TARIFNAME IMMÜNOTERAPIYE YÖNELIK RNA FORMÜLASYONU BULUSUN TEKNIK SAHASI Mevcut bulus, özellikle tümör immünoterapisi olinak üzere immünoterapi alanindadir. Mevcut bulus, sistemik uygulama sonrasinda dalaktaki dendritik hücreler (DC) gibi antijen sunan hücrelere yüksek seçicilik ile RNA"nin dagitilmasina yönelik farmasötik formülasyonlarin saglanmasi ile ilgilidir. Özellikle burada açiklanan foimülasyonlar, antijen kodlayici RNAsnin sistemik uygulanmasindan sonra bir immün yaniti indükleyebilir. BULUSUN ALT YAPISI DNA, siRNA veya RNA benzeri nükleik asitler, hastalarda çesitli terapötik müdahaleler ile ilgilidir. Tümör terapisinde nispeten yeni iminünolojik bir yaklasim, tümöre bir T-hücre yanitini indüklemek amaciyla antijen sunan hücrelerde (APCWer) kodlayici RNA ile tümör antijen ifadesine dayandirilir (Weide, B. et al. (2008) Journal of Immunotherapy 31(2): 180-188; Weide, B. et al. (2009) Journal of lminunotherapy 32(5): 498-507; Kreiter, S. et al. (2010) Cancer Res 70(22): 9031-9040; Kuhn, A. N. et al. (2010) Gene Ther 17(8): 961- 971). Bu tür müdahaleye yönelik hedef hücreler, örnegin lenf dügümleri (LNsler) veya dalakta bulunan dendritik hücrelerdir (DCiler). DC,ler araciligiyla RNA"nin yeterli alimini saglamak ainaciyla RNA,nin lenf dügümlerine lokal uygulamasinin basarili oldugu kanitlanmistir. Ancak bu tür lokal uygulama, hekimin spesifik uzmanligini gerektirir. Bu nedenle sistemik olarak, örnegin intravenöz olarak (i.v.), subkütanöz olarak (s.c.), intradermal olarak (id.) veya inhalasyon yoluyla uygulanabilir RNA formülasyonlarina ihtiyaç duyulur. Literatürden nükleik asitlerin sistemik uygulamasina yönelik çesitli yaklasimlar bilinir. Viral olmayan gen transferinde katyonik lipozomlar, DNA/RNA yogunlasmasini indüklemek üzere ve hücresel alimi kolaylastirmak üzere kullanilir. Katyonik lipozomlar genellikle DOTAP benzer bir katyonik lipidden ve DOPE benzeri bir veya daha fazla yardimci lipidden olusur. 'Lipopleksler' olarak adlandirilan kisimlar, katyonik (pozitif yüklü) lipozomlardan ve anyonik (negatif yüklü) nükleik asitten olusturulabilir. En basit haliyle lipopleksler, nükleik asidin çesitli diger protokoller uygulanabilmesine ragmen belirli bir karistirma protokolü ile lipozomlar ile karistirilmasi yoluyla spontan sekilde olusur. Pozitif yüklü lipozomlar ve negatif yüklü nükleik asit arasindaki elektrostatik etkilesimler lipoleks olusumu için tahrik edici kuvvettir. Lipid bilesiminin yani sira katyonik ve anyonik kisimlar arasindaki yük orani, etkili yogunlasma ve transfeksiyon için önemli bir rol oynar. Genellikle lipoplekslerin asiri pozitif bir yükünün, etkili transfeksiyon için gerekli oldugu düsünülür (Templeton, N. S. et al. (1997) Nature Biotechnology 15(7): 647-652; Zhdanov, R. 1. et al. (2002) Bioelectrochemistry 58(l): 53-64; Templeton, N. S. (2003) Current Medicinal Chemistry 10(14): 1279-1287). Çogu dogal membran negatif yüklüdür ve bu nedenle pozitif yüklü lipopleksler ile negatif yüklü biyoineinbran arasindaki etkileyici elektrostatik etkilesim, lipoplekslerin hücre baglanmasi ve aliminda önemli bir rol oynayabilir. Transfeksiyon için optimal oldugu düsünülen +/- oranlarinin tipik araliklari 2 ile 4 arasindadir. Daha düsük pozitif yük ile transfeksiyon etkinligi çarpici sekilde hemen hemen sifira düser. Ne yazik ki pozitif yüklü lipozomlar ve lipopleksler için yüksek toksisite belirtilmistir, bu durum bu tür preparatlarin farrnasötik bilesimler olarak uygulanmasi için bir problem olabilir. US 2011/0311584, özellikle enfeksiyöz hastaliklar veya bir kanser hastaligi ile iliskili RNA kodlayici antijenler olmak üzere asilama veya immunostimülasyon için hücrelere RNASnin saglanmasi ile ilgilidir. Genellikle RNA,nin, genellikle nötral veya negatif yüklü fosfolipidleri içeren lipozomlar vasitasiyla dagitilabildiginden bahsedilir. Martinon F. et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23, 1719-1722, virüse spesifik sitotoksik T-lenfositleri indükleyebilen lipozom ile tutulmus mRNA,yi açiklar. WO 2011/005799, örnegin gen terapisi veya asilama için bir özneye dagitilabilen pozitif yüklü bir lipozom içinde tutulan kendi kendini yenilen bir RNA molekülü ile ilgilidir. US 5,580,859, pozitif yüklü bir lipozom ile iliskili olarak uygulanabilen DNA ve RNA molekülleri ile ilgilidir. WO 2012/006378, immünizasyon amaçlarina yönelik olarak bir lipozomda dagitilan bir immünoj eni kodlayan RNA ile ilgilidir. WO 2013/ 1 13502 Al, immünostimülasyona yönelik kompleksleri içeren negatif yüklü nükleik asit ile ilgilidir. WO 2010/037539 A1, immünostimülasyon için bir kompleks (m)RNA ve bir çiplak mRNA içeren bilesimler ile ilgilidir. Yukarida açiklanan lipoplekslerin, çesitli organlarda transfeksiyon sagladigi kanitlanmistir. ifadenin detayli organ dagilimi, kompleks bir sekilde formülasyona ve uygulama parametrelerine (lipid bilesimi, boyutu, uygulama yolu) baglidir. Simdiye kadar, hedef disi organlarda ifadeyi önleyen, belirli bir hedef organ veya hücresel kisimdaki seçici ifade yeterli derecede gerçeklestirilememistir. Bir raportör olarak lusiferaz DNA veya RNA kullanilarak, örnegin akciger, karaciger, dalak, böbrekler ve kalpte transfeksiyon belirtilmistir. Birçok durumda akciger ve karaciger hedefleme isleminin baskin olmasi nedeniyle akciger ve karacigerin hedefle isleminin önlenmesinin özellikle zor oldugu kanitlanmistir. Akciger oldukça büyük bir yüzeye sahiptir ve bu, i.v. enjekte edilen bilesiklerin uygulamadan sonra geçtigi ilk organdir. Karaciger, lipoplekslerde bulunan lipidler benzeri lipofilik bilesikler ile formülasyonlar ve lipozomlar için tipik hedef organdir. RNA bazli immünoterapi için akciger veya karaciger hedefleme islemi, bu organlara karsi bir immün yaniti riski nedeniyle zararli olabilir. Bu nedenle, bu tür bir terapi için, dalakta oldugu gibi sadece DC`ler için yüksek seçiciligi olan bir formülasyon gereklidir. Hedefleme seçiciligini gelistirinek için belirli ligandlar önerilmistir. Örnegin mannoz ile fonksiyonelize edilmis lipidleri içeren lipozomlarin, makrofaj hedefle islemini gelistirdigi düsünülür. Ancak bu tür bilesenler formülasyonlari daha kompleks hale getirir, bu durum pratik farmasötik gelisimi daha komplike hale getirir. Ayrica seçicilik sinirlandirilir ve lipozomlarin belirli bir fraksiyonu yine diger organlar tarafindan alinir. Bir diger problem, serum etkilesimlen' ve serumdaki RNA bozulmasidir, bu pozitif yüklü lipopleksler ile tercih edilir. Ayrica terapötik uygulanabilirlik için kimyasal ve fiziksel stabilite gibi farinasötik ürünlere yönelik gereksinimlerin yerine getirilmesi gerekir. Ek olarak intraperitoneal uygulamaya yönelik ürünlerin steril olmasi gerekir ve partikül karakteristikleri ile ilgili belirli gereksinimleri yerine getirmelidir. Ek olarak ürünler, üretim için uygun olmalidir. Kisaca açiklandiginda hastalara uygulama için ürünlere yönelik kriterleri yerine getiren, yüksek dalak seçiciligi olan enjekte edilebilir bir RNA formülasyonunun gelisme probleminin de çözülmesi gerekmektedir. Mevcut bulus, yukarida açiklanan problem için bir çözüm saglar. Sasirtici sekilde RNA ve lipozomlardan negatif yüklü lipoplekslerin, sistemik uygulama sonrasinda dalak DC"lerinde önemli ölçüde RNA ifadesine yol açtigi bulunmustur. Diger organlardaki ifade düsükken hedef genlerde (dalak) raportör genin güçlü bir ifadesi belirlenmistir. Ayrica bir model antijene karsi güçlü bir immün yanit indüklenebilir. Bu, genellikle asiri pozitif yükün basarili alim ve ifade için bir ön kosul olarak düsünülmesi nedeniyle beklenmedik bir durumdur. Burada mutlak ifade miktari pozitif yük için azalan yük ile azalmasina ragmen ifadenin, sisteinik uygulaina sonrasinda lipoplekslerin terapötik etkinligini saglamak üzere yeterince yüksek oldugu bulunmustur. Bulusa göre hastalara intravenöz uygulama için gerekli olan görülemeyen partiküllerin düsük fraksiyonu olan ve sinnamik isik saçilmasi yoluyla ölçüldügü üzere iyi tanimlanmis bir partikül boyut dagilim profili olan lipoplekslerin olusturulmasi mümkündür. Kendi kendine düzenleme yoluyla RNA ile lipozomlarin inkübasyonu yoluyla olusturulmasi halinde orijinal lipozomlarin partikül boyutu sadece çok az etkilenir ve büyük agregalarin istenmeyen kisimlari bulunmaz. Prekürsör lipozomlarin boyutunun ve karistirma kosullarinin seçilmesi ile farkli boyutlar elde edilebilir. Bu, genellikle katyonik lipozomlar ile RNA inkübasyonu üzerine büyük agregalarin olusumu gözlendiginden sasirticidir. Bu agrega olusumu, intravenöz veya subkütanöz uygulama için kabul edilebilir olan lipopleks olusumlarinin gelistirilmesi için Önemli bir engeldir. Partiküller en az 24 saat stabildir ve zamanla topaklanmaya egimli degildir. Partikülleri, orijinal partikül boyut profili sürdürülürken ve biyolojik aktivite sürdürülürken agrega olusmaksizin dondurulabilir ve tavlanabilir. Partiküller, orijinal partikül boyut profili sürdürülürken ve biyolojik aktivite sürdürülürken agrega olusmaksizin liyofilize edilebilir ve su ile yeniden olusturulabilir. Partiküller, ölçeklenebilir olan ve kontrollü kosullar altinda gerçeklestirilebilen farkli protokoller ile üretilebilir. Bu tür özellikle ile bulusun lipopleks formülasyonlari, partikül boyut dagilim profili ve stabilite bakimindan hastalara uygulama için farmasötik formülasyonlar için önemli gereksinimleri yerine getirir. Ayrica pozitif yüklü lipopleksler ile karsilastirildiginda burada açiklanan RNA nanopartiküllerinin daha az toksik olmasi ve daha az istenmeyen serum etkilesimi göstermesi beklenir. Özellikle formülasyonlar, intravenöz ve subkütanöz uygulama dahil parenteral uygulama için uygundur. BULUSUN AÇIKLAMASI Bulusun Kisa Açiklamasi Immünoterapötik stratejiler, örnegin enfeksiyöz hastaliklar ve kanser hastaliklarinin tedavisi için umut vaat edici seçeneklerdir. Giderek artan sayida patojen ve tümör iliskili antijenlerin (burada ayrica tümör antijenleri olarak adlandirilir) tanimlanmasi, immünoterapi için uygun hedeflerin genis bir koleksiyonuna yol açar. Mevcut bulus genellikle hastalikli hücrelerin hedeflenmesi ile hastaliklarin immünoterapötik tedavisini kapsar. Bulus, bir antijeni ifade eden hücrelerin seçici eradikasyonunu saglar, böylelikle söz konusu antijenleri ifade etmeyen normal hücrelere yönelik olumsuz etkileri en aza indirilir. Dolayisiyla bir terapi için tercih edilen hastaliklar, kanser hastaliklari veya enfeksiyöz hastaliklarin bir veya daha fazla antijenin ifade edildigi hastaliklardir. Mevcut bulus, hastalikli hücreleri spesifik olarak taniyabilen ve bunlari öldürebilen, hastadaki T hücreleri indükleyen ve genisleten aktif immünizasyon yoluyla antijen ifade eden hücrelerin spesifik olarak hedeflenmesini amaçlar. Spesifik olarak mevcut bulus, i'n vi'vo dendritik hücreler gibi antijen sunan hücrelere RNA olarak sunulan bir antijenin seçici yerlesmesini saglar. Antijen, MHC molekülü için bir peptit partneri üretmek üzere islenebilir veya MHC moleküllerine baglanabilmesi halinde ilave islemeye gerek olmaksizin sunulabilir. Etkili bir immün yaniti için gerek duyulan T yardimci hücre yanitlarini üretebilmesi nedeniyle tam antijenin, antijen sunan hücreler araciligiyla in vi'vo islendigi uygulama formlari tercih edilir. Dolayisiyla bir hastaya uygulandiginda bulusa göre saglanan bilesimler, MHC sunan epitoplarin türetildigi antijenleri ifade eden hücrelere yönelik T hücrelerinin uyarilmasi, hazirlanmasi ve/veya genisletilmesi için bir veya daha fazla MHC sunan epitop saglar. Buna uygun olarak burada açiklanan bilesimler tercihen sinif I MHC ile antijenlerin sunulmasi ile karakterize edilen bir hastaliga karsi hücresel bir yaniti, tercihen sitotoksik T hücre aktivitesini indükleyebilir veya destekleyebilir. Özellikle mevcut bulus, en az bir antijenin bir öznenin dalaginda profesyonel antijen sunan hücrelere dagitilmasina yönelik bir yöntemde kullanim için az bir katyonik lipid, en az bir nötral yardimci lipid ve en az bir antijeni kodlayan RNAiyi içeren nanopartikülleri içeren farmasötik bir bilesim ile ilgilidir, söz konusu yöntem farmasötik bilesimin özneye sistemik olarak uygulanmasini içerir, burada antijen, hastalik ile iliskili bir antijendir veya hastalik ile iliskili bir antijene veya hastalik ile iliskili bir antijeni ifade eden hücrelere karsi bir immün yanit saglar ve burada nanopartiküller, asagidakileri içeren lipoplekslerdir (i) &2 ila 327, tercihen 7:3 ila 5:5 molar oraninda DOTMA ve DOPE, burada DOTMAida bulunan pozitif yüklerin RNA`da bulunan negatif yüklere yük orani 1.622 ila 122, tercihen 1.422 ila l.1:2'dir; veya (ii) &2 ila 327, tercihen 7:3 ila 5:5 molar oraninda DOTMA ve Kolesterol, burada DOTMA7da bulunan pozitif yüklerin RNA'da bulunan negatif yüklere yük orani 1.6:2 ila 1:2, tercihen 1.422 ila 1.122,dir; veya (iii) 822 ila 3z7, tercihen 7:3 ila 525 molar oraninda DOTAP ve DOPE, burada DOTAPWa bulunan pozitif yüklerin RNA,da bulunan negatif yüklere yük orani 1.622 ila 1:2, tercihen 1.422 ila 1.1:2`dir. Tercihen burada açiklanan nanopartiküller, sifir agregasyon, çökelme veya boyut artisi ve dinamik isik saçilmasi yoluyla ölçüldügü üzere %303dan daha fazla polidispersite indeksi gerçeklesmesi bakimindan en az 2 saat koloidal bir sekilde stabildir. Bir düzenlemede nanopartiküllerin zeta potansiyeli -5 veya daha az, -10 veya daha az, -15 veya daha az, -20 veya daha az veya -25 veya daha azdir. Çesitli düzenlemede nanopartiküllerin zeta potansiyeli -35 veya daha yüksek, -30 veya daha yüksek veya -25 veya yüksektir. Bir düzenlemede nanopartiküller, 0 mV ila - 50 mV, tercihen 0 mV ila -40 mV veya -10 mV ila -30 mV arasinda bir zeta potansiyeline sahiptir. Katyonik lipid, inonokatyonik veya polikatyonik olabilir. Herhangi bir katyonik amfifilik molekül, örnegin en az bir hidrofilik ve lipofilik kisim içeren bir molekül, mevcut bulus anlami içerisinde bir katyonik lipiddir. Nötral yardimci lipid, nötral lipidler ile benzerlikleri olmayan bir fosfolipid gibi bir nötral lipid veya bir nötral lipid analogu veya tamamen sentetik lipid veya lipid benzeri moleküldür. Bir düzenlemede katyonik lipid ve/veya nötral yardimci lipid iki katman olusturan bir lipiddir. Çesitli düzenlemelerde lipidler, mannoz, histidin ve/veya imidazol ile fonksiyonelize edilen gibi fonksiyonelize edilmez, nanopartiküller mannoz ile fonksiyonelize edilen lipidler gibi bir hedefleme ligandi içermez ve/veya nanopartiküller asagidakilerin bir veya daha fazlasini içermez: pH bagimli bilesikler, katyonik polimerler örnegin histidin ve/Veya polilisin içeren polimerler, burada polimerler istege bagli olarak PEGile edilmis ve/veya histidile edilmis veya Ca2+ gibi iki degerlikli iyonlar olabilir. Bir düzenlemede nanopartiküller, 50 nm ila 1000 nm, tercihen 50 nm ila 400 nm, tercihen 100 nm ila 300 nm örnegin 150 nm ila 200 nm araliginda ortalama bir çapa sahiptir. Bir düzenlemede nanopartiküller 200 ila 700 nm, 200 ila 600 nm, tercihen 250 ila 550 nm, özellikle 300 ila 500 nm veya 200 ila 400 nm araliginda bir çapa sahiptir. Bir düzenlemede dinamik isik saçilmasi ile ölçüldügü üzere burada açiklanan nanopartiküllerin polidispersite indeksi, 0.5 veya daha az, tercihen 0.4 veya daha az veya hatta daha çok tercihen 0.3 veya daha azdir. Bulusa göre olmayan bir düzenlemede burada açiklanan nanopartiküller asagidaki islemlerin bir veya daha fazlasi ile elde edilebilir: (i) aköz bir fazdaki RNA ile aköz bir fazdaki lipozomlarin inkübasyonu, (ii) aköz solüsyondaki RNA ile, etanol gibi organik, su ile karisabilen bir solvent içerisinde çözünen lipid inkübasyonu, (iii) revers fazli buharlasma teknigi, (iv) ürünün dondurulmasi ve tavlanmasi, (v) ürünün dehidrasyonu ve rehidrasyonu, (vi) ürünün liyofilizasyonu ve rehidrasyonu veya (Vii) ürünün püskürterek kurutulmasi ve rehidrasyonu. Bulusa göre olmayan bir düzenlemede nanopartiküller, söz konusu nanopartiküllere yerlestirme isleminden önce tercihen 0.1 mM ila 5 mM örnegin 0.1 mM ila 4 mM veya 0.3 mM ila 1 Mm arasinda bir konsantrasyonda iki degerlikli katyonlar ile RNA'nin inkübe edilmesi adimini içeren bir proses ile ve/veya söz konusu nanopartiküllere yerlestirme isleminden önce tercihen l mM ila 500 mM örnegin 100 mM ila 200 mM veya 130 mM ila 170 mM arasindaki bir konsantrasyonda tek degerlikli iyonlar ile RNA"nin inkübe edilmesi ile ve/veya söz konusu nanopartiküllere yerlestirme isleminden önce tamponlar ile RNAinin inkübe edilmesi ile üretilir. Bulusa göre olmayan bir düzenlemede iki degerlikli katyonlarin RNA,ya inkübasyonundan sonra en azindan 1.5"ten daha fazla bir faktör, tercihen 27den daha fazla bir faktör ile veya 5"ten daha fazla bir faktör ile lipozoinlar ve/Veya diger aköz fazlarin eklenmesi ile bir dilüsyon adimi dahil edilir. Bir düzenlemede iki degerlikli katyonlar kalsiyum iyonlaridir, burada söz konusu kalsiyum iyonlarinin nihai konsantrasyonu 4 mM"den daha az, tercihen 3 mM,den daha az ve hatta daha çok tercihen 2.2 mM veya daha azdir. Bulusa göre olmayan bir düzenlemede burada açiklanan nanopartiküller, nanopartikülleri ekstrüde edilmesi adimini ve/veya filtrasyon adimini ve/veya liyofilize edilme adimini içeren bir proses ile üretilir. Bir düzenlemede nanopartiküllerin sistemik uygulamasindan sonra dalakta RNA ifadesi meydana gelir. Bir düzenlemede nanopartiküllerin sistemik uygulamasindan sonra akciger ve/veya karacigerde sifir veya esas olarak sifir RNA ifadesi meydana gelir. Bir düzenlemede nanopartiküllerin sistemik uygulamasindan sonra dalaktaki RNA ifadesi akcigerdeki RNA ifadesi miktarinin en az 5 kati, tercihen en az 8 kati, tercihen en az 10 kati, tercihen en az 20 kati, tercihen en az 50 kati, tercihen en az 100 kati, tercihen en az 1000 kati veya hatta daha fazlasidir. Bir düzenlemede nanopartiküllerin sistemik uygulamasindan sonra tercihen dalaktaki profesyonel antijen sunan hücreler olmak üzere antijen sunan hücrelerdeki RNA ifadesi meydana gelir. Sistemik olarak uygulandiginda nanopartiküller, dalakta hedeflenir veya birikir. Özellikle sistemik olarak uygulandiginda nanopartiküller, RNA'yi dalaktaki dendritik hücreler ve/veya makrofajlar gibi profesyonel antijen sunan hücrelere dagitir. Tercihen nanopartiküller, hedef organ veya dokuda RNA salgilar ve/veya hedef organ veya dokuda hücrelere girer, burada hedef organ veya doku dalaktir ve hedef organ veya dokudaki hücreler, dendritik hücreler gibi profesyonel antijen sunan hücrelerdir. Bir düzenlemede sistemik olarak uygulandiginda nanopartiküller akciger vc/veya karacigerde hedeflenmez veya birikmez veya esas olarak hedeflenmez veya birikmez. Bir düzenlemede dalakta hedeflenen veya biriken nanopartiküllerin miktari, akcigerde hedeflenen veya biriken miktarin en az 5 kati, tercihen en az 8 kati, tercihen en az 10 kati, tercihen en az 20 kati, tercihen en az 50 kati, tercihen en az 100 kati, tercihen en az 1000 kati veya hatta daha fazlasidir. Bulusa göre sistemik uygulama tercihen parenteral uygulama, tercihe intravenöz uygulama, subkütanöz uygulama, intradermal uygulama veya intraarteriyel uygulamadir. Bulusun farmasötik bilesimi ayrica bir veya daha fazla farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici, seyreltici ve/veya eksipiyan içerebilir. Bulusun farmasötik bilesimi ayrica en az bir adjuvan içerebilir. Bulusun farmasötik bilesimi sistemik uygulama için formüle edilebilir. Bulusun farmasötik bilesimi, bir immün yanitin, özellikle hastalik iliskili bir antijene veya hastalik ile iliskili bir antijeni ifade eden hücrelere karsi bir immün yanitin, örnegin kansere karsi bir immün yanitin indüklenmesine yönelik kullanilabilir. Buna uygun olarak farmasötik bilesim, kanser gibi hastalik ile iliskili bir antijen veya hastalik ile iliskili bir antijeni ifade eden hücreleri içeren bir hastaligin profilaktik ve/veya terapötik tedavisine yönelik kullanilabilir. Tercihen Söz konusu immün yanit, bir T hücre yanitidir. Bir düzenlemede hastalik iliskili antijen bir tümör antijenidir. Bir düzenlemede burada açiklanan nanopartiküllerde bulunan RNA, psödoüridin kalintilari içermez ve tercihen modifiye edilmis nükleozidleri içermez. Mevcut bulusun diger özellikleri ve avantajlari, asagidaki detayli açiklama ve istemlerden görünür olacaktir. Bulusun detayli açiklamasi Mevcut bulus, asagida detayli sekilde açiklanmasina ragmen bu bulusun, degiskenlik gösterebilmeleri nedeniyle burada açiklanan degiskenlik belirli metodolojiler, protokoller ve reaktitler ile sinirlandirilmadigi anlasilacaktir. Ayrica burada kullanilan terminolojinin, sadece belirli düzenlemeleri açiklama amacina yönelik oldugu ve sadece ekli istemler ile sinirlandirilacak mevcut bulus kapsamini sinirlandirmasi tasarlanmadigi anlasilacaktir. Aksi belirtilmedikçe burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler, teknikte uzman bir kisi tarafindan yaygin sekilde anlasilan ile ayni anlama sahiptir. Asagida mevcut bulus ait elemanlar açiklanacaktir. Tercihen burada kullanilan terimler, "A multilingual glossary of biotechnological terms: (lUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel ve H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Isviçre"de açiklanan sekilde tanimlanir. Mevcut bulus uygulamasi, aksi belirtilmedikçe, alandaki literatürde açiklanan biyokimya, hücre biyolojisi, immünoloji ve rekombinant DNA tekniklerinin klasik yöntemlerini kullanacaktir (karsilastiriniz örnegin, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989). Bu tarifnamede ve asagida yer alan istemlerde baglam aksini gerektirmedikçe "içerirler" kelimesi ve "içerir" ve "içeren" gibi varyasyonlarin, belirtilen üye, tamsayi veya adimin veya üye, tamsayi veya adim grubunun dahil edildigini ancak bazi düzenlemelerde bu tür diger üye, tamsayi veya adimin veya üye, tamsayi veya adim grubunun hariç birakilabilmesine ragmen diger herhangi bir üye, tamsayi veya adimin veya üye, tamsayi veya adim grubunun hariç birakilmadigini belirttigi anlasilacaktir, yani söz konusu konu, belirtilen bir üye, tamsayi veya adimin veya üye, tamsayi veya adim grubunun eklenmesinden olusur. "Bir" ve "tek" ve "bu" terimleri ve bulusun açiklanmasi baglaminda (özellikle istemler baglaminda) kullanilan benzer referans, burada aksi belirtilmedikçe veya içerik tarafindan aksi net bir sekilde belirtilmedikçe tekil ve çogulu da kapsayacak sekilde yorumlanacaktir. Burada degerlerin araliklarina iliskin açiklamalarin sadece, bu aralik içinde yer alan her ayri degere ayri olarak refere