TW200422050A - Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents - Google Patents

Description

200422050 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於在癌症治療中，抗體和細胞毒性化合物之 共軛物’與化學治療劑的混合應用，包括這類化合物及/或 化學治療劑的醫藥組合物，以及癌症治療的方法。 【先前技術】 已經多次嘗試藉著將抗贅生物藥物與對抗與腫瘤有關之 抗原的抗體共軛，以便藉著瞄準遞送至腫瘤而升高該藥物 的局部濃度，來改善這類藥物之效力。這些方法中，有許 多已經遇到有限的成功，並已經在文獻中討論數個原因來 解釋失敗。至於以化學計算之方式作用的抗癌藥物，像是， 例如阿黴素或胺甲碟呤，需要相對上較高的細胞内濃度， 以便發揮所需的細胞毒性。認為許多抗體-藥物共軛物不易 達到這些濃度’是因為（a)許多普通抗癌藥物不充分的效 力’（b)抗原標起的低細胞表面濃度，（c)抗原·抗體複合物無 效地内化至標靶細胞内，以及（d)從在細胞内之共軛物中， 無效地釋放自由的藥物（Chari等人，1992)。 兩個前述的缺點，即&)和（(1)，已經藉著（：11紅丨與同事的努 力而解決了（Chari等人，1992; Liu等人，I9%;美國專利第 5,208,020號）。他們已經發展出抗體共輛物，其中抗體經由 一硫鍵與類美登素連接。美登素屬於柄形（Ans勾大環内酯 類，其衍生自諾卡菌屬（N〇cardia sp )。使用藉著細菌發酵 而產生的美登素安絲菌素（ansamit〇cin)p_3，作為製造類美 登素DM1的前驅分子。美登素和衍生物的作用為抗_有絲分 86932 200422050 裂劑（微管蛋白聚合作用的抑制劑），像長春新鹼一樣，但具 有比長春新鹼或其他已確立之化學治療劑明顯更高的效力 (DM1在大約1〇-igM的濃度下，在活體外是對細胞有毒性 的）。與自由類美登素的尚細胞毒性相反，與對抗原-陽性之 細胞相比較，抗體共軛物對抗原_陰性之細胞具有更低數個 等級的毒性。藉著二硫鍵連接，具有這些鍵結可在標靶細 胞内，被細胞内縠胱甘肽迅速切開的優點，釋放出具有高 毒性的自由藥物。該方法已應用在對抗與腫瘤有關之抗原 的抗體上，例如C242-DM1共軛物（Liu等人，1996; Lambert 等人，1998)，以及HuN901-DMl(Chad等人，2000)。然而， 這些共軛物的應用卻受到限制，因為各個標靶抗原的有限 表現。例如，由N901認出的抗原（CD56，义CAM)優先由神 、’二内刀/必起源的腫瘤表現，C242抗原（CanAg)的表現則主要 限於衍生自GI道的腫瘤。 因此，仍有藉著發現具有良好抗原表現型式之與腫瘤有 關的適當抗體、在標靶組織中高度和專一的細胞表面抗原 濃度，以及將與抗原複合之抗體共輛物運送至細胞内的有 效内化過程，來改良該方法的需求。 CD44是以數種不同同功型，在各種細胞類型之表面上表 現的蛋白質。認為最小的同功型，標準CD44(CD44s)，其係 由各種不同的細胞表現，調節細胞與細胞外基質成分的附 接，並可在淋巴細胞和單核細胞激活作用中傳達共同_刺 激。相反的’在細胞外區域含有功能部位v6的CD44之接合 變體（CD44v6)的表現，則限於上皮的亞組。尚未完全了解 86932 200422050 CD44v6的生理學角色。 已經顯示CD44v6以及其他變體表現序列（CD44v3, CD44v5, CD44v7/v8, CD44vlO)是與腫瘤有關的抗原，在人 類腫瘤和正常組織中具有良好的表現型式（Heider等人， 1995; Heider等人，1996; Dali等人，1996; Beham_Schmid等人， 1998; Tempfer等人，1998; Wagner等人，1998)，並已經等候 以抗體為基礎之診斷和治療方法，特別是腫瘤之放射性免 疫治療（RIT)的批准（Verel等人，2002; Stromer等人，2000; WO 95/33771; WO 97/21104)。 然而’藉著類美登素共軛物有效殺死腫瘤細胞的先決條 件，是標靶抗原的充分内化作用。對於CD44的内化作用， 只獲得少量的資料。Bazil et Horejsi報告了當以PMA刺激 時’在白血球細胞上之CD44的向下調節，係藉著抗原的排 出’而非藉著内化作用引起（Bazil et H〇rejsi，1992)。CD44 的排出’亦得到數個在腫瘤患者和正常個體的血清中，對 可落性CD44之報告的支持（SHutz等人，1995; Gu〇等人，1994; Martin等人，1997)。在最近Aguiar等人的論文中，判定在4 小時内，在基質-完整的軟骨細胞上，内化cD44的含量約為 6%(Aguiar等人，1999)。在藉著BIA進行的實驗中，發現一 樣低的在腫瘤細胞上内化CD44v6之程度。總而言之，這些 資料暗CD44受體較可能遭遇到排出而㈣化，目此不認 為CD44專一的抗體是類美登素共軛物法的適當候選者。這 已經得到在活體外之細胞增殖測定的支持，其中 Abcww-DMl對提供-抗原之細胞，與缺乏該抗原的細胞相 86932 200422050 比較，僅顯示出稍微升高的細胞毒性。 目前已經發現，經由在細胞内條件下被切開之交聯劑， 與具有高細胞毒性之藥物共軛的CD44專一性抗體，在活體 内是非常有效的腫瘤治療學。因此，可在癌症治療上有利 地使用這類化合物。 仍需要進一步的改良。關於抗體類美登素共軛物huN901-DM1和C242-DM1，已經提出這些共軛物與紫杉烷、紫杉醇 (paclitaxel)或多舍他昔（docetaxel)的組合（WO 01/24763)。 目前已經意外地發現，由CD44專一性抗體和細胞毒性製 劑組成之共輛物與進一步之化學治療劑的組合，顯示出協 同效果。 【發明内容】 特定而言，本發明係關於式A(LB)n(式（I))化合物 其中 A為抗體分子，其對CD44是專一的； L為交聯劑部分； B為對細胞有毒性的化合物；且 η為十進位數，n=l至10 在製備治療癌症用的醫藥組合物上的用途，其中使用該化 合物，或用來與進一步的化學治療劑混合。在進一步的觀 點中，本發明係關於治療癌症的方法，其中將有效含量的 按照在本文中定義之式（I)化合物，與進一步的化學治療劑 混合，投予需要其之患者。 抗體分子A對CD44具有結合專一性，較佳的是變體 86932 200422050 CD44，最好是CD44v6。 ’•抗體分子π —詞應包括完整的免疫球蛋白，因為它們由 淋巴細胞產製，並出現在例如血清中，由融合瘤細胞株分 泌的單株抗體，藉著在宿主細胞中重組表現產生的多肽， 其對免疫球蛋白或單株抗體具有結合專一性，以及已經藉 著進一步加工處理而衍生自這類免疫球蛋白、單株抗體或 多肽的分子，仍保留其結合專一性。特定而言，’’抗體分子 "一詞，包括含有兩個重鏈和兩個輕鏈的完整免疫球蛋白， 這類免疫球蛋白的片段，像Fab，FaV或F(ab)2片段（Kreitman 等人，1993)，重組產製的多肽，像嵌合型、人類化或完全 的人類抗體（Breitling et Duebel，1999; Shin 等人，1989; GUssow et Seemann，1991; Winter等人，1994，歐洲專利第 0 239 400號；歐洲專利第0 519 596號；WO 90/07861 ;歐洲專 利第0 368 684號；歐洲專利第0 438 310號；WO 92/07075 ; WO 92/22653 ;歐洲專利第0 680 040號；歐洲專利第〇 451 216號），單鏈抗體（scFv，Johnson et Bird，1991)，多聚體抗 體（Kortt等人，2001)，像微型雙功能抗體（diabody)、微型三 功能抗體（triabody)或微型四功能抗體（tetrabody)，及其類似 物。今天，不免疫接種實驗動物，亦可產製抗體’例如’ 藉著嗟菌體展示法（Aujame等人，1997;美國專利第 5,885,793號；美國專利第5,969，108號；美國專利第6,300,064 號；美國專利第6,248,516號；美國專利第6,291，158號）。可 使用帶有有功能之人類Ig基因的基因轉殖老鼠，產製完整 的人類抗體（歐洲專利第〇 438 474號；歐洲專利第〇 463 151 -10- 86932 200422050 號；歐洲專利第〇 546 073號）。從前述的參考文獻中，專家 知道如何產製這些類型的抗體分子，使用現代科技的方 法’像自動肽和核酸合成、實驗室動物免疫、融合瘤技術、 聚合酶連鎖反應（PCR)、載體和表現技術、宿主細胞培養和 蛋白質純化方法。接下來，交替使用，，抗體”和”抗體分子” 一詞。’’對CD44專一的’’應意指對出現在CD44中的抗原決定 位’具有專一結合親和力的抗體分子。在較佳的具體實施 例中’本發明之抗體分子對由人類CD44基因之變體表現序 列v6編碼的胺基酸序列’具有結合專一性。變體表現序列 v6的序列和其他變體表現序列，是此項技藝中已知的 (Screaton等人，1992; T3lg等人，1993; Hofmann等人， 1991)。本發明較佳的抗體分子，專一地與具有或含有伴隨 的序列一覽表之胺基酸序列序列識別1號的肽或多肽，或該 序列之對偶基因變體結合。較佳的是，抗體分子對在該序 列中之抗原決定位具有結合專一性。更佳的是，抗體分子 對具有胺基酸序列序列識別2號，再更佳的是，具有胺基酸 序列序列識別3號之肽專一地結合。可利用此項技藝中已知 的方法（WO 95/33771、WO 97/21104)，輕易地產製這類抗 體分子，例如藉著利用以化學方式合成、具有前述序列的 肽免疫實驗動物，例如與半抗原結合，或以重組產製之包 括該序列的融合蛋白質免疫，並根據此項技藝中已知的方 法處理（Harlow，1988; Catty，1988; Koopman等人，1993;

