TARIFNAME AKIM SITOMETRIK IMMÜNOFENOTIPLEMEYE YÖNELIK YÖNTEMLER, REAKTIFLER VE KITLER Bulus, akis sitometrisi alani ile ve özellikle floresan bilesiklere konjuge edilmis antikor reaktiflerinin bir paneli ile ilgilidir. Bunlar, periferal kan (PB), keinik iligi (BM), plevral effuzyonlar, assit, beyin-omurilik sivisi (CSF), cainsi cisim, eklem sivisi, bronkoalveoler lavaj, ürin, dalak, karaciger, lenf dügümü ve diger doku numunelerindeki normal, reaktif, yenileyici ve neoplastik hücrelerin immünofenotipik karakterizasyonunda kullanim imkani bulurlar. Normal, reaktif, yenileyici ve köyü huylu hücrelerin (özellikle lökositler) akis sitometrik immünofenotiplemesi, halihazirda, immünoloji, hematoloji ve onkoloji de dahil tipta birçok uygulamaya yönelik olarak kullanilir. Digerlerinin yani sira, söz konusu uygulamalar, bagisiklik sisteminin izlenmesini; primer immün yetmezliklerin tanisini ve siniflandirilmasini; lösemilerin, lenfomalarin ve plazma hücresi diskrazilerinin immünofenotiplemesini; tedavi etkinligine yönelik bir ölçü olarak kötü huylu lökositlerin düsük sikliklarinin izlenmesini; paroksimal noktümal hemoglobirüni (PNH) ve mastositoz gibi klonal hastaliklarin tanisini ve izlenmesi; kök hücre transplantasyonundan veya gen terapisinden (hedef olarak heinatopoietik prekürsör hücreler kullanilarak) farkli klinik kosullarinda, örnegin, saglikli bireylerdeki hematopoiezin veya lenfopoiezin degerlendirilmesini ve terapötik amaçlara yönelik olarak kullanilacak hücre ürünlerinin bilesiminin ve kalitesinin degerlendirilmesini içerir. Akis sitometrik immünofenotiplemedeki klasik tani prosesi tipik olarak, antikor panellerinin kullanimina dayanir. Simdiki durumda, farkli, antikor örtüsme panelleri, spesifik uygulamalar için önerilir. Bu tür paneller, tibbi bir belirti (örnegin, sitopeninin görüntülenmesi, lenfositozun karakterizasyonu), hastalik ( örnegin, akut lösemi tanisi, lenfoma tanisi) veya hastalik duruinu (örnegin, ALLinin tani siniflandirmasina karsi tedavi etkinliginin degerlendirilmesine yönelik ALL,nin izlenmesi) ile yönlendirilir. Tavsiye edilen antikor panellerinin örnekleri, Avrupa Lösemi Agi (ELN) (l), heinatolojik malignitelerin farkli alt türlerine yönelik 2006 Bethesda Uluslararasi Konsensus (2) panelleri, soyun tayin edilmesine ve akut lösemilerin alt siniflandirmasina yönelik EGIL panelleri (3), plazma hücre diskrazilerinin tanisina, siniflandirmasina ve izlenmesine yönelik Avrupa Miyelom Agi (EMN) panelleri (4), diger kronik lenfoproliferatif bozukluklara karsi kronik lenfotik lösemi ve saçakli hücre lösemisinin immünofenotipik alt siniflamasina yönelik ERIC (5) ve Matutes (6) skor panelleridir. Önerilen bu antikor panelleri çogunlukla, farkli ülkeler ve çalisma gruplari arasinda benzerdirler, ancak hiçbir zaman tamamen ayni degillerdir. Önemli olarak, antikorlarin, spesifik tloresans bilesikleri ile konjuge edilmis antikor reaktiflerinin bir paneline tercihen nasil kombine edilmesi gerektigine iliskin çesitli aglar ve çalisma gruplari ile herhangi bir bilgi saglanmamistir veya sinirli bilgi saglanmistir. Tani laboratuvarlari, ayri olarak ölçülebilen Iloresans emisyonlarina sahip farkli floresan boyalar ile konjuge edilmis 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 veya daha fazla antikor ile bir numune alikotunu es zamanli olarak boyadiginda dahi antikorlarin sadece basit listeleri sunulmustur. Dünya genelinde merkezler arasindaki varyasyonlar, asagidakileri kullanimi nedeniyledir: - Antikorlarin ve antikor klonlarinin benzer ancak ayni olmayan listeleri; - Farkli duyarliliklar gösteren farkli florokromlar ayni antikorlar ile konjuge edilir. Örnegin, bir antikor reaktifî, antikorun düsük duyarlilikli bir florokrom ile kombine edilmesi halinde bir negatif` sonuç saglayabilirken, farkli, daha duyarli bir florokrom ile kombine edilmis ayni antikordan olusan bir antikor reaktifinin ayni hücreleri boyamak üzere kullanilmasi durumunda, bir pozitif sonuç elde edilebilir. - Antikor reaktiflerinin farkli kombinasyonlarinin es zamanli olarak degerlendirilmesi. - Akut miyeloplastik lösemilerdeki CD45 kapilama gibi, ilgili hücre popülasyonunun (popülasyonlarinin) tanimlanmasina yönelik degisken ve genellikle teresiz ve uygun olmayan stratejiler. Sonuç olarak, görünürde benzer antikor panelleri, klinik numunelerin benzer tanilarini ortaya çikarmazlar. Aslinda, tani laboratuvarlari arasindaki yeniden üretilebilirlik, %70,ten fazla degildir. Maalesef, normal ve kötü huylu hücreler arasindaki uygun olmayan ayrim nedeniyle tani yapilamaz veya yenileyici kemik iligi, akut löseminin tekrarlamasi seklinde hatali olarak tani konur. US Patent No. 5,047,32l'de Loken ve Terstappen, PB ve BM,deki hücresel bilesenlerin çok parametreli analizine yönelik bir prosedür açiklamistir. Açiklanan prosedür ile, bu bulusçular, PB ve BM,nin birkaç hücresel bilesenini ayirt edebilmisler, her bir bilesendeki hücre sayisini hesaplayabilmisler ve bunlardan her birinin, LDS- DNA-boyasi, tiyazol turuncusu (TO, Molecular Probes, Inc) RNA-boyasi, Iloresans olarak isaretli anti-CD45 monoklonal antikor, ileri isik dagilimi (FSC) ve yanlamasina isik dagiliminin (SSC) kombine kullanima dayanan bir diferansiyel analizini saglayabilmislerdir. Bu yaklasim, çekirdekli kirmizi hücrelerin, eritrositlerin, retikulositlerin, plateletlerin, lenfositlerin, monositlerin, nötrofilik