edilmesine yönelik kisa bir yöntem olarak görev yapmasi tasarlanir. Burada aksi belirtilmedikçe her ayri deger burada ayri olarak belirtilmis gibi spesifikasyona dahil edilir. Burada açiklanan tüm yöntemler, burada aksi belirtilmedikçe veya içerik tarafindan aksi net bir sekilde belirtilmedikçe uygun olan herhangi bir sirada gerçeklestirilebilir. Burada saglanan herhangi bir ve tüin örneklerin veya örnek niteligindeki dilin (örnegin "gibi") kullanimi sadece bulusun daha iyi açiklanmasina yöneliktir ve baska sekilde talep edilen bulus kapsami için bir sinirlandirma olusturmaz. Tarifnamedeki herhangi bir dil, bulusun uygulanmasi için önemli olan istemlerde bahsedilmemis herhangi bir elemani belirtecek sekilde yorumlanmamalidir. Mevcut bulus, uygulama üzerine kanser hücreleri gibi bir hastalik ile iliskili antijene veya hastalik ile iliskili bir antijeni ifade eden hücrelere yönelik özellikle hücresel bir immün yaniti olmak üzere bir immün yaniti indükleyen ajanlari ve bilesimleri açiklar. Özellikle, mevcut bulus hastalik ile iliskili antijene veya hastalik ile iliskili antijeni ifade eden hücrelere karsi özellikle bir T hücre yaniti olmak üzere bir immün yanitini indükleyen antijenik proteinler veya peptitleri (ayrica burada "antijen" olarak adlandirilir) kodlayan RNA"nin kullanimini kapsar. Bu antijen proteinleri veya peptitleri, hastalik ile iliskili antijenin veya bir veya daha fazla fragmaninin dizisine esas olarak karsilik gelen veya bunun ile ayni bir dizi içerebilir. Bir düzenlemede antijenik protein veya peptit, hastalik ile iliskili antijenden türetilen bir MHC ile sunulan peptit dizisini içerir. MHC sinif 1 ve sinif ll peptitleri gibi RNA kodlayici intakt veya büyük ölçüde intakt hastalik ile iliskili antijen veya fragmanlari ile immünizasyon, bir MHC sinif 1 ve/Veya sinif ll tipi yanitin ortaya çikartilmasi ve dolayisiyla hastalikli hücreleri ve/veya CD4+ T hücrelerini parçalayabilen CD8+ sitotoksik T lenfositler gibi T hücrelerinin uyarilmasini mümkün hale getirir. Bu tür immünizasyon ayrica antijene karsi antikorlarin üretimi ile sonuçlanan hümoral bir iininün yanitini (B hücre yanitini) ortaya çikarabilir. Buna uygun olarak mevcut bulusa ait farmasötik bilesim, genetik asilamada kullanilabilir, burada bir immün yaniti bir özneye bir antijenik protein veya peptidi kodlayan uygun bir RNA molekülünün yerlestirilmesi ile uyarilir. Burada açiklanan ajanlar ve bilesimler, burada açiklanan bir hastalik gibi bir hastaligin tedavisi veya önlenmesine yönelik terapötik veya profilaktik bir asi olarak kullanilabilir. Bir düzenlemede hastalik ile iliskili bir antijen bir tümör antijenidir. Bu düzenlemede burada açiklanan ajanlar ve bilesimler, kanser veya kanser metastazinin tedavi edilmesinde faydalidir. Tercihen hastalikli organ veya doku, hastalik ile iliskili bir antijeni ifade eden ve tercihen MHC molekülleri baglaminda hastalik ile iliskili antijeni sunan kanser hücreleri gibi hastalikli hücreler ile karakterize edilir. "Immün yanit" terimi, bir antijene veya bir antijeni ifade eden bir hücreye karsi entegre vücut yanitina refere eder ve tercihen, hücresel immün yanita veya hücresel ve hümoral immün yanita refere eder. Immün yanit, koruyucu/önleyici/profilaktik ve/veya terapötik olabilir. "Immün yanitin indüklenmesi", indüksiyon öncesinde özel bir antijene veya bir antij eni ifade eden bir hücreye karsi immün yanitin olmadigi anlamina gelir ancak ayni zamanda indüksiyon öncesinde özel bir antijene veya bir antijeni ifade eden bir hücreye karsi belirli seviyede immün yanit oldugu anlamina gelir ve indüksiyondan sonra söz konusu immün yanit arttirilir. Dolayisiyla "immün yanitin indüklenmesi", ayni zamanda "immün yanitin arttirilmasini" içerir. Tercihen bir öznede immün yanitin indüklenmesinden sonra söz konusu öznenin, enfeksiyöz bir hastalik veya bir kanser hastaligi gibi bir hastaligi gelistirmesi engellenir veya hastalik durumu, immün yanitin indüklenmesi ile iyilestirilir. Örnegin Viral bir antijene karsi immün yanit, Viral bir hastaliga sahip bir hastada veya viral hastalik gelistirme riski tasiyan bir öznede indüklenebilir. Örnegin bir tümör antijenine karsi immün yanit, bir kanser hastaligina sahip bir hastada veya bir kanser hastaligi gelistirme riski tasiyan bir öznede indüklenebilir. Bu durumda immün yanitin indüklenmesi, öznenin hastalik durumunun iyilestirildigi, öznenin metastazlar gelistirmedigi veya bir kanser hastaligi gelistirme riski tasiyan öznenin, kanser hastaligi gelistirmedigi anlamina gelebilir. "Hücresel immün yanit", "hücresel yanit", "bir antijene karsi hücresel yanit" veya benzer bir terim, sinif I veya sinif II MHC ile bir antijenin sunulmasi ile karakterize edilen ve bir antijeni ifade eden hücrelere yönlendirilmis hücresel yaniti içerir. Hücresel yanit, "yardimcilar" veya "öldürücüler" olarak görev yapan T hücreleri veya T lenfositler olarak adlandirilan hücreler ile ilgilidir. Yardimci T hücreler (ayni zamanda CD4+ T hücreler olarak adlandirilir), immün yaniti düzenleyerek merkezi bir rol oynar ve öldürücü hücreler (ayni zamanda sitotoksik T hücreler, sitolitik T hücreler, CD8+ T hücreler veya CTLller olarak adlandirilir), daha fazla hastalikli hücrenin üretilmesini önleyerek enfekte hücreler veya kanser hücreleri gibi hastalikli hücreleri öldürür. Tercih edilen düzenlemelerde mevcut bulus, bir veya daha fazla tümör antijenini ifade eden ve tercihen sinif I MHC ile bu tür tümör antijenlerini sunan kanser hücrelerine karsi bir anti-tümör CTL yanitinin stimülasyonunu içerir. Mevcut bulusa göre "antijen" terimi herhangi bir molekülü, tercihen bir peptidi veya proteini içerir, bu bir immün yaniti ortaya çikaracak en az bir epitop içerir ve/veya buna bir immün yaniti yönlendirilir. Tercihen mevcut bulus baglaminda bir antijen, istege bagli olarak islemeden sonra, tercihen antijene veya antijeni ifade eden hücrelere spesifik olan bir immün yaniti indükleyen bir moleküldür. Özellikle bir "antijen", istege bagli olarak islemeden sonra, MHC molekülleri tarafindan sunulan ve T lenfositleri (T hücreleri) ile spesifik olarak reaksiyona giren bir molekül ile ilgilidir. Dolayisiyla bir antijen veya fragmanlari, bir T hücre reseptörü tarafindan taninabilir olmalidir. Tercihen bir T hücre reseptör tarafindan taninmasi halinde antijen veya fragman, uygun es-uyarici sinyaller varliginda antijeni veya fragmani spesifik olarak tanimlayan T hücre reseptörü tasiyan T hücrenin klonal genislemesini indükleyebilir. Mevcut bulusun düzenlemeleri baglaminda antijen veya fragman tercihen bir hücre tarafindan, tercihen MHC molekülleri baglaminda bir antij en sunan hücre ve/veya hastalikli bir hücre tarafindan sunulur, bu antijene veya antij en ifade eden hücrelere karsi bir immün yaniti ile sonuçlanir. Mevcut bulusa göre bir immün yanit için bir aday olan uygun herhangi bir antijen düsünülür, burada immün yanit tercihen hücresel bir immün yanittir. Bir antijen tercihen, dogal olarak görülen bir antijene karsilik gelen veya bundan elde edilen bir üründür. Bu tür dogal olarak görülen antijenler, alerjenler, virüsler, bakteriler, mantarlar, parazitler ve diger enfeksiyöz ajanlar ve patojenleri içerebilir veya bunlardan elde edilebilir veya bir antijen ayni zamanda, tümör ile iliskili bir antijen olabilir. Mevcut bulusa göre bir antijen, dogal olarak görülen bir ürüne, örnegin viral protein veya bir parçasina karsilik gelebilir. "Patojen" terimi patojenik mikroorganizmalar ile ilgilidir ve virüsler, bakteriler, mantarlar, tek hücreli organizmalar ve parazitleri içerir. Patojenik virüslere yönelik örnekler insan immünyetmezlik virüsü (HIV), sitomegalovirüs (CMV), herpes virüsü (HSV), hepatit A-virüsü (HAV), HBV, HCV, papilloma virüsü ve insan T-lenfotropik virüsdür (HT'LV). Tek hücreli organizmalar plazmodyum, tripanosom, amoeba, vb. içerir. "Hastalik ile iliskili antijen" terimi, patolojik öneme sahip tüm antijenlere refere eder ve "tümör antijenlerini" içerir. Bulusa göre MHC molekülleri baglaminda bir hastalik iliskili antijene veya hastalik ile iliskili bir antijeni ifade eden ve tercihen hastalik iliskili bir antijeni sunan hücrelere bir immün yanitin indüklenmesi istenir. Tercihen hastalik iliskili bir antijen dogal olarak görülen bir antijendir. Bir düzenlemede hastalik ile iliskili bir antijen, hastalikli bir hücrede ifade edilir ve tercihen hücrenin MHC molekülleri tarafindan sunulur. Burada açiklanan nanopartiküllerde bulunan RNA tarafindan kodlanan bir antijen, hedeflenecek hastalik iliskili antijene veya hedeflenecek hastalik iliskili antijeni ifade eden hücrelere yönlendirilen bir immün yaniti indüklemelidir. Dolayisiyla burada açiklanan nanopartiküllerde bulunan RNA tarafindan kodlanan bir antijen, hastalik ile iliskili antijenin bir veya daha fazla MHC baglanma peptitleri gibi hastalik ile iliskili bir antijene veya bir veya daha fazla immünojenik fragmana karsilik gelebilir veya bunlari içerebilir. Dolayisiyla burada açiklanan nanopartiküllerde bulunan RNA tarafindan kodlanan antijen bir rekombinant antij en olabilir. Mevcut bulus baglaminda "rekombinant" terimi, "genetik mühendislik yoluyla yapilmis" anlamina gelir. Tercihen mevcut bulus baglaminda rekombinant bir nükleik asit gibi bir "rekombinant nesne" dogal olarak meydana gelmez. Burada kullanildigi üzere "dogal olarak görülen" terimi, bir nesnenin dogada bulunabilmesi durumuna refere eder. Örnegin bir organizmada (virüsler de dahil) bulunan ve dogadaki bir kaynaktan izole edilebilen ve laboratuvarda insan eliyle kasitli olarak modifiye edilmemis olan bir peptit veya nükleik asit, dogal olarak görülür. Tercih edilen bir düzenlemede bir antijen, bir tümör antijeni, diger bir ifadeyle özellikle primer olarak hücre içinde veya kanser hücreleri üzerinde yüzey antijenleri olarak meydana gelenler olmak üzere sitoplazma, hücre yüzeyi veya hücre çekirdeginden türetilebilen bir kanser hücresinde ifade edilen bir protein veya peptit gibi kanser hücrelerinin bir bileseni olabilir. Örnegin tümör antijenleri karsinoembriyonel antijen, dl-fetoprotein, izoferritin ve fötal sülfoglikoprotein, dZ-H-ferroprotein ve y-fetoprotein içerir. Mevcut bulusa göre bir tümör antijeni tercihen, tümör veya kanser hücrelerinin yani sira tümörler veya kanserler için ifade seviyesi ve/veya tipine göre ifade edilen ve istege bagli olarak karakteristik olan herhangi bir antijeni içerir. Mevcut bulus baglaminda "tümör antijeni" veya "tümör ile iliskili antijen" terimleri tercihen normal kosullar altinda spesifik gelisim asamalarinda veya sinirli sayida doku ve/veya organda spesifik olarak ifade edilen proteinler ile ilgilidir, örnegin tümör ile iliskili antijen, normal kosullar altinda mide dokusunda, tercihan gastrik mukozada, üreme organlarinda örnegin testiste, trofoblastik dokuda örnegin plasentada veya germ hatti hücrelerinde ifade edilebilir ve bir veya daha fazla tümör veya kanser dokusunda ifade edilir veya anormal olarak ifade edilir. Bu baglamda "sinirli sayi" tercihen 3,ten fazla olmayan, daha çok tercih edildigi üzere 2 veya l,den fazla olmayan anlamina gelir. Mevcut bulus baglaminda tümör antijenleri, örnegin farklilasma antijenleri, tercihen hücre türüne spesifik farklilasma antijenleri, yani, normal kosullar altinda belirli farklilasma asamasinda belirli bir hücre türünde spesifik olarak ifade edilen proteinleri, kanser/testis antijenlerini yani, normal kosullar altinda spesifik olarak testiste ve bazen plasentada ifade edilen proteinleri ve germ hattina spesifik antijenleri içerir. Mevcut bulus baglaminda tümör antijeni tercihen normal dokularda hiç ifade edilmez veya sadece nadir olarak ifade edilir. Tercihen tümör antijeni veya tümör antijeninin anormal ifadesi, kanser hücrelerini tanimlar. Mevcut bulus baglaminda bir öznede örnegin bir kanser hastaligindan sikayet eden bir hastada bir kanser hücresi tarafindan ifade edilen tümör antijeni tercihen söz konusu öznedeki öz-proteindir. Tercih edilen düzenlemelerde mevcut bulus baglaminda tümör ile iliskili antijen, normal kosullar altinda spesifik olarak önemli olmayan bir dokuda veya organda yani, immün sistem tarafindan hasara ugratildiginda öznenin ölümüne neden olmayan dokularda veya organlarda veya immün sistemin erisemedigi veya zor erisebildigi vücut organlarinda veya yapilarinda ifade edilir. Tercihen, tümör antijeninin amino asit dizisi, normal dokularda ifade edilen tümör antijeni ile kanserli dokularda ifade edilen tümör antijeni arasinda aynidir. Tercihen bir tümör antijeni, ifade edildigi kanser hücresi tarafindan sunulur. Mevcut bulusta faydali olabilen tümör antijenlerine yönelik örnekler p53, ART-4, BAGE, beta-katenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-l, CASP-S, CDC27/m, CDK4/m, CEA, klaudin familyasinin hücre yüzeyi proteinleri, örnegin CLAUDIN-Ö, CLAUDIN-18.2 ve CLAUDlN-IZ, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELFZM, ETV6- AMLI, G250, GAGE, GnT-V, GaplOO, HAGE, HER-Z/neu, HPV-E7, HPV-Bö, HAST-Z, hTERT (veya hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, tercihen MAGE- Al, MAGE-AZ, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-AS, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-AS, MAGE-A9, MAGE-AlO, MAGE-Al 1, veya MAGE-AIZ, MAGE-B, MAGE-C, MART-l/Melan-A, MClR, Miyosin/m, MUCl, MUM-l, -2, -3, NA88-A, NFl, NY-ESO-l, NY-BR-l, pl90 minor BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, proteinaz. 3, PSA, PSM, RAGE, RUl veya RU2, SAGE, SART-l veya SART-3, SCGB3A2, SCPl, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AMLI, TPl/m, TRP-l, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE ve WT, tercihen WT-1,dir. "Epitop" terimi, bir antijen gibi bir moleküldeki antijenik bir belirleyiciye, diger bir ifadeyle özellikle MHC molekülleri baglaminda sunuldugunda örnegin bir T hücresi tarafindan bilinen immün sistemi tarafindan bilinen molekül fragmanina veya buradaki bir parçaya refere eder. Bir tüinör antijeni gibi bir protein epitopu tercihen söz konusu proteinin sürekli veya süreksiz bir kismini içerir ve uzunluk bakiminda tercihen 5 ile 100 arasinda, tercihen 5 ile 50 arasinda, daha çok tercihen 8 ila 30 arasinda, en çok tercih edildigi üzere 10 ile 25 arasinda amino asit içerir, örnegin epitop tercihen uzunluk bakimindan 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 veya 25 amino asit olabilir. Mevcut bulus baglaminda epitopun bir T hücre epitopu olmasi özellikle tercih edilir. Bulusa göre bir epitop, bir hücre yüzeyi üzerindeki MHC molekülleri gibi MHC moleküllerine baglanabilir ve dolayisiyla bir "MHC baglama peptidi" olabilir. "MHC baglama peptidi" terimi, bir MHC sinif I ve/veya bir MHC Sinif II molekülüne baglanan bir peptit ile ilgilidir. Sinif I MHC/peptit koinpleksleri durumunda daha uzun veya daha kisa peptitler etkili olabilmesine ragmen baglama peptitleri tipik olarak 8-10 amino asit uzunlugundadir. Sinif 11 MHC/peptit kompleksleri durumunda daha uzun ve daha kisa peptitler etkili olabilirken baglama peptitleri tipik olarak 10-25 ainino asit uzunlugunda ve özellikle 13-18 amino asit uzunlugundadir. Bulusa göre burada açiklanan nanopartiküller içinde bulunan RNA tarafindan kodlanan bir antijen, tercihen bir MHC baglanma peptidi olan bir hastalik iliskili antijenin (ayrica burada antijen peptidi olarak adlandirilir) bir peptit fragmani gibi bir hastalik iliskili antijenin bir immünojenik fragmanini içerebilir. Bulusa göre "bir antijenin immünojenik fragmani" tercihen bir iminün yaniti, tercihen antijene veya antijeni ifade eden ve tercihen hastalikli hücreler, özellikle kanser hücreleri gibi antijeni sunan hücrelere karsi hücresel bir yaniti uyarabilen bir antijen parçasi veya fragmani ile ilgilidir. Tercihen bir antijenin bir iminünojenik fragmani, sinif I MHC ile bir antijenin sunulmasi yoluyla karakterize edilen bir hücreye karsi hücresel bir yaniti uyarabilir ve tercihen bir antijene yanit veren CTL°yi uyarabilir. Tercihen, özellikle MHC molekülleri baglaminda sunulmasi halinde bir T hücre reseptörü tarafindan taninan (diger bir ifadeyle spesifik olarak bagli) bir antijenin bir parçasidir. Tercih edilen belirli iminünojenik fragmanlar, bir MHC sinif I veya sinif II molekülüne baglanir. Burada kullanildigi üzere bir immünojenik fragmanin, bu tür baglanmanin teknikte bilinen herhangi bir yöntem kullanilarak saptanabilir olmasi halinde bir MHC sinifl veya sinif 11 molekülüne "baglandigi" söylenir. Tercihen bulusa göre bir antijenin bir immünojenik fragmani bir MHC sinif I ve/veya sinif H ile sunulan peptittir veya bir MHC sinif I ve/veya sinif II ile sunulan peptidi üretmek üzere islenebilir. Tercihen bir antijenin immünojenik bir fragmani, bir antijen fragmaninin amino asit dizisine büyük ölçüde karsilik gelen ve tercihen bunun ile ayni olan bir amino asit dizisini içerir. Tercihen bir antijenin söz konusu fragmani bir MHC sinif I ve/veya sinif II ile sunulan peptittir. Bir peptidin dogrudan diger bir ifadeyle isleme olmaksizin, özellikle klevaj olmaksizin sunulmasi halinde bu, özellikle bir sinif 1 MHC molekülü olmak üzere bir MHC molekülüne baglanma için uygun olan bir uzunluga sahiptir ve tercihen 7-20 amino asit uzunlugunda, daha çok tercihen 7-12 amino asit uzunlugunda, daha çok tercihen 8-11 amino asit uzunlugunda, özellikle 9 veya 10 amino asit uzunlugundadir. Bir peptidin ek dizileri içeren büyük bir maddenin, örnegin bir polipeptidin parçasi olmasi halinde ve islemeyi takiben, özellikle klevaji takiben sunulmasi halinde isleme yoluyla üretilen peptit, özellikle bir sinif I MHC molekülü olmak üzere bir MHC molekülüne baglanma için uygun olan bir uzunluga sahiptir ve tercihen 7-20 amino asit uzunlugunda, daha çok tercihen 7-12 amino asit uzunlugunda, daha çok tercihen 8-11 amino asit uzunlugunda, özellikle 9 veya 10 amino asit uzunlugundadir. Tercihen islemeyi takiben sunulacak peptit dizisi, bir antijenin amino asit dizisinden türetilir, diger bir ifadeyle dizisi bir antijenin bir fragmanina büyük ölçüde karsilik gelir ve tercihen bunun ile tercihen tainamen aynidir. Dolayisiyla burada açiklanan nanopartiküllerde bulunan RNA tarafindan kodlanan bir antij en, hastalik ile iliskili bir antijenin MHC ile sunulan bir fragmanina büyük ölçüde karsilik gelen ve tercihen bunun ile tamamen ayni olan ve islemeyi takiben sunulan bir peptidi olusturan 7-20 amino asit uzunlugunda, daha çok tercihen 7-12 amino asit uzunlugunda, daha çok tercihen 8-11 amino asit uzunlugunda, özellikle 9 veya 10 amino asit uzunlugunda bir dizi içerir. Sinifl MHC tarafindan sunulan bir peptit dizisine büyük ölçüde karsilik gelen amino asit dizilerine sahip peptitler, sinif 1 MHC tarafindan sunuldugu üzere peptidin TCR taninmasi için veya MHCSye peptit baglanmasi için önemli olmayan bir veya daha fazla kalintida farklilik gösterebilir. Bu tür büyük ölçüde karsilik gelen peptitler ayrica istenilen spesifiklige sahip CTUyi uyarabilir ve immünolojik olarak esdeger oldugu düsünülebilir. MHC tarafindan sunuldugunda bir peptit, bir T hücre reseptörü tarafindan taninabilir olmalidir. Tercihen bir T hücre reseptörü tarafindan taninmasi halinde sunulan peptit, uygun es-uyarici sinyaller varliginda sunulan peptidi spesifik olarak taniyan T hücre reseptörünü tasiyan T hücrenin klonal genislemesini indükleyebilir. Tercihen antijen peptitleri, özellikle MHC molekülleri baglaminda sunulmasi halinde, bir immün yaniti, tercihen bunlarin türetildigi antijene veya antijeni ifade eden ve tercihen antijeni sunan hücrelere karsi hücresel bir yaniti uyarabilir. Tercihen bir antijen peptidi, sinif 1 MHC ile antijeni sunan bir hücreye karsi hücresel bir yaniti uyarabilir ve tercihen antijene yanit veren bir CTL°yi uyarabilir. Bu tür bir hücre tercihen bulus amaçlarina yönelik bir hedef hücredir. "Hedef hücre", hücresel bir immün yanit gibi bir immün yanit için bir hedef olan bir hücre anlamina gelir. Hedef hücreler, hastalik ile iliskili bir antijen gibi bir antijeni ifade eden ve tercihen söz konusu antijeni sunan hücreleri içerir (bu, özellikle, antijenin hücrelerde islendigi ve antijenin bir veya daha fazla fragmaninm hücreler üzerinde MHC molekülleri baglaminda sunuldugu anlamina gelir). Hedef hücreler, enfekte olmus bir hücre veya kanser hücresi gibi istenmeyen herhangi bir hücreyi içerir. Tercih edilen düzenlemeler hedef hücre, burada açiklanan bir antijeni ifade eden ve tercihen sinif I MHC ile söz konusu antij eni sunan bir hücredir. "Antijen isleme", bir antijenin söz konusu antijenin fragmanlari olan, isleme ürünleri halinde parçalanmasina (örnegin bir proteinin peptitler halinde parçalanmasi) ve hücreler, tercihen spesifik T hücrelerine antijen sunan hücreler ile sunuma yönelik MHC molekülleri ile bu fragmanlarin bir veya daha fazlasinin birlesmesine (örnegin baglama vasitasiyla) refere eder. Bir antijen sunan hücre (APC), bunun yüzeyi üzerinde majör histokompatibilite kompleksi (MHC) baglaminda antijeni sunan, diger bir ifadeyle gösteren bir hücredir. Bu, ir antijen fragmanlarinin sadece bir veya daha fazlasinin sunuldugu durumu içerir. T hücreleri, bunlarin T hücre reseptörünün (TCR) kullanildigi bu kompleksi taniyabilir. Antijen sunan hücreler antijenleri isler ve bunlari T hücrelerine sunar. Profesyonel antijen sunan hücreler, fagositoz ile veya reseptör aracili endositozlar araciligiyla antijenin benimsenmesinde ve daha sonra bunlarin membrani üzerinde bir sinif 11 MHC molekülüne bagli antijen parçasinin gösterilmesinde oldukça etkilidir. T hücresi, antijen sunan hücrenin meinbrani üzerinde antijen-sinif ll MHC molekül kompleksini tanir ve bunun ile etkilesime girer. Ek es uyarici bir sinyal daha sonra T hücresinin aktivasyonuna neden olan antijen sunan hücre ile üretilir. Es uyarici moleküllerin ifadesi profesyonel antijen sunan hücrelerin tanimlayici bir özelligidir. Profesyonel antijen sunan hücrelerin ana türleri, antijen sunumunun en genis araligina sahip dendritik hücrelerdir ve muhtemelen en önemli antijen sunan hücreler, makrofajlar, B-hücreleri ve belirli aktive edilmis epitelyal hücrelerdir. Dendritik hücreler (DC,ler), periferik dokularda yakalanan antijenleri her iki sinif II ve I antijen sunum yolaklari vasitasiyla T hücrelerine sunan lökosit popülasyonlaridir. Dendritik hücrelerin immün yanitlarinin güçlü indükleyicileri oldugu ve bu hücrelerin aktivasyonunun anti tümöral immünitenin indüksiyonu için önemli bir adim oldugu iyi bilinir. Dendritik hücreler, iyi