)之M9基本培養基中生長。使細胞在37°C下 生長至對數中期（〇D6〇〇=0.8)。用1 mM IPTG誘導蛋白質表 現，且將培養物在室溫下再培育12小時。藉由在4,000xg 下離心1 5分鐘收集細胞。將所得細胞小球再懸浮於具有1 128788.doc -106- 200846358 mM PMSF之緩衝液A中，且由高剪切力流體處理器溶解細 胞。將細胞溶解產物藉由在21，000xg下離心45分鐘澄清， 用0·45 μηι過濾器過濾且加載於Nickel-NTA Superflow管柱 (QIAGEN)上。將管柱用於50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、500 mM NaCl(缓衝液A)中之10 mM咪唑洗滌，且用於緩衝液a 中之500 mM咪唑溶離。彙集溶離份，添加凝血酶（1單位/ 宅克蛋白貝）’且在4C下以具有2 mM CaCL之50 mM Tris HCl(pH7.5)、100mMNaCl(緩衝液B)將樣品滲析隔夜。將 蛋白質樣品濃縮且經Superdex-75管柱（Pharmacia)a25 Tris HCl(pH 7·5)、300 mM NaCl純化。將樣品進一步經 MonoQ(Pharmacia)陰離子交換管柱以具有〇u 〇 μ NaCl 梯度之Tris(pH 7.5)純化。於含有10%氧化氘（仏⑺及！ mM 疊氮化鈉之25 mM磷酸鈉（pH 6·0)中將蛋白質樣品濃縮至 約2 mM。藉由冷凍乾燥10% D20樣品及將其溶解於 99.996% D2〇(Cambridge Isotope Labs，Inc.)中製備，，100%，’ D20樣品。 在25 °C下在配備有三重共振三軸主動屏蔽梯度探針之 Bruker DRX600 MHz 或 DRX800 MHz 光譜計上獲得 NMR 光 譜。所有NMR資料均使用NMRPipe處理（Delaglio，F·， Grzesiek，S·，Vuister，G· W·，Zhu，G·，Pfeifer，J·iBax，A. (1995) 6(3), 277-293)且使用 Sparky程式分析 (3·11版本，Goddard及Kneller，UCSF)。藉由在分步滴定肽 Hl_c3之情況下量測15N、13C-標記之HtrAl-PDZ之15N-HSQC直接監測複合物之形成。新尖峰之出現及一些對應 128788.doc •107· 200846358 於游離HtrAl-PDZ之峰的消失與NMR時標上之缓慢交換相 符。使用來自 3D HNCA、HNCOCA、CBCACONH、 CBCANH、HNCO 及 HNCACO 實驗（Cavanagh，J·， Fairbrother，W. J·，Palmer，A. G.及 Skelton，N. J. (1995)

Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice, Academic Press，New York)之資料由Monte 程式（Hitchens， T. K·，Lukin，J. A·，Zhan，Y·，McCallum，S· Α·及 Rule，G· S. (2003) /⑽rna/ iVMi? 25(1)，1-9)輔助1Hn、 15N、13Ca、130β及13C，歸屬。藉由以D20人工分析3D-HCCH-TOCSY得出側鏈歸屬。藉由在FI中以13C及15N過濾 器分析2D NOESY及2D TOCSY指定肽共振（Zwahlen，C·， Legault，P·，Vincent, S· J· F·, Greenblatt，J·，Konrat，R.及 Kay? L. E. (1997) J. Am. Chem. Soc, 119(29), 6711-6721 ； Iwahara，J·，Wojciak，J. M·及 Clubb，R. T· (2001) 〇/ JVMi? V19(3)，231-241)。藉由使用利用程式 CYANA(2.0版本，Herrmann，T·，Guntert，Ρ·及 Wuthrich，Κ· (2002) J Mo/ 价·〇/ 319(1)，209-227)之自動 NOE指定分析 3D NOESY_15N-HSQC、3D NOESY-13C-HSQC 及 3D 13C F1 過濾 F3-編輯-NOESY-HSQC光譜獲得初始結構及距離限制。 Φ、Ψ及χΐ二面角限制係藉由根據已確立之Karplus關係分 析HNHA、HNHB及TOCSY_15N-HSQC(35毫秒混合時間）實 驗來獲得。藉由用程式TALOS(Cornilescu，G_，Delaglio，F· 反 Βη，A, {\999、Journal of Biomolecular NMR 2名9- 302)分析主鏈化學位移來獲得其他鬆散主鏈二面角限制。 128788.doc -108· 200846358 應用二面角限制以良好擬合為化學位移（如程式所定義）， 其中所允許之範圍為TALOS所確定之平均±30°之較大者或 TALOS所計算之標準偏差之三倍。藉由如所述分析穩態 iH-^N-NOE 來研究主鏈動力學（Farrow，Ν· A·，Zhang，0·， Forman-Kay，J· D.及 Kay，L· Ε· (1994) σ/ 价TVMi? V4(5)，727-734)。使用模擬黏接程式 CNX(Accelrys，Inc·，2002)使用距離、二面角及氫鍵限制由 隨機蛋白質及肽構形起始計算100種結構。選擇20種具有 鲁 最低限制違犯能量之結構表示複合物之溶液結構。Htr A1 -PDZ/肽複合物之NMR資料足以清楚地確定該複合物之結 構（圖3，表4)。 表4 ··與Hl_c3肽結合之HtrAl-PDZ之NMR整體之輸入限制 及結構統計貧料的概述 參數 整體 輸入限制： 總NOE 1352 殘基内 179 連續 340 中程 252 遠程 504 分子間 77 總二面角 178 Φ 77 Ψ 76 χΐ 21 違犯： 實驗限制之RMSD : ΝΟΕ-距離(Α) 0.0041 ±0.0003 二面角（。） 0.056 士 0.016 128788.doc •109- 200846358

