TW200825066A - Phthalazinone derivative - Google Patents

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200825066 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於特定酞嗪酮衍生物之晶體形式及合成其之 改良方法、該合成中之中間體及醫藥組合物及該晶體形式 之用途。 【先前技術】 哺乳動物酵素PARP(—種113-kDa之多區域蛋白質）涉及 藉助其識別並快速結合DNA單鏈或雙鏈斷裂之能力來遞送 DNA損傷之信號（D’Amours等人，Biochem. J·，342，249-268 (1999))。 許多觀察已得出以下結論：PARP參與各種與DNA相關 之作用（包括基因擴增、細胞分裂、分化、凋亡、DNA鹼 基切除修復）且亦影響端粒長度及染色體穩定性（cTAdda di Fagagna等人，Λ^ίι/re Gm·，23(1)，76-80 (1999))。 對PARP調節DNA修復及其他過程之機制的研究確定了 其在形成細胞核内聚（ADP-核糖）鏈中之重要性（Althaus， F.R·及 Richter，C.，ADP-Ribosylation of Proteins: Enzymology and Biological Significance，Springer-Verlag，Berlin (1987))。 與DNA結合並經活化之parp利用NAD於多種核把蛋白（包 括拓撲異構酶、組蛋白及PARP自身）上合成聚（ADP-核 糖）（Rhun專人，及以 Comm㈣.，245，1-10 (1998))。 聚（ADP-核糖基）化作用亦與惡性轉化相關。舉例而言， 在SV40轉化之成纖維細胞的分離細胞核中Parp活性較 125153.doc 200825066 高，而且白血病細胞及結腸癌細胞二者均顯示較同種正常 白細胞及結腸黏膜中為高之酵素活性（Miwa等人， A·，181，313-321 (1977) ; Burzio 等人， /Vm. 5W·心/7· Mec/·，149，933-938 (1975);及 Hirai 等人，Cawcer 43, 3441-3446 (1983))。 許多低分子量PARP抑制劑已用於闡釋聚（ADP-核糖基） 化作用在DNA修復中之功能性作用。在經烷基化試劑處理 之細胞中，PARP之抑制會導致Dna鏈斷裂及細胞殺傷顯 著增加（Durkacz 等人，❻％ 283，593-596 (1980)；

Berger，N.A.，iiaearc/z，101，4-14 (1985))。 隨後，該等抑制劑顯示可藉由抑制潛在致死損傷之修復 來增強輻射反應之作用（Ben_Hur等人，沿/2乃以⑽/ 〇/ C_ar，49 (Suppl. VI)，34-42 (1984) ; Schlicker等人，/价. 乂 山anzW·，75, 91-100 (1999))。據報道，parp抑制劑 在射線增敏性乏氧腫瘤細胞中有效（美國專利第5,〇32,617 號；美國專利第5,215,7：38號及美國專利第5,〇41，653號）。 此外，PARP基因剔除（PARP -/-)動物響應烷基化試劑及 γ-轄照展示基因組不穩定性（Wang等人，/)〜.，9, 509-520 (1995) ; Menissier de Murcia等人，/Voc. W"·

Acad. Sci. USA, 945 7303-7307 (1997)) 〇 PARP之作用亦展示於一些血管疾病、敗血性休克、缺 血性損傷及神經毒性中（Cantoni等人，价 —α，1014, 1-7 (1989) ; Szabo等人，乂 c/z>?如廳,，1〇〇, 723-735 (1997))。導致DNA鏈斷裂（其隨後藉由pARp識別） 125153.doc 200825066 之氧自由基DNA損傷係該等如在PARP抑制劑研究中所示 之疾病狀態的主要影響因素（Cosi等人，及以.， 39，38-46 (1994) ; Said等人，/Voc. Sc/· 儿， 93，4688-4692 (1996))。近來，已證明PARP在出血性休克 之發病機理中起作用（Liaudet等人，iVw/· dead 5W. 97(3), 10203-10208 (2000)) 〇 亦已證明哺乳動物細胞之有效逆轉錄病毒感染可藉由抑 制PARP活性來阻斷。已顯示，重組逆轉錄載體感染之此 抑制可發生於各種不同細胞類型中（Gaken等人，J. Fz>〇/ag>；， 70(6)，3992-4000 (1996))。因此，人們已經開發出PARP抑制 劑以用於抗病毒治療及癌症治療（WO 91/18591)。 另外，已推測PARP抑制可延遲人類成纖維細胞中老化 特徵之開始（Rattan and Clark, Biochem. Biophys, Res. Comm., 201(2)，665-672 (1994))。此可能與PARP在控制端 粒功能中所起之作用相關（d’Adda di Fagagna等人， G亂，23(1)，76-80 (1999)) 〇 WO 2004/080976揭示許多酞嗪酮衍生物、其抑制PARP 之活性、及其在治療癌症中之重要用途（無論其作為放射 治療或化學治療之輔助藥劑還是作為單獨藥劑）。 WO 2005/053 662闡述PARP抑制劑（尤其酞嗪酮衍生物）作 為鹼基切除修復（BER)抑制劑之用途。其闡述該等抑制劑 在製造藥物中之用途，該等藥物用於治療同源重組（HR)依 賴性DNA DSB修復活性缺陷之癌症、尤其用於治療具有 BRCA1及/或BRCA2缺陷表型之癌症。 125153.doc 200825066 WO 2004/080976中所揭示之4_[3-(4_環丙烷羰基_六氫吡 嗪-1-幾基）_4_氟·节基]-2H-酞嗪小酮（化合物A) ··

〇 尤其令人感興趣。

在WO 2004/080976中，化合物A係作為許多文庫化合物 中之-自4-[4-氟-3-(六氫 比唤小艘基）_节基]n秦小晒 (化合物B)藉由以下合成：

NH 將環丙烷羰醯氯 c,\z 添加於（B)溶於二氣甲、J^ 虱f烷之溶液中，隨後添加Hanig鹼 (N，N-二異丙基乙基胺）。 該反應在室溫下邊攪拌邊眚 干遠實加達16小時，且所得化合物 藉由製備型HPLC純化。 六氫吡嗪衍生物（B)係藉由 ^ 田以下製備：使用6M HC1及乙 醇脫保護4-[2-氟-5-(4-氧代> •，4_二氧_酞嗪-1-基甲基）_苯甲 125153.doc -10- 200825066 醯基]-六氫吡嗪_1-甲酸第三丁基酯（化合物C):

去保護達1小時，隨後用氨鹼化至pH為9，並將其萃取入二 氣甲烷中。

經Boc-保護之六氫吡嗪衍生物（C)係自2_銳_5-(心氧代· 3，4_二氫-酉大嗪-1-基甲基）_苯曱酸（化合物d)藉由以下製 備：

添加六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯：

六氣碟酸2-(m-苯并三嗤_丨-基四甲基脲尿鑌 (HBTU)及存於二甲基乙醯胺中之N，N-二異丙基乙基胺， 隨後攪拌18小時。 化合物A之特定形式可具有有利性質，例如，就其溶解 性及/或其穩定性及/或其生物利用度及/或其雜質分佈圖及/ 或其過濾特性及/或其乾燥特性及/或其缺乏吸水性、及/或 其可更容易地處理及/或微粒化及/或形成錠劑而言。亦期 125153.doc 11 200825066 望有種適於大規模合成化合物A之改良合成方法。 【發明内容】 因此’本發明之第一態樣提供實質上呈晶體形式、且尤 其呈形式A之4-[3-(4-環丙烷羰基-六氫吡嗪羰基）_4_氟_ 苄基]-2Η-酞嗪-丨_酮（化合物A)。 上文所用之Π實質上呈晶體形式，，意指至少50重量％、較 佳至少70重量％、8〇重量％或9〇重量％之化合物a呈晶體形 式。在一些實施例中，至少95重量％、99重量。/。或甚至 99.5重量％或更高重量百分數呈晶體形式。 呈晶體形式A之化合物A具有在以下位置處包含特定峰 之X射線繞射圖案（χ=1.5418Α): 峰 2Θ0 (土 0.1。） 12.0 __2 17.8 21.1 22.3 29.2 呈晶體形式Α之化合物Α亦可具有下列額外峰之X射線繞 射圖案（λ=1·5418Α): 峰 2Θ。(士 0.1。） ____6 10.5 — 14.0 21.7 24.3 26.1 125153.doc -12- 200825066 呈晶體形式A之化合物a之特徵亦在於三個或更多選自 上述1 0個峰列表中之峰的任何組合。 呈形式A之化合物A的代表性粉末XRD圖案展示於圖3 中。 不欲受限於理論，化合物A能容易地形成其中溶劑分子 可佔據晶袼中之位置的結構。該等溶劑合物（本質上不必 按化學計量）可由-種純溶劑合物（例如，化合物A的甲醇 合物、及化合物A的四氫呋喃合物）構成或可能由一種以上 溶劑組份（例如’甲醇及二乙基⑷構成。該等溶劑分子通 常位於由化合物A分子所產生之洞穴内。纟某些情況下， 該等洞穴之體積具有足夠撓性以納人—㈣溶劑，此使得 材料之整體結構幾乎無變化，且因此在XRpD反射中僅有 微小位移。 石物（包括彼等共享相同整體結構者）係 /L· TL λι « 、 ，溶液熟化及結晶實驗產生：二氣甲烷、乙酸乙醋、甲 醇、乙醇、異丙醇、2_ 丁酮、第三丁基甲基醚、甲苯、四 氫呋喃、水、環己烷、環丙基甲基酮、U _ 敦乙酸乙醋、氣苯六氣-異-丙醇、曱基九氣丁基二; 丙醇、確基甲烧、丙腈、三氯乙稀、α•三氟甲 ^坑、二氧雜環己烧、乙腈，該等可作為純溶劑或盘 展：=。且最:二之:劑合物結構的 且通吊包含下列位置處之最強峰·· 125153.doc -13 - 200825066