karakterize edilen iki fenotip arasinda ayrim yapmak üzere basit bir yol olarak kullanilabilen "olgun olmayan" ve "olgun" hücreler olarak uygun sekilde kategorize edilir. Ancak bu adlandirma tüm muhtemel farklilastirma asamalarini hariç tutacak sekilde yorumlanmamalidir. Olgun olmayan dendritik hücreler, Fcy reseptörü ve mannoz reseptörünün yüksek ifadesi ile iliskili olan antijen alimi ve islenmesine yönelik yüksek bir kapasiteye sahip antijen sunan hücreler olarak karakterize edilir. Olgun fenotip tipik olarak bu markörlerin daha düsük bir ifadesi ancak sinif 1 ve sinif ll MHC, adhezyon molekülleri (örnegin CD54 ve CD] 1) ve yardimci uyaran moleküller (örnegin, CD40, CD80, CD86 ve 4-1 BB) gibi T hücre aktivasyonundan sorumlu hücre yüzey inoleküllerinin yüksek bir ifadesi ile karakterize edilir. Dendritik hücre olgunlasmasi, olgun olmayan dendritik hücreler tolerans ile sonuçlanirken bu tür antijen sunan dendritik hücrelerin T hücre hazirlanmasina neden oldugu dendritik hücre aktivasyonunun durumu olarak refere edilir. Dendritik hücre olgunlasmasi en çok dogustan reseptörler (bakteriyel DNA, viral RNA, endotoksin, Vb), pro-inflamatuvar sitokinler (TNF, IL-l, IFNs), dendritik hücre yüzeyi üzerinde CD40L ile CD40 ligasyonu ve stresli hücre ölümü geçiren hücrelerden salgilanan maddeler ile tespit edilen mikrobiyal özellikleri olan biyomoleküllerden kaynaklanir. Dendritik hücreler granülosit-makrofaj koloni uyarici faktör (GM-CSF) ve tümor nekröz faktörü alfa gibi sitokinler ile in vitro kemik iligi hücrelerinin kültürlenmesi ile elde edilebilir. Profesyonel olmayan antijen sunan hücreler, naif T hücreleri ile etkilesim için gerekli olan MHC sinif 11 proteinlerini esas olarak ifade etmez; bunlar sadece IFNy gibi belirli sitokinler araciligiyla profesyonel olmayan antijen sunan hücrelerin stimülasyonu üzerinde ifade edilir. Antijen sunan hücreler, örnegin antijeni kodlayan bir nükleik asit, sunulacak peptidi içeren bir peptidi veya proteini kodlayan, RNA gibi nükleik asit ile hücrelerin transdüke edilmesi yoluyla MHC ile sunulan peptitler ile yüklenebilir. mRNA ile dendritik hücrelerin transfeksiyonu, güçlü antitümör immünitesinin uyarilmasina yönelik umut vaat edici antij en yükleme teknigidir. "Immünojenisite" terimi, bir antijenin nispi bir immün reaksiyonunu indükleme etkinligi ile ilgilidir. "T hücresi" ve "T lenfosit" terimleri, burada degisimli olarak kullanilir ve T yardimci hücreleri (CD4+ T hücreleri) ve sitolitik T hücrelerini içeren sitotoksik T hücrelerini (CTLWer, CD8+ T hücreleri) içerir. T hücreleri, lenfositler olarak bilinen beyaz kan hücrelerinin bir grubuna aittir ve hücre-aracili immünitede merkezi bir rol oynar. T hücresi reseptörleri (TCR) olarak adlandirilan hücre yüzeyi üzerindeki özel bir reseptörün varligi ile B hücreleri ve dogal öldürücü hücreler gibi diger lenfositlerden ayirt edilebilirler. Timüs, T hücrelerinin olgunlasmasindan sorumlu temel organdir. T hücrelerinin birkaç farkli alt kümesi kesfedilmistir, her biri ayri bir fonksiyona sahiptir. T yardimci hücreler, B hücrelerinin plazmaya olgunlasmasi ve diger fonksiyonlar arasinda sitotoksik T hücrelerinin ve makrofajlarin aktivasyonu dahil olmak üzere immünolojik proseslerde diger beyaz kan hücrelerini destekler. Bu hücreler, yüzeylerinde CD4 proteinini ifade ettiginden CD4+ T hücreleri olarak da bilinir. Yardimci T hücreleri, antijen sunan hücrelerin (APCller) yüzeyinde ifade edilen MHC sinif [1 molekülleri yoluyla peptit antijenleri ile sunuldugunda aktive edilmis hale gelir. Aktive edildiginde, hizli bir sekilde bölünürler ve aktif immün yaniti regüle eden veya destekleyen sitokinler olarak adlandirilan küçük proteinleri salgilar. Sitotoksik T hücreleri, hastalikli hücreleri, örnegin viral olarak enfekte hücreleri ve kanser hücreleri gibi enfekte hücreleri yikar ve ayrica transplant reddinde implike edilir. Bu hücreler ayrica, yüzeylerinde CD8 glikoproteini ifade ettiginden CD8+ T hücreleri olarak da bilinir. Bu hücreler, neredeyse vücudun her hücresinin yüzeyinde bulunan MHC sinif I ile baglantili antijene baglanma yoluyla hedeflerini tanirlar. T hücrelerinin çogunlugu, birkaç protein kompleksi olarak var olan bir T hücresi reseptörüne (TCR) sahiptir. Gerçek T hücresi reseptörü, bagimsiz T hücre reseptörü alfa ve beta (TCROL ve TCRß) genlerinden üretilen ve et- ve ß-TCR zincirleri olarak adlandirilan iki ayri peptit zincirinden olusur. 75 T hücreleri (gama delta T hücreleri), yüzeylerinde ayri bir T hücresi reseptörü (TCR) içeren T hücrelerinin küçük bir alt kümesini temsil eder. Ancak yö T hücrelerinde, TCR bir y-zincirinden ve bir ö-zincirinden olusturulur. T hücrelerinin bu grubu, orß T hücrelerinde daha az yaygindir (toplam T hücrelerinin %2"si). Tüm T hücreleri, kemik iligindeki heinatopoietik kök hücrelerden elde edilir. Hematopoietik kök hücrelerden elde edilen hematopoietik progenitörler, timüs popülasyonunu olusturur ve olgunlasmamis timositlerin büyük bir popülasyonunu üretmek üzere hücre bölünmesi ile genisler. En erken timositler, CD4 veya CD8 ifade etmez ve bu nedenle çift negatif (CD4-CD8-) hücreler olarak siniflandirilir. Gelisme yoluyla ilerledikçe, çift pozitif timositler (CD4+CD8+) halini alirlar ve nihai olarak timüsten periferik dokulara salinan tek pozitif (CD4+CD8- veya CD4-CD8+) timositlere olgunlasirlar. T hücrelerinin aktivasyonundaki birinci sinyal, T hücresi reseptörünün bir baska hücre üzerinde majör histokompatibilite kompleksi (MHC) ile sunulan kisa bir peptide baglanmasi ile saglanir. Bu, yalnizca bu peptide spesifik bir TCR içeren bir T hücresinin aktive edilmesini saglar. B hücreleri ve makrofajlarin önemli APC`ler olabilmesine ragmen, partner hücre genellikle, profesyonel bir antijen sunan hücre (APC), genellikle dogal yanitlar durumunda bir dendritik hücredir. MHC sinif 1 molekülleri yoluyla CD8+ T hücrelerine sunulan peptitler, uzunluk olarak 8-10 amino asittir; MHC sinif II molekülünün baglanma cebinin uçlari açik oldugundan, MHC sinif 11 molekülleri yoluyla CD4+ T hücrelerine sunulan peptitler daha uzundur. "Klonal genisleme" terimi, spesifik bir varligin çogaltildigi bir prosese refere eder. Mevcut bulus baglaminda terim tercihen immünolojik bir yanit baglaminda kullanilir burada lenfositler bir antijen tarafindan uyarilir, çogalir ve söz konusu antijeni taniyan spesifik lenfosit çogaltilir. Tercihen klonal genisleme, lenfositlerin farklilasmasina yol açar. Bulusa göre sitotoksik T lenfositleri, bir antijen veya bir antijen peptidinin in Viva antijen sunan hücrelere eklenmesi ile in vi'vo üretilebilir. Antijen veya antijen peptidi, RNA olarak sunulur. Bir fragmani ilave isleme için gereksinim olmaksizin sunulabilirken antijen, MHC molekülü için bir peptit partnerini üretmek üzere islenebilir. Sonuncusu, özellikle, bunlar MHC moleküllerine baglanabilmesi halinde geçerlidir. Ortaya çikan hücreler ilgili kompleksi sunar ve daha sonra çogalan otolog sitotoksik T lenfositler tarafindan taninir. CD4+ veya CD8+ T hücrelerinin spesifik aktivasyonu, çesitli yollarla saptanabilir. Spesifik T hücresi aktivasyonunun saptanmasina yönelik yöntemler, T hücrelerinin proliferasyonunun saptanmasini, sitokinlerin (örnegin lenfokinler) üretimini veya sitolitik aktivitenin üretilmesini içerir. CD4+ T hücreleri için spesifik T hücresi aktivasyonunun saptanmasina yönelik tercih edilen bir yöntem, T hücrelerinin proliferasyonunun saptanmasidir. CD8+ T hücreleri için, spesifik T hücresi aktivasyonunun saptanmasina yönelik tercih edilen bir yöntem sitolitik aktivite üretiminin saptanmasidir. "Majör histokompatibilite kompleksi" terini ve "MHC" kisaltmasi, MHC sinif I ve MHC sinif II moleküllerini içerir ve tüm omurgalilarda meydana gelen genlerin bir kompleksi ile ilgilidir. MHC proteinleri veya molekülleri, immün reaksiyonlardaki lenfositler ve antijen sunan hücreler veya hastalikli hücreler arasindaki sinyallemeye yönelik önemlidir, burada MHC proteinleri veya molekülleri peptitleri baglar ve T hücresi reseptörleri tarafindan taninmaya yönelik bunlari sunar. MHC yoluyla kodlanan proteinleri hücrelerin yüzeyi üzerinde ifade edilir ve bir T hücresine öz antijenleri (hücrenin kendisinden peptit parçalari) ve öz olmayan antijenleri (örnegin istila eden mikroorganizmalarin parçalari) sergiler. MHC bölgesi, sinif 1, sinif Il ve sinif III olmak üzere üç alt gruba ayrilir. MHC sinif I proteinleri, bir (Jr-zinciri ve ß2-mikr0globulin (kromozom 15 ile kodlanan MHCnin parçasi degildir) içerir. Sitotoksik hücrelere antijen parçalarini sunarlar. Birçok immün sistem hücresi üzerinde, spesifik olarak antijen sunan hücreler üzerinde MHC sinif 11 proteinleri, Ot- ve ß-zincirlerini içerir ve T-yardimci hücrelere antijen parçalarini sunar. MHC sinif III bölgesi, tamamlayici bilesenler ve sitokinleri kodlayanlar gibi diger immün bilesenleri kodlar. Insanlarda hücre yüzeyinde antijen sunan proteinleri kodlayan MHC bölgesindeki genler, insan lökosit antijen (HLA) genleri olarak refere edilir. Ancak MHC kisaltmasi, genellikle HLA gen ürünlerine refere etmek üzere kullanilir. HLA genleri, söz konusu dokuz klasik MHC genini içerir: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPAI, HLA-DPBI, HLA-DQAl, HLA-DQBl, HLA-DRA, ve HLA- DRBl. Bulusun tüm açilarinin tercih edilen bir düzenlemesinde bir immün sistem hücreleri, bir HLA molekülüdür. "Bir antijenin sunumu ile karakterize edilen hücre", "bir antij en sunan hücre", "bir hücre tarafindan sunulan antijen", "sunulan antijen" veya benzer ifadeler yoluyla, MHC molekülleri, özellikle MHC Sinif 1 molekülleri kapsaminda örnegin antijen islenmesi yoluyla bir enfekte hücre veya bir kanser hücresi gibi bir hücre, özellikle hastalikli bir hücre veya hedef hücre veya bunun ifade ettigi antijeni sunan hücreyi sunan bir antijen veya söz konusu antijenden elde edilen bir parça kastedilir, Benzer sekilde "bir antijenin sunulmasi ile karakterize edilen hastalik" terimi, özellikle sinif 1 MHC ile bir antijenin sunulmasi ile karakterize edilen hücreleri içeren bir hastalik anlamina gelir. Bir hücre yoluyla bir antijenin sunulmasi, antijeni kodlayan RNA gibi bir nükleik asit ile hücrenin transfekte edilmesi yoluyla gerçeklestirilebilir. "Immünolojik olarak esdeger" terimi, immünolojik olarak esdeger amino asit dizisi gibi immünolojik olarak esdeger molekülün, Örnegin, bir hümoral ve/veya hücresel immün yanitinin tetiklenmesi, tetiklenen immün reaksiyonun gücü ve/Veya süresi gibi immünolojik etkinin tipine veya tetiklenen immün reaksiyonunun spesifikligine göre ayni veya esasen ayni immünolojik özellikleri sergiledigi ve/veya ayni veya esasen ayni immünolojik etkileri uyguladigi anlamindadir. Mevcut bulusun baglaminda "immün efektör fonksiyonlari" terimi, bagisiklik sisteminin bilesenlerinin aracilik ettigi, örnegin, enfekte olmus hücrelerin veya kanser hücrelerinin öldürülmesiyle veya tümör diseininasyonunun ve metastazinin inhibisyonu dahil olmak üzere tümör büyümesinin inhibisyonuyla ve/Veya tümör gelisiminin inhibisyonuyla sonuçlanan herhangi bir fonksiyonu kapsar. Tercihen, mevcut bulusun baglaminda immün efektör fonksiyonlari, T hücresi aracili efektör fonksiyonlaridir. Bu fonksiyonlar, bir yardimci T hücresi (CD4+ T hücresi) durumunda, MHC sinif II molekülleri baglaminda bir antijenin veya bir antijen peptidinin T hücresi reseptörü tarafindan taninmasini, sitokinlerin salinmasini ve/veya CD8+ lenfositlerin ve/veya B-hücrelerinin (CTL°ler) aktivasyonunu ve CTL durumunda, MHC sinif I molekülleri baglaminda bir antijen veya bir antijen peptidinin T hücresi reseptörleri tarafindan taninmasini, MHC sinif I moleküllerinin baglaminda sunulan hücrelerin, yani, sinif 1 MHC7ye sahip bir antijenin sunulmasiyla, örnegin, apoptoz veya perforin-aracili hücre yikimi ile karakterize hücrelerin yok edilmesini, IFN-y ve TNF-oi gibi sitokinlerin üretilmesini ve antijen ifade eden hedef hücrelerin spesifik sitolitik öldürülmesini içerir. Bir nükleik asit, bulusa göre ribonükleik asittir (DNA), en çok tercihen in vitro transkribe edilmis RNA (IVT RNA) veya sentetik RNA`dir. Nükleik asitler bulusa göre mRNA içerir. Bir nükleik asit bulusa göre tek sarmalli veya çift sarmalli olan ve dogrusal veya bir daire olusturmak için esdeger olarak kapali olan bir molekül formunda olabilir. Bir nükleik, hücrelerin içine, örnegin bir DNA sablonundan in vitro transkripsiyon ile hazirlanabilen RNA formunda eklenmesi, yani, transfeksiyonu için kullanilabilir. RNA ayrica, stabilize edici dizilerle, basliklama ve poliadenilasyonla uygulanmadan önce modifiye edilebilir. Nükleik asitler bir vektörde içerilebilir. Burada kullanildigi sekliyle "vektör" terimi, plazmid vektörler, kozmid vektörler, lambda faji gibi faj vektörleri, adenoviral veya bakuloviral vektörler gibi viral vektörler veya bakteriyel yapay kromozomlar (BAC), maya yapay kromozomlari (YAC) veya Pl yapay kromozomlari (PAC) gibi yapay kromozom vektörleri dahil olmak üzere, teknikte uzman kisinin bildigi vektörleri içerir. Söz konusu vektörlere ifade ve ayrica klonlama vektörleri dahildir. Ifade vektörleri, plazmidlerin yani sira viral vektörleri içerir ve genellikle istenen bir kodlama dizisi ve uygun sekilde bagli kodlama dizisinin belirli bir konak organizmada (örnegin, bakteri, maya, bitki, böcek veya memeli) veya in vitro ifade sisteinlerinde ifadesi için gerekli uygun DNA dizilerini ihtiva eder. Klonlama vektörleri genellikle, belirli bir istenen DNA fragmanini islemek ve güçlendirmek için kullanilir ve istenen DNA fraginanlarinin ifadesi için gereken fonksiyonel dizilerden yoksun olabilir. Mevcut bulus baglaminda "RNA" terimi, ribonükleotid kalintilarini içeren ve tercihen tamamen veya büyük ölçüde ribonükleotid kalintilarindan olusan bir molekül ile ilgilidir. "Ribonükleotid", ß-D-ribofuranosil grubunun 2'- pozisyonunda bir hidroksil grubu olan bir nükleotid ile ilgilidir. Terim, çift sarmalli RNA,yi, tek sarmalli RNA"yi, kismen saflastirilmis RNA gibi izole RNA°yi, esasen saf RNA"y1, sentetik RNA'yi, rekombinan olarak üretilmis RNA"yi ve ayrica dogal olusumlu RNA7dan bir ya da daha fazla nükleotidin eklenmesi, silinmesi, sübstitüsyonu ve/veya degistirilmesiyle farklilik gösteren degistirilmis RNA,y1 kapsar. Bu degisimler, bir RNA7nin ucuna (uçlarina) veya dahili olarak, örnegin RNA3nin bir ya da daha fazla nükleotidinde nükleotid- olmayan materyalin eklenmesini içerebilir. RNA moleküllerindeki nükleotidler ayrica, dogal olusumlu olmayan nükleotidler veya kimyasal olarak sentezlenmis nükleotidler veya deoksiiiükleotidler gibi standart-olmayan nükleotidleri içerebilir. bu degistirilmis RNASIar analoglar veya dogal olarak olusan RNA'nm analoglari olarak refere edilebilir. Mevcut bulusa göre "RNA" terimi, "mesajci RNA" anlamina gelen "mRNA"`yi içerir ve tercihen bununla ilgilidir ve ayrica, sablon olarak DNA kullanilarak üretilen ve bir peptit ya da protein kodlayan bir "transkript" ile ilgilidir. mRNA tipik olarak bir 5' transle edilmemis bölge (5'-UTR), bir protein ya da protein kodlayan bölge ve bir 3' transle edilmemis bölge (3'-UTR) içerir. mRNA hücrelerde ve in vitro sinirli bir yarilanma ömrüne sahiptir. Tercihen, mRNA, bir DNA sablonu kullanilarak in vitro transkripsiyonla üretilir. Bulusun bir uygulamasinda RNA, in vitro transkripsiyon veya kimyasal sentez yoluyla elde edilir. In vitro transkripsiyon metodolojisi uzman kisi tarafindan bilinir. Örnegin ticari olarak temin edilebilir çesitli in vitro transkripsiyon kitleri mevcuttur. Mevcut bulusun baglaminda, "transkripsiyon" terimi, bir DNA dizisindeki genetik kodun RNA içine kopyasinin çikarildigi bir islemle ilgilidir. Akabinde, RNA proteinin içine transle edilebilir. Mevcut bulusa göre "transkripsiyon" terimi "in vitro transkripsiyonu" içerir. "In vitro transkripsiyon" terimi, RNAsnin, özellikle mRNA3nin hücresi bir sistemde, tercihen uygun hücre ekstraktlari kullanilarak in vitro sentezlendigi bir islemle ilgilidir. Tercihen, klonlayici vektörler, transkriptlerin olusturulmasi için uygulanir. Bu klonlayici vektörler genellikle, transkripsiyon vektörleri olarak atanir ve mevcut bulusa göre "vektör" terimi tarafindan kapsanir. Mevcut bulusa göre RNA, uygun bir DNA sablonunun in vitro transkripsiyonuyla elde edilebilir. Transkripsiyonun kontrol edilmesi için baslatici, herhangi bir RNA polimerazi için herhangi bir baslatici olabilir. RNA polimerazlarinin belirli örnekleri, T7, T3 ve SP6 RNA polimerazlaridir. In vitro transkripsiyon için bir DNA sablonu, bir nükleik asidin, özellikle cDNA`nin klonlanmasiyla ve bunun in vitro transkripsiyon için uygun bir vektörün içine eklenmesiyle elde edilebilir. cDNA, RNA,nin ters transkripsiyonuyla elde edilebilir. Tercihen klonlayici vektörler, genellikle atanmis transkripsiyon vektörleri olan transkriptlerin üretilmesi için kullanilir. "Ifade" terimi burada en genis anlamiyla kullanilmaktadir ve RNAinin ve/veya protein ya da peptidin üretimini içerir. RNAaya iliskin olarak, "ifade" veya "translasyon" terimi özellikle, peptitlerin veya proteinlerin üretimiyle ilgilidir. Ifade geçici veya stabil olabilir. Bulusa göre ifade terimi ayrica, bir "sapkin ifade" veya "anormal ifade" içerir. "Sapkin ifade" veya "anormal ifade", bulusa göre ifadenin, bir referansa, belirli bir proteinin, örnegin, bir tümör antijeninin sapkin veya anormal ifadesiyle iliskili bir hastaliga sahip olmayan bir öznedeki bir duruma kiyasla degistirildigi, tercihen arttirildigi anlamina gelinektedir. Ifadedeki bir artis en az %10,luk, özellikle en az %20,lik, en az %50,lik veya en az %100,lük veya daha fazla bir artisi ifade etmektedir. Bir uygulamada, ifade sadece hastalikli bir dokuda bulunabilirken, saglikli bir dokudaki ifade baskilanir. "Spesifik olarak ifade edilen" terimi, bir proteinin esasen sadece spesifik bir doku veya organda ifade edildigi anlamina gelmektedir. Örnegin, tümör antijeni spesifik olarak mide mukozasinda ifade edilir, yani, söz konusu protein öncelikle inide mukozasinda ifade edilir ve diger dokularda ifade edilmez veya diger doku veya organ tiplerinde kayda deger bir seviyede ifade edilmez. Böylelikle, yalnizca mide mukozasinin hücrelerinde ve testis gibi herhangi bir diger dokuda kayda deger sekilde az bir seviyede ifade edilen bir protein, spesifik olarak mide mukozasinin hücrelerinde ifade edilir. Bazi uygulamalarda, bir tümör antijeni de normal kosullar altinda birden fazla doku türünde veya organda, örnegin 2 ya da 3 adet doku türünde veya organinda ancak tercihen en fazla 3 farkli doku ya da organ türünde spesifik olarak ifade edilebilir. Bu durumda, tümör antijeni daha sonra bu organlarda spesifik olarak ifade edilir. Örnegin, bir tümör antij eni normal kosullar altinda, akcigerde ve midede tercihen yaklasik olarak esit seviyede ifade ediliyorsa, söz konusu tümör antijenine spesifik olarak akciger ve midede ifade edilir. "Translasyon" terimi, bulusa göre bir hücrenin ribozomlarindaki, bir protein veya peptit yapmak için mesajci RNAlnin bir sarinalinin amino asitlerin bir dizisinin toplanmasini yönettigi islemle ilgilidir. Bulusa göre "RNA kodlamasi" terimi, özellikle bir dendritik hücre olmak üzere bir antijen sunan hücre gibi, tercihen bir hücre içerisinde olmak üzere uygun çevrede bulunmasi halinde RNA7nm, kodladigi bir protein veya peptidi üretmek üzere ifade edilebildigi anlainina gelir. Bulusa göre RNA°nin stabilitesi ve translasyon etkinligi, gerektiginde modifiye edilebilir. Mevcut bulusa göre kullanildiginda RNA baglaminda "modifikasyon" terimi, söz konusu RNASda dogal olarak bulunmayan RNASnin herhangi bir modifikasyonunu içerir. Bulusun bir düzenlemede bulusa göre kullanilan RNA, baslikli olmayan 5'- trifosfatlara sahip degildir. Bu tür basliksiz 5'-trifosfatlarin uzaklastirilmasi, RNAsnin bir fosfataz ile muamele edilmesi ile gerçeklestirilebilir. Bulusa göre RNA, stabilitesini arttirmak ve/veya sitotoksisiteyi azaltmak amaciyla modifiye edilmis ribonükleotidlere sahip olabilir. Örnegin, bir düzenlemede, bulusa göre kullanilan RNA'da 5-metilsitidin kismen veya tamamen, tercihen tamamen sitidin ile sübstitüe edilir. Alternatif olarak veya ek olarak, bir düzenlemede bulusa göre kullanilan RNA"da psödoüridin kismen veya tamamen, tercihen tamamen üridin ile sübstitüe edilir. Bir düzenlemede "modifikasyon" terimi, bir 5'-basligi veya 5'-basligi analogu ile bir RNA"nin saglanmasi ile ilgilidir. "5'-basligi" terimi, bir mRNA'nin 5'-ucunda bulunan bir baslik yapisina refere eder ve genellikle olagan olmayan 5' ila 5' trifosfat bagi vasitasiyla mRNASya baglanan bir guanosin nükleotidden olusur. Bir düzenlemede bu guanosin, 7-pozisy0nunda metillenir. "Klasik 5'-basligi" terimi, dogal olarak meydana gelen RNA 5'-bas11gina, tercihen 7-metilguanosin basligina (m7G) refere eder. Mevcut bulus baglaminda "5'-basligi" terimi, RNA baslik yapisina benzeyen ve tercihen in vivo ve/Veya bir hücrede buna baglanmasi halinde RNAayi stabilize etme ve/veya RNA translasyonunu arttirma kabiliyetine sahip olmak üzere modifiye edilen bir 5'-baslik analogunu içerir. Tercihen RNASnin 5' ucu, asagidaki genel formüle sahip bir baslik yapisini içerir: HN ,. NH I o o o l ---*-`-'-'~› '" i -. --` HzN" "N" N` ...-~O-P-O PIO~P reora ,N -N- N# i 5." /O\ .'"ii I `K` , _.-^O^-i_ . .* ` ____.