Heider等人，1993)。 可供本發明使用的抗體分子，最好是叫做VFF -18的老鼠 -11- 86932 200422050 單株抗體，其係由融合瘤細胞株產製，已經在1994年6月7 日，以登錄編號DSM ACC2174存放於DSM-Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig, Deutschland/ Germany。較佳的還有該單株抗體VFF-18的Fab，Fab’或 F(ab)2片段。在另一個較佳的具體實施例中，抗體分子是人 類化的重組抗體，其中已經將VFF-18的互補性決定區 (CDR’s)移植到人類免疫球蛋白重和輕鏈的各個基因内。 了解單株抗體的’’互補性決定區”是涉及專一性抗原結合 的那些胺基酸序列，根據Kabat等人，1991，連同Chothia和 Lesk， 1987 。 在另一個較佳的具體實施例中，可將這類CDR-移植抗體 的適當架構殘基恢復成老鼠殘基，來改良結合親和力。從 與此項技藝有關的方法中，專家知道如何獲得VFF-18的 CDR丨s，從前述帶有登錄編號DSM ACC2174的融合瘤開始， 選擇並獲得適當的人類免疫球蛋白基因，移植CDR’s至這些 基因内，修改所選出的架構殘基，在適當的宿主細胞中表 現CDR-移植的抗體，例如中國倉鼠卵巢（CHO)細胞，並針 對結合親和力和專一性，測試所得的重組抗體（參見，例如 上文的參考文獻）。在本發明另一個較佳的具體實施例中， 該抗體分子是具有抗體VFF-18之CDR’s的重組抗體。這類重 組抗體最好是人類化的抗體，且為由兩個完整輕和兩個完 整重鏈組成的完整免疫球蛋白。在本發明另一個較佳的具 體實施例中，該抗體分子是具有與抗體VFF-18相同之遗傳 86932 -12- 200422050 性型的重組抗體。在本發明另一個較佳的具體實施例中， 該抗體分子是與抗體VFF-18相同之遣傳性型結合的重組抗 體。 在特佳的具體實施例中，抗體分子A是包括具有胺基酸序 列序列識別4號之輕鏈，和具有胺基酸序列序列識別6號之 重鏈的抗體。將該抗體稱為BIWA4。它是上文提及之抗體 VFF-1 8的人類化版本，在完整的人類架構中具有老鼠抗體 VFF -1 8的互補性決定區，和人類丨亙定區。因此，它是在人 體中具有極低免疫原性的抗體，這是有利的特性。然而， 因為它不具有老鼠的架構殘基，發揮抗體結合的最大效 用，因此它具有比其親代抗體VFF-18明顯更低的抗原結合 親和力，並因此未被視為是治療藥物的良好候選者。意外 地發現BIWA4，不管它不佳的結合親和力，在活體内具有 極有利的生物分布和腫瘤攝入，使它超越其他具有較高結 合親和力之VFF-18的人類化版本。在更佳的具體實施例 中，抗體分子A是包括具有胺基酸序列序列識別8號之輕 鏈，和具有胺基酸序列序列識別6號之重鏈的抗體。將該抗 體稱為BIWA8，且具有比BIWA4更高的結合親和力。可如 下產製這些抗體。可藉著標準方法，以化學和酵素方式合 成編碼輕鏈和重鏈的核酸分子。首先，可利用此項技藝中 已知的方法（例如Gait MJ，1984)，合成適當的寡核替酸，並 可用它來產製合成的基因。從寡核钻酸中產製合成基因的 方法是此項技藝中已知的（例如Stemmer等人，1995; Ye等人， 1992; Hayden et Mandecki 1988; Frank等人，1987)。較佳的 -13- 86932 200422050 是，編碼BIWA4之輕和重鏈的核酸分子分別具有序列識別5 號和序列識別7號的核嘗酸序列。這些序列包括編碼可由宿 主切開之前導肽的序列（序列識別5號：前60個核苷酸；序 列識別7號：前57個核甞酸）。在更進一步的具體實施例中， 編碼根據本發明之抗體分子之輕和重键的核酸分子，分別 具有序列識別9號和序列識別7號的核苷酸序列。然後可將 編碼抗體重和輕鍵的核酸分子選殖到表現載體内（兩個鍵 在一個載體分子内，或每個鏈分別在不同的載體分子内）， 然後將其導入宿主細胞中。適合在原核生物或真核生物宿 主細胞中表現免疫球蛋白的表現載體，以及將載體導入宿 主細胞中的方法，是此項技藝中已熟知的。通常，其中免 疫球蛋白在功能上與適當的啟動基因連接，像是例如位在 Ig基因上游的人類細胞巨大病毒（CMV)啟動基因、倉鼠泛素 啟動基因（W0 97/15664)、或猿病毒SV40啟動基因。至於轉 錄的終止，可使用牛生長荷爾蒙或SV40的適當終止/聚腺苷 酸化作用位置。此外，可包括促進子序列，像是CMV或SV40 促進子。而且，表現載體總是含有選擇標記基因，像是二 氫葉酸還原酶（DHFR)、穀胺醯胺合成酶、腺甞脫胺酶、腺 答酸脫胺酶基因或新黴素、博菜黴素或嘌羅黴素抗藥性基 因。各種表現載體可構自諸如Stratagene，La Jolla，CA; Invitrogen，Carlsbad，CA; Promega，Madison，WI 或 BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA之類的公司。例如，可 使用表現載體pAD-CMVl(NCBI GenBank登錄編號A32111) 或 pAD-CMV19(NCBIGenBank 登錄編號 A32110)來表現。宿 86932 -14- 200422050 主細胞最好是哺乳動物宿主細胞，例如COS、CHO或ΒΗΚ 細胞，更佳的是中國倉鼠卵巢（CHO)細胞，例如CHO-DUKX (Urlaub和 Chasin，1980)、CHO-DG44(Urlaub等人，1983)，或 CH0-K1(ATCC CCL-61)細胞。然後在適當的培養基中，在 產製抗體的條件下，培養該宿主細胞，然後根據標準程序， 從培養物中分離抗體。從在宿主細胞中之重組DNA和個別 表現載體中產製抗體的程序，是此項技藝中已熟知的（參 見，例如 WO 94/11523、WO 97/9351、歐洲專利第 〇 481 790 號、歐洲專利第〇 669 986號）。 為了連接抗體分子A與對細胞有毒性的化合物B ’使用交 聯部分L。在大多數簡單的案例中，交聯部分L是一化學鍵 結，最好是在細胞内的條件下被切開的共價鍵。在本發明 的一個具體實施例中，該键結是在出現在抗體分子中的硫 原子，例如在半胱胺酸殘基之側鏈中的硫原子’與出現在 毒性化合物中的另一個硫原子之間。在另一個具體實施例 中，交聯部分L由一或多個原子或化學基團所組成。適當的 交聯基團為此項技藝中已熟知的，並包括二硫基團、硫醚 基團、酸不穩定的基團、光不穩定的基因、肽酶不穩定的 基團和酯酶不穩定的基團。較佳的是二硫基團和硫醚基團。 可使用目前已知或稍後發展的任何技術，形成本發明之 抗體分子與毒性化合物的共輛物。可修改毒性化合物’產 生自由胺基基團，然後經由酸-不穩定的交聯劑或光不穩定 的交聯劑，與抗體分子連接。然後將毒性化合物與肽縮合’ 接著連接抗體分子，產生肽酶不穩定的交聯劑。可處理該 86932 -15- 200422050 毒性化合物，產生一級經基基團，可將其琥珀醯化，並與 抗體分子連接，產生可被細胞内酯酶切開，釋放出自由藥 物的共輛物。最佳的是，處理毒性化合物，創造自由或經 保護的硫醇基團，然後經由二硫键結（們），將含有一或多個 二硫或硫醇的毒性化合物與抗體分子共價連接。 例如，藉著已知的方法，以交聯試劑修改抗體分子，像 是N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶二硫基）丙酸酯（SPDP)、4-琥珀 ϊ盛亞胺基-乳基談基-ex-甲基比淀二硫基）-甲苯 (SMPT)、N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫基）-丁酸酯 (SDPB)、N-破拍酸亞胺基-4-(2-口比淀二硫基）戊酸酯（SPP)、 N-琥珀醯亞胺基-5-(2-吡啶二硫基）戊酸酯、2-亞胺基硫醇烷 或乙酸基琥珀酸酐。參見Carlsson等人，1978; Blattler等人， 1985; Lambert等人，1983; Klotz等人，1962; Liu等人，1979; Blakey和Thorpe，1988; Worrell等人，1986。在較佳的具體實 施例中，交聯劑部分是衍生自SPP的5-硫代戊酸酯或4-硫代 戊酸酯。然後使如此衍生出之含有自由或經保護硫醇基團 的抗體分子與含有二硫-或硫醇的毒性化合物反應，產生共 輛物。可藉著HPLC或藉著凝膠過濾，純化該共輛物。 ’’有毒性的π是抑制或妨礙細胞之功能，及/或引起細胞破 壞的化合物。用來偶聯的毒性化合物可產生細胞靜止或細 胞毒性的作用，導致細胞週期停止或細胞死亡。這些化合 物可作用在細胞週期的不同階段上，例如藉著干擾核酸合 成、使核酸失活，或藉著與微管蛋白結合。 在較佳的具體實施例中，出現在A(LB)n*，對細胞有毒 -16- 86932 200422050 性的化合物B，是類美登素，即美登素（CAS 35846538)的衍 生物。在較佳的具體實施例中，它是美登醇（maytansinol) 的C-3酯。適合用在癌症治療中與抗體共軛的類美登素，包 括該類美登素的製備，及其與抗體分子連接，已經由Chari 和同事（Chari等人，1992; Liu等人，1996;美國專利第 5,208,020號）描述過了。這些類美登素可供本發明使用。在 較佳的具體實施例中，該毒性化合物是ί^-脫乙醯基-N\(3-巯基-1-氧丙基）-美登素（CAS 139504-50_0號），亦稱為 DM1。該類美登素最好是在美登醇之0_3位置處，經由二硫 橋與抗體分子連接的美登醇衍生物。在特佳的具體實施例 中，可從式（II)之類美登素來製備抗體/類美登素共軛物 式（II)

其中 I代表Η或SR4，其中R4代表甲基、乙基、直線的烷基、分 -17- 86932 200422050 支的燒基、環狀的燒基、單純或經取代的芳基或雜芳基. R2代表C1或Η ; ^ R3代表Η或CH3 ;且 m代表1、2或3。 最好是Rl為 H、CH3或 SCH3，為 c卜 R3為 CH3JLm42。 在文獻中，將R1==H、R2=C卜R3=CH3且m=2的化合物命名 為 DM1。 在較佳的具體實施例中，本發明之化合物具有下式

㈧ (式 III) 其中 A為對CD44專一的抗體分子，最好是對變體表現序列V6專 一的’最好是對胺基酸序列序列識別3號專一的；（L，）是任 意的交聯劑部分； P為十進位數，其中P=1至10。 86932 -18- 200422050 最好是p為3至4，更佳的是大約3.5。 製備這類類美登素的方法，是此項技藝中已知的（特別表 見美國專利第5,208,020號，實例1)。在第一個步驟中，可 便利地藉著屬於諾卡菌屬或放線共黴菌 之Μ生物’例如AT C C 3 15 6 5、AT CC 31281的細菌發酵（美國 專利第4,356,265號；美國專利第4,450,234號；W0 〇1/ 77360)，產製類美登素C-3酯安絲菌素P3。可使用像醋酸乙 酯或甲苯之類的有機溶劑，從培養物中萃取安絲菌素p3， 並可藉著吸附層析法’使用例如碎膠進一步純化。然後使 用LiAlH4(美國專利第4,360,462號）’或按照最近建議的（w〇 02/16368)，以LiAl(OMe)3H或其他LiAl或NaAl之氰化物，將 其還原為美登醇。然後可在C-3位置處，利用N-甲基—L-丙 胺酸或N-甲基-L-半胱胺酸衍生物，將美登醇酯化，產生含 有二硫的類美登素（美國專利第5,208,020號；美國專利第 5,416,064號；美國專利第6,333,410號），例如使用二環己基 碳化二醯亞胺（DCC)和催化用量的氯化鋅（美國專利第 4，137,230號；美國專利第4,260,609號）。在較佳的具體實施 例中，以下式之化合物N-甲基-N-(3-甲基二硫代丙醯基）-L-丙胺酸

，將美登醇酯化，產生其中RfSIU、R4=CH3、R2=cn、r3=ch3 且m=2的式（II)之類美登素。在例如美國專利第5,208,020號 200422050 和WO 02/22554中揭示田甘τ 了 Ν-甲基丙胺酸或Ν-甲基_L-半腕 胺酸衍生物的製造。 然後可藉著利用二硫蘇摊酸 ”、禾糖知（DTT)的二硯键切開作用，釋 放自由的硫醇基團，產生例如DM1。 當在細胞内切開時，釋放出自由的毒性化合物。從化合 物A(LB)n中釋放的自由藥物，可具有式Β_χ，其中χ是原子 或化學基81 ’將視切開反應的性質而定。χ最好是氫原子， 像是例如當交聯劑部分正好是在兩個硫原子，或經基基團 之間的共價鍵時。若交聯劑部分是化學基圏，切開位置亦 可在交聯劑部分内，在切開時產生式B_L”_X之自由藥物， 其中X為原子或化學基團，視切開反應的性質而定。χ最好 疋氫原子或羥基基團。若交聯劑是穩定的，則從細胞内釋 放出的自由藥物亦可含有抗體分子的部分（胺基酸或肽殘 基），但抗體分子被降解。 在較佳的具體實施例中，式⑴化合物的毒性比在細胞内 切開時釋放出之毒性化合物B、b_x或b_l”-X的更低。在活 體外測試細胞毒性的方法是此項技藝中已知的（Goldmacher 等人，1985; Goldmacher等人，1986;亦參見美國專利第 5,208,020號，實例2)。化合物⑴最好是比在切開時釋放出 之自由藥物的毒性低1〇倍或更多，更佳的是低1()〇倍或更 多’或甚至是低1000倍或更多。 較佳的是，抗體分子/類美登素共軛物是經由二硫鍵連接 的那些’如同上文討論的，其能夠遞送類美登素分子。藉 著已知的方法來製備這類細胞結合共軛物，像是以琥珀醯 86932 -20" 200422050 亞胺基峨淀基-二硫丙酸S旨（SPDP)或破ίό酿亞胺基p比淀基 二硫戊酸酿（SPP，N -破轴縫亞胺基-4-(2·ρ比症二硫基）戊酸 酯或Ν-琥珀醯亞胺基-5-(2-吡啶二硫基））戊酸酯修改單株抗 體（Cadsson等人，1978)。然後藉著以含有硫醇的類美登素 處理，置換所得的硫代批淀基團，產生二硫連接的共輛物。 或者，在芳基二硫代類美登素的案例中，藉著以先前導入 抗體分子内的硫氫基基團直接置換類美登素之芳基-硫 醇，完成抗體共輛物的形成。藉著任一種方法迅速地製備 含有1至10個經由二硫橋連接之類美登素藥物的共軛物。關 於此點，在式A(LB)n中的十進位數η當然是平均數，並非特 定製品的所有共軛物分子可能具有相同整數的LB殘基附接 在抗體分子上。 更特定而言，以含有硫醇之類美登素（1.25莫耳當量/二硫 代吡啶基團）處理在0.1 Μ，ρΗ7·0,含有1 mMEDTA的磷酸鉀 緩衝溶液中，濃度為1毫克/毫升之二硫吡啶基修改抗體的 溶液。在343毫微米處，以分光光度計之方式，監視從經過 修改之抗體中釋放吡啶-2-硫酮，並在大約30分鐘内完成。 純化抗體-類美登素共輛物，並藉著凝膠過濾，通過交聯葡 聚糖G-25之管柱，除去未反應的藥物，及其他低分子量的 物質。可藉著測量在252毫微米處和280毫微米處之吸光度 的比例，判定與每個抗體分子結合之類美登素的數目。可 藉著該方法，經由二硫键連接平均1-10個類美登素分子/抗 體分子。 在較佳的觀點中，本發明係關於CD44v6專一之抗體分子 86932 -21 - 200422050 與類美登素的共輛物。在本文中，nD44v6專一的”應意指對 出現在由CD44，最好是人類CD44之變體表現序列v6編碼之 胺基酸序列的肽中之抗原決定位，具有專一的結合親和力 的抗體。本發明較佳的抗體分子，專一地與具有或含有附 帶之序列一覽表中的胺基酸序列序列識別1號之肽或多 肽，或該序列之對偶基因變體結合。較佳的是，該抗體分 子對在該序列内的抗原決定位，具有結合親和力。更佳的 是，該抗體分子專一地與具有胺基酸序列序列識別2號，再 更佳的是具有胺基酸序列序列識別3號的肽結合。 在該共輛物中的抗體分子，最好是單株抗體VFF-18(DSM ACC2174)，或具有VFF-18之互補性決定區（CDRs)的重組抗 體。更佳的是，該抗體包括具有胺基酸序列序列識別4號或 序列識別8號的輕鏈，以及具有胺基酸序列序列識別6號的 重鏈。 類美登素最好藉著二硫部分與抗體連接，並具有下式