峰 2Θ°(±0.1°) (λ=1.5418Α)

應瞭解，圖中所示之峰的相對強度可根據測試下樣品之 定向及所使用儀器之類型及設定而變化，因此本文所包括 之XRD痕跡之強度係闡釋性的且並非意欲用於絕對比較。

V 化5物Α之形式Α實質上不含溶劑。本文所用術語"實質 上不3办劑意指僅具有可忽略量之任何溶劑的形式，例 如，具有總共0.5重量。/◦或更少之任何溶劑的形式。任何溶 劑（包括水）之總量可係0.25重量％、〇1重量％、〇 〇5重量％ 或0.025重量％或更低。 化合物A之形式A亦可使用DSC表徵。當以1(rc/分鐘之 速率自25°C加熱至325°C時，化合物A之形式八在以^丨它幻 C下開始熔化。呈形式A之化合物A的代表性DSC痕跡於圖 5中顯示。 本發明之第二態樣提供一種獲得呈晶體形式A之4-[3-(4-環丙烧幾基-六氫u比嗪-1-獄基）-4-氟-苄基]_2H-酜嗓-1-酮 (化合物A)之方法，其包括使化合物A在一種溶劑中結晶及 125153.doc 200825066 隨後用替代劑自晶體形式中替代該溶劑。該替代劑可係水 或<^·2醇與水之混合物。 在第一實施例中，該方法包括以下步驟： ⑴自-溶齊j中結晶析出心[3-(4-環丙烧幾基六氫。比嗓-1-羰基）-4-氟-苄基卜2H-酞嗪化合物A); ⑻右初始溶劑不為乙醇，則用乙醇處理該晶體化合物

(in)用水處理該晶體化合物Α以移除所捕獲之乙醇； (iv)乾燥所得產物。 用於最初結晶之溶劑可係（例如）二氯甲烷或乙腈。 獲得形式A之方法通常可涉及溶劑替換。已發現化合物 A以在晶格内形成能捕獲溶劑之通道的方式結晶， 該等溶劑難以移除。 化合物A結晶中所用溶劑為二氣甲烷，則尤其可使用 f 一實施例之方法。用乙醇作為溶劑來交換作為溶劑之二

亂甲坑的步驟可藉由在乙醇存在下於常壓下蒸館化合物A 的溶液來實施。當頭部溫度達到乙醇沸點(例如，至少 時π成此交換。具體而言，該交換可藉由蒸餾出大部分 職、然後添加大量乙醇來實施。然後繼續蒸館，同時用 等體積乙醇替換餾出物批料。 可藉由將溶液冷卻至低於饥、較佳低於阶、 至約來實施化合物a自乙酿、、交南丨々从曰 劑之結晶。然、後可藉由過 濾將化合物A之晶體自溶液移出。 可用水處理該晶體化合物切移除所捕獲乙醇，此係藉 125153.doc 15- 200825066 由將該晶體材料懸浮於水中並於回流下加熱足夠長之時間 (例如至少3小時，且較佳至少約4小時）來實施。可藉由過 遽將該晶體化合物A自存於水中之懸浮液中移出。 上述步驟所得產物之乾燥可容易地達成。舉例而言，藉 由在一烘箱中於至少6(rc、較佳約7〇。〇之溫度下加熱該產 物來達成。 在另一该實施例中，該方法包含下列步驟： (I) 獲得包含溶劑呈晶體形式之化合物A ; (II) 若在合成呈晶體形式之化合物A中所用初始溶劑不 為水與Cm醇（即甲醇、乙醇）之混合物，則用水與〔μ醇之 混合物處理呈晶體形式之化合物A ; (ii)乾燥所得產物。 可用水與C!·2醇之混合物進一步處理所得產物，並將其 乾燥以進一步分離呈晶體形式A之化合物a。 水與Cw醇之混合物較佳以體積計在2:1至丨：2之範圍 内，且更佳以體積計在之範圍内。尤其較佳之 混合物係丨份水·^份^·2醇。另一尤其較佳之混合物係2份 水：1份(：1-2醇。該Cl_2醇較佳為乙醇。 如上所述，可藉由使化合物A自溶劑中結晶來獲得呈晶 體形式之化合物A。 步驟（Π)之溶劑處理可藉由將化合物A懸浮於水與Ci2醇 之混合物中並邊攪拌邊加熱回流來實施。此後，可將其冷 卻至55。。與65。。之間並(例如)藉助矽藻土墊過濾。用水與 c丨-2醇之混合物洗務渡塾，然後於常壓（通常i atm)、或高 125153.doc -16 - 200825066 於常壓下蒸餾。停止蒸餾獲得懸浮液，將該懸浮液置於室 溫下，隨後過濾。用水洗滌所得濾餅。 上述步驟所得產物之乾燥可容易地達成。舉例而言，藉 由在烘箱中於至少50。(：、較佳約60°C之溫度下加熱該產物 來達成。 可以類似於上述之方式進行進一步處理。 在第三實施例中，該方法包括：

(1)將化合物A懸浮於作為溶劑之水與Cl_2醇之混合物 中； (H)將該懸浮液加熱回流，· (m)冷卻該溶液並用呈形式A之化合物a種晶種； (iv)乾燥所得產物。 可用水與Cw醇之混合物進一步處理所得產物，並將其 乾燥以進一步分離呈晶體形式A之化合物A。 水與C〗·2醇之混合物較佳以體積計在2:丨至丨：5之範圍 内’且更佳以體積計在1:2至1:4之範圍内。尤其較佳之混 «為1份水：3份C!_2醇。該匚丨.2醇較佳為乙醇。 步驟（出）可包括將溶液冷卻至65M75t之間（例如7〇 :C)並(例如)藉助石夕藻土墊過濾。用水…醇之混合物洗 滌濾墊’然後將其蒸餾(例如’在常壓、或更高壓力下)。 :所得渡液冷卻至贼與贼之間(例如4rc)後，可添加 在2與3小時之_如25小時）將所得懸浮液冷卻至 如，C)並於該溫度下維持足夠長時間以產生結 曰時間可係12小時至24小時之間，且可約16小時。此 125153.doc 200825066 階段結束後，可進-步添加水。該量可約等於所存在溶劑 (水及Cu醇）之總體積且應（例如）在4至6(例如5)小時内緩 慢添加。添加水後，將懸浮液維持在周溫下（例如）達2小 時。 • 然後可過濾該懸浮液，用Cw醇及水之混合物（比率介於 ， 1:3與1:2之間，例如1:2·3)洗滌所得濾餅。 上述步驟所得產物之乾燥可容易地達成。舉例而言，藉 ( 由在烘箱中於真空下在40。〇與6〇。(：間之溫度下加熱二產^ 來達成。 本發明之第二態樣提供一種自化合物B合成化合物A之 方法，其包括如下步驟： (Ο以控制方式將溶於適當有機溶劑（例如dCM(二氣甲 烷））中之二乙基胺及環丙烷羰醯氯之預混合溶液添 加至溶於相同有機溶劑之化合物B中，同時將溶液 溫度控制在低於20。(：。 ( 在一些實施例中，該方法進一步包括下列步驟： (Π)攪動（例如攪拌）來自⑴之所得溶液直至反應完成， 同時將溶液溫度維持在低於2(rc。 步驟⑴中之添加可以逐滴方式實施。 該方法較WO 2004/080976中所述之方法控制更嚴格，此 使得醯基氯之加成更具位置選擇性。先前技術控制較少之 方法可導致醯基氣加成至酞嗪酮態氮及/或氧、以及期望 之六氫吡啶態氮上。 較佳地，上述方法在氮蒙氣下實施。 125153.doc 200825066 更佳地，階段（ii)中溶液之溫度保持在10 °c與1 5 °C之 間。 上述反應之產物較佳藉由至少一步水洗滌步驟處理。更 佳地，該處理包括最初及最終之水洗滌步驟、及用稀酸 (例如5%檸檬酸溶液）、隨後用稀鹼（例如5%碳酸鈉溶液）之 中間洗滌步驟。 本發明之第四態樣提供一種自化合物D合成化合物A之 方法，其包括使化合物D與1-(環丙基羰基）六氫吡嗪、或 其無機酸鹽在醯胺偶合劑及驗（例如，胺（例如三級胺，諸 如二異丙基乙基胺））之存在下反應。 該無機酸鹽可係（例如）鹽酸鹽。 1-(環丙基羰基）六氫吡嗪 '或其無機酸鹽至化合物D之 添加可在任何適宜溶劑（例如，乙腈）中實施。該醯胺偶合 劑較佳為六氟磷酸2_(1H_苯并三唑]•基卜^^四甲基脲 鑌（HBTU)。其較佳在一段時間内（例如3〇分鐘）將丨_(環丙 基碳基）六氫吡嗪、或其無機酸鹽之溶液添加至二異丙基 乙基胺及化合物D中。T將所得溶液之溫度維持在饥或 更低（或20°C或更低’例如18。〇。在其添加完後，可將所 得溶液靜置-段時間。較佳之溫度狀態係將溶液在室溫下 維持2小時。 可藉由將溶液冷卻至低於1〇。(〕（或低於，例如3。〔〕）達 :段時間(例如i小時)、隨後過遽來將所得化合物A自溶液 中移出。可用（例如）冷乙腈洗滌所得化合物A。 W〇 2〇〇4/〇80976中揭示了下述至化合物D之路線： 125153.doc -19- 200825066