NOE距離違犯： 數值>0.01 A 34.1 ±4.8 數值>0.1人 0.0 平均最大值違犯(A) 0.07 ±0.01 二面角違犯： 數值>0.1。 6.6 ±1.9 平均最大值違犯(。） 0.5 ±0.19 理想化幾何結構之RMSD 0.0009 ±0.0001 鍵(A) 0.27 土 0.01 角(。） 0.12±0.01 瑕(improper)(〇) 能量： 能置部分(kcal.mol/1) NOE 1.24±0.18 CDIH 0.04 士 0.02 鍵 1.5 ±0.2 角 35.1 ±1.4 瑕 2.1 ±0.37 凡得瓦爾力(Van der Waals) 16,3 土 2·4 立體化學： 拉馬錢德蘭(Ramachandran)(%) 有利 74.39 允許 24.18 慨然 0.97a 禁止 0.46a 結構精度： 平均結構之平均RMSD 主鏈(N、Ca、C) 0.52±0.12b 重鏈(N*、C*、Ο*、S*) 0.71±0.35b a彼等屬於慨然區及禁止區中之殘基位於HtrAl-PDZ之不明 確之N-末端；整體中不超過3個成員具有該等區中之任一 殘基。 \則定涵蓋殘基 378-389、411-463及 468-475之 HtrAl-PDZ之 有序區之RMSD。 128788.doc -110- 200846358 b.X-射線結晶學 在具有由噬菌體呈現鑑別之高親和力五肽序列 (FGRWVC00H)(SEQ ID NO: 11)之複合物中使HtrA3-PDZ域 (殘基354-453)結晶。使用先前描述之策略使PDZ_配位體 複合物結晶（本文中命名為HtrA3-PDZext)，包括使5殘基肽 序列與PDZ域之C-末端經由三甘胺酸連接子融合 (Appleton，Β· A·，Zhang，Y·，Wu，P·，Yin，J· P.，Hunziker， W·，Skelton，N. J·，Sidhu，S. S·及 Wiesmann，C. (2006) J. # 价·〇/. Chm. 281(31), 22312-22320)。將編碼人類 HtrA3- PDZ之殘基354-453之DNA片段選殖於pET22d表現載體之 Ndel/BamHI位點中，且此產生具有N-末端His-標籤及凝血 酶裂解位點之編碼HtrA3-PDZ之開放閱讀框。另外，使用 標準分子生物學技術使1 〇殘基延伸部分與Htr A3 -PDZ之C 末端融合以產生編碼HtrA3-PDZ-ext(延伸部分， GGGFGRWV)(SEQ ID NO: 161)之開放閱讀框。使含有表 現質體之大腸桿菌BL21(DE3)(Stratagene)培養物在37°C下 _ 生長至對數中期（Α600=0·8)。用0·4 mM IPTG誘導蛋白質表 現，且使培養物在16°C下生長16小時。藉由在4,000xg下 離心15分鐘使細菌成粒，用20 mM Tris-HCl(pH 8·0)洗務 兩次，且在-80°C下冷凍8小時。將離心塊再懸浮於100 mL 緩衝液 A(50 mM Tris-HCl(pH 8.0)及 500 mM NaCl)中，且 藉由穿過Microfluidizer®處理設備（110Y型，Microfluidics Corp·，Newton，MA，USA)使細菌溶解。將細胞溶解產物加 載於鎳-氮基三乙酸-瓊脂糖管枉（Qiagen)上。將管柱用緩 128788.doc -111 - 200846358 衝液A加20 mM咪唑洗滌，且將蛋白質用於緩衝液a中之 25 0 mM咪唑溶離。彙集含有所關注之蛋白質之溶離份， 添加凝血酶（1單位/ ¾克蛋白質），且在4°C下以PBS將樣品 滲析隔夜。將蛋白質樣品漢縮且進一步經Superdex-75管柱 以 50 mM Tris-HCl(pH 8·0)、300 mM NaCl及 5 mM β-魏基 乙醇純化。 藉由將等體積之蛋白質（10 mg/mL)與0.1 M Bis-Tris(pH 6·5)、0·2 M MgCl2及25% PEG 3350混合（適當溶液)經由在 19 C下以沈滴蒸氣擴散獲得晶體。在於液氮中急驟冷;東之 前，將該等晶體轉移至含有適當溶液之低溫緩衝液中。在 先進光源（Advanced Light Source)(Berkeley, CA)之光束線 5.0.1下收集完整的資料集合。 所有貧料均使用來自HKL Suite之Denzo及Scalepack (Otwinowski, Z. a. W. M. (1997) Methods in Enzymology 276, 307-326)處理。使用HtrA2/Omi晶體結構之PDZ域（pdb 登錄號 lLCY(Li，W·，Srinivasula，S, M,，Chai，J.，Li，P·， Wu，J· W·，Zhang，Z·，Alnemri，E· S·及 Shi，Y· (2002) iVai Βζ·ο/ 9(6)，436-441))，使用 AMoRe(Navaza，J· (1994) Acta Cry st alio graphic a Section A 50(2)， 1 57-163)及由 SWISS-MODEL產生之搜索模型（Schwede，T.，Kopp，J” Guex，N·及 Peitsch，M· C. (2003) NucL Acids Res. 31(13)， 3381-3385)藉由分子置換求解HtrA3-PDZext結構。HtrA3-PDZext結晶於空間群P4JJ中，其中每個不對稱單元具有 兩個分子。不對稱單元中之各PDZ域與因晶體學對稱而相 128788.doc •112- 200846358 關之相對分子之配位體形成結晶二聚體。該填充排列產生 兩個非等效PDZ-肽二聚體（圖1B)，由102 Ca原子上方之 0.3 A之RMSD證明，其在結構上極相似。用Coot(Emsley， Ρ·及 Cowtan，Κ· (2004) 60(12第1部分），2126-2132)建立原子模型且用 Refmac(Murshudov，G. N·，Vagin，A. A.及 Dodson，E. J. (1997) Acta Crystallographica Section D 53(3), 240-255)^： 進。獲得HtrA3-PDZ/肽複合結構之高度精確之結構（圖4， 表5)。 表5 : HtrA3-PDZext之結晶資料收集及改進統計資料之 概述 資料收集 解析度(A)a 50-1.7 空間群 P4A2 晶胞參數(A) a ' 6=73.0 > c 獨特反射 24,442 冗餘a 7.6(5.6) 完整性C%)a 99.9(99.6) Rsym(%)ab 0.049(0.461) <I>/a(I)>a 改進 39.2(3.3) 解析度 30-1.7 ^cryst J RfreeC 0·186，0.221 反射數 23,159 非氫原子數 1849 殘基數 416 水數目 202 RMSD 鍵(A) 0.012 RMSD 角(。） 1·4 拉馬錢德蘭圖(Ramachandran 95.3、4·7、0 ^l〇tX%)d =80.1

128788.doc -113· 200846358 &圓括號中之值係指最高解析度外殼中之數據 b Rsym4|/-</>|E/，其中<1>為獨特反射之對稱性相關 觀察結果之平均強度 C RcrysFRfreedl/Vi^l/Ei^，其中 Rfree 表示 P通機選擇之 資料中之5%。 d值分別表示拉馬錢德蘭圖之最有利區、額外允許 區、慨然允許區及禁止區中之殘基百分比 (Laskowski，R. A·，MacArthur，M· W·，Moss，D· S·及 籲 Thornton，J. Μ· (1993) Journal of Applied

Crystallography 26(2), 283-291) e.結構分析 在兩種結構中，如在其他PDZ域結構中所見，PDZ摺疊 (圖3B及4B)由經兩個α-螺旋（αΐ、α3)封端之五鏈β夾層（βΐ-β5)組成（Sheng，Μ·及 Sala，C· (2001) 〇/

Neuroscience 24(1)，1-29)。另外，在N-末端及C-末端觀察 到短β鏈（βΝ及PC)。如HtrA2蛋白質之PDZ域（Zhang等人 鲁 2007，製備部分），與典型PDZ摺疊（例如，由Erbin之PDZ 域例示（Skelton，N· J·，Koehler，M· F·，Zobel，K·，Wong，W· L.，Yeh，S.，Pisabarro，Μ· T·，Yin，J· P·，Lasky，L· Α·及

Sidhu, S. S. (2003) J Biol Chem 278(9), 7645-7654))^ tb ? HtfAl-PDZ及HUA3-PDZ具有環狀交換摺疊，其中典型摺 疊之第一 β鏈對應於HtrAl-PDZ之β5(參見圖5C及5D)。所 有三個HtrA家族成員之PDZ域之β1-β2環形成明確之α-螺 旋。然而，該螺旋相對於域其餘部分之取向變化，此提示 128788.doc -114- 200846358 該螺旋在構形上可為動態的。實際上，就HtrAl-PDZ複合 物而言，異核NOE量測與該區中亞奈秒尺度動力學之存在 相符（圖6)。（為有利於比較各pdZ域内之殘基，以其在各 二級結構元件或環内之位置提及殘基（Aasland，R.，Abrams， C·，Ampe，C·，Ball，L· J·，Bedford，Μ· T·，Cesareni，G,， Gimona，M·，Hurley，J. H·，Jarchau，T.及 Lehto，V.-P· (2002) LWiers 513(1)，141-144)。因此，βΐ-ΐ 為鏈 βΐ中之第 一殘基，且βΐ: β2-1為鏈βΐ與β2之間的環中之第一殘基。

在HtrA家族之所有三個成員之Pdz域-肽複合物中，肽 以延伸構形結合於鏈βΐ與螺旋α3之間的裂隙中，使由鏈 βΐ及β2形成之反平行β摺疊片延伸一個鏈（圖3、5Β及 5C)。C-末端羧酸酯基由恰在鏈β 1之前的三個主鏈醯胺配 位。在HtrAl-PDZ之情況下，如由氫/氣交換NMR實驗所測 定’保遵遠專酸胺以免在複合物中與溶劑交換。雖然殘基 βΝ: pl-l(Ile383)及pl-l(Ile385)之醯胺氫兩者均直接指向 魏基，但距離比通常認為確定氫鍵之距離稍長（重原子距 離為3.9 土〇.4人及3.5土〇.6人）。0>1:01-2(〇卜384)之醯胺氫 並不直接指向羧酸酯基，且其可能參與水傳遞之氫鍵。雖 然對於二個醯胺氫所觀察到之氫/氘交換實驗及低場化學 位移提示形成氫鍵，但NOE限制之固有缺乏阻止精確確定 配位體羧酸酯基及羧酸酯基結合環或特定氫鍵限制在結構 計算中之使用。在HtrA3-PDZ之情況下，所有三個醯胺基 直接以蛋白質中可見之氫鍵之典型距離指向羧酸酯氧原子 (βΝ: βΐ-l、βΝ: β1-2及βΐ-ΐ之重原子距離分別為2·9 A、2 8 A 128788.doc -115 - 200846358 及 3·2 A)。 兩種結構之間的另一相似性為識別位置0處之顯胺酸側 鏈，其在PDZ配位體結合槽之淺疏水性袋内定向。在兩種 結構中，疏水性結合袋呈現提供可置放纈胺酸側鏈之互補 表面之脂族側鏈，然而在該袋中明顯存在足以容納位置0 處之多個脂族肽側鏈之空間。雖然在HtrAl-PDZ複合物之 NMR整體中觀察到VaP側鏈之兩種旋轉異構構形，但形成 PDZ配位體結合袋之月旨族側鏈在整體之所有成員中採取單 一構形。