〇 3 Η C

S- -22- 86932 200422050 其中與抗體的連接，是經由在式IV中所示的硫原子，和出 現在抗體分子中的第二個硫原子。欲創造可用來結合的這 類硫原子，可藉著將如同上文概述的適當交聯劑導入，來 修改抗體分子。較佳的是，經由-s-ch2ch2-co-、-s-ch2ch2-CH2CH2_CO_4_S-CH(CH3)CH2CH2-CO-基團，使類美登素與 抗體分子連接。在這類交聯劑基團中的硫原子與類美登素 形成二硫鍵，而羰基官能可與出現在抗體分子之胺基酸殘 基側鏈上的胺基官能結合。 那種方式，可將一或多個類美登素與抗體分子連接。最 好是將3至4個類美登素殘基與一個抗體分子連接。 最佳的是，CD44v6專一性抗體分子與類美登素的共軛 物，其中抗體包括具有胺基酸序列序列識別4號之輕鏈，和 具有胺基酸序列序列識別6號的重鏈，且其中類美登素具有 下式 (式 IV) 86932

C

S-- CH3 /

-23- 200422050 並經由二硫鍵與抗體連接。連接基團最好是_s_CH2CH2_ CH2CH2-CO-或-S-CH(CH3)CH2CH2-CO_，與每個抗體分予結 合之類美登素殘基的數目是3圭4。 最好將按照在本文中定義之式⑴共軛物或化合物，調配 成醫藥組合物，包括這類共軛物或化合物，最好與在藥學 上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑一起。 通當之在藥學上可接受的載劑、稀釋劑和賦形劑是已熟 知的，並可由熟諳此藝者根據臨床狀況來決定。通常，可 將共軛物調配成緩衝含水溶液的形式，使用在生理學上可 接焚的緩衝溶液，像是磷酸緩衝的生理鹽水（PBS; 8克/公升 NaC1，0.2 克 / 公升 KC1，h44 克 / 公升 Na2Hp〇4, 〇·24 克 / 公升 ΚΗ2Ρ〇4在瘀餾水中，以含水的HC1調整成ρΗ7·4)，其可含有 額外的促溶、穩定及/或保存成分，例如血清白蛋白、乙二 胺四乙酸（EDTA)、苯甲醇或清潔劑，像聚氧乙烯山梨糖醇 單月桂酸酯（吐溫20™)。適當之載劑、稀釋劑及/或賦形劑 包括·（1)杜貝可氏（Dulbecco，s)磷酸緩衝之生理鹽水， 7·4，含有大約1毫克/毫升至25毫克/毫升人類血清白蛋白， (2)0.9%生理鹽水（〇·9%重量/體積NaC1)，以及（3)5%(重量/ 體積）右旋糖。調配物也可以是冷凍_乾燥粉末的形式，其可 在投藥之前以水或緩衝溶液重建。這類冷凍乾燥物可含有 填充劑，像是例如甘露糖醇。 關於癌症的臨床治療，根據本發明之式⑴化合物，特別 是CD44v6專一的抗體分子與類美登素的共軛物，將以溶液 的形式提供，並針對無菌和内毒素含量進行測試。共輛物 86932 -24- 200422050 投藥之適當草案的實例如下。可每週給予共輛物，持請以 6週，像是以靜脈内團塊注射，或連續輸液5天。在每％小 時的期間内，可在50至1〇〇毫升的等張生理鹽水中提供團塊 劑量，在其中加入5至10毫升人類血清白蛋白。可在25〇至 5〇〇毫升的等張生理鹽水中提供連續輸液，在其中加入25至 5〇晕升人類血清白蛋白。每次應用，劑量將是ι〇毫克至*⑼ 笔克/平方公尺體表面積。每次投藥應用在患者上的劑量， 應高得足以是有效的，但必須低於劑量限制毒性（dlt)。通 系，將低於DLT<充分完全耐受劑量視為最大耐受性劑量 (MTD)。專家知道如何判sMTD(Lambert等人，丨9%)。至於 每週投藥，可預期MTD是在50至2〇〇毫克/平方公尺的範圍 内。或者，在施用之間的間隔可以是較長的，例如2至4週， 取好是3週。在該情況下，可預期MTD是在1〇〇至3〇〇毫克/ 平方公尺的範圍内。或者，應用可以5個每日劑量，接著在 中Wf數週後可重複處理。在該情況下，可預期每次投藥的 MTD應低於1〇〇耄克/平方公尺。例如，可每隔2丨天，以3毫 克/分鐘之速率單次靜脈内輸液，投予共輛物。 在本發明的岫後文中，”化學治療劑"應意指抑制或殺死 正在生長之細胞的化學化合物，且其可使用或核准使用在 癌症的治療上。像式⑴化合物，特別是CD44v6專一的抗體 分子與類美登素的共軛物，在那種意義上來說，本身是化 學治療劑，了解本發明係關於這類式⑴化合物或共輛物， 與第二種在結構上不同的化學治療劑之組合。較佳的是， 與按照上文定義之式（I)化合物或共輛物混合的化學治療 86932 -25- 200422050 劑，本身不是免疫共輛物。適合這類組合的較佳化學治療 劑是細胞靜止劑’其在核分裂或細胞質分裂的層面，阻止、 妨害、瓦解或延遲細胞分裂。該化學治療劑最好是抗-有絲 分裂劑，特別是纺錘體毒，藉著千擾微管功能而產生作用， 引起有絲分裂的停止。可將這類製劑分成兩類，像是紫杉 烷的那些，其使微管格子穩定，或是長春花生物鹼的那些， 在微管末端優先形成交互的格子聯繫和聚合物，並因此使 微管不穩定（Future 0ncol〇gy 6:1421-1456，2002; Goodsell， 2000)。在本發明中包括這兩種紡錘體毒。 因此，較佳的化學治療劑包括與微管蛋白結合的那些。 使微管穩定的較佳製劑是紫杉烷，特別是多舍他昔或紫杉 醇，以及艾普西隆，特別是艾普西隆A、B、C、D、E*F。 使微管不穩定的較佳製劑是長春花生物鹼，特別是長春花 驗、長春新驗、長春地辛（vindesine)、長春氟寧（vinflunine) 和長春瑞賓（vinorelbine)。 紫杉烷是分離自紫杉屬之紫杉樹，及其天然存在之以半 合成或以合成方式獲得的衍生物的抗-有絲分裂劑（Future Oncology 6:1421-1456, 2002; The Oncologist 5:345-346, 2000)。紫杉醇（太平洋紫杉醇（Taxol)®，Suffness[編輯]，l"5; Wani等人，1971; Holton等人，1994; Runowicz等人，1993)是 已核准的抗癌藥物，調配成不-含水的溶液（在聚氧乙烯化之 蓖麻油/乙醇中），企圖以適當的非經腸液體稀釋，可供以 15-275毫克/平方公尺的劑量靜脈内輸液，以卜、6-或24小 時輸液應用。至於有另一種化學治療劑的組合治療’建議 -26- 86932 200422050 在3或24小時内，以135或175毫克/平方公尺的劑量輸液。多 舍他昔（剋癌易（Taxotere)® ;歐洲專利第0 253 738號；美國 專利第 4,814,470號；Mangatal等人，1989; Denis等人，1991;

Burds等人，1993)亦是已核准的抗-贅生物之紫杉烷藥物。 建議的投藥是在1週的期間内，以60至100毫克/平方公尺的 摯 劑量靜脈内輸液。其他在本發明之前後文中，可使用的紫 杉烷是1^11-1 16258八(〇(^2等人，2001)。其他在此項技藝中 已知的，並可用來治療癌症的紫杉烷類，亦可用在本發明 0 中。在例如 WO 01/70718、WO 01/57028、WO 01/57027、 WO 01/56564、WO 01/57030、WO 01/57029、WO 01/57031、 WO 01/56565、WO 01/57032、WO 01/27115、WO 01/55126、 WO 01/50059、美國專利第 6,002,023號、WO 99/52887、美 國專利第5,998,656號、WO 99/32473、美國專利第5,892,063 號、WO 99/14209、美國專利第 5,763,477號、WO 98/14187、 WO 98/08833、WO 98/02426、美國專利第 5,705,508號、美 國專利第 5,703,247號、WO 97/43291、WO 97/10234、WO 癱 97/09979、歐洲專利第747 372號、WO 96/21658、英國專利 。 第 2296239號、WO 96/14308、WO 96/03394、歐洲專利第 693 ·

485號、英國專利第 2289277號、WO 95/25728、WO 95/24402 、WO 95/11020、歐洲專利第 639 577號、WO 94/27984、美 國專利第 5,367,086號、WO 94/20088、WO 95/07900、WO 94/21651、WO 94/21252、WO 94/21251、WO 94/21250、歐 洲專利第 617 034號、WO 94/17052、WO 94/17050、WO 94/25449、WO 94/15599、歐洲專利第 604 910 號、WO -27- 86932 200422050 94/12484、WO 94/10997、WO 94/08984、歐洲專利第 668 762 號、WO 94/11362、WO 94/01425、WO 93/23389、歐洲專利 第534 709號、歐洲專利第534 708號和歐洲專利第354 707 號中揭示了這類紫杉燒。

其他可在本發明中使用的化合物是經由紫杉燒機制發揮 作用的那些。經由紫杉燒機制發揮作用的化合物’包括具 有發揮使微管-穩定之影響的能力，以及對正在增殖之細胞 有細胞毒性活性的化合物，像是腫瘤細胞或其他過度增殖 性的細胞疾病。這類化合物包括例如艾普西隆化合物，像 是例如艾普西隆 A、B、C、D、E、F、BMS_247550、BMS-310705 及其衍生物。艾普西隆化合物是由某些黏液菌產生的纺錘 體毒，及其天然存在之以半合成或合成方式獲得的衍生 物。艾普西隆化合物及其衍生物為此項技藝中已知的，並 描述於例如美國專利第6，121，029號、第6，117,659號、第 6,096,757號、第 6,043,372號、第 5,969，145號、第 5,886,026 號、WO 97/19086、WO 98/08849、WO 98/22461、WO