--" Vvl x V v_ -__ R R OH OH burada R1 ve R2 bagimsiz olarak hidroksi veya metoksidir ve W', X' ve Y` bagimsiz olarak oksijen, sülfür, selenyum veya BH3°tür. Tercih edilen bir düzenlemede R1 ve R2 hidroksidir ve W`, X' ve Y' oksijendir. Daha fazla tercih edilen bir düzenlemede R1 ve Rgiden biri, tercihen R1 hidroksidir ve digeri metoksidir ve W', X' ve Y' oksijendir. Daha fazla tercih edilen bir düzenlemede R1 ve R2 hidroksidir ve W', X' ve Y"den biri, tercihen X` sülfür, selenyum veya BH3, tercihen sülfürken digeri oksijendir. Daha fazla tercih edilen bir düzenlemede R1 ve Rglden biri, tercihen R2 hidroksidir ve digeri metoksidir ve W` , X' ve Y'"den biri, tercihen X' sülfür, selenyum veya BH3, tercihen sültîirken digeri oksij endir. Yukaridaki formülde sag taraftaki nükleotid, bunun 3' grubu yoluyla RNA zincirine baglanir. Bir RNA"nin bir 5'-basligi veya 5'-baslik analogu ile saglanmasi, söz konusu 5'- basligi veya 5'-baslik analogu varliginda bir DNA sablonunun in vitro transkripsiyonu ile gerçeklestirilebilir, burada söz konusu 5'-basligi üretilen RNA sarmalina es transkripsiyonel olarak yerlestirilir veya RNA, örnegin in vitro transkripsiyon yoluyla üretilebilir ve 5'-basligi, basliklama enzimleri, örnegin vaksinia virüsünün basliklama enzimleri kullanilarak post-transkripsiyonel olarak RNA"ya baglanabilir. RNA ilave modifikasyonlari içerebilir. Örnegin mevcut bulusta kullanilan RNA,nin ilave bir modifikasyonu dogal olarak meydana gelen poli(A( kuyrugunun bir uzantisi veya kirpilmasi veya 5'- veya 3'-transle edilmemis bölgelerin (UTR) bir degisimi örnegin söz konusu RNA"nin kodlama bölgesi ile iliskili olmayan bir UTRinin yerlestirilmesi, örnegin mevcut 3'-UTR"nin degisimi veya alfaZ-globin, alfal-globin, beta-globin, tercihen beta-globin, daha çok tercihen insan beta-globin gibi bir globin geninden türetilen bir 3'-UTR°nin bir veya daha fazla, tercihen iki kopyasinin insersiyonu olabilir. Maskelenmemis bir poli-A dizisine sahip RNA, maskelenmis bir poli-A dizisine sahip RNA,dan daha etkili bir sekilde transle edilir. ""P01i(A) kuyrugu" veya "poli-A dizisi" terimi, tipik olarak bir RNA molekülünün 3'-ucunda yer alan adenil (A) kalintilarinin bir dizisiyle ilgilidir ve "maskelenmemis poli-A dizisi", bir RNA molekülünün 3'-ucundaki poli-A dizisinin, poli-A dizisinin bir A'si ile bittigi ve poli-A dizisinin 3'-ucunda, yani, asagi yönünde yer alan A disindaki nükleotidler tarafindan izlenmedigi anlamina gelmektedir. Dahasi, yaklasik 120 baz çifti boyundaki uzun bir poli-A dizisi, RNA"nin optimal transkript stabilitesiyle ve translasyon etkililigiyle sonuçlanir. Bu nedenle, mevcut bulusa göre kullanilan RNA"nin stabilitesinin ve/veya ifadesinin arttirilmasi için, tercihen 10 ila 500 arasinda, daha tercihen 30 ila 300 arasinda, daha da tercihen 65 ila 200 arasinda ve özellikle 100 ila 150 arasinda adenosin kalintisi boyunca bir uzunluga sahip bir poli-A dizisiyle bir arada mevcut olmasi amaciyla modifiye edilebilir. Özellikle tercih edilen bir uygulamada, poli-A dizisi, yaklasik 120 adenosin kalintilik bir uzunluga sahiptir. Bulusa göre kullanilan RNA,nin stabilitesinin ve/veya ifadesinin daha da arttirilmasi için, poli-A dizisi maskelenmemis olabilir. Ek olarak, bir 3'-transle edilmemis bölgenin (UTR) bir RNA molekülünün 3'- transle edilmemis bölgesinin içine katilmasi, translasyon etkililiginde bir güçlenmeyle sonuçlanabilir. Sinerjistik bir etki, bu tip 3'-transle edilmemis bölgenin ikisinin ya da daha fazlasinin birlestirilmesiyle elde edilebilir. 3'-transle edilmemis bölgeler, eklendikleri RNA"ya otolog veya heterolog olabilir. Belirli bir uygulamada, 3'-transle edilmemis bölge, insan ß-globin geninden türetilir. Yukarida tarif edilen modifikasyonlarin, yani bir poli-A dizisinin katilmasinin, bir poli-A dizisinin maskesinin kaldirilmasinin ve bir ya da daha fazla 3'-transle edilmemis bölgenin birlestirilmesinin bir kombinasyonu, RNA°nin stabilitesi üzerinde translasyon etkililiginin arttirilmasinda sinerjistik bir etkiye sahiptir. Mevcut bulusa göre kullanilan RNA7mn ifadesinin arttirilmasi amaciyla, kodlayici bölgenin içerisinde, yani, ifade edilen peptidi veya proteini kodlayan dizinin içerisinde, mRNA stabilitesini arttirmak ve bir kodon optimizasyonunu gerçeklestirmek üzere GC-içerigini arttirmak ve böylece hücrelerdeki translasyonu güçlendirmek amaciyla tercihen ifade edilen peptidin veya proteinin dizinini degistirmeden modifiye edilebilir. RNAlnin "stabilitesi" terimi, RNA'nin "yarilanma ömrü" ile ilgilidir. "Yarilanma ömrü", moleküllerin aktivitesi, miktari veya sayisinin yarisini ortadan kaldirmak için gerekli olan zaman periyodu ile ilgilidir. Mevcut bulus baglaminda bir RNA'nm yarilanma ömrü, söz konusu RNA,nin stabilitesi için göstergedir. RNAlnin yarilanma ömrü, RNA"nin "ifade süresini" etkileyebilir. Uzun bir yarilanma ömrüne sahip RNA9nin uzun bir zaman ifadesi boyunca ifade edilmesi ön görülebilir. Elbette, mevcut bulusa göre RNAinm stabilitesini ve/veya translasyon etkililigini azaltmak istenirse, RNA"nin stabilitesini ve/veya translasyon etkililigini arttiran yukarida tarif edilen elemanlarin fonksiyonuyla karisma amaciyla RNA"yi modifiye etmek mümkündür. Burada açiklanan nanopartiküllerin ortalama "çapi" veya "boyutu" genellikle belirlenen bir proses göre hazirlanan nanopartiküllerin "tasarim boyutu" veya tasarlanan boyutudur. Boyut dogrudan ölçülen çap, örnegin ortalama veya maksimum çap olabilir veya bir filtrasyon tarama analizi gibi dolayli bir analiz yoluyla belirlenebilir. Partikül boyutunun dogrudan ölçümü tipik olarak dinamik isik saçilmasi ile gerçeklestirilir. Genellikle dinamik isik saçilma ölçüinlerinden elde edilen sonuçlar, Zomim.d (ortalama boyutun bir ölçümü) ve polidispersite indeksi, PI veya PDI (polidispersite için bir ölçüm) terimleri halinde ifade edilir. Üretim prosesi boyunca önemsiz varyasyonlar ortaya çiktigindan belirtilen ölçümün %40311k bir varyasyonu kabul edilebilirdir ve belirtilen boyut dahilinde olacagi düsünülür. Alternatif olarak boyut, filtrasyon tarama analizleri yoluyla belirlenebilir. Örnegin bir partikül preparati, en az %97 partikülün belirtilen boyutta bir "elek tipi" filtreden geçmesi halinde belirtilen bir boyuttan daha azdir. Tercihen bir dendritik hücre gibi, bir hücreye özellikle in Viva mevcut bir hücreye dagitilmasi, diger bir ifadeyle transfekte edilmesi halinde RNA kodladigi proteini, peptidi veya antij eni ifade eder. "Transfeksiyon" terimi, nükleik asitlerin, özellikle RNAsnin bir hücreye yerlestirilmesi ile ilgilidir. Mevcut bulus amaçlarina yönelik olarak "transfeksiyon" terimi ayrica bir nükleik asidin bir antijen sunan hücre gibi bir hücreye yerlestirilmesi veya bir nükleik asidin bu tür hücre tarafindan alinmasini içerir, burada hücre bir öznede, örnegin bir hastada mevcut olabilir. Bulusa göre bir antijeni kodlayan RNA"nin hücrelere yerlestirilmesinin söz konusu antijenin ifadesi ile sonuçlanmasi tercih edilir. Bulusa göre "peptit" terimi, oligo- ve polipeptitleri içerir ve esdegerli olarak peptit baglariyla birlestirilen iki ya da daha fazla, tercihen 3 ya da daha fazla, tercihen 4 ya da daha fazla, tercihen 6 ya da daha fazla, tercihen 8 ya da daha fazla, tercihen 9 ya da daha fazla, tercihen 10 ya da daha fazla, tercihen 13 ya da daha fazla, tercihen 16 ya da daha fazla, tercihen 21 ya da daha fazla veya tercihen 8, 10, 20, , 40 veya 50°ye kadar, özellikle 100 amino asit içeren maddeleri ifade eder. "Protein" terimi büyük peptitleri, tercihen lOOlden fazla amino asit kalintisi içeren peptitleri ifade eder, ancak genelde "peptitler" ve "proteinler" terimleri esanlamlidir ve burada birbirlerinin yerine degisimli olarak kullanilmaktadir. "Hücre" terimi tercihen, bozulmamis bir hücredir, yani, enzimler, organeller veya genetik materyal gibi normal hücre için bilesenlerini salmamis olan bozulmamis bir membrana sahip bir hücredir. Bozulmamis bir hücre tercihen, viyabil bir hücredir, yani, normal metabolik fonksiyonlarini gerçeklestirebilen yasayan bir hücredir. Tercihen söz konusu terimler bulusa göre eksojen bir nükleik asitle transfekte edilebilen herhangi bir hücreyle ilgilidir. "Hücre" terimi bulusa göre prokaryotik hücreleri (örnegin, E. coli) veya ökaryotik hücreleri (örnegin, dendritik hücreleri, B hücreleri, CHO hücreleri, COS hücreleri, K562 hücreleri, HEK293 hücreleri, HELA hücreleri, maya hücreleri ve böcek hücreleri) içerir. Eksojen nükleik asit, hücrenin için (i) bu itibarla serbestçe dagilmis, (ii) rekombinan bir vektöre katilmis veya (iii) konak hücre genomunun veya mitokondriyal DNA,nin içine yerlestirilmis sekilde bulunabilir. Insanlarda, farelerden, hamsterlardan, domuzlardan, keçilerden ve primatlardan gelen hücreler gibi memeli hücreleri özellikle tercih edilmektedir. Hücreler çok sayida doku türünden türetilebilir ve birincil hücreleri ve hücre çizgilerini içerir. Spesifik örneklere, keratinositlerh, periferal kan lökositleri, kemik iligi kök hücreleri ve embriyonik kök hücreleri dahildir. Diger uygulamalarda, hücre bir antijen-sunan, özellikle bir dendritik hücre, bir monosit veya makrofaj sunan hücredir. Burada kullanildigi üzere "nanopartikül" terimi, bir partikülü tipik olarak 1000 nanometreden (nin) daha az bir çapta, özellikle nükleik asitlerin sistemik, özellikle parenteral, uygulamasi için uygun hale getiren bir çapa sahip herhangi bir partiküle refere eder. Bazi düzenlemelerde bir nanopartikül, 600 nm,den daha az bir çapa sahiptir. Bazi düzenlemelerde bir nanopartikül, 400 nmiden daha az bir çapa sahiptir. Burada kullanildigi üzere "nanopaitikül formülasyonu" terimi veya benzeri terimler, en az bir nanopai'tikül içeren herhangi bir maddeye refere eder. Bazi düzenlemelerde bir nanopartikül bilesimi, nanopartiküllerin tek biçimli bir koleksiyonudur. Bazi düzenlemelerde nanopartikül bilesimleri dispersiyonlar veya emülsiyonlardir. Genellikle bir dispersiyon veya emülsiyon, en az iki birbirine karismayan materyal kombine edildiginde olusturulur. "Lipopleks" veya "RNA lipopleks" terimi, lipidler ve RNA gibi nükleik asitlerin bir kompleksi ile ilgilidir. Lipopleksler, genellikle nötral "yardimci" bir lipid içeren katyonik lipozomlar nükleik asitler ile karistirildiginda spontan olarak olusturulur. Zeta potansiyeli, kolloidal sistemlerdeki elektrokinetik potansiyel için bilimsel bir terimdir. Teorik bir bakis açisindan zeta potansiyeli, ara yüzeyden uzakta hacimli akiskandaki bir noktaya karsi kayma düzlemi lokasyonunda ara yüzeye iliskin ikili katmandaki elektronik potansiyeldir. Diger ifadelerle zeta potansiyeli, dispersiyon ortami ile dagitilan partiküle baglanan sivinin sabit katmani arasindaki potansiyel farktir. Zeta potansiyeli genellikle ikili katmanda elektrik yükü büyüklügünün kantifîkasyonu için kullanilir. Zeta potansiyeli, teorik modeller ve deneysel olarak belirlenen elektroforetik mobilite veya dinamik elektroforetik mobilite ölçümleri kullanilarak hesaplanabilir. Elektrokinetik olaylar ve elektroakustik olaylar, zeta potansiyelinin hesaplaninasi için verilerin genel kaynaklaridir. Elektroforez, partikülatlarin zeta potansiyelinin tahmin edilmesi için kullanilabilir. Pratikte bir dispersiyonun zeta potansiyeli, dispersiyon boyunca bir elektrik alanin uygulanmasi ile ölçülebilir. Bir zeta potansiyeline sahip dispersiyon içerisindeki partiküller, zeta potansiyelinin büyüklügüne oranli bir hiz ile zit yükün elektrotuna dogru göç eder. Bu hiz, Lazer Doppler Anemometre teknigi kullanilarak ölçülebilir. Bu hareketli partiküllerin neden oldugu bir gelen lazer isininin frekans kaymasi veya faz kaymasi partikül mobilitesi olarak ölçülebilir ve bu mobilite, dagitici viskozitesi ve dielektrik geçirgenliginin giris yapinasi ve Smoluchowski teorilerinin uygulanmasi ile zeta potansiyeline dönüstürülebilir. Elektroforetik hiz, ölçülebilir parametre olan elektoforetik mobiliteye orantilidir. Elektroforetik inobiliteyi zeta potansiyeli ile birlestiren birkaç teori mevcuttur. Nicomp 380 ZLS sistemi gibi uygun sistemler, zeta potansiyelinin belirlenmesi için kullanilabilir. Bu tür sistemler genellikle yüklü partiküllerin sivi süspansiyon içerisindeki elektroforetik mobilitesi ve stabilitesini ölçer. Bu degerler, süspansiyondaki partiküller tarafindan uygulanan itme kuvvetlerinin bir tahminidir ve dogrudan kolloidal sistemin stabilitesi ile ilgilidir. Bir zeta potansiyeli, asagida açiklandigi üzere bir protokole göre ölçülebilir. Elektrik yükü, elektriksel olarak yüklenen diger maddenin yaninda oldugunda bir maddenin zorlanmasina neden olan fiziksel bir özelliktir. Elektrik yükü, pozitif ve negatif olarak adlandirilan iki tipte gelir. Yükleri ayni isarete sahip olan yüklü partiküller birbirini iter ve yükleri farkli isaretlere sahip olan partiküller çeker. Bir partikül gibi bir makroskopik nesnenin elektrik yükü, bunu olusturan partiküllerin elektrik yüklerinin toplamidir. Burada açiklanan nanopartiküller, esit sayida pozitif ve negatif yüke sahip olabilir, bu durumda yükleri sifir olan net bir yük saglayarak sifirlanir, dolayisiyla nanopartiküller nötral hale getirilir. Net yük, bir bilesik gibi bütün bir nesne üzerindeki yüktür. Genel olarak net pozitif bir yüke sahip olan bir iyon, bir katyonken genel olarak net negatif bir yüke sahip olan bir iyon bir anyondur. Burada açiklanan nanopartiküller, katyonik lipidin RNA"ya olan (+/-) yük oranina bagli olarak bir pozitif ila negatif yükün ayarlanmasi ve RNA ve katyonik lipidin karistirilmasi ile olusturulabilir. Katyonik lipidin burada açiklanan nanopartiküllerde RNA°ya olan +/- yük orani, asagidaki denklem ile hesaplanabilir. (+/- yük orani)=[(katyonik lipid miktari (mol)) * (katyonik lipiddeki pozitif yüklerin toplam sayisi)]:[(RNA miktari (inol)) * (RNA"daki negatif yüklerin toplam sayisi)]. RNA miktari ve katyonik lipid miktari, nanopartiküllerin hazirlanmasi üzerine bir yükleme miktari bakimindan teknikte uzman bir kisi tarafindan kolay bir sekilde belirlenebilir. Mevcut bulusun pozitif yük, negatif yük veya nötral yük veya katyonik bilesik, negatif bilesik veya nötral bilesik olarak bir yüke refere etmesi halinde bu genellikle bahsedilen yükün fizyolojik bir pH gibi seçilmis bir pH degerinde bulundugu anlamina gelir. Örnegin "katyonik lipid" terimi, fizyolojik bir pH gibi seçilmis bir pH degerinde net pozitif bir yüke sahip olan bir lipidi ifade eder. "Nötral lipid" terimi, net pozitif veya negatif yüke sahip olmayan bir lipidi ifade eder ve fizyolojik bir pH gibi seçilmis bir pH degerinde yüksüz veya nötral amfoterik bir iyon formunda bulunabilir. Buradaki "fizyolojik pH" ifadesi ile yaklasik 7.5 olan bir pH degeri belirtilir. Lipid tasiyicilar gibi nanopartikülat tasiyicilar, örnegin RNA ile komplekslerin olusturulmasi veya RNASnin kapatildigi veya enkapsüle edildigi keseciklerin olusturulmasi ile RNA7nin iliskilendirilebildigi herhangi bir maddeyi veya araci içerebilir. Bu, çiplak RNA"ya kiyasla RNA°nin artmis stabilitesi ile sonuçlanabilir. Özellikle kandaki RNA stabilitesi arttirilabilir. Pozitif yükleri olan katyonik lipidler, katyonik polimerler ve diger maddeler, negatif yüklü nükleik asitler ile kompleksleri olusturabilir. Bu katyonik molekülleri, nükleik asitleri kompleks yapmak üzere kullanilabilir, böylece örnegin sirasiyla lipopleksler veya polilpleksler olusturulur ve bu komplekslerin nükleik asitleri hücrelere dagittigi gösterilmistir. Nanopartikülat RNA preparatlari, çesitli protokoller ile ve çesitli RNA kompleks yapici bilesiklerden elde edilebilir. Lipidler, polimerler, oligomerler veya amfipiller tipik kompleks yapici ajanlardir. Bir düzenlemede kompleks yapici bilesik, protamin, polietilenimin, bir poli-L-lisin, bir poli-L-arjinin veya bir histondan olusan gruptan seçilen en az bir ajani içerir. Protamin, katyonik tasiyici ajan olarak faydalidir. "Protamin" terimi, çesitli hayvanlarin (balik gibi) sperm hücrelerinde somatik histonlar yerine özellikle DNA ile iliskili oldugu bulunan ve arjinin bakimindan zengin nispeten düsük moleküler agirlikli çesitli güçlü derecede bazik proteinlerin herhangi birine refere eder. Özellikle "protamin" terimi, güçlü derecede bazik, su içinde çözünen, isi ile koagüle olmayan ve hidroliz üzerine en çok arjinin saglayan balik sperrninde bulunan proteinlere refere eder. Saflastirilmis formda bunlar, insülinin uzun etkili forrnülasyonunda ve heparinin koagülan önleyici etkilerini nötralize etmek üzere kullanilir. Burada kullanildigi üzere "protamin" terimi, fragmanlari ve söz konusu amino asit dizisinin multimerik formlari veya fragmani dahil natif veya biyolojik kaynaklardan elde edilen veya türetilen herhangi bir protamin amino asit dizisini içerdigi belirtilir. Ayrica terim, yapay olan ve spesifik olarak spesifik amaçlar için tasarlanan ve natif veya biyolojik kaynaklardan izole edilemeyen (sentezlenmis) polipeptitleri kapsar. Protamin, sülfatlanmis protamin veya hidroklorid protamin olabilir. Tercih edilen bir düzenlemede burada açiklanan nanopartiküllerin üretimi için kullanilan protamin kaynagi, izotonik bir tuz solüsyonunda 10 mg/ml"den (ml basina 5000 heparin-nötralize edici birim) fazla protamin içeren protamin 5000,dir. Lipozomlar genellikle fosfolipid gibi bir kesecik olusturan lipidin bir veya daha fazla katmanina sahip mikroskopik lipidik keseciklerdir ve bir ilaci enkapsüle edebilir. Mevcut bulus baglaminda teknikte bilinen diger iki katmanli formlarin yani sira bunlarla sinirli olmamak üzere inultilameler kesecikler (MLV), küçük unilamellar kesecikler (SUV), büyük unilamellar kesecikler (LUV), sterikal olarak sterilize edilen lipozomlar (SSL), çok kesecikli kesecikler (MV), ve büyük çok kesecikli kesecikler (LMV) dahil farkli tiplerdeki lipozomlar kullanilabilir. Lipozom boyutu ve lamellar olma durumu, hazirlanma sekline bagli olacaktir ve kullanilacak keseciklerin tipinin seçilmesi, tercih edilen uygulama moduna bagli olacaktir. Birkaç diger formda süpramoleküler organizasyon mevcuttur burada lipidler, lamellar fazlar, hekzagonal ve inverse hekzagonal fazlar, kübik fazlar, iniseller, mono katmanlardan olusan revers miseller içeren aköz bir ortamda bulunabilir. Bu fazlar ayrica DNA veya RNA kombinasyonunda elde edilebilir ve RNA ve DNA ile etkilesim faz durumunu önemli ölçüde etkileyebilir. Açiklanan fazlar, burada açiklanan nanopartikülat RNA formülasyonlarinda bulunabilir. RNA ve lipozomlardan RNA olusumu için, lipozomlarin olusturulmasina yönelik uygun herhangi bir yöntem, ön görülen RNA lipoplekslerini sagladigi sürece kullanilabilir. Lipozomlar, revers buharlastirma yöntemi (REV), etanol enjeksiyon yöntemi, dehidrasyon-rehidrasyon yöntemi (DRV), sonikasyon ve diger uygun yöntemler gibi standart yöntemler kullanilarak olusturulabilir. Lipozom olusumundan sonra lipozomlar, büyük ölçüde homojen bir boyut araligina sahip lipozomlarin bir popülasyonunu elde etmek üzere boyutlandirilabilir. Iki katman olusturan lipidler tipik olarak iki hidrokarbon zincirine, özellikle asil zincirlerine ve polar veya polar olmayan bir baslik grubuna sahiptir. Iki katman olusturan lipidler, fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, fosfatid asit, fosfatidilinositol ve süngomiyelin gibi, fosfolipidler dahil sentetik kökenli veya dogal olarak meydana gelen lipidlerden olusur burada iki hidrokarbon zinciri tipik olarak yaklasik 14-22 arasinda karbona atomu uzunlugundadir ve çesitli derecelerde doymamisliga sahiptir. Burada açiklanan bilesimde kullanima yönelik diger uygun lipidler kolesterol gibi glikolipidleri ve sterolleri ve ayrica lipozomlarda kullanilabilen çesitli analoglarini içerir. Katyonik lipidler tipik olarak bir lipofilik kisma, bir sterol, bir asil veya diasil zincirine sahiptir ve genel olarak net bir pozitif yüke sahiptir. Lipidin baslik grubunu tipik olarak pozitif yük tasir. Katyonik lipid tercihen 1 ila 10 degerliginde pozitif yüke, daha çok tercihen 1 ila 3 degerliginde pozitif yüke ve daha çok tercihen l degerliginde pozitif yüke sahiptir. Katyonik lipidlerin örnekleri bunlarla sinirli olmamak üzere l,2-di-O-oktadesenil-3-trimetilamonyum propan (DOTMA);dimetildioktadesilamonyum(DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonyum- propan (DOTAP); l,2-diole0i1-3-dimetilamonyum-propan (DODAP); 1,2- diasiloksi-3-dimetilamonyum propan; 1,2-dialkiloksi-3-dimetilamonyum propan; dioktadesildimetil amonyum klorid (DODAC), 1,2-dimiristoiloksipropil-'l,3- dimetilhidroksietil amonyum (DMRIE), ve 2,3-dioleoiloksi-N- [2(sperminkarboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanamiyum trifloroasetat (DOSPA) içerir. DOTMA, DOTAP, DODAC, ve DOSPA tercih edilir. En çok DOTMA tercih edilir. Ek olarak burada açiklanan nanopartiküller tercihen ayrica yapisal stabilite ve benzeri bakimindan nötral bir lipid içerir. Nötral lipid, RNA-lipid kompleksinin dagitim etkinligi bakimindan uygun sekilde seçilebilir. Nötral lipidlerin örnekleri bunlarla sinirli olmamak üzere; l,2-di-(9Z-oktadesen0il)-sn-glisero-3- fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC), diasilfosfatidil kolin, diasilfosfatidil etanol amin, seramid, sfingomiyelin, sefalin, sterol, ve serebrosid içerir. DOPE ve/veya DOPC tercih edilir. En çok DOPE tercih edilir. Katyonik bir lipozomun hem katyonik bir lipid hem de nötral bir lipid içerdigi durumda katyonik lipidin nötral lipide molar orani, lipozomun stabilitesi ve benzeri bakimindan uygun sekilde belirlenebilir. Bir düzenlemeye göre burada açiklanan nanopartiküller fosfolipidleri içerir. Fosfolipidler bir gliserofosfolipid olabilir. Gliserofosfolipid örnekleri bunlarla sinirli olmamak üzere üç tür lipid içerir: (i) örnegin fosfatidilkolin (PC), yumurta sarisi fosfatidilkolini, nötral, kismen hidrojenize edilmis veya tamamen hidrojenize edilmis formda soya fasulyesi türevli PC, dimiristoil fosfatidilkolin (DMPC) sfingomiyelin (SM) içeren zwitteriyonik fosfolipidler; (ii) örnegin fosfatidilserin (PS), fosfatidilinositol (Pl), fosfatidik asit (PA), fosfatidilgliserol (PG) dipalmipoil PG, dimiristoil fosfatidilgliserol (DMPG) içeren negatif yüklü fosfolipidler; konjugatin metoksi-polietilen, glikol-distearoil fosfatidiletanolamin (mPEG-DSPE) durumunda oldugu gibi bir zwitteriyonik fosfolipid ile negatif yüklü hale geldigi sentetik türevler ve (iii) örnegin fosfomonoesteri katyonik lipidleri olusturmak üzere O-metillendigi fosfatidilkolin veya sfingomiyelini içeren katyonik fosfolipidler. RNA'nin lipit tasiyicisina baglanmasi, örnegin tasiyicinin interstisyel bosluklarini dolduran RNA ile gerçeklesebilir, böylece tasiyici RNAiyi fiziksel olarak yakalar veya kovalent, iyonik veya hidrojen bag yoluyla veya spesifik olmayan baglar ile adsorpsiyon yoluyla gerçeklesebilir. Baglanti modu ne olursa olsun RNA, bunun terapötik, diger bir ifadeyle antijen kodlayici özelliklerini bulundurrnalidir. "Polidispersite indeksi", bir partikül karisimindaki lipozomlar gibi ayri partiküllerin homojen veya heterojen boyut dagiliminin ölçümüdür ve bir karisimdaki partikül boyutunun genisligini gösterir. PI, örnegin burada açiklanan sekilde belirlenebilir. Burada kullanildigi üzere "iki degerlikli katyon" teriminin arti 3 yüke sahip olan pozitif yüklü bir elemani, atomu veya molekülü ifade etmesi tasarlanir. Terim Caz+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Fe2+, C0", Ni2+ ve/Veya Cu2+ gibi metal iyonlari içerir. Iki degerlikli katyonlar bulusa göre ayrica iyonlarin tuz formlarini içerir. Iki degerlikli tuz formlarinin spesifik örnekleri CaClz, ZnClz, MnSO4, MnClz ve MgCl; ve örnegin klorid (Cl), sülfat (804), asetat ve/Veya