TW200817435A

TW200817435A - Compositions and methods for modulating vascular development

Info

Publication number: TW200817435A
Application number: TW096120337A
Authority: TW
Inventors: Minhong Yan
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-06-06
Filing date: 2007-06-06
Publication date: 2008-04-16
Also published as: SG172687A1; ECSP099032A; BRPI0710411A2; NO20090046L; WO2007143689A8; CL2007001624A1; IL194788A0; CR10529A; WO2007143689A2; EP2029159A2; US20080014196A1; WO2007143689A3; US20100129356A1; AU2007256617A1; JP2009539870A; RU2008152435A; MX2008015532A; CA2654304A1; MA30536B1; KR20090016762A

Description

200817435 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明大體而言係關於適用於調節血管發育之組合物及方法。在某種程度上，本發明係關於類δ4 (DLL4)拮抗劑用於診斷及治療與血管生成相關之病症的用途。【先前技術】血官供應之形成為許多生理學及病理學過程之基本要、求。諸如胚及瘤之活躍生長的組織需要充足之血液供應。 ( 其藉由產生促血管生成因子而滿足此需要，促血管生成因子經由所謂血管生成之過程促進新血管形成。血管形成為複雜但有序之生物事件，其包括以下步驟中之所有步驟或多個步驟：a)内皮細胞（EC)自現有EC增殖或自祖細胞分化；b) EC遷移且聚結以形成索樣結構；幻血管索接著經歷管生成（tubulogenesis)以形成具有中心内腔之血管；d)現有索或血管長出萌芽以形成第二血管；幻原生血管叢經歷 I 進一步重塑及再成形及f)摹集内皮外細胞以封圍内皮管，提供對血管之保持及調節功能；該等細胞包括小的毛細管之周細胞（pericyte)、較大血管之平滑肌細胞及心臟中之心肌細胞。Hanahan，D· 277:48-50 (1997); Hogan，B. L.及 Kolodziej，Ρ· A· iVaiwre 肩 GMeiz.cs· 3:513-23 (2002) ; Lubarsky，B.及 Krasnow，M. A. Ce//· 112:19-28 (2003) 。現充分確定，血管生成涉及多種病症之發病機理。此等病症包括實體腫瘤及癌轉移、動脈粥樣硬化症、晶狀體後 121445.doc 200817435 纖維增生症、血管瘤、慢性炎症、眼内新生血管疾病（諸如增生性視網膜病，例如糖尿病性視網膜病）、年齡相關之黃斑變性（AMD)、新生血管性青光眼、所移植之角膜組織及其他組織之免疫性排斥反應、類風濕性關節炎及牛皮癬。Folkman 等人，j. c/2㈣，267:1〇9311〇934 (1992); Klagsbrun等人，乂關& 及⑼ 53:217·239 (1991)及 Garner A.，"Vascular diseases"，In: Pathobiology of

Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A.5 Klintworth GK，編輯，第 2版（Marcel Dekker，Νγ，1994)，第 1625-1710頁。在腫瘤生長之狀況下，血管生成對於自過度增生轉變為瘤形成以及為腫瘤生長及轉移提供營養而言似乎起著決定性的作用。Folkman等人，TVaiwre 339:58 (1989)。與正常細胞相比，新血管生成使腫瘤細胞獲得生長優勢及增生自主性。腫瘤常以單個異常細胞開始，由於其可利用之毛細管床之距離’因此該異常細胞僅可增殖為幾立方毫米之大小’且其可長期’蟹伏’而不進一步生長及擴散。某些腫瘤細胞接著轉換成血管生成表型以激活内皮細胞，該等内皮細胞增殖且長成新毛細血管。此等新形成之血管不僅使原發腫瘤繼續生長，而且使轉移性腫瘤細胞擴散且重新移生。因此’已注思到腫瘤切片中之微也管密度與乳癌及若干其他腫瘤之患者存活率之間存在相互關係。等人，7V·五叹/.丄 324:1-6 (1991); Horak等人， 340:1120-1124 (1992); Macchiarini等人，L㈣340:145- 121445.doc 200817435 146 (1992) °雖然控制血管生成轉換之準確機制未瞭解清楚’但咸k腫瘤塊之新血管生成由大量血管生成刺激物與抑制物之淨平衡引起（Folkman，1995，iVw MW 1(1):27-31)。血管發月之過私受到嚴密調節。迄今為止，已顯示相當大量之分子（大多為周圍細胞所產生之分泌因子）調節EC分化、增殖、遷移及聚結成索樣結構。舉例而言，已確定血管内皮生長因子（VEGF)為涉及刺激血管生成及誘導血管通透性之關鍵因子。Ferrara等人，心18:4-25 (1997) °即便單個VEGF等位基因之缺損亦導致胚致死之結論表明此因子在血管系統之發育及分化中所起的作用無法替代。此外，已顯示VEGF為與腫瘤及眼内病症相關之新血管生成的關鍵介體。Ferrara等人，swpra。 VEGF mRNA被大部分所檢查之人類腫瘤過度表現。 Berkman等人，/· C/M. /πναί. 91:153-159 (1993); Brown等 k 1 Human Ραί/ζο/· 26:86-91 (1995); Brown等人，C㈣cer Λα. 53:4727-4735 (1993); Mattern等人，J. Cancer 73:931-934 (1996); Dvorak等人，dm. J. Ραί/ζο/· 146:1029-1039 (1995)。又，VEGF在眼睛流體中之濃度水平與患有糖尿病性視網膜病及其他局部缺血相關性視網膜病之患者中存在血管之活躍增殖高度相關聯。Aiello等人，从五叹/. j. Mei 331:1480-1487 (1994)。此外，研究已證明，在受AMD侵襲之患者中，VEGF定位於脈絡膜新生血管膜中。Lopez等 121445.doc 200817435 人，/πναί. Fb. 5W· 37:855-868 (1996) 0 抗VEGF中和抗體抑制裸小鼠中多種人類腫瘤細胞株之生長（Kim專人 ’ 〜362:841 _844 (1993); Warren 等人， /· C/M. /⑽ ew· 95:1789-1797 (1995); Borgstr5m等人， 56:4032-4039 (1996); Melnyk等人，Cwcer 及56:921-924 (1996))且其亦在局部缺血性視網膜病症模型中抑制眼内企管生成。Adamis等人，drc/z. 114:66-71 (1996)。因此，抗VEGF單株抗體或VEQF作用之其他抑制劑有望成為用於治療腫瘤及各種眼内新生血管性病症之候選者。在1998年1月14日公開之EP 817,648及1998 年10月15日公開之WO 98/4533 1及WO 98/45332中描述了該等抗體。抗VEGF抗體之一，貝伐單抗（bevacizumab)已由FDA批准用於與化學療法組合使用以治療轉移性結直腸癌（CRC)。且貝伐單抗正在多個進行之中的關於治療各種癌適應症之臨床試驗中接受調查。鑒於血管生成在多種疾病及病症中之作用，需要一種調節-或多種引起此等過程之生物效應的方式。顯而易見，不斷需要具有對治療劑之研發而言為最佳之臨床屬性的藥劑。本文所述之發明滿足此需要且提供其他益處。包括專利申請案及公開案的所有本文引用之文獻均以全文引用的方式併入本文中。【發明内容】本發明部分係基於發現可藉由用調節砒灿受體路科之賴（可互換地稱為"DLL4，，）活化的藥劑治療來抑制血管發 121445.doc 200817435 育。用DLL4拮抗劑治療導致維管結構（包括腫瘤維管結構）中增加之内皮細胞（EC)增殖、不當之内皮細胞分化及 * 田之動脈發育。明顯地，用抗131^4抗體治療導致若干不同癌症中腫瘤生長受到抑制。因此，本發明提供用於調節 (例如促進或抑制）涉及血管生成之過程且用於靶向與血管生成相關之病理性病症的方法、組合物、套組及製造物品。在一態樣中，本發明提供用於治療腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症之方法，該等方法包含將有效量之dll4拮抗劑投與需該治療之受檢者。在恶樣中，本發明提供用於減少、抑制、阻斷或預防腫瘤或癌症生長之方法，該等方法包含將有效量之抗 DLL4拮抗劑投與需要該治療之受檢者。在一態樣中’本發明提供用於抑制血管生成之方法，該等方法包含將有效量之DLL4拮抗劑（諸如抗DLL4抗體）投與需要該治療之受檢者。在一態樣中，本發明提供用於治療與金管生成相關之病理性病症的方法，該等方法包含將有效量之DLL4拮抗劑 (諸如抗DLL4抗體）投與需要該治療之受檢者。在某些實施例中，忒與血官生成相關之病理性病症為腫瘤、癌症及/ 或細胞增殖性病症。在某些實施例中，該與血管生成相關之病理性病症為眼内新生血管疾病。在一態樣中’本發明提供用於刺激内皮細胞增殖之方法忒專方法包含將有效量之DLL4拮抗劑投與需要該治 121445.doc -10- 200817435 療之文檢者。在某些實施例中，該受檢者患有與血管生成相關之病理性病症（諸如腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症）。在一恶樣中，本發明提供用於抑制内皮細胞分化之方法該等方去包含將有效量之DLL4拮抗劑投與需要該治療之又才欢者。在某些實施例中，該受檢者患有與血管生成相關之病理性病症（諸如腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症）。一一在恶樣中，本發明提供用於抑制動脈發育之方法，該等方法包3將有效量之DLL4拮抗劑投與需要該治療之受仏者。在某些實施例中，該受檢者患有與血管生成相關之病理性病症（諸如腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症）。在一態樣中，本發明提供用於抑制血管灌注之方法，該 1方法包含將有效量之DLL4拮抗劑投與需要該治療之受 &者。在某些實施例中，該受檢者患有與血f生成相關之 (-病理性病症（諸如腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症）。在另一態樣中，本發明提供一種增強抗血管生成劑在患有與血管生成相關之病理性病症的受檢者中之治療功效之方法，該枝包含將有效量之DLL4拮抗劑與該抗血管生 ^劑組合投與該受檢者。該方法可適用於治療例如癌症或眼内新生血管疾病之病症，尤其對單獨用抗 ^ R m ^ w /π ’、μ不佳之彼等疾病或病症階段。該抗血管生成劑可Α 能夠減少或抑制血管生成之任何藥劑，包括vegf_ 劑，諸如抗VEGF抗體。 "几 121445.doc -11 - 200817435 在一態樣中，本發明提供包含組合投與有效量之dll4 括㈣（諸如抗dLL4抗體）與有效量之另一治療劑（諸如抗血官生成劑）的方法。舉例而言，將DLL4拮抗劑與抗癌劑或抗血官生成劑組合使用以治療各種贅生性或非贅生性病症。在一實施例中，贅生性或非贅生性病症為與血管生成 $關之病理性病症。在某些實施例中，另—治療劑為抗血管生成劑、抗贅生劑及/或化學治療劑。 DLL4拮抗劑可連續地或與有效於達成彼等目的之其他冶療劑組合，以同一組合物或作為獨立組合物之形式投與。DLL4拮抗劑及另一治療劑（例如抗癌劑、抗血管生成劑）之投與可同時進行，例如作為單一組合物或作為兩種或兩種以上不同組合物使用相同或不同投藥途徑來投與。或者或另外技藥可以任何次序相繼進行。或者或另外，步驟可呈任何次序以連續與同時之組合的形式實施。在某些實施例中，兩種或兩種以上組合物之投藥之間可存在分〇鐘至天至週至月之範圍内之時間間隔。舉例而言，抗癌劑了首先投與，接著投與DLL4拮抗劑。然而，亦涵蓋同時投與或首先投與DLL4拮抗劑。因此，在一態樣中，本發明提供包含投與DLL4拮抗劑（諸如抗DLL4抗體）接著投^ 抗血官生成劑（諸如抗VEGF抗體，諸如貝伐單抗）之方法。在某~ κ施例中，兩種或兩種以上組合物之投藥之間可存在分鐘至天至週至月之範圍内之時間間隔。在某些態樣中，本發明提供一種藉由投與有效量之 DLL4拮抗劑及/或血管生成抑制劑及一或多種化學治療劑 121445.doc -12- 200817435 來治療一病症（諸如腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症）之方法二本發明之組合治療方法中可使用多種化學治療劑。所涵盍之化學治療劑之例示性及非限制性列表提供於本文中之”定義”項下。DLL4拮抗劑及化學治療劑之投與可同時進灯，例如作為單一組合物或作為兩種或兩種以上不同組合物使用相同或不同投藥途徑來投與。或者或另外，投藥可以任何次序相繼進行。或者或另外，步驟可呈任何次序以 (連續與同時之組合的形式實施。在某些實施例中，兩種或 ,兩種以上組合物之投藥之間可存在分鐘至天至週至月之範圍内之時間間隔。舉例而言，可首先投與化學治療劑，接者投與DLL4拮抗劑。然而，亦涵蓋同時投與或首先投與 DLL4拮抗劑。因此，在一態樣中，本發明提供包含投與 DLL4拮抗劑（諸如抗DLL4抗體）接著投與化學治療劑之方法。在某些實施例中，兩種或兩種以上組合物之投藥之間可存在分鐘至天至週至月之範圍内之時間間隔。〇在一態樣中，本發明提供DLL4拮抗劑在製備用於治療性及/或預防性治療一病症（諸如與血管生成相關之病理性病症）之某劑中的用途。在某些實施例中，該病症為腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症。在悲樣中’本發明提供用於治療一病症之方法，該等方法包含將有效量之DLL4促效劑投與需要該治療之受檢者。在某些實施例中，該病症與DLL4_N〇tch受體路徑之表現及/或活性（諸如DLL4_N〇tci^體路徑之增加的活性）相關聯。在某些實施例中，該病症為需要血管生成、新血管生 121445.doc •13- 200817435 成及/或肥大之病症，例如血管外傷、傷口、穿口七口、燒傷、潰瘍（例如糖尿病性潰瘍、壓力性潰瘍、血友病性潰瘍、靜脈曲張性潰瘍）、組織生長、體重增加、鬥邊動脈疾病、誘發陣痛、毛髮生長、大皰性表皮鬆懈症、視網膜萎縮症、骨折、骨脊柱融合、半月板撕裂等。在某些實施例中，該病症為需要抑制血管生成之病症。在某些實施例中’ DLL4促效劑為DBZ。 DLL4拮抗劑及促效劑在此項技術中係已知的，且某些在本文中描述及例示。在某些實施例中，〇“4拮抗劑為結合DLL4且中和、阻斷、抑制、中止、減少或干擾dll4 相關效應之一或多個態樣的分子。在某些實施例中， DLL4拮抗劑為結合N〇tch受體（諸如N〇tchl、心滅2、 Notch3及/或Notch4)且中和、阻斷、抑制、中止、減少或干擾DLL4相關效應之一或多個態樣的分子。在某些實施例中，DLL4拮抗劑能夠促進内皮細胞增殖、抑制内皮細胞分化、抑制動脈發育及/或減少血管灌注。如此項技術中所充分確定，可使用多種檢定（某些檢定在本文中描述且例示）之任一種來評估内皮細胞增、殖、内皮細胞分化、動脈發育及血管功能（諸如血管灌注）且根據多種定量值來表示。在某些實施例中，相對於在缺乏]〇乙1^拮抗劑治療之情況下内皮細胞增殖、内皮細胞分化、動脈發育及/或血管功能（諸如血管灌注）之水平來評估DLL4拮抗劑促進内皮細胞增殖、抑制内皮細胞分化、抑制動脈發育及/或減少血官功能（諸如減少血管灌注）之能力。在某些實施例 121445.doc • 14- 200817435 中，在活體外檢定（諸如本文所述之HUVEC檢定）中測定促進内皮細胞增殖、抑制内皮細胞分化、抑制動脈發育及/ 或減少血管功能（諸如減少血管灌注）之能力。在某些實施例中，在活體内檢定（諸如本文所述之小鼠視網膜發育檢定）中測定促進内皮細胞增殖、抑制内皮細胞分化、抑制動脈發育及/或減少血管功能（諸如減少血管灌注）之能力。 DLL4拮抗劑可為抗DLL4抗體。在某些實施例中，抗 DLL4抗體為單株抗體。在某些實施例中，該抗體為多株抗體。在某些實施例中，該抗體係選自由嵌合抗體、親和力成熟抗體、人化抗體及人類抗體組成之群。在某些實施例中，該抗體為抗體片段。在某些實施例中，該抗體為 Fab、Fab’、Fab’-SH ' F(ab’)2 或 scFv。在某些實施例中，該抗體包含表1中所示之重鏈及輕鏈可變區。表1

VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDNWISWVRQAPGKGLEWVGYISPNSGFTYYADSV KGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNFGGYFDYWGQGTLVT (SEQIDNO: 1)

VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATTYYCQQSYTGTVTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 2) 在一實施例中，抗體為嵌合抗體，例如包含自非人類供體移植至異源非人類、人類或人化序列（例如構架及/或恆定域序列）之抗原結合序列的抗體。在一實施例中，非人類供體為小鼠。在一實施例中，抗原結合序列為合成的，例如藉由突變（例如噬菌體呈現篩檢等）獲得。在一實施例 121445.doc -15- 200817435 中，本發明之嵌合抗體具有鼠¥區及人類c區。在一實施例中，使鼠輕鏈v區融合至人類κ輕鏈。在一實施例中，使鼠重鏈V區融合至人類igGi C區。人化抗體包括在FR中具有胺基酸取代之彼等抗體及在移植CDR中具有變化之親和力成熟變異體。或中經取代之胺基酸不限於彼等存在於供體或受體抗體中之胺基酉文。在其他實施例中，本發明之抗體進一步包含Fc區胺基酸殘基之變化，其導致包括增強之CDC及/或ADCC功能及 B細胞殺傷力的改良效應功能。本發明之其他抗體包括彼等具有可改良穩定性之特異性變化者。在其他實施例中，本發明之抗體包含FC區胺基酸殘基之變化，其導致效應功月b降低，例如CDC及/或ADCC功能降低及/或B細胞殺傷力降低。在某些實施例中，DLL4拮抗劑為DLL4免疫黏附素。在一態樣中，本發明提供包含一或多種DLL4拮抗劑及載劑之組合物。在一實施例中，載劑為醫藥學上可接受之載劑。在某些實施例中，DLL4拮抗劑為抗DLL4抗體。在怨樣中’本發明提供一種用於治療腫瘤、癌症及/ 或、、、田胞增殖性病症之組合物，該組合物包含有效量之 DLL4拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑，其中該用途包含同日守或相繼投與抗血管生成劑。在某些實施例中，DLL4 拮抗劑為抗DLL4抗體。在某些實施例中，抗血管生成劑為抗VEGF抗體（諸如貝伐單抗）。在忍樣中，本發明提供一種用於治療腫瘤、癌症及/ 121445.doc -16 - 200817435 或細胞增殖性病症之組合物，該組合物包含有效量之 DLL4拮抗劑及醫藥學上可接受之載劑，其中該用途包含同時或相繼投與抗癌劑。在某些實施例中，DLL4拮抗.劑為抗DLL4抗體。在某些實施例中，抗癌劑為化學治療劑。在某些實施例中，該用途進一步包含同時或相繼投與抗血管生成劑。在某些實施例中，DLL4拮抗劑為抗DLL4 抗體。在某些實施例中，抗血管生成劑為抗VEGF抗體（諸如貝伐單抗）。在一態樣中，本發明提供一種製造物品，其包含容器及含於容器内之組合物，其中該組合物包含一或多種DLL4 拮抗劑或DLL4促效劑。在一態樣中，本發明提供一種包含一第一容器（包含有包含一或多種DLL4拮抗劑或DLL4促效劑之組合物）及一第二容器（包含緩衝劑）之套組。在一實施例中，該緩衝液為醫藥學上可接受的。在一實施例中，該DLL4拮抗劑為抗 DLL4抗體.。在另一態樣中，本發明提供一種用於製備一組合物之方法，該方法包含將治療有效量之DLL4拮抗劑或DLL4促效劑與醫藥學上可接受之載劑混合。【實施方式】通用技術本文描述或參考之技術及程序一般為眾所熟知且常使用熟習此項技術者習知之方法來採用，諸如Sambrook等人 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第 3 版（2001) Cold 121445.doc -17- 200817435

Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 等人編輯，（2003)) ; the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J· MacPherson，B. D. Hames及 G. R. Taylor編輯（1995))，Harlow 及 Lane 編輯（1988) ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，及 ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編輯（1987))中所述之廣泛使用之方法。定義除非特別地或於上下文中另外指出，否則如本文所用之術語"DLL4”（可互換地稱為π類δ4”）係指任何天然或變異 (無論天然抑或合成）DLL4多肽。術語’’天然序列”特定涵蓋天然存在之截斷或分泌形式（例如胞外域序列）；天然存在之變異形式（例如替代性剪接形式）及天然存在之等位基因變異體。術語π野生型DLL4” 一般係指包含天然存在之 DLL4蛋白之胺基酸序列的多肽。術語，，野生型DLL4序歹ij ’’ 一般係指見於天然存在之DLL4中的胺基酸序列。除非特別地或於上下文中另外指出，否則如本文使用之術語"Notch受體π (可互換地稱為"Notch”）係指任何天然或變異（無論天然抑或合成）之Notch受體多肽。人類具有四個 Notch 受體（Notchl、Notch2、Notch3 及 Notch4)。如本文所用之術語Notch受體包括四個人類Notch受體中之任一者或所有。術語π天然序列’’特定涵蓋天然存在之截斷或分泌形式（例如胞外域序列）、天然存在之變異形式（例如替代性剪 121445.doc -18- 200817435 接形式）及天然存在之等位基因變異體。術語π野生型Notch 受體’’一般係指包含天然存在之Notch受體蛋白之胺基酸序列的多肽。術語’’野生型Notch受體序列”一般係指見於天然存在之Notch受體中的胺基酸序列。 nDLL4核酸π為編碼如上定義之DLL4多肽之RNA或DNA 或編碼在嚴格雜交條件下雜交至該DNA或RNA且穩定保持與其之結合並長度大於約10個核苷酸之DLL4多肽的RNA 或DNA。嚴格條件為（1)針對洗滌採用低離子強度及高溫之條件，例如50°C下0.15 M NaCl/0.015 Μ檸檬酸鈉/0.1% NaDodS04，或（2)雜交期間使用變性劑（諸如甲醯胺）之條件，例如在42°C下具有0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1 %聚乙烯σ比洛σ定酮/50 mM鱗酸鈉緩衝液（pH 6.5，具有75 0 mM NaCl、75 mM擰檬酸鈉）之5 0% (v/v)甲醯胺。 ’’嵌合DLL4”分子為包含融合或結合至異源多肽之全長 DLL4或其一或多個域的多肽。嵌合DLL4分子一般可與天然存在之DLL4 —樣共有至少一種生物特性。嵌合DLL4分子之一實例為經抗原決定基標記以達成純化目的之分子。另一嵌合DLL4分子為DLL4免疫黏附素。術語’’DLL4免疫黏附素’’可與術語’’DLL4免疫球蛋白嵌合體”可互換使用，且係指使至少一部分DLL4分子（天然或變異）與免疫球蛋白序列合併之嵌合分子。免疫球蛋白序列較佳（但並非必需）為免疫球蛋白恆定域（Fc區）。免疫黏附素可具有人類抗體之頗具價值之化學及生物特性中之多種特性。因為免疫黏附素可自具有連接至適合人類免疫球蛋 121445.doc -19- 200817435 白鉸鏈及恆定域（Fc)序列之所要特異性的人類蛋白序列建構’所以可使用完整人類組分達成所關注之結合特異性。汶免疫黏附素最低程度地使患者產生免疫性，且對長期或重複使用而言係安全的。在某些實施例中，Fc區為天然序列Fc區。在某些實施例中，以區為變異以區。在某些實施例中，Fc區為功能！^區。針對治療用途描述之同源多聚免疫黏附素之實例包括用於阻斷HIV結合至細胞表面CD42CD4_IgG免疫黏附素。自階段I臨床試驗（其中在剛要分娩之前將Cj^dgG投與孕婦）獲得之資料表明此免疫黏附素可適用於預防HIV之母嬰傳遞（Ashkenazi等人，/价⑽及ev /所所㈣^厂1〇:219_227 (1993))。亦已研製結合腫瘤壞死因子（tnf)之免疫黏附素。TNF為前發炎性細胞因子，其經證明為敗血性休克之主要介體。基於敗血性休克之小鼠模型，顯示TNF受體免疫黏附素有望成為用於治療敗血性休克之臨床用途的候選者（Ashkenazi，A.等人88:10535-10539 (1991))。 ENBREL@(依那西普（etanercept)，一種包含融合至Ig(}卜區之TNF受體序列的免疫黏附素）經美國食品與藥物管理局 (U.S. Food and Drug Administration，FDA)於 1998年 11 月 2 日批准用於冶療類風濕性關節炎。ENBREL®在治療類風濕性關節炎中之新的擴展用途經FDA於2000年6月6日批准。關於TNF阻斷劑（包括ENBREL、之最新資訊參見L〇veU等人，见以g/· J. Me忒342:763·169 (2000)，及附隨社論在第 810-811 頁及 Weinblatt 等人，见五㈣ J 34〇:253_ 121445.doc -20- 200817435 259 (1999); Maini A Taylor, Annu. Rev. Med. 51:207-229 (2000)中之評論。若免疫黏附素結構之雙臂具有不同特異性，則類似於雙特異性抗體稱該免疫黏附素為”雙特異性免疫黏附素，，。 Dietsch等人，㈣162:123 (1993)描述合併黏附分子E-選擇素（seleetin)及^選擇素之胞外域的該種雙特異性免疫黏附素，其中各選擇素以本質上不同之細胞類型表現。結合研究表明所形成之雙特異性免疫球蛋白融合蛋白具有與衍生其之單特異性免疫黏附素相比增強之結合至骨髓細胞株的能力。術語”異型黏附素”與表述，，散合異型多聚體黏附素，，可互換使用且係指嵌合分子（胺基酸序列）之複合物，其中各嵌合分子合併生物活性部分（諸如各異型多聚受體單體之胞外域）與多聚化域。”多聚化域，，促進異型多聚體複合物内嵌合分子之穩定相互作用。多聚化域可經由免疫球蛋白序列、白胺酸拉鏈、疏水區、親水區或形成嵌合異型多聚體之肷合分子之間的分子間二硫鍵之游離硫醇相互作用。多聚化域可包含免疫球蛋白恆定區。此外，多聚化區可經工程化以使得空間相互作用不僅促進穩定相互作用，且進一步促進自單體混合物優於同型二聚體形成異型二聚體。藉由用較大側鏈（例如酪胺酸或色胺酸）自第一多肽之界面置換小的胺基酸側鏈來構築，，凸起，，。視情況在第二多肽之界面上藉由用較小胺基酸側鏈（例如丙胺酸或蘇胺酸）置換大的胺基酸側鏈來產生與該等凸起大小相同或類似之補償性 121445.doc •21- 200817435 11腔π。免疫球蛋白序列較佳（但並非必需）為免疫球蛋白恆定域。本發明之嵌合體中免疫球蛋白部分可自IgGi、 IgG2、IgG3 或 IgG4 子型 IgA、IgE、IgD 或 IgM獲得，但較佳自 IgG14IgG3獲得。本文之術語"Fc區”係用以定義免疫球蛋白重鏈之c末端區，包括天然序列Fc區及變異Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區的界限可能變化，但常定義人類匕0重鏈Fc區自位置Cys226處之胺基酸殘基或自pr〇230伸展至其羧基末端。例如可在產生或純化抗體期間或藉由重組工程化編碼抗體重鏈之核酸移除Fc區之C末端離胺酸（根據EU編號系統之殘基447)。因此，完整抗體之組成可包含所有K447殘基經移除之抗體群體、K447殘基未移除之抗體群體及具有含 K447殘基之抗體與無K447殘基之抗體的混合物之抗體群體。除非另外指出，否則在本文中免疫球蛋白重鏈中殘基之編號為如 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service， National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991)(以引用的方式明確併入本文中）中的EU索引之編號方式。”如 Kabat中之EU索引”係指人類IgGl EU抗體之殘基編號。 ”功能Fc區”具有天然序列Fc區之”效應功能π。例示性”效應功能’’包括Clq結合、補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)、呑噬作用、細胞表面受體（例如B細胞受體，BCR)之下調等。該等效應功能一般需要Fc區與結合域（例如抗體可變域）組合 121445.doc -22- 200817435 且例如可使用如本文所揭示之各種檢定來評估。 π天然序列Fc區π包含與天然發現之Fc區的胺基酸序列一致之胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類 IgGl Fc區（非A及A同種異型）、天然序列人類IgG2 Fc區、天然序列人類IgG3 Fc區及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變異體。 π變異F c區π包含由於至少一個胺基酸修飾、較佳一或多個胺基酸取代而不同於天然序列Fc區之胺基酸序列的胺基酸序列。與天然序列Fc區或親本多肽之Fc區相比，變異FC 區較佳具有至少一個胺基酸取代，例如天然序列Fc區或親本多肽之Fc區中約1至約1〇個胺基酸取代，且較佳為約1至約5個胺基酸取代。本文中變異Fc區較佳將與天然序列Fc 區及/或親本多肽之Fc區至少約80%同源，且最佳與其至少約90%同源，更佳與其至少約95〇/〇同源。經分離’’抗體為已經識別且與天然環境之組分分離及/或自天然環境之組分中回收的抗體。其天然環境之污染組分為會干擾抗體之診斷或治療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白或非蛋白溶質。在較佳實施例中，將抗體純化（1)為如以勞力法（L〇Wry meth〇d)測得之大於乃加％之抗體，且最佳為大於99重量％ ;⑺純化至藉由使用旋杯式定序儀足以獲得N末端或内部胺基酸序列之至少丨5個殘基之私度’或（3)純化至在遷原或非還原之條件下使用庫馬斯亮藍（C〇〇massie Mue)或較佳銀染藉由SDs_pAGE得知之均質性。因為抗體之天然環境中的至少_種組分將會不存在， 121445.doc -23 - 200817435 所以經分離抗體包括重組細胞内原位之抗體。然而，經分離抗體通常將藉由至少一步純化步驟製備。 t語"抗體"及”免疫球蛋白"於最廣義上可互換使用且包括單株抗體（例如全長或完整單株抗體）、多株抗體、多價抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體，只要其展現所需生物活性即可）且亦可包括特定抗體片段（如本文中更詳細之描述）。抗體可為人類、人化及/或親和力成熟之抗體。術語”可變”係指抗體間可變域之特定部分之序列普遍不同且係以各特定抗體對其特定抗原之結合及特異性之方式使用的事實。然而，可變性並不均句地分布於抗體之可變域各處。其集中於輕鏈及重鏈可變域兩者中之稱為互補判定區（CDR)或高變區的三個區段。可變域中之較高度保守之部分被稱作構架（FR)。天然重鏈及輕鏈之可變域各包含四個主要採用β-折疊構型、藉由三個CDR連接iFR區，其 Q 形成連接及（在某些狀況下）形成卜折疊結構之部分的環。各鏈中之CDR由FR區緊密接近地固持在一起，且來自其他鏈之CDR促成形成抗體之抗原結合位點（參看Kabat等人， Sequences of Proteins of Immun〇1〇gical 加⑽討，第五版，National Institute of Health，Bethesda，MD (1991))。雖然恆定域不直接涉及抗體與抗原之結合，但其顯示多種效應功此，例如抗體於抗體依賴性細胞毒性之參與。抗體之番木瓜酶消化產生各自具有單一抗原結合位點之稱為"Fab”片段之兩個相同的抗原結合片段及名稱反映其 121445.doc -24- 200817435 易於結晶之能力之殘餘” Fc ”片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原組合位點且仍能夠交聯抗原之片段。 ”Fv”為含有完全抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區由緊密、非共價締合之一重鍵可變域及一輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈"種類中， -個重鏈可變域與-個輕鏈可變域可由可触狀連接子共價連接，使得輕鏈與重鏈可以與雙鏈^種類類似之，，二聚'，，結構締合。各可變域之三個COR在此構型中相互作用以界定VH-VL二聚體表面上之抗原結合位點。總之，六個賦予抗體抗原結合特異性。然而，甚至單一可變域（或半數僅包含二個抗原特異性CDR之Fv)亦具有識別且結合抗原之能力，不過其與抗原結合之親和力比整個結合位點之親和力低。

Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域 (CH1)。Fab*片段與Fab片段之不同之處在於重鏈CH1域之 ( 羧基端基處添加了若干殘基，包括來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。本文中將Fab，-SH指定為恆定域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基的Fab’。最初以Fab’片段對之形式產生F(ab’）2抗體片段，其間具有鉸鏈半胱胺酸。亦已知抗體片段之其他化學偶合。來自任何脊椎動物物種之抗體（免疫球蛋白）之”輕鏈，，可基於其恆定域之胺基酸序列而歸類為兩種明顯不同類型 (稱作κ及λ)之一。可將免疫球蛋白視其重鏈恆定域之胺基酸序列而定指定 121445.doc -25- 200817435 為不同種類。存在5種主要類別之免疫球蛋白· IgA、 IgD、IgE、IgG及IgM，且此等免疫球蛋白中之若干者可被進一步分成子類（同型），例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別被稱作α、δ、ε、γ及μ。熟知不同類別之免疫球蛋白之子單元結構及三維構型。抗體片段僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較佳 (..保留通常與存在於完整抗體中時之該部分相關之至少一種，較佳為大部分或所有功能。抗體片段之實例包括 Fab、Fab’、F(ab’）2及Fv片段、雙功能抗體（diab〇dy)、線性抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。在一實施例中，抗體片段包含完整抗體之抗原結合位點且口此保遠結合抗原之能力。在另一實施例中，抗體片段 (例如包含Fc區之抗體片段）保留通常與存在於完整抗體中時之Fc區相關之至少一種生物功能，諸如FcRn結合、抗體 ( 半衰期調節、ADCC功能及補體結合。在一實施例中，抗體片段為活體内半衰期實質上類似於完整抗體之單株抗體。舉例而言，此抗體片段可包含能賦予片段活體内穩定性之連接至Fc序列之抗原結合臂。一 2語”高變區”、”HVR”或”HV”在本文中使用時係指序列咼變且/或形成結構確定之環的抗體可變域之區域。一般而吕，抗體包含六個高變區；三個在VH (H1、H2、H3) :，且=個在VL (L1、L2、L3)中。本文中使用且涵蓋許夕有關向變區之描繪。Kabat互補判定區（CDR)係基於序列 121445.doc -26- 200817435 可變性且為最常用者（Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))。而 Chothia指出結構環之位置（Chothia及Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。AbM 高變區表示 Kabat CDR 與

Chothia結構環之間的折衷，且藉由Oxford Molecular的 AbM抗體模型化軟體來加以使用。”接觸”高變區係基於可得之複雜晶狀結構的分析。以下附註來自此等高變區中之每一者的殘基。環 Kabat AbM Chothia 接觸 L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat編號） H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia編號） H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101 高變區可包含如下π擴展之高變區n : VL中之24-36^

34 (L1)、46-56 或 5 0-5 6 (L2)及 89-97 (L3)以及 VH 中之 26-35 (H1)、50-65 或 49-65 (H2)及 93-102、94-102 或 95-102 121445.doc -27- 200817435 (H3)。可變域之殘基係根據Kabat等人（同上文）關於該等定義中之每一者來編號。 ’’構架”或”FR”殘基為除如本文所定義之高變區殘基以外之彼荨可變域殘基。如本文所用之術語，，單株抗體"係指來自

V 之抗體的抗體，意即除了在產生該單株抗體期間可能會產生之可能變異體外（該等變異體一般以微量存在），該群體所包含之個別抗體為一致的且/或結合相同抗原決定基。戎單株抗體通常包括包含結合目標之多肽序列的抗體，其中藉由包括自複數個多肽序列選擇單個目標結合多肽序列之過私獲得目標結合多肽序列。舉例而言，選擇過程可為自複數個純系（諸如融合瘤純系池、噬菌體純系池或重組 DNA純系池）選擇獨特純系。應瞭解可進一步改變所選擇之目標結合序列，（例如）以改良對目標之親和力，使目桿結合序列人化，改良其在細胞培養中之產生，減少其在：體内之免疫原十生’產生多特異性抗體等，且包含經改變之目標結合序列的抗體亦為本發明之單株抗體。與通常包括針對不同決定子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，單株抗體製劑之各單株抗體針對—個抗原上之單個決定子。除特異性外，單株抗體製劑之優勢亦在於苴通常未受其他免疫球蛋白污染。修飾語,,單株"說明如自^ 質上同源之抗體群體獲得之抗體的特徵，且不應解釋為: 用要藉由任一特定方法產生抗體。例如，根據本發明欲待：用之單株抗體可由多種技術製備，該等技術包括（例 121445.doc -28- 200817435 合瘤法（例如 Kohler 等人，Nature, 256:495 (1975) ; Harlow 等人，Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press，第 2版 1988); Hammerling等人，在 Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-68 1 中，（Elsevier，N. Y·，1981))、重組DNA法（例如參見美國專利第4,816,567號）、噬菌體呈現技術（例如參見Clackson等人，Nature，352:624-628 (1991); Marks 等人，J. Mol·

Biol·，222:581-597 (1991); Sidhu 等人，J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee# A ^ J. Mol. Biol. 340(5):1073-

1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)及 Lee 等人，J· Immunol.

Methods 284(1-2):119-132 (2004))及用於在具有部分或所有編碼人類免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因座或基因的動物中產生人類或類人類抗體之技術（例如參見WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits等人，Proc. Natl· Acad. Sci. USA， 90:2551 (1993); Jakobovits 等人，Nature，362:255-258 (1993); Bruggemann等人，Year in Immuno·，7:33 (1993); 美國專利第 5,545,806 、5,569,825 、 5,591，669(所有 GenPharm)、5,545,807號、WO 1997/17852、美國專利第 5,545,807、5,545,806 > 5,569,825、5,625，126、5,633,425 及 5,661，016號；Marks 等人，Bio/Technology，10: 779-783 (1992); Lonberg 等人，Nature，368: 856-859 (1994);

Morrison，Nature，3 68: 8 12-813 (1994); Fishwild 等人， 121445.doc -29- 200817435

Nature Biotechnology, 14： 845-851 (1996); Neuberger,

Nature Biotechnology，14: 826 (1996);及 Lonberg 及 Huszar，Intern. Rev. Immunol·，13: 65_93 (1995))。非人類（例如鼠科動物）抗體之，，人化，，形式為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。一般，人化抗體為人類免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體高變區之殘基經具有所要特異性、親和力及能力之來自非人類物種 (諸如諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物）之高變區 (供體抗體）的殘基置換。在某些情況下，人類免疫球蛋白之構架區（FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人化抗體可包含未見於受體抗體或供體抗體中之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上所有序列，其中所有或實質上所有高變環與非人類免疫球蛋白之彼等序列相對應，且所有或實質上所有FR為人類免疫球蛋白序列之彼等序列區。人化抗體視情況亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區（Fc)，通常為人類免疫球蛋白之恆定區。進一步之詳情參見 Jones 等人，Nature 321:522-525 (1986);

Riechmann等人，Nature 332:323-329 (1988)及 Presta，Curr. Op. Struct. Biol· 2:593-596 (1992)。亦參見以下評論文章及其中引用之參考：Vaswani 及 Hamilton，Ann. Allergy， Asthma & Immunol. 1:105-1 15 (1998); Harris, Biochem. S〇c. Transactions 23 :1035· 1038 (1995); Hurle 及 Gross， Curr· Op· Biotech. 5:428-433 (1994)。 121445.doc -30- 200817435 π嵌合π抗體（免疫球蛋白）具有與自特定物種衍生或屬於特定抗體種類或子類之抗體中的對應序列一致或同源之一部分重鏈及/或輕鏈，而鏈之剩餘部分與自另一物種衍生或屬於另一抗體種類或子類之抗體中的對應序列一致或同源’以及該等抗體之片段’只要其展現所要生物活性即可 (美國專利第 4,816,567 號及 Morrison 等人，proc. Natl Acad· Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。如本文所用之人化抗體為嵌合抗體之子集。 π單鏈Fvn4nscFvn抗體片段包含抗體之vh及VL區，其中此荨域以早一多狀鍵存在。一般而言，scpv多狀進一步包含介於VH與VL域之間的多肽連接子，其使得％^能夠形成抗原結合所需之結構。關於scFv之評論參見 Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 中，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編輯，Springer-Verlag， New York，第 269-315頁（1994)。 n抗原”為抗體可選擇性地與之結合的預定抗原。把抗原可為多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其他天然存在或合成之化合物。靶抗原較佳為多肽。術語”雙功能抗體”係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段’該等片段包含連接至同一多肽鏈中輕鏈可變域（VL) 之重鏈可變域（VH)(VH-VL)。藉由使用過短而使得同一鏈上之兩個域無法配對的連接子，迫使該等域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更充分地描述於例如EP 404,097、WO 93/11161及11〇出吨61*等人， 121445.doc -31 - 200817435

Proc. Natl· Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993)中〇 ”人類抗體，，為具有與人類產生之抗體之胺基酸序列對應的胺基酸序列且/或已使用如本文所揭示之用於製造人類抗體之任何技術製得的抗體。此關於人類抗體之定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人化抗體。 "親和力成熟’’抗體為其一或多個CDR具有一或多處變化之抗體，與不具有彼等變化之親本抗體相比，該等變化使抗體對抗原之親和力得到改良。較佳親和力成熟抗體對靶抗原具有奈莫耳或甚至皮莫耳（pic〇m〇lar)之親和力。藉由此項技術中已知之程序產生親和力成熟抗體。Marks等人，Bio/Technology 10:779-783 (1992)描述由 VH及 VL域改組引起之親和力成熟。CDR及/或構架殘基之隨意突變由

Barbas等人Proc Nat. Acad. Sci，USA 91:3809-3813 (1994); Schier 等人 Gene 169:147-155 (1995); Yelton 等人 J. Immunol· 155:1994-2004 (1995); Jackson等人，J· immunol. 154(7):3310-9 (1995)及 Hawkins 等人，J· Mol· Biol. 226:889-896 (1992)描述。抗體’’效應功能”係指彼等可歸於抗體以區（天然序列Fc區或胺基酸序列變異Fc區）之生物活性且隨抗體同型而變的彼等生物活性。抗體效應功能之實例包括：Clq結合及補體依賴性細胞毒性、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC)、吞噬作用、細胞表面受體（例如B細胞受體）之下調及B細胞活化等。 ’’抗體依賴性細胞介導之細胞毒性”或” ADCC”係指細胞 121445.doc -32- 200817435 毒性之一種形式，其中所分泌之結合至存在在特定細胞毒性細胞（例如自然殺傷（NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞）上之Fc受體（FcR)的Ig使此等細胞毒性效應細胞特異性結合至負載抗原之靶細胞且隨後用細胞毒素殺死該靶細胞。抗體’’裝備”細胞毒性細胞且對於此殺傷而言為絕對需要的。用於介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcyRIII，而單核細胞表現FcyRI、FcyRII及FcyRIII。造血細胞上之 FcR 表現概述於 Ravetch 及 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9··457-92 (1991)第464頁表3中。為評估所關注分子之 ADCC活性，可實施活體外ADCC檢定，諸如美國專利第 5,500,362或5,821，337號或？^1&之美國專利第 6,737,056號中所述之檢定。適用於此等檢定之效應細胞包括外周血單個核細胞（PBMC)及自然殺傷（ΝΚ)細胞。或者或另外，可在活體内（例如動物模型中，諸如Clynes等人PNAS (USA) 95:652-65 6 (1998)中揭示之動物模型中）評估所關注分子之 ADCC活性。，，人類效應細胞”為表現一或多個FcR且實施效應功能之白細胞。該等細胞較佳至少表現FcyRIII且實施ADCC效應功能。介導ADCC之人類白細胞之實例包括外周血單個核細胞（PBMC)、自然殺傷（NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T 細胞及嗜中性白血球；其中PBMC及NK細胞為較佳。效應細胞可自例如血液之天然來源分離。

nFc受體”或”FcRn描述一種結合至抗體之Fc區的受體。較佳FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG 121445.doc -33- 200817435 抗體之受體（γ受體）且包括Fc^RI、Fc^RII及FqRIII子類之受體，其包括此等受體之等位基因變異體及替代性剪切形式。FcyRII受體包括FcYRIIA(’’活化受體’’）及FcyRIIB(n抑制受體π)，其具有主要在其細胞質域有不同之類似胺基酸序列。活化受體Fc^RIIA在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸活化基序（ITAM)。抑制受體FcyRIIB在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸抑制基序（ITIM)。（參見評論M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)) o FcR在 Ravetch 及 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel 等人，Immunomethods 4:25-34 (1994)及 de Haas 等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)中有評論。包括彼等欲待在未來識別者之其他FcR以術語’’FcR”涵蓋於本文中。該術語亦包括新生受體FcRn，其負責將母IgG轉移至胎兒（Guyer 等人，J. Immunol· 117:587 (1976)及 Kim等人， J· Immunol· 24:249 (1 994))且調節免疫球蛋白之穩定。 WO 00/42072 (Presta)描述對FcR具有改良或減低之結合的抗體變異體。該專利公開案之内容以引用的方式明確併入本文。亦參見Shields 等人 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。量測與FcRn結合之方法為已知的（例如參見Ghetie 1997, Hinton 2004)。可（例如）在表現人類FcRn之轉殖基因小鼠或經轉染之人類細胞株中或在投與Fc變異多肽之靈長類動物中檢定人類FcRn高親和力結合多肽與人類FcRn在活體内之結合及其血清半衰期。 121445.doc -34- 200817435 ”補體依賴性細胞毒性”或"CDC”係指靶細胞在補體存在下之溶解。藉由使補體系統（Clq)之第一組分結合至與同源抗原結合之抗體（為合適子類）開始典型補體路徑之活化。為評估補體活化，可實施CDC檢定，例如，如 Gazzano.Santoro 等人，J· Immunol Meth〇ds 2〇2:163 (1996)中所述。在美國專利第6，194,55131號及\^〇 99/51642中描述具有

改變之Fc區胺基酸序列及增強或減低之Clq結合能力的多肽變異體。該等專利公開案之内容以引用的方式明確併入本文亦參見 Idusogie 專人 J. lmmun〇i 164: 41 78-41 84 (2000)〇術語”包含Fc區之多肽”係指包含卜區之多肽，諸如抗體 f免疫黏附素（參見下文定義）。可例如在多肽純化期間或藉由重組工程化編碼多肽之核酸來移除以區之c末端離胺酸（根據EU編號系、统之殘基帽）。@此，包含本發明之具有Fc區之夕肽的組合物可包含具有之多肽、所有、乂移除之多肽或具有Κ447殘基與不具有κ447殘基之多肽的混合物。 Ρ斷抗體或”拮抗劑”抗體為抑制或降低所結合之抗原物〆舌欧的抗體。較佳阻斷抗體或拮抗劑抗體大體上或元全抑制抗原之生物活性。保:Π藥係指與急性模式相反以連續模式投與藥劑以非二作用(活性)持續長期時間。，’間歇，，投藥為並辦地連續進行而在本質上為循環之治療。 121445.doc -35- 200817435 π病症”或π疾病”為將受益於用本發明之物質/分子或方法治療之任何病症。其包括慢性及急性病症或疾病，包括使鸯乳動物傾向於罹患所論及之病症的彼等病理性病症。本文中欲治療之病症之非限制性實例包括惡性及良性腫瘤、癌、胚細胞瘤及肉瘤。術語”細胞增殖性病症”及，，增生性病症”係指與某種程度之異常細胞增殖相關之病症。在一實施例中，細胞增殖性病症為癌症。

如本文中所使用之”腫瘤，，係指所有贅生性細胞生長及增殖（無_惡性抑或良性）以及所有癌變前細胞及組織與癌細胞及組織。術語"癌症"、”癌的"、"細胞增瘦性病症"、”增生性病症’’及"腫瘤"如本文中所引述並非互相排斥。術語，，癌症"及"癌的，，係指或描述特徵通常為不受調控之細胞生長/增殖的喷乳動物體内之生理學病症。癌症實例包括(但不限於)：癌瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺之腺癌、肺之鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結μ 腸癌、子宮内膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝 ^ 一耵屈月癌、黑素瘤及各種類5L之碩頸癌。血管生成之失調 ^ 1 J W起多種病症，該等病症可糟由本發明之組合物及方法治此專病症包括非贅生性病症及贅生性病症。資生性生扃包括（但不限於）上述彼 121445.doc -36 - 200817435

非賛生性病症包括(但不限於)非所要或異常肥大、關類風濕性關節炎（RA)、牛皮癖、牛皮癖斑、結節病、動脈粥樣硬化症、動脈粥樣硬化斑、糖尿病性及其他增生性視網臈病（包括早熟性視網膜病）、晶狀體後纖維增生症、新生血管f光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、視網膜/脈絡膜新血管生成、眼角新血管生成(虹膜紅變）、眼新生血管疾病、也管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生（包料雷弗氏病（Grave，s disease))、角膜及其他組織^ 植、慢性炎症、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺動脈高壓、惡性肺部滲出、腦水腫（例如，與急性中

風/封閉式頭部損傷/創傷相關聯）、滑液炎、尺八中之血管翁形成、骨化性肌炎、肥厚性骨形成、骨關節炎（〇a)、難治性腹水、多囊性卵巢疾病、子宮内膜異位、第三間隔流體疾病（胰腺炎、間隔症候群、燒傷、腸病）、子宮纖維瘤、早產、慢性炎症（諸如IBD(克羅恩氏病（Cr〇hn，s disease)及潰瘍性結腸炎））、腎同種異體移植排斥、發炎性腸病、腎病症候群、非所要或異常組織大量生長（非癌）、血友病性關節病、肥厚性瘢痕、毛髮生長抑制、奥韋二氏症候群（Osier-Weber syndrome)、化膿性肉芽腫晶狀體後纖維增生症、硬皮病、顆粒性結膜炎、血管黏著、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液（諸如，與心包炎相關之彼病）及胸腔積液。 121445.doc -37- 200817435 本文所用《治療”係、指嘗試改變所治療之個體或細胞 =自=過程的臨床干預，且可為了預防或在臨床病理學過私中“。理想的治療效果包括預防疾病發作或復發、減輪症狀、減少疾病之任何直接或間接病理性後果、預防病灶轉移、降低疾病進展速率、改善或減緩疾病病況以及症狀緩解或預後改良。在某些實施財，抗制於延緩疾病或病症之發展。 ’’個體”為脊椎動物，較佳為哺乳動⑼，更佳為人類。哺乳^物包括（但不限於）家畜（諸如牛）、士吳樂動物、寵物（諸如鈿、犬及馬）、靈長類動物、小鼠及大鼠。為達成治療目#，，，哺乳動物，，係指歸類於哺乳動物之任何：物，包括人類、家畜與農畜及動物園動物、娛樂動物或歲物’諸如犬、卩、猶、牛等。哺乳動物較佳為人類。有效量”係指有效於達成所要治療或預防結劑量及時間之量。而物貝/刀子之’治療有效量”可根據諸如以下之因素而變化·個體之疾病病況、年齡、性別及體重以及物質/分子、促效劑或拮抗劑在個體巾引起所要反應之能力。治療有效量亦為治療有益效應超過物質/分子、促效劑或拮抗 d之任何毒性或有害效應的量。，，預防有效量”係指有效於達成所要預防結果所必需之劑量及時間之量。通常但並非 '、、而由於預防劑量係在疾病之前或早期階段用於受檢者’所以預防有效量將小於治療有效量。如本文所用之術語”細胞毒性劑”係指抑制或阻礙細胞功 121445.doc -38 - 200817435 能及/或致使細胞破壞之物質。術語意欲包括放射性同位素（例如 At211、I131、I125、Y9G、Rel86、Rel88、Sml53、

Bi212、P32及Lu之放射性同位素）；化學治療劑，例如甲胺喋呤（methotrexate)、阿黴素（adriamicin)、長春花生物鹼 (長春新鹼（vincristine)、長春驗（vinbiastine)、依託泊苦 (etoposide))、多柔比星（doxorubicin)、美法命 (melphalan)、絲裂黴素 C、苯丁酸氮界（chl〇rambucil)、柔紅黴素（daunorubicin);或其他嵌入劑、酶及其片段，諸如核分解酶、抗生素及毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素（包括其片段及/或變異體）及以下揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。其他細胞毒性劑描述於下文中。殺腫瘤劑導致腫瘤細胞之破壞。 π化學治療劑”為可用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括烧基化劑’諸如σ塞替派（thiotepa)及 CYTOXAN®環鱗醯胺（cyclosphosphamide);石黃酸烧g旨類，諸如白消胺（busulfan)、英丙舒凡（improsulfan)及派泊舒凡 (piposulfan);氮丙啶類，諸如苯幷多巴（benzodopa)、卡巴醌（carboquone)、麥曲多巴（meturedopa)及尤利多巴 (uredopa);伸乙基亞胺類及甲基三聚氰胺類，包括六曱蜜胺（altretamine)、三伸乙基三聚氰胺（triethylenemelamine)、三伸乙基填醯胺（triethylenephosphoramide)、三伸乙基硫代稱醯胺（triethiylenethiophosphoramide)及三經甲基三聚氰胺（trimethylolomelamine);乙醢生（acetogenin)類（尤其布拉他辛（bullatacin)及布拉他辛酮（bullatacinone)) ; δ·9- 121445.doc •39- 200817435 四氫大麻紛（曲大麻紛（dronabinol)，MARINOL⑧）；β-拉帕藏（beta-lapachone);拉帕醇（lapachol);秋水仙鹼 (colchicine);樺木酸（betulinic acid);喜樹驗 (camptothecin)(包括合成類似物拓樸替康（topotecan) (HYCAMTIN®) 、 CPT-11(伊立替康（irinotecan)，

CAMPTOSAR®)、乙醯喜樹鹼、斯可波萊辛（scopolectin) 及9-胺基喜樹驗）；苔蘚抑素（bryostatin);卡利他、汀 (callystatin) ; CC-1065(包括其阿多來新（adozelesin)、卡折來新（carzelesin)及比折來新（bizelesin)合成類似物）；鬼臼毒素（podophyllotoxin);足葉草酸（podophyllinic acid);替尼泊甙（teniposide);念珠藻環肽（cryptophycin)(尤其念珠藻環肽1及念珠藻環肽8);海兔毒素（dolastatin);多卡黴素 (duocarmycin)(包括合成類似物，KW-2189 及 CB1-TM1); 艾權塞洛素（eleutherobin);潘卡替他汀（pancratistatin); 沙科地辛（sarcodictyin);海锦素（spongistatin);氮芥劑 (nitrogen mustard)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芬 (chlornaphazine)、膽填酸胺（cholophosphamide)、雌莫司 >T (estramustine)、異環填醯胺（ifosfamide)、氮芬 (mechlorethamine)、氧化氮芥鹽酸鹽（mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖、新恩比興（novembichin)、苯芥膽甾醇（phenesterine)、潑尼莫司汀（prednimustine)、曲石粦胺（trofosfamide)、尿σ密σ定氮芥（uracil mustard);亞石肖基脲類（nitrosurea)，諸如卡莫司汀（carmustine)、氯脲菌素 (chlorozotocin)、福莫司汀（fotemustine)、洛莫司、;丁（lomustine)、 121445.doc -40- 200817435 尼莫司汀（nimustine)及拉努司汀（ranimnustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素（例如，刺孢黴素 (calicheamicin)，尤其刺孢黴素γΐΐ及刺孢黴素ΩΙ1)(參看例如，Agnew，Chem Inti. Ed. Engl·，33:183-186 (1994));達内黴素（dynemicin)，包括達内黴素A ;埃斯培拉黴素 (esperamicin);以及新製癌菌素發色團（neocarzinostatin chromophore)及相關色蛋白稀二炔類抗生素發色團，阿克萊諾黴素（aclacinomysin)、放線菌素（actinomycin)、奥瑟黴素（authramycin)、偶氮絲胺酸（azaserine)、博萊徽素 (bleomycin)、放線菌素 C(cactinomycin)、卡洛比星 (carabicin)、洋紅黴素（carminomycin)、嗔癌菌素 (carzinophilin)、色德：素（chromomycinis)、放線菌素 D (dactinomycin)、柔紅黴素、地托比星（detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®多柔比星（包括嗎琳基-多柔比星、氰基嗎琳基-多柔比星、2-吼洛琳基-多柔比星及脫氧多柔比星）、表柔比星（epirubicin)、依索比星（esorubicin)、伊達比星（idarubicin)、麻西羅黴素 (marcellomycin)、絲裂黴素（諸如絲裂黴素C)、黴酚酸 (mycophenolic acid)、諾拉黴素（nogalamycin)、橄欖黴素 (olivomycin)、培洛黴素（peplomycin)、博替羅黴素 (potflromycin)、嘌呤黴素（puromycin)、奎拉黴素 (quelamycin)、羅多比星（rodorubicin)、鏈黑黴素 (streptonigrin)、鏈佐星（streptozocin)、殺結核菌素 (tubercidin)、烏苯美司（ubenimex)、淨司他丁 121445.doc •41 - 200817435

(zinostatin)、佐柔比星（zorubicin);抗代謝物，諸如甲胺喋呤及5-氟尿嘧啶（5-FU);葉酸類似物，諸如迪諾特寧 (denopterin)、甲胺嗓呤、蝶羅呤（pteropterin)、三甲曲沙 (trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓 (fludarabine)、6-疏嗓呤、硫口米嗓吟（thiamiprine)、硫鳥口票吟（thioguanine)；哺唆類似物，諸如安西他濱 (ancitabine)、阿紮胞普（azacitidine)、6-氮尿普（6-azauridine)、卡莫氟（carmofur)、阿糖胞苦（cytarabine)、雙脫氧尿普（dideoxyuridine)、去氧尿普（doxifluridine)、依諾他濱（enocitabine)、氟尿苷（floxuridine);雄激素，諸如卡普睾酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮（dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄烧 (mepitiostane)、睾内酿（testolactone);抗腎上腺劑，諸如胺魯米特（aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、曲洛司坦（trilostane);葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡醛内酯 (aceglatone);酸麟醢胺糖皆（aldophosphamide glycoside); 胺基乙醯丙酸（aminolevulinic acid);乙炔尿嘴咬 (eniluracil);安吖口定（amsacrine);貝曲布辛（bestrabucil); 比生群（bisantrene);伊達曲仙（edatraxate);德弗法明 (defofamine);秋水仙胺（demecolcine);地吖酿（diaziquone); 伊弗尼辛（elfornithine);依利醋銨（elliptinium acetate);艾普塞隆（epothilone);依託格魯（etoglucid);硝酸鎵；羥基脲；蘑蒜多糖（lentinan);洛尼達寧（lonidainine);美登素類（maytansinoids)，諸如美登素（maytansine)及安絲菌素 121445.doc -42- 200817435

(ansamitocin)；米托脈腙（mitoguazone)；米托蒽酉昆 (mitoxantrone)；莫 σ比丹莫（mopidanmol);尼曲伊寧 (nitraerine);喷司他丁（pentostatin);蛋胺氮芥 (phenamet) ; σ比柔比星（pirarubicin); 洛索蒽酉昆 (losoxantrone) ； 2-乙基醯肼；丙卡巴肼（procarbazine); PSK® 多醣複合物（JHS Natural Products，Eugene，OR);雷佐生（razoxane);根瘤菌素（rhizoxin);西佐喃（sizoHran); 鍺螺胺（spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸（tenuazonic acid);三亞胺酉昆（triaziquone) ; 2,2’，2M-三氯三乙胺；單端孢黴稀族毒素（trichothecene)(尤其T-2毒素、威瑞素 A(verracurin A)、漆斑菌素A(roridin A)及蛇形菌素 (anguidine));烏拉坦（urethan);長春地辛（vindesine) (ELDISINE®、FILDESIN®);達卡巴嗪（dacarbazine);甘露莫司汀（mannomustine);二漠甘露醇（mitobronitol);二溴衛矛醇（mitolactol);略泊溴烧（pipobroman);瓜西托辛 (gacytosine);阿拉伯糖普（arabinoside)(f’Ara-Cn) ; σ塞替旅；紫杉醇類（taxoids)，例如TAXOL⑧紫杉醇（paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton， N.J.)、 ABRAXANE™-不含聚氧乙烯蓖麻油、紫杉醇之白蛋白工程化奈米顆粒調配物（American Pharmaceutical Partners， Schaimiberg，Illinois)及 TAXOTERE® 多西他賽（doxetaxel) (Rhone-Poulenc Rorer， Antony, France);氯萊布辛 (chloranbucil);吉西他賓（gemcitabine)(GEMZAR⑧）；6-硫鳥嘌呤；疏基嘌呤；甲胺嗓呤；翻類似物，諸如順始 121445.doc -43- 200817435 (cisplatin)及卡始（carboplatin);長春驗（VELBAN®);翻；依託泊苷（etoposide)(VP-16);異環磷醯胺（ifosfamide);米托蒽醌·（mitoxantrone);長春新驗（ONCOVIN®);奥沙利翻 (oxaliplatin);甲醯四氫葉酸（leucovovin);長春瑞賓 (vinorelbine)(NAVELBINE⑧）；諾凡特龍（novantrone);依達曲沙（edatrexate);道諾黴素（daunomycin);胺嗓呤 (aminopterin);伊班膦酸鹽（ibandronate);拓樸異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氟甲基鳥胺酸（DMFO);類視色素，諸如視黃酸；卡西他賓（capecitabine)(XELODA®);上述任何物質的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及兩種或兩種以上上述物質之組合，諸如CHOP(即環磷醯胺、多柔比星、長春新驗及潑尼龍（prednisolone)之組合療法的縮寫）及FOLFOX(即奥沙利鉑（ELOXATINTM)與5-FU及甲醯四氫葉酸組合之治療方案的縮寫）。此定義亦包括抗激素劑，其用於調控、降低、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素的作用且其常為全身性或整個身體治療之形式。其可為激素本身。實例包括抗雌激素劑及選擇性雌激素受體調節劑（SERM)，包括（例如）他莫昔芬 (tamoxifen)(包括 NOLVADEX⑧他莫昔芬）、EVISTA® 雷諾昔芬（raloxifene)、屈洛昔芬（droloxifene)、4-經基他莫昔芬、曲沃昔芬（trioxifene)、克沃昔芬（keoxifene)、 LY117018、奥那司酮（onapristone)及 FARESTON® 托瑞米芬（toremifene);抗孕酮劑；雌激素受體下調劑（ERD);用於抑制或阻止卵巢之藥劑，例如，黃體生成激素釋放激素 121445.doc -44- 200817435 (LHRH)促效劑，諸如LUPRON®及ELIGARD⑧乙酸亮丙瑞林（leuprolide acetate)、乙酸戈舍瑞林（goserelin acetate)、乙酸布舍瑞林（buserelin acetate)及曲皮瑞林（tripterelin); 其他抗雄激素劑，諸如氟他胺（flutamide)、尼魯胺 (nilutamide)及比卡魯胺（bicalutamide);及抑制調節腎上腺中之雌激素產生之芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如4(5)-味。坐、胺魯米特（aminoglutethimide)、MEGASE®乙酸甲地孕酮（megestrol acetate)、AROMASIN⑧依西美坦（exemestane)、福美綵坦（formestanie)、法屈唾（fadrozole)、RIVISOR® 伏羅 °坐（vorozole) 、 FEMARA® 來曲 °坐（letrozole)及 ARIMIDEX®安美達鍵（anastrozole)。此外，此化學治療劑定義包括雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽（clodronate)(例如， BONEFOS⑧或 OSTAC®) 、DIDROCAL® 依替膦酸鹽 (etidronate)、NE-58095、ΖΟΜΕΤΑ®σ坐來膦酸（zoledronic acid)/唑來膦酸鹽、FOSAMAX⑧阿俞膦酸鹽 (alendronate)、AREDIA® 帕米膦酸鹽（pamidronate)、 SKELID®替魯膦酸鹽（tiludronate)或ACTONEL®利塞膦酸鹽（risedronate);以及曲沙他濱（troxacitabine)(l，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物）；反義募核苷酸，尤其抑制涉及於異常細胞增殖之信號轉導路徑中之基因表現的彼等者，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體（EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如 ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗及VAXID⑧疫苗；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX⑧ 121445.doc • 45- 200817435 rmRH ’拉帕替尼二甲苯石黃酸鹽（iapatinib dit〇Syiate)(—種 ErbB-2及EGFR雙重酪胺酸激酶小分子抑制劑，亦稱為 GW5 72016);及上述物質中之任一者的醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。本文使用之’’生長抑制劑”係指活體外或活體内抑制細胞 (諸如表現DLL4之細胞）生長之化合物或組合物。因此，生長抑制劑可為顯著降低s相細胞（諸如表現01^4之細胞）之百刀比者。生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期進程（除s 相外之位置）之劑，諸如誘發G1停滯及Μ相停滯之劑。典 I Μ相阻斷劑包括長春花類（長春新鹼及長春驗）、紫杉烧 (taxanes)及II型拓撲異構酶抑制劑，諸如多柔比星、表柔比星、柔紅黴素、依託泊苷及博萊黴素。彼等阻滯⑴之劑亦外溢至S相停滯，例如0^^八烷基化劑，諸如他莫昔芬、潑尼松、達卡巴嗪、氮芥、順鉑、甲胺喋呤、5_氟尿嘧啶及 ara_C。另外資訊可見於 The Molecular Basis 〇f Cancer， Mendels〇hl1 and Israel，編輯，第}章，標題"CeU 巧士 regulation, oncogenes, and antineoplastic drugsf,, Murakami 等人（WB Saunders: Philadelphia, 1995)，尤其第 13頁。紫杉烷（紫杉醇及多烯紫杉醇）均為源自紫杉之抗癌藥物。源自歐洲紫杉之多烯紫杉醇（TAX〇TERE(g)，Rh〇ne_pQulene R r)為备、杉醇（TAXQL®，Bristol-Myers Squibb)之半合成，:物。紫杉醇及多烯紫杉醇促進由微管蛋白二聚體:裝微官且藉由防止解聚合來穩定微管，&導致細胞中有絲分裂之抑制。 121445.doc -46- 200817435 夕柔比生為恩環黴素抗生素。多柔比星之化學全名為 (10 胺基-2,3,6-三去氧來酥糖基-六吡喃糖基）氧]7,8,9，1〇_四氫·6,8，u_三羥基_8_(經基乙醯基甲氧基_5，12_幷四苯二酮。 P内新生血官疾病”為一種特徵為眼部新血管生成之疾病眼内新生血管疾病之實例包括（但不限於）增生性視網膜病、脈絡膜新血管生成（CNV)、年齡相關之黃斑退化 r (^糖尿病性及其他局部缺血相關之視網膜病、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、希林二氏病(一HiPpel- isease)、眼睛之組織漿菌病、視網膜靜脈阻塞，包括視網膜中央靜脈阻塞(CRV〇)、角膜新血管生成、視網膜新血管生成等。疾2之"病理"包括所有損害患者健康佳態之現象。對癌症而。，其包括(但不限於)異常或不可控制之細胞生長、轉移，干擾相鄰細胞之正常功能，釋放異常水平之細胞因子或其他分泌產物’抑制或惡化發炎或免疫反應等。與一或多種其他治療劑”組合”投與包括以任何次序同時 (並行）及連續投與。如本文所用之"載劑"包括醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或敎劑，其在所用之劑量及濃度τ對暴露於其之細胞或哺乳動物係無毒的。生理學上可接受之載劑常為爾衝水溶液。生理學上可接受之載劑之實例包括緩衝劑，諸如碟酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量（少於約10個殘基）之多狀·蛋白質，諸如血 121445.doc -47· 200817435 清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他破水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA ;糖醇，諸如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽之平衡離子，諸如鈉及/ 或非離子界面活性劑，諸如TWEENTM、聚乙二醇（PEG)及 PLURONICS™。 ’’脂質體π為由各種類型之脂質、磷脂及/或界面活性劑組成之小微脂粒，其適用於傳遞藥物（諸如DLL4多肽或其抗體）至哺乳動物。脂質體之組分通常排列為雙層形式，類似於生物膜之脂質排列。術語”VEGFn&’’VEGF-A”可互換使用，其係指165胺基酸血管内皮細胞生長因子及相關121、145、183、189及 206胺基酸血管内皮細胞生長因子（如Leung等人Science， 246:1306 (1989)，Houck 等人 Mol. Endocrin·， 5:1806 (1991)，及 Robinson 及 Stringer，Journal of Cell Science， 144(5):853-865 (2001)所述）以及其天然存在之等位基因及加工形式。 "VEGF拮抗劑”係指能夠中和、阻斷、抑制、中止、減少或干擾VEGF活性（包括與一或多個VEGF受體之結合）之分子。VEGF拮抗劑包括抗VEGF抗體及其抗原結合片段、特異性結合至VEGF藉此隔絕其結合至一或多種受體之受體分子及衍生物、抗VEGF受體抗體及VEGF受體拮抗劑，諸如VEGFR絡胺酸激酶之小分子抑制劑及融合蛋白，例如 121445.doc -48- 200817435 VEGF-Trap (Regeneron) 、 VEGF121-天堂果蛋白 (gelonin)(Peregrine)。VEGF拮抗劑亦包括VEGF之拮抗劑變異體、針對VEGF之反義分子、RNA適體及抗VEGF或 VEGF受體之核糖核酸酶。