c

於〇c下將亞磷酸二甲酯逐滴添加至甲醇鈉於甲醇中之 溶液中。然後將2·羧基苯曱醛（H)逐份添加至作為溶於甲 醉中之漿液的反應混合物中’同時溫度保持低於代。在丄 小時内將所得淺黃色溶液升溫至抓。將甲糾酸逐滴添 加至該反應中並於真空下蒸發所得白色懸浮液。用水使白 色殘餘物驟冷並將其萃取至氣仿中。將合併的有機萃取物 用水洗務、經MgS〇4乾燥、並於真空下蒸發，獲得白色固 體狀(3-氧代-二氫-異苯并咬喃小基)膦冑二甲基醋 (G)(產率：95%)。然後其可不經進一步純化 段。 、丨I白 ，在25分鐘内向存於四氫呋喃中之（3_氧代-丨，3•二氫-異苯 并呋喃-1-基）膦酸二甲基酯（G)及存於四氫呋喃中之氟T 甲醯基f腈（F)之混合物中逐滴添加三乙基胺，同時膝: 。:保持低於抑…小時内將反應混合物緩慢升溫至二 並於真空下濃縮。將白色殘餘物在水中成漿液達％分 、’里^過據、用水、己烧及鱗洗務、並乾燥，獲得2·氣二 (3_乳代-3H-異苯并咬喃小亞基甲基）节赌⑻，其為^及^異 125153.doc -20 - 200825066 構體之5 0 ·· 5 0混合物（產率：9 6 % )。 向2_氟_5-(3-氧代-3H-異苯并呋喃小亞基甲基）节腈⑻存 於水中之懸淨液中添加氫氧化鈉水溶液並於氮氣下將反應 混合物於90°C下加熱達30分鐘。將反應混合物部分冷卻至 7(TC，添加水合肼並於贼下授拌18小時。將反應冷卻至 室溫並用2M HC1酸化至pH4。將混合物攪拌1〇分鐘並過

濾、。將所得固體用水、己烧、醚、乙酸乙醋洗務並乾燥， 獲得淺粉色粉末狀化合物D(產率：77%)。 亦期望有一種合成化合物D之改良方法。 因此，本發明之第五態樣提供一種合成化合物D之方 法，其包括如下步驟： ⑷自2-缓基笨甲路⑻合成（3m,3_二氯_2_苯并咬 喃-1-基）膦酸二乙酯（G，）； (b)自（3氧代-1，3·一氳-2-苯并吱喃小基）膦酸二乙酯合 成2备5-[(Ε/ΖΗ3_氧代_2·苯并吱喃](叫亞基）甲基代 腈（Ε) 〇 較佳地，化合物G,在合成中未分離。該方法避免使用在 醇溶液中不穩定之亞磷酸二甲酿之鈉鹽(Peich〇wicz等人， /. Chem. Soc, 4348-4350 (1961^ ^ y+ n 1 b1))。較佳地，步驟（a)係在亞 填酸二乙酯之鈉鹽於其中穩定 τ k疋之2-甲基四氫呋喃中實施。 該鹽可藉由將亞破酸二乙酯添， 曰♦加至第二戊醇鈉存於2-甲基 四氫呋喃中之冷溶液中原位报士 ^ ^ 开少成。與亞磷酸二乙酯之鈉鹽 反應後可與甲烷磺酸反應。 步驟（b)可在2-曱基四氫呋喃中 穴南中冋時添加三乙基胺來實 125153.doc 200825066 施。 合成化合物D之方法可進一步包括如下步驟： (C)自化合物E藉由與水合肼反應合成2-氟-5-[(私氧代 3,4_二氫酞嗪基）甲基]苄腈（ED):

及 (d)自化合物ED藉由與氫氧化鈉反應合成化合物〇。 可藉由使用1.1與丨·3當量之間存於四氫呋喃之水合肼、 隨後用乙酸中和過量水合肼來達成步驟（c)。 本發明之第六態樣提供化合物: / \

及其在化合物D合成中之用途。 本發明之進一步態樣提供一種丨_(環丙基羰基）六氫。比嗪 之無機酸鹽、及藉由六氫吡嗪與乙酸反應、隨後添加環丙 烷羰醯氯來合成其之方法。 & 本發明之第七態樣提供一種醫藥組合物，其包括第一能 樣之化合物及一醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。 125153.doc >22- 200825066 本發明之第八態樣提供第一態樣化合物用於治療人體或 動物體之方法。 本發明之第九態樣提供本發明第—㈣巾所定義之化合 物在製備用於抑制PARP活性之藥物中的用途。 本發明之進一步態樣提供本發明第一態樣中所定義之化 =物在製備藥物中的該藥物用於治療下列疾病··血 管疾病；敗血性休克；缺血性損傷；神經毒性；出血性休 克；病毒感染；或藉由抑制PARP活性改善之疾病。 本發明之另一其他態樣提供本發明第一態樣中所定義之 化合物在製備藥物中之用途，該藥物在癌症治療中用作辅 助某抝或用於加強利用電離輻射或化學治療劑之腫瘤細胞 治療。 本發明之其他態樣提供治療藉由抑制pARp來改善之疾 病的方法，其包括投與需要治療之受試者治療有效量之第 一悲樣所定義、較佳呈醫藥組合物形式的化合物；及治療 癌症之方法，其包括投與需要治療之受試者治療有效量之 第一態樣所定義、較佳呈醫藥組合物形式的化合物，同時 或隨後用電離輻射或化學治療劑治療。 在本發明之其他態樣中，該等化合物可用於製備治療同 源重組（HR)依賴性DNA DSB修復活性缺陷之癌症的藥物、 或用於治療同源重組（HR)依賴性DNA DSB修復活性缺陷之 癌症患者，其包括投與該患者治療有效量之該化合物。 该HR依賴性DNA DSB修復通路經由同源機制修復dna 中之雙鏈斷裂（DSB)以重新形成連續DNA螺旋（κ κ· 125153.doc -23 - 200825066