HtrAl-PDZ與HtrA3-PDZ域之間的其餘蛋白質-配位體相 互作用顯著不同。詳言之，兩種結構之間最驚人的差異包 括位置-1處色胺酸之識別。在HtrA3-PDZ之情況下，Trp·1 採取幾乎與位置-1處優選色胺酸之其他PDZ域（例如， HtrA2(Zhang 等人 2007，製備部分））及 Erbin(Skelton，N. J·， Koehler，Μ· F.，Zobel，K·，Wong，W. L·，Yeh，S·，Pisabarro, Μ. T.，Yin, J. P·，Lasky，L. A.及 Sidhu，S. S. (2003) 5/o/ C/zem 278(9)，7645-7654)中可見之構形一致的構形。該色 胺酸之吲哚環延伸穿過鏈βΐ之主鏈且插在P2-5(Glu390)與 β2: cx2-l(Ala392)之側鏈之間（圖5C)。Trp·1側鏈相對於鏈β2 之取向使人想起肽β-髮夾穩定性之最近研究（Cochran，Α· G·，Tong，R. T·，Starovasnik，Μ. A·，Park，E. J·，McDowell， R. S·，Theaker，J· Ε·及 Skelton，N. J· (2001) Ckm 123(4)，625-632)中所觀察到之鏈間色胺酸接觸。因此，位 置-1處優選色胺酸提示對由芳族與鏈βΐ之蛋白質主鏈之相 128788.doc -116- 200846358 互作用所介導之高親和力結合之一般且稍微非選擇性的貢 獻。在HtrAl-PDZ之情況下，Trp 1亦延伸穿過鍵βΐ之主 鏈，然而，吲哚環之取向與HtrA3-PDZ之取向顯著不同（圖 7A)。TYp·1定位於 pN-3(Tyr382)與 pi-2(Arg386)之側鏈之間 且鄰接位置β2: α2-1處之異白胺酸側鏈（Ile418)。吲垛環之 取向並不採取橫穿整體之獨特構形（圖3 A)。NOE限制之缺 乏（芳族質子之3個分子間NOE)與未採取獨特構形而在構形 上為動態之吲哚環相符。所量測之化學位移與所計算之化 學位移的比較亦不支持吲哚環之單一、明確之構形。

HtrAl-PDZ在位置-2處確實展示對色胺酸之強烈優選。 Trp·2尤其在整體中由指定至其芳族質子之20個獨特分子間 NOE得以明確確定。吲哚環包裝抵靠螺旋α3，產生與α3-l(Ala445)、pi-3(Met387)及 α3-2之亞甲基（Gln446)之有利 疏水性相互作用（圖5 A)。°弓卜朵環直接定位在Gln446之α質 子上方，歸因於環電流效應誘發大的（-1 ppm)化學位移擾 動。雖然HtrA3-PDZ之結合概況及合成肽結合檢定提示位 置-2對配位體結合而言不重要，但晶體結構展示肽H3_cl 中之Arg·2經定位以與位置α3-4處之麩胺醯胺側鏈（Gin 423) 形成氫鍵（圖5C)。在人類CASK PDZ域之結構中已觀察到 幾乎一致的相互作用（Daniels，D· L·，Cohen，A· R·， Anderson, J. M.^Brunger, A. T. (1998) Nat Struct Mol Biol 5(4)，317-325)。

HtrA 1 -PDZ之配位體結合概況及合成肽結合檢定提示其 在位置-3優選異白胺酸殘基。NMR結構展示11一包裝至由 128788.doc -117- 200846358 p2-3(Ile415)及pl-2(Arg386)產生之疏水補丁塊中（圖5A)。 肽及蛋白質之β2-3的lie·3包裝抵靠β1-2(Αα386)之側鏈亞 甲基可能造成影響位置-1之可達性的Arg386-Glu416鹽橋 之突出。在HtrA3-PDZ複合結構之情況下，肽H3_cl之Gly·3 不直接接觸HtrA3-PDZ，但採取正Φ角定位Phe-4之羰基氧 以在位置p2-2(Arg360)處與側鏈形成氫鍵以及使Phe-4之側 鏈經由π-π堆疊與Arg360側鏈相互作用（圖5C)。雖然此在 在能量方面為有利構形且噬菌體選擇展示在位置-3處優選 甘胺酸或絲胺酸（表1)，但HtrA3-PDZ之合成肽結合檢定並 未提示位置-3處甘胺酸與配位體位置-4處芳族殘基之能量 優點（參見表3)。殘基-4至-7似乎不參與與HtrAl-PDZ之相 互作用，且在NMR整體中未充分確定。在HtrA3-PDZ中， 存在由Gly·6之羰基氧與Gly·3之醯胺之間的氫鍵穩定之I型 反轉，然而合成肽結合檢定並未提示該構形對配位體結合 很重要。 具有匹配HtrAl-PDZ之特異性概況之C-末端的潛在細胞 外配位體的基因組廣泛檢索鑑別出具有C-末端肽 KNLKSLTWWL(SEQ ID NO: 162)之白胺醯基/胱胺醯基胺 基肽酶同功異型物l(GenBank第NP_005566號）及具有C-末 端肽KNLKSLTWWL(SEQ ID NO: 163)之白胺醯基/胱胺醯 基胺基肽酶同功異型物2(GenBank第NP_787116號）。HtrAl 與TGF-β家族成員特異性相互作用之提示（Murwantoko等 人，（2004) Biochem J. 381(第 3 部分）：895-904)並未得到該 等結果的支持。雖然結果確認HtrAl-PDZ確實結合C-末端 128788.doc -118- 200846358 (諸如Col3al之C-末端）且因此可在纖維狀膠原蛋白C-前肽 之代謝中起作用，但分析亦展示多種其他C-末端序列能夠 以可比或甚至較高之親和力結合。HtrAl-PDZ似乎識別多 種具有暴露疏水性C-末端之標靶而非僅少數選定標靶。 在HtrA3_PDZ之情況下，對在位置-1處含有色胺酸之配 位體之驚人優選提示雖然特異性之決定子有限，但HtrA3 可優先與在該位置含有色胺酸之配位體結合。許多定位於 細胞外基質之哺乳動物蛋白質在倒數第二的位置處具有保 守色胺酸，包括具有C-末端序列YCKRSMQEWV(SEQ ID NO: 164)之人類基質金屬蛋白酶15(GenBank第NP_002419 號）；具有 C-末端序列 YCKRSMQEWV(SEQ ID NO: 165)之 基質金屬蛋白酶16(GenBank第NP_005932號）；及具有C-末 端序列YYKRPVQEWV(SEQ ID NO: 166)之基質金屬蛋白 酶24(GenBank第NP—006681號）。具有C-末端序列 PALKNGQYWV(SEQ ID NO: 1 67)之黑素瘤相關硫酸軟骨 素（GenBank第NP-001888號）及具有C-末端序列 EIRASQRSWV(SEQ ID NO: 168)之角化細胞相關蛋白質 3(GenBank第NP_776252號）在倒數第二的位置處亦具有保 守色胺酸且因此可為HtrA3-PDZ域之配位體。 實例4 ·· HtrAl_PDZ之烏搶掃描 由組合丙胺酸掃描評估Htr A1-PDZ域之個別殘基對配位 體結合之貢獻（參見，例如WO 2001/044463)。構造三個文 庫，其中肽結合位點中及周圍之64個位置由編碼野生型胺 基酸或丙胺酸（或，在當野生型胺基酸為丙胺酸時情況 128788.doc -119- 200846358 下，為非丙胺酸突變體）之三核苷酸表示。如下構造文 庫。藉由修改先前所述之嗟粒（pS2202b)使HtrAlPDZ呈現 於 M13噬菌體之表面上（Skelton，N· J.，Koehler，M. F·， Zobel，K·，Wong，W· L·，Yeh，S·，Pisabarro, Μ· T,5 Yin，J· P·，Lasky，L· A·及 Sidhu，S. S· (2003) 278(9)， 7645-7654)。使用標準分子生物學技術用編碼HtrAl PDZ 之DNA片段置換編碼人類Erbin PDZ之pS2202b之片段。所 得噬粒（p8HtrAl)含有編碼麥芽糖結合蛋白分泌信號之開 放閱讀框，隨後為抗原決定基標籤（胺基酸序列： SMADPNRFRGKDLGS(SEQ ID NO: 169))，隨後為 HtrAl PDZ且以M13基因-8次要鞘蛋白之C-末端域結束。用M13-K07輔助噬菌體共感染含有p8HtrAl之大腸桿菌且使其在 無IPTG誘導之情況下在37°C下生長，從而使得產生包裹 p8HtrAl DNA且以單價格式呈現HtrAl PDZ之噬菌體粒 子。 使用先前所述之方法（sidhu，s_ S·，Lowman，Η· B·， Cunningham, B. C.及 Wells，J· Α· (2000) Mei/zoA 328, 333-363)用經適當設計之p8HtrAl之"終止模板”形式構 造文庫。對各文庫而言，吾人使用在各待突變之區中含有 TAA終止密碼子之終止模板。使用終止模板作為Kunkel突 變誘發方法（Kunkel，Τ· A·，Roberts，J· D.&Zakour，R.A· (1987) Mei/zoA五似少所<9/ 154，367-382)之模板，其中誘變 募核苷酸經設計以同時修復終止密碼子且在所要位點引入 突變。就鳥搶掃描而言，用Vajdos等人（Vajdos，F· F·， 128788.doc -120- 200846358