，，抗VEGF抗體”為以足夠親和力及特異性結合至VEGF之抗體。抗VEGF抗體可用作靶向及干擾涉及VEGF活性之疾病或病症的治療劑。例如參見美國專利6,582,959、 6,703,020 ; WO 98/45332 ; WO 96/30046 ; WO 94/10202 ; WO 2005/044853 ; EP 0666868B1 ;美國專利申請案 20030206899、20030190317、20030203409、20050112126、 20050186208 及 20050112126 ; Popkov 等人，Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)及 WO 20050123 59。抗VEGF抗體通常並不結合其他VEGF同源物，諸如VEGF-B或VEGF-C，亦不結合其他生長因子，諸如P1GF、PDGF或bFGF。抗VEGF抗體”貝伐單抗（BV)"(亦稱為 ’’rhuMAb VEGF” 或，，Avastin®”）為一種根據 Presta 等人，Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)所產生之重組人化抗 VEGF單株抗體。其包含來自阻斷人類VEGF結合至其受體之鼠科動物抗hVEGF單株抗體A.4.6.1的突變人類IgGl構架區及抗原結合互補判定區。約93%之貝伐單抗胺基酸序列 (包括大部分構架區）係來源於人類IgG，且約7%之序列係來源於鼠科動物抗體A4.6.1。貝伐單抗具有約149,000道爾頓之分子質量且經糖基化。貝伐單抗及其他人化抗VEGF 抗體（包括抗VEGF抗體片段”蘭尼單抗（ranibizumab)’’，亦 121445.doc -49- 200817435 稱為”LUCentiS®”）在2005年2月26曰頒與之美國專利第 6,884,879號中有進一步描述。關於DLL4多肽之術語"生物活性"及"生物學上具活性"係指與DLL4相關之物理/化學性質及生物r力能。纟某些實施例中DLL4生物活性"包括以下—或多種：結合灿受體（例如 NotcM、Notch2、N〇tch3、N〇tch4)、活化 ν〇_ 受體及活化Noteh受體下游分子信號轉導。在本文巾，術語”調節”包括促進及抑制。〇

’’DLL4拮抗劑”係指能夠中和、阻斷、抑制、中止、減少或干擾DLL4活性（包括例如減少或阻斷^^…化受體活化、減少或阻斷Noteh受體下游分子信號轉導、破壞或阻斷ν〇灿受體結合DLL4及/或促進内皮細胞增殖及/或抑制内皮細胞分化及/或抑制動脈發育）之分子。DLL4拮抗劑包括抗體及其抗原結合片段、蛋白質、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多醣、寡醣、核酸、生物有機分子、肽模擬物、藥劑及其代謝物、轉錄及轉譯控制序列及其類似物。拮抗劑亦包括蛋白質之小分子抑制劑及融合蛋白、特異性結合至蛋白藉此隔絕其結合其目標之受體分子及衍生物、蛋白質之抬抗劑變異體、針對蛋白質之siRNA分子、針對蛋白質之反義分子、RNA適體及抗蛋白質之核糖核酸酶。在某些實施S 中，DLL4拮抗劑為結合至DLL4且中和、阻斷、抑制、中止、減少或干擾DLL4之生物活性的分子。在某些實施例中’ DLL4 #抗劑為結合至N〇tch受體（諸如N〇tchl、 Notch2、N〇tch3及/或Notch4)且中和、阻斷、抑制、中 121445.doc -50- 200817435 止、減少或干擾DLL4之生物活性的分子。在某些實施例中，DLL4拮抗劑調節DLL4相關效應之一或多個態樣，包括（但不限於）減少或阻斷Notch受體活化，減少或阻斷 Notch受體下游分子信號轉導，破壞或阻斷^^…仏受體結合至DLL4，及/或促進内皮細胞增殖，及/或抑制内皮細胞分化，及/或抑制動脈發育，及/或抑制腫瘤血管灌注，及/或治療及/或預防腫瘤、細胞增殖性病症或癌症，及/或治療或預防與DLL4表現及/或活性相關之病症，及/或治療或預防與Notch受體表現及/或活性相關之病症中的任一或多者。術語”抗贅生性組合物”係指適用於治療癌症之組合物，其包含至少一種活性治療劑（例如”抗癌劑”）。治療劑（抗癌劑，本文中亦稱”抗贅生性劑”）之實例包括（但不限於）例如化學治療劑、生長抑制劑、細胞毒性劑、放射療法中所使用之藥劑、抗血管生成劑、細胞凋亡劑、抗微管蛋白劑、毒素及其他用以治療癌症之藥劑，例如抗VEGF中和抗體、VEGF拮抗劑、抗HER-2、抗CD20、表皮生長因子受體（EGFR)拮抗劑（例如酪胺酸激酶抑制劑）、HER1/EGFR抑制劑、埃羅替尼（erlotinib)、C0X-2抑制劑（例如塞來考昔 (celecoxib))、干擾素、細胞因子、結合至ErbB2、ErbB3、

ErbB4或VEGF受體中之一或多者之拮抗劑（例如中和抗體）、血小板衍生生長因子（PDGF)及/或幹細胞因子（scf) 之受體酪胺酸激酶抑制劑（例如，伊馬替尼曱磺酸鹽 (imatinib mesylate)(Gleevec⑧ Novartis))、TRAIL/Ap〇2L及 121445.doc -51 - 200817435 其他生物活性藥劑及有機化學藥劑等。如本申請案中所用之術語”前藥”係指醫藥學上具活性之物質之刖驅⑯或衍生形A，其與親本藥物相丨，對腫瘤細胞的細胞毒性小，且能夠被酶促活化或轉化成活性更強之親本形式。例如參見 WUman，，，Pr〇drugs in Cancer Chemotherapy’，Biochemical s〇ciety Transacti〇ns，i4，第 375-382 頁，615th Meeting Belfast (1986)及 stella等人， fTrodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，” Directed Drug Delivery，B〇rchardt等人，（編輯），第 247-267 頁，Humana press (1985)。本發明之前藥包括（但不限於）含磷酸鹽之前藥、含硫代磷酸鹽之前藥、含硫酸鹽之前藥、含肽之前藥、經D_胺基酸修飾之前藥、經糖基化之前藥、含β_内醯胺之前藥、視情況經取代之含苯氧基乙醯胺之前藥或視情況經取代之含苯乙醯胺之前藥、5_氟胞嘧啶及其它可轉化成更具活性之無細胞毒性之藥物的5-氟尿苷前藥。可衍生為適用於本發明之前藥形式之細胞毒性藥物的實例包括（但不限於）上述彼等化學治療劑。血管生成因子或血管生成劑”為刺激血管發育之生長因子，例如促進血管生成、内皮細胞生長、血管穩定及/或血官發生等之生長因子。舉例而言，血管生成因子包括 (但不限於）例如VEGI^VEGF家族之成員、plGF、家族、纖維母細胞生長因子家族（FGF)、TIE配位體（血管生成素）、ephrin、ANGPTL3、DLL4等。亦會包括加速傷 121445.doc -52- 200817435 口癒合之因子，諸如生長激素、類胰島素生長因子I(IGF-I)、VIGF、表皮生長因子（EGF)、CTGF及其家族成員，以及 TGF-α及 TGF-β。例如參見 Klagsbrun及 D’Amore，Annu· Rev. Physiol.，53:217-39 (1991); Streit及 Detmar，Oncogene， 22:3 172-3179 (2003); Ferrara 及 Alitalo，Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999); Tonini等人，Oncogene，22:6549-6556 (2003)(例如表1列出血管生成因子）及Sato Int. J. Clin. Oncol·，8:200-206 (2003)。 ’’抗血管生成劑n或’’血管生成抑制劑”係指直接或間接抑制血管生成、血管發生或非所要之血管通透性的小分子量物質、多核苷酸（包括例如抑制性RNA (RNAi或siRNA))、多肽、經分離蛋白、重組蛋白、抗體或其共軛物或融合蛋白。舉例而言，抗血管生成劑為如上文所定義之血管生成劑之抗體或其他拮抗劑，例如抗VEGF之抗體、抗VEGF受體之抗體、阻斷VEGF受體信號轉導之小分子（例如 PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT®/SU11248(舒尼替尼蘋果酸鹽（sunitinib malate))、AMG706或例如國際專利申請案WO 2004/113 304中描述之彼等者）。抗血管生成劑亦包括天然血管生成抑制劑，例如血管抑制素、内皮抑制素等。例如參見 Klagsbrun及 D’Amore，Annu· Rev· Physiol” 53:217-39 (1991); Streit及 Detmar，Oncogene，22:3172-3179 (2003)(例如，表3列出惡性黑素瘤之抗血管生成療法）；

Ferrara及 Alitalo，Nature Medicine 5(12):1359-1364 (1999);

Tonini 等人，Oncogene，22:6549-6556 (2003)(例如表 2列出 121445.doc -53- 200817435 抗血管生成因子）；及Sat0 Int. L Clin 〇n⑶h，8:2〇〇德 (2003)(例如表i列出臨床試驗中所使用的抗血管生成劑）。本發明之方法及組合物本發明部分係基於發現可藉由用調節Notch受體路徑之類δ4(可互換地稱為”DLL4”）活化的藥劑治療來抑制血管發育。用DLL4拮抗劑治療導致維管結構（包括腫瘤維管結構）中增加之内皮細胞（EC)增殖、不當之内皮細胞分化及不當之動脈發育。明顯地，用抗〇乙乙4抗體治療導致若干不同癌症中腫瘤生長受到抑制。不受理論束縛，咸信增加之ec 增殖及削弱之EC分化導致不當之腫瘤血管功能，導致腫瘤生長受到抑制。因此，咸信DLL4拮抗劑證實了一種用於治療癌症之廣泛有效的方法。口此本發明k供用於調節（例如促進或抑制）涉及血管生成之過私且用於靶向與血管生成相關之病理性病症（諸如癌症）之方法、組合物、套組及製造物品。咸預期’根據本發明，DLL4調節劑及/或DLL4調節劑與其他治療劑之組合可用於治療各種病症。因此’本發明涵盍用於抑制血管生成之方法，該等方法係使用有效量之DLL4拮抗劑（諸如抗DLL4抗體或DLL4免疫黏附素）來抑制DLL4活化Notch受體（諸如Notchl、 N〇tCh2、N〇tch3及/或Notch4)。在另一態樣中，本發明提供用於抑制血管生成之方法，該等方法包含將有效量之 DLL4拮抗劑投與需該治療之受檢者。在某些實施例中， DLL4抬抗劑能夠促進内皮細胞增殖、抑制内皮細胞分 121445.doc -54- 200817435 I /主。在另一態樣中，、抑制内皮細胞分化、化、抑制動脈發育及/或減少血管灌注本發明提供用於刺激内皮細胞增殖、拆抑制動脈發育及/或抑制腫瘤血管灌注之方法，該等方去包含將有效量之DLL4拮抗劑投與需該治療之受檢者。欲以DLL4拮抗劑（諸如抗〇1^4抗體）治療之贅生性病症之實例包括（但不限於）本文在俶铥”虛右，ltt ,,、☆

炎、類風濕性關節炎（RA)、牛皮癖、牛皮癬斑、肥大、關節、結節病、動脈粥樣硬化症、動脈粥樣硬化斑、心肌梗塞之水腫、糖尿病性及其他增生性視網膜病（包括早熟性視網膜病）、晶狀體後纖維增生症、新生血管青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血官生成、角膜移植排斥、視網膜/脈絡膜新血管生成、眼角新血管生成（虹膜紅變）、眼新生血管疾病、血管再狹窄、動靜脈畸形（AVM)、腦脊膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生（包括格雷弗氏病）、角膜及其他組織移植、k性炎症、肺炎、急性肺損傷/ ARDS、敗血症、原發性肺動脈高壓、惡性肺部滲出、腦水腫（例如，與急性中風/封閉式頭部損傷/創傷相關聯）、滑液炎、RA中之血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚性骨形成、骨關節炎（〇A)、難治性腹水、多囊性卵巢疾病、子宮内膜異位、第三間隙流體疾病（胰腺炎、間隔症候群、燒傷、腸病）、子宮纖維瘤、早產、k性炎症（諸如IBD(克羅恩氏病及潰瘍性結腸 121445.doc -55- 200817435 炎））、腎同種異體移植排斥、發炎性腸病、腎病症候群、非所要或異常組織大量生長（非癌）、肥胖症、脂肪組織大里生長、血友病性關節病、肥厚性瘢痕、毛髮生長抑制、奥韋症候群、化膿性肉芽腫晶狀體後纖維增生症、硬皮病、顆粒性結膜炎、血管黏著、滑膜炎、皮炎、先兆子癇、腹水、心包積液（諸如，與心包炎相關聯之彼病）及胸腔積液。欲用DLL4拮抗劑（諸如抗DLL4抗體）治療之病症 ^ 的其他實例包括上皮或心臟病症。 DLL4凋喊劑（例如DLL4促效劑或活化劑）可用於治療病理性病症。在某些實施例中，DLL4調節劑（例*dll4促效劑）可用於治療需要抑制血管生成之病理性病症。〇1^4調即劑（例如DLL4促效劑）亦可用於治療需要血管生成或新血管生成及/或肥大之病理性病症，該等病症包括（但不限於）例如血管外傷、傷口、裂口、切口、燒傷、潰瘍(例如糖尿病性/貝瘍、壓力性潰瘍、血友病性潰癌、靜脈曲張性潰〔瘍）、組織生長、體重增加、周邊動脈疾病、誘發陣痛、毛髮生長、大皰性表皮鬆弛症、視網臈萎縮症、骨折、骨脊柱融合、半月板撕裂等。組合療法如上文指出，本發明提供與另一療法一起投與dll4拮抗劑（諸如抗DLL4抗體）或DLL4促效劑之組合療法。舉例而言，將DLL4拮抗劑與抗癌劑或抗灰管生成劑組合使用以治療各種贅生性或非贅生性病症。在—實施例中’該贊生性或非贅生性病症之特徵為與異常或非所要之血管生成 121445.doc • 56 - 200817435 相關的病理性病症。說4拮抗劑可連續地或與有效於達成彼等目的之其他藥劑組合H組合物或作為獨立电合物之形式投與。或者或料，可投與耻4之多劑。卞DLL4拮抗劑（或DLL4促效劑）及另一治療劑（例如抗癌劑、抗血管生成劑）之投與可同時進行，例如作為單一組合物或作為兩種或兩種以上不同組合物使用相同或不同投藥途徑來投與。或者或另外，投藥可以任何次序相繼：仃。或者或另外，步驟可呈任何次序以連續與同時之組合的形式實施。 ^ 在某些實施例中，兩種或兩種以上組合物之投藥之間可存在分鐘至天至週至月之範圍内之時間間隔。舉例而言，抗癌劑可首先投與，接著投與DLL4拮抗劑。然而，亦涵蓋同時投與或首先投與DLL4拮抗劑。因此，在一態樣中本务明&供包含投與DLL4拮抗劑（諸如抗DLL4抗體）接著投與抗血管生成劑（諸如抗VEGF抗體）之方法。在某些實施例中’兩種或兩種以上組合物之投藥之間可存在分鐘至天至週至月之範圍内之時間間隔。與DLL4拮抗劑（或DLL4促效劑）組合投與之治療劑之有效量應由醫師或獸醫判斷。進行劑量投與及調節以達成對待治療之病症的最大控制。此外，劑量應視諸如欲使用之治療劑之類型及所治療之特定患者的因素而定。抗癌劑之適合劑量為目前使用之彼等劑量且歸因於抗癌劑及DLL4 拮抗劑之組合作用（協同作用），劑量可降低。在某些實施 121445.doc •57- 200817435 例中，抑制劑之組合加強單一抑制劑之功效。術語’’加強π 係指治療劑在通用或認可劑量下之功效得到改良。亦參見本文中標題為醫藥組合物之部分。 DLL4拮抗劑及抗癌劑通常適用於相同或類似疾病以阻斷或減少病理性病症，諸如腫瘤、癌症或細胞增殖性病症。在一實施例中，抗癌劑為抗血管生成劑。與癌症相關之抗血管生成治療為旨在抑制提供營養以支持腫瘤生長所需之腫瘤血管發育的癌症治療策略。因為血管生成涉及原發性腫瘤生長與轉移，所以由本發明所提供之抗血管生成治療能夠抑制腫瘤在原發位點處之贅生性生長，以及預防腫瘤在繼發位點處之轉移，從而容許藉由其他治療劑破壞腫瘤。多種抗血管生成劑已得以鑑別且在此項技術中為已知的，該等抗血·管生成劑包括本文中所列之彼等物，例如，在定義項下所列之彼等物，以及例如Carmeliet及Jain， Nature 407:249-257 (2000) ; Ferrara 等人，Nature

Reviews:Drug Discovery，3:391-400 (2004)及 Sato Int. J. Clin. Oncol·，8:200-206 (2003)中所歹ij之彼等物。亦參見美國專利申請案US 20030055006。在一實施例中，將DLL4 拮抗劑與抗VEGF中和抗體（或片段）及/或另一 VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑（包括（但不限於）例如可溶性VEGF受體 (例如 VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神經纖毛蛋白 (neuropilin)(例如 NRP1、NRP2))片段、能夠阻斷 VEGF 或 VEGFR、中和抗VEGFR抗體之適體、VEGFR酪胺酸激酶 121445.doc -58- 200817435 (RTK)之低分子量抑制劑、VEGF之反義策略、抗VEGF或 VEGF受體之核糖核酸酶、VEGF之拮抗劑變異體及其任何組合）組合使用。或者或另外，除了 VEGF拮抗劑及其他藥 WJ以外，可視情況將兩種或兩種以上血管生成抑制劑共投與患者。在某些實施例中，一或多種額外治療劑（例如抗癌劑）可與DLL4拮抗劑、VEGF拮抗劑及抗血管生成劑組合投與。在本發明之某些態樣中，適用於與〇1^4拮抗劑（或dll4 促效劑）組合治療腫瘤之其他治療劑療法包括其他癌症療法（例如，外科手術、放射性治療（例如涉及輻照或投與放射性物質）、化學療法、本文中所列舉及此項技術中已知之用抗癌劑之治療或其組合）。或者或另外，可將本文所揭示之結合相同或兩種或兩種以上不同抗原的兩種或兩種以上抗體共投與患者。有時，亦將一或多種細胞因子投與患者可為有利的。化學治療劑在一態樣中，本發明提供—種藉由投與有效量之dll4 拮抗劑（或DLL4促效劑）及/或血管生成抑制劑及一或多種化學治療劑來治療一病症(諸如腫瘤、癌症或細胞增殖性 :症)之方法。本發明之組合治療方法中可使用多種化學 °所涵蓋之化學治療劑之例示性及非限制性列表提定…：_拮抗劑及化學治療劑之投上 _ τ列如作為早—組合物或作為兩種或兩種以 5 °物使用相同或不同投藥途徑來投與。或者或另 121445.doc -59- 200817435 外，投藥可以任何次序相繼進 J A者或另外，投藥可以任何次序相繼進行。或去式丁次者或另外，步驟可呈任何次序以連續與同時之組合的形式實施。在某些實施例中，兩種或兩種以上組合物之投藥之間可存在分鐘至天至週至月之範圍内之時間間隔。舉例而古，$音止牛1 J句口可百先投與化學治療劑，接著投與DLL4括抗劑。然而’亦涵蓋同時投與或首先投與 DLL4拮抗劑。因&，在一態樣中’本發明提供包含投與

DLL4拮抗劑（諸如抗邮4抗體）接著投與化學治療劑之方法。在某些實施例中’兩種或兩種以上組合物之投藥之間可存在分鐘至天至週至月之範圍内之時間間隔。、如H打者應瞭解，化學治療劑之適當劑量應一般約為已用於臨床療法中之彼等劑量，其中將化學治療劑單獨 =投與或與其他化學治療劑組合投與。視所治療之病症而定應可此存在劑量變化。施行治療之醫師應能夠確定個別受檢者之適當劑量。復發性腫瘤生長本發明亦提供用於抑制或預防復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長之方法及組合物。復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長用於描述一種病症，其中患者正經歷或經一或多種現行療法（例如癌症療法，諸如化學療法、放射療法、外科手術、激素療法及/或生物學療法/免疫療法、抗VEGF 抗體療法’尤其針對特定癌症之標準治療方案）治療，該等療法在臨床上不足以治療該等患者，或該等患者自療法中未再收到任何有盈效果，使得此等患者需要其他有效療 121445.doc -60- 200817435 :::本文所用之該短語亦可指”無反應/難治”之患者之病如其描述對治療起反應但遭受副作用、顯現耐藥、療不起反應、對治療無法令人滿意地起反應等的在各種κ知例中’癌症為復發性

癌細胞生長，其中癌細胞之數量未顯著減少或已增加，或腫瘤大小未顯著減少或已增加，或大小或癌細胞數量無法進:步減少。藉由此項技術中已知之用於檢定治療癌細胞有效性的任何方法(在該背景中使用"復發性”或"難治”或 "曰無反應:之技術公認含義），可活體内或活體外測定癌細胞疋否為復《f生腫瘤生長或為復發性癌細胞生長。對抗 VEGF治療有抗性之腫瘤為復發性腫瘤生長之實例。本發明提供阻斷或減少受檢者體内復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長之方法，該等方法藉由投與—或多種 DLL4拮抗劑（或DlL4促效劑）來阻斷或減少受檢者體内復發性腫瘤生長或復發性癌細胞生長。在某些實施例中，拮抗劑可在癌症治療劑之後投與。在某些實施例中，說4 拮抗劑可與癌症療法同時投與。或者或另外，dll4拮抗劑療法與另一癌症療法交替，此可以任何次序實施。本發明亦涵盍投與一或多種抑制性抗體以預防傾向於患有癌症之患者體内的癌症發作或復發之方法。一般而言，受檢者同時正經歷癌症治療。在一實施例中，癌症治療用抗血管生成劑（例如VEGF拮抗劑）治療。抗血管生成劑包括此項技術中已知之彼等物及見於本文中定義項下之彼等物。在一實施例中，抗血管生成劑為抗VEGF中和抗體或片段（例如 121445.doc -61 - 200817435 人化 A4.6.1、AVASTIN® (Genentech，South San Francisco, CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3 等）。例如參見美國專利 6,582,959、6,884,879、6,703,020 ; WO 98/45332 ； WO 96/30046 ； WO 94/10202 ; EP 0666868B1 ;美國專利申請案 20030206899 、 20030190317 、 20030203409及20050112126 ; Popkov等人，Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)及WO 2005012359。額外藥劑可與VEGF拮抗劑及 DLL4拮抗劑組合投與以阻斷或減少復發腫瘤生長或復發癌細胞生長，例如參見本文中標題為組合治療之部分。 DLL4 DLL4為跨膜蛋白。其胞外區含有8個類EGF重複以及在所有Notch配位體中保守且為受體結合所必需之DSL域。該預測蛋白亦含有跨膜區及缺乏任何催化基元之細胞質尾。人類DLL4蛋白為685胺基酸蛋白且含有下列區：信號肽（胺基酸1-25) ; MNNL(胺基酸26-92) ; DSL(胺基酸155· 217);類 EGF(胺基酸 221-251);類 EGF(胺基酸 252-282); 類EGF(胺基酸284-322);類EGF(胺基酸324-360);類 EGF(胺基酸 366-400);類 EGF(胺基酸 402-438);類 EGF(胺基酸440-476);類EGF(胺基酸480-518);跨膜（胺基酸529-551);細胞質域（胺基酸552-685)。DLL4核酸及胺基酸序列在此項技術中為已知的且在本文中作進一步討論。編碼 DLL4之核酸序歹》J可使用DLL4之所要區域之胺基酸序歹來設計。或者，可使用DLL4之cDNA序列（或其片段）。人類 DLL4之寄存編號為NM_019074，且小鼠DLL4之寄存編號 121445.doc -62- 200817435 為 NM一019454。 DLL4結合Notch受體。進化保守Notch路徑為多個發育過程以及出生後自我更新之器官系統的關鍵調節物。自無脊椎動物至哺乳動物，Notch信號轉導經由無數細胞命運決定引導細胞且影響增殖、分化及細胞凋亡（Miele及 Osborne，1999)。Notch家族由結構上保守之細胞表面受體組成，該等細胞表面受體藉由DSL基因家族之膜結合配位體（稱為來自果蠅之Delta及Serrate及來自線蟲之Lag-2)活化。哺乳動物具有4個受體（Notchl、Notch2、Notch3、 Notch4)及 5 個配位體（Jagl、Jag2、DLL1、DLL3 及 DLL4) 〇 —旦為存在於鄰近細胞上之配位體活化後，Notch 受體經歷連續蛋白質裂解。此導致Notch胞内域（NICD)釋放，該Notch胞内域移位至核中且與DNA結合蛋白（RBP-Jk，亦稱為CSL[針對CBFl/Su(H)/Lag-l])及其他轉錄輔因子形成轉錄複合物。Notch活化之主要靶基因包括HES (Hairy/Enhancer of Split)基因家族及HES相關之基因 (Hey、CHF、HRT、HESR)，接著彼等基因以組織及細胞型特異性方式調節下游轉錄效應（Iso等人，2003; Li及 Harris, 2005) ° DLL4調節劑 DLL4調節劑為調節DLL4活性之分子，例如促效劑及拮抗劑。術語’’DLL4促效劑”用於指DLL4之肽及非肽類似物 (諸如本文中所述之多聚化DLL4)及具有經由天然Notch受體（例如 Notchl、Notch2、Notch3、Notch4)轉導信號之能 121445.doc -63- 200817435 力的其他劑。術語π促效劑’’在Notch受體之生物作用的内容下定義。在某些實施例中，促效劑具有如上定義之 DLL4之生物活性，諸如結合Notch受體（例如Notchl、 Notch2、Notch3、Notch4)、活化 Notch受體及活化 Notch受體下游分子信號轉導。在某些實施例中，DLL4促效劑抑制内皮細胞增殖，促進細胞分化及/或促進動脈發育。在某些實施例中，DLL4促效劑抑制血管發育。 DLL4調節劑在此項技術中為已知的且某些調節劑在本文中描述並例示。所涵蓋之DLL4拮抗劑（諸如抗DLL4抗體及DLL4免疫黏附素）之例示性及非限制性列表提供於本文中之π定義π項下。藉由此項技術中已知之各種檢定可表徵適用於本發明之調節劑的物理/化學性質及生物功能。在某些實施例中，表徵DLL4拮抗劑之以下特徵中之任一或多個特徵：與 DLL4之結合，結合至Notch受體，減少或阻斷Notch受體活化，減少或阻斷Notch受體下游分子信號轉導，破壞或阻斷Notch受體結合DLL4，及/或促進内皮細胞增殖，及/ 或抑制内皮細胞分化，及/或抑制動脈分化，及/或抑制腫瘤血管灌注，及/或治療及/或預防腫瘤、細胞增殖性病症或癌症，及/或治療或預防與DLL4表現及/或活性相關聯之病症，及/或治療或預防與Notch受體表現及/或活性相關之病症。在某些實施例中，表徵DLL4促效劑之以下特徵中之任一或多個特徵：結合Notch受體（例如Notchl、 Notch2、Notch3、Notch4)，活化Notch受體，活化Notch受 121445.doc -64- 200817435 體下游分子信號轉導，抑制内皮細胞增殖，促進内皮細胞分化，及/或促進動脈發育。用於表徵DLL4拮抗劑及促效劑之方法在此項技術中為已知的且某些已在本文描述及例示。抗體 DLL4抗體在此項技術中為已知的且在本文中描述及例示某些DLL4抗體。抗DLL4抗體較佳為單株抗體。本文中所提供之抗DLL4抗體的Fab、Fab’、Fab’-SH及F(ab，）2片段亦涵蓋在本發明之範疇内。可藉由傳統方式（諸如酶消化）來形成或可藉由重組技術來產生此等抗體片段。該等抗體片I又可為肷合抗體或人化抗體。此等片段適用於以下闡述之診斷及治療目的。卓株抗體係自實質上同源之抗體群體獲得，亦即，除了可此會以微篁存在之可能之天然存在的突變外，該群體包含之個別抗體為一致的。因此修_語”單株”說明該抗體之特徵為其並非分離抗體之混合物。抗DLL4單株抗體最先可使用融合瘤方法（由K〇hier等· 人，Nature, 256:495 (1975)描述）製得，或可藉由重組dn a 法製得（美國專利第4,816,567號）。在融合瘤方法中，使小鼠或其他適合宿主動物（諸如倉氣）免疫以引出產生或能夠產生應特異性地結合至免疫所用之蛋白質之抗體的淋巴細胞。一般在動物體内藉由多次皮下（sc)或腹膜内（ip)注射DLL4及佐劑來形成DLL4抗體。可使用此項技術中熟知之方法製備DLL4，其中一些方法 121445.doc -65- 200817435 在本文中作進一步描述。舉例而言，DLL4之重組產生描述於下文中。在一實施例中，將動物用含有與免疫球蛋白重鏈之Fc部分融合之DLL4胞外域（ECD)的DLL4衍生物免疫。在一較佳實施例中，將動物ffiDLL4_IgG1融合蛋白免疫。通常用單磷醯脂質A(MpL)/海藻糖二黴菌酸酯（tdm) 使動物免疫以抵抗免疫原性DLL4共軛物或衍生物（Ribi