granülositlerin, bazofilik granülositlerin, eozinofilik granülositlerin ve çekirdekli hematopoietik hücrelerin tamaminin prekürsörlerinin spesifik tanimlanmasina imkan saglamistir. Ancak açiklanan multi parametre analizi, ayni numunede bir arada bulunan normal, reaktif, yenileyici ve neoplastik hücreler arasinda spesifik olarak farklilasamaz, ayrica bu prosedür hücrelerin bu gruplarini karakterize edemez. Bu patentin baska bir gelismesi, daha sonra Terstappen ve Chen tarafindan U.S. Patent No 6,287,791 ,de açiklanmistir, ancak lökositlerin farkli popülasyonlarinin karakterize edilmesinde herhangi bir gelisme göstermemistirler. Son zamanlarda, Orfao et al., US. Patent No. 7,332,2953te, çekirdekli kirinizi hücrelere, lenfositlere, monositlere, nötrofilik granülositlere, bazofilik granülositlere, eozinofilik granülositlere ve çekirdekli hücrelerin tamaminin hematopoietik prekürsörlerine ek olarak, dendritik hücrelerin ve bunlarin alt kümelerinin tanimlanmasina spesifik olarak imkan saglayan, PB, BM ve diger vücut sivilarinin çok boyutlu lökosit diferansiyel analizine yönelik bir prosedür açiklamistir. Bununla birlikte U.S. Patent No 5,538,855, Orfao et alfte Orfao et al., PB, BM ve lenf dügüinü numunelerindeki T, B ve NK-hücrelerinin 123ye kadar farkli alt türlerinin es zamanli tanimlanmasi yoluyla lenfoid kompartmanlarinin daha detayli bir analizine imkan saglayan bir prosedürü açiklamistir. Patentte, Orfao et al., bir 3-renkli tek boyamadaki CD3, CDl9, CD56 (ve/veya CD16), CD4 ve CD8 antijenlerine yönelik bir kombine boyama kullanmistir, burada ayni florokroma konjuge edilmis monoklonal antikor çiftleri kullanilmistir. Ancak, bu yaklasim araciligiyla, normal ve neoplastik hücreleri ayirt edememisler ve tanimlanan hücre alt kümelerini de karakterize edememislerdir; bununla birlikte, normal PB, BM veya diger dokularda ve vücut sivilarinda bulunan lenfoid ve lenfoid olmayan hücrelerin (örnegin, TCRyö+ T- hücreleri) ilgili bazi alt kümeleri spesifik olarak saptanamamistir. Bahsi geçen prosedürlerin hiçbirisi, normal, reaktif, yenileyici ve neoplastik/klonal hücre popülasyonlarinin ayrimi da dâhil, tanimlanan hücrelerin daha detayli karakterizasyonuna direkt olarak imkân saglamamistir. Bu tür bir karakterizasyon ve ayrim, daha fazla sayida fark edilebilir floresans emisyonlari ile baglantili boyalarin ve daha yüksek sayida farkli floresans emisyonlarini ölçebilen akis sitornetresi araçlarinin kullanimini gerektirir. Baska birçok yayin, spesifik immünofenotipik profillere dayanilarak, normal hücrelerin, neoplastik benzerlerinden ayrilabileceklerini ve ayrim kapasitelerinin (nonnali klonal/kötü huylu hücrelerden ayirmaya yönelik duyarlilik), ayni numuneyi boyamak üzere kullanilan florokom-konjuge antikor reaktiflerinin sayisi ile arttigini gösterir. Bazi raporlar ayrica, BM yenilenmesi sirasinda olgunlasan hücrelerin yani sira normal ve reaktif hücrelerin, ayri iminünofenotipik profiller gösterebileceklerini, ancak bu hücrelerin belirgin bir biçimde kötü huylu hücrelerden ayrilamayacaklarini gösterir. Önemli olarak, Bu dogrultuda önerilen antikor kombinasyonlarinin panelleri, normal, reaktif, yenileyici hücre popülasyonlari ile neoplastik benzerlerini sistematik bir sekilde etkili olarak ayiramazlar, fakat ayni zamanda, kötü huylu hücrelerin genisletilmis bir immünofenotipik karakterizasyonu yoluyla farkli tanisal hastalik kategorileri arasinda belirgin bir ayirmaya imkan saglayabilir. Tani laboratuvarlarinda yeni nesil çok lazerli akis sitometrelerinin uygulanmasi ile, ayni antikor listeleriyle dahi farkli paneller olusturmaya yönelik potansiyel alan, daha fazla sayida farkli Iloresan bilesiklerinin kullanilmasi ve es zamanli olarak tek hücrelerde daha fazla sayida Iloresans emisyonunun ölçülmesi olasiligi nedeniyle katlanarak artmaktadir. U.S. Patent No. 7,321,843"te, Orfao, Pedreira ve Sobral da Costa, matematiksel hesaplamam prosedürlerine (örnegin, en yakin komsu prensibi) dayanan yeni bir yaklasim sunar, burada sinirsiz sayida parametreye iliskin olarak ölçülmüs her bir hücreye yönelik bilgiyi içeren akis Sitometresi liste modu veri dosyalari, farkli, kismen örtüsmeli monoklonal antikorlarin kombinasyonlari ile boyanan bir numunenin birkaç alikotunun bir akis sitoinetresinde ölçülmesinden sonra olusturulabilmistir. Bu prosedürün kullanilmasi sadece en son akis sitometresinin artirilmis çok renkli kapasiteleri ile maksimize edilebilir. Bunun nedeni, bu prosedürlerin, bilinen omurga markörlerinin, bir paneldeki monoklonal antikorlarin her bir kombinasyonuna yönelik olarak degisebilen diger ek inarkörler ile kombine edildigi, monoklonal antikor reaktiflerin kombinasyonlarina ait etkili panellerinin tasarimlarini gerektirmesidir. Buna paralel olarak, ayni yazarlar ayrica (U.S. Patent No. 7,507,548), örnegin, neoplastik hücrelere karsi normalin dogrudan karsilastirmasina imkan saglayacak bir referans veri dosyasina karsi bir vakadan akis sitoinetri verilerinin karsilastirilmasina yönelik bir prosedür açiklamistir. Ancak, her iki patentte de, yazarlar, lösemi, lenfoma ve plazma hücresi diskrazisinin tanisina/siniflandirmasina, evrelemesine ve/Veya izlemesine tam ve sistematik olarak uygulanabilen bir kapsamli antikor paneli sunamainislardir. Bu nedenle, mevcut protokoller, bir panelde büyük ölçüde önerilen monoklonal antikorlarin spesifik olarak nasil kombine edilecegini