98/25929、WO 98/38192、WO 99/01124、WO 99/02514、WO 99/03848、WO 99/07692、WO 99/27890和 WO 99/28324中 ° 特佳的是艾普西隆B(CAS第152044-54-7號；WO 98/25929; White等人，1999; Valluri等人，2001; Muhlradt等人，1997; Chou等人，1998; Chen等人，2000)，可以在0.3到3.6毫克/平 方公尺之劑量應用，更佳的是在0.3到2.5毫克/平方公尺之 間。較佳的還有由Yamaguchi等人，2002和Lee等人，2001揭 示的艾普西隆B類似物BMS-247550。艾普西隆A類似物 -28- 86932 200422050 BMS_310705(Vite等人，2002; Mekhail等人，2002)亦是較佳 的。較佳的還有艾普西隆A，由Zhu et Panek，2000描述了它 的合成，以及艾普西隆E，由Nicolaou等人，1999描述了它的 合成。艾普西隆D(美國專利第6,204,388號；美國專利第 6,303,342號；Wang等人，2001; Chou等人，1998)亦是較佳 的，其可以10-20毫克/平方公尺的劑量應用。 長春花生物驗是由長春花（catharanthus)屬（從前的vinca Linn.)之植物，特別是長春花產製的紡錘體毒，及其天然存 在之以半合成或合成方式獲得的衍生物。長春花鹼，例如 以其硫酸鹽的形式，是已經核准的抗·癌藥物（Gorman等人， 1959;美國專利第3,097，137號；美國專利第3,225,030號； Sieber等人，1976; Lu et Meistrich，1979; Muhtadi et Afifi， 1992)。可調配硫酸鹽成為純的物質，在投藥之前將其溶解 於生理鹽水中，並可以3至18.5毫克/平方公尺之劑量，較佳 的是5.5至7.5毫克/平方公尺，每週一次以靜脈内團塊注 射。長春新驗，例如以其硫酸鹽的形式，亦是已核准的抗-癌藥物（Neus等人，1964; Sieber 等人，1976; Owellen et Donigian，1972; Burns，1972)。可將硫酸鹽調配成固體製 品，含有作為賦形劑的等量乳糖，並在投藥之前溶解於等 張的生理鹽水中。每週可使用1至2毫克/平方公尺的藥物， 以靜脈内團塊應用。長春地辛是長春花鹼的合成衍生物， 亦為已核准的化學治療劑（德國專利第2415980號；Burnett 等人，1978; Owellen等人，1977; Kfivit等人，1979)。可利用 甘露糖醇作為賦形劑（以1:5之比例），將長春地辛硫酸鹽調 86932 -29- 200422050 配成散劑調配物，並在投藥之前溶解於水或等張的生理鹽 水中。每週靜脈内團塊注射，可使用2-4毫克/平方公尺。長 春瑞賓是半合成的長春花生物驗，亦核准用於癌症的治療 (美國專利第 4,307，100號；Mangeney等人，1979; Rahmani等 人，1987; Marty等人，1989)。可在水中以1〇毫克/毫升的濃 度，將其調配成長春瑞賓雙[(R,R)-酒石酸鹽]，在投藥之前 以等張的生理鹽水或5%葡萄糖溶液稀釋，並以20至30毫克/ 平方公尺之劑量，每週以靜脈内輸液。長春氟寧（CAS 162652-95-1 ; Decosterc等人，1999)和去甲長春花鹼 (navelbine)(Van-den-Berge等人，1993)亦適用於本發明。在 此項技藝中，已知更多的長春花生物鹼，可與本發明聯合 使用（WO 99/62912 ; WO 98/45301 ;美國專利第 5,369，111 號；美國專利第5,888,537號；美國專利第5,891，724號；美 國專利第5,676,978號；美國專利第4,096，148號）。 更多可用在本發明之前後文中’使微管不穩定的製劑是 5,6-二氫啕哚并[2，l-a]異喳琳衍生物（Goldbrunner等人， 1997)。特別適合的是康柏塔斯汀（c〇mbretastatin)A4-鱗酸酯 (Horsman等人，1998) ’及其衍生物’像是+斯塔汁 (hydroxphenastatin)(Pettit等人，2000)或 AVE 8062(Ohsumi寺 人，1998)。亦可使用海绵素（Spongistatins) ’像是海綿素1、 2、3、4、5、6、7、8或9(歐洲專利第〇 608 111號；歐洲專 利第0 632 042號；歐洲專利第〇 634 414號）。在本發明中所 使用的其他微管蛋白拮抗劑，是E_7010(CAS丨41430-65·1 ; Hoshi et Castaner，1993)。可在本發明之前後文中使用的其 -30- 86932 200422050 他微管蛋白拮抗劑，是多拉斯塔汀（dolastatins)，像是西馬 多丁（cemadotin)鹽酸鹽（Mross等人，1996)。亦可使用米佛布 林經乙績酸鹽（Mivobulin isethionate)(De-Ines等人，1994)。 將式（I)化合物，特別是CD44v6專一性抗體分子與類美登 素的共軛物，與其他的化學治療劑，像是念珠環藻月太 (cryptophycin)、喜樹鹼類（camptothecin)(特別是喜樹鹼、抬 樸特肯（topotecan)、伊利替康（irinotecan)、9-胺基喜樹驗） 或表鬼臼毒素（epipodophyllotoxin)(特別是依托泊芬 (etoposide)或替尼泊苷（teniposide))充分混合。亦與本發明 聯合使用的是氨茴環黴素，像是阿黴素和道諾紅菌素。此 外，亦可使用像放線菌素D、普卡黴素（plicamycin)、絲裂 黴素、博菜黴素和伊達比星（idarubicin)之類的抗生素。同 樣也可以使用像環磷酷胺、氮芥（mechlorethamine)、苯丙胺 酸氮芥（melphalan)、苯丁酸氮芥（chlorambucil)、丙卡巴肼 (procarbazine)、甲嗪咪 口坐胺（dacarbazine)、六甲蜜胺 (altretamine)、鉑化合物（特別是順氯氨鉑（cisplatin)、卡鉑 (carboplatin)、奥沙利鉑（oxaliplatin)、異丙鉑（iproplatin)、 奥馬舶（ormaplatin)、特崔銘（tetraplatin))，或亞梢基脲，像 是卡莫司汀（carmustine)、洛莫司汀（lomustine)或司莫司汀 (semustine)之類的燒基化試劑。亦包括胺甲碟呤、嘌呤拮抗 劑，像是競基嘌呤、硫代鳥嘌吟、氟達拉濱（fludarabine)磷 酸鹽、克拉君賓（cladribine)、噴司他丁（pentostatin)或口密淀 結抗劑，像是氟尿响淀、去氧氟尿嘗（doxifluridine)(5’_脫氧 -5-敦尿嘗）、截瘤達（capecitabine)、阿糖胞芬（〇713^1)丨1^)或 86932 -31 - 200422050 阿扎胞苷（azacytidme)。在更佳的具體實施例中，該化學治 療劑是截瘤達（N4-戊氧羰基_5，_脫氧_5_氟胞嘧啶；Ishikawa 等人，1998)。 在本發明的前後文中，”組合”應意指在攝生法中，將式⑴ 化合物，特別是CD44v6專一之抗體分子與類美登素的共軛 物投予患者，其中患者可從這類組合的有利作用而獲益。 特定而言，在接近的時間點將兩種藥物應用於患者上。在 較佳的具體實施例中，在4週（28天）内將兩種藥物應用於患 者上。更佳的是，在2週（14天）内投予兩種藥物，更佳的是 在1週（7天）内。在較佳的具體實施例中，在2或3天内投予兩 種藥物。在另一個較佳的具體實施例中，在同一天，即Μ 小時内投予兩種藥物。在另一個具體實施例中，在4小時或 2小時内，或在1小時内應用兩種藥物。在另一個具體實施 例中，平行地，即同時投予兩種藥物，或兩次投藥在時間 上重疊。例如，它們可在同時輸液，或輸液在時間上重疊。 若同時投予兩種藥物，可在單一的醫藥製品中，將它們調 配在一起，或在投藥之前才將兩種不同的醫藥製品混合在 一起，例如藉著溶解或稀釋於單一的輸液溶液中。在另一 個具f豆貫犯例中，分開投予兩種藥物，即以兩種獨立的醫 藥組合物。在一個較佳的具體實施例中，以使在患者體内 之腫瘤細胞同時暴露在有效含量的兩種藥物下的方式^投 予兩種藥物。在另一個較佳的具體實施例中，使有效含= 的兩種藥㈣時出現在腫瘤的位置。個較佳的：： 實施例中，使有效含量的兩種藥物同時出現在患者體内。 -32- 86932 200422050 本發明亦包含除了根據定義的組合之外，更多可投予之製 劑的應用。例如，可以是一或多個更多的化學治療劑（們）。 亦可以是一或多個用來預防、壓抑或緩和任何已給予之其 他藥物的不想要之副作用的製劑（們）。例如，可應用刺激白 血球增殖的細胞激動素，來緩和白血球減少症或嗜中性白 血球減少症的影響。 劑量、投藥途徑、應用計畫 縻的重複和期間，通常 將依據疾病的性質（腫瘤的類型、等級和階段等等），以及串、 者（體格、年齡、性別等等），並將由負責治療的醫學專家判 定。至於所揭示之上述組合之成分的可能劑量，顯然負責 治療之醫學專家將小心地監視是否出現任何劑量_限制之 毒性或其他嚴重的副作用，並承擔管理那些的必要步驟。 本發明具有治療表現CD44抗原，最好是CD44v6之鱗狀細 胞癌的特殊優點。其特別適合頭和頸部的鱗狀細胞癌、食 道鱗狀細胞癌、肺臟鱗狀細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌或子宮 頭鱗狀細胞癌。此外’其亦具有治療表現cd44抗原，最好 是⑶⑽腺癌的特殊優點。特別適合乳房腺癌、肺臟腺癌、 騰臟腺癌、結腸腺癌或胃腺癌1 了治療在臨床上明顯的 惡性疾病之外，根據本發明之治療應用，在作為手術介入 《佐助劑’以便治療最低殘餘疾病上是特別有益的。 、在更進—步的觀點中，本發明係關於包括按照在本文中 疋義之化合物A(LB)n或共輛物，冑同按照在本文中定義之 劑的醫藥組合物，並可視需要進-步包括一或多 “上可接文疋載劑(們)、#釋劑⑹或賦形劑(們)。 86932 -33- 200422050 在更進一步的具體實施例中，本發明係關於在分開的醫 藥組合物中，包括按照在本文中定義之化合物A(LB\，特 別是CD44V6專一之抗體分子與類美登素的共軛物，以及在 本文中足義之化學治療劑的套組。 在更進-步的具體實施例中，本發明係關於化學治療劑 在製備治療癌症之醫藥組合物上的應用，其中使用該化學 治療劑，或在按照在本文中定義之化合物A(LB)n的組合 中，特別是CD44v6專一之抗體分子與類美登素的共軛物中 使用孩化學治療劑。該化學治療劑最好是紫杉烷、艾普西 隆、長春花生物鹼或其他的微管蛋白拮抗劑、鉑化合物、 喜樹鹼、念珠環藻肽、多拉斯塔汀、表鬼臼毒素、烷基化 試劑、嘌呤拮抗劑、嘧啶拮抗劑或DNA嵌入物。在較佳的 具體實施例中，該化學治療劑為多舍他昔、紫杉醇、 RPR-116258A、艾普西隆 A，B C D E 或 F、BMS 24755〇、 BMS-3 10705、長春花鹼、長春地辛、長春新鹼、長春瑞賓、 康柏塔斯汀A4-磷酸酯、羥苯斯塔汀、AVE 8〇62、海绵素 1，2,3,4,5,6,7,8或9、Ε·7010、多拉斯塔汁、西馬多丁鹽酸鹽、 米佛布林羥乙磺酸鹽、念珠環藻肽、喜樹鹼、拓樸特肯、 伊利替康、9-胺基喜樹鹼、順氯氨鉑、卡鉑、奥沙利鉑、 兴丙鉑、奥馬鉑、特崔鉑、依托泊苷、替尼泊苷、阿黴素、 返諾紅菌素、放線菌素D、普卡黴素、絲裂黴素、博菜黴素、 伊達比星、j哀磷醯胺、氮芥、苯丙胺酸氮芥、苯丁酸氮芥、 丙卡巴胼、甲嗪咪唑胺、六甲蜜胺、卡莫司汀、洛莫司汀、 司莫司>丁、胺甲碟呤、巯基嘌呤、硫代鳥嘌呤、氟達拉濱 86932 -34- 200422050 磷酸鹽、克拉君賓、喷司他丁、氟尿嘧啶、阿糖胞苷或阿 扎胞菩。 在更進一步的觀點中，本發明係關於治療癌症的方法， 其中將有效含量之按照在本文中定義的化學治療劑，投予 需要其之患者，連同按照在本文中定義之化合物A(LB)n， 特別是CD44v6專一之抗體分子與類美登素的共軛物。 參考資料