Immimochem· Research，lnc·，Hamilton，MT)，且在多個位點皮内注射溶液。兩週後加強注射動物。7至丨4天後，對動物抽血且分析血清之抗DLL4效價。加強注射動物直至效價曲線平穩。或者，可在活體外使淋巴細胞免疫。接著使用諸如聚乙二醇之適合融合劑使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞（Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，第 59_1〇3 頁（Academic press，1986))。在較佳含有抑制未融合之親本骨髓瘤細胞生長或存活之一或多種物質的適合培養基中接種如此製備之融合瘤細胞且使其生長。舉例而言，若親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRt或hprt)，則融合瘤培養基通常將包括次黃嘌呤、胺蝶呤及胸苷（HAT培養基），該專物質防止HGPRT缺乏之細胞的生長。較佳骨趙瘤細胞為彼等有效融合、藉由所選擇之產生抗體之細胞支持抗體穩定高水平產生的骨髓瘤細胞，且其對諸如HAT培養基之培養基敏感。其中，較佳骨髓瘤細胞株為鼠科動物骨髓瘤細胞株，諸如彼等源自可自仏仏 121445.doc •66- 200817435

Institute Cell Distribution Center，San Diego，California US A得到之MOPC-21及MPC -11小鼠腫瘤以及可自American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA得到之 SP-2或X63-Ag8-653細胞的細胞株。亦已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株 (Kozbor，J· Immunol·，133:3001 (1984); Brodeur等人， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51-63 頁（Marcel Dekker，Inc.，New York， 1987))。檢定生長融合瘤細胞之培養基中針對DLL4之單株抗體之產生。較佳藉由免疫沈澱反應或藉由諸如放射免疫檢定 (RIA)或酶聯結免疫吸附檢定（ELISA)之活體外結合檢定測定由融合瘤細胞產生之單株抗體的結合特異性。可例如藉由 Munson 等人，Anal· Biochem·，107:220 (1980)之斯卡查德分析（Scatchard analysis)來測定單株抗體之結合親和力。在鑑定融合瘤細胞產生具有所要特異性、親和力及/或活性之抗體後，可藉由限制性稀釋程序對純系進行次選殖且藉由標準方法使其生長（Goding，Monoclonal Antibodies: Principles and Practice，第 59-103 頁（Academic Press， 1986))。用於此目的之適合培養基包括例如D-MEM或 RPMI-1640培養基。此外，融合瘤細胞可如動物中腹水腫瘤在活體内生長。藉由諸如蛋白A-瓊脂糖、羥磷灰石層析法、凝膠電泳 121445.doc -67- 200817435 法、透析法或親和層析法之習知免疫球蛋白純化程序將由次純系分泌之單株抗體自培養基、腹水或血清適當地分離。可藉由使用組合文庫來製得抗DLL4抗體以篩檢具有所需活性之合成抗體純系。原則上，藉由篩檢呈現融合至噬菌體鞘蛋白之抗體可變區之（FV)各種片段的含有噬菌體之嗟菌體文庫來選擇合成抗體純系。藉由對所需抗原進行親和層析而淘選此荨嗟菌體文庫。使表現能夠與所需抗原結合之Fv片段的純系吸附至抗原，且因此與文庫中之非結合性純系分離。隨後，使結合純系自抗原溶離，且可藉由額外之抗原吸附/溶離循環而進一步富集該等結合純系。可猎由e又汁合適抗原師檢程序獲得任一抗DLL4抗體以選擇所關注之噬菌體純系，接著使用來自所關注噬菌體純系之 Fv 序列及 Kabat 等人，Sequences of Proteins of

Immunological Interest，第 5版，NIH Publication 91-3242,

Bethesda MD (1991)，1-3卷中所述之適合恆定區（Fc)序列來建構全長抗D L L 4抗體純系。抗體之抗原結合域由具有約11 〇個胺基酸之兩個可變（V) 區形成，該兩個可變區各來自輕鏈（VL)及重鏈（VH)，二者皆呈現三個高變環或互補判定區（CDR)。可變域可功能性地呈現於嗤菌體上，如單鏈Fv(scFv)片段，其中vh及VL 經由具有可撓性之短肽共價連接，或如Fab片段，其中其各自融合至恆定域且非共價地相互作用，此如Winter等人，Ann. Rev. Immunol.，12:433-455 (1994)所述。如本文 121445.doc -68- 200817435 所用，編碼噬菌體純系之ScFv及編碼噬菌體純系之Fab統稱為”Fv噬菌體純系，，或”Fv純系”。 VH及VL基因譜系可藉由聚合酶鏈反應（pCR)而分離選殖且隨機重組於噬菌體文庫中，接著可搜尋其中之結合抗原之純系，如Winter等人，Arm· Rev· Immun〇1，12:433_455 (1994)中所述。來自經免疫之來源之文庫無需建構融合瘤即提供對免疫原具高親和力之抗體。或者，如Griffhhs等人，EMBO J，12:725-734 (1993)所述，可選殖天然譜系以在無任何免疫之情況下提供單一來源之人類抗體至各種非自身以及自身抗原。最終，亦可藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因區段且利用含有隨機序列之pCR引子來編碼高度可變之CDR3區且實現活體外重排而合成性地建立天然文庫，如 Hoogenboom 及 Winter，J· Mol· Biol·，227:381-388 (1992)所述。藉由融合至次要鞘蛋白pIII，將絲狀噬菌體用於呈現抗體片段。抗體片段可呈現為單鏈FV片段，其中又]^與乂[域藉由可撓性多肽間隔基連接於同一多肽鏈上，如Marks等人，J. Mol_ Biol·，222:581_597(1991)所述；或呈現為片段，其中使一鏈與pill融合而使另一鏈分泌入細菌宿主細胞周質内，在周質内藉由置換一些野生型鞘蛋白組裝呈現於噬菌體表面上的Fab-鞘蛋白結構，例如，如

Hoogenboom·# 人，Nucl· Acids Res·，19:4133-4137 (1991) 中所述。一般而言，編碼抗體基因片段之核酸係自獲自人類或動 121445.doc -69- 200817435 物之免疫細胞獲得。若需要偏利於抗DLL4純系之文庫，則用DLL4使X檢者免疫以產生抗體反應，且回收脾細胞及/或循環B細胞、其他外周血淋巴細胞（pBL)用於文庫之建構。在-較佳實施例中，偏利於抗說4純系之人類抗體基因>!段文庫係藉由在攜帶功能性人類免疫球蛋白基因陣列（且缺乏功能性内源性抗體產生系統）之轉殖基因小鼠中產生抗DLL4抗體反應以使得DLL4免疫使B細胞產生抗 DLL4之人類抗體而獲得。產生人類抗體之轉殖基因小鼠的產生係如下文所述。可藉由使用合適篩檢程序（例如藉由用DLL4親和層析進行細胞分離，或使細胞吸附至經螢光染料標記之DlL4，隨後進行流式活化細胞分選（FACS))來分離表現DLL4特異性膜結合抗體之B細胞而達成抗DLL4反應性細胞群體之額外富集。或者，使用來自未經免疫之供體之脾細胞及/或B細胞或其他PBL提供可能抗體譜系之更佳代表，且允許使用其中 DLL4非抗原之任何動物（人類或非人類）物種建構抗體文庫。對於活體外併入抗體基因建構體中之文庫而言，收集來自受檢者之幹細胞以提供編碼未經重排之抗體基因區段的核酸。所關注之免疫細胞可自多種動物物種獲得，諸如人類、小鼠、大鼠、兔類、狼、犬科、貓科、豬、牛、馬及鳥類物種等。自所關注之細胞回收編碼抗體可變基因區段（包括VH及 VL區段）的核酸並使其擴增。在重排VH及VL基因文庫之 121445.doc -70- 200817435 狀況下，所需dna可藉由自淋巴細胞中分離基因組DNA或 mRNA，接著與匹配重排Vh及VL基因之5,及3,末端的引子考又生5^合轉鍵反應（PCR)而獲得’如〇riandi等人，proc·

Natl· Acad. Sci· (USA)，86:3833-3837 (1989)中所述，從而獲得各種V基因譜系以用於表現。V基因可自cDNA及基因組DNA擴增，其中反向引子在編碼成熟v域之外顯子之5, 末端處’且正向引子基於j區段内，如〇rlandi等人（1989) 及 Ward等人，Nature，341:544-546 (1989)中所述。然而，對於自cDNA擴增’反向引子亦可基於前導外顯子中，如 Jones 等人，Biotechnol·，9:88-89 (1991)中所述，而正向引子在恆定區内，如Sastry等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，86:5728-5732 (1989)中所述。為使互補最大化，如 Orlandi等人（1989)或Sastry等人（1989)中所述，可將簡幷性併入引子中。較佳藉由使用靶向各V-基因家族之PCR引子使文庫多樣性最大化，以便擴增存在於免疫細胞核酸樣本中之所有可利用的VH與VL排列，例如，如Marks等人，J. Mol. Biol.，222:581-597 (1991)之方法中所述，或如 Orum 等人，Nucleic Acids Res·，21:4491-4498 (1993)之方法中所述。為將擴增DNA選殖至表現載體中，可將稀少限制性位點在一末端處引入PCR引子内作為一標記，如Orlandi等人 (1989)中所述，或藉由用經標記之引子進行進一步pCr擴增，如 Clackson 等人，Nature，352: 624-628 (1991)中所述。合成性重排之V基因譜系可在活體外源自於V基因區 121445.doc •71 - 200817435 段。大部分人類VH-基因區段已經選殖且定序（報導於 Tomlinson等人，j· Mol· Biol·，227:776-798 (1992)中），且經定位（報導於]Vtatsuda 等人，Nature Genet·，3:88-94 (1993)中）；可使用此等經選殖區段（包括HI與H2環之所有主要構形）以及編碼各種序列及長度之H3環的PCR引子來產生各種VH基因譜系，如Hoogenboom及Winter，J. Mol. Biol·，227:3 81-3 88 (1992)中所述。亦可製得所有序列多樣性集中於具有單一長度之長H3環的VH譜系，如b訂bas等人，Proc· Natl. Acad. Sci· USA，89:4457-4461 (1992)中戶斤述。人類Vk及νλ區段已經選殖且定序（報導於williams及

Winter，Eur. J· Immunol·，23:1456-1461 (1993)中）且可用於獲得合成輕鏈譜系。基於一系列VH及VL折疊及L3與H3長度之合成V基因譜系將編碼具有可觀結構多樣性之抗體。在擴增編碼V基因之DNA後，可根據Hoogenboom及Winter， J· Mol· Biol·，227: 381-3 88 (1992)之方法使生殖系γ基因區段活體外重排。可藉由以若干方式組合VH及VL基因譜系於一起來建構抗體片段缙系。各譜系可建立於不同載體中，且該等載體係在活體外重組，如Hogrefe等人，Gene，128:119_126 (1993)中所述；或在活體内藉由組合感染而重組，例如， Waterhouse等人，Nucl· Acids Res，21· 2265 2266 (1993) 中所过之ΙοχΡ系統。活體内重組法利用片段之兩鏈性質以克服由大腸桿菌⑶⑽型效率對文庫大小所施加的限制性。將天然VH及VL譜系獨立選殖，一者選殖至噬 121445.doc -72- 200817435 菌粒（phagemid)中，而另一者選殖至噬菌體載體中。接著藉由嗤菌體感染含則粒之細菌來組合兩個文庫，使得各細胞含有不同組合且文庫大小僅受所存在之細胞數量（約 10丨2個純系)限制。兩種載體皆含有活體内重組信號，從而使VH及VL基因重組於單—複製子上且共同包裝於嗟菌體病毒粒子中。此等巨型文庫提供大量具有良好親和力(Kd_i 為約1(Γ8 Μ)之不同抗體。或者，該等譜系可依序選殖至同一載體中，例如，如

Barbas等人，Proc. Natl. Acad· Sci· USA，88: 7978-7982 (1991)中所述，或藉由PCr組裝於一起且接著選殖，如

Clackson等人，Nature，352:624-628 (1991)中所述。PCR組裝亦可用於接合VH及VL DNA與編碼可撓性肽間隔基之 DNA以形成單鏈Fv(scFv)譜系。在另一技術中，使用，，細胞内PCR組裝”來藉由pcr組合淋巴細胞内之麗及VL基因且接著選殖連接基因之譜系，如Embleton等人，Nucl. Acids Res·，2(h 383 1-3837 (1992)中所述。由天然文庫所產生之抗體（天然的或合成的）可具有適度的親和力（約106至1〇7 M·1之Kd-1)，但親和力成熟亦可藉由建構弟二文庫且從中再選擇來模仿，如Winter等人 (1994)(同上）中所述。舉例而言，藉由在Hawkins等人，J. Mol. Biol·，226: 889-896 (1992)之方法中或Gram等人， Proc. Natl· Acad· Sci USA，89:3576-3580 (1992)之方法中使用錯誤傾向聚合酶（報導於Leung等人，Technique，1: 1 1- 15 (1989)中）可在活體外隨機引入突變。此外，可藉由 121445.doc -73- 200817435 在所選個別Fv純系中（例如）使用PCR及帶有跨越所關注 CDR之隨機序列的引子來使一或多個CDR隨機突變且筛檢具有較高親和力之純系，藉此達成親和力成熟。w〇 9607754(於1996年3月14日公開）描述一種用於誘導免疫球蛋白輕鏈之互補判定區突變形成以建立輕鏈基因文庫的方法。另一有效方法為重組藉由噬菌體呈現所選之VH* VL 域與獲自未經免疫之供體的天然存在之V域變異體譜系且在數輪鏈改組中篩檢較高親和力者，如Marks等人， ( Biotechn〇l_，10:779-783 (1992)中所述。此技術允許產生親和力在1(Τ9 Μ之範圍内的抗體及抗體片段。 DLL4核酸及胺基酸序列在此項技術中係已知的且在本文中作進一步討論。可藉由此項技術中已知之多種方法製備編碼DLL4之DNA。此等方法包括（但不限於）藉由Engels 等人，Agnew. Chem. Int. Ed· Engl·，28: 716-734 (1989)中所述之任方法的化學合成，諸如三醋、亞麟酸g旨、胺基 I 磷酸酯及膦酸酯方法。在一實施例中，將表現宿主細胞所偏愛之密碼子用於設計編碼DLL4之DNA。或者，可將編碼DLL4之DNA自基因組或cDNA文庫中分離。在建構編碼DLL4之DNA分子後，使DNA分子可操作地連接至表現載體（諸如質體）内之表現控制序列，其中該控制序列為經載體轉型之宿主細胞所識別。一般而言，質體載體含有複製及控制序列，該等序列係源自於與宿主細胞相谷之物種。載體通常載有複製位點以及編碼能夠提供轉 5L、、、田胞内之表型選擇之蛋白的序列。適合在原核及真核宿 121445.doc -74- 200817435 主細胞中表現之載體在此項技術中為已知的且某些在本文中作進一步描述。可使用真核生物體（諸如酵母）^源自於多細胞生物體（諸如哺乳動物）之細胞。視情況使編碼DLL4之DNA可操作地連接至藉由宿主細胞導致表現產物分泌至培養基中之分泌引導序列。分泌引導序列之實例包括stn、大腸桿菌抑制劑（ec〇tin)、、疱疹GD、lpp、鹼性磷酸酶、轉化酶及α因子。亦適用於本文的為蛋白質A之36胺基酸引導序列（Abrahmsen等人， EMBO J·，4: 3901 (1985))。將宿主細胞用本發明之上述表現或選殖載體轉染且較佳為使其轉型，且培養於在適當時經改質之習知營養培養基中以用於誘導啟動子、選擇轉型物或擴增編碼所需序列之基因。轉染係指無論實際上是否表現任何編碼序列表現載體均為宿主細胞吸收。一般技術者已知眾多轉染方法，例如 ( CaP〇4沈澱及電穿孔。當在宿主細胞内發生此載體之操作的任何跡象時一般認為轉染成功。轉染方法在此項技術中為熟知的，且一些在本文中作進一步描述。轉型意謂將DNA引入生物體中以使DNA作為染色體外元件或猎由染色體整合子為可複製的。視所使用之宿主細胞而定，使用適於此等細胞之標準技術完成轉型。轉型方法在此項技術中係热知的’且一些在本文中作進一步描述。用以產生DLL4之原核彳百主細胞可如|§ambr〇〇k等人（同上）中一般所述來培養。 121445.doc -75- 200817435 用於產生DLL4之哺乳動物宿主細胞可在各種培養基中培養’此在此項技術中係熟知的且其中一些在本文中加以描述。本揭示案中所提及之宿主細胞涵蓋活體外培養物中之細胞以及宿主動物體内之細胞。 DLL4純化可使用此項技術公認之方法完成，其中一也在本文中加以描述。〆經純化之DLL4可附著於適當基質，諸如瓊脂糖微珠、 ' 丙烯醯胺微珠、玻璃微珠、纖維素、各種丙烯酸系共聚物、羥基甲基丙烯酸酯凝膠、聚丙烯酸及聚甲基丙烯酸共聚物、耐綸、中性及離子性載劑及其類似物，以供噬菌體呈現純系之親和力層析分離使用。DLL4蛋白附著至基質可藉由Methods in Enzymology，第44卷（1976)中所述之方法完成。用於連接蛋白質配位體至多醣基質（例如瓊脂糖、葡聚糖或纖維素）之通用技術包括用^化氰活化載劑 ( 且隨後使肽配位體之第一脂族胺或芳族胺偶合至經活化之基質。或者，DLL4可用於塗佈吸附盤之孔，表現於附著至吸附盤之宿主細胞上或用於細胞分選，或共軛至生物素以便經塗有抗生蛋白鏈菌素之微珠捕獲，或用於其他任何此項技術已知之方法中以便淘選噬菌體呈現文庫。在適於使至少一部分噬菌體顆粒與吸附劑結合之條件下使噬菌體文庫樣本與固定DLL4接觸。通常，對條件（包括 PH值、離子強度、溫度及其類似條件）進行選擇以模擬生 121445.doc -76- 200817435 理條件。洗滌結合至固相之噬菌體且接著藉由酸（例如，如 Barbas等人，Proc. Natl· Acad. Sci USA，88:7978-7982 (1991)中所述）或藉由驗（例如，如Marks等人，J. Mol. Biol·，222: 581-597 (1991))或藉由DLL4抗原競爭（例如在類似於 Clackson等人，Nature，352:624-628 (1991)之抗原競爭方法的程序中）溶離。可於單輪選擇中富集204,000倍之噬菌體。此外，所富集之噬菌體可在細菌培養物中生長且經受其他輪之選擇。 (·、選擇效率視許多因素而定，包括洗滌期間之解離動力學性質及單一嗟菌體上之多個抗體片段是否能同時與抗原接合。可藉由利用短時間洗滌、多價噬菌體呈現及抗原於固相中之高塗佈密度來保留具有快速解離動力學性質（及弱結合親和力）之抗體。高密度不僅經由多價相互作用使噬菌體穩定，且有利於使已解離之噬菌體再結合。可藉由利用長時間洗滌及單價噬菌體呈現（如Bass等人，Pr0teins, 8: (309-3 U (1990)及WO 92/0969〇中所述）及抗原之低塗佈密度（如 Marks等人，Biotechnol·，1〇: 779_783 (1992)中所述）來促進具有慢解離動力學性質（及優良結合親和力）之抗體的選擇。在針對DLL4具有不同親和力、甚至所具有之親和力為略微不同之嗟菌體抗體之間進行.選擇為有可能的。然而，所選抗體之隨機突變（例如，如在上文所述之某些親和力成熟技術中實施般）可能產生許多突變體，其中大部分與抗原結合，且較少部分具有較高親和力。在限制DLL4之 121445.doc •77- 200817435 十月況下，彳競爭出稀少高親和力喔菌體。為保留所有具有兩親#力之大變體，可用過量經生物素標記之培育噬菌體，但其中經生物素標記之DLL4的莫耳濃度比 DLL4目標莫耳親和常數低。隨後，高親和力結合之噬菌體可為經抗生蛋白鏈菌素塗佈之順磁微珠所捕獲。此，，平衡捕獲”使得能夠根據抗體之結合親和力以敏感性來對該等抗體進行選擇，該敏感性允許使具有僅兩倍高的親和力之大k體純系與具有較低親和力之大量過量噬菌體分離。亦可操控用於洗滌與固相結合之噬菌體的條件以基於解離動力學來區分。抗DLL4純系可根據活性加以選擇。在一實施例中，本發明提供阻斷Notch受體（諸如Notchl、N〇tch2、N〇tch3及/ 或Notch4)與DLL4之間的結合但不阻斷N〇tch受體與第二蛋白之間的結合之抗DLL4抗體。對應於該等抗DLL4抗體之 Fv純系可藉由如下步驟來選擇：（丨）如上所述自噬菌體文庫中分離抗DLL4純系，及視需要藉由使經分離之噬菌體純糸群體在適當細菌宿主中成長來擴增該群體；（2)針對分別需要阻斷活性及非阻斷活性來選擇DLL4及第二蛋白； (3)使抗DLL4嗟菌體純系吸附至固定DLL4 ; (4)使用過量第二蛋白以使任何識別與第二蛋白之結合決定子重疊或為其所共有之DLL4結合決定子的非所要純系溶離；及（5)使繼步驟（4)之後仍吸附之純系溶離。視需要，具有所需阻斷/ 非阻斷性質之純系可藉由重複本文所述之選擇程序一或多次而進一步富集。 121445.doc -78- 200817435 使用習知程序（例如藉由使用經設計以自融合瘤或嗟菌體DNA模板特異性地擴增所關注之重鏈及輕鏈編碼區的寡核普酸引子）易於將編碼融合瘤衍生之單株抗體或噬菌體呈現Fv純系的DNA分離且定序。一旦分離後，可將dna置於表現載體内，隨後將該等表現載體轉染至不會另外產生

免疫球蛋白之宿主細胞（諸如大腸桿菌細胞、猿c〇s細胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞或骨髓瘤細胞）中，以在重組宿主細胞中獲得所需單株抗體之合成。關於在具有編碼抗體之 DNA的細菌中重組表現之評論文章包括skem等人，以^·

Opinion in Immunol·，5: 256 (1993)及 piuckthun，immun〇1· Revs，130: 15 1 (1992)。、、扁碼Fv純系之DNA可與編碼重鏈及/或輕鏈恆定區之已知DNA序列（例如適合DNA序列可自Kabat等人，見上文獲得）組合以形成編碼全長或部分長度之重鏈及/或輕鏈的純系。應瞭解，為達成此目的可使用任何同型之值定區，包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE恆定區，且此等恒定區可自任何人類或動物物種獲得。如本文所用之”嵌合"抗體及 "雜交”抗體之^❹包括得自一種動物（諸如人類）物種之可變域麵且接著融合至另—動物物種之，以區DM以形成”雜交"全長重鏈及/或輕鍵之編瑪序列的Fv純系。在—較佳實施例中’使源自於人類可變dna之^純系融合至人類怪定區囊以形成所有人類全長或部分長度之重鍵及、輕鏈之編碼序列。亦可例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列代替 121445.doc -79- 200817435 來源於融合瘤純系之同源鼠科序列來修飾編碼來源於融合瘤之抗DLL4抗體的DNA(例如，如在Morrison等人，pr〇c. Natl· Acad· Sci. USA，81:685 1-6855 (1984)之方法中）。可藉由共價接合I至免疫球蛋白編碼序列、非免疫球蛋白多肽之所有或部分編碼序列來進一步修飾編碼融合瘤或F v純系衍生之抗體或片段的DNA。以此方式，製備具有Fv純系或融合瘤純系衍生之抗體之結合特異性的”嵌合”或”雜交，，抗體。抗體片段本發明涵蓋抗體片段。在某些情形下，使用抗體片段而非使用整個抗體具有優勢。片段之較小大小允許迅速清除且可導致對實體腫瘤之接近的改良。已研發出多種用於製造抗體片段之技術。傳統上，經由蛋白水解消化完整抗體來得到該等片段（參看例如， Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及 Brennan 等人，Science， 229:81 (1985))。然而，現可藉由重組宿主細胞來直接產生該等片段。Fab、Fv及ScFv抗體片段均可表現於大腸桿菌中且由大腸桿菌分泌，由此允許容易地產生大量該等片段。抗體片段可自上文所討論之抗體噬菌體文庫中分離。或者，Fab’-SH片段可自大腸桿菌中直接回收且化學偶合以形成 F(ab，）2 片段（Carter 等人，；^〇/丁6(：1111〇1〇§710:163-167 (1992))。根據另一方法，F(abf)2片段可自重組宿主細胞培養物中直接分離。在美國專利第5,869,046號中描述活 121445.doc -80 - 200817435 體内半衰期增加之包含補救受體結合抗原決定基殘基的 Fab及F(ab’）2片段。其他用於產生抗體片段之技術對於熟習此項技術者而言應為顯而易見的。在其他實施例中，所選擇之抗體為單鏈Fv片段（scFv)。參見WO 93/16185、美國專利第5,571，894號及第5,587,458號。Fv及sFv為具有完整組合位點（缺乏恒定區）之僅有類型；因此，其適於在活體内使用期間的減少之非特異性結合。可建構sFv融合蛋白以在sFv之胺基或魏基末端處產生效應蛋白之融合。參看 Antibody Engineering，編輯Borrebaeck，同上文。抗體片段亦可為”線性抗體’’，例如，如美國專利第5,641，87〇號中所述。此等線性抗體片段可為單特異性或雙特異性。人化抗體本發明涵蓋人化抗體。人化非人類抗體之各種方法在此項技術中係已知的。舉例而言，人化抗體可使一或多個胺基酸殘基自非人類來源引入其中。此等非人類胺基酸殘基通常被稱為’’輸入”殘基，其通常係來自"輸入，，可變域。人化基本上可遵循Winter及合作者之方法（jones等人（1986)

Nature 321:522-525; Riechmann等人（1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen等人（1988) Science 239:1534-1536)藉由用高變區序列取代人類抗體之相應序列來進行。因此，該等 π人化”抗體為嵌合抗體（美國專利第4,816,567號），其中實質上小於完整人類可變域者已為來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人化抗體通常為其中某些高變區殘基及可能某些FR殘基經來自齧齒動物抗體之類似位點之殘基取 121445.doc -81 - 200817435 代的人類抗體。待用於製備人化抗體之輕鏈及重鏈人類可變域的選擇對降低抗原性而言係非常重要的。根據所謂之”最適，，方法，針對整個已知人類可變域序列庫篩檢齧齒動物抗體之可變域序列。接著將與齧齒動物之序列最接近之人類序列視為人化抗體之人類構架（Sims等人（1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia等人（1987) J· Mol· Biol. 196··901)。另一

方法使用源自輕鏈或重鏈之特定亞群之所有人類抗體之一致序列的特定構架。同一構架可用於若干不同人化抗體 (Carter 等人（1992) Proc. Natl· Acad· Sci· USA，89:4285; Presta等人（1993) J. Immunol·，151:2623)。另外重要的為抗體被人化，同時保留對抗原之高親和力及其他有利生物性質。為達成此目標，根據一種方法，藉由使用親本序列及人化序列之三維模型來分析親本序列及各種概念性人化產物的方法製備人化抗體。三維免疫球蛋白模型㈢遍可得且為熟習此項技術者所熟悉。可獲得說明且展現所選候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。此等展現之檢驗允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列功能中之可能作用，意即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原之能力的殘基。以此方式，可對FR殘基進行選擇，且使叹殘基自接受者與輸人序列加以組合，為此達成所需抗體特徵，諸如增加之爾原之親和力。通常，高變區殘基直接^大部分實質上涉及影響抗原結合。人類抗體 121445.doc -82- 200817435 人類抗DLL4抗體可藉由將選自人類來源之噬菌體呈現文庫的Fv純系可變域序列與如上所述之已知人類恆定域序列組合來建構。或者，人類單株抗DLL4抗體可藉由融合瘤方法製得。已例如由Kozbor J. Immunol.，133: 3001 (1984); Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51_63 頁（Marcel Dekker， Inc·，New York，1987)及 Boerner 等人，J. Immunol.，147: 86 (1991)描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜合骨髓瘤細胞株。現有可能產生能夠在免疫後在無内源免疫球蛋白產生之情況下產生人類抗體之完整譜系的轉殖基因動物（例如小鼠）。舉例而言，已描述在嵌合及生殖系突變體小鼠中抗體重鏈連接區（JH)基因的純合子缺失導致内源抗體產生之完全抑制。將人類生殖系免疫球蛋白基因陣列轉移至此等生殖系突變體小鼠中將會在抗原激發後導致人類抗體之產生。例如參見 Jakobovits等人，proc· Natl. Acad. Sci USA， 90: 2551 (1993); Jakobovits等人，Nature，362: 255 (1993);

Bruggermann等人，Year in Immun〇1，7: 33 (1993)。基因改組亦可用於自非人類（例如齧齒動物）抗體得到人類抗體，其中人類抗體具有與初始非人類抗體相似之親和力及特異性。根據此方法（亦稱為”抗原決定基印記（epit〇pe imprinting)”），用人類v域基因譜系置換藉由如上文所述之噬菌體呈現技術獲得的非人類抗體片段之重鏈或輕鏈可變區，從而產生非人類鏈/人類鏈scFv或Fab嵌合體群體。用 121445.doc -83 » 200817435 抗原進行選擇會導致非人類鏈/人類鏈嵌合8〇1^或？&13之分離’其中人類鏈使在移除原代噬菌體呈現純系中之相應非人類鏈後受損的抗原結合位點恢復，亦即抗原決定基決定 (印記）對人類鏈搭配物之選擇。當重複該過程以置換剩餘非人類鏈時，獲得人類抗體（參看丨993年4月1日公開之PCT WO 93/06213)。與傳統藉由CDR移植來人化非人類抗體不同’此技術提供不具有非人類來源之FR或CDR殘基的完整人類抗體。雙特異性抗體雙特異性抗體為具有至少兩個不同抗原之結合特異性之單株（較佳人類或人化）抗體。在此狀況下，其中一種結合特異性係針對DLL4而另一種結合特異性係針對其他任一種抗原。例示性雙特異性抗體可結合至DLL4蛋白之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於使細胞毒性劑定位於表現DLL4之細胞中。此等抗體具有結合DLL4之臂及結合細胞毒性劑（例如，沙泊寧（saporin)、抗干擾素α、長春化生物驗、說麻毒素Α鍵、甲胺蝶吟或放射性同位素半抗原）之臂。可製備作為全長抗體或抗體片段之雙特異性抗體（例如，F(ab，）2雙特異性抗體）。用於製備雙特異性抗體之方法在此項技術中係已知的。傳統地’雙特異性抗體之重組產生係基於兩免疫球蛋白重鍵-輕鏈對之共同表現，其中兩重鏈具有不同特異性 (Milstein 及 Cuell〇, Nature，3〇5: 537 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鍵之隨機分類，所以此等融合瘤（四源雜交 121445.doc -84- 200817435 瘤，quadroma)產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅有一種具有恰當雙特異性結構。通常藉由親和層析步驟進行之恰當分子的純化相當繁瑣，且產物產率低。類似程序揭示於1993年5月13日公開之w〇 93/〇8829及

Traunecker等人，EMBO J·，10·· 3655 (1991)中。

根據一不同且更佳之方法，使具有所需結合特異性（抗體-抗原組合位點）之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。較佳與包含至少部分鉸鏈區、CH2區及CH3區之免疫球蛋白重鏈恆定域融合。較佳使含有輕鏈結合所必需之重鏈恒定區（CH1)存在於融合之至少一者中位點的第一將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及（若須要）免疫球蛋白輕鏈之DNA插人獨立表現載體中，且使其共轉染至適當之宿主生物體中。在當建構中所使用之不等比率之三個多㈣提供最佳產率時之實施例中，此提供調節三個多肽片段之相互比例的極大靈活性 '然而，當至少兩個多肽鏈以相等比率表現而產生高產率時或當該等比率並非特別重要時，有可能將兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列插人—種表體中。在此方法之-較佳實施例中，雙特異性抗體由在一臂中具有P結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈及在另一臂中 ^雜^疫球蛋白重鏈_輕鍵對（提供第二結合特異性恤匕 =由於免疫球蛋白輕鏈於僅-半雙特異性分子存在如i、-種簡便分離方式，所需雙特異性化合物與非所要免疫球蛋二:離: 121445.doc -85- 200817435 方法揭示於WO 94/04690中。關於產生雙特異性抗體之詳情，例如參見Suresh等人，Methods in Enzymology，121:210 (1986)。根據另一方法’一對抗體分子之間的界面可經工程化以最大化自重組細胞培養物中回收之雜二聚體的百分比。較佳界面包含抗體恆定域之CH3域的至少一部分。在此方法中，用較大側鏈（例如酪胺酸或色胺酸）置換來自第一抗體 ^ 分子界面之一或多個小胺基酸側鏈。藉由用較小胺基酸側 1 鏈（例如丙胺酸或蘇胺酸）置換大胺基酸側鏈，在第二抗體分子之界面上產生具有與大的側鏈相同或類似的小大之補償性”空穴”。此提供增加雜二聚體而非其他非所要終產物 (諸如均二聚體）之產率的機制。雙特異性抗體包括交聯或”雜共軛”抗體。舉例而言，雜共軛物中之一抗體可與抗生物素蛋白偶合，另一抗體與生物素偶合。例如，已建議使用該等抗體以使免疫系統細胞 & 靶向非所要細胞（美國專利第4,676,980號），且用於治療 HIV 感染（WO 91/003 60、WO 92/003 73 及 EP 03 089)。可使用任何便利之交聯方法製造雜共軛抗體。適當交聯劑在此項技術中係熟知的，且連同許多交聯技術揭示於美國專利第 4,676,980號中。自抗體片段產生雙特異性抗體之技術亦已描述於文獻中。舉例而言，可利用化學鍵聯製備雙特異性抗體。

Brennan等人，Science，229: 81 (1985)描述一種程序，其中完整抗體經蛋白裂解而產生F(ab，）2片段。在二硫醇錯合 121445.doc -86 - 200817435 劑亞坤酸鈉存在下還原此等片段以穩定鄰近二硫醇且防止分子間二硫化物形成。隨後，使所產生之Fab’片段轉化為硫代硝基苯甲酸鹽（TNB)衍生物。隨後，藉由用巯基乙胺還原使其中一種Fab’-ΤΝΒ衍生物再轉化為Fab，-硫醇，且使其與等莫耳量之另一種Fab，-TNB衍生物混合以形成雙特異性抗體。所產生之雙特異性抗體可用作用於選擇性固定酶之試劑。新近之發展已有助於自大腸桿菌直接回收Fab’_sh片段，其可化學偶合而形成雙特異性抗體。Shalaby等人，j.

