SU1738090A3 - Способ получени антибиотика S @ , штаммы стрептомицетов - продуценты антибиотика S @ - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к новым соединени м - антибиотикам и к способам их получени , более конкретно изобретение относитс  к соединени м- антибиотикам, которые могут быть получены посредством ферментации акти- номицетов Streptomyces thermoarchaen- sis штамм NC1B12015, или NC1B12111, или NC1B12112, или NC1B12113, или fiC1B12M4 на среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли , при 28-34°С, рН 5,4-7,2 в течение 5-10 сут с последующим выделением целевого продукта антибиотика Sg-,Лор- мулы он ЈН3 Н J. .,СН3 о снСО HOR где Рм - метил, этил или изопропнл,; 2. водород или метил. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 3 табл.

Description

00

о

Изобретение относитс  к новым соединени м-антибиотикам и способам их получени , более конкретно изобретение относитс  к соединени м-антибиотикам , которые могут быть получены посредством ферментации организмов Streptomyces.

Антибиотики S 54 представл ют собой группу родственных соединений формулы I

он шз н .сн,

о

более конкретно формулы II

он

СНз н

Изобретение распростран етс  на соединени , имеющие указанные выше формулы, как индивидуальные, так к их сочетани . Дл  определенных областей использовани , например в земледелии , в садоводстве или в ветеринар- 20 ной медицине, более удобным может

17380904

где RJ - метальна , этильна  или иэопропильна  группа} Rg, - водород или метильна  груп5 па

Эти шесть веществ формулы III

обозначим как фактор A (R - йзопро- пил, R - водород), фактор В (Rj - метил, R - метил), фактор С (R( - метил, R - водород), фактор D (Rj - этил, - водород), фактор Е (R - этил, R /т. - метил) и фактор F (R - изопропил, R - метил). Факторы А и С  вл ютс  особенно предпочтительными .

Факторы В, Е и F получают из компонента I, а факторы А, С и D - из компонента II.

Вещества по изобретению обладают активностью антибиотиков, например

10

15

противогельминтной, в частности, против нематод, и в особенности активностью против внутренних и внешних паразитов.

быть применение Антибиотиков S54 без разделени  на индивидуальные компоненты , однако дл  других областей использовани , например в гуманитарной медицине, может быть предпочтительным использование индивидуальных соединений .

Первоначально выделенные антибиотики S 54( легко раздел ютс  посредством хроматографии на силикагеле на два компонента, которые обладают например , противогельминтной активностью и тушат ультрафиолетовую флуоресценцию при 254 нм. Компонент I характеризуетс  значением Rf 0,7 - 0,75, а компонент II - 0,39 - 0,46, что было определено методом тонкослойной хроматографии на пластинах фирмы Мерк 5735 из силикагел  60, элюируе- мых смесью 3:1 хлороформа и этилаце- тата. Компоненты I и II, где R.  вл етс  соответственно группой -С1Ц и Н, антибиотиков S 5-4 могут быть дополнительно очищены с образованием шести веществ Формулы I, обладающих активностью антибиотика, например противогельминтной, имеющих общую формулу III

он

сн3 н„

013517

HOR

СН3

20

25

30

противогельминтной, в частности, против нематод, и в особенности активностью против внутренних и внешних паразитов.

В частности обнаружено, что такие вещества  вл ютс  активными против па- .разитирующих нематод, например Haemon- chus contortus, Ostertagia circumci- neta, Trichostrongylus colubiformis. Dictyocaulus viviparis, Cooperia on- cophera, Ostertagia ostertagi, Nip- postrongylus loraziliensis, и пара- зирующих клещиков, таких как Sarcop- tes sp., Psoroptes sp. Следовательно, эти вещества могут быть использованы 35 при лечении животных и людей, пораженных внутренними и/или внешними паразитами .

Кроме того, было обнаружено, что такие вещества обладают противофун- 40 гицидной активностью, например против штаммов Candida sp., таких как Candida albicans, Candida glabrata, и против дрожжей, таких как Saccharomyces carlsbergensis.

45 Эти вещества также активны против свободно живущих нематод Caenorhabdi- tis elegans.

Кроме того, было найдено, что вещества , полученные по предлагаемому 50 способу  вл ютс  эффективными при борьбе с насекомыми, клещевидными и нематодными вредител ми в продуктах земледели , садоводства, лесоводства, в хран щихс  продуктах и дл  общего ее здравоохранени . Вредители почвы и i растительных плодов, включа  злаки (например, пшеница,  чмень, кукуруза и рис, овощи (например, со ), фрукты (например,  блоки, виноград и цитрусовые ), а также корнеплоды (например, сахарна  свекла, картофель) могут быть эффективно уничтожены.

В частности, обнаружено, что предлагаемые вещества  вл ютс  активными, например, против фруктовых клещиков и тлей, таких как Aphis fabae, Aula- corthum curumClexuin, llyzus persicae, et all, и представителей рода Tria- 1euroides, нематод, таких как представител  рода Aphelencoides, Globo- .dera Heterodera et al., чешуекрылых, таких как Heliothis, Plutella, Spo- doptera, каландрин, таких как Antho- nonus grandis, Sitophilus granarius, мучных хрущаков, таких как Tribolium castaneum, мух, таких как 1-Iusca do- mestica, муравьев Рихтера, узкокрылых молей-минеровр Pear psylla, Thrips tabaci, тараканов, таких как Blatel- la gernanica, Periplaneta americana, и комаров, таких как Aedes aegypti.

Вообще эти вещества могут примен тьс  как в отношении хоз ина (животного или человека, или растени , или другой растительности), так и в отношении самих вредителей или их очага. Особенно предпочтительными  вл ютс  факторы А, В, С, Г), Е и F, которые указаны выше. Вещества, полу- i ченные по предлагаемому способу, могут быть использованы в виде различных лекарственных форм дл  введени  любым удобным способом в ветеринарии или медицине.

Композиции, в состав которых вход т предлагаемые вещества, могут быть использованы дл  парэнтерального (включа  внутригрудное, орального, ректального, местного или имплантного введени . При составлении композиции, котора  должна быть стериальной, например инъекци , глазные капли и мази , активный компонент сам может быть приготовлен антисептическим или стерильным , например, после обработки гамма-излучением или окисью этилена.

При использовании в садоводстве или земледелии, вещества, полученные по предлагаемому способу, могут быть включены в рецептуры сухого или - жидкого типов, например дусты, включающие основы дуста, или концентраты, порошки, включающие растворимые или увлажненные порошки, гранул ты, включающие микрогранулы или гранулы, способные диспергироватьс , таблетки, текучие гшдкости, эмульсии, такие как разбавленные эмульсии -или концентр 0

5

0

5

ты, способные эмульгироватьс , жидкости дл  погружени , такие как погружные жидкости дл  корней или дл  сем н, оболочки сем н, семенные таблетки , масл ные концентраты, масл ные растворы, инъекции, например инъекции в стебель, аэрозоли, дымы и .