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Zha et Panek, Org. Lett. 2 (17): 2575-2578, 2000. -42- 86932 200422050 【實施方式】 實例 1.製造BIWI 1並定出特徵 1.1.製造BIWI 1 按照下述，將對在序列識別1號中之抗原決定位具有結合 專一性的人類化重組抗體BIWA4和BIWA8，與類美登素DM 1 連接。將BIWA4與DM1的共輛物命名為BIWI 1。 穩定轉移感染之細胞株的產製。將編碼BIWA4 ’序列識 別5號和序列識別7號之輕和重鏈的基因，連接到表現載體 pAD-CMVl(WO 92/01055 ; NCBI GenBank登錄編號A32111) 或 pAD-CMV19(NCBI GenBank 登錄編號 A32110)内。在第二 個抗體BIWA8中，由基因編碼之輕鏈具有序列識別9號’而 重鏈則與在BIWA4中的相同。如下藉著電穿透作用，產生 穩定轉移感染的細胞株。使用CHO DUX/57ss(中國倉鼠卵巢 細胞的dhfr負突變種，適合不含血清的懸浮培養基）。在以 胰蛋白酶消化，並以RPMI-10 (90%RPMI 1640，1〇%熱失活 之胎牛血清）使胰蛋白酶失活之後，以RPMI-0(不含血清的 RPMI 1640)沖洗細胞一次，將lxlO7個細胞懸浮於0.8毫升 RPMI_0中。在加入直線化的DNA(每個質體20微克；共同轉 移感染編碼輕和重鏈的載體）之後，在下列的條件下使用 Hoefer電穿透器將細胞電穿透：1080微法拉第，320伏特， 1000毫秒，1脈衝。容許靜置細胞5分鐘，然後以α-MEM 10d (不含核糖核酸且不含脫氧核糖核酸的90%MEMa(GIBCO BRL·)’ 10%熱失活之經過透析的月台牛血清）稀釋至12500個細 86932 -43- 200422050 胞/毫升和2500個細胞/毫升。將細胞播種在96孔微量培養盤 上（200微升/孔，分別相當於2500個和500個細胞/孔）。在1〇 天後出現純種系。只追蹤有500個細胞/孔（3-6個純種系/孔） 的培養盤。在14-15天之後，以κ/γ ELISA測試得自每孔的上 清液。將53個純種系播種在12孔培養盤的α-MEM 10d中。 在3-6天後（依據細胞的匯合度），再度以κ/γ ELISA測試上清 液（連續稀釋），並使用人類IgGl標準物定量。冷凍細胞，並 儲存在液態氮中。53個純種系的IgG内含量在12-417毫微克 /毫升的範圍内。選出10個具有最高表現程度的純種系，並 如下繼代選殖··以1至5個細胞/孔的密度，將每個純種系的 細胞播種在96孔微量培養盤的1〇〇微升eLa-MEM 10d中（每 個純種系1個培養盤，以各種密度）。在8天之後，以1:2稀釋 上清液，以κ/γ ELISA測試100微升之該稀釋物，並使用BIWA 4製品作為標準物來定量。將每個純種系的5個繼代純種系 移至12孔的培養盤。IgG内含量在ι·3_9〇8毫微克/毫升的範 圍内。使用14個具有最高表現程度（384-908毫微克/毫升）的 純種系’如下利用胺甲碟呤進行擴大作用：最初在含有 a-MEM l〇d ’ 20、50和100 ηΜ胺甲碟呤的25平方公分之燒 开瓦中培養純種系。在純種系的自然發展之後，以κ/γ EUSA 測試上清液。在後續的擴大回合中，將胺甲碟呤的濃度升 高到2000 nM。一開始的最高表現程度，是在從1〇5_148微 克/¾升的範園内（純種系A31/l〇〇，1〇〇 ηΜ胺甲碟呤）。進一 步的擴大作用，利用50〇111^的胺甲碟呤濃度，得到19_2〇微 克/毫升的表現（Α3 1/500)。 86932 -44- 200422050 抗體的純化。如下從細胞培養上清液中純化抗體。在4 °C下，將含有抗體之組織培養上清液施加在5毫升蛋白質A 瓊脂糖管柱上，以80-90毫升/小時的流速。在以50毫升結合 緩衝溶液（0.1 Μ磷酸鈉pH 7.5)沖洗之後，以洗脫緩衝溶液 (0·1 Μ甘油-HC1 pH 2.7)洗脫Ig溶離份。 以SPP修改BIWA 4，形成BIWA 4-SS-Py。在含有吐溫20 的PBS調配物中，以濃度5毫克/毫升的液體形式提供BIWA 4。在偶聯DM1和MAb之前，先移除吐溫20。以含有50 mM NaCl的25 mM MES緩衝溶液，pH 5.6(MES緩衝溶液）稀釋 MAb溶液（40 mL)15-倍，然後裝入以MES緩衝溶液平衡過 (流速：100公分/小時）的瓊脂糖S管柱（12.5毫升）中。以10 倍管柱體積的MES緩衝溶液沖洗該管柱。以含有400 mM NaCl的MES緩衝溶液洗脫抗體。將抗體溶液對含有50 mM NaCl和2 mM EDTA的50 mM磷酸鉀pH 6·5(緩衝溶液A)透 析。使用SPP((2-吡啶基）-5-二硫代戊酸N-羥基琥珀醯亞胺 酯）修改BIWA 4抗體，導入二硫代吡啶基團。以7-倍莫耳過 量的在EtOH中之SPP，修改在緩衝溶液A中的MAb(185毫 克，8毫克/毫升）(5%體積/體積的MAb溶液）。該反應在周圍 溫度下進行90分鐘。然後使該反應混合物接受凝膠過濾層 析法，通過以緩衝溶液A平衡過的交聯葡聚糖G25F (2.6X31.5公分管柱，167毫升）。集合含有MAb的溶離份， 並藉著測量在280毫微米處的吸光度，以及在343毫微米 處，由於加入DTT而釋放出2-銃基吡啶所引起的吸光度改 變，判定修改的程度。使用8080M·1公分“的ε343毫微米，計算 86932 -45- 200422050 所釋放之2-巯基吡啶的濃度，並在2-疏基吡啶促成修改在 280毫微米處的吸光度之後，使用224,000m·1公分」的ε28〇毫微 米’來計算MAb的濃度〇 (2-鏡基口比淀Α280毫微米=Α343毫微米 X5100/8080)。MAb的回收為99.6%，每個MAb分子與5.5個 可釋放的2-銃基吡啶基團連接。 BIWA4-SS-Py與DM1的共軛作用。以2.5毫克MAb/毫升， 共輛在緩衝溶液A中之上文經過修改的MAb( 184毫克），使 用1.7-倍莫耳過量的DM1，覆蓋可釋放之2-巯基吡啶基團。 將DM1加至DMA(3%體積/體積的MAb溶液）中，並在周圍溫 度下培養該反應混合物29小時。藉著凝膠過濾層析法，在 以PBS平衡過的丙晞葡聚糖凝膠（Sephacryl) S300 HR管柱 (5x50公分管柱，980毫升，流速10公分/小時）上分離共軛 物。在稍早洗脫出少量蛋白質之單體MAb的位置處，以單 一高峰洗脫該共輛物。針對與每個MAb分子連接之DM1分 子的數目，測定溶離份。（藉著測量在252毫微米和280毫微 米處的吸光度，判定已連接的DM1分子）。以結果為基礎， 收集相當於63-77%管柱體積的溶離份。發現在所收集之溶 液中的DM1/MAb比例是3.1，且以起始MAb為基礎，共輛 BIWA 4的產量是75%。藉著在非-還原條件下進行SDS-PAGE，評估共軛物BIWI 1，並發現主要是由單體物種（>95%) 和少量的（<5%)二聚體共輛物組成。 1.2. BIWI 1之活體外結合的分析 判定BIWA 4抗體和BIWI 1共軛物與抗原-陽性FaDu細胞 的結合。在冰上，在96-孔培養盤中，將細胞（1-2x10_5)與各 86932 -46- 200422050 種濃度之抗體或共輛物一起培養1小時。從培養盤中沖洗出 受試物件，並加入FITC-標示之抗-人類IgG，並於暗處在冰 上繼續培養1小時。在沖洗之後，以1 %仲甲醛固定細胞，並 在螢光激活之細胞分類器（FACS)上分析。BIWA 4抗體結合 顯然有1\1〇-9以的反〇，而趴\¥11結合顯然有1.8又1〇-9]^的〖1)。 因此，與DM1共輛，即使有也僅稍微改變抗體的結合親和 力。 1.3. BIWI 1的活體外細胞毒性 為了判定可存活細胞，使用Cell Titer 96® AQueous# 放射 性細胞增殖測定（Promega)。將每孔5000個細胞播種在96-孔培養盤的90微升不含盼紅之培養基中。容許細胞沉降1至 3小時，然後加入在10微升PBS中連續稀釋的免疫共軛物。 沒有免疫共軛物的細胞作為陰性對照組。在37°C下，在潮 濕的5%C02氣壓下，培養細胞4天，並根據製造者的建議， 加入20微升MTS/PMS。在37°C下額外培養1至4小時之後， 使用ELISA培養盤讀取器記錄在490毫微米處的吸光度。每 種細胞株進行一式三份的分析。使用GraphPad Prism®(3.0 版）軟體，計算存活細胞分數的百分比和IC50值。 使用抗原-陽性的細胞株A43 1和FaDu，以及抗原-陰性的 細胞株A459，評估BIWI 1在活體外的細胞毒性。將細胞暴 露在不同濃度的BIWI 1下4天，然後以MTS/PMS染色，並在 ELISA培養盤讀取器上測定。然後使用GraphPad Prism®套裝 軟體計算細胞的存活分數。在圖1中出示結果。BIWI 1有效 地殺死抗原-陽性的A431細胞，具有大約7·6χ10_8Μ的IC50, 86932 -47- 200422050 以及第二個抗原·陽性的細胞株FaDu，具有大約2.4χ10·8Μ的 IC5G。抗原-陰性的細胞株Α549受到共軛物的影響，在受試 之BIWI 1的最高濃度（5xlO_7M)下有50%的存活分數。這些 結果顯示，BIWI 1在活體外對抗原-陽性之細胞，僅比抗原 -陰性之細胞有稍高的細胞毒性。為了進行比較，其他的 DM1-抗體共軛物已經顯示，與抗原-陰性的細胞相比較，對 抗原-陽性的細胞有至少更多1000倍的細胞毒性（Chari等人， 1992) ° 2.在裸鼠中的效力研究 2.1. 異種移植模式 在3種使用抗原·陽性之人類腫瘤：A431(ATCC#CRL 15 55 ;外陰的表皮樣癌）、FaDu(ATCC#HTB43 ;咽的鱗狀細 胞癌）和MDA-MB 453(ATCC#HTB-131 ;乳癌）的裸鼠異種移 植模式中，測試BIWI 1在活體内的抗-腫瘤效力。從ATCC 收到細胞，並培養在含有10%胎牛血清和補充物的RPMI 1640培養基中。將lxlO6個腫瘤細胞皮下移植到6週齡雌性 NMRI- nu/nu老鼠的右側内。藉著測量腫瘤尺寸來監視腫瘤 的生長。將在開始治療之後任何時間點，腫瘤完全消失時 的腫瘤反應視為完全反應。將在治療後腫瘤體積降低，但 隨後又開始再度生長時的反應視為部分反應。藉著在觀察 期間内測量老鼠的體重，監視治療的耐受性。 2.2. 在A431異種移植裸鼠中的BIWI 1單一治療 將老鼠隨機分成下列的治療組（治療/最初平均腫瘤體積/ 腫瘤體積範圍/老鼠數目）： 86932 -48- 200422050 第1組：對照組（PBS)/185土217立方毫米/19-424立方毫米/5 隻老鼠 第2組：BIWA 4(21毫克/公斤/天）/丨33 士 115立方毫米/42-302 立方毫米/5隻老鼠 第3組：BIWI 1(2.1毫克/公斤/天）/107 土 63立方毫米/42-205 立方毫米/5隻老鼠 第4組：BIWI 1(7毫克/公斤/天）/132土73立方毫米/42-205立方 毫米/5隻老鼠 第5組：BIWI 1(21毫克/公斤/天）/ι〇7 土 63立方毫米/42-205立 方毫米/5隻老鼠 分別以2.1毫克/公斤/天BIWI 1、7毫克/公斤/天BIWI 1、 21¾克/公斤/天BIWI 1和21毫克/公斤/天對照組抗體處理每 組5隻老鼠。治療包括從第1天開始，在連續$天中給予BIWI 1的靜脈内注射。在圖2中出示在觀察期間内每組的平均腫 瘤體積。以對照組抗體處裡的腫瘤，顯示像未治療腫瘤類 似的生長，腫瘤體積變雙倍的時間約為5天。在以7毫克/公 斤/天BIWI 1或21毫克/公斤/天趴…工【處理的動物中，所有 的腫瘤均完全反應，並在大約第17天消失。直到觀察期間 結束（134天）為止，未觀察到腫瘤再度生長。以21毫克/公 斤/天處理的腫瘤，3/5的案例完全反應，直到第134天為止， /又有腫瘤再度生長。剩下2個腫瘤顯示部分反應，但最後再 度生長。這些結果顯示BIWI 1在A431異種移植的裸鼠中， 誘導劑量-依賴性抗-腫瘤反應，從毫克/公斤/天趴界工1 至21毫克/公斤/天趴界^，有完全和長期持續的反應。未共 86932 -49- 200422050 軛的對照組抗體顯示沒有抗-腫瘤的效果。 參見圖2。 2.3.在FaDu異種移植裸鼠中的BIWI1單一治療 將老鼠隨機分成下列的治療組（治療/最初平均腫瘤體積/ 腫瘤體積範圍/老鼠數目）： 第1組：對照組（PBS)/142 士 82立方毫米/34_268立方毫米/8隻 老鼠 第2組：BIWA 4(21毫克/公斤/天）/134土86立方毫米/42-268立 方毫米/6隻老鼠 第3組：BIWI 1(2.1毫克/公斤/天）/149 士 96立方毫米/50-268 立方毫米/ 6隻老藏 第4組：BIWI 1(7毫克/公斤/天）/132土97立方毫米/42-268立方 毫米/6隻老鼠 第5組：BIWI 1(21毫克/公斤/天）/129 土 74立方毫米/50-231立 方毫米/6隻老鼠 分別以2.1毫克/公斤/天BIWI 1、7毫克/公斤/天BIWI 1、 21毫克/公斤/天BIWI 1和21毫克/公斤/天對照組抗體處理每 組6隻老鼠。治療包括從第1天開始，在連續5天中給予BIWI 1的靜脈内注射。在圖3中出示在觀察期間内每組的平均腫 瘤體積。以對照組抗體和2.1毫克/公斤/天BIWI 1處裡的腫 瘤，顯示像未治療腫瘤類似的生長，腫瘤體積變雙倍的時 間約為5天。在以21毫克/公斤/天BIWI 1處理的動物中，所 有的腫瘤均完全反應，並在大約第24天消失。直到觀察期 間結束（107天）為止，未觀察到腫瘤再度生長。1/6以7毫克/ 86932 -50- 200422050 公斤/天BIWI 1處理的腫瘤完全反應，3/6的腫瘤顯示部分反 應。剩下2個腫瘤顯示像未治療腫瘤類似的生長。這些結果 顯示BIWI 1在FaDii異種移植的裸鼠中，謗導劑量-依賴性抗 -腫瘤反應，從7毫克/公斤/天BIWI 1至21毫克/公斤/天BIWI 1，有完全和長期持續的反應。未共輛的對照組抗體顯示沒 有抗-腫瘤的效果。 參見圖3。 2.4.在MDA-MB 453異種移植老鼠中的BIWI 1單一治療 分別以6.25毫克/公斤BIWI 1、12.5毫克/公斤BIWI 1和25 毫克/公斤BIWI 1處理每組6隻老鼠。治療包括每週給予 BIWI 1的靜脈内注射，持續4週。在處理開始時，平均腫瘤 尺寸分別為246土 79立方毫米（PBS)，216士 85立方毫米（6.25毫 克/公斤BIWI 1)，188土79立方毫米（12·5毫克/公斤BIWI 1)和 207 士96立方毫米（25毫克/公斤BIWI 1)。在圖4中出示在觀察 期間内每組的平均腫瘤體積。對照組腫瘤之最初腫瘤體積 變雙倍的時間約為5天。在以25毫克/公斤BIWI 1處理的動物 中，所有的腫瘤均完全反應，並在開始處理之後大約第22 天消失。直到觀察期間結束（64天）為止，未觀察到腫瘤再度 生長。以12.5毫克/公斤或6.25毫克/公斤處理的腫瘤，在各 組中分別有5/6的案例完全反應，且每組中各有4隻動物保 持沒有腫瘤，直到實驗結束為止。這些結果顯示BIWI 1在 MDA-MB 453異種移植的裸鼠中，在4週的期間内每週投藥 一次時，誘導抗腫瘤的反應，且從6.25毫克/公斤BIWI 1至 25毫克/公斤BIWI 1，有完全和長期持續的反應。 86932 -51- 200422050 參見圖4。 2·5·在裸鼠*BIWI丨單一治療的耐受性