Exp· Med.，175:217-225 (1992)描述完全人化雙特異性抗體 F(ab’）2分子之產生。由大腸桿菌獨立分泌各Fab，片段且使其經受活體外定向化學偶合而形成雙特異性抗體。如此形成之雙特異性抗體能夠結合至過度表現HER2受體之細胞及正常人類T細胞，且能夠引發抗人類乳瘤靶之人類細胞毒性淋巴細胞的溶解活性。亦已描述直接由重組細胞培養物製造並分離雙特異性抗體片段之各種技術。舉例而言，已使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體。Kostelny 等人，J. Immunol.，148(5):1547- 1553 (1992)。藉由基因融合使來自F〇s&jun蛋白之白胺酸拉鏈肽與兩種不同抗體之Fab，部分連接。使抗體均二聚體於鉸鏈區還原以形成單體，且隨後使其再氧化而形成抗體雜一 ^^體。此方法亦可用於產生抗體均二聚體。由

Hollinger等人，Pr〇c· Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448 (1993)描述之”雙鏈抗體”技術已為製備雙特異性抗體片段 121445.doc -87- 200817435 提供另一機制。該等片段包含藉由連接子連接至輕鏈可變域（VL)之重鏈可變域（VH)，該連接子太短而使得同一鏈上之兩個域之間無法配對。因此，迫使一個片段之vh及VL 域與另一片段之互補VL及VH域配對，藉此形成兩個抗原結合位點。亦已報導另一種藉由使用單鏈Fv(sFv)二聚體來製造雙特異性抗體片段之戰略。參見Gruber等人，j·

Immunol.，152:5368 (1994) ° 涵蓋大於二價之抗體。舉例而言，可製備三特異性抗體。Tutt 等人 J. Immunol· 147: 60 (1991) 〇多價抗體可藉由表現抗體所結合之抗原的細胞比二價抗體更快地内在化（且/或異化）多價抗體。本發明之抗體可為具有三個或三個以上抗原結合位點之多價抗體（其與IgM種類之抗體不同）（例如四價抗體），該等多價抗體可易於藉由編碼抗體多肽鏈之核酸的重組表現來產生。多價抗體可包含二聚化域及二個或三個以上抗原結合位點。較佳之二聚化域包含 Fc區或鉸鏈區（或由其組成）。在此情形下，抗體將包含Fc 區及在胺基末端至Fe區之三個或三個以上抗原結合位點。本文之較佳多價抗體包含三個至約八個，但較佳為四個抗原結合位點（或由其組成）。多價抗體包含至少一條多肽鏈 (且較佳具有兩條多肽鏈），其中該（等）多肽鏈包含兩個或兩個以上可變域。舉例而言，該（等）多肽鏈可包含vd卜 (Xl)n-VD2_(X2)n-Fc，其中VD1為第一可變域，vD2為第一可變域，Fc為Fc區之一條多肽鏈，幻及又2表示胺基酸 121445.doc -88- 200817435 或多肽且n為0或1。舉例而言’該（等）多肽鏈可包含：VH_ CH1-可⑽生連接子_VH_cm_Fc㊣鍵；或wn cm-Fc區鏈。本文之多價抗體較佳進—步包含至少兩個 (且較佳為四個）輕鏈可變域多肽。本文之多價抗體可（例如）包含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。本文所涵蓋之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域且視需要另外包含匸1域。抗體變異體在某二灵施例中，涵盍本文所述之抗體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可能希望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。藉由將適當核苷酸改變引入抗體核酸中或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括（例如）抗體之胺基酸序列内殘基之缺失及/或插入及/或取代。進行刪除、插入與取代之任何組合以達成最終建構體，其限制條件為最終建構體具有所需特徵。可在製造序列時將胺基酸變化引入標的抗體胺基酸序列中。一種適用於鑑別為突變發生之較佳位置的抗體之某些殘基或區的方法稱為，，丙胺酸掃描突變，，，如由Cunningham及

Wells (1989) Science，244:1081-1085所述。此處，鑑別殘基或無殘基群（例如帶電殘基，諸如arg、aSp、Ms、lys及 glu)且以中性或罗負電胺基酸（最佳為丙胺酸或聚丙胺酸）置換以影響胺基酸與抗原之相互作用。隨後，藉由在取代位點處引入另外或其他變異體或者引入另外或其他變異體作為取代位點來改進彼等對取代展現功能敏感性之胺基酸位置。因此’雖然預先確定引入胺基酸序列變化之位點， 121445.doc •89- 200817435 但突變自身之性質益兩 r生貝無而預先確定。舉例而言，為分析特定位點處突變之效能，在靶穷山馬子或區域處進行ala掃描或隨機突變，且篩檢所表現之疋〈光&球蛋白之所需活性。胺基酸序列插入包括：胺基及/或竣基末端融合，其長度在自-個殘基至含有—百個或一百個以上之殘基的多肽之範圍内變化；以及單個或多個胺基酸殘基之序列内插入末端插入之實例包括具有N-末端甲硫胺醯基殘基之抗

體或融合至細胞毒性多肽之抗體。抗體分子之其他插入變體包括使抗體之N或C末端融合至酶（例如對於ADEpT而言）或多肽，其增加抗體之血清半衰期。多肽之糖基化作用通常為N-連接型或〇_連接型。N_連接型係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸_χ_蘇胺酸（其中 X為除脯胺酸外之任何胺基酸）為碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，此等三肽序列中任一者在多肽中之存在產生潛在糖基化位點。〇-連接型糖基化作用係指糖Ν-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者連接至羥胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，儘管5_羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸亦可使用。將糖基化位點添加至抗體中係便利地藉由改變胺基酸序列來達成，為此使該序列含有上述三肽序列中之一或多者 (Ν-連接糖基化位點）。改變亦可藉由將一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基添加至初始抗體之序列中或由其進行替代來進行（對於Ο-連接糖基化位點而言）。 121445.doc -90- 200817435 可在抗體包含Fc區之情況下改變附著至其之碳水化合物。舉例而言，在美國專利申請案第US 2003/0157108號 (Presta，L·)中描述在成熟碳水化合物結構中缺乏附著至抗體Fc區之海藻糖之抗體。亦參見US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co·，Ltd)。在附著至抗體Fc區之碳水化合物中具有對開N-乙醯基葡糖胺（GlcNAc)的抗體參考WO 2003/01 1878，Jean-Mairet等人及美國專利第 6,602,684號， Umana等人。在附著至抗體Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基的抗體報導於WO 1997/30087，Patel等人中。亦參見關於具有附著至抗體Fc區之經變化碳水化合物之抗體的 WO 1998/58964 (Raju，S.)及 WO 1999/22764 (Raju，S·)。亦參見關於具有改質糖基化之抗原結合分子的US 2005/0123546 (Umana等人）〇本文之較佳糖基化變異包含Fc區，其中附著至Fc區之碳水化合物結構缺乏海藻糖。此等變異體具有改良之ADCC 功能。視需要地，Fc區中進一步包含進一步改良ADCC之一或多個胺基酸取代，例如在Fc區之位置298、333及/或 334處（殘基之Eu編號）之取代。與π去海藻糖化”或’’海藻糠缺乏’’抗體有關之公開案的實例包括：US 2003/0157108 ; WO 2000/61739 ； WO 2001/29246 ； US 2003/01 15614 ; US 2002/0164328 ； US 2004/0093621 ； US 2004/0132140 ； US 2004/0110704 ； US 2004/0110282 ； US 2004/0109865 ； WO 2003/085 1 19 ； WO 2003/084570 ； WO 2005/035586 ； WO 2005/035778 ； WO 2005/053742 ； Okazaki 等人，J. Mol. 121445.doc -91 - 200817435

Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng· 87:614 (2004)。產生去海藻糖化抗體之細胞株之實例包括蛋白海藻糖化缺乏之Lecl3 CHO細胞（Ripka等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986);美國專利申請案第 US 2003/0157108 A1 號，Presta，L 及 WO 2004/056312 Al，Adams等人，尤其實例11)及剔除細胞株，諸如α-1，6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8、剔除CHO細胞 (Yamane-Ohnuki等人，Biotech. Bioeng· 87:614 (2004))。另一變異體類型為胺基酸取代變異體。此等變異體在抗體分子中具有至少一個經不同殘基置換之胺基酸殘基。雖然對於取代突變而言最受關注之位點包括高變區，但亦涵蓋FR變化。保守取代在表2中標題’’較佳取代”下展示。若此等取代導致生物活性之改變，則可引入表2中命名為”例示性取代π或如以下關於胺基酸種類進一步描述之更多實質變化且篩檢產物。表2 初始殘基例示性取代較佳取代 Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg (R) Lys; Gin; Asn Lys Asn (N) Gin; His; Asp, Lys; Arg Gin Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gin (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gin Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gin; Lys; Arg Arg 121445.doc -92- 200817435 lie (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe ;正白胺酸 Leu Leu (L) 正白胺酸；lie; Val; Met; Ala; Phe lie Lys (K) Arg; Gin; Asn Arg Met (Μ) Leu; Phe; lie Leu Phe(F) Trp; Leu; Val; lie; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp(W) Tyr; Phe Tyr Tyr⑺ Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala ;正白胺酸 Leu 對抗體生物性質之實質修飾係藉由選擇在對保持（a)取代區之多肽主鏈結構（例如呈折疊或螺旋構形）、（b)靶位點處分子之電荷或疏水性或者（c)側鏈大小之作用方面顯著不同之取代而達成。基於常見側鏈性質，將天然存在之殘基分成以下各組： (1) 疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile ; (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; (3) 酸性：asp、glu ; (4) 驗性：his、lys、arg ; (5) 影響鏈取向之殘基：gly、pro ;及 (6) 芳族：trp、tyr、phe。非保守性取代應需要將此等種類中之一者之成員換成另一種類。 121445.doc -93 - 200817435 一種取代變異體類型涉及取代親本抗體（例如人化或人類抗體）之一或多個高變區殘基。一般而言，為進一步研發而選擇之所得變異體相對於產生其之親本抗體而言應具有改良之生物性質。一種用於產生此等取代變異體之便利方式涉及使用噬菌體呈現發生之親和力成熟。簡言之，使若干高變區位點（例如6-7個位點）突變以在各位點產生所有可能之胺基酸取代。如此產生之抗體係作為融合至封裝於各粒子内之M13基因ΠΙ產物之物自絲狀噬菌體粒呈現。接 (； ^ 、，者針對如本文所揭示之生物活性（例如結合親和力）篩檢噬菌體呈現之變異體。為鑑別適於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變以鑑別顯著促成抗原結合之高變區殘基。另外或其他，其可有益於分析抗原_抗體複合物之結晶結構以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。根據本文詳述之技術，此等接觸殘基及相鄰殘基為適於取代之候選者。一旦產生此等變異體後，使一系列變異體經受如本文所述 ( 之篩檢且可選擇在一或多個相關檢定中具有優良性質之抗體以用於進一步研發。藉由此項技術中已知之多種方法製備編碼抗體之胺基酸序列變異體的核酸分子。此等方法包括(但不限於)自天然來源（在天然存在之胺基酸序列變異體之狀況下）分離或藉由使早期製備之抗體變異體或抗體之非變異型式發生募才二音酸介導（或位點疋向）之突響 a人』乂〜大殳、大變及盒式突變而製可能需要在免疫球蛋白客日士 + ^ ^ 夕肽之Fc &引入一或多個胺基酸 121445.doc -94- 200817435 修飾，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置（包括鉸鏈半胱胺酸之位置）處包含胺基酸修飾（例如取代）之人類Fc區序列（例如人類IgGi、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區）。根據本描述及此項技術之教示，預期在某些實施例中，與野生型對應抗體相比，例如Fc區中，方法中所使用之抗體可包含一或多個變化。不過，此等抗體仍將保持與其野生型對應物相比實質上相同之治療效用所需的特性。舉例而吕’據認為’可在F c區中進行會導致改變（亦即改良或減少）Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性（Cdc)的某些變化，例如WO 99/51642中所述。關於Fc區變異體之其他實例’亦參見Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); 美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號及WO 94/29351。WO 00/42072 (Presta)及 WO 2004/0563 12 (Lowman)描述具有改良或減少之與FcR之結合的抗體變異體。此等專利公開案之内容以引用的方式明確併入本文。亦參見 Shi elds 等人 J· Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。具有增加之半衰期及改良之與新生Fc受體（FcRn)(其負責使母體IgG轉移至胎兒（Guyer等人，J. Immunol. 117:587 (1976)及 Kim等人，J· Immunol. 24:249 (1994)))之結合的抗體描述於US2005/0014934A1 (Hinton等人）中。此等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，該（等）取代改良以區與FcRn之結合。具有變化之Fc區胺基酸序列及增加或減少之Clq結合能力的多肽變異體描述於美國專利第 121445.doc -95- 200817435 6，194,551B1號、W0 99/51642中。彼等專利公開案之内容以引用的方式明確併入本文中。亦參見Idus〇gie等人了

Immunol. 164: 4178-4184 (2000)。抗體衍生物

可進一步修飾抗體以含有此項技術中已知且易得之額外非蛋白部分。較佳地，適於使抗體衍生之部分為水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括（但不限於）聚乙一醇（PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯11比洛唆_、聚_ 1，3 _二氧戊環、聚 1，3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸（均聚物或無規共聚物）及葡聚糖或聚（正乙烯吡咯啶酮）聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚乙氧基化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中之穩定性而在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可具支鏈或無支鏈。附著至抗體之聚合物數量可不同，且若附著一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。-般而言，用於衍生化之聚合物之數目及/或類型可基於包括（但不限於）待改良抗體之特定性貝或功旎、抗體衍生物是否將用於確定條件下之療法等考慮因素來確定。篩檢具有所要性質之抗體可藉由此項技術中已知之各種檢定來表徵抗體之物理/ 化學性質及生物功能。纟某些實施例中，表徵抗體之以下特铽中之任一或多個特徵：與dll42結合；減少或阻斷 121445.doc -96- 200817435

Notch受體活化；減少或阻斷Notch受體下游分子信號轉導；破壞或阻斷Notch受體結合至DLL4 ;及/或促進内皮細胞增殖；及/或抑制内皮細胞分化；及/或抑制動脈分化；及/或抑制腫瘤血管灌注；及/或治療及/或預防發腫瘤、細胞增殖性病症或癌症；及/或治療或預防與DLL4表現及/或活性相關之病症；及/或治療或預防與Notch受體表現及/或活性相關之病症。經純化抗體可藉由一系列檢定來進一步表徵，該等檢定包括（但不限於）N末端定序、胺基酸分析、非變性尺寸排阻高壓液相層析法（HPLC)、質譜法、離子交換層析法及番木瓜酶消化。在本發明之一些實施例中，分析本文所產生之抗體之生物活性。在某些實施例中，測試本發明之抗體的抗原結合活性。此項技術中已知且可於本文中使用之抗原結合檢定包括（但不限於）使用諸如西方墨點法、放射免疫檢定、 ί, ELISA(酶聯結免疫吸附劑檢定）、，，夾心，，免疫檢定、免疫沈;殿k疋、螢光免疫檢定及蛋白A免疫檢定之技術進行的任何直接或競爭性結合檢定。例示性抗原結合檢定在以下實例部分提供。可精由針對所需性質經由任何習知方法筛檢抗融口瘤、屯系來獲侍具有本文所述之獨特性質的抗抗體j等習知方法中其中一些在本文中有描述及例示。舉抑右而要阻斷或不阻斷^^…讣受體與dll4結合之抗單株k體，則可在諸如競爭性結合MSA之結合競爭 121445.doc -97· 200817435 檢定中測試候選抗體，其中將盤孔用DLL4塗佈，且使抗體於過量所關注之Notch受體中之溶液於經塗佈之盤上成層，且酶促彳貞測所結合之抗體，例如使所結合之抗體與 HRP共軛之抗Ig抗體或經生物素標記之抗Ig抗體接觸，且使HRP色彩反應顯色，例如藉由以抗生蛋白鏈菌素HRP及/ 或過氧化氫使盤顯色且藉由分光光度計在490 nm下用 ELISA盤讀取器偵測HRP色彩反應。在一實施例中，抗體為具有一些但並非所有效應功能之經改變的抗體，此使得該抗體成為多種應用之所需候選者，在該等應用中抗體之活體内半衰期係重要的，但某些效應功能（諸如補體及ADCC)係不必要或有害的。在某些實施例_，量測所產生之免疫球蛋白之F c活性以確保僅保持所需特性。可進行活體外及/或活體内細胞毒性檢定以確定CDC及/或ADCC活性之降低/耗盡。舉例而言，可進行 Fc受體（FcR)結合檢定以確保抗體缺乏FcYR結合（因此可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC 之原代細胞NK細胞僅表現FcyRIII，而單核細胞表現 FcyRI、FcyRII及FcyRIII 〇造血細胞上之FcR表現概述於 Ravetch及 Kinet，Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)第 464 頁表3中。評估所關注分子之ADCC活性的活體外檢定之實例描述於美國專利第5,500,362號或第5,821，337號中。適用於該等檢定之效應細胞包括外周血單個核細胞（PBMC)及自然殺傷（NK)細胞。或者或另外，所關注分子之ADCC活性可在活體内評估，例如在如Clynes等人PNAS (USA) 121445.doc -98- 200817435 95··652-656 (溯）中所揭示之動物模型中評估。亦可進行 Clq結合檢^以敎抗體無法與Clq結合且因此缺乏⑽活性。為評估補體活化，可進行CDC檢定，例如，如⑽讓& W。等人 ’ Immunol. Meth〇ds 紙163 (19叫中所述。亦可使用此項技術中已知之方法，例如實例部分所述之彼專方法’進行FcRn結合及活體内清除/半衰期測定。载體、宿主細胞及重組方法為重組產生抗體，使編碼抗體之核酸分離並插入可複製載體中以供進一步選殖⑽A擴增)或供表現用。編瑪抗體之DNA易於分離且使用習知 1 精由使用能夠特異十也、、、σ ά至編碼抗體之重鏈及卓 ^ 蟪及幸工鏈之基因的募核苷酸探 ^疋序。多^載體均可用。载體之選擇部分視待使用之 ::::田胞而疋。一般而言，較佳宿主細胞為原核生物或真核生物(-般為哺乳動物)來源。應瞭解，為達成此目的，可使用任何同型之恆定區，包括1gG、IgM、IgA、IgD及 gE恒疋區，且此等丨互定p … 區了自任何人類或動物物種獲件0 a.使用原核宿主細胞產生抗體： i·載體建構編碼抗體之多肽組分的多術來獲得。可自酸序列可使用標準重組技 m ^ ^ ^ ^ ^ ^ , 胞（啫如嘁合瘤細胞）中分離所而I核苷酉夂序列並進行定庠。 1 ^PCRiiiff ^ 或者，可使用核苷酸合成裔：¾ PCR技術合成多核苷酸。 ^ A X ^ ^ ^ 獲侍、扁碼多肽之序列後，將其插入此夠在原核宿甲複1並表現異源多核苷酸之重 121445.doc -99- 200817435 組載體_。為達成太森^ X月之目的，可使用可用且在此項祜術中已知之多種載體。、技 ^ ^ 對適當载體之選擇主要應視待插入載體中之核酸分子的夫、小及待以載體而轉型之特定宿主細胞而疋。各載體視其功能(異源多核苷酸之擴增或表現，或者）及/、與其所在之特定宿主細胞的相容性而定，含有多種組件。載體細/生 ή/L A I / ^ ^、、且件一般包括（但不限於）··複製起點、選擇標記基因、啟動子、妨城躺#人 … 敬動子、核糖體結合位點（RBS)、信號序

列、異源核酸插入物及轉錄終止序列。一般而言，含有源自可與宿主細胞相容的物種之複製子及控制序列的質體載體可與此等宿主結合使用。載體一X般具有複製位點，以及能夠在轉型細胞中提供表型選擇之標記序列。舉例而言，通常使用_322，源自大腸桿菌種之質體使大腸桿菌轉型。pBR322含有編碼安比西林 (ampicillin，Amp)及四環素（tetracycline，Tet)抗性之其因’且因此提供易於鐘別轉型細胞之方式。pBR322、其衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可含有或經修飾而含有可藉由微生物有機體用於表現内源蛋白之啟動子。用於表現特定抗體之PBR322衍生物之實例詳細描述於Carter等人之美國專利第5,648,237號中。此外，含有與宿主微生物體相容之複製子及控制序列的噬菌體載體可用作與此等宿主有關之轉型載體。舉例而言，諸如XGEM™-11之噬菌體可用於製造重組載體，其可用於使易感宿主細胞（諸如大腸桿菌LE392)轉型。表現載體可包含兩個或兩個以上編碼多狀組分中之各者 121445.doc -100 - 200817435 之啟動子-順反子配對。啟動子為一種位於調節其表現之順反子上游（5，）的未經轉譯之調控序列。原核啟動子通常分為兩類，即誘導型及組成型。誘導型啟動子為一種在其控制之下隨培養條件之改變（例如#養物之存在或缺溫度之改變)而促使順反子之轉錄水平增加的啟動子。— 熟知為多種潛在宿主細胞識別之大量啟動子。藉由經由限制酶消化將所選擇之啟動子自源舰移除且將所分離之 (啟動子序列插入載體中可使該啟動子操作性地連接至編碼輕鏈或重鏈之順反子D N A。X然啟動子彳列及許多異源啟動子均可用於指引靶基因之擴增及/或表現。在某些實施例中，利用異源啟動子，因為與天然靶多肽啟動子相比，其一般允許所表現之靶基因的更大之轉錄及更高之產率。適於供原核宿主使用之啟動子包括ph〇A啟動子、卜半乳聚糖酶及乳糖啟動子系統、色胺酸（trp)啟動子系統及雜啟動子，諸如tac或trc啟動子。然而，在細菌中起作用之其 (.他啟動子（諸如其他已知之細菌或噬菌體啟動子）亦適用。其核苷酸序列已公開，藉此使用連接子或接合器（adapt〇r) 來提供任何所需限制位點，使得熟習者能夠可操作地連接該等核苷酸序列至編碼靶輕鏈及重鏈之順反子（SiebenlM 等人（1980) Cell 20: 269)。在本發明之一態樣中，重組載體内之每一順反子均包含引導所表現之多肽跨膜移位之分泌型信號序列組件。一般而言，信號序列可為載體之組件，或其可為插入載體中之靶多肽DNA的一部分。為達成本發明之目的，所選擇之信 121445.doc -101 - 200817435 號序列應I經宿主細胞識別及加工(亦即為信號肽酶所裂解）之信號序列。對於不識別及加工異源多肽之天然信號序列的原核宿主細胞而言，信號序列經（例如）選自由下列各物、、且成之群之原核信號序列取代：驗性磷酸酶、青黴素酶（penicillinase)、！ρρ或熱穩定性腸毒素II (STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、〇mp Α及 ΜΒΡ。在本發明之一實施例中，用於表現系統之兩順反子之信號序列為STII信號序列或其變異體。在另一態樣中，本發明之免疫球蛋白之產生可發生在宿主細胞之細胞質中，且因此不需要各順反子内分泌信號序列的存在。在該點上，免疫球蛋白輕鏈及重鏈經表現，折璺及組裝’在細胞質内形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株（例如，大腸桿菌trxjg-菌株）提供有利於二硫鍵形成之細胞質條件，藉此允許所表現之蛋白次單元的適當折疊及組裝。Proba 及 Pluckthun，Gene，159:203 (1995)。適於表現抗體之原核宿主細胞包括古細菌 (Archaebacteria)及真細菌（Eubacteria)，諸如革蘭氏陰性 (Gram_negative)或革蘭氏陽性有機體。適用細菌之實例包括埃希氏菌（Escherichia)(例如大腸桿菌）、桿菌（例如枯草芽孢桿菌（B· subtilis))、腸内細菌（Enterobacteria)、假單胞菌種（Pseudomonas species)(例如綠膿桿菌（ρ· aeruginosa))、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌（Serratia marcescans)、克雷伯氏菌 (Klebsiella)、變形桿菌屬（Proteus)、志贺氏菌屬 121445.doc -102- 200817435 (Shigella)、根瘤菌（Rhizobia)、透明顫菌（Vitreoscilla)或副球菌（Paracoccus)。在一實施例中，使用革蘭氏陰性細胞。在一實施例中，將大腸桿菌細胞用作本發明之宿主。大腸桿菌菌株之實例包括囷株W3 11 〇 (Bachmann，Cellular and Molecular Biology，第 2卷（Washington，D.C·: American Society for Microbiology，1987)，第 1190-1219 頁；ATCC 寄

存編號27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA (△tonA) ptr3 lac Iq lacL8 AompTA (nmpc-fepE) degP41 kanR之菌株33D3(美國專利第5,639,635號）。其他菌株及其衍生物亦適合，諸如大腸桿菌294 (ATCC 31，446)、大腸桿菌B、大腸桿菌λ 1776 (ATCC 31，537)及大腸桿菌rV3〇8 (ATCC 31，608)。此等實例為例示性的而無限制性。用於建構以上提及之具有所定義之基因型的細菌中之任一者之衍生物的方法在此項技術中為已知的且描述於（例如）Bass 等人’ Proteins，8:309-3 14 (1990)中。一般有必要考慮複製子在細菌細胞中之可複製性來選擇適當之細菌。舉例而 a ’當將热知之質體（諸如pBR322、pBR325、pACYC177 或PKN410)用於提供複製子時，大腸桿菌、沙雷氏菌或沙門氏菌種可適用作宿主。通常，宿主細胞應分泌極少量之蛋白水解酶，且可需要將額外蛋白酶抑制劑併入細胞培養物中。 ii·抗體產生用上述表現載體使宿主細胞轉型，且將其培養於在適當時經改質之習知營養培養基中以用於誘導啟動子、選擇轉 121445.doc -103 - 200817435 型物或使編碼所需序列之基因擴增。轉型意謂將DNA引入原核宿主中，為此使DNA作為染色體外元件或藉由染色體整合子為可複製的。視所用宿主細胞而定’使用適於此等細胞之標準技術完成轉型。一般將採用氯化鈣進行之鈣處理用於含有堅固細胞壁障壁之細菌細胞。另一轉型方法採用聚乙二醇/DMSO。所使用之又一技術為電穿孔。

使用以產生多肽之原核細胞在此項技術中已知且適於培養所選擇之宿主細胞的培養基中生長。適當培養基之實例包括加有必需營養物補充物iluria肉湯（LB)。在某些實施例中’培養基亦含有基於表現載體之建構而選擇之選擇劑，以便選擇性地允許含有表現載體之原核細胞的生長。舉例而s，將安比西林添加至培養基中以用於表現安比西林抗性基因之細胞的生長。亦可包括單獨地或作為與其他補充物或培養基（諸如複合氮源）之混合物以適當濃度引入的除碳、氮及無機磷酸 =來源外之任何必需補充物。視需要，培養基可含有一或夕種l自由下列各物組成之群的還原劑：麵胱甘肽、半耽胺酉夂胱胺、硫乙醇酸g旨、二硫赤藻糖醇及二硫蘇糖醇。在適當溫度下培養原核宿主細胞。對大腸桿菌生長而言，例如，較佳溫度在約抓至約听之範圍内變化，更佳在約25。(：至約3rC之範圍内變化，甚至更佳為約⑽。培養基之PH值可為在約5至約9範圍内變化之任一 pH值，心定°對大腸桿菌而言，PH值較佳為 121445.doc -104- 200817435 約6·8至約7.4 且更佳為約7.0。、右將誘導型啟動子用於表現載體中，則在適於使啟動子活化之條件下可料蛋自表現。在本發明之—態樣中，使用〇 Α啟動子來控制多狀之轉錄。為此，將經轉型之宿主、I 口養於石4敲鹽限制性培養基中以用於誘導。較佳地，