Ögretmez; bir miniinal hastaligin tani siniflandirmasina ve izlenmesine yönelik farkli paneller sunarlar; büyük ölçüde test edildiklerinde sinirli bir etkinlik gösterirler; tek bir numuneden birkaç alikota yönelik olarak ölçülmüs bilginin direkt kombinasyonuna yönelik bir yol saglamazlar; ve/veya kronik T ve NK lenfoproliferatif bozukluklar (örnegin, daha genis granüler lenfotik löseminin diferansiyel tanilarinda) gibi spesifik hastaliklarda, immünofenotipik özelliklerine göre klonal/neoplastik hücrelere karsi normal/reaktifleri sistemik olarak ayirmada basarisiz olmuslardir. Mevcut bulusçular bu zorluklari fark etmistirler ve sonuçlarin yanlis yorumlanmasini ve asiri yorumlanmasini önleyen gelismis, iyi tanimlanmis antikor panelleri ortaya koymuslardir. Ilgili markörlerin dikkatli bir sekilde seçilmesinden, çok renkli tüplerdeki uygun antikor kombinasyonlarinin tasarimindan ve uygun florokromlarin seçilmesinden (parlaklik, dengeleme, stabilite ihtiyaçlarina göre) sonra, antikor reaktiflerinin bir alt kümesi gelistirilmistir. Çalismalar, bir optimal etkinlige ulasmak ve bunu yeniden biçimlendirmek amaciyla, uzlasma panellerinin kapsamli çok merkezli bir degerlendirmesi ile tamamlanmistir. Bu dogrultuda bulus, bir düzenlemede, ilgili bir lökosit popülasyonunun tanimlanmasina yönelik en az üç tanimlama antikorunun ve söz konusu lökosit popülasyonunun karakterizasyona ve/veya siniflandirmasina yönelik en az dört karakterizasyon antikorunun bir kümesini içeren en az sekiz ayri florokom- konjuge antikorlari içeren lökositlerin akis sitometrik immünofenotiplemesine yönelik bir reaktif bilesim saglar. Burada saglanan bir reaktif bilesimi, asagidaki markör kombinasyonlarina karsi yönlendirilmis antikorlarin bir panelini içerir: bilesimi). sitometrik fenotipleineye yönelik reaktifler ile ilgilidir. On markörden olusan bir DR), akut löseminin degerlendirilmesine yönelik olarak gerekli oldugu ögretilir. Ilave markörler eklenebilir. Bununla birlikte, Braylan et al., mevcut bulusa ait belirli markör kombinasyonlarina karsi antikorlari içeren tekli bir reaktif kompozisyonunu açiklamakta basarisiz olur. Mevcut bulusun tercih edilen bir düzenleinesinde bilesim, monoklonal antikorlar içerir. CD, yigin adlandirmasini temsil eder ve monoklonal antikorlar tarafindan tanimlanan spesifik hücre yüzeyi antijenlerinin tanimlanmasina yönelik bir nomenklatürdür. Kullanilan kisaltmalar su sekildedir: cngK = sitoplazmik IgG kappa zinciri; cngÄ = sitoplazmik IgG lambda zinciri; ß2micr0 =ß2mikr0globulin; cyMPO = sitoplazmik nayeloperoksidaz. Belirtilen markörlere karsi (Monoklonal) antikorlar, Becton/Dickinson (BD) Biosciences, Dako, Beckman Coulter, CYTOGNOS, Caltag, Pharrningen, Exbio, Sanquin, Invitrogen ve benzerleri de dahil, çesitli firmalardan ticari olarak elde edilebilirler. Antikorlari konjuge etmeye yönelik uygun florokromlar teknikte bilinirler. Anlasilacagi üzere, bir reaktif bilesiminin içerisine kullanilan florokromlar akis sitometrisi ile ayirt edilebilirler. Florokromlar tercihen, parlaklik, sinirli spektral örtüsme ve sinirli dengeleme, stabilite, vs. ihtiyacina yönelik olarak tercih edilirler. Florokromlarin asagidaki paneli, bulusa göre bir reaktif bilesiminde özel bir kullanima sahiptir: (1) pasifik mavisi (PacB) veya Horizon V450, (2) pasifik turuncusu (PacO) veya AMCA, (3) floresin izotiyosiyanat (FITC) veya Alexa 488, (4) fikoeritrin (PE), (5) peridinin klorofil protein/siyanin , PerCP veya PE-Teksas Kirmizisi, (6) fikoeritrin/siyanin 7 (PE-Cy7), (7) allofikosiyanin (APC) veya Alexa , APC-Cy7, Alexa680 veya Alexa700. Birçok test diliminden sonra, mevcut bulusçular, asagidaki florokromlarin seçilmesi halinde çok iyi sonuçlarin elde edilebildigini gözlemlemistir: Pasifik Mavisi veya Horizon V450, Pasifik Turuncusu, floresin izotiyosiyanat (FlTC), fikoeritrin (PE), peridinin klorofil protein/siyanin ve APC-H7. Reaktif bilesimi, Örnegin, bir lenfoid hastaliginin görüntülenmesine yönelik olarak bu sekilde kullanilabilir. Çesitli reaktif bilesimlerin örnek uygulamalarinin bir sematik genel bakisi için bakiniz Sekil 2. Bulus bu nedenle ayrica, bir veya daha fazla reaktif bilesimi içeren tani kitleri ile ilgilidir. Ancak bilesimler ayrica, bir veya daha fazla baska reaktif bilesimi, özellikle hastaligin görüntülenmesi ve siniflandirilmasina yönelik olarak ayrica tasarlanmis reaktif bilesimleri ile kombinasyon halinde avantajli olarak kullanilirlar. "Ile kombinasyon halinde" ifadesi, reaktif bilesimlerin fiziksel kombinasyonuna veya karistirilmalarina refere etmez, ancak ayri (ardisik) analiz adimlarinda uygulanmalarina ve bu sekilde elde edilen verilerin kombinasyonuna refere eder. Örnegin, bir karakterizasyon tipi ile kombinasyon halinde kullanilan görüntüleme tüpü, her birinin reaktif bilesimlerdeii birini kullandigi, ayni biyolojik numunenin farkli alikotlari üzerinden iki farkli analitik adim, akabinde kaydetme ve degerlendirmeyi içerir. Bu nedenle bulus ayrica, en az iki reaktif bilesiminin bir kümesini, söz konusu küme yukarida açiklanan bir reaktif bilesimini içerir ve ayri florokrom-konjuge antikorlar içeren en az bir baska reaktif ile ilgilidir. Bu nedenle her iki reaktif bilesimi, bazilarinin her iki bilesimde de bulunabilmesine ragmen, antikorlarin ayri bir panelini içerir. Ayri florokromlarin panelinin esasinda her bir reaktif bilesime yönelik olarak ayni