Обычно такие рецептуры включают соединение в сочетании с подход щим носителем или разбавителем. Такие носители могут быть жидкими или твердыми и предназначаютс  дл  облегчени  применени  вещества или посредством диспергировани  там, где оно должно быть нанесено, или дл  обеспечени  рецептуры, котора  может быть составлена потребителем в виде препарата, способного к диспергированию. Такие рецептуры хорошо известны и могут быть получены традиционными методами, такими как, например, смешивание и/или размалывание активного компо- нента(тов) вместе с носителем или разбавителем, например твердым носителем , растворителем или поверхностно-активным веществом.

Твердые носители, подход щие дл  использовани  в рецептурах, таких как дусты, гранул ты и порошки, могут быть выбраны, например, из природных минеральных наполнителей, таких как диатомит, тальк, каолин, монтмориллонит , пирофиллит или аттапульгит. Сильно диспергированна  кремнева  кислота или сильно диспергированные поглощающие полимеры могут быть включены в композицию. Используемые гранулированные адсорбирующие носители могут быть пористыми (такими как пем0 за, размолотый кирпич, сепиолнт или бентонит) или непоркстыми (такими как кальцит или песок). Могут быть использованы подход щие предварительно гранулированные материалы, которые могут быть органическими или неорганическими и включают доломит и размолотые растительные остатки.

Используемые в качестве носителей или разбавителей растворители представл ют собой ароматические углеводороды , алифатические углеводороды, спирты и гликоли или их простые эфи- ры, сложные эфиры, кетоны, амиды кислот , сильно пол рные растворители,

, необ зательно эпоксидированные растительные масла и воду.

Также могут быть использованы традиционные неионогенные, катиоаогенные или анионные поверхностно--актив0

5

5

0

ные вещества, например этоксилирован- ные алкилфенолы и спирты, соли щелоч- ных или щелочно-земельных металлов алкилбензолсульфокислот, лигносульфо- кислоты или сульфонаты полимерных фенолов , которые обладают хорошими эмульгирующими, диспергирующими и/или увлажн ющими свойствами, или индивидуально или в сочетании в композици х .

Кроме того, в композици х могут быть использованы стабилизаторы, про- тивослеживаюциес  добавки, регул торы в зкости, св зующие и липкие добавки, фотостабилизаторы, а также удобрени , стимул торы питани  или другие активные вецества, вещества полученные по предлагаемому способу, могут быть использованы в смеси с другими инсектицидами , акарицидами и нематоцидами.

В этих рецептурах концентраци  активного материала обычно составл ет 0,01 - 99% и более, предпочтительно 0,01 - 40 вес.%.

Промышленные продукты обычно поставл ютс  в виде концентрированных композиций, которые дл  использовани  могут быть разбавлены до соответствующей концентрации активного материала , например от 0,001 до 0,0001 вес.%.

В земледелии, садоводстве и в ветеринарии может быть желательным использование цельного ферментационного бульона (без разделени  его на компоненты или факторы) в качестве источника активных веществ. Ножет L быть удобным использование высушеннс- го бульона, содержащего мицелий, 1ШШ лизированного мицели , живого или неживого мицели , выделенного из бульона с использованием методик разделени  жидкость - твердое тело или методик выпаривани , или с использованием ферментационного бульона, остающегос  после выделени  мицели . По желанию мицелий может быть пастеризован или, ибо более предпочтительно, высушен, например, методами распылительной сушки или сушки на роликах. Мицелий или бульон могут входить в состав композиций, включающих, традиционные инертные носители, среды дл  лекарств или разбавители, которые описаны выше.

Па основе таксономических исследований , конкретным микроорганизмом, способным продуцировать указанные выше вецества,  вл етс  новый вид рода

5

5

0

5

0

$

Ctreptorayces, который был назван Streptomyces thermoarchaensis. Образец этого микроорганизма, выделенного из почвы, депонирован в посто нную коллекцию культур Национальных Коллекций промышленных и морских бактерий (Исследовательска  станци  Торри, г. Абердин, Великобритани ) и ему присвоен номер ПС 1В 12015.

Изобретение также распростран етс  на любые вещества, которые способны продуцироватьс  посредством ферментации S. thermoarchaensis NC1B 12015 и которые  вл ютс  оптическими изомерами веществ формулы I. . Организм рода Streptomyces предпочтительно представл ет собой Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12015 или его мутант.

Мутанты S. thermoarchaensis NC1B 12015 могут возникать самопроизвольно или продуцирбватьс  множеством способов. Такие способы включают ионизирующее излучение, химические методы, например обработку N-метил- N -нитро-Н-нитрозогуанидином (НТГ), термообработку, генетические методики , такие как рекомбинаци , трансдук- ци , трансформаци , лизогенизаци  и лизогенное превращение, и селективные методики дл  самопроизвольных мутантов .

Так, например, получены четыре му- тантных штамма S. thermoarchaensis NCI В 12015, причем каждый штамм депонирован в коллекции культур Национальных Коллекций промышленных и морских бактерий (Исследовательска  станци  Торри, г. Абердин, Великобритани ) и им присвоены номера NC1B

12111,NC1B 12112, НС1В 12113 и NC1B 12114: S. thermoarchaensis NC1B 12111,

12112,12113 и 12114. Мутантные штаммы NC1B 12111,

12112 и 12113 выведены путем обработки спор S. thernoarchaensis NGIJ 1201 5 К-метил-К -нитро-Н-нитрозогуанидином и затем охарактеризованы одностадийным способом Холлидэ .

Мутантный штамм NC1B 12114 возник при самопроизвольной мутации S. thermoarchaensis NCI В 12015 и был иденти- сЬицирован как стойкий к стрептомицину , так как оставалс  жизнеспособным после воздействи  сульфата стрептоми- цина (100 мгк/мл) при 28°С в течение 5 сут.

Таксономические исследовани  показывают , что S.thernoarchaensis NC1B 12015 представл ет собой микроорганизм нового вида, характеристики которого описаны ниже.

Па предпочтительных спорул ционны средах - агаре овс ной муки, солодо- во-дрожжевом агаре и крахмальном агаре с неорганическими сол ми - S.ther moarchaensis NC1B 12015 обильно растет , продуциру  стабильный субстратный мицелий и воздушный мицелий, порождающий споры в открытых спиральны цепочках в виде боковых ответвлений от основных гиф. На этих средах обратна  пигментаци  желто-коричнева , а спорофоры серые. При стократном увеличении видно, что спорофоры содержат 2-5 витков в цепочке с 5-10 спорами внутри каждого витка спирали В среднем спорофоры содержат 20-50 спор. При увеличении в 12 000 в сканирующем электронном микроскопе видно , что споры имеют гладкие стенки и эллипсоидную форму 0,7x1,4 мкм в наиболее широкой части эллипсоида.

S.thermoarchaensis I d В 12015  в- лгетс  грамположительным организмом и способен расти и образовывать споры при 20-50°С.

Сравнение приведенных выше данных с опубликованными описани ми в Бер- геевском справочнике определительной бактериологии показывает, что организм 5.thernoarchaensis NC1B 12015 принадлежит к роду SLreptomyces.