磷酸鹽限制性培暮A ^ 養基為C.R.A.P培養基（例如參見Simm〇ns 等人 ’ J· ImmUn〇1· Meth〇ds (2002)，263:133-147)。根據此項技術中所知，可根據所採用之載體建構體，使用多種其他誘導子。

在一個實施例中，係使本發明之經表現多肽分泌至宿主、、、田月。周貝内且自該等宿主細胞周質中回收。蛋白回收通常涉及般藉由諸如滲透性衝擊（osmotic sh〇ck)、超音波處或合解之方式使微生物分裂。細胞—但破裂後，可藉由離心或過濾來移除細胞碎片或完整細胞。可進一步⑼如) 藉由親和樹脂層析來純化蛋白。另一種方式是，將蛋白輸 ' 養土中且在其中進行分離。可將細胞自培養物中移除^過;慮培養物上清液且濃縮以進一步純化所產生之蛋白可進步使用諸如聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAC}E)及西方土”、占核疋的丨貝知方法來分離所表現之多肽且加以鑑別。 _在本&月之個怨樣中，藉由醱酵方法來大量產生抗體各種大規杈饋料分批醱酵程序可用於產生重組蛋白。大規杈醱酵具有至少公升之容量，較佳為約1，⑼〇至 y ，★ A升之各里。该等醱酵器係使用攪拌葉輪以分散氧及呂養物，尤其為葡萄糖（較佳之碳/能量源）。小規模醱 121445.doc 200817435 酵一般係指在僅有約100公升之體積容量且可在約丨公升至約100公升範圍内變化的醱酵器中醱酵。在醱酵過程中，通常在細胞已於適當條件下生長至所需密度（例如，OD^o為約18〇至22〇)後開始誘導蛋白表現作用，在此階段時細胞處於穩定期早期。根據此項技術中已知及上述，可根據所採用之載體建構體使用各種誘導子。可使細胞在誘導之前生長較短時間。雖然可使用更長或更短誘導時間，但通常將細胞誘導約12_5〇小時。為改良多肽之產率及品質，可改變各醱酵條件。舉例而吕，為改良所分泌之抗體多肽之適當組裝及折疊，可使用過度表現伴隨蛋白（諸如Dsb蛋白（DsbA、DsbB、DsbC、 DsbD及/或DsbG)或FkpA(具有伴隨蛋白活性之肽基脯胺醯基順反異構酶））之額外載體來進行宿主原核細胞之共轉型。已證實伴隨蛋白有利於細菌宿主細胞中所產生之異源蛋白之適當折疊及溶解。Chen等人（1999) J. Bio· Chem. 274:19601-19605; Georgiou 等人，美國專利第 6,〇83,715 號；Georgiou等人，美國專利第M27,888號；Bothmann及

Pluckthun (2000) J· Biol· Chem· 275:17100-17105; Ramm及 Pluckthun (2000) J· Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie 等人（2001) Mol· Microbiol. 39:199-210。為使所表現之異源蛋白（尤其為蛋白水解敏感者）之蛋白水解減至最少’可將缺乏蛋白水解酶之某些宿主菌株用於本發明中。舉例而言，可對宿主細胞菌株進行修飾以實現編碼已知之細菌蛋白酶（諸如蛋白酶ln、〇mpT、DegP、 121445.doc -106 - 200817435

Tsp、蛋白酶j、蛋白酶乂丨、蛋白酶v、蛋白酶…及其組合）之基因的基因突變。某些大腸桿菌蛋白酶缺乏之菌株可用且描述於（例如）J〇1y等人（1998)，上文；Ge〇rgi〇u等人，美國專利第5,264,365號；Georgiou等人，美國專利第5,5〇8，192 唬，Hara等人，Microbial Drug Resistance，2:63-72 (1996)。在具施例中’將缺乏蛋白水解酶且經過度表現一或多種伴隨蛋白之質體轉型的大腸桿菌菌株用作表現系統中之伤主細胞。〇 U1·抗體純化可採用此項方法中已知之標準蛋白純化方法。以下程序例不合適純化程序：以免疫親和柱或離子交換柱分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、以二氧化矽或以陽離子交換樹脂（諸如DEAE)層析、層析聚焦、SDS_PAGE、硫酸銨沈殿及使用（例如）SephadexG-75凝膠過渡。在一怨樣中’將固定於固相上之蛋白A用於全長抗體產 ( 物之免疫親和純化。蛋白A為來自金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureas)之41 kD細胞壁蛋白，其以高親和力結合至抗體之Fc區。Lindmark等人（1983) J. immun〇i· Meth· 62:1-13。用以固定蛋白A之固相較佳為包含玻璃或二氧化矽表面之管柱，更佳為可控孔玻璃管柱或石夕酸管柱。在某些應用中’用諸如甘油之試劑塗佈管柱以試圖防止污染物之非特異性黏著。作為純化之弟一步驟’將源自於如上所述之細胞培養物的製劑塗覆至固定蛋白A之固相上以使所關注之抗體特異 121445.doc -107- 200817435 性地結合至蛋白A。接著洗滌固相以移除非特異性地結合至固相之污染物。最後，藉由溶離自固相中回收所關注抗體。 b.使用真核宿主細胞產生抗體：載體組件一般包括（但不限於）以下之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列。 (0信號序列組件供真核宿主細胞用之載體亦可含有在所關注之成熟蛋白或多肽之N末端處具有特定裂解位點的信號序列或其他多肽。所選擇之異源信號序列較佳為由宿主細胞識別且加工 (亦即，A信號肽酶所裂解）之信號序列。纟哺乳動物細胞 j現中，哺乳動物信號序列以及病毒分泌引導序列（例如單純疱療gD信號）係可用的。此前驅物區之DNA在閱讀構架内連接至編碼抗 DNA。 (ii)複製起點 :般而言，哺乳動物表現載體無需複製起點組件。舉例起黑:。由於SV4G起點含有早期啟動子，故通常可僅使用該 (i i i)選擇基因組件 /現及輕㈣可含㈣擇基目，亦稱為 t。典型選擇基因編碼具有下列作用之蛋白··其⑷賦予= 抗生素或其他毒素（例如， ” 、西林、新黴素、甲胺喋呤 121445.doc 200817435 或衣素）之抗十生，（b)補充營養缺陷型不足（若相關）；或 (C)供應自複合培養基不可得之關鍵營養物。選擇方案之-實例利用藥物來阻滯宿主細胞之生長。經異源基因成功轉型之彼等細胞產生賦予藥物抗性之蛋白且因此在選擇方案中存活。此顯性選擇之實例使用藥物新徽素、黴酚酸及濕黴素（hygromyein)。哺乳動物細胞之合適可選標記之另—實例為可實現鑑別月b夠吸收抗體核酸之細胞的彼等者，諸如DHFR、胸苷激酶i屬硫蛋白-I及-n(較佳為靈長類動物金屬硫蛋白基因）、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶等。舉例而言’首先藉由在含有甲胺喋呤（MtxKDHFR之競爭性拮抗劑）之培養基中培養所有轉型物來鑑別經DHFr選擇基因轉型之細胞。當採用野生型DHFR時，合適宿主細胞為缺乏DHFR活性之中國倉鼠卵巢（CH〇)細胞株（例如 ATCC CRL_9096)。或者’可藉由在含有作為可選標記（諸如胺基糖苷抗生素，例如康黴素（kanamycin)、新黴素或G418)之選擇劑的培養基中之細胞生長來選擇經編碼抗體、野生型〇111711蛋白之DNA序列及另一可選標記（諸如胺基糖苷3，_磷酸轉移酶（ΑΡΗ))轉型或與其共轉型之宿主細胞（尤其含有内源 DHFR之野生型宿主）。參看美國專利第々々Η」99號。 (iv)啟動子組件表現及選殖載體通常含有為宿主生物體所識別且可操作地連接至抗體多肽核酸之啟動子。已知真核生物之啟動子 121445.doc -109- 200817435 序列。實際上所有真核基因均具有定位於轉錄起始位點上為約25至3G個鹼基處之AT富集區。在自許多基因轉錄起始處上游70至80個鹼基處發現的另一序列為cncaat區，其中N可為任何核苦酸（SEQ m N〇: 3)。在大部分真核基因之3,末端處為AATAAA序列，其可為添加p〇ly a尾至編碼序列（SEQ ID NO:4)之y末端的信號。所有此等序列均適於插入真核表現載體中。 ( 抗體多肽在哺乳動物宿主細胞中自載體轉錄係（例如）由 ^自病毒€諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（諸如腺病毒 2)、牛礼頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨化病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿病毒4〇 (SV4〇))基因組獲得之啟動子、異源哺乳動物啟動子（例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子）、熱休克啟動子所控制，其限制性條件為此等啟動子與宿主細胞系統相容。 SV40病毒之早期及晚期啟動子係作為亦含有sv4〇病毒 ( 複製起點之SV40限制性片段而便利地獲得。人類細胞巨化病毒之即刻早期啟動子係作為HindIII E限制性片段而便利地獲得。在哺乳動物宿主中使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體來表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號。此系統之改進描述於美國專利第4,601，978號。或者勞斯肉瘤病毒長末端重複序列（Rous Sarcoma Vims long terminal repeat) 可用作啟動子。 (v)增強子元件組件由較高級真核細胞轉錄編碼本發明之抗體多肽的dna通 121445.doc -110- 200817435 常係藉由將增強子序列插入載體中來增強。現已知許多增強子序列來自哺乳動物基因（血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素）。然而，吾人通常將使用來自真核細胞病毒之增強子。實例包括在複製起點之晚期的 SV40增強子（bp 100-270)、細胞巨化病毒早期啟動子增強子、複製起點之晚期的多瘤病毒增強子及腺病毒增強子。關於活化真核啟動子之增強元件亦參見Yaniv， 297:17-18 (1982)。雖然可將增強子在編碼抗體多肽之序列之5’或3’位置處剪接至載體中，但較佳定位於自啟動子之y 位點。 (vi) 轉錄終止組件用於真核宿主細胞中之表現載體通常亦將含有終止轉錄且穩定mRNA所必需之序列。該等序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA之5’及有時3,之未經轉譯區獲得。此等區含有在編碼抗體之mRNA之未經轉譯部分中轉錄為多聚腺嘌 ( 〜化片&的核苷酸區段。一種適用之轉錄終止組件為牛生長激素多聚腺嘌呤化區。參見w〇 94/11〇26及本文所揭示之表現載體。 (vii) 宿主細胞之選擇及轉型適用於在本文之載體中選殖或表現Dna之宿主細胞包括本文所述之較高級真核生物細胞，包括脊椎動物宿主細胞。在培養物（組織培養物）中脊椎動物細胞之繁殖已成為一種常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為以SV4〇轉型之猴腎CV1細胞株（c〇S_7, ATCC CRL 1651)、人類胚 121445.doc -111 - 200817435 胎腎細胞株（293細胞或次選殖以在懸浮培養物中生長之 293細胞，Graham等人，J. Gen Virol. 36:59 (1977))、幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO，Urlaub等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))、小鼠支持細胞（sertoli cell)(TM4，Mather，Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))、猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人類子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2)、犬科動物腎細胞 (MDCK，ATCC CCL 34)、水牛鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人類肺細胞（W138, ATCC CCL 75)、人類肝細胞（Hep G2, HB 8065)、小鼠乳房腫瘤（MMT 060562, ATCC CCL51)、TRI 細胞（Mather 等人，Annals Ν·Υ· Acad. Sci. 3 83:44-68 (1982))、MRC 5細胞、FS4細胞及人類肝細胞瘤細胞株（Hep G2)。用上述用於產生抗體之表現或選殖載體使宿主細胞轉型，並將其培養於在適當時經改質之習知營養培養基中以用於誘導啟動子、選擇轉型物或擴增編碼所需序列之基因。 (viii)培養宿主細胞用以產生本發明之抗體之宿主細胞可在多種培養基中培養。諸如Ham’s F10 (Sigma)、最低必需培養基（(MEM)， Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)及杜氏改良依格培養基 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)，Sigma)之市售培養基適於培養該等宿主細胞。此外，描述於Ham等人， 121445.doc -112- 200817435

Meth· Εηζ· 58··44 (1979)，Barnes等人，Anal· Bi〇chem 1〇2:255 (1980)，美國專利第4,767,7〇4號、第4,657,866號、第

4,927,762 號、第 4,560,655 號或第 5，122,469 號；WO 90/03430; WO 87/00195，·或美國專利 Re· 3〇,985 中之任一培養基可用作宿主細胞之培養基。任何此等培養基均可在有必要時經激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（諸如氯化鈉、I弓、鎂及磷酸鹽）、緩衝液（諸如HEPES)、核苦酸（諸如腺普及胸芽）、抗生素 (諸如GENTAMYCIN™藥物）、痕量元素（被定義為無機化合物，通常以在微莫耳範圍内之最終濃度存在）及葡萄糖或等效能源補充。亦可包括為熟習此項技術者應已知之適合濃度的任何其他必需補《劑。培養條#(諸如溫度、值及其類似條件）為先前用於所選擇之宿主細胞之表現所用的條件，且應為一般技術者所瞭解。 (ix)抗體之純化當使用重組技術時，可在細胞内產生抗體或直接分泌至培養基中。若抗體在細胞内產生’則作為第一步，例如藉由離心或超濾、來移除宿主細胞或溶胞片段之微粒碎片。^ 抗體被分泌至培養基中之情況下，一般首先用市售蛋白濃縮過滤器（例如Amicon或Millipore Pellic〇n超遽單元）來濃縮來自該等表現系統之上清液。在任何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。由細胞製備之抗體組合物可使用例如羥磷灰石層析、凝 121445.doc -113 - 200817435 膠電泳法、透析及親和層析來純化，其中親和層析為較佳純化技術。蛋白A作為親和力配位體之適宜性視存在於抗體中之任何免疫球蛋白Fc域的種類及同型而定。蛋白八可用於純化基於人類γΐ、γ2或γ4重鏈之抗體（Lindmark等人， J· Immunol· Meth. 62:1-13 (1983))。對所有小鼠同型及人類丫3推薦蛋白 G(Guss等人，EMBO J· 5:15671575 (1986))。親和配位體所附著之基質最常見為瓊脂糖，但亦可用其他基質。機械穩定性基質（諸如可控孔玻璃或聚（苯乙稀二乙烯）苯）允許比可用瓊脂糖達成之更快的流動速率及更短的處理時間。在抗體包含CH3域之情況下，Bakerb〇nd ABX™樹脂（j· τ· Baker，Phillipsburg，NJ)適用於純化。視待回收之抗體而定，亦可使用其它用於蛋白純化之技術，諸如離子交換管柱分級分離、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化石夕層析、以陰離子或陽離子交換樹脂（諸如聚天冬胺酸管柱）進行之肝素SEPHAROSEtm層析、層析聚焦、SDS_ PAGE及硫酸銨沈澱。在任何初步純化步驟後，可使包含所關注之抗體及污染物之混合物經受使用pH值在約2.5-4.5之間的溶離緩衝液較佳在較低鹽濃度（例如約0_0·25 Μ鹽）下進行之低pH值疏水相互作用層析。免疫共耗物本發明涵蓋免疫共軛物（可互換稱為，，抗體_藥物共軛物，，或”ADC”），其包含與細胞毒性劑（諸如化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、冑菌、植物或動物來 121445.doc -114- 200817435 源之酶活性毒素或其片段）或放射性同位素（亦即放射性共軛物））共軛之抗DLL4抗體。抗體-藥物共軛物用於局部傳遞細胞毒性劑或細胞生長抑制劑（亦即在癌症治療中用以殺死或抑制腫瘤細胞之藥物）之用途（Syrigos及 Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz及 Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26··151-172;美國專利4,975,278)允許藥物部分靶向傳遞至腫瘤且在其中細胞内累積，若全身投與此等未經共軛之藥劑可能會導致對正常細胞以及設法消除之腫瘤細胞而言不可接受之毒性水平（Baldwin等人，（1986) Lancet pp. (1986 年 3 月 15 日）:603-05; Thorpe，（1985) ’’Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review"，在 Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications 中，A. Pinchera 等人（編），第 475-506 頁）。因此，尋求最大功效與最小毒性。已報導多株抗體及單株抗體適用於此等策略中（Rowland等人，（1986) Cancer Immunol· Immunother·，21:183-87)。此等方法中所用之藥物包括道諾黴素、多柔比星、曱胺喋呤及長春地辛（Rowland等人， (1986)，同上文）。抗體-毒素共軛物中所用之毒素包括細菌毒素（諸如白喉毒素）、植物毒素（諸如蓖麻毒素）、小分子毒素（諸如格爾德黴素（geldanamycin)(Mandler等人 (2000) Jour, of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; Mandler 等人（2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler 等人（2002) Bioconjugate Chem. 121445.doc -115- 200817435 13:786_791)、美登素類（maytansinoid)(EP 1391213; Liu 等人，（1996) Proc· Natl. Acad. Sci· USA 93:8618-8623)及刺孢黴素（Lode 等人（1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman 等人 (1993) Cancer Res_53 :33 3 6-3 342)。該等毒素可藉由包括微管蛋白結合（tubulin binding)、DNA結合或拓樸異構酶抑制之機制來達成其細胞毒性及抑制細胞生長之作用。某些細胞毒性藥物當與大的抗體或蛋白受體配位體共輛時傾向於不具活性或具有較低活性。 ZEVALIN⑧（替伊莫單抗（ibritumomab tiuxetan)， Biogen/Idec)為由藉由硫脲連接子-螯合劑結合的鼠IgGlK 單株抗體（針對見於正常及惡性B淋巴細胞表面上之CD20 抗原）及11 hn或9GY放射性同位素組成之抗體-放射性同位素共幸厄物（Wiseman 等人（2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman 等人（2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig等人（2002) J. Clin. Oncol· 20(10):2453-63; Witzig等人（2002) J· Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。雖然 ZEVALIN 具有抗B細胞非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)之活性，但投藥在大多數患者體内引起嚴重且長期之血球減少。在2000年批准將 MYLOTARG™(吉妥單抗（gemtuzumab ozogamicin)， Wyeth Pharmaceuticals)(—種由連接至刺孢黴素之hu CD33 抗體組成之抗體藥物共軛物）藉由注射用於治療急性骨髓白血病（Drugs of the Future (2000) 25(7):686 ;美國專利第 4970198號、第 5079233號、第 5585089號、第 5606040號、第 5693762號、第 5739116號、第 5767285號、第 5773001 121445.doc -116- 200817435 號）。坎突單抗（Cantuzumab mertansine)(Immunogen， Inc.)(—種由經由二硫化物連接子SPP連接至美登素類藥物部分DM1之huC242抗體組成的抗體藥物共軛物）正進展至治療表現CanAg之癌症（諸如結腸癌、胰腺癌、胃癌及其他癌症）之 II 期試驗。MLN-2704 (Millennium Pharm·，BZL Biologies，Immunogen Inc·)(—種由連接至美登素類藥物部分DM1之抗前列腺特異性膜抗原（PSMA)單株抗體組成之抗體藥物共軛物）正處於前列腺腫·瘤之潛在性治療的研發中。使奥瑞他汀（auristatin)肽、奥瑞他汀E(AE)及單甲基奥瑞他汀（MMAE)(海兔毒素（dolastatin)之合成類似物）與嵌合單株抗體cBR96(對癌之路易斯Y (Lewis Y)具特異性）及 cAC 1 0(對血液惡性腫瘤之CD30具特異性）共耗（Doronina等人，（2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)且正處於治療研發階段。適用於產生免疫共軛物之化學治療劑於本文中加以描述 (例如上文）。可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌）、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素（modeccin)A 鏈、α-帚麴菌素（α-sarcin)、桐油樹蛋白（Aleurites fordii protein)、康乃馨蛋白（dianthin protein)、洋商陸蛋白 (Phytolacca americana protein)(PAPI、PAPII及 PAP-S)、苦瓜（momordica charantia)抑制劑、麻楓樹蛋白（curcin)、巴豆毒素（crotin)、鼠尾草（sapaonaria officinalis)抑制劑、天堂果蛋白、有絲分裂素（mitogellin)、侷限麴菌素 121445.doc -117- 200817435 (restrictocin)、紛黴素（phenomycin)、伊諾黴素（enomycin) 及黴菌毒素（tricothecene)。例如參見1993年10月28日公開之WO 93/21232。多種放射性核可用於產生放射性共軛之抗體。實例包括212Bi、131ΐ、ι”Ιη、9〇γ及i86Re。使用多種雙官能蛋白偶合劑製得抗體與細胞毒性劑之共輛物，該等蛋白偶合劑諸如N-琥珀醯亞胺基_3_(2_吡啶基二硫基）丙酸酯（SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷（IT)、醯亞胺酯之雙官能衍 (

生物（諸如己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如辛二酉文一琥珀醯亞胺酯）、酸類（諸如戊二駿）、雙-疊氮基化合物（諸如雙對疊氮基苯甲醯基）己二胺）、雙_重氮鹽衍生物 (諸如雙對重氮鹽苯甲醯基）_乙二胺）、二異氰酸醋（諸如甲笨2,6-二異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如1 二氟4_ 二硝基苯）。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如％⑻匕等人，Science，238:1098 (1987)中所述來製備。碳μ標記之 1-異硫氰基节基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸（mx_dt^為一種用於使放射性核苷酸與抗體共輛之你〈例不性螯合劑。參看 WO 94/11026。本文中亦涵蓋抗體與一或多種小分子表主 , 、，努素（諸如刺孢黴素、美登素類、海兔毒素、奥瑞他汀 w J 單端抱徽稀 (trichothecene)及 CC1065 以及具有毒素活^； μ / T生之此蓉|音夕衍生物）之共軛物。 Μ i·美登素（Maytansine)及美登素類在某些實施例中，免疫共軛物包含盘_ 〃或多個美登素類分子共軛之抗體（全長或片段）。 121445.doc -118· 200817435 美登素類為有絲分裂抑制劑，其藉由抑制微管蛋白聚合而起作用。美登素最先係自東非灌木齒葉美登木（east African shrub Maytenus serrata)分離（美國專利第 3,896，lu 號）。後來’發現某些微生物類亦產生美登素類，諸如美登醇（maytansinol)及C-3美登醇酯（美國專利第4，151，〇42 號）。合成美登醇及其衍生物及類似物例如揭示於美國專利第 4，137,230 號、第 4,248,870 號、第 4,256,746 號、第 (4,260,608號、第 4,265,814號、第 4,294,757號、第 4,307,016 號、第 4,308,268 號、第 4,308,269 號、第 4,309,428 號、第 4,313,946號、第 4,315,929號、第 4,317,821號、第 4,322,348 號、第 4,331，598 號、第 4,361，650 號、第 4,364,866 號、第 4,424,219號、第 4,450,254號、第 4,362,663 號及第 4,371，533 號中。美登素類藥物部分為抗體藥物共軛物中吸引人之藥物部为，此係因為其：⑴相對地易於藉由醱酵或化學改質、酸 ( 酵產物之衍生來製備’（ii)易於藉由適於經由非二硫化物連接子共輛至抗體之官能基衍生化，（iii)在血漿内穩定，及（iv)有效於對抗多種腫瘤細胞株。含有美登素類之免疫共軛物、製備其之方法及其治療用途係（例如）揭示於美國專利第5,2〇8,〇2〇號、第5,416,〇64號及歐洲專利EP 〇 425 235 B1中，該等專利之揭示内容據此以引用的方式明確併入本文。Liu等人，Pr〇c. Natl. Acad.

Sci· USA 93:8618-8623 (1996)描述包含連接至針對人類結腸直腸癌之單株抗體C242之美登素類（稱為DM1)的免疫共 121445.doc -119- 200817435 輛物。已發現共輛物對所培養之結腸癌細胞具有高度細胞毒性，且其在活體内腫瘤生長檢定中展示抗腫瘤活性。 Chari等人，Cancer Research 52:127_131 (1992)描述免疫共輛物’其中美登素類經由二硫化物連接子與結合至人類結腸癌細胞株上的抗原之鼠科動物抗體A7共軛，或與結合 HER-2/neu致癌基因之另一鼠科動物單株抗體⑴共軛：在活體外測試T A · 1 _美登素類共輛物對人類乳癌細胞株sk_

BR-3(其每個細胞表現3><1〇5個1^尺_2表面抗原）之細胞毒性。藥物共軛物達成與游離美登素類類似之細胞毒性程度，此可藉由增力口每個抗體分子之美登素類分子之數目而增加° A7_美登素類共輕物在小鼠中展示低全身性細胞毒性0 抗體-美登素類共軛物係藉由使抗體化學地連接至美登素類刀子’而不顯著降低抗體或美登素類分子之生物活性來製，。參看例如，美國專利第5,2G8，G2G號（該專利之揭 ’、内谷據此以引用的方式明確併人本文中）。平均每個抗體分：共軛3-4個美登素類分子已展示出增強對靶細胞之、、田胞毋丨生的功效’而對抗體之功能或溶解性並無不利影曰1 &預期甚至一分子毒素/抗體即可增強細胞毒性（優 /吏用裸抗體）。$登素類在此項技術中係熟知的，且可藉由已知之技術合成或自天然來源分離。適當之美登素類係（例如m示於美國專利第5,2〇M2〇號及上文提及之其他專=及非專利公開案中。較佳美登素類為美登醇及於美登醇刀子之方裱或其他位置經改質之美登醇類似物，諸如各 121445.doc -120- 200817435 種美登醇酯。此項技術中已知多種用於製造抗體-美登素類共軛物之連接基團，包括（例如）下列文獻中所揭示者：美國專利第 5,208,020號；或 EP專利〇 425 235 B1 ; Chari等人，Cancer Research 52:127-131 (1992)及 2004 年 10月 8 曰申請之美國專利申請案第10/960,602號，該等專利之揭示内容據此以引用的方式明確併入本文中。包含連接子組分SMCC之抗體_ 吴登素類共軛物可如20〇4年10月8曰申請之美國專利申請案第1〇/960,602號中所揭示來製備。連接基團包括如以上確定之專利巾揭示之二硫基、制基、酸不穩定性基團、光不穩定性基團、月大酶不穩、定性基團或_酶不穩定性基團，二硫基及賴基為較佳。額外連接基團描述及例示於本文中。抗體與美登素類之共概物可使用多種雙官能蛋白偶合劑來製得’肖等蛋白偶合劑諸如^琥珀亞胺基_3_(2_吡啶基二硫基）丙義（SPDP)、相醢亞胺基_4|馬㈣亞胺基甲基）¾己烧-1-緩酸酷曰（SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷 (IT)、醯亞胺酯之雙官能街月匕何生物（啫如己二醯亞胺酸二甲鹽酸鹽）、活性酯（諸如辛-醏一〒一I一琥珀醯亞胺酯）、如戊二醛）、雙-疊氮基化合物物（啫如雙_(對疊氮基苯甲醯己二胺）、雙-重氮鹽衍生物/ ) 初（4如雙_(對重氮鹽苯甲醯美乙二胺）、二異氰酸酯（諸如甲土如甲本2,6-二異氰酸酯）及雙氣化合物（諸如1，5-二氟_2,4_二 14 劑包括Ν_琥珀醯亞胺基^ ° 基·3-(2_吡啶基二硫基）丙酸酉旨 121445.doc -121 - 200817435 (SPDP)(Carlsson等人，Biochem· J. 173:723-737 (1978))及 N-琥珀醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基）戊酸酯（spp)以提供二硫鍵。視連接類型而定，可使連接子附著於美登素類分子之各位置處。舉例而言，可使用習知之偶合技術藉由與羥基反應形成酯鍵。反應可發生於具有羥基之C-3位置、經經甲基改質之C_ 14位置、經羥基改質之cq 5位置及具有羥基之 C-20位置。在一較佳實施例中，鍵形成於美登醇或美登醇類似物之C-3位置。 i i _奥瑞他丁及海兔毒素在某些實施例中，免疫共軛物包含與海兔毒素或海兔毒素肽類似物及衍生物、奥瑞他汀共軛之抗體（美國專利第 5635483號、第5780588號）。已顯示海兔毒素及奥瑞他汀干擾微管動力學、GTP水解以及核及細胞分裂（w〇yke等人 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584)且具有抗癌（US 5663 149)及抗真菌活性（pettit等人 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)。可經由肽藥物部分之N(胺基）末端或c(羧基）末端使海兔毒素或奥瑞他汀藥物部分附著於抗體（WO 02/088 172)。例示性奥瑞他汀實施例包括N末端連接之單甲基奥瑞他 >丁樂物部分 DE及 DF ’ 其在 ’’Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands，，，2004 年 11月 5 日申請之美國序列號弟10/983,340號中揭示，該參考文獻之揭示内容以全文引用的方式明確併入本文。 121445.doc -122- 200817435 通常’基於肽之藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。此等肽鍵可（例如）根據肽化學領域中熟知之液相合成方法（參看E· Schr5der&K.