物。在所有其他的劑量組中，體 、4 π如次天體重，並持續 增重，且舉動類似對照組動 骨豆重的喪失類似媒劑對照組 (PBS)。在所有治療組中6%或更低的平均體重喪失，代表在 裸鼠中對於特定劑量iBIWI i治療的良好耐受性。因為 BIWI 1不與老鼠的cD44v6產生交又-反應，可在本實驗中監 視到僅藉著自由DM 1引起的抗原-獨立性作用，像是毒性。 參見圖5。 2·6·在FaDu異種移植的模式中，BIWI 1與紫杉醇的組合治 療 將老氣隨機分成下列的治療組（治療/最初平均腫瘤體積/ 腫瘤體積範圍/老鼠數目）： 第1組··對照組（PBS)/197立方毫米/65-402立方毫米/8隻老鼠 第2組：紫杉醇/182立方毫米/65-302立方毫米/8隻老鼠 第3組：BIWI 1/208立方毫米/65-382立方毫米/8隻老鼠 第4組：BIWI 1 +紫杉醇/159立方毫米/79-335立方毫米/7隻老 鼠 治療包括分別在第1、3、5、8、10天時，5次靜脈内注射 BIWI 1(7毫克/公斤，相當於100微克/公斤的DM1)，或在第 -52- 86932 200422050 2、4、6、9、11、13天時，6次腹腔内注射紫杉醇（1〇毫克/ 公斤）’或其混合。以pBS處理對照組。 在表1中概述貫驗的結果。在圖6中出示在治療期間的平 均相對腫瘤體積，在圖7中出示個別的腫瘤體積。以紫杉醇 單一治療的結果，與以PBS治療的動物相比較，導致腫瘤生 長延遲。BIWI 1單一治療的結果，與PBS_治療的動物相比 較，有3/8的動物顯示腫瘤生長的明顯延遲。在混合組中， 所有的腫瘤均對治療產生反應，且與對照組相比較，明顯 地延遲了腫瘤生長。在治療期間，一個腫瘤完全消失，且 直到觀察期間結束為止，動物仍保持沒有腫瘤。這些實驗 從貫與各自的單一治療相比較，明顯地增加了 丄與紫 杉醇之組合的抗-腫瘤效力，表示組合治療的協同效果。 表1 :不同治療組之最初腫瘤變雙倍的時間、生長延遲因數 f完全腫瘤退化的數目 治療組 最初腫瘤變雙倍的 時間(天） 生長延遲因數 完全退化 對照組 4 n.a. 0/8 紫杉醇 7 0.75 0/8 BIWI 1 7 0.75 0/8 組合BIWI 1+紫杉醇 39 8.75 1/7 亦參見圖6和7。 藉耆在整個實驗期間内監視老鼠體重，來判定治療的耐 文性。在混合組中’每組平均體重喪失的最大觀察值為低 於5%。在所有其他的劑量組中，在治療時基本上沒有觀察 86932 -53 - ^^422050 到體重喪失。㈣5%的平均體重喪失，代表在裸鼠中對於 特定劑量之治療的良好耐受性。 2.7.在FaDu異種移植的模式巾，Bwi i與乡舍他昔的組合 治療 使用皮下異種移植人類頭和頸部鱗狀細胞瘤的裸 鼠，來進行實驗。欲判定作為靜脈内給予之單一藥物的mwi 1的效力，以每週的計畫，測試不同的劑量含量。欲 砰估與化學治療併用時可能的拮抗、加成或超加成效果， 將非-治癒劑量的BIWI i與非-治癒劑量的多舍他昔或順氯 氨鉑混合。藉著i)在一段時間内分析腫瘤體積，並ii}藉著腫 瘤達到某些尺寸的時間，將這些組合的效果與各自單一治 療的效果相比較。 根據指定之DM1濃度，以PBS稀釋一批BIWI 1(2.95毫克/ 毫升蛋白質，53.6微克/毫升DM1，3.7分子DM1/分子Ab)。 在整個治療期間，將稀釋物儲存在+41下。以25克老鼠2〇〇 微升之注射體積，將抗體溶液注射到尾靜脈内。在無BIWi 1 治療的對照組中，以PBS靜脈内注射動物。根據指定的濃 度’以0.9%NaCl稀釋多舍他昔（划癌易®，Aventis，10毫克/ 愛升）°以25克老鼠200微升之注射體積，將該溶液注射到 尾靜脈内。根據指定的濃度，以〇.9%NaC1稀釋順氯氨鉑（順 氯氨銘"Ebewe，，，1毫克/毫升）。以25克老鼠200微升之注射 體積，將該溶液注射到尾靜脈内。 每週記錄腫瘤尺寸和體重2-3次。以測徑器測量腫瘤尺寸 (長度和寬度），並根據下列的公式計算體積：體積=(長 86932 -54- 200422050 度）χ(寬度）2χ(π/6)。藉著在整個觀察期間内測量老鼠體重， 監視治療的耐受性。當腫瘤達到丨6〇〇立方毫米以上的體積 時’或當動物顯示出體重喪失超過15%時犧牲動物。為了計 算每組的平均腫瘤體積，在整組結束之前，將在那些動物 疋因為大腫瘤負荷而欲犧牲的案例中，個別動物腫瘤尺寸 的最終值記入。除了以立方毫米計的絕對腫瘤體積之外， 如下計算相對腫瘤體積（RTV): RTV=(在第X天的腫瘤體積）/(在開始治療時的腫瘤體 積）xl00 至於治療效力的計算，計算下列的參數： -T/C(%)=(治療組的平均RTV)/(對照組的平均RTV)xl〇〇 -T4T(腫瘤變四倍的時間）=直到平均RTv達到4〇〇%的時間 -GDF4(生長延遲因數）=Τ4Τ治療組/T4T對照組 此外，對某些案例而言，亦計算腫瘤達到其開始尺寸8 倍的平均時間（Τ8Τ)。然後據此來計算生長延遲因數 (gdfs)。在指定的曰子，計算治療組對對照組之平均相對 腫瘤體積的百分比（τ/c)。至於組合治療的統計評估，使用 精確的Wilcoxon檢定。藉著監視體重變化，來評估耐受性。 欲評估BIWI 1與紫杉烷多舍他昔（剋癌易,之組合的效 力，在以？3〇11£)1)腫瘤異種移植的裸鼠中，測試兩種藥物作 為單一製劑或併用時的非-治癒劑量。在實驗性的實驗中， 判疋3毫克/公斤多舍他昔（每7天一次以次）在該模式中是非 -治癒的。以200微克/公斤DM1之非_治癒劑量，並以稍高的 劑量（300微克/公斤〇]^1)，使用31〜11。 86932 -55- 200422050 將老鼠隨機分成治療組，並在表2中出示評估治療效力的 參數。對照組具有大約7天的T4T。利用多舍他昔的單一治 療，在腫瘤生長的延遲程度上，顯示出中等的效力（T/C 56%， GDF4:1.9)。在兩個BIWI 1單一治療的治療組中，多少有更 深遠的影響，具有T/C41-30%和GDF‘2.8-4.4。在利用較高 _ BIWI 1劑量時，可觀察到1/8完全腫瘤退化。相反的，在兩 個組合治療中，明顯地抑制腫瘤的生長（T/C 3-2%)，在95 天的觀察期間内，沒有腫瘤達到400%的相對腫瘤體積 (GDF4〉13.3)。多舍他昔與低劑量BIWI 1的組合，結果產生 7/8完全腫瘤退化，同時在與較高BIWI 1的混合組中，所有 的腫瘤均消失。這些結果表示與個別的單一治療相比較， 組合治療的超加成效果。在所有組別中均完全可忍受治 療，除了在多舍他昔單一治療組中，細微無法解釋的體重 喪失（約-5%)。 表2 :在以FaDuDD腫瘤異種移植的裸鼠中，BIWI 1與多舍他 昔的組合：最初腫瘤體積（TV)和評估治療效力的參數（參數 φ 的定義參見4.4段）。治療計畫：每週一次持續4週（每7天一 . 次x4);每組8隻動物 。指定 古τ/c的日子。 組別 最初TV平 均值（立 方毫米） 最初TV範 圍（立方 毫米） T/C(第 16天） T4T (天） gdf4 對照組（PBS) 166 113-268 100% 7.2 1.0 BIWI 1 200微克/公斤 DM1 157 79-335 41% 20.1 2.8 BIWi 1 300微克/公斤 DM1 183 65-382 30% 31.1 4.4 86932 -56- 200422050 多舍他昔3毫克/公斤 193 79-302 56% 13.5 1.9 BIWI 1 200微克/公斤 DM1 +多舍他昔3毫克 /公斤 160 92-268 3% >95 >13.3 BIWI 1 300微克/公斤 DM1 +多舍他昔3毫克 /公斤 200 113-424 2% >95 >13.3 以順氯氨鉑進行不同組的實驗。在實驗性的實驗中，判 定按每週之間隔，靜脈内投予4毫克/公斤之劑量的順氯氨 鉑4次，在本實驗中是非·治癒的，亦代表在所使用之老鼠 品系中，是最大财受劑量。將該劑量的順氣氨舶，與已經 在先前實驗中使用200微克/公斤DM1和300微克/公斤DM1 之非·治癒劑量的BIWI 1混合。將老鼠隨機分成治療組，並 在表3中出示評估治療效力的參數。對照組具有大約11天的 T4T。利用BIWI 1的單一治療，在兩種劑量含量中，顯示出 中等的效力（T/C 59-27%，GDF4:2.2-2.3)，而以順氯氨鉑作為 單一製劑時是無效的（T/C 100%，GDF4:1.1)。相反的，順氯 氨鉑與BIWI 1的組合，顯示出明顯的治療益處，在利用較 低BIWI 1劑量的組中，具有4之GDF4，而在利用較高BIWI 1 的組中，GDF4〉6.8。在後者的組合中，可觀察到2/8完全腫 瘤退化。這些結果表示與個別的單一治療相比較，組合治 療的超加成效果。在所有組別中均完全可忍受治療。 表3 :在以FaDuDD腫瘤異種移植的裸鼠中，BIWI 1與順氯氨 鉑的組合：最初腫瘤體積（TV)和評估治療效力的參數。治 療計畫：每週一次持續4週（每7天一次x4);每組8隻動物。 -57- 86932 200422050 指定評估τ/c的日子。 組別 最初TV平均 值(立方毫米） 最初TV範圍 (立方毫米） Τ/C(第 19天） T4T (天） gdf4 對照組(PBS) 183 79-268 100% 10.7 1.0 BIWI 1 200微克/公斤 DM1 237 113-382 59% 23.2 2.2 BIWI 1 300微克/公斤 DM1 178 113-268 27% 24.8 2.3 順氯氨舶4毫克/公斤 218 132-268 100% 11.3 1.1 BIWI 1 200微克/公斤 DM1+順氯氨鉑4毫克 /公斤 239 132-302 16% 42.7 4.0 BIWI 1 300微克/公斤 DM1+順氯氨鉑4毫克 /公斤 236 113-382 3% >72.3 >6.8 2.8.在人類乳癌模式的異種移植模式中，BIWI 1與阿黴素 或多舍他昔的組合治療 在人類乳癌異種移植的模式中，進行與在2.6下之概述類 似的實驗。使用以人類乳癌細胞株MDA-MB-453皮下異種移 植的裸鼠進行實驗。欲判定靜脈内給予、作為單一藥物之 BIWI 1的效力，以每週1次x4之計畫，測試不同的劑量含 量。欲評估與化學治療併用時可能的拮抗、加成或超加成 效果，將非-治癒劑量的BIWI 1與非-治癒劑量之不同細胞靜 止劑混合。藉著i)在一段時間内分析腫瘤體積，並ii)藉著腫 瘤達到某些尺寸的時間（腫瘤生長延遲），將這些組合的效果 與各自單一治療的效果相比較。 -58- 86932 200422050 根據指走之DΜ1濃度’以PB S稀釋一批BIWI 1 (蛋白質濃 度2-3毫克/毫升，DM1濃度30-50微克/毫升，33-37分子 DM 1 /分子Ab)。為每種應用製備新的稀釋物，或在整個治 療期間，將稀釋物儲存在+4°C下。根據Biwi 1的量，需要 將5 0 - 5 0 0微升的抗體落液注射到尾靜脈内。以每公斤體重 多少微克DM1 (微克/公斤DM1)，來表示bIWi 1的劑量含 量。以PBS稀釋阿黴素（阿黴素"Ebewe”®，2毫克/毫升），將 200微升具有不同濃度的溶液注射到尾靜脈内。以〇.9〇/。 NaCl稀釋多舍他昔（勉癌易®，Aventis，10毫克/毫升）。將2〇〇 微升具有不同濃度的溶液注射到尾靜脈内。至於組合治 療，在細胞靜止藥物之前大約4小時，注射biwi 1。 異種移植模式的操作與在2 · 1段中概述的稍有不同。簡言 之，將1 xlO7 個 MDA-MB-453 細胞（ATCC 第 HTB-131 號）注射 到雌性NMRI nu/nu老鼠的乳房脂肪塾内。在達到大約1 〇〇〇 立方毫米的體積之後切除腫瘤，切成4x4毫米的碎片，並進 一步皮下繼代。將腫瘤片段低溫保存在90% RPMI 1640/ 10%二甲亞砜中（慢慢地冷凍降至-80 °C，儲存在液態氮 中）。為了進一步繼代，使已經冷凍的腫瘤片段融解，以PBS 沖洗3次，並皮下植入4-5隻雌性NMRI nu/nu老鼠的右和左 腹側内。然後使用這些老鼠的腫瘤製備治療實驗用的動 物。切下直徑大約10毫米尺寸的腫瘤，切成2x2毫米的碎 片，並皮下植入6-8週齡雌性NMRI nu/nu老鼠的右腹侧内。 準備實驗所需大約2倍的動物。