Идентификацию S. thertnoarchaensis NC1B 12015 на уровне вида-группы провод т , использу  компьютеризированную матрицу идентификации.

Ниже приведены результаты 41 таксономического испытани  дл  S.thernoarchaensis NCTB 12015:

ПризнакРезультат

Цепочка спор мутовчата  - Цепочка спор жестко св занна  - Цепочка спор пр моизвита  - Цепочка спор спиральна  + Фрагментаци  мицели  - Поверхность спор гладка  + Поверхность спор морщиниста - Цвет спор серый+ Цвет спор красный - Цвет спор зеленый- Обратный желто-коричневый + Обратный красно-оранжевый - Производство меланина o

5

0

5

0

5

0

Использование адонитолаИспользование целлобиозы+

Использование D-фруктозы+ Использование мезо-инозитолаИспользование инулина+

Использование маннитолаИспользование раффинозычИспользование рамнозы+

Использование D-ксилозы-f Использование DL-альфааминомасл ной кислотыИспользование L-гистидина+ Использование L-гидрокси-

пролилаРасцепление аллантоина+

Расщепление арбутинаfРасцепление ксантина+

Расцепление пектина+

Расщепление лецитина Восстановление нитрата+

Производство сероводорода+ Устойчивость к азиду натри  (0,01% вес/об) Устойчивость к хлориду

натри  (7% вес/об)- Устойчивость к фенолу

(0,1% вес/об)+

Рост при 45°С+ Стойкость к неомицину

(50 мкг/мл)- Стойкость к рафампицину

(50 мкг/мл)+ Антибиоз к Aspergillus

niger LIV 131+ Антибиоз к Bacillus sub- tilis ПС1В 3610 Антибиоз к Streptomyces

murinus ISP 5091+

Иутантные штаммы NCI В 12111,

12112, 12113 и 12114 все имеют практически аналогичные S.thermoarchaensis существенные признаки. Однако

NC1B 12111 дл  роста требуетс  аде- нин, NC1B 12112 - серии, NC1B 12113 - гистидин, a NCIB 12114 стоек к стрептомицину .

Микроорганизмы, способные продуцировать антибиотики 55, легко могут быть обнаружены с помощью удобного мелкомасштабного теста с применением нематод Caenorhabditis elegans, например путем добавлени  испытуемого образца к суспензии нематод и определени  последующего воздействи  на хмзнеспособность последних.

Получение антибиотиков S5 путем ферментации подход щего организма

Streptomyces может быть осуществлено традиционными способами, например путем культивировани  организма Streptomyces в присутствии источника усваиваемого углерода и минеральных солей .

Источники усваиваемого углерода, азота и минеральных солей могут быть предоставлены простыми либо сложными питательными веществами. Источники углерода обычно могут включать глюкозу , мальтозу, крахмал, глицерин, кормовую патоку, декстрин, лактозу, сахарозу , фруктозу, карбоновые кислоты, аминокислоты, глицериды, спирты, ал- каны и растительные масла Вообще источники углерода могут составл ть 0,5 - 10% от веса ферментационной среды.

Источники азота могут включать муку соевых бобов, жидкости замочки е зерна, растворимые продукты перегонки , экстракты дрожжей, муку сем н хлопчатника, пептоны, размолотую ореховую муку, солодовый экстракт, кормовую патоку, казеин, смеси аминокислот , аммиак (газ или раствор), аммонийные соли или нитраты. Также могут примен тьс  мочевина и другие амиды. Источники азота могут составл ть 0,1- 10% от веса ферментационной среды.

Питательные минеральные соли, которые могут быть введены в культу- ральпую среду, включают соли, способные выдел ть ионы натри , кали , ам- монил, железа, магни , цинка, никел , кобальта, марганца, ванади , хрома, кальци , меди молибдена, бора, фосфора , сульфата, хлора и карбоната.

Дл  регулировани  избыточного вспе- 40 быть собран с использованием традиниваии  может присутствовать противо- пенна  добавка, которую добавл ют периодически по мере надобности.

Культивирование организма Streptomyces обычно осуществл ют при 20- 50°С, предпочтительно 25-40°С, особенно около 34°С, причем желательно, чтобы культивирование протекало при аэрировании и перемешивании, например , -посредством встр хивани  и перемешивани . Среда может быть первоначально инокулирована небольшим количеством суспензии микроорганизма, производ щего споры. Причем, чтобы избежать задержки роста можно приготовить вегетативный инокул т организма путем инокулировани  небольшого количества культуральной среды споро- образующим организмом, полученный ве

5

гетативный инокул т может быть перенесен в ферментационную среду или, . что-более предпочтительно, на одну или несколько затравочных стадий, где происходит дальнейший рост до переноса в основную ферментационную среду. В основном ферментаци  осуществл етс  при рН 5,5-8,5, предпочтительно 5,5-7,5.

Ферментаци  может проводитьс  в течение 2-10 сут, например около 5 сут.

Разделение материала, содержащего антибиотики и любые их компоненты или факторы, или введение любых их компонентов или факторов осуществл ют с помощью традиционных методик выделени  и разделени . Антибиотики S 541 преимущественно содержатс  в мицелии клеток, но также могут быть найдены в ферментационном бульоне. Выделение может быть проведено до или после осветлени  ферментационного бульона , выбор методики выделени  может широко варьироватьс .

Антибиотики могут быть выделены и разделены с помощью множества методик фракционировани , например с помощью адсорбции-элюировани , осаждени , дробной кристаллизации и экстракции растворителем, которые могут сочетатьс  различным образом.

Найдено, что экстракци  растворителем , хроматографи  и дробна  кристаллизаци   вл ютс  наиболее пригодными дл  выделени  и разделени  веществ , получаемого по предлагаемому способу.

После ферментации мицелий может

5

0

S

0

5

ционных методик, например фильтрации или центрифугировани . После этого материал может быть экстрагирован из мицели  подход щим органическим растворителем , таким как кетон, ацетон, метилэтилкетон или метилизобутилка- тон, углеводород, например, гексан, галоидированный углеводород, например хлороформ, четыреххлористый углерод или хлористый метилен, спирт, например метанол или этанол, или диол, например пропандиол-1,2, или сложный эфир, например метилацетат или этил- ацетат. Если мицелии содержат значительное количество воды, то предпоч- i тительно использование водорастворимого растворител .

Дл  достижени  оптимального выделени  необходима более чем одна экстракци . Предпочтительно первую экстракцию провод т с использованием смешивающегос  с водой растворител , такого как метанол или ацетон. Антибиотики могут быть выделены в виде сырого экстракта посредством удалени  растворител . Экстракты растворител  i могут быть сами экстрагированы после уменьшени  объема растворител , например , посредством выпаривани . На этой стадии предпочтительно использовать не смешивающийс  с водой растворитель , такой как гексан, хлороформ, хлористый метилен или этилацетат или их смесь, причем дл  достижени  удовлетворительного распределени  соединений-антибиотиков добавл ют достаточно количество воды. При удалении не смешивающейс  с водой фазы получают материал, содержавщй антибиотики 54 акт°Р В может быть выделен посредством кристаллизации из подход щего растворител , например изопропа- нола.