Liibke，’’The Peptides"，第 1 卷，第 76-136 頁，1965,

Academic Press)製備。可根據以下中之方法製備奥瑞他汀/ 海兔毒素藥物部分：US 5635483; US 5780588; Pettit等人 (1989) J. Am. Chem· Soc· 1 11:5463-5465; Pettit等人（1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit，G.R.，等人 Synthesis，1996, 719-725及 Pettit 等人（1996) J· Chem. Soc· Perkin Trans· 1 5:859-863。亦參見Doronina (2003) Nat

Biotechnol 2 1(7): 778-784; ?f Monomethyl valine Compounds Capable of Conjugation to Ligands’’，2004 年 11月 5曰申請之美國序列號第10/983,340號（揭示例如連接子及製備共軛至連接子之諸如MMAE及MMAF之單甲基纈胺酸化合物的方法），其據此以全文引用的方式併入本文。 iii·刺胞黴素在其他實施例中，免疫共輛物包含與一或多個刺孢黴素分子共軛之抗體。抗生素之刺孢黴素家族能夠以亞皮莫耳濃度產生雙鏈DNA斷裂。對於刺孢黴素家族之共軛物的製備參見美國專利 5,712,374、5,714,586、5,739，116、 5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296 (所有均屬於American Cyanamid Company)。可使用之刺孢黴素結構類似物包括（但不限於）γ1Ι、α2Ι、α3Ι、N-乙醯基-丫11、PSAG及 ΘΙ1 (Hinman等人，Cancer Research 53:3336- 121445.doc • 123 - 200817435 3342 (1993)，Lode等人，Cancer Research 58:2925-2928 (1998)及上述American Cyanamid之美國專利）。抗體可共輛之另一抗腫瘤藥物為QFA，其為抗葉酸物。刺孢黴素及 QFA均具有細胞内作用位點且不易於穿過質膜。因此，此等劑經由抗體介導之内在化的細胞攝入極大地增強了其細胞毒性作用。 iv.其他細胞毒性劑可與抗體共軛之其他抗腫瘤劑包括BCNU、鏈脲佐菌素 (streptozoticin)、長春新鹼及5_氟尿嘧啶（美國專利第 5,053,394號、第5,770,710號中所述之共同稱為LL-E33288 複合物的藥劑家族），以及埃斯波黴素（eSperaniiCin)(美國專利 5,877,296)。可使用之酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌）、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素a鏈、莫迪素a鏈、α_帚麴菌素、桐油樹蛋白、康乃馨蛋白、洋商陸蛋白（ρΑΡΙ、ΡΑρπ及ρΑρ_ S)古瓜抑制劑、麻楓樹蛋白（curcin)、巴豆毒素、鼠尾草抑制劑、天堂果蛋白、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及黴菌毒素。參看例如1993予1〇月28日公開之 WO 93/21232。本發明另外涵蓋在抗體與具有核分解活性之化合物（例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，諸如脫氧核糖核酸酶’· DNase)之間形成之免疫共輛物。為選擇性地破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多 121445.doc -124- 200817435 種放射性同位素可用於產生放射性共軛之抗體。實例包括 At221i1'll31'I125'Y9〇>Re1-.Re-^Sm-3>Bi2->p3^ Pb及。之放射性同位素。當共軛物用於偵測時，其可包含適於閃爍攝影研究之放射性原子，例如tc99m或I123 ;或適於核磁共振（NMR)成像（亦稱作磁共振成像，mH)之自旋標記，諸如碘_123、碘-131、銦-111、氟-19、碳_13、氮-1 5、氧-17、釓、鎂或鐵。可以已知之方式將放射性標記或其他標記併入共軛物中舉例而口，可用生物學方法合成肽，或可藉由使用適當胺基酸前驅物進行化學胺基酸合成（例如，包含以氟_19 代替氫）來合成肽。諸如一^或丨⑵、^186、Re188&Inm之標記可經由肽中之半胱胺酸殘基附著。釔_9〇可經由離胺酸殘基附著。IODOGEN 方法（Fraker 等人（1978) Bi〇chem Biophys· Res· Commun· 8〇: 49巧7)可用於併入碘 _123。

Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphyf, (Chatal? CRC Press 1989)詳細描述了其他方法。可使用夕種雙g此蛋白偶合劑來製得抗體與細胞毒性劑之共軛物，該等蛋白偶合劑諸如沭琥轴醯亞胺基_3_(2_吡啶基二硫基）丙酸酯（SPDP)、琥珀醯亞胺基_4_(冰馬來醯亞胺基甲基）環己烷-1-羧酸酯（SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷 (IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物（諸如己二醯亞胺酸二甲酯鹽酸鹽）、活性醋（諸如辛二酸二琥轴醯亞胺、駿類（諸如戊二醛）、雙-疊氮基化合物（諸如雙气對疊氮基苯甲醯基）己一胺）、雙-重氮鹽彳叮生物（諸如雙、對重氮鹽苯甲醯基）_ 121445.doc -125 - 200817435 乙二胺）、二異氰酸酯（諸如曱苯2,6-二異氰酸酯）及雙活性 It化合物（諸如1，5 -二氟-2,4 -二硝基苯）。舉例而言，說麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science 238:1098 (1987)中所述來製備。碳14標記之1-異硫氰基苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸（MX-DTPA)為一種用於使放射性核苷酸與抗體共軛之例示性螯合劑。參見WO 94/11026。連接子可為有助於細胞中細胞毒性藥物之釋放之’’可分裂連接子’’。舉例而言，可使用酸不穩定性連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定性連接子、二甲基連接子或含二硫化物之連接子 (Chari等人，Cancer Research 52:127-131 (1992);美國專利第 5,208,020號）。化合物明確涵蓋（但不限於）用以下市售（例如來自Pierce Biotechnology，Inc·，Rockford，IL.，U.S.A)之交聯試劑製備的 ADC : BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、 MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、 SMPH、磺酸基-EMCS、磺酸基_GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB及SVSB (琥珀醯亞胺醯基-(4·乙烯砜）苯甲酸酯）。參見第 467-498 頁，2003-2004 Applications Handbook and Catalog 〇 ν·抗體藥物共輛物之製備在抗體藥物共軛物（ADC)中，抗體（Ab)經由連接子（L)與一或多個藥物部分（D)共軛，例如每個抗體約1至約20個藥物部分。式I之ADC可藉由若干途徑採用包括以下的熟習 121445.doc -126- 200817435 此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑來製備：（U 使抗體之親核基團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵带成Ab-L，接著與藥物部分反應；（2)使藥物部分之親核義團與二價連接子試劑反應以經由共價鍵形成D-L，接著與抗體之親核基團反應。用於製備ADC之額外方法於本文中描述。

Ab-(L-D)p I 連接子可由一或多種連接子組分構成。例示性連接子組分包括6-馬來醯亞胺基己醯基（”MC”）、馬來醯亞胺基丙醯基（"MP”）、纈胺酸瓜胺酸（，，val_cit”）、丙胺酸-苯丙胺酸 (Mala-phen)、對胺基苯甲氧基羰基（"pab”）、4-(2-吡啶基硫基）戊酸N-琥轴醯亞胺酯（”SPP，，）、4-(N-馬來醯亞胺基甲基）環己烷-1羧酸N-琥珀醯亞胺酯（”SMCC，，）及（4-碘-乙醯基）胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯（，，SIAB，，）。額外連接子組分在此項技術係已知的且某些描述於本文中。亦參見 MMonomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands1’，2004年11月5日申請之美國序列號第10/983,340 號，其據此以全文引用的方式併入本文。在某些實施例中，連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺基連接子組分包括^一狀、二狀、四狀或五狀。例示性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸（VC或val_cit)、丙胺酸-苯丙胺酸 (af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘胺酸綠胺酸_瓜胺酸 (gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸_甘胺酸（gly-gly_gly)。包含 121445.doc -127- 200817435 胺基酸連接子組分之胺基酸殘基包括彼等天然存在者，以及微量胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸連接子組分可經設計且使其選擇性最佳化而適於藉由特定酶（例如腫瘤相關之蛋白酶、組織蛋白酶B、c 及D或纖溶酶蛋白酶）酶分裂。抗體上之親核基團包括（但不限於）：（i)N末端胺基，⑴) 側鏈胺基，例如離胺酸，（iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸，及（iv)糖羥基或胺基，其中抗體經糖基化。胺基、硫醇基及羥基為親核的且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電子基團反應形成共價鍵，該等連接子部分及連接子試劑包括：（i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸鹽及酸鹵化物；（ii)烷基及苄基鹵化物，諸如鹵代乙醯胺；（出）醛類、酮類、羧基及順丁烯二醯亞胺基團。某些抗體具有可還原之鏈間二硫化物，亦即半胱胺酸橋。可藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇）之還原劑進行處理而使抗體具 (,有與連接子試劑共軛之反應性。因此，理論上每一半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫醇親核物質。可經由使離胺酸與 2-亞胺基硫雜環戊烷（Traut試劑）反應將額外親核基團引入抗體中，從而使胺轉化為硫醇。可藉由引入一個、兩個、三個、四個或四個以上半胱胺酸殘基（例如製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之突變體抗體）將反應性硫醇基團引入抗體（或其片段）中。亦可藉由改良抗體以引入親電部分來產生抗體藥物共輛物該等親電#分可與連接子試劑或藥物上之親核取代基 121445.doc -128- 200817435 反應。糖基化抗體之糖可經（例如）過峨酸鹽氧化試劑氧化以形成可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應的醛或酮基。所得亞胺希夫驗（Schiff base)基團可形成穩定的鍵，或可經（例如）硼氫化物試劑還原以形成穩定的胺鍵。在一實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉之反應可在蛋白中產生可與藥物上之合適基團反應的幾基（酸基及酮基）（Hermanson，Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白質可與偏過碘酸鈉反應，導致醛之產生以代替第一胺基酸。（Geoghegan 及 Stroh，（1992) Bioconjugate Chem· 3:138-146; US 5362852)。此酸可與藥物部分或連接子親核物質反應。類似地，藥物部分上之親核基團包括（但不限於）胺基、硫醇基、羥基、醯肼基、肟基、肼基、硫半卡基團、羧酸肼基團及芳基醯肼基團，該等基團能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電基團反應形成共價鍵，該等連接子部分及連接子試劑包括⑴活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸鹽及酸_化物；（ii)烷基及苄基_化物，諸如鹵代乙醯胺；（iii)醛類、酮類、羧基及順丁烯二醯亞胺基。或者，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白可（例如）藉由重組技術或肽合成製得。DNA之長度可包含編碼彼此相鄰或由編碼連接子肽之區域隔開（該隔開不會破壞所需共軛物特性）之共軛物的兩個部分之相應區域。在另一實施例中，抗體可與”受體”（諸如抗生蛋白鏈菌 121445.doc -129- 200817435 素)共軛以用於預靶向腫瘤’其中將抗體-受體共軛物投與患者，繼而使用清除劑自循環中移除未結合之共耗物，且接著投與與細胞毒性劑（例如放射性核㈣）共輛之"配位體" (例如抗生物素蛋白）。對DLL4多肽之共價修飾多肽拮抗劑或促效劑（例如多肽拮抗劑片段、DLL4融合分子（例如DLL4免疫黏附素）、抗DLL4抗體）之共價修飾包括在本發明之範疇内。可藉由化學合成或藉由酶分裂或化學分裂多肽（若適用時）來進行該等修飾。藉由使多肽之靶向胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或c末端殘基反應的有機衍生劑反應或藉由將經修飾之胺基酸或非天然胺基酸併入生長中之多肽鏈中，將對多肽的其他類型之共價修飾引入分子中，例如Ellman等人Mw/z.心叮所.202:301_336 (1991); Noren 等人 244:182 (1989)及美國專利申請公開案 20030108885 及 20030082575。半胱胺醯基殘基最常與a- i代乙酸酯（及相應胺諸如氯乙酸或氣乙醯胺）反應，以生成羧曱基或緩醢胺曱基衍生物。半胱胺醯基殘基亦藉由與溴三氟丙酮、α_演…β_(5_味唑基）丙酸、氯乙醯磷酸、Ν-烷基順丁烯二醯亞胺、石肖基-2-吨。定基二硫化物、甲基2-u比唆基二硫化物、對-氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氣硝基苯幷氧雜-1，3-二唆反應而衍生。組胺醯基殘基藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應而衍生，因為此試劑對組胺酿基側鍵具相對特異性。對_ 121445.doc -130- 200817435 /臭苯甲a&甲基溴亦適用；該反應通常在〇 · 1 μ二甲胂酸鈉中、pH值6.0下進行。使離胺酿基及胺基末端殘基與丁二酸酐或其他羧酸酐反應。此等試劑之衍生作用具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的作用。其他適用於衍生含心胺基之殘基的試劑包括醯亞胺醋（例如吼啶甲醯亞胺酸甲酯）、吡哆醛磷酸酯、吡哆醛、氯侧氫化物、三硝基苯磺酸、〇_甲基異脲、2,4_戊二酮，以及乙駿酸鹽（轉胺酶-催化反應）。精胺醯基殘基藉由與一種或若干種習知試劑反應而修飾’其中有苯乙二醛、2,3-丁二酮、1，2-環己二酮及茚三酮。因為脈官能基之高pKa，所以精胺酸殘基之衍生作用舄要δ亥反應在驗性條件下進行。此外’此等試劑可與離胺酸基團以及精胺酸ε_胺基反應。可藉由與芳族重氮化合物或四硝基甲烷反應進行酪胺醯基殘基之特異性修飾，其中尤其關注的為將光譜標記引入酪胺醯基殘基中。Ν-乙醯基咪唑及四硝基甲烷最常用於分別形成0-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。使用usj 或1對醅胺醯基殘基進行碳處理以製備用於放射性免疫檢定中之標記蛋白。藉由與碳化二醯亞胺（R-N=C=N-R’）（其中尺及R，為不同烷基’諸如1-環己基- 3-(2-嗎琳基-4 -乙基）碳化二醢亞胺或1_ 乙基-3-(4-氮鑌-4,4-二甲基戊基）碳化二醯亞胺）反應來選擇性地修飾羧基侧基（天冬胺醯基或麩胺醯基）。此外，天冬胺醯基殘基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應而轉化為天 121445.doc -131 - 200817435 冬醯胺醯基殘基及麩醯胺醯基殘基。通常分別使麩醯胺醯基殘基及天冬醯胺醯基殘基脫去醯胺基成為相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。此等殘基在中性或鹼性條件下脫去醯胺基。此等殘基之脫去醯胺基之形式屬於本發明之範疇。其他修飾包括脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或酥胺醯基殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之（X-胺基之甲基化（T.E. Creighton，iVokz·似.· and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co.5 San Francisco，第79-86 (1983)頁）、N末端胺之乙醯化及任何c 末端羧基之醯胺化。另一類型之共價修飾包含使醣苷化學地或酶促地偶合至本發明之多肽。此等程序的有利之處在於其無需在具有N 連接或0連接之糖基化的糖基化能力之宿主細胞中產生多肽。視所用偶合模式而定，可使該（等）糖連接至（a)精胺酸及組fe酸、（b)游離緩基、（c)游離疏基（諸如半脱胺酸之彼等疏基）、（d)游離羥基（諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之彼等經基）、（e)芳族殘基（諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之彼等芳族殘基）或（f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於1987年9月11日公開之w〇 87/05330以及Aplin及

Wriston, 第 259-306 頁（1981)中。存在於本發明之多肽上之任何碳水化合物部分的移除可以化學方式或酶促方式達成。化學去糖基化作用需要使多肽暴露至化合物三氟甲烷磺酸或等效化合物。此處理導致 121445.doc -132- 200817435 除連接糖（N-乙醯基葡糖胺或N_乙醯基半乳糖胺）之外的大多數或所有糖裂解，而多肽保持完整。由Hakimuddin等人之心政价叩咖· 259:52 (1987)及由Edge等人之」_/·历118:131 (1981)描述化學去糖基化。如由 Thotakura等人之汍心叮所〇/ 138:35〇(198乃所述例如抗體上之碳水化合物部分的酶促裂解可藉由使用多種内糖苷酶或外糖苷酶來達成。對本發明之多肽的另一類型之共價修飾包含以美國專利第 4,64〇,835 號、第 4,496,689 號、第 ^(π」44 號、第 4,670,417號、第4,791，192號或第4，179,337號中所述之方式使多肽連接至多種非蛋白聚合物（例如聚乙二醇、聚丙一醇或聚氧化烯）之一者。醫藥調配物藉由將具有所需純度之抗體與視情況之生理學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合（Remingt〇n: The以丨的“ ad (PFaCtiCe 0f Pharmacy第20版（2000))以水溶液、凍乾或其他乾秌凋配物之形式來製備包含抗體之治療調配物以供儲存在所抓用之劑量及濃度下，可接受之載劑、賦形劑或 L疋對接义者係無毒的，且包括緩衝液，諸如鱗酸鹽、挣棣酸鹽、組胺酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及曱硫胺酸；防腐劑（諸如十八基二甲基苄基氯化銨；氯化/、鲤季銨，氯化苯甲烴銨；苄索氯銨·，苯酚、丁基醇或苄基酉子’對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對.基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3 -戊 121445.doc -133 - 200817435 醇及間甲酚）’低分子量（小於約丨0個殘基）多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他石反水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如 EDTA]唐，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物（例如Zn_蛋白錯合物）及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、PLUR〇NICSTM 【或聚乙二醇（PEG)。本文之調配物亦可含有一種以上對於所治療之特定適應症為必需之活性化合物，較佳為彼等具有不會不利地影響彼此之互補活性的化合物。該等分子適合以有效於達成所欲目的之量組合存在。亦可將活性成份包埋於（例如）藉由凝聚技術或界面聚合而製備之微膠囊（例如分別為羥甲基纖維素或明膠_微膠囊 (；及聚（甲基丙烯酸甲酯）微膠囊）中，包埋於膠狀藥物傳遞系統（例如’脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊）中或包埋於巨乳液中。該等技術揭示於

Remington: The Science and Practice of Pharmacy $ 20 (2000)中。待用於活體内投藥之調配物必須無菌。此易於藉由經無菌過濾膜過濾來達成。可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之合適實例包括含免疫球蛋白之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質 121445.doc -134- 200817435 呈成形物件之形式’例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如聚（2_羥乙基_甲基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚交酯（美國專利第3,773,919號）、L_麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、非可降解乙烯_乙酸乙烯酯、可降解乳酸_乙醇酸共聚物（諸如LUpR〇N DEP〇T™)(由乳酸乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林 (leuprolide acetate)組成之可注射微球體）及聚_d_㈠-3羥 f ί: 基丁酸。雖然聚合物（諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸）使分子能夠經⑽天釋放’但某些水凝谬歷時較短時期釋放蛋白。當經囊封之免疫球蛋白留在體内長時間時，由於暴露於37t下之濕度故其可能變性或聚集，導致生物活 1·生之才貝失及免疫原性可能之改變。視所涉及之機制而定，

可設計合理策略以求鱗定。與〃丨 A I例而言，若發現聚集機制為經由硫基-二硫化物互換之分子間s_s鍵之形成，則穩定化可藉由改質疏基殘基、自酸性溶液束乾、控制濕度含量、使用合適添加物且研製特定聚合基質組合物來達成。進-步期望適用於本發明之藥劑可藉由基因療法引入受二者:其基因療法係指藉由將核酸投與受檢者所實施之：法。在基因療法應用中，將美 ……… 胞中以便達成活體内&成1療有效之基因產物，（例如）以#代缺陷汉義RNA及DNA可用作阻斷體内表現…劑。例如參見實例中"基因活月1 J r指迷之DLL4- 121445.doc -135- 200817435

SiRNA。已顯示可將短反義募核苷酸輸入細胞中，其中儘管由於細胞膜限制其攝入引起其在細胞内濃度較低，但其仍充當抑制劑。（Zamecnik 等人，Proc·Natl·Acad·Sci· USA 83:4143-4146 (1986))。可（例如）藉由用不帶電基團取代帶負電之磷醯二酯基來改質募核苷酸以增強其攝入。關於基因療法之方法的綜合評論例如參見Goldspiel等人之 Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu及 Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993); Morgan及 Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993) 及 May TIBTECH 11:155-215 (1993)。可使用之重組DNA 技術中通常已知之方法描述於Ausubel等人編，（1993)

Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，NY及 Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual，Stockton Press，NY 中0 劑量及投藥根據已知之方法，諸如以大丸劑靜脈内投藥或藉由經一段時間連續輸液、藉由肌肉内、腹膜内、腦脊髓内、皮下、關節内、滑液内、鞘内、經口、局部或吸入途徑及/ 或皮下投藥將分子投與人類患者。在某些實施例中，本發明之治療包括DLL4拮抗劑與一或多種抗癌劑（例如抗血管生成劑）之組合投與。在一實施例中，存在額外抗癌劑，例如一或多種不同抗血管生成劑、一或多種化學治療劑等。本發明亦涵蓋多種抑制劑之 121445.doc -136- 200817435 投與，例如抗同一抗原之多個抗體或抗不同癌症活性分子之多個抗體。在一實施例中，投與不同化學治療劑與 DLL4拮抗劑及/或一或多種抗血管生成劑的混合物。組合投與包括使用獨立調配物或單一醫藥調配物共投與及/或以任一次序連續投與。舉例而言，DLL4拮抗劑可在投與抗癌劑之前、之後、與之交替投與，或可隨其同時給與。在一實施例中，兩種（或所有）活性劑同時發揮其生物活性存在一段時間。為達成預防或治療疾病之目的，DLL4拮抗劑之適當劑 ϊ應視如上所定義之待治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及病程、抑制劑係出於預防還是治療之目的而投與、先前療法、患者之臨床病史及對抑制劑之反應以及主治醫師之判斷而疋。將抑制劑合適地在某一時刻或經一系列治療投 ( 〃心者。在組合治療方案中，本發明之組合物係以治療有效里或冶療增效量投與。如本文所用之治療有效量為投與 2發明之組合物及/或共投與DLL4拮抗劑及一或多種其他療劑導致靶向疾病或病症得以減少或抑制的量。藥劑組口之技與之效果可為加和性的。在一實施例中，投藥結果 :同效應/σ療增效量為協同地或顯著地減少或消除與特疋疾病相關之病狀或症狀所需的dll4拮抗劑及一或多種其他治療劑(例如血管生成抑制劑)之量。 /見疾病^類型及嚴重程度而定，無論（例如）藉由-或多技藥抑或藉由連續輸液，約1 gg/kg至50 mg/kg(例如 0.1-20 mg/k这、夕 ητ τ L4拮抗劑或血管生成抑制劑為投與患 121445.doc -137- 200817435 者之初始候選劑量。典型之每日劑量可能在約1 pg/kg至約 100 mg/kg或更高劑量之範圍内，此視上文所提及之因素而定。對於經數天或更長時間之重複投藥而言，視病症而疋’持續治療直至對疾病症狀之所需抑制發生。然而，其他劑1方案可為適用的。通常臨床醫師將投與分子直至達到提供所需生物效應之劑量。本發明之治療進程易於藉由習知技術及檢定來監控。舉例而言，A管生成抑制劑（例如抗Vegf抗體，諸如 AVASTIN® (Genenteeh))之製備及給藥時程可根據製造商之說明來使用或藉由熟習醫師評經驗來確定。在另一實施例中，該等化學治療劑之製備及給藥時程可根據製造商之說明來使用或藉由熟習醫師評經驗來確定。關於化學療法之製備及給藥流程亦描述於chem〇therapy 編， M.C. Perry, Williams & Wilkins，Baltimore，MD (1992)中。 Ά療功效本發明之治療功效可藉由評估贅生性或非贅生性病症所通用之各種端點來量測。舉例而言，可藉由（例如（但不限於））腫瘤消退、腫瘤重量或大小收縮、進展時間、生存持續時間、無進展生存期、總反應速率、反應持續時間及生 /舌π口質來評估癌症治療。因為本文所述之抗血管生成劑以腫瘤維管結構為靶向而不必以贅生性細胞自身為靶向，所以其代表獨特類別之抗癌藥物，且因此其可需要獨特之對藥物臨床反應的量測及定義。舉例而言，在二維分析中腫瘤收縮率大於50%為表示反應之標準截分點。然而，抑制 121445.doc -138- 200817435 劑可導致對轉移性擴散之抑制而非原發性腫瘤之收縮，或可僅發揮抑制腫瘤生長之作用。因此，可採用測定療法功效之方法，包括（例如）經由放射性成像量測血管生成之血漿或尿標記且量測反應。提供以下實例僅為達成例示性目的，而不欲以任何方式限制本發明之範脅。本說明書中所引用之所有專利及文獻參考的揭示内容均據此以全文引用的方式併入本文。實例除非另外指出，否則根據製造商之說明使用實例中提及之市售試劑。以下實例及整個說明書中藉由ATCC寄存編號識別之彼等細胞的來源為American Type culture Collection，Manassas，VA 20108。實例中引用之文獻列於實例之後。本文所引用之所有文獻據此均以引用的方式併入本文。實例1 :材料及方法以下材料及方法用於實例中。 HUVEC纖維蛋白凝膠珠粒檢定已描述即冗(：纖維蛋白凝膠珠粒檢定之詳情（Nakatsu，Μ· N·等人Microvasc Res 66，102-12 (2003))。簡言之，用每珠粒 35〇_4〇〇個 huvEC 塗佈 Cytodex 3珠粒（Amersham Pharmacia Biotech)。將約 200粒經HUVEC塗佈之珠粒埋置於12孔組織培養盤之一孔中的纖維蛋白凝塊中。將8 X 1 〇4個sf細胞塗於凝塊頂部。在7天與9天之間終止檢定以進行免疫染色及成像。在某些 121445.doc -139- 200817435 實驗中，藉由用生物素-抗CD31(純系WM59，eBi〇science) 及抗生蛋白鏈菌素-Cy3染色來目測HUVEC萌芽。對 HUVEC核染色而言，將纖維蛋白凝膠在2%多聚甲醛（PFA) 中固定隔夜，且用4’，6-二甲脒基-2-苯基吲哚（DAPI， Sigma)染色。對Ki67染色而言，將纖維蛋白凝膠用10X胰蛋白酶-EDTA處理5 min以移除頂層SF，用PBS中之10% FBS中和，且在4% PFA中固定隔夜。接著用PBST中之10% 羊血清阻斷纖維蛋白凝膠4 hr，用兔抗小鼠Ki67(備用，純系Sp6，LabVision)培育隔夜，接著用抗兔IgG-Cy3 (Jackson ImmunoResearch)進行第二次债測。所有隔夜培育均在4°C 下進行。小鼠新生視網膜研究對來自同窩仔之新生CD1小鼠腹膜内注射PBS或YW26.82(10 mg/kg)(Pl及P3)。收集眼睛 (P5)，且用PBS中之4% PFA固定隔夜。用PBST中之10%羊血清阻斷所切開之視網膜3 hr，接著用一次抗體培育隔夜。初始混合物包括經生物素標記之同工凝集素B4(25 pg/ml，Bandeiraea simplicifolia; Sigma)及以下之一者：兔抗小鼠Ki67 (1:1，備用，純系Sp6, Lab Vision)或小鼠Cy3-共輊之抗-a SMA (1:2000，Sigma-Aldrich)，以及 PBLEC 中之 10% 血清（1% Triton X-100，0.1 mM CaCl2，0.1 mM MgCl2, 0.1 mM MnCl2, PBS 中（pH 6.8))。接著在 PBST 中洗滌視網膜，且用Alexa 488抗生蛋白鏈菌素（1:200; Molecular Probes)與 Cy3-抗-兔 IgG(l:200; Jackson ImmunoResearch)之二次抗體組合培育隔夜。染色完成 121445.doc -140- 200817435 後，用PBS中之4% PFA後固定視網膜。所有隔夜培育均在 4°C下進行。藉由共焦螢光顯微法捕獲平直安裝之視網膜的影像。腫瘤模型使用8至10週大之米色雌性裸小鼠。為獲得皮下腫瘤，將0.1 ml含有5〇%基質凝膠（matrigel)(BD Bioscience)之細胞懸浮液注射至小鼠之右後側腹。將 5xl06個人類結腸癌HM7細胞、ιοχίο6個人類結腸癌 C〇1〇205細胞、l〇xl〇6個人類肺癌Caiu6細胞、ι〇χΐ〇6個人類肺癌MV-522細胞、l〇xl 〇6個小鼠白血病WEHI-3細胞、 l〇x 10個小鼠淋巴瘤EL4細胞、ι〇χ 1〇6個人類卵巢癌sk-〇V_3 XI細胞、ι〇χ1〇6個小鼠肺癌LL2細胞、1〇χ1〇6個白血病/淋巴瘤EL4細胞或ΙΟχΙΟ6個非小肺癌Η1299細胞注射至各小鼠中。對人類黑素瘤MDA-MB-435模型而言，將0.1 ml含有50%基質凝膠之細胞（5xio6個）懸浮液注射至小鼠之乳腺脂肪墊中。經由腹膜内投與抗DLL4抗體YW26.82(每公斤體重1 0 mg，每週兩次）。對以下腫瘤模型而言，各測試小鼠接收植入右側腹之皮下腫瘤片段（1 mm3):非小肺癌SKMES-1、人類乳癌ΜΧ-丨、人類結腸直腸癌SW62Q及人類腺癌LS 174T。腫瘤生長係藉由測徑規量測來定量。藉由量測長度⑴及寬度（w)且計算體積（v=lw2/2)來確定腫瘤體積（mm3)。每組包括1〇至15隻動物。使用雙尾Student丈測試進行處理組之統計學比較。腫廇血管標記及免疫組織化學用異氟烧（Is〇flurane)麻醉 J乳靜脈内，主射FITC“记之番蘇凝集素（LyC0persiC0n 121445.doc -141 - 200817435

Esculentum Lectin)(150 μΐ 0.9% NaCl 中 150 pg; Vector Laboratories)，且使其循環5 min，接著全身灌注。經賁門用PBS中之1% PFA灌注維管結構3 min。移除腫瘤且藉由浸入同樣固定液中2 hr進行後固定，繼而在30%蔗糖中培育隔夜以冷凍保護，接著埋置於OCT中。用抗小鼠CD3 1 (1:50，BD Pharmingen)接著 Alexa 594 羊抗大鼠 IgG (1:800, Molecular Probes)染色切片（4 μιη厚度）。小鼠腸之組織學及免疫組織化學將經福馬林（Formalin) 固定及石蠟埋置之小鼠小腸組織切片成3 μηι厚。如製造商 (PolyScientiflc)所推薦，用艾爾遜藍（Alcian blue)進行腸細胞類型之組織化學鑑別。對抗Ki67染色而言，用Target Retrieval Solution (S1700，DAKO)預處理切片，且用兔抗 Ki67 (1:200，clone SP6，Neomarkers)培育。用 Vectastain ABC Elite 套組（Vector labs)摘測 7·5 g/ml 之二次羊抗兔 (Vector labs)。所有經Ki67染色之切片均經Mayer之蘇木精複染色。對HES-1染色而言，使用抗大鼠HES_1 (純系NM1， MBL，International)，接著 TSA-HRP。 RNA干擾自Dharmacon購得靶向人類DLL4之SMARTpool 小干擾RNA(siRNA)雙鏈體及Si對照非靶向siRNA #2。使用 Optimem-Ι 及 Lipfectamine 2000 (Invitrogen)藉由 HUVEC 以40%融合進行siRNA雙鏈體（50 nM)之轉染。在siRNA轉染後 48 hr，進行 FACS 分析。4抗 DLL4 SMART pool siRNA 之序列如下： CAACTGCCCTTATGGCTTTTT(SEQIDNO: 5)(01igo 卜正義）， 121445.doc -142- 200817435 AAAGCCATAAGGGCAGTTGTT(SEQIDNO: 6)(01igo 1，反義）， CAACTGCCCTTCAATTTCATT (SEQ ID NO: 7) (Oligo 2，正義）， TGAAATTGAAGGGCAGTTGTT (SEQ ID NO: 8) (Oligo 2，反義）， TGACCAAGATCTCAACTACTT(SEQIDNO:9)(01igo3，正義）， GTAGTTGAGATCTTGGTCATT(SEQIDNO: 10)(Oligo3，反義）， GGCCAACTATGCTTGTGAATT(SEQIDNO: ll)(01igo4，正義）， TTCACAAGCATAGTTGGCCTT(SEQIDNO: 12)(01igo4，反義）。 Notch配位體：Notch阻斷ELISA用重組大鼠Notch 1-Fc (rrNotchl-Fc，R&DSystems)以0.5μg/ml塗佈96孔微量滴定盤。在此檢定中使用含有DLL4-AP(融合至人類胎盤鹼性磷酸酶之DLL4胺基酸1-404)之改良性培養基。為製備改良性培養基，用具有Fugen6試劑（Roche Molecular Biochemicals)之表現DLL4-AP的質體暫時轉染293細胞。轉染後5天，收穫改良性培養基，過濾且儲存在4°C下。室溫下用在賦予50%最大可達成之與所塗佈rrNotchl-Fc之結合之稀釋度下的DLL4-AP改良性培養基預先培育經滴定之 0· 1 5 pg/ml至2 5 pg/ml之純化抗體1 hr。接著在室溫下將抗體/DLL4-AP混合物添加至經rrNotchl-Fc塗佈之培養盤中，歷時1 hr，此後在PBS中將培養盤洗滌數次。使用1 -Step PNPP (Pierce)作為底物且使用OD 405 nm吸光率量測來偵測所結合之DLL4-AP。用DLL1-AP(人類DLL1，胺基酸1-445)進行同樣檢定。用經純化之DLL4-His (C-末端His-標記之人類 DLL4，胺基酸 1-404)及 Jagl_His (R & D system) 進行類似檢定。用小鼠抗His mAb (1 pg/ml，Roche Molecular 121445.doc -143 - 200817435

Biochemicals)、經生物標記之羊抗小氣（Jackson ImmunoResearch)及抗生蛋白鏈菌素·ΑΡ (Jackson ImmunoResearch)彳貞測所結合之His標記之配位體。 RNA萃取及即時定量RT-PCR按照製造商之說明使用 RNeasy Mini套組（Qiagen)自2D培養物中之HUVEC中萃取全部RNA。為自生長在纖維蛋白凝膠中之HUVEC中萃取全部RNA，用10X胰蛋白酶-EDTA (Gibco)處理纖維蛋白凝膠5 min以移除頂層纖維母細胞，繼而用PBS中之10% FBS 中和。接著自組織培養孔中移除凝膠凝塊且使其於微管中經受離心分離（10K，歷時5 min)以移除過量流體。用溶解緩衝液（RNeasy Mini Kit)溶解所得凝膠π離心塊”，且進一步如用2D培養物中之HUVEC處理。使用RNA 6000 Nano Chip及 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)評估 RNA 品質。使用 7500 即時 PCR 系統（Applied Biosystems) 進行即時定量RT-PCR反應，重複三次。人類GAPDH用作用於標準化之參考基因。將表現水平表示為相對於對照之來自3個獨立測定的平均（士SEM)倍數mRNA變化。 VEGFR2、TGFp2及GAPDH之正向及反向引子及探針序列如下： TGFb2 正向：GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC ΤΑ (SEQ ID NO: 13) 反向：CAT CAT CAT TAT CAT CAT CAT TGT C (SEQ ID NO: 14) 探針：AATTCTTGGAAAAGTGGCAAGACCAAAAT(SEQIDNO: 15) VEGFR2 121445.doc -144- 200817435 正向：CTTTCCACCAGCAGGAAGTAG(SEQIDNO: 16) 反向：TGCAGTCCGAGGTCCTTT(SEQIDNO: 17)