Adams，C· W·，Breece，Τ· N·，Presta，L· G·，de Vos，A. Μ,及 Sidhu，S· S. (2002) J Mo/ 320(2)，415-428)之表 1 中所 示之相應簡幷密碼子置換野生型密碼子。構造三個文庫且 各文庫如下使HtrAlPDZ之離散區突變：文庫1，位置380-400 ;文庫2，位置401-422 ;文庫3，位置440-460。文庫 1、2及3分別含有3·0χ101()個、2.5xl01G個及2.3xl01G個獨特 成員。 藉由添加Μ13 -K07輔助噬菌體使來自上述文庫之嗟菌體 在大腸桿菌XL1-藍色中繁殖。如先前所述（Sidhu，S. S·， Lowman，Η· B.，Cimningham，Β· C·及 Wells，J· A. (2000) 328，333-363)，在 37°C 下生長隔夜後， 將噬菌體藉由用PEG/NaCl沈澱來濃縮且再懸浮於PBS、 0·5°/〇 BSA、0.1% Tween 20中。將嗤菌體溶液（1〇12個嗤菌 體/毫升）添加至已塗佈有捕集標靶且經BSA阻斷之96孔 Maxisorp™免疫板中。使用兩種不同標革巴：就呈現選擇而 言，標靶為識別與HtrAl PDZ之N末端融合之抗原決定基 標籤的經固定抗體，而就功能選擇而言，將以高親和力與 HtrAl-PDZ結合之生物素化肽（生物素-GWKTWIL(SEQ ID NO: 26)或生物素-DSRIWWV(SEQ ID NO: 5))(Laura，R. P·， Witt，A. S·，Held，Η. A·，Gerstner，R·，Deshayes，K·， Koehler，M. F·，Kosik，K. S·，Sidhu，S. S.及 Lasky，L. A. (2002) J 5ζ·ο/ C/zem 277(15)，12906-12914)固定於經 NeutrAvidin™-塗佈之板上。培育兩小時以允許嗟菌體結 合後，將板用PBS、0.05% Tween 20洗務10次。將結合嗟 128788.doc -121 - 200846358 菌體用0·1 M HC1溶離10分鐘且將溶離劑用ΐ·〇 M Tris鹼中 和。使溶離嗤菌體在大腸桿菌XL 1 -藍色（Stratagene)中擴增 且用於其他輪選擇中。 使來自第二輪選擇之個別純系在96孔格式中在補充有卡 本西林及M13-K07之500 gL 2YT肉湯中生長，且將培養物 上清液直接用於嗤菌體ELISA(Sidhu，S. S.，Lowman，Η. Β.， Cunningham，B. C.及 Wells，J. A. (2000) Mei/zoA 328，333-363)中以偵測與生物素-GWKTWIL、生物素-DSRIWWV或抗標籤抗體結合之噬菌體呈現HtrAlPDZ變異 體。超過50%之純系展現大於塗佈有BSA之對照板上所觀 察到之信號至少兩倍的陽性噬菌體ELISA信號。使該等陽 性純系經受DNA序列分析。 用如先前所述之程式 SGCOUNT(Weiss，G· A·，Watanabe， C, K·，Zhong，A·，Goddard，Α·及 Sidhu，S. S. (2000) 97(16)，8950-8954)分析序列。SGCOUNT 藉由使用 Needleman-Wunch成對比對算法相對於野生型DNA序列比 對各DNA序列，轉譯各具有可接受品質之比對序列且將各 位置處各天然胺基酸之出現列成表格。就功能選擇而言， 所分析之純系之數目指示於各文庫之名稱後面之圓括號 中：就以生物素-GWKTWIL(SEQ ID NO: 4)進行之功能選 擇而言·· Ll(80)、L2(91)、L3(89);就以生物素- DSRIWWV(SEQ ID NO: 5)進行之功能選擇而言·· L1(82)、 L2(89)、L3(93);且就呈現選擇而言，分析以下數目之純 系：Ll(69) 、 L2(78) 、 L3(91)。 I28788.doc -122- 200846358 隨後就與肽Hl—c3或肽HI—c2之結合選擇該等文庫，且 在兩輪選擇後將對結合呈陽性之純系定序。將在各位置處 具有野生型殘基之純系的數目與具有丙胺酸（或突變體）之 數目比較以給出野生型殘基優於丙胺酸（或突變體）之優選 的指示。為控制不同文庫成員之表現或呈現含量之變化， 亦就與能夠識別呈現於所有文庫成員之N—末端處的抗原決 定基標籤的固定抗體之結合選擇文庫。隨後以抗體選擇中 所觀察到之野生型與突變體之比率衡量肽選擇中野生型與 _ 突變體之比率以給出正規化之出現頻率（F ;表4)。使用該 正規化之出現頻率將各位置處之取代分成三類：降低與肽 之結合之取代（F > 5);不影響結合之取代約為〇 ;及增 加與肽之結合之取代（F ^ 〇,5)。 在圖7A及7B中分別將HtrAl-PDZ中之丙胺酸取代對與肽 H1 一 c3及H1 一 c2結合之影響反映在HtrA1_pDz^結構中。就 肽HI—c3而言，一些對結合產生顯著影響（F > 5)之取代位 φ 於與狀配位體直接接觸之位置處（參見，例如Y3 82、 13 83 G384、M387及S389) ’而其他位於離肽配位體超過 4.5 A之位置處（參見，例如 K38〇、K381、G411、、 1414、V417、Τ421及Ρ422)。雖然彼等殘基並不直接接觸 肽配位體，但用丙胺酸置換其側鏈有可能引入pDZ域結構 之局部擾動。舉例而言，位置414(β2-2)處之異白胺酸包裝 至域之疏水性内部，且用單一曱基置換大體積脂族側鏈可 擾動疏水性内部之包裝排列且可能影響β2_β3反平行卜摺 疊片，故擾動配位體結合位點。許多殘基優選丙胺酸取代 128788.doc -123- 200846358 (參見，例如 D400、1418、V442、N446、D447、V448、 S449及L458)。在該等殘基中，僅殘基1418、N446及S449 在複合物之肽之4.5 A範圍内。 丙胺酸取代對H1 一c2肽結合之影響與H1 一C3極類似（圖 4A’表5)，但存在一些顯著差異。兩種肽之丙胺酸掃描結 果之間的最驚人差異可見於殘基1418。在肽Hl—c2之情況 下，殘基1418為有利的（F=17.7)，而在Hl—c3之情況下，在 該位置處稍更優選丙胺酸（F=0·5)。此可能與由結構分析所 推斷出之Trp·1之非最佳相互作用有關，且此可藉由位置 141 8處之丙胺酸取代得到改良。兩種肽之間的另一顯著差 異可見於殘基S389(pi-5)。在該位置處對與肽hi_c3結合 而言野生型絲胺酸為有利的（F > 46)，但該位置處之取代 並不衫響與狀HI—c2之結合（F=2)。雖然在NMR結構中該殘 基似乎並不直接接觸肽，但其位於結合位點之周邊且在整 體之所有成員中S389之側鏈羥基直接指向肽。在NMr整體 中，三個N·末端肽殘基之側鏈歸因於缺乏n〇e限制而未充 刀確疋，且不能明確確定S3 89(或其缺乏）直接涉&Arg-4側 鏈。 128788.doc -124- 200846358 表6 :使用生物素-GWKTWIL進行之HtrAl-PDZ之鳥槍丙胺 酸掃描之資料* 配位體：生物素-GWKTWIL___