Khanna 及 S.P. Jackson，Nat. Genet. 27(3): 247-254 (2001))。HR依賴性DNA DSB修復通路之組份包括（但不限 於），ATM (NM—000051)、RAD51 (NM—002875)、RAD51L1 (NM—002877)、RAD51C (NM一002876)、RAD51L3 (NM—002878)、 DMC1 (NM—007068) 、 XRCC2 (NM_005431) 、 XRCC3 (NM—005432)、RAD52 (NM—002879)、RAD54L (NM—003579)、 RAD54B (NM 一 012415) 、BRCA1 (NM 一007295) 、BRCA2 (NM—000059)、RAD50 (NM—005732)、MRE11A (NM—005590)及 NBS1 (NM—002485)。其他參與該HR依賴性DNA DSB修復通 路之蛋白質包括諸如EMSY等調節因子（Hughes-Davies等 人，Ce//，115，第523-535頁）。HR組份亦闡述於Wood等人 之 291，1284-1289 (2001)中。 HR依賴性DNA DSB修復缺陷之癌症可包含或由一或多 個藉助該途徑修復DNA DSB之能力相對於正常細胞降低或 消失之癌細胞構成，即，HR依賴性DNA DSB修復通路之 活性在該一或多個癌細胞中降低或消失。 在患有HR依賴性DNA DSB修復缺陷之癌症個體的該一 或多個癌細胞中一或多個HR依賴性DNA DSB修復通路的 組份之活性可能消失。業内已充分識別HR依賴性DNA DSB修復通路之組份（參見例如Wood等人，291， 1284-1289 (200 1))且其包括上文所列之組份。 在一些較佳實施例中，該等癌細胞可具有BRCA1及/或 BRCA2缺陷表型，gp，在癌細胞中BRCA1及/或BRCA2活 性降低或消失。具有此表型之癌細胞可能存在BRCA1及/ 125153.doc -24· 200825066 或BRCA2缺陷，即，在癌細胞中BRCA1及/或BRCA2之表 現及/或活性可能降低或消失，例如藉助編碼核酸之突變 或多態現象、或藉助編碼調節因子之基因（例如編碼 BRCA2調節因子之EMSY基因）的擴增、突變或多態現象 (Hughes-Davies等人，CW/，115, 523-535)。 BRCA1及BRCA2為習知之腫瘤抑制基因，其野生型等位 基因通常在雜合體攜帶者之腫瘤中丟失（Jasin M.， 21(58)，8981_93 (2002) ; Tutt等人，Mo/ Md·，8(12)，571-6,（2002))。業内已充分識別 BRCA1 及 /或 BRCA2突變與乳癌相關（Radice，P.J·，五x/7 C7k 穴以.， 21(3 Suppl)，9-12 (2002))。亦習知，編碼 BRCA2結合因子 之EMSY基因的擴增與乳癌及卵巢癌相關。 BRCA1及/或BRCA2突變體攜帶者亦具有升高之印巢 癌、前列腺癌及胰腺癌風險。 在一些較佳實施例中，在BRCA1及/或BRCA2或其調節 基因中該個體為一或多種變異（例如突變及多態現象）之雜 合體。BRCA1及BRCA2變異檢測已為業内所熟知且描述 於，例如歐洲專利第699 754號、歐洲專利第705 903號、 Neuhausen，S.L·及 Ostrander，E.A·，7^，，1，75-83 (1992) ; Chappnis，Ρ·0·及 Foulkes，W.D·，Career 107，29_59 (2002) ; Janatova M.等人，50(4)， 246-50 (2003) ； Jancarkova, N.5 Ceska GynekoL, 68(1), 11-6 (2003)中。BRCA2結合因子EMSY擴增之確定描述於 Hughes-Davies 等人之 Ce//，115，523-535 中。 125153.doc -25- 200825066 與癌症相關之突變及多態現象可在核酸階段藉由檢測變 異核酸序列之存在或在蛋白階段藉由檢測變異（即，突變 或等位基因變異）多肽之存在來檢測。 【實施方式】 本發明提供呈形式A之化合物A作為活性化合物、尤其 抑制PARP活性之活性物質。

本文所用術語”活性物質，，係指能抑制pARp活性之化合 物。一種可方便地用以評價該化合物所提供之pARp抑制 之分析闌述於以下實例中。 本發明進一步提供一種在細胞中抑制pARp活性之方 法，該方法包括使該細胞接觸有效量之活性化合物，該活 性化合物較佳呈醫藥上可接受之組合物形式。此方法可在 活體外或活體内實施。 舉例而言，細胞樣品可於活體外生長並使該活性化合物 與該等細胞接觸，並觀察該化合物對該等細胞之作用。作 =作曰用之實例，可檢測到在一定時間内受影響之膽a修 復之量。若發現該活性化合物對該等細胞產生影響，則該 化口物可在治療攜帶相同細胞類型之細胞的患者之方法中 用作功效的預後或診斷標記物。 2文在治療-病狀之上下文中所用術語，，治療，，通常係指 無論人類還是動物（例如，在 在被w應用中）其中達成某些期 望〉口療效果（例如，永卩去丨 抑制该病狀之發展，且包括使發展速 又-使發展速度停止、改善該病狀及治癒該病狀)之 125153.doc • 26 - 200825066 治療及療法。亦包括作氣 栝作為預防措轭之治療（即，預防）。 本文所用術語，，輔助”係指該活性化合物連㈣知^ 法一起使用。該等方法包括用於治療不同癌症類型之藥物 的細胞毒性方式及/或電離輕射。具體而言，已知該等活 性化合物可加強多種癌症化學治療作用，料化學治療包 括毒劑之拓撲異構酶類型⑽如，㈣㈣㈣心㈣、伊 立替康（mnotecan)、魯比替康（rubitecan))、大多數習用烷 基化刮（例如，DTIC、替莫嗤胺（tem〇z〇lamide))及用於治 療癌症之基於鉑之藥物（例如卡鉑、順鉑）。 該活性化合物亦可用作抑制pARp之細胞培養添加劑以 (例如)使、、、田胞對習知化學治療劑或活體外之電離輻射處理 敏感。 口亥活f生化口物亦可作為活體外分析之一部分以(例如)確 疋一候選俏主是否可能受益於用所述化合物之治療。 投與 ^ 該活性化合物或包含該活性化合物之醫藥組合物可藉由 任一方便投與途徑投與受試者，無論以全身方式/外周方 式還是在期望作用點投與皆可，該作用點包括（但不限於） 口（例如藉由攝取）；局部（包括例如經皮、鼻内、經眼、經 口腔及經舌下）；肺部（例如藉由使用例如氣溶膠（例如）通 過嘴或鼻吸入或吹入療法）；直腸；陰道；非經腸，例如 藉由注射’包括皮下、皮内、肌内、靜脈内、動脈内、心 臟内、鞘内、脊柱内、莢膜内、囊下、眼窩内、腹膜腔 内、氣管内、表皮下、關節内、蛛網膜下及胸骨内注射； 125153.doc -27- 200825066 藉由（例如）經皮下或肌内植入儲積物。 二=係真核生物、動物:脊椎動物、喷乳動物、 _類動物(例如’天竺鼠、倉鼠、大 物（例如，小鼠）、大科叙舲α丨l w 鼠科動 ……/ 狗)、描科動物(例如， ':)、馬科動物(例如，馬)、靈長類、猿類(例如，猴子或 % )、猴科動物（例如織狼 " 猩、黑獲獲、獲獲、長臂猿）或人類。 大獲 調配物 人;=單獨投與該活性化合物，但其較佳作為-醫藥組 &物(例如，義物)存在，該醫藥組合物包含上文所定義 之活性化合物及—或多種醫藥上可接受之載劑、輔助劑、 賦形劑、稀釋劑、填充劑、緩衝劑、穩定劑、防腐劑、潤 滑劑或其他熟習該項技術者習 或預防劑。 支…知的材料及視情況其他治療 因此二本發明進—步提供上文所定義之醫藥組合物及製 備-醫樂組合物之方法’該方法包括將上文所定義之活性 化口物與一或多種醫藥上可接受之載劑、賦形劑、緩衝 劑、辅助劑、敎劑或其他本文所述之材料混合在一起， 以使活性化合物仍呈晶體形式A。 、，本：所用術語”醫藥上可接受的，，係指彼等在合理的藥學 判斷範圍内適於與_叉試者（例如，人類）之組織接觸使用 …、k门# |± % ;敫十生、過敏性反應或其他問題或併發症 並與合理的效益/風險比率相應之化合物、材料、組合物 及/或^型。各載劑、賦形劑等就與該調配物之其他成份 125153.doc -28- 200825066 相容之意義上而言亦必須係”可接受的”。 適宜載劑、稀釋劑、賦形劑等可在標準醫藥教科書中找 到參見例如 Handbook of Pharmaceutical Additives，，，第 一版（eds. Μ· Ash 及 I· Ash)，2001 (Synapse Information

Resources公司，Endicott，New York，USA)、，，Remington，s Pharmaceutical Sciences”，第 20 版，pub. Lippincott， Williams & Wilkins，2000 ;及’’Handbook of Pharmaceutical