fosfat ile bir toz formunda yukaridaki örnek niteliginde iki degerlikli katyonlarin diger kombinasyonlarini içerir. Yukarida açiklananlardan baska ki degerlikli katyonlar ve tuz formlari teknikte iyi bilinir ve burada kullanilan terim anlami dahilindedir. "Tek degerlikli iyon" terimi, arti 1 yüke sahip bir katyon içerir. Tipik olarak terim, lityum, sodyum, potasyum, rubidiyum ve sezyum gibi alkali metalleri içerir. "Kisim" terimi bir fraksiyona refere eder. Bir amino asit dizisi veya protein gibi belirli bir yapi ile ilgili olarak "kismi" terimi söz konusu yapinin sürekli veya süreksiz bir fraksiyonunu gösterebilir. Tercihen bir amino asit dizisinin bir kismi söz konusu amino asit dizisinin en az %1, en az %5, en az %10, en az %20, en az %30, tercihen en az %40, tercihen en az %50, daha çok tercihen en az %60, daha çok tercihen en az %70, hatta daha çok tercihen en az %80, ve en çok tercih edildigi üzere en az %90 amino asidini içerir. Tercihen kismin bir süreksiz fraksiyon olmasi halinde söz konusu süreksiz fraksiyon bir yapinin 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 veya daha fazla parçasindan olusur, her bir parça yapinin sürekli bir elemanidir. Örnegin bir amino asit dizisinin süreksiz bir fraksiyonu, söz konusu amino asit dizisinin 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 veya daha fazla, tercihen en fazla 4 parçasindan olusabilir, burada her bir parça amino asit dizisinin tercihen en az 5 sürekli amino asit, en az 10 sürekli amino asit, tercihen en az 20 sürekli amino asit, tercihen en az 30 sürekli amino asidini içerir. "Parça" ve "fragman" terimleri burada degistirilebilir sekilde kullanilir ve sürekli bir elemana refere eder. Örnegin bir amino asit dizisinin veya protein gibi bir yapinin bir parçasi, söz konusu yapinin sürekli bir elemanina refere eder. Bir yapinin bir kismi, bir parçasi veya bir fragmani tercihen söz konusu yapinin bir veya daha fazla fonksiyonel özelliklerini içerir. Örnegin bir epitopun, peptidin veya protein bir kismi, bir parçasi veya bir fragmani tercihen bundan elde edilen epitop, peptit veya proteine immünolojik olarak esdegerdir. Mevcut bulus baglaminda bir amino asit dizisi gibi bir yapinin bir "parçasi, bütün yapinin veya amino asit dizinin en az %10, en az %20, en az %30, en az %40, en az %50, en az %60, en az %70, en az %80, en az %85, en az %90, en az %92, en az %94, en az %96, en az %98, en az %99"unu içerir, tercihen bundan olusur. Burada kullanildigi sekliyle "azaltma" veya "inhibe etme" ifadeleri, seviyede genel bir azalmaya, tercihen %5 veya daha fazla, %10 veya daha fazla, %20 veya daha fazla, daha tercihen %50 veya daha fazla ve en tercihen %75 veya daha fazla bir azalmaya neden olabilme anlamina gelmektedir. "Inhibe etme" terimi veya benzer ifadeler, bir tam veya esasen tam inhibisyonu, yani, sifira veya esasen sifira bir azalmayi içerir. "Arttirma" veya "güçlendirme" gibi terimler tercihen, yaklasik en az %10, tercihen en az %20, tercihen en az %30, daha tercihen en az %40, daha tercihen en az %50, daha da tercihen en az %80 ve en tercihen en az %100, en az %200, en az %500, en az %1000, en az %10000 veya hatta daha fazla bir artisla veya güçlendirrneyle ilgilidir. Burada tarif edilen ajanlar, bilesimler ve yöntemler, bir hastaligi, örnegin, bir antijeni ifade eden ve bir antijen peptidini sunan hastalikli hücrelerin varligiyla karakterize bir hastaligi olan bir öznenin tedavi edilmesi için kullanilabilir. Tedavi edilebilecek ve/veya engellenebilecek hastaliklarin örnekleri, burada tarif edilen antijenlerin birini ifade eden tüm hastaliklari kapsar. Özellikle tercih edilen hastaliklar viral hastaliklar ve kanser hastaliklari gibi enfeksiyöz hastaliklardir. Burada açiklanan ajanlar, bilesimler ve yöntemler ayrica burada açiklanan bir hastaligi önlemek üzere immünizasyon veya asilama için kullanilabilir. Bulusa göre "hastalik" terimi enfeksiyöz hastaliklar ve kanser hastaliklari, özellikle burada açiklanan enfeksiyöz hastaliklar ve kanser hastaliklarinin bu formlari dahil herhangi bir patolojik duruma refere eder. Bulusa göre tedavi edilecek bir hastalik tercihen bir antijen içeren bir hastaliktir. "Bir antijen içeren hastalik" veya benzeri ifadeler bulusa göre antijenin hastalikli bir doku veya organin hücrelerin ifade edildigi anlamina gelir. Hastalikli bir doku veya organin hücrelerindeki ifade, saglikli bir doku veya organdaki duruma kiyasla arttirilabilir. Bir düzenlemede ifade sadece hastalikli bir dokuda bulunurken saglikli bir dokudaki ifade bastirilir. Bulusa göre bir antijen içeren hastaliklar enfeksiyöz hastaliklar ve kanser hastaliklarini içerir, burada hastalik iliskili antijen tercihen sirasiyla enfeksiyöz ajanin antijeni veya bir tümör antijenidir. Tercihen bir antijen içeren bir hastalik tercihen özellikle sinif 1 MHC ile, MHC molekülleri baglaminda bir antijen içeren ve antijen sunan hücreleri içeren bir hastaliktir. "Normal doku" veya "normal kosullar" terimleri saglikli dokuya veya saglikli bir öznedeki kosullarda, diger bir ifadeyle patolojik olmayan kosullara refere eder, burada "saglikli" tercihen enfekte olmamis veya kanserli olmayan anlamina gelir. Kanser veya kanser hastaliklari (tibbi terimi: malin neoplazm), bir grup hücrenin kontrolsüz büyüme (normal sinirlarin ötesinde bölünme), invazyon (komsu dokulara zorla girme ve dokularin yok edilmesi) ve bazen metastaz (vücuttaki diger konumlara lenf veya kan vasitasiyla yayilma) sergiledigi hastaliklarin bir sinifidir. Kanserlerin bu üç malin özelligi, kanserleri, kendi kendini sinirlayan ve isgal etmeyen veya metastaz yapmayan selim tümörlerden farklilastirir. Birçok kanser bir tümör, diger bir ifadeyle hücrelerin (ne0plastik hücreler veya tümör hücreleri olarak adlandirilir) anormal bir büyümesi ile olusan bir siskinlik veya lezyon olusturur ancak lösemi gibi bazilari olusturmaz. Bulusa göre "kanser" terimi sunlari içerir: lösemiler, seminomlar, melanomlar, teratomlar, lenfomalar, nöroblastomlar, gliyomlar, kalin bagirsak kanseri, endometriyal kanser, böbrek kanseri, böbreküstü bezi kanseri, tiroit kanseri, kan kanseri, cilt kanseri, beyin kanseri, bagirsak kanseri, kafa ve boyun kanseri, mide-bagirsak kanseri, lenf bezi kanseri, özofagus kanseri, kolorektal kanser, pankreas kanseri, kulak, burun ve bogaz (KBB) kanseri, gögüs kanseri, prostat kanseri, rahim kanseri, yumurtalik kanseri ve akciger kanseriyle bunlarin metastazlari. Bunlarin örnekleri akciger karsinomlari, meme karsinomlari, prostat karsinomlari, kolon karsinomlari, böbrek hücresi karsinomlari, servikal karsinomlar veya yukarida tarif edilen kanser türlerinin veya tümörlerin metastazlari dahildir. Bulusa göre kanser terimi ayrica, kanser inetastazlarini da içerir. Burada açiklanan farmasötik bilesim ile tedavi edilebilir kanserlerin örnekleri malign melanom, tüm karsinoma türleri (kolon, renal hücreli, mesane, prostat, küçük hücreli olmayan ve küçük hücreli akciger karsinomu, vb), lenfomalar, sarkomalar, blastomalar, gliyomlar, vb. içerir. Malign melanom, cilt kanserinin ciddi bir türüdür. Melanositler olarak adlandirilan pigment hücrelerinin kontrolsüz büyüinesinden kaynaklanir. Bulusa göre bir "karsinom", epitelyal hücrelerden türetilen malin bir tümördür. Bu grup, gögüs, prostat, akciger ve kolon kanserinin yaygin formlari dahil olmak üzere en yaygin kanserleri temsil eder. Lenfoma ve lösemi, hematopoietik (kan-olusturan) hücrelerden türeyen malignitelerdir. Bir sarkoma, embriyonik mezodermden gelisen birkaç dokunun birinde transforrne edilmis hücrelerden kaynaklanan bir kanserdir. Dolayisiyla sarkomalar kemik, kikirdak, yag, kas, damar ve hematopoietik dokularin tümörlerini içerir. Blastik tümör veya blastom, bir olgunlasmamis veya embriyonik dokuya benzeyen (genellikle malin) bir tümördür. Bu tümörlerin birçogu, çocuklarda en yaygin olanlardir. Bir glioma beyin veya omurgada baslayan bir tümör tipidir. Bu, gliyal hücrelerden kaynaklandigindan bir glioma olarak adlandirilir. En yaygin glioma alani beyindir. "Metastaz" terimiyle, kanser hücrelerinin özgün alanlarindan vücudun bir baska kismina yayilmasi anlamina gelmektedir. Metastazin olusumu çok karmasik bir süreçtir ve malin hücrelerin birincil tümörden ayrilmasina, ekstraselüler ana yapinin isgal edilmesine, endotelyal taban membranlarinin vücut kavitesine ve damarlara girmek için penetrasyonuna ve daha sonra, kan tarafindan tasindiktan sonra, hedef organlarin infiltrasyonuna dayalidir. Son olarak, yeni bir tümörün, yani bir ikinci tümörün veya metastatik tümörün hedef alanda büyümesi, anjiyojeneze dayalidir. Tümör metastazi siklikla, birincil tümörün yok edilmesinden sonra bile meydana gelir çünkü tümör hücreleri veya bilesenleri metastatik kalir ve bu potansiyeli gelistirir. Bir uygulamada, bulusa göre "metastaz" terimi, birincil tümörden ve bölgesel lenf bezi sisteminden uzaktaki bir metastazla ilgili olan "uzak metastaz" ile ilgilidir. Burada açiklanan farmasötik bilesimler ile tedavi edilebilen enfeksiyöz hastaliklarin örnekleri viral enfeksiyöz hastaliklari, örnegin AIDS (HIV), hepatit A, B veya C, herpes, herpes zoster (suçiçegi), kizamikçik (rubella virüsü), sarihumma, dang vb. flavivirüsler, influenza virüsleri, hemorajik enfeksiyöz hastaliklar (Marburg veya Ebola virüsleri), bakteriyel enfeksiyöz hastaliklar, örnegin Legionnaire hastaligi (Legi'onella), gastrik ülser (Helicobacter), kolera (Vibrio), E. 0011', Staphylococci', Salmonella veya Streptococci' (tetanoz) enfeksiyonlari; Sitma, uyku hastaligi, Laysmanyaz gibi protozoan patojenleri enfeksiyonlari; toksoplazmoz, diger bir ifadeyle Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania ve Toxoplasma enfeksiyonlari veya Cryptococcus neojbrmans, Hi'stoplasma capsulatum, Cocci'di'oi'des immitis, Blastomyces dermati'ti'di's veya Candi'da albicans) kaynakli mantar enfeksiyonlarini içerir. "Tedavi" ifadesi, burada tarif edildigi sekilde bir bilesigin veya bilesimin bir özneye, bir öznedeki bir tümörün boyutunun veya tümörlerin adedinin azaltilmasi; bir öznede bir hastaligin durdumlmasi veya yavaslatilmasi; bir öznede yeni bir hastaligin gelismesinin inhibe edilmesi veya yavaslatilmasi; hâlihazirda veya daha önceden bir hastaligi olan bir öznedeki semptomlarin ve/veya yineleninelerin sikliginin veya siddetinin azaltilmasi ve/Veya öznenin ömrünün uzatilmasi, yani arttirilmasi amaciyla verilmesi anlamindadir. Özellikle, "bir hastaligin tedavisi" terimi, bir hastaligin veya semptomlarinin iyilestirilmesini, süresinin kisaltilmasini, hafifletilmesini, engellenmesini, yavaslatilmasini veya ilerlemesinin veya kötülesmesinin inhibe edilmesini veya bir hastaligin veya semptomlarinin baslamasinin engellenmesini veya geciktirilmesini içerir. "Immünoterapi" terimi, spesifik bir immün yanitin ve/veya immün efektör fonksiyonlarin aktivasyonunu içeren bir tedaviye refere eder. Immünoterapi, çesitli tekniklerin herhangi biri kullanilarak gerçeklestirilebilir, burada saglanan ajanlar, bir hastadan antijen ifade eden hücreleri uzaklastirmak üzere fonksiyon gösterir. Bu tür bir uzaklastirma islemi, bir antijene veya bir antijeni ifade eden bir hücreye spesifik bir hastada bir immün yaniti ve/veya immün efektör fonksiyonlari arttirma veya indükleme sonucu olarak gerçeklesebilir. Mevcut bulusun baglaminda, "koruma", "engelleme", "profilaktik", "engelleyici" veya "koruyucu" terimleri, bir öznedeki bir hastaligin meydana gelisinin ve/veya yayilmasinin engellenmesiyle veya tedavi edilmesiyle veya her ikisiyle ve özellikle, bir öznenin bir hastaliga yakalanma sansinin minimize edilmesiyle veya bir hastaligin gelismesinin geciktirilmesiyle ilgilidir. Örnegin, bir kanser riski altinda olan bir kisi, bir kanserin engellenmesi amaciyla terapi için bir aday olabilir. Bir immünoterapinin profilaktik bir uygulamasi, örnegin, bulusun bilesiminin profilaktik bir uygulamasi, tercihen, aliciyi bir hastaliga yakalanmaya karsi korur. Bir immünoterapinin terapötik bir uygulamasi, örnegin, bulusun bilesiminin terapötik bir uygulamasi, hastaligin ilerlemesinin/gelismesinin inhibe edilmesine yol açabilir. Bu, hastaligin ilerlemesinin/gelismesinin yavaslamasmi, özellikle, tercihen hastaligin ortadan kaldirilmasina yol açan sekilde hastaligin ilerlemesinin bir durdurulmasini içerir. "Risk altinda olmak" ifadesi, genel popülasyona kiyasla bir hastaliga, özellikle kansere yakalanmak için normalden daha yüksek bir sansa sahip olarak tanimlanan bir özne, yani bir hasta anlamina gelir. Ek olarak, bir hastalik, özellikle kanser geçirmis veya halihazirda geçirmekte olan, bir hastaliga yakalanma için artan bir riske sahip bir öznedir, bu itibarla bir özne bir hastalik gelistirmeye devam edebilir. Halihazirda kanseri olan veya önceden olmus olan özneler ayrica, kanser metastazi için artan bir riske sahiptir. Burada saglanan ajanlar ve bilesimler, tek basina veya cerrahi, isinlama, kemoterapi ve/veya (otolog, sijenik, alojenik veya ilgisiz) kemik iligi nakli gibi konvansiyonel terapötik rejimlerle kombinasyon halinde kullanilabilir. Kanser tedavisi, genellikle iki, üç, dört veya hatta daha fazla kanser ilaci/terapisinin kombine etkisinin monoterapötik bir yaklasimin etkisinden önemli ölçüde daha güçlü oldugu düsünülen sinerjistik etkileri üretmesi nedeniyle kombinasyon stratejilerinin özellikle istendigi bir alani temsil eder. Dolayisiyla, burada açiklanan farinasötik bilesimler gibi immün veya asilama bazli mekanizmalarin kullanildigi bir kanser tedavisi, benzer veya diger spesifik mekanizmalari hedefleyen çesitli diger ilaçlar ve/veya yöntemler ile etkili sekilde kombine edilebilir. bunlar arasinda örnegin klasik tümör terapileri, çoklu-epitop stratejileri, ek immünoterapi ve anjiyojenez veya Apoptozu hedefleyen tedavi yaklasimlari ile kombinasyonlar bulunur (inceleme için bakiniz örnegin Andersen et al. 2008: Cancer treatment: the combination of vaccination With other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy, 57(11): 1735-1743.) Farkli ajanlarin ardisik sekilde uygulanmasi, farkli kontrol noktalarinda kanser hücresi büyümesini inhibe edebilirken diger ajanlar, potansiyel olarak kanseri kronik bir hastaliga dönüstürerek örnegin neo-anjiyojenezi, malign hücrelerin veya metastazlarin sag kalimini inhibe edebilir. Asagidaki liste, mevcut bulus ile kombinasyon halinde kullanilabilen anti-kanser ilaçlari ve terapilerinin sinirlandirici olmayan bazi örneklerini saglar: 1. Kemoterapi Kemoterapi, birçok kanser tipi için bakiin standardidir. En yaygin kemoterapi ajanlari, kanser hücrelerinin temel özelliklerinden biri olan hizla bölünen hücreleri öldürerek etki eder. Dolayisiyla, örnegin alkilleme ajanlari, antimetabolitler, antrasiklinler, bitki alkaloidleri, topoizomeraz inhibitörleri ve hücre bölünmesi veya DNA Sentezini etkileyen diger antitümör ajanlari gibi klasik kemoterapötik ilaçlar ile bir kombinasyon, baskilayici hücreleri temizleyerek, immün sistemini yeniden baslatarak, tümör hücrelerini immün aracili ölüme daha duyarli hale getirerek ve immün sistemi hücrelerinin ek aktivasyonu ile mevcut bulusun terapötik etkilerini önemli ölçüde gelistirebilir. Kemoterapötik ve asilama bazli immünoterapötik ilaçlarin sinerjistik anti-kanser etkisi, birçok çalismada gösterilmistir (bakiniz örnegin Quoix et al. 2011: Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer: a controlled phase 2B trial. Lancet Oncol. 12( 12): 1125-33.; bakiniz ayrica Liseth et al. 2010: Combination of intensive chemotherapy and anticancer vaccines in the treatment of human malignancies: the hematological experience. J Biomed Biotechnol. 2010: 6920979; bakiniz ayrica Hirooka et al 2009: A combination therapy of gemcitabine With immunotherapy for patients With inoperable locally advanced pancreatic cancer. Pancreas 38(3): e69-74). Kombinasyon terapileri için temel olarak uygun olan temin edilebilir yüzlerce kemoterapötik ilaç bulunmaktadir. Mevcut bulus ile kombine edilebilen kemoterapötik ilaçlarin bazi (sinirlandirici olmayan) örnekleri arasinda karboplatin (Paraplatin), sisplatin (Platinol, Platinol-AQ), siklofosfamid (Cytoxan, Neosar), doketaksel (Taxotere), doksorubisin (Adriamycin), erlotinib (Tarceva), etoposid (VePesid), tlorourasil (5-FU), gemsitabin (Gemzar), imatinib mesilat (Gleevec), irinotekan (Camptosar), metotreksat (Folex, Mexate, Amethopterin), paklitaksel (Taxol, Abraxane), sorafinib (Nexavar), sunitinib (Sutent), topotekan (Hycamtin), vinkristin (Oncovin, Vincasar PF S), ve Vinblastin (Velban) bulunmaktadir. 2. Cerrahi Kanser cerrahisi - tümörü uzaklastirma islemi - kanser tedavisinin temeli olarak kalmaya devam etmektedir. Cerrahi, kalan herhangi bir tümör hücresini silmek amaciyla diger kanser tedavileri ile kombine edilebilir. Cerrahi yöntemlerinin sonraki immünoterapötik tedavi ile kombine edilmesi, çok kez gösterilmis umut vaat edici bir yaklasimdir. 3. Radyasyon Radyasyon terapisi, hastalik seyri boyunca radyasyon terapisi alan tüm kanser hastalarinin yaklasik %50lsi ile kanser tedavisinin önemli bir bileseni olmaya devam etmektedir. Radyasyon terapisinin temel amaci, kanser hücrelerini çogalma (hücre bölünmesi) potansiyellerinden mahrum birakilmasidir. Kanseri tedavi etmek üzere kullanilan radyasyon tipleri foton radyasyonu (x-isinlari ve gamma isinlari) ve partikül radyasyonlaridir (elektron, proton ve nötron isinlari). Radyasyonun kanser lokasyonuna dagitilmasi için iki yol mevcuttur. Harici isin radyasyonu, tümör lokasyonu için yüksek enerjili isinlar (fotonlar, protonlar veya partikül radyasyonu) amaçlanarak vücuda disaridan dagitilir. Dahili radyasyon veya brakiterapi dogrudan tümör alaninda kataterler veya tohumlarda kapatilmis, radyoaktif kaynaklar tarafindan içeriden vücuda dagitilir. Mevcut bulus ile kombinasyon halinde uygulanabilen radyasyon terapisi teknikleri arasinda örnegin fraksiyonasyon (parçalara ayrilmis bir rejimde dagitilan radyasyon terapisi, Örnegin birkaç hafta boyunca verilen günlük 1.5 ila 3 Gy fraksiyonu), 3D konformal radyoterapi (3DCRT; brüt tümör hacmine radyasyonun dagitilmasi), yogunluk ayarli radyasyon terapisi (IMRT; çoklu radyasyon isinlarinin bilgisayar kontrollü yogunluk modülasyonu), görüntü rehberliginde radyoterapi (IGRT; düzeltmeye olanak taniyan ön-radyoterapi görüntülemeyi içeren bir teknik) ve stereotatiktik vücut radyasyon terapisi (SRBT, sadece birkaç tedavi fraksiyonu boyunca oldukça yüksek ayri radyasyon dozlarini dagitir) bulunmaktadir. Radyasyon terapisi incelemesi için bakiniz Baskar et al. 2012: Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int. J Med Sci. 9(3): 193-199. 4. Antikorlar Antikorlar (tercihen monoklonal antikorlar), çesitli mekanizmalar yoluyla kanser hücrelerine karsi terapötik etkiler gerçeklestirirler. Bunlar apoptoz veya programlanmis hücre ölümü olusturulmasinda dogrudan etkilere sahip olabilirler. Bunlar, tümör hücrelerinin proliferasyonunu etkili bir sekilde durdurarak örnegin büyüme faktörü reseptörleri gibi sinyal transdüksiyon yolaklarinin bilesenlerini bloke edebilir. Monoklonal antikorlari ifade eden hücrelerde anti-idiyotip antikor olusumunu gerçeklestirebilirler. Dolayli etkiler, monositler ve makrofajlar gibi sitotoksisiteye sahip hücrelerin toplanmasini içerir. Bu tip antikor aracili hücre ölümü, antikora bagimli hücre aracili sitotoksisite (ADCC) olarak adlandirilir. Antikorlar ayrica kompleman bagli sitotoksisite (CDC) olarak bilinen dogrudan hücre toksisitesine yol açan komplemani baglar. Cerrahi yöntemlerin immünoterapötik ilaçlar veya yöntemler ile kombine edilmesi örnegin Gadri et al. 2009: Synergistic effect of dendritic cell vaccination and anti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma. J Immunother. 