___wt/突變 _ F 殘基 ' &能選擇 呈現選擇 K380 K381 Y382 1383 G384 1385 R386 M3 87 M388 S389 L390 T391 5392 5393 K394 A395 K396 E397 L398 K399 D400 R401 H402 R403 D404 F405 P406 D407 V408 1409 S410 G411 A412 Y413 1414 1415 E416 V417 1418 1 8 3 4 8 9 0 7 7 3 /mlo.>6>7>5>273.>1·>4 wt A 4 2 5 80724772268604494476 t/5418>5>89120037311010021010 w 2 95 ❹ 6 6 3 12 rm 4·ί1.ί7.2.0.>70.a wt/A wt/ml wt/m2 .0.3.9.3.0.8 11 1X 1A 11 ov .49 2.3.8.9.0.2 2 o 34 ool 1 5 9 6 5 6 1·>8>310.>8 1000560116 13.90.144:>32L1>9>8 3 3 4 .6.8.64.3.9.0.5 ο o 1- 2 1- o 1_ 2 5 0. 9 7 3 >80.a .2 128788.doc 49.5.8.2.5.0.5.4.7.9.6.4.8.5.0.0.4.3.9.7.7.1.7.5.0.6.2.8.5.4.7.0.9.4.2J.7.2· Αν ο 11 IX 11 Λν 11 ο CU11 ΙΑ Αν 11 ο ο f-Η ο ο 03 11 11 1i ο 11 0XW 1χ 11 11 ΙΑ 11 5 .3.7.0 0.0.1. 7 0. 4 2 4 7 0.1.0.ο* 0 2 5 8 ···* 8 2 6 1 6 2. .2.3.4.0.1.7.4 11 1i 11 11 11 11 .6 0. 0 5 0 5.2· 1· 8 5. 3 2 2 7 11 11 > 1X 1 J 7*0·9·7·9·6 il 11 11 tl 11 3 0. 5 6 0. 8 0. 7 ο· a4 7 0 169135253122049376564968843120357045 1Μ » · · mry. ·····♦···········»··········· » 7f. A15437>2>33600225121100210201200002233115>2171>3>7

ml m2 38.6 E 11.9 T >87 E 25.6 T >74 D 103.6 S >82 T 3.7 V 3.6 T 0.4 V 33.9 G 1.0 P >1.1 T 0.1 V 0.9 T 0.2 V >17 P 1.3 V

2.4 E 0.5 T 0·7 E 0.5 T 2.5 P 1.6V 3.0 E 2.9 T 0.8 G 0.7 P 0.8 D LOP 1.5 G 1.8 P 0.8 S 1.4 V

2.5 T 1.6V

>18 D >61 S >14 T 1.2 V 11.1 T 0.4 V

>15 T 23.2 V 200846358

P419 21.8 D420 2.3 T421 >91 P422 >91 Q440 1.9 S441 3.2 V442 1.5 V443 1·6 S444 43.5 A445 1.0 N446 0.1 D447 1.4 V448 13.8 S449 0.5 D450 0.4 V451 0.4 1452 18.0 K453 0·2 R454 1.6 E455 0.2 S456 3.7 T457 1,1 L458 6.8 N459 1.4 M460 >83 1.7 1.0 27.0 0.6 1.1 >68 0.7 83·0 >42 0.6 1.8 0.5 17.0 6.2 3.116.6 2.5 1.7 2.3 2.5 1.7 2.4 45.0 2.5 44.5 1.0 12.0 1.0 0.2 0.2 0.3 2.5 7.3 2.3 0,8 0.5 6.0 12.0 1.5 0.4 0.5 0.9 1.5 2.7 14.3 0.5 3.1 1.2 31·0 62.0 2.3 1.6 1.1 2.0 32·0 64.0 2.7

8·7 1,4 >40 >36 0.7 Ε >0.9 Ρ 1.3 0·0 1.6 3.6 1.0 0·7 5.8 D 1.9Τ 0.6 1.9 0.2 0.6 0.8 3·〇 2.3 Τ 1.2 V 0·5 1.0 Ε 0.6 Τ !·1 0.4 G 1.2Ρ 0.4 1.2 0.9 0·2 >1.1 Τ 2,7 V °·9 0.6 D 1,6 Τ ^3 1.3 Τ 6.2 V *就與高親和力肽配位體（功能選擇）或抗gD_標籤抗體（呈現 選擇）結合進行選擇後，由所分離之結合純系之序列來測 定Wt/突變比率。藉由將功能選擇wr/突變比率除以呈現選

擇Wt/突變比率得到正規化之出現頻率。在功能選擇序 列中未觀察到特定突變之情況下，僅可確定wt/突變比率 及F值之下限（以大於符號指示）。在丙胺酸掃描需要四聯 费碼子（tetranomial codon)之情況下，測定丙胺酸取代以及 兩個其他取代（m2及m3)之F值。非丙胺酸取代之一致性展 示於各F值右邊之圓括號中。粗體數字指示具有超過4倍效 應之突變。 (續表7在下一頁上） 128788.doc •126- 200846358 表7 :使用生物素-DSRIWWV進行之HtrAl-PDZ之鳥搶丙胺 酸掃描*

配位體:生物素-DSRIWWV wt/突變J 殘基 功能選擇 _ ' 瓦現選擇 K380 K381 Y382 1383 G384 1385 R386 M387 M388 S389 L390 T391 5392 5393 K394 A395 K396 E397 L398 K399 D400 R40! H402 R403 D404 F405 P406 D407 V408 1409 S410 G411 A412 Y413 1414 1415 E416 V417 1418 wt/A wt/ml wt/m2 4.2 8.3 3.6 5.5 66.0 22.0 8.4 74.0 3.9 61.0 61.0 2.9 W L 4 9 5 8 /Αο· ο. ο· 2· wt Ell wt/m2 0.3 0.4 0.7 1.2 1.0 0.4 0.7 0.7

01080 00.4.9.4.3.6.6.6.0·0.0.5 41.1.31.7.18.18.39.3.41101 ο8528196 ο 6 632067963084923.7.0.8.8.8.3.6.9.6.6.0.0.3.0.8.5.0.6 2,4.1.0.5.0.3.2.1.111102.10.110.0210301ί91Σ82841890 8 18 8 2 2 CC 3 3 7· 8· 1· 11 Q ο ο 11 3 ο 2 6 〇〇 1.6.5 2.2.3.2.2.2.0.1 5 0. 0 5 9 5.0.C5 8 7 25 0547964850043.9.7.71·.7.5.ο.62·8.54.7ο.94217 2· 2· 2* 1.1.1· 2· ο· 1·0.ο· 1· 1· OLOO.0.1 ο ο 3 1 1 1 ο 1 2 1 2 1 1 1 2 8.0 1·7 2.2 73.0 6.5 L2 1.8 1.2 2.6 1.1 o.2.34 ο· 1· 7· 4· 1- 1 1- 1 1- 11 ο 11 6 0. 17.0.9.7.9.68· 11 Ίχ 1-Η ο ο ο 11 0. 2 .0.5.0.8 52.1 5 5 6 8 1.0.0. 7 0. la1.96.26.9>22>37L90.86.83,8sL24.5L42.02.51.01.80.92.3L40:52.40.91.21.70.90.80.52.21.2u>331.09.720:a4.01.4>330.5 A 1 1 > > 4 2

ml m2 29·8Ε 8.7 Τ 91.0 Ε 17.9 Τ >74 D 11.0 S >86 Τ 4.093 V >5Τ 0.761 V 0.5 G 0.4 Ρ 4.8 Τ 0.6 V 42 Τ 0.7 V 7.0 Ρ 1.0 V

18.0 Ε 2.1 Τ 33.2 Ε 1.2 Τ 2.7 Ρ 3.2 V 3.4 Ε 3,1 Τ 1.4G 1.6 Ρ 1.2 D 2.3 Ρ 0.8 G 1.0 Ρ 1.1 S 0.9 V LOT 1.5 V

>17 D 58.0 S >11 Τ 0.8 V 20.0 Τ 1.1 V 1.1 Τ 2.3 V 128788.doc -127- 200846358 P419 D420 T421 P422 Q440 S441 V442 V443 S444 A445 N446 D447 V448 S449 D450 V451 1452 K453 R454 E455 S456 T457 L458 N459 M460 3.2 2.36.4 21.3 2.0 22 5.2 1.7 22.3 1.0 0.1 0.5 2.8 0.3 0.5 1.018.0 0.8 1·9 0.5 2.9 0.8 8·8 0.712.0 2Λ 23.5 36.0 3·3 3.7 0.7 1.08.0 1.5 2.5 1.7 2.3 2.5 1.7 2.5 44.5 1.012.0 1.0 0.2 2.5 73 2.3 0.8 0.5 6.0 0.4 1.5 0.5 3.1 1.231.0 1.632.0 24 45,0 〇·2 0.3 12.0 0.5 2.7 1.5 0.914.3 2.7