olmasi ve toplamda sekize kadar farkli florokromun Bir düzenlemede, yukarida, burada açiklandigi üzere (ALOT reaktifi) bir birinci reaktif bilesimini içeren en az iki reaktif bilesimlerin bir dizisi ve belirgin florokrom-konjuge antikorlari içeren en az bir diger reaktif bilesimi, asagidaki markör kombinasyonlarindan birine karsi yönlendirilir: (ii) ng, CD45, cylgu, CD33, CD34, CDl9, lgM, CDl 17 ve lgît, burada IgM ve CDl l7'ye karsi antikorlar ayni florokroma konjuge edilir. (iii) CD9, CD45, terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT), CD13, CD34, burada CD 15 ve CDW65"e karsi antikorlar ayni florokroma konjuge edilir. (v) cyCD3, CD45, TdT, CD99, CD5, CD10, CDla ve CD3 (vii) cyCD3, CD45, TCRyö, TCRaß, CD33, CD56, cyTCRß ve CD3 ile ifade edilen immün reseptörü ve CD14 (xii) HLADRa CD45, CD15, kondroitin sülfat proteoglikan (N G2), CD34, CD117, CD7 ve CD38 burada CD42a ve CD61°e karsi antikorlar ayni florokroma konjuge edilir. Reaktif bilesimlerinin örneklendirici dizileri, Tablo 3-5'in herhangi birinde belirtildigi üzere en az bir reaktif bilesimi ile birlikte olmak üzere en azindan asagida bulunan Tablo 2'deki tüpte#20 belirtilen reaktif bilesimini içerir. Ayrica burada en azindan Tablo 2'deki tüpte#20 belirtilen reaktif bilesimini, Tablo l'deki tüpte#l belirtilen reaktif bilesimini ve Tablo 5'teki tüplerde #29, 30, 31 ve 32 belirtilen reaktif bilesimlerini içeren bir dizi reaktif bilesimi saglanir. Baska bir açi, lökositlerin akis sitometrik immünofenotiplemesine yönelik bir tani kiti ile ilgilidir, burada kit, yukarida açiklanan en az iki reaktif bilesiminin bir veya daha fazla kümesini içerir. Kit, ek olarak, kullanima yönelik talimatlar, numune hazirlama reaktifi, tampon ve/veya kontrol numuneleri gibi diger faydali bilesenleri de içerebilir. Burada saglanan reaktif bilesimler, kümeler ve tam kitleri, çesitli alanlarda uygulama alani bulurlar. Örnegin, önerilen paneller, numunenin dogasina, tibbi belirtiye ve spesifik bir amaca bagli olarak tamamen veya kismen uygulanabilirler. Panel, hücre yüzeyinin ve/Veya hücre yüzeyine arti hücre içi markörlerin boyanmasina yönelik farkli hücre hazirlama teknikleri ile kombinasyon halinde, tek veya birkaç farkli üreticiye ait spesifik inonoklonal antikorlar reaktiflerini kullanabilir. Benzer sekilde reaktif bilesimleri, ayni omurga markörlerinin saglandigi ve ek veya benzer markörler ile kombine edildigi 8 farkli Ilorokromlar ile konjuge edilmis monoklonal antikor reaktiflerini içeren kombinasyonlari içeren bir panele artirilabilir. Bir antikor bilesimi, bagisiklik sisteminin izlenmesi de dahil farkli amaçlar ile yeni kombinasyonlarin eklenecegi bir ana panel olarak da islev görebilir. B-hücre prekürsörünün ALL (BCP-ALL) tespitine yönelik en az bir reaktif bilesimi ile birlikte ALOT reaktif bilesimini içeren olgunlasmamis lenfoid hücrelerinin tanimlanmasi ve karakterize edilmesine yönelik bir tani kiti saglanir, burada IgM ve CD] 177ye karsi antikorlar, ayni floro kroma konjuge edilir; CD9, antikorlar ayni florokroma konjuge edilir. Diger bir açida, olgunlasmamis lenfoid hücrelerinin tanimlanmasi ve karakterize edilmesine yönelik bir tani kiti, cyCD3, CD45, TdT, CD99, CD10, CDla ve CD3; CD45RA, CD123 ve CD3°e karsi antikorlari içeren T-hücre prekürsörü ALL`nin (T-ALL) tespitine yönelik en az bir reaktif bilesimi ile birlikte ALOT reaktif bilesimini içerir. miyelodisplastik sendrom (MDS)/kronik myeloproliferatif hastaligin (MPD) tespitine yönelik en az bir reaktif ile birlikte ALOT reaktif bilesimini içeren miyeloid hücrelerin taniinlanmasi ve karakterize edilmesine yönelik olarak bir tani kiti saglanir, burada CD42a ve CD61"e karsi antikorlar ayni florokroma Bulus ayrica, lökositleri içeren bir biyolojik numuneni saglanmasi ve numunenin en azin bir kisminin (alikot) burada saglanan reaktif bilesim ile temas ettirilmesi adimlarini içeren, lökositlerin akis sitometrik immünofenotiplemelerine yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Lökositleri içerdigi bilinen veya süphelenilen herhangi bir tip (insan) numune kullanilabilir. Örnegin numune, periferal kan, kemik iligi, lenf dügümleri, adenoid, dalak veya karaciger gibi doku numunesi veya beyin- omurilik sivisi, camsi cisim, eklem sivisi, plevra effüzyonlar ve assitler gibi, vücut sivisinin baska tipleridir. Tercihen yöntem, söz konusu numunenin birinci alikotu ile bulusa göre bir kümenin birinci reaktif bilesiminin temas ettirilmesini ve söz konusu numunenin en az bir ikinci alikotunun, söz konusu kümenin baska bir reaktif bilesimi ile teinas ettirilmesini; bir akis sitometresinde söz konusu alikotlardaki lökositlerin analiz edilmesi ve elde edilen verilen saklanmasini ve degerlendirilmesini içerir. Tipik olarak adim (c), akis sitometrisi dosyalarinin çok boyutlu analizine ve veri entegrasyonuna yönelik bir yazilimin kullanilmasini içerir. lNFlNlCYTTM ticari adi altinda, CYTOGNOS SLiden (Salamanca, Ispanya) ticari olarak temin edilebilen yazilim, bulusun yönteminde kullanilmaya çok uygundur. INFINICYTTM yazilimi, en yakin komsu hesaplamalarina göre birçok tüpten seçilmis hücre popülasyonlarinin immünofenotipik bilgisini otomatik olarak kombine edebilir, burada bir numunenin bir alikotundan hücreler, omurga markörlerine ve yayilim profillerine göre, ayni numunenin baska bir alikotundan ilgili hücreler ile eslestirilirler. INFINICYT