Excipients"，第二版，1994。 该等调配物可採用方便的單位劑型且可藉由製藥技術中 習知之任何方法製備。該等方法包括使該活性化合物與包 含一或多種辅助成份之載劑結合之步驟。一般而言，該等 調配物可藉由使該活性化合物與液體載劑或微細固體載劑 或兩者均勻且充分結合且然後（若必要）使該產物成形來製 備。 調配物可呈懸浮液、錠劑、顆粒、粉末、膠囊、藥丸、 丸劑或膏糊形式。 適於口服投與（例如，藉由攝取）之調配物可作為下列形 式存在：離散單元，例如膠囊、藥丸或錠劑，各皆包含預 定量的活性化合物；粉末或顆粒；存於水性液體或非水性 液體中之懸浮液；或膏糊。 可視情況使用一或多種輔助成份藉由習知方法（例如， 壓縮或模製）製備錠劑。可藉由在一適宜機器中壓縮該呈 自由流動形式（例如粉末或顆粒）之活性化合物來製備壓縮 鍵劑’該活性化合物視情況與一或多種下列成份混合：黏 125153.doc -29- 200825066 合劑(例如，聚乙烯吡咯啶_、明 $ 醇、磺蓍膠、羥丙基甲基纖’ σ <白膠、山梨 如，乳糖、微晶纖維素、鱗酸氣填充劑或稀㈣ 鈉、經交聯聚乙烯吡咯啶酮、έ“：例如，翹乙酸澱粉 表面活性劑或分散劑〜聯竣甲基纖維素納）； 防腐_丨1 劑（例如，月桂基硫酸鈉）；及 對-經基苯甲酸甲酿、對，基苯甲酸丙醋、 、門、…、★肖由在一適宜機器中模製經惰性液體稀釋劑 狀化合物之混合物來製傷模製錠劑。該等錠劑 可視十月況經塗敷或刻痕且可經調配以便使用（例如）各種比 例之㈣基甲基纖維素提供其中之活性化合物的緩慢或控 制釋放以提供期望的釋放性質。錠劑可視情況具有—腸溶 衣以在部分内臟而非胃中提供釋放。 膠囊可包括呈懸浮液之活性化合物。 適於局部投與（例如，經皮、鼻内、經眼、頰内及舌下） 之調配物可調配成膏糊。 適用於局部投與眼睛之調配物亦包括滴眼劑，其中該活 性化合物懸浮於適宜載劑中，尤指用於該活性化合物之水 性溶劑。 適用於經鼻投與之調配物（其中該載劑為一固體）包括具 有（例如）約20至約500微米粒徑之粗粉末，其以其中藉由 (即）藉助鼻腔自一保持靠近鼻子處之粉末容器快速吸入來 攝取之方式投與。 適於藉由吸入投與之調配物包括彼等呈加壓包裝之氣溶 125153.doc -30- 200825066 膠喷霧者，其同時使用諸如二氯二氟甲烧、三氯氟甲烧、 氣乙烧、二氧化碳或其他適宜氣體等適宜推進 劑量 應瞭解，該活性化合物及包含該活性化合物之 適宜劑量可因患者而異。最_量之確定衫涉及治療效 盈私度與本發明治療之任何風險或有害副作用之平衡。， 經選擇之劑量程度應端視各種因素而定，該等因素包： (但不限於)特定化合物之活性、投與途徑、投與時間、該 化合物之排泄速率、治療持續時間、該組合中所用其他藥: 物、化合物及/或材料、及患者的年齡、性別、重量、狀 況、全身健康狀況及先前醫療史。化合物之量及投與途徑 最終應由s師判冑’但通常該劑量在作用點應達到達成期 望效果而不會造成實質性傷害或有害副作用之局部濃度: 活體内投與可在整個治療過程中以單劑量連續或間歇 (例如，依適宜間隔時間投與分割之劑量）實施。確定最有 效投與方法及劑量之方法已為熟習此項技術者所習知且應 隨用於治療之調配物、治療之目的、所治療之靶細胞及所 治療之受試者而變化。可根據主治醫師所選擇之劑量程度 及模式實施單次或多次投與。 般而吕’該活性化合物之適宜劑量介於約i 0毫克至約 6〇0毫克/平方米身體面積受試者體重/天之間。 實例 實例1 :化合物A之合成 125153.doc -31 - 200825066

起始材料（D)藉由w〇 2004/080976所揭示之方法合成。 方法

製備型HPLC 用一 Waters質量指導之純化系統純化樣品，該系統使用 Waters 600 LC 幫浦、Waters Xterra C18 管柱（5微米，19 毫 米x50^米）及Micromass ZQ質譜儀，以陽離子電喷射離子 化模式操作。流動相Α(0·1%存於水中之甲酸）及Β(0·1%存 於乙腈中之甲酸）以梯度使用；在7分鐘内自5% Β至 100%，保持3分鐘，流速為20毫升/分鐘。

分析型HPLC-MS 分析型HPLC係使用Spectra System Ρ4000幫浦及Jones Genesis C18管柱（4微米，50毫米Χ4·6毫米）來實施。流動相 Α(〇·1 %存於水中之曱酸）及Β (乙腈）使用5% Β保持1分鐘、 5分鐘後升至98% Β之梯度，以2毫升/分鐘之流速保持3分 鐘。藉由TSP UV 6000LP檢測器於254奈米UV及量程210-600奈米PDA檢測。質譜儀係以陽離子電噴射模式操作之 125153.doc -32- 200825066

Finnigan LCQ。

NMR iH NMR光譜係在300 MHz下使用Bruke:r Dpx 300光譜儀 進行記錄。化學位移係根據相對於四甲基矽烷内標之§標 度以百萬分率（ppm)報告。除非另有說明否則所有樣品皆 溶於 DMSO-d6。 (a) 4-[2-氟-5-(4-氧代_3,4_二氫-酞嗪_：ι_基甲基）_苯甲醯 基]-六氫吼嗓-1 -甲酸第三-丁基酯（C) 於室溫下在氮氣下向起始材料D(85〇克）存於二甲基乙醯 胺（DMA)(3 561毫升）中之攪拌溶液中一次性添加HBTU(六 氟磷酸2_(1H-苯并三唑_1_基Η」），％四甲基脲鑌）（14〇2 克）。然後添加Hiinig’s鹼（iPr2Net，1〇96毫升），同時將溫 度保持在15 C至25 C之間，隨後添加卜b〇c-六氫α比嗓（63 7 克）存於DMA(1428毫升）中之溶液，同時將溫度保持在15 °C至25°(：之間。 於室溫下將溶液攪拌2小時並取樣用於確定是否完成 (HPLC)。完成後，將溶液添加至劇烈擾拌的水（ι7〇85毫 升）中，同時將溫度保持在15°C至25°C之間並濾、出固體、 用水（2x7131毫升）、己烷（2x7131毫升）及甲基第三-丁基醚 (ΜΤΒΕ)(2χ3561毫升）洗滌。然後將固體乾燥過夜，隨後取 樣用於水含量及化學純度分析。 然後重複該反應，參見下表： 125153.doc -33- 200825066 批次 產量(克） 純度(HPLC面積％) 水含量(K.F·) 續正產量 1 1571.3 86.80 24.3 1032.5 克(78%) 2 2781.6 85.00 40.3 1411.5 克(106%) a.大於100%產率係由於非代表性取樣 (b) 4-[4-氟- 3-(六氫吼嗪-1-羰基）-节基]-2H-酜嗪-1-酮（B) 在室溫於氮氣下向工業甲基化乙醇（IMS)(2200毫升）及濃 HC1(4400宅升）之擾摔溶液中分次添加化合物c(2780.2 克），藉由添加速率來控制起泡。然後在1 5 °C至25 °C下將 溶液攪拌30分鐘並取樣用於確定是否完成（Hplc)。 完成後蒸發該溶液以移除任何IMS並用CH2C12(2x3500毫 升）萃取含水物質，然後使用濃氨水將pH值調至>8。然後 用水（10000毫升）稀釋所得漿液並用CH2C12(4x3500毫升）萃 取、用水（2x2000毫升）洗滌、經MgSO4(250克）乾燥並蒸 發。然後將粗產物在CH2C12(3500毫升）中變成漿液並添加 至MTBE(5000毫升）中。過濾所得懸浮液並於5〇〇c乾燥過 夜，獲得611.0克（58.5%產率）純度為94.12%之材料。 (c) 4-[3-(4-環丙烷羰基-六氫σ比嗪-丨-羰基）_4_氟-苄基]_2H_ 酞嗓-1-酮（A) 在氮氣下向化合物B( 1290克）存於CH2Ch( 15480毫升）中 之擾拌懸浮液中逐滴添加三乙基胺（47〇毫升）及環丙烷羰醯 氯（306毫升）存於CH2C12(129〇毫升）中之預混合溶液，同時 將溫度保持低於2〇°C。然後在i〇_15°c下將該溶液攪拌15 分鐘並取樣用於確定是否完成。發現反應混合物僅含 125153.doc -34- 200825066 1.18%起始材料b並因此認為反應已完成且隨後實施分批處 理。 用水（7595毫升）、5%檸檬酸溶液（7595毫升）、5%碳酸鈉 溶液（7595毫升）及水（7595毫升）洗滌該反應混合物。然後 經硫酸鎂（5 00克）乾燥該有機層。 然後分離包含CHAl2之產物層，藉助Ceiite過濾並裝填 於25公升容器中。然後於常壓下蒸餾出CH2C12(8445毫升） f 並添加乙醇（10000毫升）。然後繼續蒸餾，同時所有4000毫 升被移除之错出物用乙醇（4000毫升）代替，直至頭部溫度 達73.7°c為止。然後反應體積減少（至773〇毫升），此時頭 部溫度達78.9°C並使該溶液冷卻至8°C過夜。然後過濾出 固體’用乙醇（1290毫升）洗滌並於7〇。〇乾燥過夜。 產率=1377.3 克（90%)。HPLC 純度（99.34%[面積％])。藉 由 GC 包含 4.93% 乙醇及 0.45% CH2C12。 (d)化合物A之水處理 {: 將如藉由實例1之方法所製造化合物A( 13 77.0克）存於水 中的懸浮液加熱回流達4小時，冷卻至室溫並過濾。用水 (2754毫升）洗滌固體並於7〇°C乾燥過夜。 產率=1274·8 克（92.6%)。HPLC 純度（99.49%[面積％])。 藉由GC包含0.01%乙醇及0.01% CH2C12 。 水處理後化合物A之1H NMR光譜（DMSO-d6)顯示於圖1 中。 水處理後化合物A之粉末XRD圖案顯示於圖2中，該圖顯 示該化合物呈形式A。 125153.doc -35- 200825066 實例2 :化合物A使用1-(環丙基羰基）六氩ϋ比嗪之代替合成