Очистка и/или разделение активных компонентов и/или факторов могут быть осуществлены традиционными способами, такими как, например, хроматографи  (включа  жидкостную хроматографию высокого разрешени ) на подход щем носителе , таком как силикагель, нефункциональна  макросетчата  адсорбционна  смола, например, сшитые полисти- рольные смолы, такие как амберлит XAD-2, XAD-4 или XAD-1180 (фирма Роом и Хаас, Лтд.), или смола S112 (фирма Касталл. Лтд.), или совместно с органическим растворителем сшитый декстран, такой как сефадекс LH20 (бирма Фармаци  Ю-Кей.Лтд.), или в случае жидкостной хроматографии высокого разрешени  - обратимофазные носители, такие как привитой углеводородный силикагель, например привитой силикагель. Этот носитель

более предпочтительно, набит в колонку . В случае нефункциональных макро- сетчатых смол, таких как XAD-1180 или S112, дл  элиюровани  могут быть использованы смеси органических растворителей , например ацетопирил с водой .

Обычно раствор веществ в подход щем растворителе запускаетс  в колонки с силикагелем или сефадексом после первого уменьшени  объема растворител . Колонка необ зательно может быть промыта и затем элюирована раст0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ворителем подход щей пол рности. В случае гесЪадекса и силикагел  в каче-1 стве растворителей могут быть использованы спирты, такие как метанол, углеводороды , такие как хлороформ или хлористый метилен, или сложные эфиры, такие как этилацетат. Кроме того, могут примен тьс  сочетани  таких растворителей или без воды, или с водой .

За ходом элюировани  и разделени / /очистки веществ можно следить, использу  традиционные методики, такие как хроматограби , например тонкослойна  хроматографи  и жидкостна  хроматограсЬи  высокого разрешени .

При хроматографировании на силика- гсле, предпочтительно с использованием элюента, такого как смесь хлороформ: этилацетат, антибиотики S541 легко раздел ютс  на компоненты I и II, причем компонент I элюируетс  первым. Затем легко могут быть получены из компонента I факторы В, Е и Г с использованием, например, жидкостной хроматограсЬии высокого разрешени . Аналогично, факторы А, С и D легко могут быть выделены из компонента II. Альтернативно фактор В может быть разделен с факторами Е и F путем кристаллизации из спирта, такого как метанол или изопропапол. По желанию,маточные растворы, содержащие йакторы Е и Г, могут быть подвергнуты дальнейшей очистке, например хроматографической на силикагеле, причем факторы Е и F выдел ют с использованием жидкостной хроматографии высокого разрешени .

После того как эти факторы получены , они могут быть очищены дополнительно посредством кристаллизации, например, из метанола, изопропанола или смеси метанол/вода, и это распростран етс  на вещества, наход щиес  в кристаллическом состо нии.

С помощью подход щего сочетани  указанных выше методик вещества, полученные согласно предлагаемому способу , выдел ют в твердом состо нии. Причем пор док, в котором провод тс  указанные выше стадии очистки, и выбор этих стадий дл  применени  могут широко варьироватьс .

Так, Лактор В был получен как t кристаллическое твердое вещество, имеющее степень чистоты выше 90%. Аналогично йакторы А, С, D, Е и F имеют степень чистоты выше 90%. Однако эти Лекторы используютс  со степенью чистоты, соответствующей их предполагаемому использованию: дл  применени  в медицине желательна степень чистоты по меньшей мере 90%, предпочтительно выше чем 95%} дл  использовани  в ветеринарии, земледелии или садоводстве достаточны степени чистоты, например, 50% или ниже.

Изобретение иллюстрируетс  примерами , где прин ты следующие сокращени : ТСХ - тонкослойна  хроматографи  (с использованием пластинок фирмы Мерк 5735 с силикагелем 60, про вленных смесью (3:1) хлороЛорм:этил- ацетат) } ХК - хроматографи  на колонке фирмы Мерк 7734 с силикагелем 60 (колонка длиной 200 и диаметром 4 см) элюируемой смесью (3:1) хлороформ: этилацетат; КХВР - жидкостна  хроматографи  высокого разрешени / ПЭ - петролейный эфир (т.кип. 60-80°С).

Среды Л, В и С, которые упоминаютс  в примерах, имеют следующий состав .

Среда Л, г/л:

D-Глюкоза15,0

Глицерин15,0

Соевый пептон15,0

Хлористый натрий 3,0 Углекислый кальций 1,0 Дистиллированна  вода До 1 л рН довод т до значени  7,0 водным раствором едкого натра до выдерживани  в автоклаве. Среда В, г/лг

D-Тлюкоза2,5

Солодовый декстрин М ЗОЕ (фирма Рокуетт, Лтд. Великобритани ) 25,0 Арказой 50 (фирма Бритиш Лркади Ко., Лтд.) Кормова  патока

КгНР04

12,5 1,5 0,125 1,25

Карбонат кальци  MOP (N-морфолино)- пропансульфокислота 21,0 Дистиллированна  вода До 1 л рН довод т до значени  6,5 водным 5 н. раствором едкого натра до выдерживани  в автоклаве. Среда С, г/л:

В-Глюкоза2,5

Солодовый декстрин МД ЗОЕ (фирма Рокуетт. Лтд. Великобритани ) 25,0 Арказой 5012,5

Свекольна  патока 1,5 ,125

5

0

Углекислый кальций 1,25 Силикон 1520 (фирма Доу Корнинг) 0,625

Дистиллированна  вода До 1 л рИ довод т до 6,5 до стерилизации. Пример 1. Споры Streptomyces thermoarchaensis NCI В 12015 инокули- руют на скошенный агар, состо щий из следующих компонентов, г/л: Дрожжевой экстракт (фирма Оксоид L21) 0,5 Солодовый экстракт (фирма Оксоид L39) 30,0 Микологический пептон (йирма Оксоид L40) 5,0 Агар Р 3 (фирма Оксоид L13)15,0

значение рН около 5,4, и культивируют при 20°С в течение 10 сут. Затем созревший скошенный агар покрывают 10%- ным раствором глицерина (6 мл) и соскабливают стерильным инструментом дл  того, чтобы разрыхлить споры и мице- лий. Аликвоты (0,4 мл) полученной

суспензии спор перенос т в стерильные полипропиленовые соломки, которые затем термически запаивают и хран т в парах жидкого азота до употреблени . Содержимое отдельной соломки используют дл  инокулировани  10 мл . среды А, которую затем культивируют при 28°С в течение 3 сут на качалке, вращающейс  со скоростью 250 об/мин с диаметром орбитального движени  5 50 мм. Эта культивируема  среда используетс , дл  инокулировани  (в количестве 2%) 15 пробирок и двух колб Эрленмейера (емкостью 250 мл), содержащих соответственно 10 мл и 50 мл 0 среды В.

Пробирки и колбы культивируют при 28 С в течение 5 сут, а затем культуры раздельно фильтруют под вакуумом и клетки встр хивают в течение 30 мин 5 с метанолом, вз тым в количестве, равном объему фильтрата культуры.