當腫瘤達到直徑5-10毫米的 尺寸時（在植入後10-14天），隨機分組動物並開始治療。動 -59- 86932 200422050 物係獲自 Harlan(Germany)或 M&B(Denmark)。按照在 2.7段 中描述的，記錄腫瘤的尺寸和體重。 在實驗性的實驗中，判定6毫克/公斤之劑量的阿黴素（每7 天一次x4)在該模式中是非-治癒的。因為以100微克/公斤 DM1的BIWI 1劑量，每7天一次x4,可能治癒4/6攜帶腫瘤的 動物，故在組合實驗中使用較低劑量的抗體共輛物（75和50 微克/公斤DM1)，確保僅以BIWI 1是非-治癒療法。將老鼠 隨機分成治療組，並在表4中出示評估治療效力的參數。對 照組，以及以50微克/公斤DM1之BIWI 1劑量或6毫克/公斤 阿黴素治療的動物，具有大約8天的T4T。在以75微克/公斤 DM 1之BIWI 1治療的組別中，觀察到13天的T4T。50微克/ 公斤DM1之劑量的BIWI 1與阿黴素的組合，顯示少量增加 超過各自之單一治療的效力（T4T:11天）。然而，當75微克/ 公斤DM1之BIWI 1與阿黴素混合時，Τ4Τ為43天，與各自之 單一治療相比較，顯示出超-加成的治療優點（5.3之GDF4與 沒有延遲的阿黴素治療，以及BIWI 1(75微克/公斤DM1)單 一治療之1.6的GDF4相比較）。在所有組別中均完全容忍治 療。只有在阿黴素單一治療組中的2隻動物，以及在75微克 /公斤DM1之混合組中的1隻動物，顯示出超過12%的暫時性 體重喪失。 表4 :在以MDA-MB-453腫瘤異種移植的裸鼠中，BIWI 1與 阿黴素的組合：最初腫瘤體積（TV)和評估治療效力的參數 (關於參數的定義，參見上文）。 治療計畫：每週一次持續4週（每7天一次x4);每組6隻動物。 -60- 86932 200422050 指定評估τ/c的日^ γ — 〇 組別 最初TV平均 值(立方毫米） 最初TV範圍 (立方毫米） Τ/C(第 13天） T4T (天） gdf4 對照組(PBS) 244 151-424 100% 8.0 1.0 BIWI 1 50微克/公斤 DM1 261 180-302 68% 8.0 1.0 BIWI1 75微克/公斤 DM1 272 205-382 59% 13.0 1.6 阿黴素6毫克/公斤 249 132-424 66% 7.8 1.0 BIWI 1 50微克/公斤 DM1+阿黴素6毫克/ 公斤 274 180-424 65% 10.7 1.3 BIWI 1 75微克/公斤 DM1+阿黴素6毫克/ 公斤 293 180-424 29% 42.6 5.3 在第2組實驗中，將先前已經判定之多舍他昔的非-治癒 劑量與BIWI 1混合。在表5中出示評估治療效力的參數。在 整個治療期間，可看到在對照組和以3毫克/公斤多舍他昔 處理的動物之間沒有差異（T4T 11-9天）。在另外兩個單一治 療（6毫克/公斤多舍他昔和BIWI 1)中，在治療期結束時可觀 察到中等的腫瘤生長延遲（T/C:75-71%，14天的T4T，與對 照組的11天T4T，相當於1.3之GDF4相比較）。相反的，兩種 組合治療與各自之單一治療相比較時，顯示出增加的腫瘤 生長延遲。BIWI 1與6毫克/公斤多舍他昔混合，具有37天的 T4T(T/C : 19%)，與單一治療的14天相比較。當3毫克/公斤 多舍他昔與BIWI 1混合時，可觀察到類似的效果（32天的 -61 - 86932 200422050 T4T，T/C:30°/〇)。在兩個混合實驗中，比較組合治療和單一 治療的生長延遲因數，暗示超加成效果。BIWI 1與6毫克/ 公斤多舍他昔混合，得到3.3的GDF4,與單一治療的1.3相比 較。在其他使用3毫克/公斤多舍他昔的組合組中（2.9之 GDF4)，多舍他昔的單一治療本身是無效的（GDF8:0.8)，而 僅以BIWI 1治療得到1.3之GDF4。在所有的組別中均完全容 忍治療。 表5 :在以MDA-MB-453腫瘤異種移植的裸鼠中，BIWI 1與 多舍他昔的組合：最初腫瘤體積（TV)和評估治療效力的參 數（關於參數的定義，參見上文）。 治療計畫：每週一次持續4週（每7天一次x4);每組8隻動物。 指定評估T/C的日ί —0 組別 最初TV平均 值(立方毫米） 最初TV範圍 (立方毫米） T/C(第 16天） T4T (天） gdf4 對照組(0.9%NaCl) 239 179-329 100% 11.0 1.0 BIWI 1 75微克/公斤 DM1 235 147-299 75% 14.1 1.3 多舍他昔6毫克/公斤 253 179-306 71% 13.9 1.3 多舍他昔3毫克/公斤 288 122-586 102% 9.0 0.8 BIWI 1 75微克/公斤 DM1+多舍他昔6毫克 /公斤 327 169-486 19% 36.8 3.3 BIWI 1 75微克/公斤 DM1+多舍他昔3毫克 /公斤 280 192-377 30% 31.7 2.9 2.9.在人類乳癌模式的異種移植模式中，BIWI 1與截瘤達 -62- 86932 200422050 的組合治療 在人類乳癌異種移植的模式中，進行與在2.6下之概述類 似的實驗，其中將BIWI 1治療與5’脫氧-5-氟尿嘧啶前藥截 瘤達0〇1〇(13@)混合。按照2.8段來操縱異種移植模式^4〇八-MB-453。 以PBS稀釋BIWI 1溶液（蛋白質濃度2.95毫克/毫升，53.6 微克DM1/毫升，3.7分子DM1/分子抗體），至75微克/公斤體 重的DM1濃度。在整個治療期間，將稀釋物儲存在+4°C下。 以25克老鼠200微升注射體積，將抗體溶液注射到尾靜脈 内。在沒有BIWI 1治療的對照組中，以PBS靜脈内注射動 物。以75微克DM1/公斤之劑量，每週一次將BIWI 1靜脈注 射到尾靜脈内，持續3週。在3週的期間内，每週連續5天， 以375或500毫克/公斤之劑量，胃内（藉著灌食針頭，作成在 水中的懸浮液）給予截瘤達（150毫克之錠劑，Roche)。 按照在2.8段中概述的，比較組合的效力和各別之單一治 療的那些。欲評估與截瘤達併用之BIWI 1的效力，在以 MDA-MB-453腫瘤異種移植的裸鼠中，測試作為單一製劑或 併用之兩種藥物的非-治疲劑量。在先前的實驗中，顯示7 5 微克/公斤DM 1的BIWI 1劑量是非-治癒的。至於截瘤達，判 定500和750毫克/公斤之劑量（每天一次x5，4個週期）是非-治癒的，而250毫克/公斤的劑量完全是無效的。 關於組合實驗，將75微克/公斤DM1的BIWI 1與375或500 毫克/公斤截瘤達混合。將老鼠隨機分成在表6中出示的治 療組。對照組具有大約10天的T4T。不同的單一治療，在腫 -63- 86932 200422050 瘤生長延遲上顯示出中等效力，BIWI 1具有2.6的生長延遲 因數（GDF4)，低劑量的截瘤達為1.3，而高劑量的截瘤達為 2.9。未看到完全的退化。當BIWI 1與375毫克/公斤或500毫 克/公斤截瘤達混合時，生長延遲因數分別增加至4.5和 5.3，且在第25天的T/C分別為4%和3%。在兩個組合組中， 可觀察到完全的退化。 表6 :在以MDA-MB-453腫瘤異種移植的裸鼠中，BIWI 1與 截瘤達的組合：最初腫瘤體積（TV)和評估治療效力的參數。 治療計畫： BIWI 1 :每週一次持續3週（每7天一次x3);截瘤達：每天一 次每週5次，持續3週（每天一次x5, 3個週期）。每組8隻動物。 在以375毫克/公斤截瘤達作為單一治療，以及與BIWI 1組合 的組別中，僅可評估7隻動物（死亡，與治療或腫瘤生長無 關）。指定評估T/C的日子。 組別 最初TV平均 值(立方毫米） 最初TV範圍 (立方毫米） T/C(第 25天） T4T (天） gdf4 對照組(pbs/h2o) 139 84-180 100% 10.3 1.0 BIWI 1 75微克/公斤 DM1 132 58-212 31% 26.9 2.6 截瘤達500毫克/公斤 130 78-173 23% 30.0 2.9 截瘤達375毫克/公斤 130 82-227 58% 13.8 1.3 BIWI 1 75微克/公斤 DM1+截瘤達500毫克 /公斤 141 89-204 3% 54.7 5.3 -64- 86932 200422050 BIWI 1 75微克/公斤 133 DM1+截瘤達375毫克 /公斤 80-233 4% 46.2 4.5 母週1次持續3週給予75微克/公斤DM1之BIWI卜與每週5 次持續3週給予375或500毫克/公斤截瘤達的組合，在與各自 之單一治療的那些比較腫瘤尺寸時，顯示從第7天起，明顯 地增加了治療效力。腫瘤生長延遲因數的比較，代表在該 組合設定中之BIWI 1與截瘤達的協同效果。完全容忍所有 的治療，沒有任何明顯喪失體重的動物。 2· 10·在人類乳癌模式的異種移植模式中，biwi 1與紫杉醇 和阿黴素的組合治療 在人類乳癌異種移植的模式中，進行與在2·6下之概述類 似的實驗，其中將BIWI 1治療與紫杉烷紫杉醇或氨茴環黴 素阿黴素混合。在連續5天中，將50微克DM1/公斤/天或1〇〇 微克DM 1/公斤/天劑量的BIWI 1靜脈内注射治尾靜脈内。靜 脈内給予20或10毫克/公斤紫杉醇（太平洋紫杉醇，僅在治 療期間的第1天，在每個案例中在BIWI 1治療之後4小時給 予6或4毫克/公斤阿黴素（亞德里亞黴素。在帶有體積約 100立方毫米之乳癌異種移植物的老鼠中，1〇〇微克DM1/公 斤之劑量含量的BIWI 1單一治療是有效的，在所有腫瘤中 (12/12)顯示出完全退化。50微克DM 1/公斤的劑量含量，結 果產生2/12的完全腫瘤退化。當將50微克DM1/公斤的BIWI 1與20或10毫克/公斤紫杉醇混合時，與各自之單一治療 (BIWI 1之T/C 19%，20毫克紫杉醇/公斤為13%，且1〇毫克 -65- 86932 紫杉醇/公斤為50%)相比較，觀察到治療效力的明顯增加 (&療組對對照組的中間相對腫瘤體積=T/c，2〇毫克紫私醇 /公斤為0%，1〇毫克紫杉醇/公斤為9%)。完全容忍所有的治 療，沒有任何明顯喪失體重的動物。利用較高劑量含量的 阿黴素，觀察到類似的結果，雖然多少與較高的毒性有關。 【圖式簡單說明】 圖1 · BIWI 1在活體外的細胞毒性。使用抗原_陽性細胞 株A431和FaDu，以及抗原-陰性細胞株A549。 圖2 : BIWI 1治療在以A431腫瘤異種移植之裸鼠上的效 力。出示每組的平均腫瘤體積和標準差，指出治療組。箭 頭指出治療的起點（第丨天）。 圖3 : BIWI 1治療在以FaDu腫瘤異種移植之裸鼠上的效 力。出示每組的平均腫瘤體積和標準差，指出治療組。箭 頭指出治療的起點（第1天）。 圖4 : BIWI 1治療在以MDA-MB 453腫瘤異種移植之裸鼠 上的效力。出示每組的平均腫瘤體積和標準差，指出治療 組。箭頭指出治療的日子。 圖5 : BIWI 1治療的耐受性。出示在2種調查模式中所有 治療組的平均體重變化。第1天：開始治療。 圖6 : BIWI 1與紫杉醇之組合治療在以FaDu腫瘤異種移植 之裸鼠上的效力。出示每組的平均腫瘤體積和標準差。 圖7: BIWI 1與紫杉醇之組合治療在以FaDu腫瘤異種移植 之裸鼠上的效力。出示每組的個別腫瘤體積。 圖8 : BIWI 1與紫杉醇之組合治療在以FaDu腫瘤異種移植 86932 -66- 200422050 之裸鼠上的效力。出示所有治療組的平均體重變化。 天··開始治療。 67- 86932 200422050 序列一覽表 < 110> Boehringer Ingelheim International GmBH <120〉細胞毒性CD44抗體免疫共輛物 <130〉 <140〉 092122891 <141〉2003-08-20 <150〉02018686.2 <151〉2002-08-21 <160〉7 <170> Patentln Ver. 2.1 <210〉 1 <211> 42 <212>蛋白質 <213〉人類 <223>人造序列的說明：人類CD44表現序列v6序列識別1號 <400> 1