1.3 1.4 2.98.5 U 1.0 Ε 0.5 Ρ 0.9 0.1 1.7 1.9 1.0 0.5 20.4 D 2.0 Τ 0.2 0.4 0.1 0.6 1.8 3.0 1.9 1.3 0.9 0.9 0.6 0.3 >0.9 Τ 0.7 V 0.4 0.3 D 0.7 Τ 038 LIT L9V 3.0 Τ 0.4 V 6.0 Ε 1.2Τ 1.4 G 0,6 Ρ *就與高親和力肽配位體（功U @ 、擇）或抗標籤抗體（呈現 „選擇後，由所分離之結合純系之序列來測 疋wt/m：b率1由將功能選擇⑽突變比率除以呈現選 擇wt/突變比率得到正規化 <出見^員率（F)。在功能選擇序 列中未觀察到特定突變之情況下，僅可確 及F值之下限(以大於符號指示）。在丙胺酸掃描需要四聯 密碼子之情況下，敎丙胺酸取代以及兩個其他取代㈤ 及叫^值。非丙胺酸取代之—致性展示於各右邊之 圓括號中粗體數子指示具有超過4倍效應之突變。 實例5 : HtrAl-PDZ突變體之結合特異性概況 上述結構及突變分析提示出1^1_1>1)2與HtrA3_pDZ之間 的特異性之差異為鄰近肽結合位點之主要在位置p 2 _ 3、β 2: 128788.doc -128- 200846358 2_1及α3-5處之有限數目之序列差異的結果。評估在HtrAl-PDZ之情況下對突變之配位體特異性之影響。使用噬菌體 呈現肽文庫確定HtrAl-PDZ之點突變（I415Q、I418A及 S449Q)及雙重突變體（I415Q/I418A)之結合特異性概況，其 中HtrA卜PDZ之殘基係經HtrA3-PDZ之相應殘基取代。相 對於呈現於M13 p8鞘蛋白之C-末端之隨機七肽的文庫對突 變體加以分類。僅對雙重突變體HtrAl(I415Q/I418A)-PDZ 獲得特異性結合純系。 特異性設計該突變體以使其模擬HtrA3-PDZ之結合特性 (參見表1)，且其特異性概況與HtrA3-PDZ之特異性概況基 本上一致。在位置0處，HtrAl(I415Q/I418A)-PDZ展示對 纈胺酸及白胺酸殘基之優選，儘管亦選擇其他疏水性胺基 酸。雖然HtrAl(I415Q/I418A)-PDZ之位置 0優選與 HtrA3-PDZ之優選稍有不同，但其餘配位體位置處之優選與對 HtrA3-PDZ結合所觀察到之優選難以區分。僅在位置-1處 選擇色胺酸，位置-2處不存在優選，位置-3展示對甘胺酸 及絲胺酸殘基之優選，且任何其他配位體位置均未展示任 何優選。 【圖式簡單說明】 圖1描繪人類Htf A家族蛋白質之序列比對，其中在各序 列之左邊對序列編號。在序列上方指示二級結構之元件。 所有4個成員中均一致之殘基用虛線框突出顯示，且所有4 個成員中類似之殘基用實線加框。在序列下方由實心星形 (位點0)、實心三角形（位點-1及位點-3)或實心圓圈（位點- 128788.doc -129- 200846358 2)指示直接參與配位體識別且對配位體特異性重要之殘 基。圖之右下方概述如由喔囷體王現及合成狀親和力檢定 所測定之HtrAl、HtrA2及HtrA3之配位體結合特異性概 況，其中X指示無優先且Φ指示疏水性胺基酸優先。 圖2描繪肽Hl_c3與HtrAl-PDZ之結合之實驗熱量測定資 料。上圖展示單一滴定實驗期間所獲得之原始熱資料，在 該實驗中將10 μ!"肽（284 μΜ)注射液滴定至於具有1 mM疊 氮化鈉之PBS緩衝液中之HtrAl-PDZ域（5·5 μΜ)中。上圖之 資料之積分熱信號產生下圖中所示之結合曲線。實線代表 基於單一結合位點模型之減去稀釋熱後資料之非線性最小 平方擬合。 圖3描繪如實例3(a)中所述之與來源於噬菌體之肽配位體 結合的HtrAl-PDZ之結構。圖3Α展示與肽Hl_3複合之 HtrAl-PDZ的結構整體。僅由線展示主鏈Ν、Ca及C原子。 HtrAl-PDZ結構以淺灰色展示，而肽Hl_3以深灰色展示。 包括所選肽側鏈重原子。殘基378-3 89、411-463及468-475 之主鏈重原子與平均結構之均方根離差為0.52 土 0.1 A。距 離或二面角限制分別不被超出0.1 A或1°(表4)。圖3B展示 與Hl__3肽結合之HtrAl-PDZ之帶狀視圖（肽以棒表示法展 示）。規則二級結構之元件及肽殘基係經標記。 圖4八描繪如實例3(13)中所述之11忖八3-?026\1結構之二聚 體。使PDZ域呈深灰色陰影且五肽以淺灰色展示。肽經由 3個甘胺酸殘基連接至PDZ域之C末端。HtrA3-PDZext結構 每個不對稱單元含有兩個分子，且除鏈βΐ與β2之間的無序 128788.doc -130- 200846358 區外，兩個複本均在電子密度方面經充分確定。圖4B展示 HtrA3-PDZext之帶狀視圖，其中肽以棒表示法展示。規則 二級結構之元件及狀殘基係經標s己。 圖5描繪如實例3(C)中所述之某些PDZ域與特定肽配位體 之相互作用。圖5A展示與肽Hl_c3結合之HtrAl-PDZ。圖 5B 展示與肽 H2—cl(WTMFWVCOOH)(SEQ ID NO: 170)結合 之HtrA2-PDZ。圖5C展示與肽H3_cl結合之HtrA3-PDZ。圖 5D-5F展示未經配位體結合之DegP-PDZl (圖5D，pdb登錄 號1KY9)、未經配位體結合之DegS-PDZ(圖5E，pdb登錄號 1SOT)及與OmpC肽結合之DegS_PDZ(圖5F，pdb登錄號 1SOZ)。在各圖中，結構以相同相對取向展示。圖A、B、 C及F中所示之肽出現在各圖之中心。側鏈氮原子以深灰色 展示。肽配位體側鏈用三字母胺基酸代碼及呈上標之配位 體位置編號以灰色標記，而PDZ域之側鏈用單字母胺基酸 代碼及殘基編號以黑色標記。 圖6展示如實例3(c)中所述，對HtrAl-PDZ複合物之異核 NOE量測。 圖7描繪如實例4中所述，鳥槍丙胺酸掃描中肽Hl_c3(圖 7A)及肽Hl_c2(圖7B)於HtrAl-PDZ結構上之定位（如表面所 展示）。兩種肽均以棒顯示。隨文庫變化之PDZ域殘基著色 成黑色（F>16)、深灰色（16>F>5)、中灰色（5>F>0.5)或淺灰 色（F</=0.5)。不隨選擇變化之殘基經加點。使用與肽 Hl_c3結合之HtrAl-PDZ之NMR整體用同源建模程式建模 者（Modeler)(Accelrys，Inc·)產生與肽 HI—c2結合之 HtrAl-PDZ之結構模型。 128788.doc -131 -

Claims (1)