Активность против Caenorhabditis elegans определ ют в экстрактах клеток , выращенных в пробирках и колбах. 0 Мицелиальные экстракты объедин ют, выпаривают досуха и повторно экстрагируют метанолом до концентрата (6 мл), который подают в колонку, заполненную сейадексом Н20 (110X2,5 см) t и элюированную метанолом. Собирают фракции по 10 мл.

Фракции 21-28 сгруппировывают и выпаривают с образованием масл нистого остатка (156 кг), который экстрагируют смесью (3:1) хлороформ:этил- ацетат. Получают 3 мл экстракта, который подвергают ХК (колонка 55X Х2,5 см), собирают фракции по 10 мл и анализируют методом ТСХ, использу  пластины, содержащие флуоресцентный индикатор. Фракции 20-23 и 36-44 вызывают две главные области, которые тушат флуоресценцию, их идентифицируют как компонент 1 (Rf 0,70) и компонент II (Rf 0,43).

При выпаривании фракций 20-23 получают компонент I в твердом виде (9 мг) В максимумах поглощени  при 238, 245 и 254 нм величины Ер равны соответственно 340, 350 и 200.

При выпаривании Фракций 36-44 получают компонент II в твердом виде (11 мг). В максимумах при 238, 245 и 254 нм величины Е составл ют соответственно 440, 460 и 280.

Пример 2. Каждую из двух колб Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащую по 50 мл среды Л, инокулиру- ют 0,2 мл суспензии спор Streptomy- ces thermoarchaensis NC1B 12015, вз той из соломки, приготовленной, как описано в примере 1. Колбы культивируют при 28°С в течение 3 сут на качалке, вращающейс  со скоростью 250 об/мин с диаметром орбитального движени  50 мм. Затем содержимое обеих колб используют дл  инокулировани  сосуда-йерментера емкостью 20 мл, со- деркащего 12 л среды В. Через 5 сут роста производ т сбор клеток культуры , которые обрабатывают, как описано в примере 3.

Пример 3. Через 5 сут культивировани  при 28°С Ферментационного бульона (12 л), полученного, как описано в примере 2, производ т сбор клеток, которые центриЛугируют со скоростью 4200 об/мин при 10 С в течение 15 мин. Лепешку из клеток смешивают с 5 л метанола и выдерживают при 4°С в течение 20 ч. Мицелиальный экстракт фильтруют, выпаривают при 40°С и подвергают азеотропной перегонке после добавлени  100 мл бутано- ла-1. Затем экстракт обрабатывают метанолом (5 раз по 200 мл), объединенные экстракты выпаривают до объема 100 мл и подают на колонку с сефадек- сом LH20 (112x5 см). Колонку элюируют метанолом и после пробного прохождени  200 мл собирают Аракции по 50 мл. Фракции 40-90 группируют и выпаривают , получа  3,85 г масл нистого ос0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

татка. Этот остаток экстрагируют 77 мл смеси (3:1) хлороформ:этилаце- тат, бильтруют и затем подвергают разделению на ХК, причем после пробного прохождени  200 мл собирают фракции объемом около 15 мл.

йракций 124-142, содержащие компонент I, группируют и выпаривают, получа  253 мг твердого вещества, из которых 216 мг очищают методом ЖХВР (колонка с фазой Зорбакс ODS, 25к 2,1 см, элгоент 80% ацетонитрила/вода ) . Фракции 250-320, содержащие компонент II, группируют и выпаривают, получа  602 мг твердого вещества, из которых 540 мг очищают методом ЖХВР (как дл  фракций 124-142) и собирают Аракции из нескольких опытов.

Элюируемый из колонки ЖХВР материал просматривают методом УФ-спектро- скопии при 243 нм. Вещества, имеющие пики поглощени  при этой длине волны, высушивают и испытывают на активность против Carnorhabditis elegans, а также анализируют методом ТСХ. Четыре вещества, которые обладали активностью против Caenorhabditis elegans, также имеют значение Rf 0,39-0,46 или .0,70-0,75.

Компонент I дает один пик со значением Rf от 0,7 до 0,75, этот пик был приписан фактору В. Компонент II дает три пика со значени ми Rf 0,39- 0,46, эти три пика были приписаны факторам А, С и D.

Фактор А, элюированный из колонки ЖХВР между 260 и 340 мл после введени  образца, имеет значение Rf 0,44, найденное методом ТСХ. Фактор В элюп- руют из колонки ЖХВР между 270 и 310 мл после введени  образца, причем он имеет значение Rf 0,62, найденное методом ТСХ. Фактор С элюируют из колонки ЖХВР между 160 и 180 мл после введени  образца, причем он имеет значение Rf 0,4, найденное методом ТСХ. Дополнительные характеристики факторов А, В, С и D описаны ниже.

Пример 4. Используют 0,4 мл суспензии спор организма Streptomyces thermoarchaensis NC1B 12015, вз той из соломки, приготовленной как описано в примере 1, дл  инокулировани  50 мл среды А, содержащейс  в колбе Эрленмейера емкостью 250 мл. Колбу культивируют при 28°С в течение 4 сут на качалке, вращающейс  со скоростью 250 об/мин с диаметром орбитального

движени  50 мм. Затем используют порции по 8 мл дд  того, чтобы инокули- ровать каждую из двух плоскодонных колб, содержащих 400 мл той же среды, и затем культивируют в тех же самых услови х в течение 3 сут.

Содержимое обеих колб затем используют дл  инокулировани  сосуда- Лерментера емкостью 70 л, содержащего 40 л среды В, дополненной силиконом 525 (бирма Доу-Горнинг, 0,0625 об/об.%). Ферментацию провод т с перемешиванием и аэрированием, которое обеспечивает поддержание концентрации растворенного кислорода на уровне более 20% от насыщени , причем при необходимости добавл ют силиконовый антивспениватель. Через 10 сут провод т сбор ферментационных клеток, причем бульон (40 л) осветл ют цент- риЛугированием (1500 об/мин). Жидкость над осадком замен ют на воду (5 л) и выделенные клетки (1,4 кг) замораживают при -20 С.

Через неделю замороженные клетки оттаивают, суспендируют в 15 л метанола и осторожно перемешивают 15 ч. Затем суспензию фильтруют и твердый остаток повторно экстрагируют метанолом (10 л). Объединенные фильтры (25 л) разбавл ют водой (12л) и экстрагируют петролейным эфиром (25 л)t Через 30 мин Лазы раздел ют центрифугированием .

Нижнюю метанольную фазу снова экстрагируют петролейным эфиром (3 раза: 25, 15 и 15 л). Объединенные фазы петролейного эфира (80 л) концентрируют , пропуска  три раза через тонкопленочный испаритель пфаудлер 8,8- 12V-27 (давление паров 0,1 бар, температура паров 20°С, температура вод ного пара 127°С), и концентрат (8 л) сушат сульфатом натри  (1 кг) и дополнительно концентрируют при пониженном давлении и 40°С в роторном пленочном испарителе. Масл нистый остаток (15 мл) раствор ют в смеси хлороформа и этилацетата (70 мл, 3:1 об/об.) и подвергают разделению на ХК, собира  фракции объемом около 40 мл после пробного прохождени  1400 мл.