prosedürü, burada saglanan 8-renkli EuroFlow panellerini, tüp basina omurga markörü sayisina ve panel basina tüp sayisina bagli olarak, 12, 16 veya 2 20-color immunoboyamalara dönüstürebilir. Antikor panelleri ve INFINICYT yazilimi, FACSCantoTM ll, FACSAria, LSRII, DAKO CyAnTM,Gallio, vs. gibi 8-renkli immünoboyamaya imkan saglayan halihazirda mevcut akis sitometrelerinin tamamli ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Sekillerin Açiklamalari Sekil 1. Üç antikor paneli Kategorisinin bilesimi. Sekil 2. EuroFlow antikor panellerinin olasi uygulamalarini gösteren tanisal akis diyagrami. DETAYLI AÇIKLAMA 1. Giris Mevcut çalisma, lösemilerin, lenfomalarin ve plazma hücre diskrazilerinin tanisina, siniflandirilmasina ve izlenmesine yönelik standartlastirilmis çok renkli immünofenotipleme protokollerinin tasarimini içeren, "Flow Cytometry for Fast and Sensitive Diagnosis and Follow-up of Haematological Malignancies" gerçeklestirilmistir. Bu protokollerin ana yenilikçi bileseni, antikor kombinasyonlarinin (EuroFlow panelleri) EuroFlow panelleridir. Bu EuroFlow bulusu, digerlerinin yani sira, standartlastirilmis bir sekilde, normal, reaktif, yenileyici ve kötü huylu hematopoietik hücreleri tanimlamak üzere kullanilabilen, antikor reaktifleri (reaktif bilesimler) kombinasyonlarinin panelleri ile ilgilidir. Böylece, kronik ve akut lösemilerin, miyelodispastik sendromlarin, miyeloproliferatif sendroinlarin, mastositozun, paroksismal noktürnal hemoglobinürinin, lenfomalarin ve plazma hücre diskrazilerinin kapsamli bir immünofenotipik tanisina, siniflandirilmasina, evrelemesine ve izlenmesine imkan saglarlar. Ilk olarak, önerilen paneller, öznel uzman görüslerine dayaninazlar, ancak ileriye dönük olarak test edilmistirler ve akis sitometrisi immünofenotiplemenin en sik belirtilerine yanitin gelistirilmesine yönelik olarak modifiye edilmistirler. Sonrasinda bu paneller, tek hücrelerdeki bilginin antikor paneli ile bir nuinunenin boyanma Ölçümünden elde edilmis parametrelerin tamamina yönelik olarak kombine edildigi yeni interaktif ve yari otomatik veri analizi prosedürleri ve klasik veri analizi yaklasimlari ile kombinasyon halinde uygulanacak yenilikçi bir sekilde tasarlanirlar. Bu panelleri kurmak üzere, asagidaki adim dizisi gerçeklestirilmistir: l. Kullanilisliklarina veya katma degerlerine göre alanda kullanilan ilgili markörlerin tamaminin degerlendirilmesi - ELN, EMN, ERIC gibi Avrupa aglari tarafindan önerilen markörler; - Rawstron et al. Tarafindan önerilen olgun B-hücre malignitelerine yönelik yeni markörler. 2. Hematopoietik hücrelerin (hücre soyu, farklilasma yolagi, olgunlasma evresi ve/Veya fonksiyonel altküme) spesifik bir kompartmaninin içerisindeki normal ve reaktif ve yenileyici ve anormal/kötü huylu hücreleri taniyabilen markörlerin (26) tasarimi ve seçimi. 3. Hastalardan ve saglikli öznelerden primer numunelerdeki antikor reaktitlerinin koinbinasyonlarina ait önerilen panellerin degerlendirilmesi. 4. Bagimsiz amaçlara ve gelismeye yönelik ortama bagli olarak antikor reaktiflerinin kombinasyonlarinin tekrarlanarak test edilmesi ve optimizasyonu (markör seçimi, antikor klonu seçimi ve florokrom seçimi). . Saglikli kontrollerden numunelerin ve iyi-tanimlanmis hasta numunelerinin büyük bir serisi üzerinde EuroFlow panellerinin optimize edilmis versiyonlarinin degerlendirilmesi. Önceden var olan bilgiler ile karsilastirildiginda, bu kapsamli bir panelin (prospektif olarak çok merkezli bir sekilde degerlendirildikten sonra) birinci tasarimidir, bu, normal, reaktif, yenileyici ve klonal/neoplastik hücreler arasinda ayrim yapilmasina ve klonal/neoplastik hematopoetik bozukluklarin siniflandirilmasina, evrelemesine ve izlenmesine olanak tanir: 1) bir numunenin boyanmis alikotlarinin tamamindaki ilgili hücre popülasyonlarinin uygun ve tekrarlanabilir tanimlanmasina yönelik olarak birlikte boyanmasi gereken inarkörler ve 2) bunlarin, florokrom-konj uge edilmis antikor reaktiflerinin spesifik kombinasyonlarindaki baska karakterizasyon markörleri ile nasil kombine edilmeleri gerektigi. Ek olarak her bir kombinasyonun amacina iliskin bilgi, ne zaman ve nasil uygulanacagi hakkinda bir belirti olarak verilir. Bulus sadece, kapsamli antikor paneli denemesinden ve birkaç yeniden tasarlama döngüsünden sonra yapilmistir. Reaktiflerin EuroFlow panelleri, bir veya daha fazla floresan bilesik ile konjuge edilmis bir veya birçok antikor kombinasyonunun (tüp olarak adlandirilir) alt kümelerinden olusur, söz konusu reaktif kombinasyonlari, farkli amaçlara sahiptir. EuroFlow panelleri, üç kategoriden olusur: Kategoril, Kategori 2 ve Kategori 3 antikor panelleri (Sekil 1). 