32(4): 333-40"ta gösterildigi üzere basarili bir yaklasimdir. Asagidaki liste, mevcut bulus ile kombinasyon halinde kullanilabilen potansiyel antikor hedefleri (parantez içinde) ve anti-kanser antikorlarinin sinirlandirici olmayan bazi örnekleri saglar: Abagovomab (CA-125), Absiksimab (CD41), Adekatumumab (EpCAM), Afutuzumab (CDZO), Alasizumab pegol (VEGFRZ), Altumomab pentetat (CEA), Amatuksimab (MORAb-009), Anatumomab mafenatoks (TAG-72), Apolizumab (HLA-DR), Arsitumomab (CEA), Bavituksimab (fosfatidilserin), Bektumomab (CD22), Belimumab (BAFF), Bevakizumab (VEGF-A), Bivatuzumab mertansin (CD44 V6), Blinatumomab (CD19), Brentuksimab vedotin (CD30 TNFRSFS), Kantuzumab mertansin (müsin CanAg), Kantuzumab ravtansin (MUCl), Kapromab pendetid (prostatik karsinoin hücreleri), Karlumab (CNTOSSS), Katumaksomab (EpCAM, CD3), Setuksimab (EGFR), Sitatuzumab bogatoks (EpCAM), Siksutumumab (IGF-l reseptörü), Klaudiksimab (Klaudin), Klivatuzumab tetraksetan (MUCl), Konatumumab (TRAlL-R2), Daketuzumab (CD40), Dalotuzumab (insülin benzeri büyüme faktörü I reseptörü), Denosumab (RANKL), Detumomab (B-lenfoma hücresi), Drozitumab (DR5), Ekromeksimab (GD3 gangliosid), Edrekolomab (EpCAM), Elotuzumab (SLAMF7), Enavatuzumab (PDL192), Ensituskimab (NPC-IC), Epratuzumab (CD22), Ertumaksomab (HERZ/neu, CD3), Etarasizumab (integrin owß3), Farletuzumab (folat reseptör 1), FBTA05 (CD20), Fiklatuzumab (SCH 900105), Figitumumab (IGF-l reseptörü), Flanvotumab (glikoprotein 75), Fresolimumab (TGF-ß), Galiksimab (CD80), Ganitumab (IGF-I), Gemtuzumab ozogamisin (CD33), Gevokizumab (IL-lß), Girentuksimab (karbonik anhidraz 9 (CA-IX)), Glembatumumab vedotin (GPNMB), Ibritumomab tiuksetan (CD20), Ikrukumab (VEGFR-l), Igovoma (CA-125), Indatuksimab ravtansin (SDCl), Intetumumab (CD51), Inotuzumab ozogamisin (CD22), Ipilimumab (CD152), Iratumumab (CD30), Labetuzumab (CEA), Leksatumumab (TRAIL-RZ), Libivirumab (hepatit B yüzey antijeni), Lintuzumab (CD33), Lorvotuzumab mertansin (CD56), Lucatumumab (CD40), Lumiliksimab (CD23), Mapatumumab (TRAIL-Rl), Matuzumab (EGFR), Mepolizumab (IL-5), Milatuzumab (CD74), Mitumomab (GD3 gangliyozid), Mogamulizumab (CCR4), Moksetumomab pasudotoks (CD22), Nacolomab tafenatoks (C242 antijen), Naptumomab estafenatoks (5T4), Namatumab (RON), Nesitumumab (EGFR), Nimotuzumab (EGFR), Nivolumab (IgG4), Ofatumumab (CD20), Olaratumab (PDGF-R OL), Onartuzumab (insan ömür azalma reseptör kinazi), Oportuzumab monatoks (EpCAM), Oregovomab (CA-125), Okselumab (CX-40), Panitumumab (EGFR), Patritumab (HER3), Pemtumoma (MUCI), Pertuzuma (HER2/neu), Pintumomab (adenokarsinom antijeni), Pritumumab (vimentin), Rakotumomab (N-glikolilnöraminik asit), Radretumab (fîbronektin ekstra domen-B), Rafîvirumab (kuduz virüsü glikoprotein), Ramusirumab (VEGFRZ), Rilotumumab (HGF), Rituskimab (CD20), Robatumumab (lGF-l reseptörü), Samalizumab (CDZOO), Sibrotuzumab (FAP), Siltuksimab (IL-6), Tabalumab (BAFF), Takatuzumab tetraksetan (alfa- fetoprotein), Taplitumomab paptoks (CD19), Tenatumomab (tenaskin C), Teprotumumab (CD221), Tisilimumab (CTLA-4), Tigatuzumab (TRAIL-RZ), TNX-650 (IL-13), Tositumomab (CDZO), Trastuzumab (HER2/neu), TRBSO7 (GD2), Tremelimumab (CTLA-4), Tukotuzumab kelmolökin (EpCAM), Ublituksimab (MS4A1), Urelumab (4-lBB), Volosiksimab (integrin a5ßl), Votumumab (tümör antijeni CTAA16.88), Zalutumumab (EGFR), Zanolimumab (CD4). . Sitokinler, kemokinler, es uyarici moleküller, füzyon proteinleri Mevcut bulusa ait antij en kodlayici farmasötik bilesimlerin sitokinler, kemokinler, es uyarici moleküller ve/veya bunlarin füzyon proteinleri ile faydali immün modülasyonu veya tümör inhibisyon etkileri ortaya çikarmak üzere kombine kullanimi mevcut bulusun bir diger düzenlemesidir. Immün hücrelerin tümör için infiltrasyonunu arttirmak ve antijen sunan hücrelerin tümör süzdüren lenf dügümlerine hareketine kolaylastirmak amaciyla C, CC, CXC ve CX3C yapilari olan çesitli kemokinler kullanilabilir. En umut vaat edici kemokinlerin bazilari örnegin CCR7 ve ligandlari CCL19 ve CCL21, ayrica CCL2, CCL3, CCLS, ve CCL16"dir. Diger örnekler CXCR4, CXCR7 ve CXCLl2sdir. Ayrica örnegi B7 ligandlari (B7.1 ve 87.2) gibi es uyarici veya regülatör moleküller faydalidir. Ayrica diger sitokinler arasinda örnegin interlökinler özellikle (örnegin IL-l ila IL17), interferonlar (örnegin IFNalfal to IFNalfaS, IFNalfalO, IFNalfa13, lFNalfal4, lFNalfalö, IFNalfal7, lFNalfa2l, lFNbetal, IFNW, IFNEl ve IFNK), heinatopoietik faktörler, TGF"ler (örnegin TGF-oi, TGF-ß, ve TGF familyasinin diger üyeleri), son olarak reseptörlerin tümör nekroz faktör familyasinin üyeleri ve ligandlari ve ayrica bunlarla sinirli olmamak üzere 41BB, 41BB-L, CDl37, CD137L, CTLA-4GITR, GITRL, Fas, Fas-L, TNFRl, TRAlL-Rl, TRAlL-R2, p75NGF-R, DR6, LT.beta.R, RANK, EDAR] , XEDAR, Fnl 14, Troy/Trade, TAJ, TNFRII, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-lBB, OX40, GlTR, GITRL, TACI, BAFF-R, BCMA, RELT, ve CD95 (Fas/APO-l), glukokortikoid indüklü TNFR iliskili protein, TNF reseptör iliskili apoptoz aracili protein (TRAMP) ve ölüm reseptörü-6 (DR6) içeren diger uyarici moleküller mevcuttur. Özellikle CD40/CD40L ve OX40/OX40L, T hücre sag kalimi ve proliferasyon üzerindeki dogrudan etkileri nedeniyle kombine immünoterapi için önemli hedeflerdir. Inceleme için bakiniz Lechner et al. 2011: Chemokines, costimulatory molecules and fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors. Immunotherapy 3 (11), 1317-1340. 6. Bakteriyel tedaviler Arastirmacilar, oksijen bakimindan fakir tümörlerin içini tüketmek için Clostridium novyi gibi anaerobik bakterileri kullanmislardir. Bunlar daha sonra tümörlerin oksijenli taraflari ile temas haline geldiklerinde ölmelidirler, bu da vücudun geri kalanina zarar vermeyecekleri anlamina gelir. Diger bir strateji, toksik olinayan bir ön ilaci toksik bir ilaca dönüstürebilen bir enzim ile dönüstürülmüs anaerobik bakterilerin kullanilmasidir. Tümörün nekrotik ve hipoksik alanlarinda bakterilerin profilerasyonu ile enzim, yalnizca tümörde ifade edilir. Dolayisiyla sistemik olarak uygulanan bir ön ilaç, sadece tümörde toksik ilaca metabolize edilir. Bunun, patojenik olmayan anaerob Clostridium spor genleri ile etkili oldugu gösterilmistir. 7. Kinaz inhibitörleri Kanser hücrelerinin büyümesi ve sag kaliminin kinaz aktivitesinin deregülasyonu ile yakindan baglantili olmasi nedeniyle Tamamlayici kanser terapisine yönelik potansiyel hedeflerin bir diger büyük grubu, kinaz inhibitörlerini içerir. Normal kinaz aktivitesini restore etmek ve bu nedenle tümör büyümesini azaltmak üzere genis bir inhibitör grubu kullanilir. HedeIlenen kinazlarin grubu reseptör tirozin kinazlari örnegin BCR-ABL, B-Raf, EGFR, HER-Z/ErbBZ, lGF-IR, PDGFR-d, PDGFR-ß, c-Kit, Flt-4, Flt3, FGFRl, FGFRB, FGFR4, CSFlR, c-Met, RON, c- Ret, ALK, sitoplazmik tirozin kinazlari örnegin c-SRC, c-YES, Abl, JAK-Z, serin/treonin kinazlari örnegin ATM, Aurora A & B, CDKS, mTOR, PKCi, PLKs, b-Raf, SÖK, STKll/LKBI ve lipid kinazlari örnegin PI3K, SKI içerir. Küçük moleküllü kinaz inhibitörleri örnegin PHA-739358, Nilotinib, Dasatinib, ve PDl66326, NSC 743411, Lapatinib (GW-572016), Kanertinib (Cl-1033), Semaksinib (SU5416), Vatalanib (PTK787/ZK222584), Sutent (SUll248), Sorafenib (BAY 43-9006) ve Leflunomiddir (SUlOl). Daha fazla bilgi için bakiniz Zhang et al. 2009: Targeting cancer With small molecule kinase inhibitors. Nature Reviews Cancer 9, 28-39. 8. Toll-benzeri reseptörler Toll-benzeri reseptör (TLRller) familyasina ait üyeler, dogustan ve adaptif immünite arasindaki önemli bir bagdir ve birçok adjuvanin etkisi, TLR°lerin aktivasyonuna dayanir. Kansere karsi çok sayida belirlenmis asi, asi yanitlarinin güçlendirilmesine yönelik olarak TLR°ler için ligandlar içerir. Bunun yani sira TLR2, TLR3, TLR4 özellikle TLR7 ve TLR 8, pasif immünoterapi yaklasimlarinda kanser terapisi için incelenmistir. Yakindan iliskili TLR7 ve TLR8, immün hücreleri, tümör hücreleri ve tümör mikro çevresini etkileyerek antitümör yanitlarina katkida bulunur ve nükleosid analog yapilar araciligiyla aktive edilebilir. Tüm TLR,ler, bagimsiz immünoterapötikler veya kanser asi adjuvanlari olarak kullanilmistir ve burada açiklanan fonnülasyonlar ile sinerjistik olarak kombine edilebilir. Daha fazla bilgi için bakiniz van Duin et al. 2005: Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology, 27(1):49-55. 9. Anjiyojenez inhibitörleri Tümör aracili kaçis mekanizmalari ve immün baskilamasindan etkilenen immün modülatör reseptörlerini hedefleyen terapilere ek olarak tümör çevresini hedefleyen terapiler bulunmaktadir. Anjiyojenez inhibitörleri, tümörlerin sag kalim için gerek gerekli olan kan damarlarinin genislemesini (anjiyojenez) önler. Artan besin ve oksijen taleplerini karsilamalari için tümör hücreleri tarafindan tesvik edilen anjiyogenez örnegin farkli moleküllerin hedef alinmasi ile bloke edilebilir. Mevcut bulus ile kombine edilebilen anjiyojenezin aracilik ettigi moleküller veya anjiyojenez inhibitörlerinin sinirlandirici olmayan örnekleri, çözünür VEGF (VEGF izoformlar VEGF 121 ve VEGF 165, reseptörler VEGFRl, VEGFRZ ve es-reseptörler Neuropilin-l ve Neuropilin-Z) 1 ve NRP-l, anjiyopoietin 2, TSP-l ve TSP-2, anjiostatin ve iliskili moleküller, endostatin, vasostatin, kalretikulin, platelet faktör-4, TIMP ve CDAl, Meth-l ve Meth-2, IFN-a, -B ve -y, CXCLIO, IL-4, -12 ve -18, protrombin (kringle domeni-2), antitrombin Ill fragmani, prolaktin, VEGl, SPARC, osteopontin, maspin, kanstatin, proliferin iliskili protein, restin ve ilaçlar örnegin bevakizumab, itrakonazol, karboksiamidotriazol, TNP-470, CMlOl, IFN-a,, platelet factor-4, suramin, SU5416, thrombospondin, VEGFR antagonistleri, anjiyostatik steroidler + heparin, cartilage-derived angiogenesis Inhibitör faktörü, matriks metalloproteinaz inhibitörleri, 2-metoksiestradiol, tekogalan, tetratiyomolibdat, talidomid, trombospondin, prolaktinu Vß3 inhibitörleri, linomid, taskinimod"dur. Inceleme için bakiniz Schoenfeld and Dranoff 2011: Anti-angiogenesis immunotherapy. Hum Vaccin. (9):976-81. . Küçük moleküllü hedeüenmis terapi ilaçlari Küçük moleküllü hedeflenmis terapi ilaçlari genellikle kanser hücresinde mutasyona ugramis, asiri ifade edilmis veya baska türlü kritik proteinler üzerindeki enzimatik domenlerin inhibitörleridir. Önemli ve sinirlandirici olmayan örnekler tirozin kinaz inhibitörleri imatinib (Gleevec/Glivec) ve gefitinib"dir (Iressa). Kanser terapisi için asilar ile kombinasyon halinde küçük moleküllü örnegin sunitinib malat ve/veya sorafenib tosilat hedefleyici bazi kinazlarin kullanimi ayrica önceki patent basvurusu USZOO90042133te açiklanir. 11. Virüs bazli asilar Burada açiklanan formülasyonlar ile birlikte kombine terapötik bir yaklasimda kullanilabilen mevcut veya gelistirilmekte olan virüs bazli bir kanser asilari bulunmaktadir. Bu tür viral vektörlerin kullaniminin bir avantaji, bunlarin immün aktivasyonu için gerekli tehlike sinyalini olusturan viral bir enfeksiyonun sonucu olarak meydana gelen inflamatuvar reaksiyonlar ile iininün yanitlarini baslatmak için intrinsik kabiliyetleridir. Ideal bir viral vektör güvenilir olmalidir ve antitümör spesifik yanitlarin güçlendirilmesine olanak taniinak üzere bir anti- vektör immün yaniti vermemelidir. Vaksinia virüsleri, herpes simplex virüsleri, adenovirüsler, adeno-iliskili virüsler, retrovirüsler ve avipox virüsleri gibi rekombinant virüsler hayvan tümör modellerinde kullanilmistir ve tesvik edici sonuçlarina dayanarak, insan klinik deneyleri baslatilmistir. Özellikle önemli virüs bazli asilar, bir virüsün dis katindan belirli proteinleri içeren küçük partiküller olan virüs benzeri partiküllerdir (VLP"ler). Virüs benzeri partiküller, virüsten gelen herhangi bir genetik materyali içermez ve bir enfeksiyona neden olmaz ancak bunlarin katlari üzerine tümör antijenlerini sunmak üzere yapilandirilabilirler. VLP"ler örnegin hepatit B virüsü veya Parvoviridae (örnegin adeno iliskili virüs), Retroviridae (örnegin HIV), ve Flaviviridae (örnegin Hepatit C virüsü) dahil diger virüs familyalarindan türetilebilir. Genel bir inceleme için bakiniz; Sorensen and Thompsen 2007: Virus-based immunotherapy of cancer: what do we know and where are we going? APMIS 115(11):l 177-93; virus-like particles against cancer are reviewed in Buonaguro et al. 2011: Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseases and cancer. Expert Rev Vaccines 10(1 1): 1569-83; ve in Guillén et al. 2010: Virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants: application to chronic disease, cancer immunotherapy and infectious disease preventive strategies. Procedia in Vaccinology 2 (2), 128-133. 12. Çoklu epitop stratejileri Çoklu epitoplarin kullanimi asilama için umut verici sonuçlar gösterir. Akilli algoritina sistemleriyle kombine edilen hizli dizileine teknolojileri, tümör mutanomunun kullanilmasina olanak tanir ve mevcut bulus ile kombine edilebilen bireylestirilmis asilar için çoklu epitoplar saglayabilir. Daha fazla bilgi için bakiniz; 2007: Vaccination of metastatic colorectal cancer patients With matured dendritic cells loaded With multiple major histocompatibility complex class l peptides. J lmmunother 30: 762-772; furthermore Castle et al. 2012: Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 72 (5): 1081-91. 13. Adoptif T hücre transferi Örnegin, bir tümör antijen asilamasi ve T hücre transferinin bir kombinasyonu Rapoport et al. 2011: Combination immunotherapy using adoptive T-cell transfer and tumor antigen vaccination on the basis of hTERT and survivin after ASCT for myeloma. Blood ll7(3):788-97,de açiklanir. 14. Peptit bazli hedef terapileri Peptitler, hücre yüzey reseptörlerine baglanabilir veya tümörü çevreleyen hücre disi matriksi etkileyebilir. Nüklidin hücre çevresinde dagilmasi halinde bu peptitlere baglanan radyonüklidler (örnegin RGD71er) en sonunda kanseri öldürür. Özellikle bu baglanma motiflerinin oligo veya multimerleri büyük ilgi çekmektedir, nedeni bunun, tümörün spesifikligi ve aviditesinin artmasina neden olabilir. Sinirlandirici olmayan örnekler için bakiniz Yamada 201 1: Peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer, bladder cancer, and malignant glioma. Nihon Rinsho 69(9): 1657-61. . Diger terapiler Sinerjistik etkiler olusturmak amaciyla mevcut bulusa ait fonnülasyonlar ile kombine edilebilen sayisiz diger kanser terapileri mevcuttur. Sinirlandirici olmayan örnekler apoptoz, hipertermi, hormonal terapi, telomeraz terapisi, insülin potansiyelizasyon terapisi, gen terapisi ve fotodinamik terapiyi hedefleyen tedavilerdir. "Immünizasyon" veya "asilama" terimi, terapötik veya profilaktik nedenlerle bir öznenin tedavi edilmesine yönelik prosesi açiklar. "Özne" terimi memeliler ile ilgilidir. Örnegin mevcut bulus baglaminda memeliler insanlar, insan disi primatlar, köpekler, kediler, koyunlar, sigir, keçiler, domuzlar, atlar, vb. gibi evcil hayvanlar fareler, siçanlar, tavsanlar, kobaylar, vb. gibi laboratuvar hayvanlari ve ayrica hayvanat bahçeleri hayvanlari gibi esit tutulan hayvanlardir. Burada kullanildigi üzere "hayvan" terimi ayrica insanlari içerir. "Otolog" terimi, ayni özneden türetilen herhangi bir seyi açiklamak üzere kullanilir. Örnegin "analog transplant", ayni Özneden türetilen doku veya organlarin transplantina refere eder. Bu tür prosedürler, aksi sekilde ret ile sonuçlanan immünolojik bariyeri ortadan kaldirmalari nedeniyle avantajlidir. "Heterolog" terimi, birçok farkli elemandan olusan herhangi bir seyi açiklamak üzere kullanilir. Bir örnek olarak bir bireyin kemik iliginin farkli bir bireye transferi, heterolog bir transplanti olusturur. Heterolog bir gen, özneden baska bir kaynaktan türetilen bir gendir. Bulusa ait farmasötik bilesimler tercihen sterildir ve burada açiklanan nanopartiküllerin ve istege bagli olarak istenilen reaksiyonu veya istenilen etkiyi olusturmak üzere burada açiklanan diger ajanlarin etkili bir miktarini içerir. Bulusun farmasötik bilesimi, bir veya daha fazla adjuvan gibi ilave immünite arttirici maddeler ile birlikte uygulanabilir ve ayrica etkinligini arttirmak üzere, tercihen immunostimülasyonun sinerjistik bir etkisini elde etmek üzere bir veya daha fazla immünite arttirici madde içerebilir. "Adjuvan" terimi, bir immün yaniti uzatan veya arttiran veya hizlandiran bilesikler ile ilgilidir. Çesitli adjuvan türlerine bagli olarak bu baglamda çesitli mekanizmalar mümkündür. Örnegin, DC'nin, örnegin lipopolisakkaritler veya CD40 ligandinin olgunlasmasina olanak taniyan bilesikler, uygun adjuvanlarin birinci sinifini olusturur. Genellikle bir "tehlikeli sinyal" (LPS, GP96, dsRNA vb.) türünün immün sistemini veya GM- CSF gibi sitokinleri etkileyen herhangi bir ajan, kontrollü bir sekilde yogunlastirilacak ve/veya etkilenecek bir iminün yaniti saglayan bir adjuvan olarak kullanilabilir. Yukarida açiklandigi üzere, belirli kosullar altinda meydana gelen, yan etkileri göz önüne alinmasina ragmen CpG oligodeoksinükleotidler istege bagli olarak ayrica bu baglamda kullanilabilir. Özellikle tercih edilen adjuvanlar sitokinler, örnegin monokinler, lenfokinler, interlökinler veya kemokinler örnegin IL-l, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 12, INF (1, INF -y, GM-CSF, LT-a, veya büyüme faktörleri, örnegin hGH`dir. Ilave bilinen adjuvanlar alüminyum hidroksit, Freund adjuvani veya en çok tercih edilen M0ntanide® ISA51 olmak üzere Montanide® gibi yagdir. Pam3Cys gibi lipopeptitler, mevcut bulusun farmasötik bilesiininde adjuvanlar olarak kullanim için uygundur. Farmasötik bilesimler genellikle benzersiz bir dozaj formunda saglanir ve kendi basina bilinen bir sekilde hazirlanabilir. Bulusun farmasötik bilesimi örnegin bir solüsyon veya süspansiyon formunda olabilir. Bulusun farmasötik bilesimi tuzlar, tampon maddeler, koruyucular, tasiyicilar, seyrelticiler ve/veya eksipiyanlari içerebilir bunlarin tümü tercihen farmasötik olarak kabul edilebilirdir. "Farmasötik olarak kabul edilebilir" terimi, farmasötik bilesimin aktif bilesiminin etkisi ile etkilesime girmeyen bir materyalin toksisite olmamasina refere eder. Farmasötik olarak kabul edilmeyen tuzlar, farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarin hazirlanmasina yönelik kullanilabilir ve bulusa dahil edilir. Bu türde farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar, sinirlandirici olmayan bir sekilde asagidaki asitlerden hazirlananlari içerir: hidroklorik, hidrobromik, sülfürik, nitrik, fosforik, maleik, asetik, salisilik, sitrik, formik, malonik, süksinik asitler ve benzeri. Farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar ayrica alkali metal tuzlar veya alkalin toprak metal tuzlari, sodyum tuzlari, potasyum tuzlari veya kalsiyum tuzlari olarak hazirlanabilir. Bulusun farmasötik bilesiminde kullanima yönelik uygun tampon maddeleri bir tuz içinde asetik asit, bir tuz içinde sitrik asit, bir tuz içinde borik asir ve bir tuz içinde fosforik asit içerir. Bulusun farmasötik bilesiminde kullanima yönelik uygun koruyucular benzalkonyum klorid, klorobütanol, paraben ve timerosal içerir. Enjekte edilebilir bir formülasyon Ringer Laktat gibi farmasötik olarak kabul edilebilir bir eksipiyani içerebilir. "Tasiyici" terimi dogal veya sentetik yapili organik veya inorganik bir bilesene refere eder, burada aktif bilesen uygulamayi kolaylastirmak, arttirmak veya saglamak amaciyla kombine edilir. Bulusa göre "tasiyici" terimi ayrica bir hastaya uygulama için uygun olan, bir veya daha fazla uygun kati veya sivi dolgu maddesi, seyreltici veya enkapsülleme maddesi içerir. Parenteral uygulama için muhtemel tasiyici maddeler, örnegin steril su, Ringer, Ringer laktat, steril sodyum klorid solüsyonu, polialkilen glikoller, hidrojenize naftalenler ve özellikle biyouyumlu laktid polimerler, laktid/glikolid kopolimerler veya polioksietilen/polioksi- propilen kopolimerlerdir. Burada kullanildiginda "eksipiyan" teriminin, mevcut bulusun farmasötik bir bilesiminde mevcut olabilen ve örnegin tasiyicilar, baglayicilar, kayganlastiricilar, koyulastiricilar, yüzey aktif ajanlari, koruyucular, emülgatörler, tamponlar, lezzet verici ajanlar veya renklendiriciler gibi aktif bilesenler olmayan tüm maddeleri göstermesi tasarlanir. Burada açiklanan ajanlar ve bilesimler uygun herhangi bir yol vasitasiyla, örnegin enjeksiyon veya infuzyon dahil parenteral uygulama ile uygulanabilir. Uygulama tercihen parenteral olarak, örnegin intravenöz olarak, intraarteriyel olarak, subkütanöz olarak, intradermal olarak veya intramüsküler olarak gerçeklesir. "Parenteral uygulama" terimi, intravenöz veya intramüsküler enjeksiyon ile oldugu gibi, sindirim kanalindan baska bir sekilde olan uygulamaya refere eder. Sistemik uygulama enteral, diger bir ifadeyle gastrointestinal kanal yoluyla absorpsiyon içeren uygulama veya parenteral olan bir uygulama yoludur. Parenteral uygulama için uygun bilesimler genellikle aktif bilesigin aköz veya aköz olmayan steril bir preparatini içerir, bu tercihen alicinin kani için izotoniktir. Uygun tasiyicilar ve solventlerin örnekleri Ringer solüsyonu ve izotonik sodyum klorid solüsyonudur. Ek olarak genellikle steril, sabit yaglar solüsyon veya süspansiyon ortami olarak kullanilir. Burada açiklanan ajanlar ve bilesimler etkili miktarlarda uygulanir. "Etkili miktar" terimi, tek basina veya ilave dozlar ile birlikte istenilen bir reaksiyonu veya istenilen bir etkiyi elde eden miktara refere eder. Belirli bir hastaligin veya belirli bir durumun tedavisi durumunda istenilen reaksiyon tercihen hastalik seyrinin inhibisyonu ile ilgilidir. Bu, hastaligin ilerleyisinin yavaslatilmasini ve özellikle hastaligin ilerleyisinin sekteye ugratilmasi veya ters çevrilmesini içerir. Bir hastalik veya bir durumun tedavisinde istenilen reaksiyon ayrica söz konusu hastalik veya söz konusu durumun baslangicinin geciktirilmesi veya baslangicinin önlenmesi olabilir. Burada açiklanan bir ajan veya bilesimin etkili bir miktari, tedavi edilen durum, hastaligin ciddiyeti, yas, fizyolojik durum, boy ve agirlik dahil olmak üzere hastanin bireysel parametreleri, tedavi süresi, eslik eden terapinin (bulunmasi halinde) türü, spesifik uygulama yolu ve benzer faktörlere bagli olacaktir. Buna uygun olarak burada açiklanan ajanlarin uygulanan dozlari bu tür çesitli parametrelere bagli olabilir. bir hastadaki bir reaksiyonun bir baslangiç dozu ile yetersiz oldugu durumda daha yüksek dozlar (veya etkili sekilde farkli, daha lokalize bir uygulama yolu elde edilen daha yüksek dozlar) kullanilabilir. Mevcut bulus, sadece açiklama amaçlarina yönelik kullanilan ve sinirlandirici olarak ifade edilmeyen asagidaki sekiller ve örnekler ile detayli sekilde açiklanir. Açiklama ve örnekler sayesinde benzer sekilde bulusa dahil edilen ilave düzenlemeler uzman çalisan için ulasilabilirdir. Istemlerin içermedigi sekiller ve örneklerde açiklanan konu sadece karsilastirma amaçlarina yönelik açiklanir. SEKILLER Sekil 1: Su (a), PBS (b) ve 2.2 mM CaClz ilavesinden sonra PBS (c) ve 22 mM CaC12(d) içinde farkli DOTMA/RNA yük oranlarinda (2/ l, 1/ 1, l/2, 1/4) F4/RNA lipoplekslerin boyutu. Sekil 2: DOTMA/Chol lipozomlar (F5) ve lipoplekslerin farkli tamponlar ve DOTMA/RNA yük oranlari l/l ve 2/ l,deki (pozitif fazlalik) partikül boyutlari. Sekil 3: Farkli CaClz miktarli kullanilarak RNA kompaksiyonundan sonra yük oranlarinda (l/l) ve (1/2) F5/RNA lipoplekslerin ortalama boyutu. Sekil 4: DOTMA/DOPE lipozomlari ile RNA lipoplekslerinin fiziko- kimyasal karakterizasyonundan seçilen sonuçlarin genel açiklamasi. X- ekseni, DOTMA ile RNA arasindaki yük oranini verir. Üst: PCS ölçümlerinden elde edilen partikül boyutu, orta: polidispersite indeksi, alt: ayni fomiülasyonlarin zeta potansiyelleri. Çizgiler, göze kilavuzluk etmek için yerlestirilmistir. Sekil 5: (a) su ve konsantre tainponun PBS`ye (1x) ilavesinden sonra sodyum klorid (150 mM), glukoz (%5) veya fosfat tamponlu glukoz içinde yük oraninda (l/2) F4/Luc-RNA lipoplekslerin ortalama boyutu. Tüm tampon kosullari (gösterilmemistir) altinda agregasyona yol açan l/l oraninin aksine 1/2 oraninda lipoplekslerin partikül boyutu yaklasik olarak 220 nm"dir. (b) Boyut polidispersitesi, kolloidal stabilitesini gösteren 0.23 ila 034 araligindadir. Sekil 6: (a) Seçilen DOTMA/RNA yük oranlarinda F4/RNA lipoplekslerin ortalama boyutu. `1:1.8 ile 1:1.4 arasinda yük oranlari olan lipoplekslerin partikül boyutlari yaklasik olarak 160 nm"dir. Azalan negatif fazlalik (yük orani 121.2) ile partikül boyutu, 183 nm olarak belirlenmistir. (b) Test edilen tüm yük oranlari, 0.2,den daha az olan küçük polidispersite indeksleri olan lipoplekslere yol açar. Sekil 7: (a) Yaklasik olarak 400 nm (134-400), 200 nm (F4-200), 100 nm (F4-100) veya 50 nm (F4-50) gözenegi olan bir polikarbonat membranin kullanildigi ekstrüzyon isleminden sonra, ekstrüzyon (F4-raw) olmaksizin su içinde DOTMA/DOPE lipozomlarin (12) Ortalama Boyutu. Su (2:) ve PES tamponu (3:) içinde 1/2 olan DOTMA/RNA yük oranina sahip karsilik gelen lipopleksler. (b) 0.10 ila 0.28 araliginda ekstrüde edilmis lipozomlar ile lipoplekslerin boyutunun polidispersitesi. Ancak ekstrüde edilmemis lipozomlar ile olusturulan lipopleksler ayrica yeterince dar bir boyut dagilimi göstermistir. Sekil 8: Liyofilizasyon öncesinde ve liyofilizasyon ve su kullanilarak sulandirma isleminden sonra belirlenen DOTMA/DOPE lipozomlarinin (F4) ortalama boyutu (a) ve Polidispersite Indeksi (b). Sekil 9: Farkli DOTMA/DOPE oranlari olan lipozoinlarin partikül boyutu. Yüksek DOPA (%90) fraksiyonu bulunan lipozomlar için partiküller, PBS ve agrega içinde stabil degildir. Sekil 10: Farkli DOTMA/DOPE oranlari içeren lipozomlar ile lipoplekslerin partikül boyutu. 