Фракции 45-65 объедин ют и выпаривают , получа  фактор В (940 мг, как указано в примере 3), который дваждых перекристаллизовывают из метанола и окончательно из нитрометана. Кристал0

5

0

лы подвергают рентгеновскому дифракционному анализу монокристаллов, из которого следует, что кристаллы представл ют собой орторомбические прозрачные призмы с параметрами: а 10,171/3/, b 13,317/5/, с 25,032-7/, А, объем  чейки 3391 А3, 2 4, пространственна  группа P2j2t2i, Dc 1,18 г/см3, R 0,053 дл 

независимо наблюдаемых отражений (0 меньше 58 ), измеренных дифрактором с Cu-K -излучением (длина волны 1,54178 А).

Пример 5. Инокул т Strepto- myces thernoarchaensis NC1B 12015 готов т , как описано в примере 4, причем период роста составл л 2 сут, и используют его дл  инокулировани  со- Q суда-ферментера (70 л), содержащего 40 л среды В, дополненной полипропиленом 2000 (0,065 об/об.%) вместо силикона 525. Полипропилен 2000 добавл ют по мере необходимости на прот - жении ферментации дл  того, чтобы уменьшить вспенивание. Ферментацию провод т при 28 С с перемешиванием и аэрированием, которое обеспечивает поддержание концентрации растворенного кислорода на уровне более 30% от насыщени . Через 24 ч ферментации порцию бульона (1 л) перенос т в ферментер (700 л), содержащий 450 л среды , имеющей следующий состав, г/л: D-Глюкоза . 2,8 5 Солодовый декстрин

(М ЗОЕ)27,8

Арказой 5013,9

Кормова  патока1 , 7

КгНР040,14

0 СаСОз 1,39

Силикон 525 (Доу Кор- нинг), 0,06%

(об/об.)

До стерилизации довод т рН до 6,5. 5 Ферментацию провод т при 28°С с перемешиванием и аэрированием, обеспечивающим поддержание концентрации растворенного кислорода на уровне более 20% от насыщени . Через 2 сут 0 довод т рН до 7,2 добавлением серной кислоты. Через 5 сут ферментации провод т сбор клеток культуры.

Бульон (450 л) осветл ют путем центрифугировани  и жидкость над .. j осадком замен ют водой (20 л). Выделенные клетки (25,5 кг) перемешивают в течение 1 ч в таком количестве метанола , чтобы общий объем смеси сое

тавл л 75 л. Суспензию фильтруют, твердый остаток повторно экстрагируют 35 л метанола и фильтруют. Объединен-, ный фильтрат (87 л) разбавл ют водой (40 л) и экстрагируют петролейным эфиром. Через 30 мин фазы раздел ют центрифугированием, и нижнюю мета- нольную фазу повторно экстрагируют петролейным эфиром (30 л) после до- бавлени  40 л воды. Госле разделени  нижнюю фазу снова экстрагируют 30 л ПЭ. Объединенные фазы петролейного эфира (85 л) концентрируют, пропуска  3 раза через тонкопленочный испаритель пфаудлер 8,8-12V-27 (давление паров 0,1 бар, температура паров 20°С, температура вод ного пара Л 127°С). Концентрат (9 л) сушат сульфатом натри  (2 кг) и дополнительно концентрируют при пониженном давлении при 40 С в роторном- пленочном испарителе . Масл нистый остаток (130 г) раствор ют в хлороформе, получа  190 мл смеси, которую подвергают разделению на ХК (набивна  колонка, промыта  500 мл хлороформа), собирают фракции объемом около 40 мл после пробного прохождени  1400 мл.

Фракции 32-46 объедин ют и выпаривают , получа  21,2 г масла. Фракции 47-93 объедин ют и выпаривают, получа  20,1 г масла, которое раствор ют в смеси (3:1) хлороформ:ЭА до объема 50 мл. Раствор раздел ют на ХК, собира  фракции объемом около 40 мл после пробного прохождени  1400 мл. Фракции 22-23 объедин ют и выпаривают , получа  3,1 г масла, которое добавл ют к маслу, полученному из фракций 32-46 на первой колонке. Объеди- ненные масла раствор ют в кип щем метаноле (4 мл) и затем этот раствор добавл ют к 20 мл гор чего пропано- ла-2, получа  при выдерживании кристаллический Фактор В (2,57 г).

Маточный раствор после кристаллизации фактора В выпаривают, получа  масло, которое раствор ют в равном объеме хлористого метилена, и раствор подают на колонку (30x2,2 см) с фазой мерк кизельгель 60 (70-230 меш, ASTM № 7734), заполненной в хлористом метилене . Слой промывают (вдвое больше объема сло ) и элюируют смесью (3:1) хлороформ:этилацетат f (2 объема сло ). При выпаривании . элюата получают масло, которое раст- вор ют в метаноле и подвергают препаративному разделению методом ЖХВР на

5

0

5

Q

5 0 5

0 c

0

сферисорбе S50DS-2 ( мм, фирма Фэцз Сеп. Лтд.). Образец объемом 5 мл прокаливают через колонку в течение 1 мин и колонку элгоируют смесью (7:3) ацетонитрилгвода при следующих услови х:

Врем , мин Поток, мл/мин 0,000,00 (Врем 

1,000,00 ввода

1,1030,00 пробы)

39,9030,00

40,0035, ОХ)

75,0035,00

Элюируемый из колонки ЖХВР материал анализируют методом УФ-спектро- скопии при 238.им. При выпаривании объединенных Фракций, имеющих пик, элюируемый на 26,3 минуте, получают Фактор Е в твердом виде. При выпаривании объединенных фракций, имеющих пик, элюируемый на 36,4 минуте, получают фактор F в твердом виде.

Пример 6. Ферментационный бульон (аналогичный примеру 2) с урожаем клеток культуры через 117 ч обрабатывают в автоклаве (121 С, 1 ч), охлаждают до комнатной температуры и перемешивают на магнитной мешалке, получа  гомогенную суспензию клеток. Две порции суспензии (2 мл) центрифу- гируют (ускорение 12 000 g, 2 мин, комнатна  температура), декантируют жидкость над осадком и осажденные клетки суспендируют в 2-мл воды, тщательно смешивают и снова подвергают центрифугированию (12 000 g, 2 мин, комнатна  температура). После декантации жидкости над осадком клетки дважды промывают дистиллированной водой (порции по 2 мл). Затем промытые клетки тщательно смешивают с водой (2 мл) или с метанолом (2 мл) и выдерживают при комнатной температуре при периодическом встр хивании в течение 1,5 ч. Суспензию снова центрифугируют (12 000 g, 2 мин9 комнатна  температура) и надосадочные жидкости последовательно разбавл ют в воде. Клетки из водных суспензий повторно суспендируют в воде и немедленно последовательно разбавл ют водой. Порции (10 мкл) каждого из разбавлений добавл ют к суспензии (200 мкл) нематод Caenorhabditis elegans в буферном растворе, содержащим,, г/л: гидрофосфат натри  6, гидрофосфат кали  3} хлорид натри  5J семиводный сульфат магни  0,25 - и имеющем рН 7Д). Через 4 ч суспензию нематод исдержащие среду при 28°С в течение

следуют, чтобы установить, какие разбавление испытуемой смеси вызывают полное ингибирование подвижности более чем 98% нематод в анализируемой суспензии. Было найдено, что разбавлени  метанольного экстракта 1:5, 1:25, 1:250 и 1:500, разбавлени  клеточной суспензии 1:5, 1:25, 1:250, 1:500 и 1:1000 и разбавлени  водного- экстракта 1:2, 1:4 и 1:8 вызывают такое ингибпрование нематод, когда 10 мкл добавл ют к 200 мкл суспензий нематод.