1. 200846358 十、申請專利範圍： 1· 一種分離之多肽，其與HtrAl PDZ域特異性結合，其中 該多肽包含一個在相對於C端之位置_2具有色胺酸之序 列。 2·如請求項1之分離之多肽，其中該多肽進一步包含一個 小胺基酸在位置0。 3 ·如凊求項2之分離之多肽’其中該位置〇之胺基酸係選自 白胺酸及纈胺酸。 4·如請求項1之分離之多肽，其中該多肽進一步包含一個 包含魔大（bulky)側鏈之胺基酸在位置_ 1。 5.如請求項4之分離之多肽，其中該位置_丨之胺基酸係選自 色胺酸、異白胺酸及苯丙胺酸。 6·如請求項5之分離之多肽，其中該位置“之胺基酸為色胺 酸。 7 ·如請求項1之分離之多肽，其中該多肽進一步包含蘇胺 酸或異白胺酸在位置-3。 8·如請求項1之分離之多肽，其中位置_4之胺基酸帶電。 9. 如請求項8之分離之多肽’其中該位置_4之胺基酸係選自 麩胺酸、離胺酸、精胺酸及天冬胺酸。 10. 如請求項9之分離之多肽，其中該位置-4之胺基酸係選自 離胺酸及精胺酸。 11 ·如請求項1之分離之多肽，其中該位置〇之胺基酸係選自 白胺酸及纈胺酸；其中該位置4之胺基酸係選自色胺 酸、異白胺酸及苯丙胺酸；其中該位置-3之胺基酸係選 128788.doc 200846358 自蘇胺酸及異白胺酸；且其中該位置-4之胺基酸係選自 麩胺酸、離胺酸、精胺酸及天冬胺酸。 12·如請求項1之分離之多肽，其中該位置〇之胺基酸為白胺 酸；其中該位置-1之胺基酸為色胺酸；其中該位置-3之 胺基酸係選自蘇胺酸及異白胺酸；且其中該位置-4之胺 基酸係選自離胺酸及精胺酸。 1 3 ·如請求項1之分離之多肽，其中該多肽包含一個選自表1 中所列出之HtrAl PDZ域結合肽之序列的序列。 _ 14·如請求項1之分離之多肽，其中該多肽包含序列 DIETWLL(SEQ ID NO: 3)、GWKTWIL(SEQ ID NO: 4)、 DSRIWWV(SEQ ID NO: 5)或 WDKIWHV(SEQ ID NO: 6) o 15·如請求項1之分離之多肽，其中該多肽包含序列 DSRIWWV(SEQ ID NO: 5)。 1 6·如請求項1之分離之多肽，其中該多肽直接與至少一個 特異性HtrAl-PDZ域殘基相互作用。 ® 17·如請求項16之分離之多肽，其中C端羧酸酯基與至少一 個選自Ile383、Ile385及Gly384之HtrAl PDZ域殘基配 位。 18·如請求項16之分離之多肽，其中該位置-1之胺基酸與至 少一個選自 Tyr3 82、Arg386及 Ile418之 HtrA1 PDZ域殘基 動態相互作用。 19·如請求項16之分離之多肽，其中該位置-2之色胺酸與至 少一個選自 Ala445、Met387及 Gln446之 HtrAl PDZ域殘 128788.doc 200846358 基相互作用。 20·如請求項16之分離之多肽，其中該位置-3之胺基酸與至 少一個選自Ile415及Arg386之HtrAl PDZ域殘基相互作 用。 21 ·如請求項1 6之分離之多肽，其中該多肽與至少一個選自 Tyr382、Ile383、Gly384、Met387及 S389之 HtrAl PDZ域 殘基相互作用及/或配位。 22· —種分離之多肽，其與HtrAl PDZ域特異性結合，其中 該多肽包含一個在相對於酸性胺基酸之位置-2具有色胺 酸之序列。 23·如請求項22之分離之多肽，其中該多肽包含一個式XI-X2-W-X3-X4之序列，其中XI係選自纈胺酸及白胺酸； 其中X2係選自絲胺酸、蘇胺酸、精胺酸、丙胺酸及纈胺 酸；其中X3係選自甘胺酸、絲胺酸、苯丙胺酸及白胺 酸；且其中X4為酸性胺基酸。 24.如請求項23之分離之多肽，其中X3為甘胺酸且X4係選自 麩胺酸及天冬胺酸。 25· —種分離之多肽，其與HtrAl PDZ域特異性結合，且包 含一個包括選自表1、2及3中所列出之胺基酸序列之肽 的胺基酸序列之C端、N端或内部胺基酸序列。 26.如請求項25之多肽，其中該C端胺基酸序列係選自 DIETWLL(SEQ ID NO： 3) ^ GWKTWIL(SEQ ID NO: 4) > DSRIWWV(SEQ ID NO: 5)及 WDKIWHV(SEQ ID NO: 6) o 128788.doc 200846358 27· —種分離之多肽，其包含一個與如請求項1至26中任一 項之多肽競爭結合於HtrAl PDZ域之胺基酸序列。 28. —種分離之多肽，其與如請求項1至26中任一項之多肽 結合於HtrA1 PDZ域上之同一抗原決定基（epitope)。 29. —種分離之多肽，其包含HtrAl PDZ變異序歹U，其中至 少一個選自以下之HtrAl PDZ域殘基經另一個胺基酸取 代：Ile383、Ile385、Gly384、Tyr382、Arg386、 Ile418、Ala445、Met387、Gln446、Ile415、Arg386、 Ser389、Lys380、Lys381、G1411、Tyr413、Ile414、 Val417、Thr421 及 Pro422 〇 30. 如請求項29之分離之多肽，其中Ile4 18係經另一個胺基 酸取代。 31. 如請求項29或30之分離之多肽，其中該另一個胺基酸為 丙胺酸。 3 2. —種分離之多肽，其包含一個與如請求項29至31中任一 項之多肽競爭結合於HtrAl PDZ域之配位體之胺基酸序 列。 3 3. —種分離之多肽，其與如請求項29至31中任一項之多肽 結合於HtrAl PDZ域之配位體上之同一抗原決定基。 34. —種鑑別可調節HtrAl PDZ域-配位體相互作用之化合物 之方法，其包含使一個包含HtrAl PDZ域、HtrAl PDZ域 之片段及/或其功能相等物及至少一種如請求項1-27中任 一項之多肽的樣品與一種候選化合物接觸，及測定在該 候選化合物存在之情況下HtrAl PDZ域-配位體相互作用 1287δ8.(1οο -4- 200846358 曰 /、該候遠化合物不存在之情況相比；由在該候選 口物存在之情況下HtrAl PDZ域-配位體相互作用之量 /、在違候選化合物不存在之情況下之量相比的變化表明 該候撰^ 、 、、匕合物為可調節HtrAl PDZ域-配位體相互作用之 化合物。 •種0理設計HtrAl PDZ域-配位體相互作用之調節劑之 ' 其包含設計該調節劑以包含或模擬一個色胺酸位 於相對於C端之位置_2或相對於肽中酸性殘基之位置_2之 功庇1 ’其中該調節劑可與HtrAl PDZ域特異性結合。 36·如印求項35之方法，其中該肽係位於該羧基端。 37·如睛求項35之方法，其中位置〇係選自白胺酸及纈胺 魷，其中位置-1係選自色胺酸、異白胺酸及苯丙胺酸； 中位置-3係選自穌胺酸及異白胺酸；且其中位置·4係 選自楚胺酸、天冬胺酸、離胺酸及精胺酸。 38.如請求項35之方法，其中位置〇係選自白胺酸及纈胺 酸；其中位置-1為色胺酸；其中位置—3係選自蘇胺酸及 異白胺酸；且其中位置-4係選自麩胺酸及天冬胺酸。 39· —種HtrAl PDZ域-配位體調節劑之用途，其係用於製造 供治療與HtrAl蛋白質活性之調控異常相關之病理學病 狀之藥物，其中該調節劑可調節HtrAl PDZ域與如請求 項1 -26中任一項之多肽之間的相互作用。 40·如請求項39之用途，其中該病理學病狀係選自惡性及良 性腫瘤或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病、神經退化 性病症、發炎及免疫病症及眼内新血管疾病。 128788.doc 200846358 41. 42. 43. 如請求項39之用途，其中嗜 外々 T 口茨調即劑抑制HtrAl PDZ域盥 该夕肽之間的相互作用。 ，、 如清求項3 9之用途，其中兮士 ^ Y $调即劑增強HtrAl PDZ域與 5亥多肽之間的相互作用。 如明求項1至26中任-項之HtrAl pDz域配位體之用 :’其係用於製造供治療與此幻蛋白質活性之調控異 常相關之病理學病狀之藥物。