2. Antikor panellerinin kategorileri Asagidaki amaçlar, antikor kombinasyonlarinin EuroFlow panelleri tarafindan gerçeklestirilir: Kategori 1 antikor panelleri, normali, reaktif, yenileyici ve neoplastik B-, T-, NK- hücreler ve plazma hücreler de dahil, olgun lenfoid hücrelerin farkli alt kümelerinin, özellikle, bir klonal ve/veya neoplastik lenfoid bozuklugu, lenfositoz, lenf dügümü genislemesi, dalak büyümesi, monoklonal serum bileseni, açiklanmainis nörolojik semptomlar, vs. nedeniyle olmasindan süphelenilen numunelerde tanimlanmalarini ve karakterizasyonlarini amaçlar. Kategori 2 antikor panelleri, normal, reaktif, yenileyici ve neoplastik olgunlasmamis (veya erken olgunlasma) T- ve/veya B-lenfoid hücrelerin, özellikle neoplastik lenfoid prekürsörler içerdiklerinden süphelenilen numunelerde tanimlanmalarini ve karakterizasyonunu amaçlar. Kategori 3 antikor panelleri, normal, reaktif, yenileyici ve neoplastik olgunlasmamis, olgunlasmakta ve olgunlasmis miyeloid hücrelerinin, özellikle neoplastik miyeloid hücreler veya miyeloid-iliskili markörleri ifade eden neoplastik hücreler içerdiklerinden süphelenilen numunelerde tanimlanmalarini ve karakterizasyonlarini amaçlar. Söz konusu üç kategori içerisinde, antikor reaktifleri kombinasyonlarinin bazilarinin, daha genel amaçlar ile tek tüplü gözlemleme adiminda kullanilmalari amaçlanirken, digerleri muhtemelen, önceden gözlemleme adiminda daha spesifik hedef popülasyonlar tanimlandiginda, çok tüplü siniflandirma adimlarinda uygulanirlar. 2.] Kategori 1 antikor panelleri Kategori 1 antikor panelleri, sirasiyla normal veya yüksek hücre sayimlari (örnegin, normal periferal kan) ve düsük hücre sayimlarini (örnegin, camsi cisim) ve B-, T-, NK-hücrelerinin ve plazma hücrelerinin baska bir karakterizasyonuna hedeflenen çok tüplü antikor kombinasyonlarinin dört farkli kümesini içeren numunelerde bulunan olgun lenfoid hücrelerin spesifik alt gruplarinin baslangiç tanimlamalarina ve karakterizasyonlarina hedeflenmis üç görüntüleme tüpünden olusur. Kategori 1 görüntüleme tüpleri, sirasiyla, oldukça yüksek ve düsük hücre sayimlarina sahip numunelerdeki klonal ve neoplastik T, B- veya NK-hücrelerin ve plazma hücrelerinin varligini görüntülemek üzere kullanilabilirler. Düsük hücre sayiinli numunelerin tipik örnekleri, ince igne aspiratlari (FNA), beyin- omurilik sivisi (CSF) ve camsi cisimdir. Yukarida belirtilen görüntüleme tüpleri hâlihazirda, yüksek hücre sayimli numunelere (LST olarak kisaltilmistir) yönelik olarak lenfoid görüntüleme tüpü, düsük hücre sayimli numunelere yönelik olarak küçük numune tüpü (SST) ve ayri bir plazma hücre görüntüleme tüpü (PCST) olarak adlandirilir. Dolayisiyla, tüplerin diger dört kümesi ayrica, diger kullanimlarin yani sira, tanimlanan klonal veya neoplastik B-, T- ve NK- hücre ve plazma hücrelerini, sirasiyla, farkli B-, T- ve NK- hücre kronik lenfoproliferatif bozukluklara (sirasiyla, BCLPD, TCLPD ve NKCLPD olarak kisaltilmistir) ve plazma hücresi diskrazisine (PCD olarak kisaltilmistir) sahip hastalarda karakterize etmeye adanir. 2.2 Kategori 2 antikor panelleri Kategori 2 antikor panelleri, olgunlasmamis lenfoid ve lenfoid olmayan prekürsörlerin ilk teshisine ve karakterizasyonuna ayrilmis bir görüntüleme tüpünden ve B-hücre ve T-hücre prekürsörlerinin diger ayrintili karakterizasyonuna yönelik iki dizi tüpten olusur. Diger uygulamalar arasinda, görüntüleme tüpü, akut lösemilerin lenfoid, lenfoid olmayan, farklilasmamis ve bifenotipik veya bilineaj akut lösemilere karsi siniflandirilmasina yönelik olarak kullanilabilir. Bu tüp ayrica sirasiyla kemik iliginde normal/yenileyici ve neoplastik/malign B-hücre prekürsörleri, periferik kan ve diger dokular ve timustaki T-hücre prekürsörleri arasindaki ayrima yönelik olarak kullanilabilir. Sonuç olarak bu görüntüleme tüpü artik akut lösemi oryantasyon tüpü (ALOT olarak kisaltilmistir) olarak ifade edilir. Diger iki dizi tüp, diger uygulamalar arasinda, B-hücre prekürsör akut lenfoblastik lösemi ve T-ALL sahibi hastalarda ve ayrica farklilasmamis veya bifenotipik/bilinmeyen fenotip gösteren akut lösemili hastalarda B-hücre ve T-hücre bagliligi gösteren lenfoid patlama hücrelerinin karakterizasyonuna yönelik olarak kullanilabilir. 2.3 Kategori 3 antikor panelleri Nihai olarak, Kategori 3 antikor panelleri, lenfoid ile lenfoid olmayan prekürsör hücreleri ayirt etmeyi amaçlayan ve Kategori 2'de (ALOT tüpü) yukarida açiklanan tüplere benzer olan bir görüntüleine tüpü ve numunede (örnegin BM'de) mevcut olmasi halinde eritroid, megakaryositik, monositik, nötrofilik, eozinofilik, bazofilik, mast hücre ve dendritik hücre soylarinin yani sira, daha olgunlasmamis, islenmemis heinatopoetik prekürsörler ve stromal hücrelere bagli olan hücrelerin farkli olgunlasma asamalari dahil olmak üzere, lenfoid olmayan hücrelerin en erken hematopoetik prekürsörlerinden olgunlasmis miyeloid hücrelerine olgunlasmasini karakterize etmeyi amaçlayan ilave bir tüp dizisinden olusur. Diger kullanimlarin arasinda, bu tüp dizisi, neoplastik/klonal hastaliklarin ve diger hastaliklarin karakterizasyonuna yönelik olarak uygulanabilir, burada ilgili hücreler (örnegin klonal/neoplastik, degistirilmis/atipik hücreler), akut miyeloid lösemi (AML), miyelodisplastik sendrom (MDS)/kr0nik myeloproliferatif hastalik (MPD), paroksismal noktumal hemoglobinüri (PNH), mastositoz, saptanmamis öneme sahip idiyopatik sitopeni (ICUS) ve/veya bifenotipik ve bilineaj akut lösemilerde oldugu üzere miyeloid ile iliskili belirteçleri içeren akut lösemiye sahip hastalarda oldugu üzere miyeloid farklilastirmayi gösterir. Bu tüplere ait gruplar bundan böyle AML/MDS/MPD olarak kisaltilabilir. 