Пример 7. 50 мл среды А или среды В в колбе Эрлемейера емкостью 250 мл инокулируют 0,4 мл суспензии спор S.thermoarchaensis MC1B 12015, вз той из соломки, приготовленной, как описано в примере 1. Колбы, со- А или В, культивируют 2 сут на роторной качалке, работающей в режиме . 250 об/мин с диаметром хода 50 мм. Затем из каждой среды берут порции (8 мл) дл  инокулировани  плоскодонных колб емкостью 2 л, содержащих 400 мл той же самой среды (А или В соответственно). Эти колбы культивируют в течение 2 сут при тех же услови х .

Два ферментера емкостью 70 л каждый инокулируют двум  колбами средьь А и один 70-литровый ферментер инокулируют двум  колбами среды В. Каждый Лерментер содержит 40 л среды С. Ферментацию провод т при 34°С перемешиванием и аэрированием, достаточным дл  поддержани  концентрации растворенного кислорода свыше 30% от насыщени . Приблизительно через 24 ч Аерментации значение рН смеси довод т до 7,2 добавлением водного раствора серной кислоты. При необходимости добавл ют антивспениватель - полипро- пиленгликоль 2000. Через 5 сут провод т сбор клеток,которые объедин ют.

i

70-литровый ферментер, который

также ннокулируют двум  колбами, содержащими среду В, содержит среду В с добавлением 0,06% силикона 1520. Ферментацию провод т при 28°С с перемешиванием и аэрированием, достаточными дл  поддержани  концентрации растворенного кислорода на уровне свыш 30% от насыщени . При необходимости дл  уменьшени  вспенивани  добавл ют полипропиленгликоль 2000. Через 24 ч порцию 9 л перенос т в Лерментер ем

5

0

5

костью 700 л, содержащий 450 л среды С.

Ферментацию провод т при 34°С с перемешиванием и аэрированием, достаточными дл  поддержани  концентрации растворенного кислорода на уровне u свыше 30% от насыщени . Вспенивание регулируют добавлением полипропилен- гликол  2000 и приблизительно через 24 ч рН среды довод т г,о 7,2 добавлением водного раствора серной кислоты . Через 4 сут ферментации собирают клетки культуры, которые объедин ют с трем  описанными выше продуктами ферментации.

Объединенные бульоны с клетками центрифугируют на центрифуге Шарплес А816РУ со скоростью около 120 л/ч. Остаточную жидкость над осадком в центрифугируемых сосудах замен ют на воду.

Выделенные клетки (11,65 кг) суспендируют в 33 л метанола с помощью смесител  Силверсона. Через 60 мин суспензию фильтруют через киперную ткань и остаток еще раз суспендируют в 34 л метанола. Через 40 мин суспензию снова фильтруют. Фильтраты от двух метанольных экстракций объедин ют .

Объединенные экстракты (53,5 л) смешивают с 27 л воды и 27 л петро- лейного эсЬира. После перемешивани  в течение 20 мин две фазы раздел ют на 5 центрифуге Вестфали  МЕИ 1256. Нижнюю водно-метанольную фазу (70 л) смешивают с водой (37 л) и петролей- ным эфиром (27 л), перемешивают и раздел ют, как и раньше. Межфазную эмульсию в Лазе петролейного эфира разбивают ацетоном (4 л). Нижнюю водно-метанольную фазу (108 л) затем смешивают с водой (40 л) и петролей- ным эфиром (27 л) в третий раз, пе- ремепивают и раздел ют, как и раньше, причем дл  разбиени  межфазной эмульсии используют 4 л ацетона. Затем три гексановых экстракта объедин ют.

Объединенные экстракты петролейного эфира (85 л) концентрируют на тонкопленочном испарителе (давление паров 0,15 бар, температура паров 26°С). Концентрат (3 л) сушат сульфатом натри  (2 кг) и затем дополнительно вы- 5 паривают при пониженном давлении и 40°С. Полученное масло (639 г) раст- вор ют в 300 мл смеси хлороформа и этилацетата (3:1, об/об.), фильтруют и промывные жидкости (1060 мл) разде0

0

S

0

л ют на ХК (1500 мм, диаметр 100 мм) элюиру  со скоростью потока 6 л/ч.

Фракции, элюируемые между 8,8 и 13,1 л, объедин ют и выпаривают при низком давлении, получа  56,3 г масла} фракции, элюируемые между 13,1 и 24,6 л, упаривают аналогично, получа  светло-желтое твердое вещество (153,4 г). Первые фракции в основном содержат фактор В, тогда как последние фракции содержат смесь факторов А, В, С и D. Фактор В в этой последней фракции последовательно удал ют при повторении разделени  на ХК, как описано выше, дважды (последний раз на свежем силикагеле) при аналогичны услови х за исключением того, что скорость потока была снижена до 3 л/час.

Пики веществ, содержащих факторы А, С и D, из второй из указанных ко- .лонок элюируют между 8,8 и 17,6 л, (остаточный фактор В, который она содержит , раздел ют на третьей колонке , из которой Факторы А, С и D элюи рутотс  между 14 и 28 л. Этот окончательный объединенный элюат упаривают при пониженном давлении, получа  114 г твердого вещества. Пики веществ , содержащих Фактор В, из двух колонок (7,5-8,8 л и 10,3-13,4 л соответственно ) выпаривают до масла (соответственно 10,7 и 10 г) и объедин ют с маслом, полученным на перво из этих трех колонок.

Масла, содержащие фактор В, раст- в кип щем метаноле (25 мл) и смешивают с кип щим пропанолом-2 . (100 мл). При охлаждении до фактор В кристаллизуетс . Кристаллы отфильтровывают , промывают метанолом (200 мл), охлаждают до -20 С и сушат в вакууме, получа  25,3 г Фактора В.