探針：CGCATTTGATTTTCATTTCGACAACAGA(SEQIDNO: 18) GAPDH 正向：GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC (SEQ ID NO: 19) 反向：GAA GGT GAA GGT CGG AGT C (SEQ ID NO: 20) 探針：CAA GCT TCC CGT TCT CAG CC (SEQ ID NO: 21) 實例2 :噬菌體抗DLL4抗體之產生藉由在重鏈及輕鏈之互補判定區（CDR)内引入多樣性在單個構架（人化抗ErbB2抗體，4D5)上建構合成噬菌體抗體文庫（Lee，C· V·等人之 J Mol Biol 340，1073-93 (2004); Liang，W. C·等人之 J Biol Chem 281，951-61 (2006))。針對固定於maxisorp免疫培養盤上之His標記之人類DLL4(胺基酸1-404)進行天然文庫之培養盤淘選。在四輪富集之後，隨機揀選純系，且使用噬菌體ELISA鑑別特異性結合物。進一步用His標記之鼠科動物DLL4蛋白篩檢所得hDLL4結合純系以鑑別跨物種純系。對每一陽性噬菌體純系而言，可將重鏈及輕鏈之可變區次選殖入經工程化而表現全長 IgG鏈之pRK表現載體。將重鏈及輕鏈建構體共轉染至293 細胞或CHO細胞中，且使用蛋白質A親和管柱自無血清之培養基中純化所表現之抗體。藉由ELISA測試經純化之抗體對DLL4與大鼠Notchl-Fc之間的相互作用之阻斷，且藉由FACS測試其與表現全長人類DLL4或鼠科動物DLL4之穩定細胞株的結合。對親和力成熟而言，藉由軟性隨機化策 121445.doc -145- 200817435 略建構具有CDR環之三種不同組合（CDR-L3、CDR-H1及 CDR-H2)(來源於所關注之初始純系）之噬菌體文庫，以便使得各所選位置突變為非野生型殘基或以約50:50頻率維持為野生型（Liang等人，2006，上文）。接著在逐漸增加之嚴格度下經由四輪針對人類與鼠科動物His標記之DLL4蛋白質之溶液相淘選來鑑別高親和力純系。實例3 :抗DLL4抗體之表徵抗 DLL4 Mab YW26.82:抗 DLL4 Mab 26.82 之抗原決定基定位識別存在於人類DLL4胞外域（ECD)之類EGF重複序列號2 (EGL2)中的結合決定子。EGL2包含人類DLL4 ECD 之胺基酸252-282。簡言之，DLL4 ECD突變體係表現為鹼性磷酸酶融合蛋白且結合至抗體（如所評估）。圖5a描述一組表現為C末端人類胎盤鹼性磷酸酶（AP)融合蛋白之DLL4 突變體的圖示。括弧說明融合蛋白中所包括之DLL4序列。在經純化抗 DLL4 Mab (YW26.82, 0.5 pg/ml)塗佈之 96 孔微量滴定盤上測試含有融合蛋白之293T細胞改良性培養基。使用1-Step PNPP (Pierce)作為底物且使用OD 405 nm 吸光率量測來偵測所結合之DLL4-AP。Mab YW26.82結合包含DLL4 EGL2域之建構體且不結合缺乏DLL4 EGL2域之建構體。此證實抗DLL4 Mab YW 26.82識別人類DLL4 ECD之EGL2域中之抗原決定基。

Mab YW26.82選擇性地結合至小鼠及人類DLL4。用經純化之重組蛋白（如指示，1 pg/ml)塗佈96孔Nunc Maxisorp 盤。藉由ELISA檢定來量測在所指示之濃度下之YW26.82 121445.doc -146- 200817435 的結合。使用TMB作為底物且使用OD 450 nm吸光率量測，就抗人類抗體HRP共輛物而言，偵測所結合之抗體。抗HER2及重組ErbB2-ECD用作檢定對照（圖5b)。此實驗之結果展示於圖5b中。Mab YW26.82結合人類及小鼠DLL4，且無法偵測到其結合至人類DLL1及人類JAG1。此等結果證實Mab YW26.82選擇性地結合至DLL4。對經載體、全長DLL4、Jagl或DLL1暫時轉染之293細胞的FACS分析亦證實Mab YW20.82選擇性地結合至DLL4 〇如圖5c中所示，僅針對經DLL4轉染之細胞（頂部圖）偵測到 YW26.82之顯著結合。針對經DLL1或Jagl轉染之細胞未偵測到顯著結合。分別藉由重組大鼠Notchl-Fc (rrNotchl-Fc，中間圖）及重組大鼠Notch2-Fc (rrNotch2-Fc，底部圖）之結合證實Jagl及DLL1之表現。使用2 pg/ml之 YW26.82、rrNotchl-Fc 或 rrNotch2-Fc (R& D system)，接著羊抗人類 IgG·PE (1:500，Jackson ImmunoResearch)。競爭性實驗證實Mab YW26.82有效且選擇性地阻斷 Notch與DLL4而非其他Notch配位體之相互作用。如圖5d 中所示，抗DLL4 Mab阻斷DLL4-AP而非DLL1-AP結合至經塗佈之rNotchl，其中計算出IC50為約12 nM(左圖）。抗 DLL4 Mab阻斷DLL4-His而非Jagl-His結合至經塗佈之 rNotchl，其中計算出IC50為約8 nM(右圖）。抗DLL4 Mab YW26.82特異性地結合至在人類臍靜脈内皮細胞（HUVEC)中内源性表現之DLL4。進行對經對照或 DLL4特異性之siRNA轉染之HUVEC的FACS分析。使用2 121445.doc -147- 200817435 pg/ml 之 YW26.82，接著羊抗人類 IgG-PE (1:500，Jackson ImmunoResearch)。此實驗之結果展示於圖5e中。觀測到結合至未經轉染之HUVEC(對照）及經對照siRNA轉染之 HUVEC。相比之下，在經DLL4 siRNA轉染之HUVEC中結合顯著減少。此等實驗證實抗DLL4 Mab YW26.82特異性地結合至在HUVEC中内源性表現之DLL4。實例4:用抗DLL4抗體處理增加活體外内皮細胞增殖在共培養之人類皮膚纖維母細胞（SF)細胞存在下生長於纖維蛋白凝膠中的人類臍靜脈内皮細胞（HUVEC)產生具有獨特腔狀結構之萌芽（Nakatsu，Μ· N.等人Microvasc Res 66，102-12 (2003))。添加抗DLL4抗體YW26.82顯著增加萌芽之長度及數量（圖1 a)。藉由蛋白複合物之γ分泌酶活性催化的Notch蛋白水解加工為Notch活化期間之基本步驟 (Baron，M. Semin Cell Dev Biol 14，113-9 (2003))。有趣地為，γ分泌酶抑制劑二苯幷氮呼（dibenzazepine，DBZ)(van Es，J· Η·等人，Nature 435，959_63 (2005); Milano，J.等人，Toxicol Sci 82, 341-5 8 (2004))對 HUVEC 萌芽具有相同之作用。假定此兩種處理之機制不同，增加之萌芽明顯可歸因於Notch信號轉導之衰減。Ki67染色顯示增加之EC萌芽係歸因於升高之細胞增殖（圖lb)。在初始纖維蛋白凝膠檢定中，HUVEC萌芽及隨後之腔形成為共培養之SF細胞所支持。藉由用改良性培養基代替SF細胞，抗DLL4 Mab 及DBZ仍能夠增加HUVEC萌芽（圖ic)，此證明EC對 DLL4/Notch信號轉導之自主角色。在相反實驗中，藉由固 121445.doc -148 - 200817435 定之DLL4蛋白活化Notch導致顯著生長抑制（圖le)。此等發現表明DLL4/Notch信號轉導之活化狀態與EC增殖緊密相關。實例5 :用抗DLL4抗體處理增加活艎内内皮細胞增殖在明確之事件序列中出生後早期小鼠視網膜形成定型血管模式（Stone，J.及 Dreher，Z. J Comp Neurol 255，35-49 (1987); Gerhardt，Η·等人 J Cell Biol 161，1163-77 (2003); Fruttiger, M. Invest Ophthalmol Vis Sci 43，522-7 (2002)) o DLL4在新生視網膜中之生長中的EC中之顯著及動態表現表明DLL4調控視網膜血管發育之可能作用（Claxton，S.及 Fruttiger，M. Gene Expr Patterns 5，123-7 (2004))。 YW26.82之全身傳遞導致視網膜維管結構之重大改變。EC 之大量累積發生在視網膜中，產生具有原生血管形態之片狀結構（圖1 d)。觀測到EC中Ki67標記顯著增加，此表明升高之EC增殖（圖lh)。因此，在新生小鼠中DLL4阻斷後的視網膜EC之此過度增殖性表型確證活體外發現。實例6 : DLL4/Notch調控上皮細胞增殖之基本作用 VEGF控制EC之若干基本態樣（Ferrara，N. Exs，209-31 (2005); Coultas，L.等人，Nature 438，937_45 (2005))。然而，對於如何將VEGF信號轉導整合至複雜血管過程（諸如動靜脈（AV)分化及階層式血管組織形成，明顯要求額外高度協調之信號轉導路徑的事件）中還理解得不夠。斑馬魚中之基因研究表明VEGF在動脈内皮分化期間於Notch路徑之上游起作用（Lawson，N. D.等人，Development 128, 121445.doc -149- 200817435 3675-83 (2001))。吾人發現VEGF對HUVEC之刺激引起 DLL4表面表現增加（資料未顯示），此與近來關於藉由 VEGF刺激上調DLL4 mRNA的報道一致（Patel，N· S·等人， Cancer Res 65，8690-7 (2005))。有趣地為，在Notch活化後DLL4自身上調（圖6)，此表明DLL4有效地使VEGF信號轉導轉至Notch路徑之正反饋機制。簡言之，在DBZ (0.08 μΜ)缺乏或存在之情況下藉由固定C末端His標記之人類 DLL4(胺基酸1-404)刺激HUVEC。在刺激後36 hr，藉由 FACS分析以抗DLL4抗體檢測内源性DLL4表現。顯著地，由於阻斷Notch信號轉導而發生之EC過度增殖將仍視VEGF而定。在3D纖維蛋白凝膠培養物中，在DBZ 存在或缺乏之情況下，用抗VEGF Mab處理消除大部分EC 萌芽（圖If)，此提高了過度增殖行為可能部分歸因於增強之VEGF信號轉導的可能性。事實上，YW26.82或DBZ阻斷 Notch導致VEGFR2之上調（圖lg)。相反，固定之DLL4活化 Notch抑制VEGFR2之表現（圖lg)。因此，雖然VEGF可在 DLL4/Notch路徑之上游起作用，但DLL4/Notch能夠經由負性調控VEGFR2表現來良好地調整反應。實例7 :用抗DLL4抗體處理阻斷内皮細胞分化且阻斷動脈發育除EC增殖增加外，拮抗DLL4/Notch引起纖維蛋白凝膠中EC萌芽之顯著形態改變。多細胞腔狀結構大都缺乏（圖 2a)，此表明缺乏EC分化。在經Mab YW26.82處理之視網膜中，經向交替之動脈及靜脈之特徵模式得到嚴重破壞。 121445.doc -150- 200817435 與視網膜動脈相關聯之抗以平滑肌肌動蛋白（ASMA)染色完全不存在（圖2c)。此觀測顯著類似於DLL4+/-胚胎中之缺陷動脈發育。來自不同角度之此等發現突出DLL4/Notch在调控E C分化上之基本作用。實例8 : TFGp表現與Notch之活化狀態相聯繫類似於Notch路徑，TGFp信號轉導視環境而定且對細胞分化、增殖及生長抑制具有不同且常為相反之作用。此外，TGFP路徑涉及血管過程（Urness，l. D.等人，Nat

Genet 26，328-31 (2000); Oshima，Μ·等人，Dev Biol 179 297-302 (1996); Larsson，J.等人，Embo J 20，1663-73 (2001))。舉例而言，類活化素受體激酶i (ALKi)(EC特異性I型TGFP受體）之缺乏導致卵黃囊中之原生ec網狀物及動靜脈功能不良（AVM)(具有缺陷Notch信號轉導之小鼠共有的表型）(Urness，L. D_ 等人，Nat Genet 26，328-31 (2000); Iso，Τ·荨人 ’ Arterioscler Thromb Vase Biol 23 543-5 3 (2003))。此導致吾人研究此兩種路徑之間的可能關係。吾人發現TGFP2之表現（圖2b)與Notch之活化狀態緊密相關’此表明TGFp路徑可在Notch路徑之下游起作用。總之，吾人之發現支持一種模型，其中用作”信號轉導路由器之DLL4/Notch轴經由調控DLL4表現來整合vegF信號轉導且接合TGFP路徑以促進EC分化。實例9 :用抗DLL4抗艘處理抑制活體内腫瘤生長為直接說明DLL4/Notch信號轉導在腫瘤血管生成期間之可能作用，研究阻斷DLL4對臨床前腫瘤模型中腫瘤生長 121445.doc -151 - 200817435 之影響（圖3a-d)。在HM7、C〇1〇205及Calu6異種移植腫瘤模型中（圖3a-c)，在腫瘤確定（腫瘤大小>250 mm3)後開始 YW26.82處理。在所有三個模型中，對照組與處理組之間的生長速度之分離在給藥後3天變得明顯。處理組之腫瘤體積經2週處理保持不變。除皮下腫瘤外，抗DLL4 Mab亦抑制小鼠乳腺脂肪墊中之腫瘤生長。在MDA-MB-435腫瘤模型中，在腫瘤細胞注射後14天開始處理。對照組與處理組之間的腫瘤生長曲線之差異在給藥後6天内變得明顯且當處理持續時，差異愈加顯著（圖3d)。亦研究阻斷DLL4及/或VEGF對臨床前腫瘤模型中眾多腫瘤生長之影響（圖3e-f; i-p)。在MV-522及WEHI3異種移植腫瘤模型中，在腫瘤確定（腫瘤大小>250 mm3)後開始 YW26.82處理及/或抗VEGF處理。在MV_522模型中，雖然 YW26.82及抗VEGF處理均個別地抑制腫瘤生長，但兩種處理之組合最為有效。在WEHI3模型中，抗VEGF處理顯示對腫瘤生長無效，而經YW26.82處理顯示顯著抑制腫瘤生長。在 SK-OV-3X1、LL2、EL4、H1299、SKMES-1、 MX-1、SW620及LS174T模型中，在確定腫瘤後給予 YW26.82處理（5 mg/kg，腹膜内，每週兩次）及/或抗VEGF 處理（5 mg/kg，腹膜内，每週兩次）。在此等模型之每一者中，僅YW26.82處理抑制腫瘤生長。此外，在對組合進行測試之所有此等模型中，YW26.82與抗VEGF組合顯示增強之功效。實例10:用抗DLL4抗體處理增加腫瘤内皮細胞增殖 121445.doc -152- 200817435 就腫瘤生長抑制而言，使用EL4小鼠淋巴瘤腫瘤模型來進行血管組織學研究。發現抗DLL4 Mab處理導致内皮細胞密度顯著增加（圖3 g)。相比之下，在此模型中，雖然兩處理顯示類似功效，但抗VEGF具有完全相反之效果（圖 3g)。實例11:用抗DLL4抗體處理抑制腫瘤血管灌注因為活體外阻斷DLL4/Notch路徑削弱藉由EC形成腔狀結構（圖2a)，所以研究經抗DLL4 Mab處理是否引起腫瘤維管結構之類似缺陷且影響有效血液流動。用FITC-凝集素全身灌注顯示抗DLL4 Mab處理導致腫瘤血管之凝集素標記顯著減少（圖3h)。明顯地，顯示ALK1缺陷小鼠中之動靜脈功能不良引起反常之血液循環（Urness，L· D.等人，Nat Genet 26，328-3 1 (2000))。假定 DLL4/Notch信號轉導對 AV 分化具有重要作用，在胚胎及出生後早期視網膜中，抗 DLL4 Mab可影響腫瘤EC之細胞命運特化且導致缺陷定向之血液流動。實際上，在經抗DLL4 Mab處理之C〇1〇205腫瘤中，存在其中高EC密度與低可變腫瘤細胞含量相關之區域，此表明不良血管功能。需要利用血管成像技術進行之其他研究以獲得對準確血管缺陷之瞭解。實例12 : DLL4/Notch對小鼠腸之穩定而言並非必需假定Notch信號轉導對調控出生後自身更新系統之穩定具有多效性作用，關於Notch之總的抑制作用之主要擔憂在於其可能為有害的。舉例而言，需要Notch信號轉導來維持腸内未經分化之隱窩祖細胞（van Es，J. H.等人， 121445.doc -153 - 200817435

Nature 435, 959-63 (2005); Fre，S·等人，Nature 435, 964-8 (2005))。實際上，γ分泌酶抑制劑（其將不加選擇地阻斷所有Notch活性）引起齧齒動物中不希望有之副作用，此歸因於隱窩室内杯狀細胞大量增加（Milano，J.等人，Toxicol Sci 82, 341-58 (2004); Wong，G. Τ·等人，J Biol Chem 279, 12876-82 (2004))。藉由免疫組織化學分析檢查經抗DLL4 Mab處理之小鼠之小腸。與DBZ處理對比，在處理6週後，鑑別出在抗DLL4 Mab與對照組之間上皮隱窩細胞分化或增殖概況無差異（圖4)。此外，抗DLL4 Mab不改變Notch輕基因HES-1在快速分裂之短暫擴增（TA)群體中之表現（圖 4)。此等結果支持DLL4/Notch信號轉導很大地受限於血管系統之觀念。實例13:用抗DLL4抗體處理不影響成熟視網膜維管結構雖然阻斷DLL4對新生小鼠中之視網膜血管發育具有重大影響，但投與抗DLL4抗體對成熟視網膜維管結構無明顯影響（圖2d)。因此，DLL4/Notch信號轉導在活性血管生成期間為重要的，但在正常血管維持中起次要作用。與此觀念一致，在抗DLL4 Mab處理期間，當以10 mg/kg每週兩次歷時達8週給藥時，在具有腫瘤之小鼠中未觀測到明顯之重量損失或動物死亡。在腫瘤模型中，抗DLL4 Mab 及抗VEGF顯示對腫瘤維管結構之相反作用，此表明作用之非重疊機制。吾人認為以上所寫之說明書足以使熟習此項技術者實施本發明。然而，根據以上描述，除本文所示及所述以外之 121445.doc -154- 200817435 對本發明之各種修改應為熟習此項技術者所顯而易見且屬於隨附申請專利範圍範疇。【圖式簡單說明】圖1 ·· DLL4介導之Notch信號轉導調節EC增殖。a-c、f , 3D纖維蛋白凝膠中之HUVEC萌芽檢定。抗DLL4抗體 (YW26.82)或DBZ促進HUVEC之萌芽（a)。Ki67染色顯示抗 DLL4抗體或DBZ引起HUVEC之過度增殖（b)。在經SF改良之培養基存在下抗DLL4抗體或DBZ使HUVEC萌芽增加 (c)。d、h，抗DLL4抗體之全身傳遞引起新生視網膜中EC 大量累積。視網膜維管結構之低（頂部）及高（底部）放大倍率之共焦影像（同工凝集素（isolectin)染色）(d)。Ki67染色顯示在用抗DLL4抗體處理之新生視網膜中EC增殖增加 (h)。e，藉由固定DLL4活化Notch抑制HUVEC增殖。f，在 DBZ存在或缺乏之情況下抗VEGF抗體抑制HUVEC萌芽。 g，藉由Notch調節VEGFR2。關於對以下情形起反應之 VEGFR2表現的定量PCR分析：在HUVEC之3D纖維蛋白凝膠培養物中藉由抗DLL4抗體或DBZ阻斷Notch (7 d)(左）或在HUVEC之2D培養物中藉由固定DLL4活化Notch (36 hr)(右）。抗DLL4抗體及DBZ分別以5 pg/ml及0.08 μΜ使用 (a_c 、 e-g) 〇圖2 : DLL4介導之Notch信號轉導調節EC分化。a，由生長在纖維蛋白凝膠中之HUVEC形成的腔狀結構（白色箭頭）在抗DLL4抗體或DBZ存在下喪失。相反，瘤口高度充滿細胞（黑色箭頭）。b，藉由Notch調節TGFp2。關於對以下 121445.doc -155- 200817435 情形起反應之TGFP2表現的定量PCR分析：在HUVEC之3D 纖維蛋白凝膠培養物中藉由抗DLL4抗體或DBZ阻斷Notch (7 d)(左）或在HUVEC之2D培養物中藉由固定DLL4活化 Notch (3 6 hr)(右）。c，抗DLL4抗體阻斷動脈發育。經α平滑肌肌動蛋白（ASMA)及同工凝集素染色之新生小鼠視網膜的共焦影像。新生小鼠係如圖1 d中所述來處理。d，經 ASMA及同工凝集素染色之成年小鼠視網膜的共焦影像。用PBS或抗DLL4抗體（10 mg/kg，每週兩次）處理8週大之小鼠2週。圖3 : DLL4及/或VEGF之選擇性阻斷破壞腫瘤血管生成且抑制腫瘤生長。a-f，腫瘤模型之結果：HM7(a)、 Colo205(b)、Calu6(c)、MDA-MB-435(d)、MV-522(e)及 WEHI3(f)。呈現平均腫瘤體積加SE。g-h，腫瘤血管組織學研究。來自對照、經抗DLL4抗體及抗VEGF處理之小鼠之EL4腫瘤切片中抗CD31的免疫組織化學（g)。EL4腫瘤切片中之凝集素灌注及抗CD3 1染色（h)。i-p，腫瘤模型81^ OV-3Xl(i)、LL2(j)、EL4(k)、H1299(l)、SKMES-l(m)、 MX-l(n)、SW620(〇)及 LS174T(p)之結果。圖4 : DLL4/Notch對小鼠腸之穩定而言非必需。來自對照（a、d、g、j)、經抗DLL4抗體處理之小鼠（10 mg/kg，每週兩次，歷時6週）（b、e、h及k)及經DBZ處理之小鼠（每天 3 0 μηιοΐ/kg，歷時5天）（c、f、i、1)之小腸的免疫組織化學研究。如H&E(a、b、c)及艾爾遜（Alcian)藍染色（d、e、f) 所示，DBZ引起杯狀細胞置換ΤΑ群體。此變化在抗DLL4 121445.doc -156 - 200817435 抗體處理中完全不存在。Ki67(g、h、i)及HES-l(j、k、1) 染色進一步證實抗DLL4抗體無法複製DBZ之作用。圖5 :抗DLL4抗體之表徵。a，抗DLL4抗體（YW26.82) 之抗原決定基定位。一組DLL4突變體之圖示表示為C末端人類胎盤哺乳動物鹼性磷酸酶（AP)融合蛋白。在塗佈有經純化之抗DLL4抗體（YW26.82, 0.5 pg/ml)之96孔微量滴定盤上測試含有融合蛋白之293T細胞改良性培養基。使用1-Step PNPP (Pierce)作為底物且使用OD 405 nm吸光率量測來偵測經結合之DLL4-AP。b-d，YW26.82選擇性結合至 DLL4。用如指示經純化之重組蛋白（1 pg/ml)塗佈96孔 Nunc Maxisorp盤。藉由ELISA檢定量測指示濃度下之 YW26.82結合。使用TMB作為底物且使用OD 450 nm吸光率量測，就抗人類抗體HRP共軛物而言，偵測結合之抗體。抗HER2及重組ErbB2-ECD用作檢定對照（b)。暫時用載體、全長DLL4、Jagl或DLL1轉染之293細胞的FACS分析。僅針對經DLL4轉染之細胞偵測到YW26.82之顯著結合 (頂部圖）。分別藉由重組大鼠Notchl-Fc (rrNotchl-Fc，中間圖）及重組大鼠Notch2-Fc (rrNotch2-Fc，底部圖）之結合證實Jagl及DLL1之表現。使用2 pg/ml之YW26.82、 rrNotchl-Fc 或 rrNotch2-Fc (R & D system)，接著羊抗人類 IgG-PE (1:500，Jackson ImmunoResearch)(c)。抗 DLL4抗體阻斷DLL4-AP結合至經塗佈之rNotchl，但不阻斷DLL1-AP 結合至經塗佈之rNotchl，其中計算出IC50為約12 nM(左圖）。抗DLL4抗體阻斷DLL4-His結合至經塗佈之rNotchl， 121445.doc -157- 200817435 但不阻斷Jagl-His結合至經塗佈之rNotchl，其中計算出 IC50為約8 nM(右圖）。e，YW26.82特異性結合至内源性表現之DLL4。經對照或DLL4特異性siRNA轉染之HUVEC的 FACS分析。使用2 pg/ml之YW26.82，接著羊抗人類1§0-PE (1:500，Jackson ImmunoResearch)(e) 〇圖6 :藉由Notch活化上調DLL4。在DBZ(0.08 μΜ)缺乏或存在之情況下藉由固定C末端His標記之人類DLL4(胺基酸1-404)刺激HUVEC。刺激後36 hr，以抗DLL4抗體藉由 FACS分析檢查内源性DLL4表現。

121445.doc 158- 200817435 序列表 <110〉美商建南德克公司 <120>調節血管發育之組合物及方法 <130> P2372R1 <140〉 096120337 <141> 2007-06-06 <150> US 60/811，357 <151> 2006-06-06 <!50> US 60/866,767 <151> 2006-11-21 <160〉 21 <21()> 1 <211> 115 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>抗體序列 <400> 1

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly 15 10 15 (lly Scr Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30

Asp Asn 丁rp 丨le Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Val (；lv Tyr He Ser Pro Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Tyr '50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Phe Gly Gly Tyr Phe 95 100 105

Asp Tyr Ti*p Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Π0 115 <210〉 2 <211> 109 <212〉 PRT <2丨3>人工序列 <220> <切> 抗體序列 <400〉 2

Asp lie Gin Mel Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser 20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 I.eu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly vSer Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 65 70 75 121445.doc 200817435 •I c s G o o r 8 p ph

Th Γ Th 85 no 19 G s cy Γ Ty Ty

Th Γ Ty Γ c s n yo lo Gl 6 ph Th Γ Th na o VI s Ly Γ Th y Gl

Glu lie Lys Arg

<210> 3 <211> 6 <212> DNA <2丨3>人工序列 <22()> <223>序列合成 <220〉 <221> CAAT_si〇nal modified base <222> 2 ' <223〉CAAT盒 <400> 3 cncaat 6 <210> 4 <211> 6 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223>序列合成 <22()> <221> polyA_signal <222〉 full ~ <223>多聚腺嘌呤信號 <400> 4 aataaa 6 <2I0> 5 <211> 21 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223> siRNA <400> 5 caactgccct tatgget111 t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223> siRNA <400> 6 aaa^ccaiaa gggcagt tgt t 21 <2I0> 7 <211〉 21 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉 siRNA <400〉 7 caactgccct tcaatttcat t 21 <210> 8 121445.doc 200817435 <211> 21 <2I2> DN'A<2丨3>人工序列 <220> <223> siRNA <400> 8 igaaaitgaa gggcagttgt <210> 9 <211> 21 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223> SiRNA <400> 9 tgaccaagat ctcaactact <2)0> 10 <211> 21 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223> siRNA <4()0> 10 ^lagttyaga tcttggtcat <2I()> II <211〉 21 <212〉 DMA <213〉人工序列 <220> <223> siRNA <400> 11 ggccaactat gcttgtgaat t 21 t 21 t 21 t 21 <2)0> 12 <21i> 21 <212> DNA <213>人工序列 <22()> <223> .iRNA <400> 12 ttcacaagca tagttggcct <210> 13 <211> 20 <212> DNA<2丨3>人工賴 <220><223〉寡核苷酸引子 <4()0> 13 aagtcttgca aatgcagcta t 21 20 <210> 14 <211> 25 <212〉 DNA <2丨3〉人工序列 <220><223〉寡核苷酸引子 <400> 14 catcatcati atcatcatca ttgtc 25 121445.doc 200817435 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>寡核苷酸探針 <400> 15 aattcttgga aaagtggcaa gaccaaaat 29

<2I0> 16 <211> 21 <212> DNA 〈⑴〉人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 16 ctttccacca gcaggaagta g 21 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213>人工序列

寡核苷酸引子 <400> 17 tgcagtccga ggtccttt 18 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <2丨3>人工序列 <22()> <223>寡核苷酸探針 <400> 18 cgcaittgai tticaittcg acaacaga 28 <210> 19 <21!> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>寡核苷酸引子 <400> 19 yaagaiggt^ atgggatitc 20

<210〉 20 <21!> 19 <2I2> DNA <2丨3>人工序列 <220> <切> 寡核苷酸引子 <400> 20 gaaggtgaag gtcggagtc 19

<210> 21 <21l> 20 <212> DNA <2I3>人工序列 <22()> 寡核苷酸探針 121445.doc 200817435 <400> 21 caa^cuccc ^uctcagcc 20

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Claims

200817435 十、申請專利範圍： 1· 一種DLL4拮抗劑之用途，其用於製備供治療腫瘤、癌症或細胞增殖性病症之藥劑。 2·如明求項1之用途，其中該腫瘤、癌症或細胞增殖性病症為結腸癌、肺癌、黑素瘤或淋巴瘤。 3. —種DLL4拮抗劑之用途，其用於製備供治療與血管生成相關之病理性病症之藥劑，其中該DLL4拮抗劑能夠刺激内皮、、、田胞增殖、抑制内皮細胞分化、抑制動脈發育或抑制血管灌注。 4. 如請求項3之用途’其中該與血管生成相關之病理性病症為腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症。 5. 如請求項3之用途’其中該與血管生成相關之病理性病症為眼内新生血管疾病。 6. -種DLL4促效劑之用途’其用於製備供刺激有需該治療之受檢者中之内皮細胞增殖之藥劑。 7. -種DLL4结抗劑之用途，其用於製備供減少或抑制有需該治療之受檢者中之内皮細胞分化之藥劑。 8. -種DLL4拮抗劑之用途，其用於製備供減少或抑制有需該治療之受檢者中之動脈發育之藥劑。 9. 二種DLL4拮抗劑之用途，其用於製備供減少或抑制有需該治療之受檢者中之腫瘤血管灌注之藥劑。 1 0.如凊求項1至9中任一 xi之用^伞，甘士斗— Τ1項之用述’其中該藥劑係與抗生成劑組合使用。 Η.如請求項Π)之用途’其中該抗血管生成劑係在投與該 121445.doc 200817435 DLL4拮抗劑之前或之後投與。 12·如明求項1〇之用途，其中該抗血管生成劑係與該拮抗劑同時投與。 13_如請求項1〇之用途，其中該抗血管生成劑為血管内皮細胞生長因子（vascular endothlial cell ; VEGF)之拮抗劑。 14·如凊求項13之用途，其中該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體。 15.如請求項14之用途，其中該抗vEGF抗體為貝伐單抗 (bevacizumab)。 16·如凊求項i至9中任一項之用途，其中該藥劑係與化學治療劑組合使用。 17· —種DLL4拮抗劑及抗血管生成劑之用途，其用於製備供增強抗血管生成劑在患有與血管生成相關之病理性病症的受檢者中之抑制功效之藥劑。 18.如請求項17之用途，其中該與血管生成相關之病理性病症為腫瘤、癌症及/或細胞增殖性病症。 19·如請求項17之用途，其中該與血管生成相關之病理性病症為眼内新生血管疾病。 2〇·如請求項1至9及π至19中任一項之用途，其中該DLL4拮抗劑為抗DLL4抗體。 21.如請求項1至9及17至19中任一項之用途，其中該dlL4拮抗劑為DLL4免疫黏附素。 22·如請求項20之用途，其中該dLL4抗體為單株抗體。 23_如晴求項2〇之用途，其中該DLL4抗體為人類抗體、人化 121445.doc 200817435 抗體或叙合抗體。 24. 如請求項20之用途，其中該DLL4抗體為抗體片段。 25. 如請求項24之用途，其中該抗體片段為Fab、Fab’、Fab SH、F(ab’）2或 scFv 〇

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