2.4 EuroFlow panellerinde kullanilan markör tipleri EuroFlow panellerinin her birinde, iki tip antikor reaktiti kombine edilir: 1) çogunlukla, söz konusu hücre popülasyonlarinin fenotipik karakteristikleri ile ilgili ek bilgi de saglayan, numunede (Omurga markörleri) bulunan ilgili kesin hücre popülasyonunu tanimlamayi amaçlayan reaktifler ve 2) çogunlukla, numunedeki (Karakterizasyon markörleri) diger hücre gruplarinin yani sira söz konusu hücre popülasyonlarinin ayrica karakterizasyonuna/siniflandirilmasina adanmis reaktifler. Tipik olarak omurga markörleri, asagidaki tüp kümelerinin her birinde tekrar edilirler: AML/MDS/MPD, BCP-ALL, T-ALL, B-CLPD, T-CLPD, NK-CLPD, PCD). Ek olarak, B-CLPD tüp kümesinin omurga markörleri ayrica, LST ve SST görüntüleme tüpleri için ortaktir, PCT tüp kümelerinin omurga markörleri PCST için ortaktir ve BCP-ALL ve T-ALL tüp kümelerinin omurga markörleri de ALOT için ortaktir; son olarak AML panelindeki (diger bir deyisle: CD34 ve CD45) omurga markörleri de ALOT tüpü için ortaktir. Dolayisiyla karakterizasyon markörleri, her bir tüpte kapsamli bir sekilde kombine edilirler, böylece düsük sayida mevcut olmalari halinde dahi, klonal/neoplastik hücrelere karsi normal, reaktif, yenileyicilerin ayrilmasina imkân saglarlar ve neoplastik hücreler durumunda ayrica, akut ve kronik lösemilerin, lenfomalarin ve plazma hücre diskrazilerinin tanisina, alt siniflandirmasina, evrelemesine ve izlenmesine de imkan saglarlar. Çok tüplü panellerdeki bu amaca yönelik olarak her bir tüp, ilgili görüntüleme tüpünden (örnegin, CLL'nin tanisina, evrelemesine ve görüntülenmesine yönelik olarak, LST ile kombinasyon halindeki B-CLPD çok tüplü panelinin tüp#4`ü yeterli olacaktir) ilgili bilgi ile kombine edilmesi halinde ve belirli hastalik ile iliskili bilgilere (Örnegin, Tablo 3'te gösterilen BCP-ALL çoklu tüp panelindeki tüp#24, malign B-hücre prekürsörleri ile normal/reaktif ve yenilemeye karsi kötü huylu B- hücre prekürsörlerini ve BCP-ALL'de minimal rezidüel hastalik izlemeyi ayirt etmek amaciyla özel olarak ayrilmistir) yönelik olarak bir hastalik varliginin tam karakterizasyonu ve izlenmesi ile iliskili spesifik bir amaca adanir. 2.5 EaroFlow panellerim'n optimal uygulanmasina yönelik INFINI C Y T yazilim Bulusa göre antikor panelleri, ticari olarak temin edilebilir INFINICYT yazilim araçlari ile kombinasyon halinde kullanilabilirler. Yazilim, farkli numunelerin ve farkli numune gruplarinin arasindaki karsilastirmalarin (US 7,507,548) yani sira sadece kismi örtüsmeye (US 7,321,843) sahip antikor reaktitlerinin fakli kombinasyonlari kullanilarak, ayni numunenin diger alikotlarinda ölçülmüs tek hücrelere kadar bir numune alikotunun markörlerinin ölçülmesinden elde edilen bilginin hesaplanmasi ve veri dosyalarinin birlestirilmesi yoluyla sinirsiz sayida parametre ile dosyalar olusturmaya yönelik olarak son zamanlarda açiklanan prosedürlere dayanir. 3. Olgun lenfoid hücrelere yönelik Kategori 1 antikor panellerinin bilesigi Olgun lenfoid hücrelere yönelik Kategori 1 antikor panellerinin antikor reaktiflerine ait ok tüplü kombinasyonlarinda, seçilen ortak omurga markörleri, dört farkli panel arasinda farklilik gösterirler ve (antikor CD ari Ilorokrom bilesik CD19-6"dan olusur. Ek olarak, B-CLPD tüpünde kullanilan omurga markörleri ayrica, LST ve SST görüntüleme tüplerinde de kullanilirlar ve PCD tüplerinin omurga markörleri ayrica PCST,de de kullanilirlar. Antikor reaktiflerinin bu çok tüplü kombinasyonlarinin her birindeki omurga markörleri, ilgili hücre gruplarinin belirleninesinin saglanmasini ve yeterli sayida tümör hücresi içeren tani ve izleme numunelerindeki neoplastik hücrelerin spesifik tanimlanmasini hedefler. Ek olarak dört çok tüplü kombinasyonun her birine yönelik olarak, omurga markörleri, farkli hastalik kategorilerinden klonal/neoplastik hücrelerin ayirt edilmesinin yani sira, minimal sayida (örnegin, minimal kalintisal hastalik izleme ve hastalik evreleme) bulunduklarinda dahi, sirasiyla normal, reaktif, yenileyici ve neoplastik/klonal B-, T-, NK- hücrelerin ve plazma hücrelerinin ayrimina katki saglayan degisken sayida ek karakterizasyon markörleri ile kombine edilebilirler. ve plazma hücre görüntüleme tüpü (PCST) EuroFlow LST reaktif bilesimi, lenfositoz, lenf dügümü genislemesi, dalak büyümesi, monoklonal serum bileseni, açiklanmamis nörolojik semptomlar, açiklanmamis sitopeni, vs. (Sekil 2) gibi birkaç süpheli klinik durumun degerlendirilmesi için tasarlanmistir ve onaylanmistir. Bir örnek LST tüpü bilesimi, Tablo l,de saglanir. Bu tüp, B, T ve NK soyunun atipik olgun lenfosit popülasyonlarini saptar. Mevcut basvurunun herhangi bir Tablosunda, florokrom numara 1, pasifik mavisine (PacB) veya Horizon V450"ye, numara 2, pasifik turuncusuna (PacO) veya AMCA7ya, numara 3, Iloresin izotiyosiyanat (FITC) veya Alexa488'e, numara 4, fikoeritritine (PE), numara 5, peridinin klorofil protein/siyanin , PerCP veya PE-Teksas Kirmizisina, numara 6 fikoeritrin/siyanin 7"ye (PE-Cy7), numara 7, allofikosiyanin veya (APC) Alexa647"ye ve numara 8, allofikosiyanin/H7 (APC-H7), APC-Cy, Alexa680 veya A1exa700°e karsilik gelir. Tercih edilen kombinasyon, pasifik mavisi (PaCB) pasifik turuncusu (PaCO), floresin izotiyosiyanat (FITC), fikoeritrin (PE), peridin klorofîl protein/siyanin , ve allofikosiyanin/HTdir (APC-H7). TABLO 1. Normal ve kötü huylu/ atipik olgun lenfoid hücrelere yönelik tek tüplü EuroFIOW izleme kombinasy0nlari F lorokrom ve CD4 CD8 CD56 TCRyö Florokrom 1 2 3 4 5 6 7 8 BB = Bu markörler, LST veya SST sonuçlari, B-CLPDiye yönelik çok tüplü EuroFlow siniflandirma kombinasyonu ile elde edilen sonuçlar ile kombine edildiginde veya PCST sonuçlari, PCD'ye yönelik 2-tüplü EuroFlow siniflandirma kombinasyonu ile elde edilen sonuçlar ile kombine