〇 方法（亦用於實例3及4)

NMR H-NMR光譜係在400 MHz下使用Bruker DPX 400光譜儀 進行記錄。化學位移係根據相對於四甲基矽烷内標之§標 度以百萬分率（ppm)報告。除非另有說明，否則所有樣品 皆溶解於DMSO_d6中。 質譜 質譜係於Agilent XCT離子陷阱質譜儀上使用用於結構 確定之串列質譜法（MS/MS)記錄。該儀器以陽離子電噴射 模式操作。 (a) 4-[3-(4-環丙烷羰基-六氫啦嗪_丨_羰基卜4_氟_苄基]_2h_ 酜嗪-1 -酮（化合物A) 在氮氣下授拌的同時將2 -氟-5-[(4-氧代-3，4-二氫駄嗅-基）甲基]苯甲酸（D)(15.23克，51.07毫莫耳）懸浮於乙腈（96 笔升）中。添加二異丙基乙基胺（19·6毫升，U23毫莫耳）， 隨後添加丨-環丙基羰基六氫吡嗪（1)(9.45克，61.28毫莫耳） 及乙腈（1毫升）。將反應混合物冷卻至18c。然後在3〇分鐘 内添加六說磷酸〇-苯并三唑-^基-四曱基脲鏽（2518克， 66.39毫莫耳）並於室溫下將該反應混合物攪拌2小時。將該 125153.doc -36 - 200825066 反應混合物冷卻至3 °c並維持在此溫度達1小時，然後過 渡。用冷（3 C )乙腈（20毫升）洗務渡餅，然後於真空下高達 40 C之溫度下將其乾燥’獲得淺黃色固體狀標題化合物 (20.21 克）。 質譜：MH+ 435 c 1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ : 0.70 (m，4H)、1.88 (br s，1H)、3.20 (br s，2H)、3.56 (m，6H)、4.31 (s, 2H)、 7.17 (t，1H)、7.34 (dd，1H)、7.41 (m，1H)、7.77 (dt， 1H)、7·83 (dt，1H)、7.92 (d，1H)、8.25 (dd，1H)、12.53 (s，1H) 〇 實例3 :化合物A使用1-(環丙基羰基）六氩吡嗪HC1鹽之代 替合成

ί (a) 1-(環丙基羰基）六氫吼嗪HCI鹽（I1) 在15分鐘内於氮氣下邊攪拌邊用六氫。比嗪（50.00克， 〇·581莫耳）逐份處理乙酸（700毫升）。將該反應混合物加熱 至40°C並維持在此溫度直至獲得一完全溶液。在1 5分鐘内 添加環丙烷羰醯氯（59.2毫升，0.638莫耳）。將該反應混合 物在室溫下攪拌過夜。過濾該反應混合物並於降低之壓力 下蒸餾濾液直至收集到約430毫升餾出物。將曱苯（550毫 125153.doc -37- 200825066 升）裝填至該反應混合物 卿甲並繼績降壓蒸餾直至進一步收 集到400毫升餾出物。進一 ^ 步裝填甲苯（550毫升）並繼續降 壓蒸餾直至收集到350毫升 一 笔开餾出物。用甲苯（2〇〇毫升）稀釋 所得聚液並將其㈣過夜。進-步添加甲苯（毫升）以使 漿液流動。過滤該漿液、用甲苯⑽毫升)洗滌並在真空下 於40 C乾燥’獲得灰白色固體狀標題化合物（86· 78克）。 質譜：MH+ 155 1H NMR (400 MHz，D2〇) δ : 〇·92 (m，4H)、1·98 (m， 1Η)、3.29 (m，2Η)、3·38 (m，2Η)、3.84 (m，2Η)、4.08 (m， 2H)。 ’

(b) 化合物A 在氮氣下攪拌的同時將2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氫酞嗪 基）甲基]苯甲酸（D)(0.95克，3.19毫莫耳）懸浮於乙腈（4毫 升）中。添加六氟磷酸2-(1Η-苯并三唑-1-基四甲 基脲鑌（HBTU)(1.45克，3.83毫莫耳），然後添加ι_環丙基 羰基六氫吡嗪HC1鹽（Ι’）(0·73克，3.83毫莫耳）。在3分鐘内 添加二異丙基乙基胺（1.39毫升，7.98毫莫耳）並在室溫下 將該反應混合物攪拌過夜。將該反應混合物冷卻至5 °C並 維持在此溫度達1小時，然後過濾。用冷（3 °C)乙腈（2毫升） 洗滌濾餅，然後在真空下於高達4〇°C之溫度下將其乾燥以 獲得淺黃色固體狀標題化合物（0·93克）。 (c) 化合物A自含水曱醇之再結晶 將源自步驟（b)之化合物Α(9.40克’ 21.64毫莫耳）懸浮於 水（100毫升）及甲醇（120毫升）之混合物中。邊攪拌邊將該 125153.doc 200825066 懸浮液加熱至回流。然後將所產生之混濁溶液冷卻至6crc 並藉助harborlite墊過濾。用水（5毫升）與甲醇（5毫升）之混 合物洗滌濾墊。於常壓下蒸餾該濾液直至收集到u 5毫升 德出物。然後停止蒸德並使所產生之懸浮液冷卻至室溫。 將δ亥所得懸浮液授拌約1 §小時，然後過濾。用水（2〇毫升） 洗務濾餅，然後在真空下於高達6(TC之溫度下將其乾燥以 獲付白色固體狀呈形式A的標題化合物（8.67克）。 質譜·· MH+ 435 1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ : 0.70 (m，4H)、1.88 (br s，1H)、3.20 (br s，2H)、3.56 (m，6H)、4.31 (s，2H)、 7·17 (t，1H)、7.34 (dd，1H)、7.41 (m，1H)、7·77 (dt， 1H)、7.83 (dt，1H)、7.92 (d，1H)、8.25 (dd，1H)、12.53 (s, 1H) 〇 (d)化合物A自含水乙醇之再結晶 將源自步驟（b)之化合物Α(9·40克，21.64毫莫耳）懸浮於 水（100毫升）與乙醇（50毫升）之混合物中。邊攪拌邊將懸浮 液加熱至回流。然後將所產生之混濁溶液冷卻至6(rc並藉 助harborlite墊過濾。用水（5毫升）與乙醇（5毫升）之混合物 洗滌濾墊。在常壓下蒸餾濾液直至收集到53毫升館出物。 然後停止蒸鶴並使所產生之懸浮液冷卻至室溫。將所得轉 浮液授拌約1 8小時，然後過濾。用水（2〇毫升）洗條濾餅， 然後在真空中於6 0 °C下將其乾燥以獲得白色固體狀呈开4气 A之標題化合物（8·74克）。 質譜：MH+ 435 125153.doc -39- 200825066 1H NMR (400 MHZ, DMS〇-d6) δ ： 0.70 (m, 4H) . 1.88 (br s，1H)、3.20 (br s，2H)、3.56 (m，6H)、4 31 (s，2H)、 7.17 (t, 1H) > 7.34 (dd, 1H) . 7.41 (m, 1H) ^ 7.77 (dt, 1H)、7.83 (dt，1H)、7.92 (d，1H)、8.25 (dd，1H)、12.53 (s, 1H) 〇 實例4 ··化合物D之代替合成