   θ长項43之用述’其中該病理學病狀係選自惡性及良 性腫瘤或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病、神經退化 f生病症、發炎及免疫病症及眼内新血管疾病。 45· -種如請求項α26中任一項之多肤與此^ pDz域相互 A1蛋白貝活性之调控異常相關之病理學病狀之藥 物。 46.如請求項45之用途’其中該病理學病狀係選自惡性及良 性腫瘤或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病、神經退化 性病症、發炎及免疫病症及眼内新血管疾病。 47· -種HtrAl PDZ域與一或多種HtrA1咖域配位體相互作 用之拮抗劑之用途，其係用於製造供治療與mrAi蛋白 貝/舌性之调控異常相關之病理學病狀之藥物。 48·如請求項47之用途，其中該病理學病狀係選自惡性及良 性腫瘤或癌症、㈣血病及淋巴樣惡性疾病、神經退化 性病症、發炎及免疫病症及眼内新血管疾病。 49· 一種分離之多肽，其與mrA3 pDZ域特異性結合，其中 128788.doc 200846358 該多肽包含一個在相對於C端之位置-1具有色胺酸之序 列。 50·如請求項49之分離之多肽，其中該多肽具有總體疏水性 特徵。 5 1 ·如請求項49之分離之多肽，其中該多肽進一步包含一個 選自纈胺酸、異白胺酸及丙胺酸之胺基酸在位置〇。 52 ·如請求項49之分離之多肽，其中該多肽進一步包含一個 選自甘胺酸及絲胺酸之胺基酸在位置-3。 鲁 53·如請求項49之分離之多肽，其中該位置〇之胺基酸係選 自纈胺酸、異白胺酸及丙胺酸；且其中該位置-3之胺基 酸係選自甘胺酸及絲胺酸。 5 4.如請求項49之分離之多肽，其中該位置〇之胺基酸為纈 胺酸且該位置-3之胺基酸係選自甘胺酸及絲胺酸。 55·如請求項49之分離之多肽，其中該多肽包含一個選自表 1及表3中所列出之HtrA3 PDZ域結合肽之序列的序列。 56·如請求項49之分離之多狀’其中該多狀包含序列 • PGRWV(SEQ ID NO: 7)、SGKGIWV(SEQ ID NO: 8)、 GFWV(SEQ ID NO: 9)、IFDGRWI(SEQ ID NO: 10)、 FGRWV(SEQ ID NO: 11)、RSWWV(SEQ ID NO: 12)、 FGRWI(SEQ ID NO: 13)、FGRWL(SEQ ID NO: 14)、 GRWV(SEQ ID NO: 15)、WV、FLRWV(SEQ ID NO: 16)、FERWV(SEQ ID NO: 17)、FYRWV(SEQIDNO: 18)、FGAWV(SEQ ID NO: 19)及 FARWV(SEQ ID NO: 20) 〇 128788.doc 200846358 5 7.如請求項49之分離之多肽，其中該多肽包含序列 FGRWV(SEQ ID NO: 11)。 58. 如請求項49之分離之多肽，其中該多肽直接與至少一個 特異HtrA3-PDZ域殘基相互作用。 59. 如請求項58之分離之多肽，其中該C端羧酸酯基與至少 一個選自 Phe356、Ile357及 Gly358之 HtrA3 PDZ域殘基配 位。 60·如請求項58之分離之多肽，其中該位置·1之色胺酸與至 • 少一個選自Glu390及Ala392之HtrA3 PDZ域殘基相互作 用。 61. 如請求項58之分離之多肽，其中位置-2之胺基酸與HtrA3 PDZ域殘基Gln423相互作用。 62. 如請求項58之分離之多肽，其中該位置-3之胺基酸與 HtrA3PDZ域殘基Arg360相互作用。 63. 如請求項58之分離之多肽，其中該多肽與至少一個選自 Phe356、Ile357、Gly358、Glu390、Ala392、Gln423 及 ^ Arg360之HtrA3 PDZ域殘基相互作用及/或配位。 64. —種分離之多肽，其與HtrA3 PDZ域特異性結合，其中 該多肽包含一個在一或多個疏水性殘基之後具有一個保 守酸性殘基之序列。 65. 如請求項64之分離之多肽，其中該多肽包含序列WVL。 66. 如請求項64之分離之多肽，其中該多肽包含序列 GVVVDEWMLSLL(SEQ ID NO: 21)、GVVVDEWVLSLL (SEQ ID NO: 22)、ELLVDGYVLELL(SEQ ID NO: 23)或 128788.doc 200846358 GVVVNEWVLSLL(SEQ ID NO: 24)。 67·如請求項64之分離之多肽，其中該多肽包含一個選自表 2中所列出之HtrA3 PDZ域結合序列之序列。 68. —種分離之多肽，其與HtrA3 PDZ域特異性結合，且包 含一個包括選自表1、2及3中所列出之胺基酸序列之肽 的胺基酸序列之C端、N端或内部胺基酸序列。 69·如請求項68之多肽，其中該C端胺基酸序列係選自 PGRWV(SEQ ID NO: 7)、SGKGIWV(SEQ ID NO: 8)、 GFWV(SEQ ID NO: 9) > IFDGRWI(SEQ ID NO: 10)、 FGRWV(SEQ ID NO: 11)、RSWWV(SEQ ID NO: 12)、 FGRWI(SEQ ID NO: 13) > FGRWL(SEQ ID NO: 14)、 GRWV(SEQ ID NO: 15)、WV、FLRWV(SEQ ID NO: 16)、FERWV(SEQ ID NO: 17)、FYRWV(SEQ ID NO: 18)、FGAWV(SEQ ID NO: 19)及 FARWV(SEQ ID NO: 20) 〇 70. —種分離之多肽，其包含一個與如請求項49至69中任一 項之多肽競爭結合於HtrA3 PDZ域之胺基酸序列。 7 1. —種分離之多肽，其與如請求項4 9至6 9中任一項之多肽 結合於HtrA3 PDZ域上之同一抗原決定基。 72· —種分離之多肽，其包含HtrA3 PDZ變異體序列，其中 至少一個選自 βΝ:β1-1、βΝ:β1-2 及 βΐ-ΐ、Glu390、 Ala392、Gln423 及 Arg360 之 HtrA3 PDZ域殘基經另一個 胺基酸取代。 73·如請求項72之分離之多肽，其中Glu390及/或Ala392經另 128788.doc -9 - 200846358 一個胺基酸取代。 74.如請求項72或73之分離之多肽，其中該另一個胺基酸為 丙胺酸。 75· —種分離之多肽，其包含一個與如請求項72至74中任一 項之多肽競爭結合於HtrA3 PDZ域之配位體之胺基酸序 列。 76. —種分離之多肽，其與如請求項72至74中任一項之多肽 結合於Htr A3 PDZ域之配位體上之同一抗原決定基。 ® 77. —種鑑別可調節HtrA3 PDZ域-配位體相互作用之化合物 之方法，其包含使一個包含11忖八3?02域、11忖八3?02域 之片段及/或其功能相等物及至少一種如請求項49至69中 任一項之多肽的樣品與一種候選化合物接觸，及測定在 該候選化合物存在之情況下HtrA3 PDZ域-配位體相互作 用之量，與該候選化合物不存在之情況下相比；由在該 候選化合物存在之情況下HtrA3 PDZ域-配位體相互作用 之量與在該候選化合物不存在之情況下之量相比的變化 ^ 表明該候選化合物為可調節HtrA3 PDZ域-配位體相互作 用之化合物。 78. —種合理設計HtrA3 PDZ域-配位體相互作用之調節劑之 方法，其包含設計該調節劑以包含或模擬一個色胺酸位 於相對於C端之位置-1或相對於肽中白胺酸之位置-2之功 能，其中該調節劑可與Htr A3 PDZ域特異性結合。 79. 如請求項78之方法，其中位置0係選自纈胺酸、異白胺 酸及丙胺酸；其中位置-1為色胺酸；且其中位置-3係選 128788.doc -10- 200846358 自甘胺酸及絲胺酸。 80·如請求項78之方法，其中位置0為纈胺酸；其中位置-1為 色胺酸；且其中位置-3係選自甘胺酸及絲胺酸。 8 1 ·如請求項78之方法，其中該調節劑包含胺基酸序列色胺 酸-綠胺酸-白胺酸。 82· —種HtrA3 PDZ域-配位體調節劑之用途，其係用於製造 供治療與HtrA3蛋白質活性之調控異常相關之病理學病 狀之藥物，其中該調節劑可調節HtrA3 PDZ域與如請求 鲁 項49-69中任一項之多肽之間的相互作用。 83. 如請求項82之用途，其中該病理學病狀係選自惡性及良 性腫瘤或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病及胎盤功能 障礙。 84. 如請求項82之用途，其中該調節劑抑制HtrA3 PDZ域與 該多肽之間的相互作用。 85·如請求項82之用途，其中該調節劑增強Hti*A3 PDZ域與 該多肽之間的相互作用。 ® 86. —種如請求項49至69中任一項之HtrA3 PDZ域配位體之 用途，其係用於製造供治療與HtrA3蛋白質活性之調控 異常相關之病理學病狀之藥物。 87.如請求項82之用途，其中該病理學病狀係選自惡性及良 性腫瘤或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病及胎盤功能 障礙。 8 8. —種如請求項49至69中任一項之多肽與Hti:A3 PDZ域相 互作用之促效劑的用途，其係用於製造供治療與HtrA3 128788.doc -11 - 200846358 蛋白質活性之調控異常相關之病理學病狀之藥物。 89·如請求項88之用途，其中該病理學病狀係選自惡性及良 性腫瘤或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病及胎盤功能 障礙。 90· —種HtrA3 PDZ域與一或多種HtrA3 PDZ域配位體相互作 用之拮抗劑的用途，其係用於製造供治療與Η“Α3蛋白 質活性之調控異常相關之病理學病狀之藥物。 91·如請求項88之用途，其中該病理學病狀係選自惡性及良 鲁 性腫瘤或癌症、非白血病及淋巴樣惡性疾病及胎盤功能 障礙。 92· —種分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1至33及49至76 中任一項之多肽，或其互補序列。 93. —種載體，其包含如請求項92之聚核苷酸。 94· 一種宿主細胞，其包含如請求項93之载體。 95 · —種產生多肽之方法，其包含如請求項94之宿主細胞在 • 該聚核苷酸得以表現之條件下培養。 96· —種轉殖基因之非人類哺乳動物，其表現如請求項％之 聚核苷酸。 97.如請求項96之轉殖基因之非人類哺乳動物，其中至少一 個原HtrAl或HtrA3基因已不活化。 98· —種抗體，其與如請求項1至26及49至69中任一項之多 肽特異性結合，或其片段。 99· 一種抗體，其與如請求項27至33及70至76中任一項之多 肽特異性結合，或其片段。 128788.doc -12- 200846358 100, —種套組，其包含至少一種如請求項1至33或49至76中 任一項之多肽及一種與如請求項92之聚核苷酸選擇性雜 交之化合物。

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