Gin Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gin Lys Glu 15 10 I5

Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr Pro Arg 20 25 30

Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala 35 40 <210> 2 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人類 <223>人造序列的說明：序列識別2號 ' <400> 2

Gin Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gin Thr 15 l〇 <21〇> 3 <211> 11 <212>蛋白質 <213>人類 <223>人造序列的說明··序列識別3號 <400> 3

Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg 15 l〇 <210> 4 86932 200422050 <211> 213 <212> 蛋白質 <213>人造的序列 5 <220> <223>人造序列6々說?月 '人辦彳匕的考鼠抗體βγ\^Α4輕鍵序列識別4號 10 15 20 <400> 4 Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser 工le Asn Tyr lie 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 25 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 30

Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 115

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 35 130 135

Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu 75 80

Leu Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 90 95

Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 105 110

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 120 125

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160 40 45 50

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 5 <211> 702 55 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：人類化的老鼠抗體BIWA4輕鏈序列識別5號 86932 200422050 <400> 5 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctgctct ggctcccaga taccaccgga 60 5 gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 120 ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggtaccagca gaagccagga 180 caggctecta gactcttgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 240 ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 300 gattttgccg tttattactg cctgcagtgg agtagtaacc cgctcacatt cggtggtggg 360 10 accaaggtgg agattaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgageagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 15 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ga 702 <210> 6 <211> 444 20 <212> 蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明：人類化的老鼠抗體BIWA4重鏈序列識別6號 <400> 6

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 35 40 45

Ser Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser lie 50 55 60 40 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 45

Ala Arg Gin Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 50 115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 55 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu 165 170 175 86932 200422050

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190 5 Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220 10

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 15 245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 20 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285

Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 25

Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 工le Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 30 325 330 335

Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 35 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 370 375 380 40

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 45 405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 50 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 7 55 <211> 1392

<212> DNA <213>人造的序列 <220> -4-

86932 200422050 <223>人造序列的說明：人類化的老鼠抗體BIWA4重鏈序列識別7號 <400> 7 5 atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct aagactctcc 120 tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tatgacatgt cttgggttcg ccaggctccg 180 gggaaggggc tggagtgggt ctcaaccatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcta 240 gacagtataa agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaactc cctgtacctg 300 10 caaatgaaca gtctgagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcaag acaggggttg 360 gactactggg gtcgaggaac cttagtcacc gtctcctcag ctagcaccaa gggcccatcg 420 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480 ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 540 agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 600 15 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 660 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 720 acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 780 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 840 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900 20 cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 960 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1020 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080 25 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1140 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1200 gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 30 1260 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1320 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1380 35 ccgggtaaat ga 1392 40 45 <210> 8 <211> 213 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>人造序列的說明··人類化的老鼠抗體8_8輕鏈序列識別8號 50 <400> 8

Glu lie Val Leu 1

Glu Arg Ala Thr 20

Tyr Trp Leu Gin 35

Leu Thr Ser Asn

Thr Gin Ser Pro 5

Leu Ser Cys Ser

Gin Lys Pro Gly 40

Leu Ala Ser Gly

Ala Thr Leu Ser 10

Ala Ser Ser Ser 25

Gin Ala Pro Arg Val Pro Ala Arg

Leu Ser Pro Gly 15 工le Asn Tyr lie 30 工le Leu lie Tyr 45

Phe Ser Gly Ser 86932 55 200422050 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 5

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 10 100 105 110

Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 15 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140

Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160 20

Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 25 180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 30 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 9 35 <211> 702 <212> DNA <213>人造的序列 <220> 40 <223>人造序列的說明：人類化的老鼠抗體BIWA8輕鏈序列識別9號 <400> 9 atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctgctct ggctcccaga taccaccgga 60 45 gaaattgttc tcacccagtc tccagcaacc ctgtctctgt ctccagggga gagggccacc 120 ctgtcctgca gtgccagctc aagtataaat tacatatact ggctccagca gaagccagga 180 caggctecta gaatettgat ttatctcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgcgcgc 240 ttcagtggca gtgggtctgg aaccgacttc actctcacaa tcagcagcct ggagcctgaa 300 gattttgccg tttattactg cctgcagtgg agtagtaacc cgctcacatt cggtggtggg 360 50 accaaggtgg agattaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420 gatgageagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480 agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540 agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660 55 agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ga 702 -6- 86932

Claims (1)

1. 200422050 拾、申請專利範園： 1. 一種式A(LB)n之化合物在製備治療癌症之醫藥組合物上 的用途， 其中 A為抗體分子，其對CD44是專一的； L為交聯劑部分； B為對細胞有毒性的化合物；且 η為十進位數，n=l至10 其中使用該化合物，或與化學治療劑併用。 _ 2 ·根據申請專利範圍第1項之用途，其中該交聯劑部分具有 能夠在細胞内被切開的化學鍵結。 3·根據申請專利範圍第2項之用途，其中該化學键結為二硫 鍵。 4.根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗 體分子對人類CD44之表現序列v6是專一的。 5·根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗 _ 體分子是對胺基酸序列序列識別3號内之抗原決定位專 一白勺。 6 ·根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗 體分子是單株抗體VFF-18(DSM ACC2174)，或具有 VFF-18之互補性決定區（Cdrs)的重組抗體。 7·根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該抗 體分子包括具有胺基酸序列序列識別4號或序列識別8號 的輕鏈，以及具有胺基酸序列序列識別6號的重鏈。 86932 200422050 8·根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途’其中讀毒 性化合物Β是類美登素。 9·根據申請專利範圍第8項之用途，其中該類美登素具有下 式

   (式（II)) 其中 I代表Η或SR4，其中R4代表甲基、乙基、直線的烷基、 分支的烷基、環狀的烷基、單純或經取代的芳基或雜芳 基； R2代表C1或Η ; h代表Η或CH3 ;且 m代表1、2或3。 10·根據申請專利範圍第9項之用途，其中1為η或CH3，R2 為 Cl，R3為 CH3，且 m=2。 U·根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該化 86932 2〇〇422〇5〇 合物A(LB)n為下式

   ㈧ 其中 A為抗體分子，其對CD44是專一的， (L1)為任意的交聯劑部分 P為十進位數，ρ= 1至1 〇。 19 ^ , β途，其中P為3 2.根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用 至4 〇 13·根據申請專利範圍第1至3項中任一項之用途，其中該化 學治療劑是微管蛋白結合劑。 14·根據申請專利範圍第13項之用途，其中該化學治療劑是 微管穩定劑。 15·根據申請專利範圍第14項之用途，其中該化學治療劑是 紫杉烷或艾普西隆。 16·根據申請專利範圍第項之用途，其中該化學治療劑是 86932 200422050 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 紫杉醇、多舍他昔、rPR-116258A、艾普西隆a、B、c、 D、E或 F，BMS-247550或 BMS-310705。 根據申請專利範圍第13項之用途，其中該化學治療劑是 使微管不穩定劑。 根據申請專利範圍第17項之用途，其中該化學治療既是 長春花生物鹼。 根據申請專利範圍第18項之用途，其中該化學治療劑是 長春花鹼、長春新鹼、長春氟寧、長春地辛、去甲長春 花驗或長春瑞賓。 一種CD44v6專一性抗體分子與類美登素的共軛物之用 途’其作用於製造治療癌症之醫藥組合物，其中使用該 共輛物或與化學治療劑併用。 根據申請專利範圍第20項之用途，其中該抗體分子是對 胺基酸序列序列識別3號内之抗原決定位專一的。 根據申請專利範圍第21項之用途，其中該抗體分子是單 株柷體VFF_18(DSM ACC2174)，或具有VFF-18之互補性 決定區（CDRs)的重組抗體。 根據申請專利範圍第20至22項中任一項之用途，其中該 抗體分子包括具有胺基酸序列序列識別4號或序列識別8 號的輕鏈，以及具有胺基酸序列序列識別6號的重鏈。 根據申請專利範圍第2〇至22項中任一項之用途，其中該 類美登素是藉著二硫部分與抗體分子連接。 根據申請專利範圍第20至22項中任一項之用途’其中該 類美登素具有下式 86932 200422050

   〇 式（ιν)。 26. —種CD44v6專一性抗體分子與類美登素的共輛物之用 途，其係用於製造治療癌症之醫藥品，其中使用該化合 物或與化學治療劑併用，且其中該抗體包括具有胺基酸 序列序列識別4號之輕鏈，和具有胺基酸序列序列識別6 號之重鏈，且其中該類美登素具有下式 86932 3 Η c

   ώ (式 IV) 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 並經由二硫鍵與抗體連接。 根據申請專利範圍第20至22和26項中任一項之用途’其中 使一或多個類美登素殘基與抗體分子連接。 根據申請專利範圍第27項之用途，其中使3至4個類美登 素殘基與抗體分子連接。 根據申請專利範圍第20至22和26項中任一項之用途，其中 該類美登素經由 _S_CH2CH2-CO-、-S_CH2CH2CH2CH2-CO- 或-S_CH(CH3)CH2CH2-CO-基團與抗體分子結合。 根據申請專利範圍第2〇至22和26項中任一項之用途，其中 該化學治療劑是微管蛋白結合劑。 根據申請專利範圍第30項之用途，其中該化學治療劑是 微管穩定劑。 根據申請專利範圍第31項之用途，其中該化學治療劑是 紫杉烷或艾普西隆。 根據申請專利範圍第32項之用途，其中該化學治療劑是 紫杉醇、多舍他昔、RpR_ll6258A、BMS-247550、 BMS-310705 或艾普西隆a、b、C、D、E或 F。 根據申請專利範圍第30項之用途，其中該化學治療劑是 使微管不穩定劑。 根據申請專利範圍第34項之用途，其中該化學治療劑是 長春花生物驗。 根據申請專利範圍第3 5项之用途，其中該化學治療劑是 長春花鹼、長春新鹼、長春地辛、長春氟寧、去甲長春 花驗或長春瑞賓。 86932 37. ^據申請專利範圍第⑴、20至22和26項中任一項之用 途’其中該癌症為頭和頸部的鱗狀細胞癌、食道鱗狀細 癌肺臟鱗狀細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、子宮頸鱗狀 細胞癌、乳房腺癌、肺臟腺癌、胰臟腺癌、結腸腺癌或 胃腺癌。 38·根據申請專利範圍第1至3、20至22和26項中任一項之用 途，其中在分開的醫藥組合物中，調配該化合物A(LB)n 或共軛物，以及該化學治療劑。 39·根據申請專利範圍第2〇至22和26項中任一項之用 途，其中在單一的醫藥組合物中，調配該化合物A(LB)n 或共軛物，以及該化學治療劑。 40. —種在需要其之患者中治療癌症的醫藥組合物，包括在 治療上有效含量的如在申請專利範圍第1至3項中任一項 中定義之化合物A(LB)n，或如在申請專利範圍第2〇至22 和26項中定義之共軛物，以及為微管蛋白結合劑之化學 治療劑混合。 41_根據申請專利範圍第40項之醫藥組合物，其中該癌症為 頭和頸部的鱗狀細胞癌、食道鱗狀細胞癌、肺臟鱗狀細 胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、子宮頸鱗狀細胞癌、乳房腺癌、 肺臟腺癌、胰臟腺癌、結腸腺癌或胃腺癌。 42·根據申請專利範圍第40項之醫藥組合物，其中投予化合 物八(1^)11或共軛物，以及化學治療劑，作為單一醫藥組 合物的組份。 43.根據申請專利範圍第40項之醫藥組合物，更進一步包括 86932 200422050 一或多個在藥學上可接受的載劑（們）、稀釋劑（們）或賦形 劑（們）。 44· 一種套組，包括在分開的醫藥組合物中，如在申請專利 範圍第1至3項中任一項中定義之化合物A(LB)n，或如在申 請專利範圍第20至22和26項中任一項中定義之共軛物，以 及為微管蛋白結合劑之化學治療劑混合。 45· —種化學治療劑在製備用來治療癌症之醫藥組合物上的 用途’其中使用该化學治療劑，或與如在申請專利範固 第1至3項中任一項中定義之式A(LB)n化合物併用。 46. —種化學治療劑在製備用來治療癌症之醫藥組合物上的 用途，其中使用该化學治療劑，或與如在申請專利範園 第20至22和26項中任一項中定義之共軛物併用。 47·根據申請專利範圍第45項之用途，其中該化學治療劑為 紫杉坑、艾普西隆、長春花生物驗、鉑化合物、喜樹驗、 念珠環藻肽、多拉斯塔汀、5,6-二氫啕哚并[2，l-a]異喳啉 衍生物、海綿素、表鬼臼毒素、烷基化試劑、嘌呤拮抗 劑、嘧啶拮抗劑或DNA嵌入物。 48·根據申請專利範圍第47項之用途，其中該化學治療劑為 多舍他昔、紫杉醇、RPR_n6258A、艾普西隆a、B、C、 D、E或F、BMS-247550、BMS-310705、長春花鹼、長春 地辛、長春新鹼、長春瑞賓、長春氟寧、去甲長春花鹼、 康柏塔斯汀A4-磷酸酯、羥苯斯塔汀、AVE 8062、海绵素 1、2、3、4、5、0、7、8或9、丑_7〇1〇、多拉斯塔汀、西 馬多丁鹽酸鹽、米佛布林羥乙磺酸鹽、念珠環藻肽、喜 86932 200422050 卡 特肯、伊利替康、胺基喜樹驗、順氯氨銷、 、奥沙利鉑、*丙鉑、奥馬鉑、特崔鉑、依托泊苷、 替尼泊苷、阿黴素、道諾紅菌素、放線菌素D、普卡黴素、 絲裂徽素、博菜黴素、伊達比星、環磷醯胺、氮芥、苯 丙胺酸氮芥、苯丁酸氮芥、丙卡巴胼、甲嗪咪唑胺、六 甲蜜胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、胺甲碟呤、 巯基嘌呤、硫代鳥嘌呤、氟達拉濱磷酸鹽、克拉君賓、 喷司他丁、氟尿嘧啶、截瘤達、阿糖胞苷或阿扎胞苷。 9- 86932