(a) 2-氟-5-[(E/Z)-(3-氧代-2-苯并呋喃-1(3Η)_亞基）甲基]节 腈(Ε) 在氮氣氣氛下將第三戊醇鈉（99〇〇克，〇·854莫耳）及2_曱 基四氫呋喃（960毫升）冷卻至2〇c。逐滴添加亞磷酸二乙酯 (110*升，0.855莫耳）並維持溫度<5。〇。添加2_甲基四氫 呋喃（40耄升）進行線上洗滌。於2〇c下將反應攪拌i小時 分鐘。添加2-羧基苯甲醛（H)(8〇克，〇·533莫耳）存於2_甲基 四氫呋喃（200毫升）中之溶液並在整個添加過程維持溫度 <7 C。添加2-甲基四氣呋喃（4〇毫升）進行線上洗滌。將該 反應混合物升溫至20 °C並於20 °C下維持20分鐘。在1小時 10分鐘内添加甲烷磺酸（66毫升，101莫耳），然後添加2_ 甲基四氫呋喃（40毫升）。在2(rc下將該反應混合物攪拌過 夜。添加甲烧磺酸（7毫升，〇 ·丨〇丨莫耳），隨後添加2_甲基 四氫呋喃（7毫升）並於2〇°C下將反應混合物再攪拌4小時。 125153.doc -40- 200825066 於室溫下添加水（400毫升）並於室溫下將所得兩相混合物攪 拌20刀鐘。移除下部水層並將碳酸氫鉀克，0.534莫 耳）存於水（400毫升）中之溶液添加至有機層中。於室溫下 將該雙相混合物攪拌20分鐘且隨後移除下部水溶液。保留 有機部分（(3-氧代丨^氫·2_苯并呋喃+基）膊酸二乙醋溶 液）。將2-氟-5-甲醯基苄腈（64克，〇·429莫耳）添加至有機 邛刀中並於20 C下攪拌該混合物。逐滴添加三乙基胺（66 笑升，0.473莫耳），隨後添加2-甲基四氫呋喃毫升）。然 後於20°C下將該反應混合物攪拌過夜，然後冷卻至5它， 過濾，用工業甲基化乙醇（48〇毫升）洗滌並隨後在真空中於 高達40°C之溫度下乾燥，獲得標題化合物（91·2克）。 質譜：ΜΗ+ 266 1Η NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ : 6.89(s，1Η，主要異 構體）、6.94(s，1H，次要異構體）、7.4〇(dd，m，次要異 構體）、7.58(t，1H，兩種異構體）、7.7〇(t，m，兩種異構 體）、7.89(t，1H，兩種異構體）、7·95((1，m，兩種異構 體）、8.05(d’ 1H，兩種異構體）、8.i5(m，2H，兩種異構 體）。 (1〇2-氟-5-[(4-氧代-3,4-一風駄嘻-1_基）甲基]节猜（^£^) 在氮氣氣氛下，於室溫下將2-氟-5-[(Ε/Ζ)-(3·氧代-2·苯 并呋喃_1(3Η)_亞基）甲基]苄腈（Ε)(2〇克，75.40毫莫耳）及四 氫呋喃（200毫升）攪拌30分鐘。添加單水合肼（4·4〇毫升， 90.53毫莫耳），隨後添加四氫呋喃（4毫升）用以線洗。於室 温下將該反應混合物攪拌1小時45分鐘。添加乙酸〇1〇毫 125153.doc •41 · 200825066 升I9·20耄莫耳）並將反應混合物升溫至6〇°C。將反應混 合物保持在6〇它過夜。將反應混合物冷卻至50°C並逐滴添 加水（2〇〇耄升）。在整個添加過程中將溫度維持在45°C。將 反應混合物冷卻至2〇r，過濾，用水（3〇毫升）及四氫呋喃 (30宅升）之混合物洗務，並隨後在真空中於高達。〇下將 其乾燥以獲得標題化合物（18 · 7克）。 質譜：MH+ 280 1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ : 4·38 (s，2H)、7.46 (t，1Η)、7.72 (m，1Η)、7·85 (dt，1Η)、7·92 (m，2Η)、7 99 (d，1H)、8.27 (dd，1H)、12.57 (s，1H)。 (〇)2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氫欧嗓-1-基）甲基]苯甲酸（〇) 於20 C下擾拌2-氟- 5-[(4-氧代-3,4-二氫酞嗪_ι·基）甲基] 苄腈（ED)(9.60克，34.37毫莫耳）及水（40毫升）。添加2 乂氫 氧化納（36¾升，72.00¾莫耳）’將反應混合物升溫至9〇 並維持此溫度過夜。將反應混合物冷卻至室溫並過漁。用 水（10毫升）洗滌濾墊並於60°C下在40分鐘内將經合併之滤 液添加至2M HC1(56毫升，112.00毫莫耳）中。將所得懸浮 液冷卻至50°C並過濾，用水（57毫升）洗滌並在真空中於高 達60 °C下將其乾燥以獲得白色固體狀標題化合物（9.72 克）。 質譜：MH+ 299 1H NMR (400 MHz，DMSO-d6) δ : 4.36 (s，2H)、7 24 (dd，1Η)、7·59 (m，1Η)、7·84 (dt，2Η)、7.90 (dt，1Η)、 7.98 (d，1H)、8·27 (dd，1H)、12.59 (s，1H)、13.22 (br s 125153.doc -42- 200825066 1H) 〇 實例5 :化合物A自含水乙醇之再結晶 將4-(3-{[4-(環丙基羰基）六氫吼嗪_丨_基]羰基}_4•氟苄基） 酞嗪-1(2H)-酮（化合物Α)(20·00克，44.66毫莫耳）懸浮於水 (50毫升）與乙酵（150毫升）之混合物中。邊攪拌邊將該懸浮 液加熱至回流。然後將所產生之溶液冷卻至7〇。〇並過濾。 用水（8毫升）與乙醇（22毫升）之混合物洗滌濾墊。 邊攪拌邊將濾液冷卻至45°C。添加呈形式a之4-(3-{[4_ (環丙基羰基）六氫啦嗪-1·基]羰基卜4_氟苄基）酞嗪“（2H)_ 酮（化合物Α)(0·08克）以為混合物種晶種。在2·5小時内將所 得懸浮液冷卻至20°C並於此溫度下再攪拌16小時以產生結 晶。在5小時内添加水（2〇〇毫升）並將溫度維持在⑼^。在 添加結束後將懸浮液維持在2〇它達2小時。 過濾該懸浮液並用乙醇（24毫升）與水（56毫升）之混合物 洗務;慮餅。取出經分離之固體並在真空中於4 〇 _ $ 〇。〇下將 其乾燥，獲仔灰白色固體狀標題化合物（形式Α)(ι 8· 1克）。 獲得圖3-5之方法 粉末XRD-圖3(呈形式A之化合物a) 粉末X-射線繞射係使用Bruker D5000繞射儀（χ_射線之 波長為1.5418 A Cii源，電壓40 kV，燈絲發射40 mA)記 錄。使用0.02。步寬及4秒鐘時間計數自2_4〇。2Θ掃描樣 品° 粉末XRD-圖4(溶合形式之化合物a) 溶劑合物種類之粉末X-射線繞射係使用一裝配有彎曲位 125153.doc •43 - 200825066 置敏感檢測器（範圍120° 2Θ)之Inel XRG-3000繞射儀（X-射 線之波長為1.5418 A Cu源、電壓40 kV、燈絲級發射30 mA)記錄。使用0.03。步寬自2.5-40。2Θ掃描樣品，通常總 收集時間為300秒鐘。 差示掃描量熱法（DSC)-囷5 使用一具有TSO801RO自動化系統之Mettler DSC820E記 錄DSC。通常將少於5克之材料包含於40微升配有刺破蓋 子的鋁盤中，以l〇°C/分鐘之恆定加熱速率在25°C至325°C 溫度範圍内加熱。以1 〇 〇毫升/分鐘之流速使用氮氣吹掃 氣。 實例6 抑制作用 使用下列分析來測定IC5G值以便評價該活性化合物之抑 制作用。 在96孔FlashPlates(商標名）(NEN，UK)中用Z-緩衝液（25 mM Hepes (Sigma) ； 12.5 mM MgCl2 (Sigma) ； 50 mM KC1 (Sigma) ; 1 mM DTT (Sigma) ; 10%甘油（Sigma) ; 0.001% NP-40 (Sigma) ; pH 7.4)培養自Hela細胞核提取物分離之哺 乳動物PARP並添加不同濃度之該等抑制劑。所有化合物 皆稀釋於DMSO中並提供介於10與0.01 μΜ間之最終分析濃 度，同時DMSO之最終濃度為1%/孔。每孔之總分析體積 為40微升。 於30 °C下培養10分鐘後，藉由添加10微升包含NAD (5 μΜ)、3H-NAD及30 mer雙鏈DNA寡聚物之反應混合物來 125153.doc -44- 200825066 開始反應。指定之陽性及陰性反應孔與化合物孔（未知）一 起處理以便計算％酵素活性。然後將該等板振盪2分鐘並 於30°C下培育45分鐘。 培育後，藉由添加50微升30%乙酸至各孔中來淬滅反 應。然後將該等板於室溫下振蘯1小時。 將該等板轉移至TopCount NXT(商標名）(Packard，UK)用 於閃爍計數。所記錄之值為各孔計數30秒鐘後之計數/分 鐘（cpm) 〇