9/1 ila 4/6 arasinda DOTMA/DOPE orani ile lipopleksler, düsük PI degerleri (<0.2) olan tanimlanmis partikül boyutlarina (<300 nm) sahiptir. Daha yüksek DOPE fraksiyonu ile, yüksek Pl degerleri olan daha büyük partikül boyutlari elde edilir. Sekil 11: 4.8zl, 2.421, 1.221, 1.2:2, 1.2:4 olan F42RNA oranlarini vermek üzere farkli miktarlarda F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilen lusiferaz-RNA'nin (20ug) BALB/c farelerine enjeksiyonundan sonra in vivo ve ex vivo lusiferaz aktiviteleri. Sekil 12: Sekil llide gösterilen deneyden elde edilen organlar arasinda toplam lusiferaz sinyalinin dagilimi. Sekil 13: F 11 veya F12 lipozomlari ile kompleks hale getirilen Lusiferaz- RNA7nin (20ug) BALB/c farelerine enjeksiyon sonrasinda in vivo ve ex vivo lusiferaz aktiviteleri. Sekil 14: F2 veya F5 lipozomlari ile kompleks hale getirilen Lusiferaz- RNA"nin (20ug) BALB/c farelerine enjeksiyon sonrasinda in vivo ve ex vivo lusiferaz aktiviteleri. Sekil 15: 1212 olan bir F42RNA orani ile lX PBS (B) içinse seyreltilmis veya su (A ve C) içinde seyreltilmemis F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilen IX PBS (A) içinde seyreltilmis veya su (B ve C) içinde seyreltilmemis Lusiferaz-RNA (20ug) enjeksiyonundan sonra farelerin dalaklarindaki lusiferaz aktivitelerinin miktarinin belirlenmesi. Tüm komplekslerin nihai PBS konsantrasyonlari lX PBS,ye ayarlanmistir. Sekil 16: 0.125 veya lmM CaClz ile önceden kompleks hale getirilen veya ön komplikasyon olmaksizin ve 1222 olan bir F41RNA orani olan F4 lipozomlari ile karistirilan Lusiferaz-RNA (20pg) enjeksiyonundan sonra farelerin dalaklarindaki lusiferaz aktivitelerinin miktarinin belirlenmesi. Sekil 17: IX PBS veya 154mM NaCl içinde seyreltilen ve 1222 olan bir F42RNA orani ile karistirilan Lusiferaz-RNA (20ug) veya F4 lipozomlarinin enjeksiyonundan sonra farelerin dalaklarindaki lusiferaz aktivitelerinin miktarinin belirlenmesi. Sekil 18: 1-4 mM CaClz ile önceden kompleks hale getirilen ve dilüsyon tamponu olarak IX PBS yerine 154mM NaCl kullanilarak 1.2:2 olan bir F42RNA oranina sahip F4 lipozomlari ile karistirilan Lusiferaz-RNA (20iig) enjeksiyonundan sonra farelerin dalaklarindaki lusiferaz aktivitelerinin miktarinin belirlenmesi. Sekil 19: (A) Lusiferaz-RNA (Sag), 30 dakika %25 veya 50 fare serumunda inkübe edilmistir ve daha sonra insan monosit türevli olgun olmayan DC°lerde elektroporasyon islemine tabi tutulmustur. Lusiferaz aktivitesi, standart in vitro lusiferaz analizi vasitasiyla 18 saat sonra degerlendirilmistir. (B) Lusiferaz-RNA (20ug), 1.2:2 olan bir F4:RNA oranina sahip F4 lipozomlari ile standart protokol vasitasiyla kompleks hale getirilmistir ve daha sonra 30 dakika %50 fare serumu varliginda veya yoklugunda inkübe edilmistir. BALB/c fareleri, bu formülasyonlar ile intravenöz olarak enjekte edilmistir ve lusiferaz aktiviteleri in vivo farelerinden salaklarindan belirlenmistir. Sekil 20: Rodamin (F4-rho) (l.2:2; LipozomiRNA) ile etiketlenen F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilen CyS-RNAlnin (40ug) BALB/C farelerine enjeksiyondan sonra dalaktaki hücre popülasyonu tarafindan Cy5-RNA veya F4-rho aliniminin degerlendirilmesi. Sekil 21: (A) dendritik hücrelerin olgunlasma duruinu (CD86 ve CD40"in yukari regülasyonu ile ortaya çikarilmistir) ve (B) F4 (1.2z2; LipozomzRNA), tek basina F4 veya PBS (kontrol olarak) ile kompleks hale getirilen HA-RNA"nin (40ng) C57BL/6 farelerine enjeksiyondan sonra IF Na ve TNF a serum konsantrasyonlarinin degerlendirilmesi. Sekil 22: (A) antijen spesifik CD8+ T hücrelerinin frekanslari ve (B) farkli lipozomzRNA oranlarinda F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilen SllNFEKL-RNA (20 veya 40ug) ile C57BL/6 farelerinin immünizasyonundan sonra bellek geri çagirma yanitlarinin degerlendirilmesi. Sekil 23: 1.222 olan bir F42RNA oranina sahip F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilen SIINFEKL-RNAHnn (40ug) üç intravenöz immünizasyonunu alan veya islem görmemis sekilde birakilan ve yan taraflara s.c. 2x105B16-OVA tümör hücrelerinin enjekte edildigi C57BL/6 farelerinin Kaplan-Meier sag kalim egrileri. Sekil 24: 1.2:2 olan bir F42RNA oranina sahip F4 veya F12 lipozomlari ile kompleks hale getirilen SllNFEKL-RNAsnin (40ug) yedi intravenöz immünizasyonunu alan C57/B16 farelerinin yanlarina 2x105B16-OVA tümör hücrelerinin s.C. inokülasyonundan sonra bireysel tümör büyümesi. SIINFEKL-RNA olmaksizin tek basina lipozomlar kontrol tedavisi olarak kullanilmistir. Sekil 25: l.2:2 olan bir F42RNA oranina sahip F4 veya F 12 lipozomlari ile kompleks hale getirilen SllNFEKL-RNAmn (40ug) yedi intravenöz immünizasyonunu alan C57/Bl6 farelerinin yanlarina 2x105B16-OVA tümör hücrelerinin s.c. inokülasyonundan sonra Kaplan-Meier sag kalim egrileri. SllNFEKL-RNA olmaksizin tek basina lipozomlar kontrol tedavisi olarak kullanilmistir. Sekil 26: 4.8zl, 2.421, l.2:l, l.2:2, 1224 olan F51RNA oranlarini vermek üzere farkli miktarlarda F5 lipozomlari ile kompleks hale getirilen lusiferaz-RNA"nin (20ug) BALB/c farelerine enjeksiyon sonrasinda in vivo ve ex viv0 lusiferaz aktiviteleri. Sekil 27: Sekil 26,da gösterilen deneysen elde edilen organlar arasinda toplam lusiferaz sinyalinin dagilimi. Sekil 28: RNA"n1n ön forrnülasyonu ve RNA-lipopleks solüsyonunun sulandirilmasi. Sekil 29: Klinik formülasyon protokolüne göre sulandirilan RNA lipoplekslerin DLS ölçümlerinin sonuçlari. Alinan lipopleks partikül boyutlarinin sinirli yayilimi, karistirma prosedürünün dayanikliligini gösterir. Sekil 30: Ekstrüde edilen ve ekstrüde edilmeyen lipozomal prekürsörlerin 1:2 lipoplekslerinin Partikül boyutu ve Polidispersite Indeksi. Sekil 31: Boyut bakimindan farkli lip0pleksler elde etmek üzere küçük veya büyük lipozomlar ile kompleks hale getirilen lusiferaz-RNA"nin (20 ug) BALB/c farelerine enjeksiyon sonrasinda in vivo lusiferaz aktiviteleri. Sekil 32: Boyut bakimindan farkli LusiferaZ-RNA lipoplekslerinin enjeksiyonundan sonra farelerin dalaklarindaki lusiferaz aktivitelerinin miktarinin belirlenmesi. Daha büyük lipozomlardan düzenlenen, daha genis lipopleksler, lipozomlarin lipid bilesiminden bagimsiz olarak daha yüksek aktiviteye sahiptir. Sekil 33: 'normal' ve 10X konsantre formunda NaCl ve PES tamponu kullanilarak olusturulan lipopleksler. Sonraki durumda 10 kat daha düsük bir hacim, ayni nihai konsantrasyonu elde etmek üzere eklenmistir. Tüm lipopleksler yaklasik ayni boyuta sahiptir ancak konsantre solüsyonlardan elde edilenler bir miktar daha küçüktür. Sekil 34: Sekil 33% ölçülen lipoplekslerin aktivitesi (luc ifadesi). Bir egilim olarak konsantre edilmemis tainponlardan lipopleksler aktivite bakimindan daha yüksektir. Normal salin ile tedavi en yüksek aktiviteyi saglar. Sekil 35: Farkli konsantrasyonlarda NaCl`nin RNA°ya eklenmesinden sonra olusan lipopleksler. Nihai NaCI konsantrasyonu tüm durumlarda aynidir, konsantre solüsyonlardan daha küçük hacimler eklenmistir. Bir egilim olarak lipoleks boyutu, eklenen NaCl solüsyonunun azalan konsantrasyonu ile artar. Daha büyük lipopleksler, aktivite bakimindan küçük olanlardan daha yüksek oldugundan %0.9 NaCl (150 mM) kullaniminin en iyi aktivite ile sonuçlandigi düsünülür. Sekil 36: Dogrudan sulandinnadan sonra ve 2 saat ve 24 saat sonra farkli karistirma oranlari (DOTMA/nükleotid oranlari) olan lipopleksler için Boyut (Zave) ve Polidispersite Indeksi (Pl). Sekil 37: In vivo test edilen farkli yük oranlarina sahip RNA lipoplekslerinin DLS ölçümlerinin sonuçlari. Sekil 38: Boyut bakimindan farkli Lusiferaz-RNA lipoplekslerin enjeksiyonundan sonra farelerin dalaklarindaki lusiferaz aktivitelerinin miktarinin belirlenmesi. ÖRNEKLER Burada kullanilan teknikler ve yöntemler, burada açiklanir veya kendi basina bilinen bir sekilde veya Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y."de açiklanan sekilde gerçeklestirilir. Kitlerin ve reaktiflerin kullanimi dahil tüm yöntemler, spesifik olarak belirtilmedikçe üreticinin bilgisine göre gerçeklestirilir. Referans Örnek 1: Materyaller ve Yöntemler Lipozomun hazirlanisi Lipozomlarin üretimi, farkli protokoller ile gerçeklestirilmistir. 'Film yöntemi' veya 'etanol enjeksiyonu', lipozomun hazirlanmasi için kullanilmistir. Film yöntemi için lipidler, kloroform içinde çözünmüstür ve uygun miktarlarda yuvarlak tabanli bir balona yerlestirilmistir. Organik solvent, döner bir buharlastiricida buharlastirilmistir ve kuru film, balonun hafifçe çalkalanmasi ile su veya tampon/eksipiyan solüsyonu ile sulandirilmistir. Tipik olarak toplamda 5mM`lik bir lipid konsantrasyonu seçilmistir. Etanol enjeksiyonu için lipidler, 100-400 mM,lik aralikta toplam konsantrasyona etanol içinde uygun molar oranlarda çözünmüstür. Etanol solüsyonu, su veya aköz tampon/eksipiyan solüsyonunda karistirina altinda enjekte edilmistir. Lipozoinlarin boyutu, farkli gözenek boyutunda (50-400 nm) polikarbonat membranlari boyunca ekstrüzyon yoluyla ayarlanmistir ve/veya bunlar, 220-450 nm gözenek boyutu olan ticari olarak temin edilebilir steril filtreler yoluyla filtrelenmistir veya diger gözenek boyutlari (1 um-Sum) ile klinik kullanima yönelik filtreler kullanilmistir (Sartorius, Göttingen, Germany, Millipore, Schwalbach, Germany). Aköz fazdaki nihai lipid konsantrasyonu 5 mM ile 25 inM arasindadir. Lipid bilesimi HPLC analizi ile kontrol edilmistir. Partikül boyutu ve zeta potansiyeli, dinamik isik saçilmasi yoluyla belirtilmistir. Lipopleks olusumu Lipopleks olusumu, farkli protokoller ile gerçeklestirilmistir. Detayli prosedür, ayri deneyler ile saglanir. Birkaç deney için RNA solüsyonlarinin su içinde lipozom solüsyonlari veya tamponlar veya eksipiyanlarin varliginda dorudan inkübasyonu gerçeklestirilmistir. Lipopleksler ayrica etanol içinde lipid solüsyonlarinin su veya aköz tampon/eksipiyan solüsyonlari içinde RNA solüsyonlari ile karistirilmasi ile olusturulabilir. Seçilen hazirlama protokolü, istenilen partikül karakteristiklerine ve biyolojik uygulamaya dayanir ve ayrica ilgili deneyler ile açiklanir. PCS ölçümleri Partikül boyutu ve zeta potansiyeli ölçümleri, bir 380 ZLS submikron partikül / zeta potansiyel analiz cihazi (PSS Nicomp, Santa Barbara, CA) üzerinde gerçeklestirilmistir. Boyut, 2 dakikalik bir dengeleme süresi ve 15 dakikalik çalisma süresi ile 90°,lik bir saçilma açisinda Foton korelasyon spektroskopisi (PCS) ile belirlenmistir. Oto korelasyon, kütle popülasyonunun ortalama çapi ve polidispersite indeksi (Pl) hakkinda bilgi veren yogunluk ortalamali Gaussian analizi kullanilarak gerçeklestirilmistir. Zeta potansiyeli Zeta potansiyeli, 5 V/cm*1ik elektrik alan kuvveti ve 0.4 cm°lik bir elektrot araligi kullanilarak su içinde ölçülmüstür. Elektrostatik hareketlilik, Helmholtz- Smoluchowski denklemi kullanilarak zeta potansiyeline dönüstürülmüstür. Tüm ölçümler, 23°C,lik bir sicaklikta gerçeklestirilmistir. Alan-Akis-Fraksiyonasyon Asimetrik Akis FFF (AF4), asagidaki donani/parametreler kullanilarak üç açili MALS isik saçilmasi detektörü mim` DA WN TREOS(Wyatt Technologie, Dernbach, Germany) ve uzun bir kanal (275 mm uzunlugunda) ile donatilan Eclipse 3+ sistemi kullanilarak gerçeklestirilmistir: Membran: 10 kD yeniden üretilen selüloz (Microdyn Nadir, Wiesbaden, Germany) Aralayici: 250 um aralayici (genislik 21.5 mm) Solvent: 10 mM NaN03 Detektör akisi: 1.0 mL/dakika Odak akisi: 1.5 mL/dakika Enjeksiyon akisi: 0.2 mL/dakika Çapraz akis 4 mL/dakika (15 dakika, daha sonra 20 dakikada 4 gradyani: mL/dakika ila 0.] mL/dakika sabitlenmistir) Hayvanlar C57BL/6 ve BALB/c fareleri, Jackson Laboratories,dan alinmistir. Deneyler boyunca yas (8-10 haftalik) ve cinsiyet (disi) olarak eslesen hayvanlar kullanilmistir. Hücreler ve hücre hatlari B16-OVA, tavuk ovalbümin geni (OVA) ifade eden bir B16-F10 melanom hücre hattidir. Insan monosit türevli olgun olmayan DC,ler (iDC), 5 gün IL-4 (1000 U/ml) ve GM-CSF (1000 U/ml) varliginda saIlastirilmis CD14+ monositlerinden farklilastirilmistir. RNA yapilari ve in vitro transkripsiyon Çiplak antijen kodlayici RNA°nin in vitro transkripsiyonuna yönelik tüm plazmidler, 3' insan ß-globin UTR (hBgUTR) ve 120 nükleotidlik bir poli(A) kuyrugu özelligini tasiyan ve farmakolojik olarak gelistirilmis in vitro transkribe edilmis RNA`nin üretimine olanak taniyan pSTl-2hBgUTR-A120 omurgasina dayanir. SIINFEKL yapisi, tavuk OVA,ya ait aa 257-264 içerir. HA yapisi, majör immünodominant MHC epitoplarini kombine etmek üzere tasarlanan influenza HA"nin (aa 517-527,ye kaynasik aa 60-285; influenza susu A/PR/8/34) kodon optimize edilmis kismi bir dizisidir. pSTI-Lusiferaz-A120 (Luc), ates böcegi lusiferaz genini (15) içerir. RNA, in vitro transkripsiyon yoluyla üretilmistir. RNA"n1n CyS-UTP (Cy5-RNA) ile etiketlenmesi, sablon olarak HA yapisi kullanilarak üreticinin talimatlarina (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) göre gerçeklestirilmistir. Lipoplekslerin hazirlanmasi ve enjeksiyonu Standart protokol olarak aksi belirtilmedikçe RNA'lar ve Lipozomlar, karistirma öncesinde lOOulslik nihai bir hacme IX RNaz serbest fosfat tamponlu salin (PBS) (Ambion) içinde önceden seyreltilinistir. Seyreltilmis RNA ve lipozomun karistirilmasindan 10 dakika sonra 200ul lipopleks solüsyonu, her fare için intravenöz olarak enjekte edilmistir. Bazi deneyler için PBS, 154mM RNeaz serbest NaCl (Ambion) ile degistirilmistir. Akis sitometrik analiz Akis sitometrisi için monoklonal antikorlar, BD Pharmingen,den alinmistir. Hipotonik olarak parçalanmis kan numuneleri, spesifik mABiler ile 4°Cade inkübe edilmistir. Dalak hücreleri, kollajenaz (1 mg/ml; Roche) ile parçalama yoluyla elde edilmistir. H-2 Kh/SIINFEKL tetramer (Beckman-Coulter) ile SIINFEKL-spesifik CD8+ hücrelerinin miktarinin belirlenmesi daha önceden açiklanmistir. Akis sitometrik veriler, bir FACS-Canto II analitik akis sitometrisi üzerinde elde edilmistir ve F10WJO (Tree Star) yazilimi kullanilarak analiz edilmistir. Elektroporasyon 50iil RNA solüsyonu, BioRad elektro buharlastirici kullanilarak 270V ve 150iiF elektroporasyon parametreleri ile iDCalerde elektroporasyon islemine tabi tutulmustur. In vi'va biyolüminesans görüntüleme (BLI) Luc-RNAanin alimi ve translasyon, IVIS Lumina görüntüleme sistemi (Caliper Life Sciences) kullanilarak in vi'vo biyolüminesans görüntüleme yoluyla degerlendirilmistir. Kisaca aköz D-lusiferin (150 mg/kg vücut agirligi) (BD Biosciences) solüsyonu, RNA lipoplekslerin uygulamasindan 6 saat sonra i.p. enjekte edilmistir. Bundan 5 dakika sonra yayilan fotonlar ölçülmüstür (1 dakikalik entegrasyon süresi). Ilgili bölgelerde (ROI) in vivo biyolüminesans, IVIS Living Image 4.0 Yazilimi kullanilarak ortalama radyans (foton/sec/cmZ/sr) olarak ölçülmüstür. Hayvanda lusiferaz ifade eden hücrelerden kaynakli iletilmis isigin yogunlugu bir griölçek görüntüsü olarak sunulmustur, burada siyah en düsük yogunlukta ve beyaz en yüksek yogunluktaki biyolüminesans sinyalidir. Farelerin griölçek referans görüntüleri, LED düsük isik aydinlatmasi altinda elde edilmistir. Görüntüler, Living Image 4.0 yazilimi kullanilarak üst üste getirilmistir. ELISA Fare lFN-a (PBL) ve TNFa (eBioscience), üreticinin talimatlarina göre standart ELISA analizi kullanilarak fare serumunda tespit edilmistir. Tümör deneyleri Koruyucu immüniteyi belirlemek üzere fareler, üç immünizasyon almistir. Bundan sonra 2 X 105 Bl6-OVA tümör hücreleri, C57BL/6 farelerinin yan taraflarina s.c. inoküle edilmistir. Terapötik immünitenin degerlendirilmesi için ilk olarak ayni sayida tümör hücreleri inoküle edilmistir. Immünizasyonlar daha sonra tümörler, 2 ila 3 mm°lik bir çapa ulastiktan sonra baslatilmistir. Tümör boyutlari her üç günde ölçülmüstür. Tümör çapi 15 mm"yi astiginda hayvanlar öldürülmüstür. Örnek 2: Tamponlar/iyonlarin partikül boyutlari ve RNA lipoplekslerinin Pl"si üzerindeki etkisi Katyonik (pozitif yüklü) lipid DOTMA ile negatif yüklü RNA arasinda +/- farkli yük oranlarinda lipozomlar ve RNA,n1n lipopleksleri hazirlanmistir. Lipozomlarin fizikokimyasal karakteristikleri, dinamik isik saçilmasi (PCS) ve zeta potansiyel ölçümleri ile arastirilmistir. Genellikle farmasötik uygulamalar için gerekli olan tainponun ve iyonlarin kullanimi, lipoplekslerin agregasyonuna yol açabilir bu, bunlari hastalara parenteral uygulama için uygunsuz hale getirir. Lipoplekslerin ortalama çapi üzerindeki bu etkileri degerlendirmek amaciyla farkli yük oranlarinda DOTMA/DOPE (F4) lipozomlar [DOTMA/DOPE (l:l mol:mol)] ve RNA°nin lipoplekslerlerin partikül karakteristikleri, dört tampon kosulu, kisaca su, PBS tamponu, PBS arti 2.2 mM CaClz, ve PES arti 22 mM CaClz altinda belirlenmistir. Ölçümler için, kisaca, lipopleksler, RNAlnin önceden olusturulan lipozomlara eklenmesi ile olusturulmustur, daha sonra tamponlar eklenmistir. Nihai RNA konsantrasyonu yaklasik 100 ug/mlsye seçilmistir. Diger tüm konsantrasyonlar uygun sekilde ayarlanmistir veya sekillerde verilen sekilde seçilmistir. Partikül boyutlari Sekil 1'de gösterilir. DOTMA/RNA yük orani, her bir tablonun x-ekseninde verilir. (21) Su içinde düsük polidispersite indeksleri (< 0.3) olan tanimlanmis partikül boyutlarindaki (ortalama boyut 300 nm9den az) lipopleksler elde edilmistir. Ölçülen partikül boyutlari sadece yük oranindan az oranda etkilenmistir. Ancak negatif yüklü partiküller, yüksüz partiküllerden (ortalama 200 ila 250 nm,lik boyut, PI < 0.2) daha küçük (ortalama `100 ila 200 nm"lik boyut) ve daha stabildir (Pl < 0.15). (b) PBS tamponunda ayni etki daha önemlidir. Pozitif veya nötral yük orani olan karsilastirmali lipopleksler, daha genis partikülleri (pozitif yükler ile kismen stabilize edilmis) olusturur. Nötral bir yük oranina sahip karsilastirmali lipopleksler, stabil olmayan agregalar olusturur. Bunun aksine negatif yüklü lipopleksler hem stabildir (düsük bir PI < 0.2 ile gösterildigi üzere) hem de ortalama 250 nm veya daha az partikül boyutlari ile kompakttir. (c) CaClgilavesinden sonra partikül boyutlarinda bir artis gözlemlenir. Ancak fizyolojik Ca++konsantrasyon1arinda (gösterilen: 2.2 mM; bazi hücre türlerinde fizyolojik konsantrasyon 5 mM kadar, nadiren 10 nm kadar olabilir) negatif yüklü partiküller, 0.6,yi asmayan bir polidispersite indeksi ile 500 nm altinda tanimlanmis boyutlara sahiptir. Asiri pozitif yükü olan karsilastirmali numune için boyut, neredeyse 1000 nmiye yükseltmistir. (d) Numunelere b) (PES) 22 mM CaClfnin eklenmesi, tahminen kalsiyum fosfat partiküllerinin olusumu nedeniyle tüm kosullar altinda agregasyon/topaklanmayi indüklemistir. Bu sonuçlar, PBS tamponu içinde oldugu gibi tamponlu solüsyonlarda ve/Veya C3C12 varliginda pozitif veya nötral yük oranlarinin stabil lipozomal formülasyonlarin üretimi için çok uygun olmadigini gösterir. Lipoplekslerin stabilitesi yüksek derecede katyonik DOTMA lipid ile yüklü RNA arasinda +/- yük oranina baglidir. Ek olarak formülasyon tamponunun iyonik mukavemeti ve iki degerlikli katyonlarin varligi, partikül boyutlari üzerinde güçlü etkilere sahiptir. Fizyolojik kosullar (diger bir ifadeyle pH 7.4; 2.2 mM Ca++) altinda negatif bir yük oraninin, karsilastirmali nötral veya pozitif yüklü lipoplekslerin instabilitesi nedeniyle zorunlu oldugu görünür. Asiri negatif yüke sahip lipopleksler için agregasyon için en düsük egilim gözlenmistir. Referans Örnek 3: Pozitif yükün RNA lipoplekslerinin stabilitesi üzerindeki etkisi Pozitif yüklerin lipoplekslerin stabilitesi üzerinde potansiyel faydali/zararli etkisinin ek bir degerlendirmesi için (bakiniz örnegin Sekil 1 b ve c) 1/1 ve 2/1 olan DOTMA/RNA yük oranlari olan RNA ve DOTMA/Chol lipozomlar (F5) [DOTMA/Chol (lzl molzmol) lipoplekslerinin partikül boyutlari, farkli tamponlarda ölçülmüstür (bakiniz Sekil 2). Karsilastirma için ayrica saf lipozomlarin boyutu ölçülmüstür. 150 mMilik sodyum klorid ve ayrica PBS tamponu içinde pozitif bir 2/1 DOTMA/RNA yük orani, 0.4"ten daha büyük bir polidispersite indeksi ile büyük ölçüde artmis/agrega haline gelmis partikül boyutlarina yol açar. Bu sonuç, pozitif yüklerin lipopleksleri stabilize etmek için uygun olmadigini ve agregasyonunun, fizyolojik kosullar altinda pozitif yüklü lipopleksler için beklenmesi gerektigini gösterir. Örnek 4: Iki degerlikli katyonlarin aracilik ettigi RNA°nin ön- kompaksiyonunun RNA lipoplekslerinin partikül boyutu üzerindeki etkisi Komplekslestirme isleminden önce iki degerlikli katyonlar kullanilarak RNA°n1n ön-kompaksiyonunun etkisini test etmek üzere F5/RNA lipoplekslerin yük oranlarinda (1/1 karsilastirmali) ve (1/2) partikül boyutu, farkli CaClz miktarlari ile RNAanin koinpaksiyonundan sonra belirlenmistir. Buradaki Örnekler 2 ve 3,ün aksine iyonlar, lipopleks olusumundan önce RNA2ya eklenmistir. Nihai lipozom konsantrasyonu tüm durumlarda 100 uM"dir ve RNA konsantrasyonu buna uygun sekilde ayarlanmistir. F5/RNA 1/2 için RNA konsantrasyonu iki katina çikartilmistir, burada ayrica CaClz konsantrasyonu iki katina çikartilmistir. Fizyolojik CaClz konsantrasyonlari ile yüksüz RNA/F5 (121 karsilastirmali) lipoplekslerin ön islemi sonrasinda ortaya çikan lipopleks partikülünün ortalama boyutu arttirilir (diger bir ifadeyle 1.2 pm°ye); bakiniz Sekil 3. Bu büyük boyut nedeniyle bu tür partiküller, farmasötik bilesimler ve/veya RNA"nin hücrelere dagitimi için ideal olarak uygun degildir. Bunun aksine negatif yüklü lipopleksler ve düsük/yüksek CaClz konsantrasyonlari (düsük: 0.3 mM; yüksek: 4.4 mM) ile yapilan ön-kompaksiyon deneyleri, yaklasik olarak 200 (350) nm°lik küçük boyutlu partiküller olusturmustur. Bu sonuçlar, RNA`nin iki degerlikli iyonlar ile önceden yogunlastirilabildigini gösterir. Bu ön yogunlastirma adimi nedeniyle tanimlanmis ve kompakt partikül boyutlari olan lipopleksler, negatif yük oranlarinda olusturulabilir; agregasyon veya partikül boyutunun önemli ölçüde artisi önlenebilir. Örnek 5: RNA lipoplekslerinin fiziko-kimyasal karakterizasyonu Sekil 4ite, DOTMA ile RNA arasinda +/- farkli yük oranlarinda F4 (DOTMA/DOPE) ile RNA lipoplekslerin fîziko-kimyasal karakterizasyondan elde edilen sonuçlar verilir. Negatif yüklü lipopleksler için görülebildigi üzere l/l (karsilastirmali) ve üzerinde +/- oranlarinda partikül boyutu, yaklasik 200 nmide sabittir. Zeta potansiyeli, +/- 2/ 1 ila l// 1 ,den (her ikisi karsilastirmali) monoton bir biçimde azalir ve daha yüksek asiri negatif yükte sabit kalir. Bu sonuçlar, önemli partikül karakteristikleri, kisaca partikül boyutu ve zeta potansiyelinin, l/l (karsilastirmali) oranindan baslayarak asiri RNA ile sabit oldugunu belirtir. Bu aralikta iyi tanimlanmis boyutta kolloidal stabil partikülleri üretilebilir. Ayrica iyonlar ve tamponlarin (PBS) varliginda benzer sonuçlar elde edilebilir. Örnek 6: Tampon bilesiminin negatif yüklü RNA lipoplekslerin stabilite/partikül boyutu üzerindeki etkisi Ayrica farkli tamponlarda lipoplekslerin stabilitesi detayli sekilde arastirilmistir. Asiri bir negatif yükün potansiyel ilgili tampon sistemlerinde kolloidal stabil lipoplekslere yol açip açmadigini test etmek üzere su içinde ve konsantre tamponun PBS°ye (1x) ilavesinden sonra sodyum klorid (150 mM), glukoz (%5) veya fosfat tamponlu glukoz yük oraninda (1/2) F4/Luc-RNA lipoplekslerin partikül boyutlari belirlenmistir (bakiniz Sekil 5). Test edilen tüm kosullar altinda partikül boyutlari, belirgin sekilde 0.4"ten daha az olan PI degerleri ile 300 nm`yi asmaz. Bu sonuçlar, burada açiklanan sekilde üretilmesi halinde, '/2 olan bir yük oranina (negatif yüklü RNA fazlasi) sahip RNA lipopleksleri farkli tampon kosullari altinda kolloidal olarak stabil oldugunu gösterir. Örnek 7: Negatif yük orani ve partikül boyutu/stabilite korelasyonu (1/1, karsilastirmali) ile (1/2) arasinda lipoplekslerin kolloidal stabilitesi ayrica arastirilmistir. 