edildiginde Omurga markörleri olarak islev görürler; LST = lenfoid izleme tüpü; SST = küçük numune tüpü; PCST: plazma hücresi izleme tüpü. 4. Olgunlasmamis lenfoid hücrelere yönelik Kategori 2 bilesimi EuroFlow ALOT tüpü, akut lösemi hastalarinda (B, T, lenfoid olmayan, farklilastirilmamis veya karisik fenotip akut lösemilere karsi) olgunlasmamis patlama hücresi popülasyonlarinin dogasi ve sonuçta en uygun tamamlayici antikor panellerine dogru oryantasyonun degerlendirilmesi için tasarlanmistir: BCP-ALL, T-ALL ve/veya AML/MDS/MPD. ALOT tüpünün bilesimi, Tablo 2,de saglanir; markörler CD45-2, CD34-5 ve CDl9-6, ALOT bilgileri, BCP-ALL paneli (örnegin INFINICYT yazilimi kullanilarak) ile kombine edilir ve cyCD3-1, CD45-2 ve CD3-8 markörleri ayrica, ALOT'un bilgileri T-ALL paneliyle birlestirildiginde ortak omurga belirteçleri olarak islev görür; buna ek olarak CD45-2 ve CD34-5, AML/MDS/MPD çoklu tüp paneline ortak omurga markörleridir. TABLO 2. Akut lösemilerdeki blast hücrelerin soy tayinine yönelik tek tüplü EuroFlow kombinasyonu BB =Bu markörler, sonuçlar, BCP-ALL veya T-ALLtye (bakiniz, sirasiyla Tablo 3 ve Tablo 4) yönelik çok tüplü Euro-Flow siniflandirma kombinasyonlari ile elde edilmis sonuçlar ile kombine edildiginde Omura markörleri olarak çalisirlar. ALOT, ALOT antikor kombinasyonunun, bu amaç için yeterli olmamasi nedeniyle, bir hematolojik malignitenin çikarilmasi için uygun degildir. Ancak, ALOT, LST ve 4 tüp AML/MDS protokolü (tüp # 29, 30, 31 ve 32) ile kombine edildiginde, hematolojik malignite türlerinin neredeyse tamami saptanabilir (siniflandirilmamis) veya çikarilabilir (Sekil 2). yönelik çoklu tüplü antikor paneli EuroFlow BCP-ALL tüpü, tam olarak klasik sekilde tanimlanan bu BCP-ALL"nin (B-ALL sonrasi, ortak-ALL, ön-B-ALL) veya belirli füzyon genleri gibi iyi tanimli moleküler durumlar ile ilgili immunofenotipik siniflandirmalar dahil olmak üzere alternatif BCP-ALL sinitlandirmalarinin tanimlanmasi ve Siniflandirilmasini amaçlar. BCP-ALL tüpü ile elde edilen bilgiler, omurga markörleri CD45-2, CD34-5 ve CD19-6`ya bagli olarak ve uygun veri analiz yazilimi (örnegin INFINICYT yazilimi araciligiyla) (Tablo 3) kullanilarak ALOT ile kombine edilmeye ihtiyaç duyar. TABLO 3. B-hücre prekürsörü ALL"ye (BCP-ALL) yönelik çok tüplü Euro- Flow siniflandirma kombinasyonlari 24 CD21CD4SBB CD15 NGZ BCP-ALL tani ve siniflandirma; Lap markörlerinin tespiti BCP-ALL tani ve siniflandirma; moleküler durumlar ile iliskili fenotiplerin BCP-ALL tani ve siniflandirma; moleküler durumlar ile iliskili fenotiplerin tespiti, LAP markörlerinin tespiti BCP-ALL alt siniflandirma; LAP markörlerinin tespiti BB = Omurga markörleri. Tüpler ayrica, hastalik evreleme ve izlemeye yönelik olarak basarili bir sekilde uygulanabilirler. yönelik çok tüplü antikor paneli EuroFlow T-ALL paneli, dört tüpten olusur ve ALOT ile ortak sekilde omurga markörleri (bakiniz Tablo 4) olarak cyCD3-1, CD45-2 ve CD3-8,ü kullanir. T- ALL paneli, örnegin TCR protein ifadesi (cyTCRß, TCRaß, TCRyö) veya iyi tanimli moleküler durumlar ile arasindaki iliskiye bagli olarak tüm klasik sekilde açiklanan T-ALL (olgunlasmamis T-ALL, ortak timositik T-ALL, olgunlasmis T- ALL) veya alternatif T-ALL siniflandirilmasini amaçlar. TABLO 4. T-ALL,ye yönelik çok kombinasyonlari 27 cyCD3BB CD45BB TCRyö TCRoiß CD33 siniIlandirmasinin tanimlanmasini VC EuroFlow siniflandirma 7 8 Amaç CDla CD3BB T-ALL tanisi; Lap markörlerinin belirlenmesi CD7 CD3BB T-ALL tanisi; T-ALL siniflandirmasi ve arest olgunlasma asamasinin teSpiti; LAP markörlerinin tanimlanmasi TCRß olgunlasma BB = Omurga markörleri. Tüpler ayrica, hastalik evreleme ve izlemeye yönelik olarak basarili bir sekilde uygulanabilirler. asamasinin tespiti; LAP markörlerinin tanimlanmasi T-ALL alt Siniflandirma . Miveloid hücrelere vönelik Kategori 3 bilesimi EuroFlow AML/MDS/MPD paneli, tümü, omurga markörleri (Tablo 5) olarak HLA-DR-l, CD45-2, CD34-5 ve CDl l7-6"yi içermek üzere iki bütünleyici Birinci tüp dizisi (tüpler 29-32) tercihen, olgunlasmamis nötrofilik soyu (tüp 30), monositik soyu (tüp 31) ve eritroid soyu (tüp 32) üzerine odaklanarak AML ve MDS gibi miyeloid malignitelerin tespit edilmesi ve siniflandirilmasi (soy degerlendirmesi ve olgunlasmasi) amacina yönelik olarak EuroFlow ALOT ile kombinasyon halinde kullanilmak üzere tasarlanir. Bu dört tüp ayrica, APL (tüp 32), PNH (tüpler 29 ve 30) ve diger atipik miyeloid fenotiplerin tespit edilmesine katkida bulunur. Ikinci tüp dizisi (tüpler mastositoz tanisina yönelik megakaryositik, bazofilik, plazmasitoid dendritik soylar (tüp 33) hakkinda ilave bilgileri saglar. Tüp 35 ayrica AML/MDSiyi karakterize eder ve özellikle lenfoid iliskili markörler ve anormal lenfoid olgunlasmanin atipik ifadesine odaklanir. TABLO 5. AML/MDS/MPD,ye yönelik çok tüplü EuroFlow siniflandirma kombinasyonlari Tüp# 1 2 3 4 5 6 7 8 Amaç soya odaklanan PNH ve AMUnin tanisi ve alt siniflandirmasi HLADRBB CD45BB CD15 HLADRBB CD45BB CD42a HLADRBB CD45BB CD4] HLADRBB CD45BB TdT CD34BB CD117BB CD7 CD34BB CD117BB CD42b CD9 CD34BB CD117BB c022 BB = Omurga markörleri; Antikor kombinasyonlarinin bu çok tüplü dizisi, yalnizca AML, MDS ve MPD saptamasina yönelik degil, ayni zamanda mastositoz, PNH ve ICUS*a yönelik olarak faydalidir. Tüpler ayrica, hastalik evreleme ve izlemeye yönelik olarak basarili bir sekilde uygulanabilirler. TR TR TR TR TR