然後使用以下等式計算該化合物之％酵素活性： %抑制=100 ( (未知之cpm-平均陰性cpm) _ 10Ox-- V (平均陽性cpm-平均陰性cpm) 計算IC5G值（50%酵素活性受到抑制之濃度），該值係在一 系列不同濃度内（通常自10 μΜ低至0.001 μΜ)測定。該等 IC5〇用作比較值以確定化合物效力的增加。 化合物A具有約5 nM之IC50。 增強係數 活性化合物之增強係數（PF5G)係計算成對照細胞生長之 IC5G除以添加PARP抑制劑之細胞生長之IC5〇的比率。對照 及經化合物處理細胞的生長抑制曲線皆在烷基化試劑甲烷 磺酸甲酯（MMS)存在下測得。測試化合物以0.2微莫耳之固 定濃度使用。MMS之濃度介於0至10微克/毫升之間。 使用石黃醢羅丹明B(sulforhodamine B) (SRB)分析評價細 胞生長（Skehan，P.等人，（1990) New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. J. Natl. Cancer Inst. 125153.doc -45 - 200825066 82，U〇7-1112·)。將2,000個HeLa細胞以100微升之體積接 種於平底96孔微量滴定板之各孔中並於37。〇培育6小時。 用單獨的培養基或包含終濃度為〇·5、i或5 PARP抑制 劑之培養基替換細胞培養基。使細胞再生長丨小時，然後 將一系列濃度（通常為〇、1、2、3、5、7及1〇微克/毫升）之 MMS添加至未處理細胞或經parP抑制劑處理之細胞。使 用經由PARP抑制劑單獨處理之細胞來評價由parP抑制劑 引起之生長抑制。 將細胞再放置16小時，然後替換培養基並於37^下使細 胞再生長72小時。然後移除培養基並隨後用1 〇〇微升冰冷 的10% (w/v)三氯乙酸固定細胞。將該等板於4。〇培育2〇分 鐘並隨後用水洗滌4次。然後用100微升溶於〇·4% (w/v)存 於1 %乙酸中之SRB對各孔之細胞實施染色達2〇分鐘，然後 用1%乙酸洗滌4次。然後將板在室溫下乾燥2小時。藉由 添加100微升10 mM Tris鹼至各孔中來溶解經染色細胞之 染料。輕輕搖動板並將其於室溫下放置30分鐘，然後在 Microquant微量滴定板讀取器上於564 nM下量測光密度。 化合物A在200 nM具有至少20之PF5〇。 【圖式簡單說明】 圖1顯示化合物A水處理後之NMR(實例1); 圖2顯示呈形式A之化合物A水處理後的粉末xrd圖案（實 例1); 圖3顯示呈形式A之化合物A的代表性粉末xrd圖案； 圖4顯示呈溶合形式之化合物A的代表性粉末XRD圖案； 125153.doc -46- 200825066 圖5顯示呈形式A之化合物A的代表性DSC痕跡，其係藉 由以10°C/分鐘自25°C加熱至325°C獲得。 125153.doc 47-

Claims (1)

1. 200825066 十、申請專利範圍： 1. 一種4-[3-(4-環丙烷羰基-六氫π比嗪-1-羰基）-4-氟-苄基]-2H-酞嗪-1-酮，其呈晶體形式A。 2. 如請求項1之化合物，其在粉末XRD中具有下列特徵 峰： 峰 2Θ0 (士 0.1。） (λ=1.5418λ) 1 12.0 2 17.8 3 21.1 4 22.3 5 29.2 3.如請求項1之化合物，其在粉末XRD中具有下列特徵 峰： 峰 2Θ0 (±0.1°) (λ=1·5418Α) 1 12.0 2 17.8 3 21.1 4 22.3 5 29.2 6 10.5 7 14.0 8 21.7 9 24.3 10 26.1 4.如請求項1至3中任一項之化合物，其在DSC中以10°C /分 125153.doc 200825066 鐘自25°C加熱至325°C時在210.1°C 士 1°C開始熔化。 一種獲仔呈晶體形式A之4-[3_ (4-環丙烧羧基-六氫吼嗓-1-羰基）-4-氟-苄基]_2H•酞嗪化合物A)之方法，其 包括如下步驟： (i) 自溶劑中結晶析出4-[3-(4-環丙烷羰基-六氫吼嗪-1-羰基）-4-氟-苄基]-2H-酞嗪-1-酮； (ii) 若初始溶劑不為乙醇，則用乙醇處理該晶體化合物 A ； (iii) 用水處理該晶體化合物A以移除所捕獲乙醇； (iv) 乾燥所得產物。 一種獲得呈晶體形式A之4-[3-(4-環丙烷羰基-六氫吡嗪-Ι-lk基）-4-氟-苄基]-2H-酜嗓-Ι-g同（化合物A)之方法，其 包括如下步驟： (i) 自溶劑中結晶析出4_[3_(4_環丙烷羰基-六氫σ比嗪-羰基）-4-氟-苄基]-2Η-酞嗪-1-酮； (ii) 若呈晶體形式之化合物A合成法所用初始溶劑不為水 與C! _2醇之混合物’則將該化合物與水與c丨2醇之混 合物一起加熱； (iii) 於常壓下蒸餾該混合物；及 (iv) 乾燥所得產物。 種獲件呈晶體形式A之4-[3-(4 -環丙烧幾基-六氫外b.-基）-4-氟-苄基]-2H-酞嗪-1-酮（化合物A)之方法，其 包括如下步驟·· (0將化合物A懸浮於作為溶劑之水與c!_2醇的混合物 125153.doc 200825066 中； (ii) 加熱該懸浮液至回流； (iii) 冷卻該溶液並用接種呈形式A之化合物A晶種； Ο)乾燥所得產物。 8· 一種自4-[4-氟-3-(六氫吨嗪-1-羰基 > 苄基]_2H-酞嗪―卜酮 合成4-[3-(4-環丙烷羰基-六氫吡嗪·丨_羰基）_4_氟·苄基]_ 2H-酞嗪-1-酮之方法，其包括如下步驟： f (0以控制方式將含二乙基胺及環丙烷羰醯氣之有機溶 劑之預混合溶液添加至存於相同有機溶劑中之4_[4_ 氟-3-(六氫吼嗪-丨_羰基）·节基]·2Η_酞嗪·丨-酮中，同 時將溶液溫度控制在低於2〇t。 9種自獻氧代·3,4-二氫-酞嗪-1-基甲基）-苯甲酸 口成4 [3-(4-¼丙烷碳基_六氫^比嗓小幾基）_4_氟·节基]· 2仏駄嗪小_之方法，其包括使2备5♦氧代_3，心二 氫-酉太嗪-1_基甲基）-苯曱酴盥,/與工#、 u 、 -、1 - (%丙基幾基）六氫υ比唤或 其無機酸鹽在醯胺偶合劑存在下反應。 10. —種合成2-氟-5·(4-氧代1 Λ 卜 礼代3,4·二虱-酞嗪-1-基甲基）-苯甲 酸之方法’其包括如下步驟： (a)自2-羧基苯甲醛合成门 风虱代_1，3-二氫·2-苯并呋喃-1- 基）膦酸二乙酯； (b)自（3 -氧代_ι，3_二氫_2_笼丑 本开呋喃·1-基）膦酸二乙酯合 成 2_氟-5_[(£/2)-(3-蓋处。* 氧代本并呋喃-1(3Η)-亞基）甲 基]节腈。 11·如請求項1〇之方法，其 ^ 步包括如下步驟： 125153.doc 200825066 (c)由化合物E與水合肼反應，合成2-氟·5-[(4-氧代-3,4-二氫醜嗪-1-基）甲基]苄腈（ED):

   及 (d)由化合物ED與氫氧化鈉反應，合成化合物D。 12. —種2-氟-5-[(4-氧代-3,4-二氫醜嗓小基）曱基]节腈 (ED):

   13. —種醫藥組合物’其包括如請求項丨至4中任一項之化合 物及一醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。 U.如請求項⑴中任一項之化合物，其用於治療人體或動 物體之方法中。 15.如請求項⑴中任一項之化合物，其用於在人體或動物 體治療中抑制PARP之方法中。 16·-種如請求項⑴中任一項之化合物在製備藥物中之的 用途’該藥物用於抑制PARP活性。 種：請求項丨至4中任一項之化合物在製備藥物中的用 …樂物用於治療下列疾病：血管疾病；敗血性休 125153.doc 200825066 克；缺血性損傷；神經毒性；出血性休克；病毒感染； 或可藉由抑制PARP活性來改善之疾病。 1 8. —種如睛求項丨至4中任一項之化合物在製備藥物中之用 途，該藥物用於在癌症治療中用作辅助藥劑或用於加強 利用電離輻射或化學治療劑之腫瘤細胞治療。 19·種如凊求項1至4中任一項之化合物在製造用於治療個 體中癌症的藥物中之用途，其中該癌症存在HR依賴性 DNADSB修復通路缺陷。 2 0 ·如明求項19之用途，其中該癌症包含一或多個相對於正 常細胞已降低或消失由HR修復DNA DSB的能力之癌細 胞。 21. 如請求項20之用途，其中該等癌細胞具有BRCAl或 B R C A 2缺陷表型。 22. 如凊求項21之用途，其中該等癌細胞存在BRCA1或 BRCA2缺陷。 23 ·如凊求項1 9至22中任一項之用途，其中該個體係編碼HR 依賴性DNA DSB修復通路之組份的基因突變之雜合體。 24·如請求項23之用途，其中該個體係BrCA1& /或brCA2 突變之雜合體。 25·如請求項19至24中任一項之用途，其中該癌症係乳癌、 印巢癌、騰腺癌或前列腺癌。 26·如請求項19至25中任一項之用途，其中該治療進一步包 括投與電離輪射或化學治療劑。 125153.doc