1:1.8 ile 1212 (karsilastirmali) arasindaki yük oranlarina sahip F4/RNA lipoplekslerin partikül boyutlari su içinde ölçülmüstür; bakiniz Sekil 6. Bu sonuçlar, test edilen yük oranlari araliginda lipoplekslerin partikül boyutunun, fazla RNA,da minör degisikliklere karsi sabit oldugunu gösterir. l:l.2 (karsilastirmali) ila 1:1.8 olan test edilen (negatif) yük oranlari ile baglantili olarak partikül boyutlari, 0.2,den daha az PI degerleri ile genellikle 100 ila 200 nm araligindadir. Örnek 8: Ekstrüzyonun ortalama partikül boyutu ve RNA lipoplekslerinin PI degerleri üzerindeki etkisi Bu deneyde farkli boyutta lipoplekslerin üretilebildigi gösterilir. Ek bir ekstrüzyon adiminin ortalama partikül boyutu ve lipozomlar veya RNA lipoplekslerinin PI degerleri üzerindeki etkisini belirlemek amaciyla ekstrüzyon deneyleri (farkli gözenek çaplari olan bir polikarbonat membran kullanilarak) gerçeklestirilmistir. Su veya PBS içinde ekstrüde edilmis F4 ile ve ekstrüde edilmemis F4 (DOTMA/DOPE) ile RNA lipoplekslerinin partikül boyutlandirilmasindan elde edilen sonuçlar Sekil 7,de gösterilir. Deneyler, daha önceden açiklanan 200-300 nm`lik boyut araligina ek olarak ayrica daha büyük ve daha küçük partiküllerin üretilebildigini gösterir. Burada bir örnek olarak 400-500 nm araliginda ve <100 nm boyuta sahip partiküller saglanir. Ekstrüde edilmemis RNA lipopleksler, 400 ile 500 nm arasindaki ortalama partikül boyutlarini gösterirken RNA lipoplekslerin ekstrüde edilmesi genellikle 200 nm'den daha az boyutlari olan önemli ölçüde daha küçük olan partiküllere yol açar. Bunun aksine ekstrüzyonun polidispersite üzerindeki etkisi Önemsizdir; ekstrüde edilen ve ekstrüde edilmemis lipozomlar, RNA ile kompleks hale getirilmesi halinde ayri, iyi tanimlamis partiküllere (0.1 ile 0.3 arasinda Pl degerleri olan) yol açar. Örnek 9: Liyofilizasyonun partikül karakteristikleri üzerindeki etkisi Lipopleksler, uzun süreli depolama ve agregasyon için sivi süspansiyon içinde stabil degildir. Liyofilizasyon, bu zorlugu ele almaya yönelik bir tekniktir. Liyofilizasyonunun partikül karakteristikleri üzerindeki etkisi arastirilmistir. DOTMA/DOPE lipozomlarin (F4) partikül boyutlari liyofilizasyon öncesince ve liyofilizasyon ve su ile sulandirma isleminden sonra belirleninistir (bakiniz Sekil 8, burada 1.8:2 ve 2:2 olan bir yük oranina sahip kompleksler karsilastirilabilir). Bu sonuçlar, lipoplekslerin partikül karakteristiklerini etkilemeksizin liyotilize edilebildigini belirtir. Örnek 10: DOTMA/DOPE oraninin partikül karakteristikleri üzerindeki etkisi Farkli DOTMA/DOPE oranlarina sahip lipozomlar ve lipopleksler üretilmistir. Oldukça yüksek DOPE fraksiyonuna (%90 mol, karsilastirmali) sahip lipozomlar PBS içinde stabil degildir (Sekil 9). Lipopleksler için %70 mol olan bir DOPA fraksiyonunda partikül boyutu önemli ölçüde artmistir (Sekil 10). Diger tüm bilesimler stabildir. Örnek 11: RNA lipoplekslerin in vivo uygulanmasi BALB/c farelerine (n=3), 4.8:1 (karsilastirmali), 2.4:1 (karsilastirmali), 1.2:1 (karsilastirmali), 1.2:2, 1.2:4 (karsilastirmali) olan F4:RNA oranlarini saglamak üzere F4 lipozomlarin farkli miktarlari ile kompleks hale getirilen LusiferaZ-RNA (20iig) intravenöz olarak enjekte edilmistir. Lusiferaz aktiviteleri in vivo ve ex vivo, lipopleks enjeksiyonundan 6 saat sonra in Vivo görüntüleme vasitasiyla degerlendirilmistir ve temsili fareler ve organ küineleri Sekil llide gösterilir. Sekil 12, Sekil lltde gösterilen deneyden elde edilen organlar arasinda toplam lusiferaz dagilimini gösterir. F4 (DOTMAzDOPE) çogunlukla F4:RNA of 4.811 (karsilastimali) oraninda akcigerlere, F4:RNA of 2.421 (karsilastirmali) oraninda hem akcigerlere hem de dalaga ve özellikle F4:RNA of 12:] (karsilastirmali), l.2:2, 1.2:4 (karsilastirmali) oranlarinda dalaga gider. Dolayisiyla nötral ve anyonik lipopleksler spesifik olarak dalagi hedef alirken katyonik lipopleksler esas olarak akcigeri (protein ifadesine göre) hedef alir. Karacigerde herhangi bir ifade saptanmamistir. BALB/c farelerine (n=5), 1.2:2 [Fll: DOTMA/DOPE (122 mol:mol); F12: DOTMA/DOPE (221 m01:m01)] olan bir FxzRNA oranina sahip F 11 veya F 12 lipzoinlar ile kompleks hale getirilen Lusiferaz-RNA (20ug) intravenöz olarak enjekte edilmistir. Lusiferaz aktiviteleri in vivo ve ex vivo, lipopleks enjeksiyonundan 6 saat sonra in vivo görüntüleme vasitasiyla degerlendirilmistir ve temsili fareler ve organ kümeleri Sekil l3"te gösterilir. F4 türevleri F 11 ve F 12, 1222 olan bir lipozomzRNA oraninda dalagi hedef alir. BALB/c farelerine (n=5) 1:l (karsilastirmali) [F2: DOTAP/DOPE (121 mol:mol); F5: DOTMA/Chol (121 m01:m01)] olan bir FxzRNA oranina sahip F2 veya F5 lipozomlari ile kompleks hale getirilen Lusiferaz-RNA (ZOug) intravenöz olarak enjekte edilmistir. Lusiferaz aktiviteleri in vivo ve ex vivo lipopleks enjeksiyonundaii 6 saat sonra in vivo görüntüleme vasitasiyla degerlendirilmistir ve temsili fareler ve organ kümeleri Sekil 147te gösterilir. 121 (karsilastirmali) olan lipozomzRNA oraninda F2 dalagi hedef alir, F5 hem dalagi hem de akcigerleri hedef alir. lX PBS (A) içinde seyreltilmis veya su (B ve C) içinde seyreltilmemis lusiferaz- RNA (ZOug), 1.2:2 olan bir F41RNA orani ile lX PBS (B) içinde seyreltilmis veya su (A ve C) içinde seyreltilmemis F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilmistir. Tüm komplekslerin nihai PBS konsantrasyonlari lX PBS,ye ayarlanmistir. BALB/c farelerine (n:5) A, B veya C intravenöz olarak enjekte edilmistir ve farelerin dalaklarinda lusiferaz aktivitelerinin miktari, in vivo görüntüleme vasitasiyla belirlenmistir (Ortalama + SD); bakiniz Sekil 15. Standart bir karistirma protokolü olarak hem lipozomlar hem de RNA, PBS (lX PBS nihai konsantre) içinde seyreltilir ve daha sonra esit haciinler karistirilir. Sadece RNA"nin ön dilüsyonu standart protokol kadar yeterlidir. PBS içinde RNAsnin ön dilüsyonundan yoksun diger tüm protokoller daha zayif sonuçlar vermistir. Kompleks olusturma öncesinde RNA solüsyonunda iyonlarin varligi iyi sonuçlar elde edilmesi için tercih edilir. 0.125 veya lmM CaClz ile önceden kompleks hale getirilen veya ön komplekslestirme islemi olmaksizin lusiferaz-RNA (20ug), 1.2:2 olan bir F41RNA orani olan F4 lipozomlar ile standart protokol vasitasiyla karistirilinistir. BALB/c farelerine (n:5) bu formülasyonlar intravenöz olarak enjekte edilmistir ve lusiferaz aktivitelerinin miktari in vivo, farelerin dalaklarindan belirlenmistir (Ortalama + SD); bakiniz Sekil 16. PES, bir tampon olarak kullanildiginda lmM CaClz ile RNA,nin ön yogunlasmasi, lusiferaz sinyalini 3 kat arttirir (PBS varliginda daha yüksek CaClz konsantrasyonlari, büyük partikül agregalarina yol açar). Ca2+ ile RNA"nin ön yogunlasmasi, lusiferaz sinyalinin artmasina yardim eder. lX PBS veya 154mM NaCl içinde seyreltilmis lusiferaz-RNA (20ug) veya F4 lipozomlar, 1.2:2 olan bir F41RNA orani ile karistirilmistir. BALB/c farelerine (n=5), bu formülasyonlar intravenöz olarak enjekte edilmistir ve lusiferaz aktivitelerinin miktari in vivo farelerin dalaklarindan miktari belirlenmistir (Ortalama + SD); bakiniz Sekil 17. Standart karistirma protokolü kullanilarak PBSlnin izoozmolar NaCl ile degistirilmesi PBS kadar iyi islev görmüstür. l-4 mM CâClg ile önceden kompleks hale getirilen lusiferaz-RNA (20ug), dilüsyon tamponu olarak 1)( PES yerine 154mM NaCl kullanilarak 1.2:2 olan bir F41RNA oranina sahip F4 lip020mlari ile standart protokol kullanilarak karistirilmistir. BALB/c farelerine (n=5) bu formülasyonlar intravenöz olarak enjekte edilmistir ve lusiferaz aktivitelerinin miktari in vivo farelerin dalaklarindan miktari belirleninistir (Ortalama + SD); bakiniz Sekil 18. PES, NaCl ile degistirildiginde 2mM CaClz, 4.5 kat artisa yol açarak kullanilabilir (daha yüksek CaClz konsantrasyonlari sinyali daha fazla arttirmaz). Lusiferaz-RNA (Spg), 30 dakika %25 veya 50 fare serumunda inkübe edilmistir ve daha sonra insan monosit türevli olgun olmayan DC,lerde elektroporasyon islemine tabi tutulmustur. Lusiferaz aktivitesi, standart in vitro lusiferaz analizi vasitasiyla 18 saat sonra degerlendirilmistir (Ortalama + SD); bakiniz Sekil l9A. Lusiferaz-RNA (20pg), 1.2:2 olan bir F42RNA orani ile F4 lipozomlar ile standart protokolü yoluyla kompleks hale getirilmistir ve daha sonra 30 dakika %50 fare serumu varliginda veya yoklugunda inkübe edilmistir. BALB/c farelerine (n=5), bu fonnülasyonlar intravenöz olarak enjekte edilmistir ve lusiferaz aktivitelerinin miktari in vivo farelerin dalaklarindan miktari belirlenmistir (Ortalama + SD); bakiniz Sekil 19B. Çiplak RNA, serum varliginda parçalara ayrilir. RNA7n1n F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilmesi, bunu serumdaki RNaz aracili parçalanmadan korur. BALB/c farelerine (n=3), Rodamin (F4-rho) (1.2z2; LipozomzRNA) ile etiketlenmis F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilen CyS-RNA (40pg) intravenöz olarak enjekte edilmistir. CyS-RNA veya F4-rh0,nun dalakta hücre popülasyonlari tarafindan alimi, lipopleks enjeksiyonundan 1 saat sonra akis sitomctrisi ile degerlendirilmistir; bakiniz Sekil 20. Profesyonel antijen sunan hücreler (APCWer) olarak splenik DC"1er ve makrofajlar, lipozom enkapsüle RNA ve lipozomun kendisini etkili sekilde içsellestirirken B ve T hücreleri, lipozoin enkapsüle RNA"yi ve lipozomun kendini hemen hemen hiç içsellestirmemistir. Dolayisiyla RNA Iipopleksler, splenik APC,ler ile seçici sekilde içsellestirilir. C57BL/6 farelerine (n:3), F4 (l.2:2; LipozomzRNA), tek basina F4 veya PBS (kontrol olarak) ile kompleks hale getirilen HA-RNA (40ug) enjekte edilmistir; bakiniz Sekil 21. (A) Dalakta dendritik hücrelerin olgunlasma durumu (CD86 ve CD40 yukari regülasyonu ile ortaya çikmistir), islemlerden 24 saat sonra akis sitoinetrisi ile belirlenmistir (Ortalama + SD). (B) IFNa ve TNFa serum konsantrasyonlari, islemlerden 6 ve 24 saat sonra ELISA vasitasiyla degerlendirilmistir (Ortalama + SD). DCaler üzerinde aktivasyon markörlerinin (CD86, CD40) yukari regülasyonu ile ortaya çikarildigi üzere RNA-F4 lipopleksler splenik DClleri aktive ederken lipozom tek basina aktive etmemistir. Ilginç sekilde RNA-F4 lipopleksler, önceki deneyde splenik DC"lerin %5-10"nunda saptanmasina ragmen tüm DCller, dagitim üzerine dalakta inflamatuvar bir ortamin varligina isaret ederek aktive edilmistir. RNA-lipoplekslerin enjekte edildigi tüm hayvanlarda 6 saat kansa tüksek miktarda IFNa saptanmistir (ayrica 24 saat sonra çok daha az miktarda olmasina ragmen). Ayrica TNFa saptanabilmistir ancak RNA-lipoplekslerin enjekte edildigi tüm hayvanlarda oldukça orta seviyelerde (sadece 6 saat sonra) saptanmistir. Sitokinlerin salgilanmasi, ne PBS ne de tek basina lipozomun önemli herhangi bir sitokin salgilanmasina (taban çizgisi) yol açmamasi nedeniyle RNA- lipoplekslere spesifiktir. Dolayisiyla RNA lipopleksler, sistemik inflamasyona yol açan splenik DCaleri aktive eder. C57BL/6 fareleri (n=5), 0., 3., 8. ve 15. günlerde farkli lipozom:RNA oranlarinda F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilen SIINFEKL-RNA (20 veya 40üg) ile intravenöz olarak immünize edilmistir; bakiniz Sekil 22. (A) Antijen spesifik CD8+T hücrelerinin frekanslari son immünizasyondan (20. Gün) 5 gün sonra SIINFEKL-MHC tetramer boyama islemi vasitasiyla belirlenmistir (Ortalama + SD). (B) Bellek geri çagirma yanitlari, 57. Günde F4-RNA lipoplekslerin bir diger enjeksiyonundan 62 Gün sonra SIINFEKL-MHC tetramer boyama islemi vasitasiyla degerlendirilmistir (Ortalama + SD). Yüksek derecede antijen spesifik T hücre immünitesi, F4 lipopleksler (A) ile tekrarlayan immünizasyon sonrasinda üretilebilir. Son immünizasyondan (d57) 6 hafta sonra güçlü bir lipopleks enjeksiyonu, önceki enjeksiyonlarda (B) olusan CD8 T hücre bellegini genisletebilmistir. F4 (l.2:2) kompleksleri belirginken F4 (1.221 karsilastirmali) kompleksleri agregalari olusturmustur. 40iig RNA ile F4 (1.222) tercih edilir. Dolayisiyla güçlü T hücre efektörü ve bellek yanitlari RNA- lipopleksler ile üretilebilir. 0., 3. ve 8. günlerde C57BL/6 fareleri (n : 3), 1.2:2 olan bir F42RNA oranina sahip F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilen SIINFEKL-RNAhin (40ug) üç intravenöz immünizasyonunu almistir veya islem görmeden birakilmistir. 14. günde 2x105 B16-OVA tümör hücreleri, yari taraflara s.c. enjekte edilmistir. Kaplan-Meier sag kalim egrileri Sekil 23 "te gösterilir. Tam koruma, profilaktik B16-OVA modelinde RNA lipopleks uygulamasi ile gerçeklestirilmistir. 2X105 B16-OVA tümör hücreleri, C57/B16 farelerinin (11 = 10, dO) yan taraflarina s.c. inoküle edilmistir. 10. günde (tümör çapi 2-3 mm) fareler, 1.2:2 olan bir F42RNA oranina sahip F4 veya F12 lipozomlari ile kompleks hale getirilmis SIINFEKL-RNASnin (40ug) yedi intravenöz immünizasyonunu almistir (10., 13., 17., 24., 31., 38., 45. günlerde). SIINFEKL-RNA olmaksizin tek basina lipozomlar, kontrol tedavisi olarak kullanilmistir. Ayri tümör büyümesi ve Kaplan-Meier sag kalim egrileri sirasiyla Sekiller 24 ve 25'te gösterilir. Terapötik bir modelde F4+RNA veya F12+RNA gruplari için öncem derecede gecikmis tümör büyümesi saptanmistir. Üç immünizasyondan sonra tümörlerin daralmasi her grup için gözlenmistir. BALB/c farelerine (n=3), 4.821 (karsilastirmali), 2.4:1 (karsilastirmali), 1.2:1 (karsilastirmali), 1.2i2, 1.2:4 (karsilastirmali) olan F5:RNA oranlarini saglamak üzere farkli miktarlarda F4 lipozomlari ile kompleks hale getirilen Lusiferaz-RNA (20iig) intravenöz olarak enjekte edilmistir. Lusiferaz aktiviteleri in vivo ve ex vivo, lipopleks enjeksiyonundan 6 saat sonra in vivo görüntüleme vasitasiyla degerlendirilmistir ve temsili fareler ve organ kümeleri Sekil 261da gösterilir. Sekil 27, Sekil 26lda gösterilen deneyden elde edilen organlar arasinda toplam lusiferaz sinyalinin dagilimini gösterir. F5 (DOTMAzChol), F52RNA of 4.821 (karsilastirmali) oraninda akcigerlere, F51RNA (2.411 karsilastirmali) oraninda esas olarak akcigerlere ve ayrica dalaga, F51RNA (1.221 karsilastirmali) oraninda esas olarak dalaga ve ayrica akcigerlere ve F51RNA (1.2z2, l.21:4 karsilastirmali) oraninda özellikle dalaga gider. Nötral ve anyonik lipopleksler daha spesifik olarak dalagi hedef alirken katyonik lipopleksler esas olarak akcigeri hedef alir (protein ifadesine göre). Karacigerde herhangi bir ifade saptanmamistir. Örnek 12: Lipoplekslerin klinik formülasyonu Önceden açiklanan protokolü takip eden formülasyon, iki adimdan kisaca seyreltici olarak izotonik sodyum klorid solüsyonu kullanilarak belirli bir RNA7n1n ön formülasyonu ve tanimlanmis bir miktarda lipozom eklenmesi ile lipopleks olusumu adimlarindan olusur. Ön formülasyon için öncelikle 4 ml sodyum klorid (su içinde %09 W/W) solüsyonu, bir siringa araciligiyla NaCI disina alinacaktir ve RNA°ya eklenecektir. Daha sonra 400 uL lipozom (su içinde 2.8 mg/mL toplam lipid), lipozom sisesinin disina alinacaktir ve bir kanül (iç çapi 0.9 mm) kullanilarak RNA ve sodyum klorid solüsyonuna enjekte edilmistir. Elde edilen RNA lipopleks formülasyonu (5.5 ml), intravenöz bir infüzyonun hazirlanmasindan sonra istenilen dozun dogrudan parenteral enjeksiyonu ile uygulanabilir. Bu amaca yönelik olarak RNA lipopleks formülasyonundan 5.0 mL alinacaktir ve 50 m1 izotonik sodyum klorid solüsyonu içeren bir infüzyon torbasina seyreltilecektir. Bu protokol araciligiyla yaklasik 300 ila 500 nmalik partikül boyutlarina sahip lipopleks formülasyonlari, güçlü ve tekrar üretilebilir bir sekilde elde edilir; bakiniz Sekil 28. Kullanilabilen materyaller ve bilesenler asagidaki gibidir: Bilesenler: - RNA: 10 mM HEPES ve 0.1 mM EDTA içinde 0.5 mg/ml . Seyreltici: %0.9 NaCl . Lipozomlar: 2.68 mM DOTMA, 1.34 mM DOPE, partikül boyutu (ZM) 300-500 nm Siringalar: o 5 mL'lik siringa: (örnegin Omnifix, 5 mL, Luer Lock, B. Braun Melsungen AG (Melsungen, Germany) o 1 mL"lik siringa: Injekt-F Tuberculin, 1 mL, Luer Lock, B. Braun Melsungen AG (Melsungen, Germany) Igneler: . 0.9 x 44 mm, 20 G 1 V2", BD Microlance 3, Becton Dickinson S.A. (Fraga, Spain) Yukaridaki prosedüre göre üretilen RNA lipopleks partiküllerinin boyutlari 300 nm ila 500 araligindadir; bakiniz Sekil 29. Örnek 13: Partikül boyutunun etkisi Lipoplekslerin aktivitesinin artan boyut ile arttigi gösterilir. Lipoplekslerin olusumu için kullanilan lipozomlarin boyutu ayrica lipoplekslerin boyutunu etkiler. Daha büyük lipozomlar daha büyük Iipoplekslere yol açar F4 (DOTMA/DOPE 50:50 mol/mol) ve F12 (DOTMA/DOPE 66.7:33.3 mol/mol) kullanilarak yeniden yapilandirilan RNA lipoplekslerin partikül karakteristikleri, farkli boyutlarda prekürsörler gerçeklestirilerek arastirilmistir. Bunun için, ekstrüde edilmis ve ekstrüde edilmemis lipozomlar ile lipoplekslerin partikül boyutlandirilinasina yönelik olarak 0.45 mm filtrelenmis lipozomlar gerçeklestirilmistir. Tablo 1: Lipopleks olusumu için kullanilan lipozomlarin boyutlari Formülasyon Ekstrüde edilen boyut Ekstrüde edilmemis boyut F4 164 nm 582 nm F12 163 nm 637 nm Lipopleksler için sonuçlar Sekil 30"da gösterilir. Farkli boyutlarda lipoplekslerin farkli boyutlarda prekürsörler kullanilarak üretilebildigi gösterilir. Sekiller 31 ve 323de elde edilen sonuçlar, lipozomlarin ne kadar büyük olursa bu deneyde 0 kadar büyük lipopleksler olustugunu ve o kadar yüksek lusiferaz sinyali gözlemlendigini gösterir. Örnek 14: Sodyum klorid tamponu Birkaç deney, lipozomlarin ilavesinden önce RNAiya PBS tamponunun ilavesinin, lipoplekslerin aktivitesinin artmasina yol açtigini göstermistir. Burada PBS yerine normal salin solüsyonunun (%09 örnegin 150 mM NaCl) RNA yogunlasmasi için kullanilabildigi gösterilir. Bu tür NaCI solüsyonu, lipopleks- lMP için lojistik ve kullaniini kolaylastiran, onaylanmis tibbi ilaç ürünü olarak temin edilebilir. Ayrica NaCl ve PBS,nin konsantre solüsyonlarinin, daha sonra olusan lipoplekslerin esdeger aktivitesi ile sonuçlanarak RNA için kullanilabildigi gösterilir. Ayrica detaylandirilmis boyut ölçümleri gösterilir, burada farkli sekilde konsantre edilen NaCI solüsyonlari, lipopleks olusumundan önce RNA"ya eklenmistir. Genellikle lipopleks boyutu, eklenen NaCI solüsyonunun azalan konsantrasyonu ile artar; bakiniz Sekil 35. Artan boyut, artan aktivite ile iliskili oldugundan (bakiniz Örnek 13), normal salinin ilavesi ve konsantre salinin ilave edilmemesinin daha yüksek aktivite sagladigi kabul edilir. Düzenlemeden önce yaygin tamponlar kullanilarak RNA°nin ön-formülasyonunun etkisini test etmek üzere l:2 olan bir yük oraninda lipoplekslerin partikül boyutu, farkli konsantre PBS tamponlar veya sodyum klorid solüsyonlari ile RNA,nin isleme tabi tutulmasindan sonra belirlenmistir; bakiniz Sekiller 33 ve 34. Lipozomlar ve RNA`nin PBS (1x PBS nihai konsantrasyon) içinde muamele edildigi ve daha sonra esit hacimlerde karistirildigi önceki karistirma protokolü, onaylanmis tibbi bir ilaç olarak ticari olarak temin edilebilen normal sodyum klorid solüsyonu (%09) ile basit bir karistirma islemi ile degistirilebilir. Lipopleks-IMP için karistirma protokolü olarak RNA, izotonik salin solüsyonu ile önceden formüle edilir ve daha sonra su içinde lipozomlar ile karistirilir. Sonuç" tek degerlikli iyonunun, lipopleks özellikleri önemli ölçüde etkilemeksizin lipopleks formülasyonunda ayni nihai iyonik mukavemeti elde etmek amaciyla farkli konsantrasyonlarda eklenebildigini belirtir. Örnegin 15: Lipozom/ RNA yük orani 1.3 ila 2 olan yük orani (katyonik lipidin nükleotide orani), fizikokimyasal karakteristikler ve biyolojik aktivite ile ilgili olarak uygundur. Bu oranda daha yüksek bir RNA fraksiyonunun, 1:2 oraninda oldugu gibi lipoplekslere dahil edildigi var sayilir. Ekstrüde edilmemis lipozomlarin kolloidal stabilitesi, partikül karakteristikleri ve Lusiferaz aktivitesi ayrica arastirilmistir. Lipopleksler, 1:2 ile 1.9:2 (karsilastirmali) arasinda lipozom/RNA yük oranlari olan izotonik salin solüsyonunda düzenlenmistir, bakiniz Sekiller 36 ve 37. Lipopleksler için 1.722 (karsilastirmali) olan bir yük oraninda partikül boyutu zamanla önemli ölçüde artmistir. Ekstrüde edilmis lipozomlarin lipoplekslerine göre 1:2 ile 1.622 arasinda bir yük oranina sahip lipopleksler, fazla RNA'da önemsiz degisiklikler için sabittir ve 0.3"ten daha az PI degerleri ile 350 ila 480 nm araliginda partikül boyutlari gösterir. Sekil 38"de gösterildigi üzere 1.12 ile 1.6:2 arasindaki lipozom/RNA yük oranlari, dalakta iyi bir aktivite ile sonuçlanir. TR TR