Твердое вещество из третьей си- ликагелевой колонки, в котором содержатс  Факторы А, С и D, сушат в вакууме до посто нного веса (87 г). Образцы (20 г) этого твердого вещества раствор ют в 190 мл метанола и довод т до объема 230 мл смесью (7:3 по объему) ацетонитрила и воды. Затем порции (5 мл) этого раствора раздел ют на хроматографической колонке (250 мм, диаметр 21,2 мм) со сфери- сорбом ODS-2 (частицы диаметром 5 мкм), использу  в качестве элюирую щего растворител  смесь (7:3) ацетонитрила и воды. Скорость потока элю- ента поддерживают равной 20 мл/мин

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

приблизительно в течение 10 с, затем ее посто нно увеличивают до 34 мл/мин в течение 22-минутного периода и оту скорость поддерживают еще в течение 3 мин. Элюируемые факторы детектируют при длине волны 238 нм. Фактор С элюируют между 11,0- и 13,4-й минутами . Фактор D - между 13,4- и 17,4-й минутами и фактор А между 17,4- и 23,0-й минутами.

Содержащие фактор С фракции из каждого хроматографического разделени  объедин ют и выпаривают при низком давлении до твердого вещества. Фракции, содержащие Фактор А, аналогично выпаривают до твердого вещества . Фракции, содержащие Фактор D, также объедин ют и выпаривают, получа  неочищенное твердое вещество (7 г). Последнее вещество снова раствор ют в метаноле (65 мл), смешивают с водным ацетоннтрилом (30 об.% воды) и повторно раздел ют хроматографически на колонке со сферисорбом ODS-2, как описано выше, с тем исключением, что при разделении поддерживают посто нным поток элюента 20 мл/мин. Теперь ф ктор D элюируют между 16- и 20-й минутой, и эти Фракции из каждого хроматографического разделени  объедин ют. Объединенные олюаты выпаривают до твердого вещества. Три твердых вещества, содержание факторы А, С и D, высушивают над Р20д-в вакууме до посто нного веса (55, 7,0 и 1,21 г соответственно) .

Показано, что каждое из четырех твердых веществ, выделенных в этом способе, аналогично образцам факторов А, В, С и D.

Пример 8. 50 мл среды В, содержащейс  в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, инокулируют суспензией спор организмов Streptomyces thermo- arhaensis NC1B 12111, 12112, 12113 и 12114 (по 0,5 мл), вз той из соломок, приготовленных, как описано в примере 1.

I

Колбы, содержащие S.thermoarhaensis NC1B 12111, NC1B 13112 и NC1B 12113, культивируют при 31 С на роторной качалке. Колбу, содержащую S.thernoarhaensis 12114, культивируют при 28°С в течение 2 сут и затем 1 мл бульона перенос т в другую колбу Эрленмейера , содержащую 50 мл среды В. Эту колбу культивируют при 31°С на роторной качалке. Все колбы встр хи

271

вают со скоростью 250 об/мин при диаметре хода 50 мм.

Через 4 сут культивировани  центрифугируют 10 мл образца каждого бульона при ускорении 1250 g в течение 45 мин и обрабатывают, как указано ниже. Жидкость над осадком сливают и таблетку осадка повторно суспендируют в 10 мл метанола. Суспензию тща тельно встр хивают и выдерживают 1 ч при периодическом перемешивании. Затем суспензию центрифугируют при 10 000 g в течение 5 мин и жидкость над осадком анализируют методом НХВР (колонка S5 ODS-2, 10 см, диаметр 4,6 мм, элюент 70%-ный ацетонитрил/ /0,1 И раствор дигидрофосфата аммони ) . Гики веществ анализировали при 246 нм.

В каждом случае анализ ЖХВР показал наличие Лакторов А, В, С и D.

Пример 9. Установлено, что факторы А, В, С, D, E и F содержат только углерод, водород и кислород.

Методом масс-спектроскопии электронного удара (МСЭУ) были получены

H/Z635(M+Na) M/Z613(M+H)M/Z691 (М+Н+глицерин ) M/Z599 (М+НУ M/Z581(MH-PeO)4 M/Z563(mi-2K20)4

M/Z607(M+Na){ M/Z621(M+Na)f

Методом масс-спектроскопии полевой десорбции дл  фактора Е были получены следующие результаты: M/Z 61211 , а дл  Фактора F - M/Z 626М4.

В спектре МСЭУ фактора А при точном измерении масс отмечены ионы: при 612,37 - C36HS208-, 466,31 - С 0Н4г04; 448,30 - СЭОН400-,, 425,23 - 354,22 - С2-$1ЦаОг; 297,22 - С2,Нг90 ; 278,11-С,. 247,17 - C,6H2302; 219,18 - С,5Н2%0 , 95,05 - С6Н70.

В спектре МСЭУ фактора В при точном определении масс отмечены ионы: при 598,35 - Сг5-Н5008 438,28 - С2в Ь804 420,26 - 314,19 - СгоЬгбО,; 248,14 - С15-ПгоОэ; 151,08- „ 02.

28

результаты дл  Факторов А, В, С, D, Е и F (приведенные в табл. 1).

Таблица 1

Методом масс-спектроскопии с бомбардировкой быстрыми атомами (МС-ББА) были получены результаты, приведенные

в табл. 2. т аблица 2

M/Z61KM-H) 612

598

M/Z583(M-H) 584 M/Z597(M-H) 598

В спектре НСЭУ фактора С при точ- ном определении масс отмечены ионы: при 584,34 - С34Н4808; 566,33 438,28 - С28Н38Оф.

В спектре НСЭУ сЬактора D при точном определении масс отмечены ионы: 1РИ 598,35-Сг5.Н5008;452,29-Сг9Н 1(р4 434,28 - C29H3803.

В спектре МСЭУ фактора Е при точном определении масс отмечены ионы: при 452,2908 - ., и дл  сЬакто- pa F ионы при 466,3067 - С 0Нг4гЧФакторы А, В, С, D, ЕиР имеют следующие характерные пики в ИК-спек тре (в бромоЛорме).

29,

Длл Лактора А - около 3510 (ОН), 1712 (сложный эйир) и 998 (С-0). Дл  сЬактора В около 3510 (ОН),

1710(сложный эфир) и 996 см((С-0). Дл  Лактора С около 3510 (ОН)

1712 (сложный ) и 996 см- (С-О). Дл  Фактора D около 3508 (ОН)«,

1711(сложный эЛир) и 996 (С-0). Дл  Лактора Е около 3500 (ОН);

1708 (сложный эфир) и 994 см (С-0).

Дл  юактора F около 3100 (ОН); 1708 (сложный эфир) и 997 см (С-0).

Факторы А, В, С, D, Е и F имеют УФ-спектры в растворе метанола (0,002%), где П - перегиб и М - максимум (см. табл. 3).

Таблица 3

Концентраци  в метаноле ,001%

Приведенные выые значени  Д waKC представл ют собой характеристику каждого фактора, значени  Е( отражают чистоту материала в полученном виде (отношени  величины Е  вл ютс  характеристичными дл  вецества).

Спектры протонного магнитного резонанса (ПНР) при 200 МГц каждого

10

25

3809030

фактора в растворе дейтерохлороформа включают следующие сигналы (значени  1 с мультиплектностью, константами сочетани  (Гц) и интегральными величинами в скобках).

Фактор А: 4,1-4,4 (м, 2Н), 4,61 (шир. с, 1H)j 4,6-4,75 (м, 2Н), 4,81 (д, 9, 110 i 5,05 (м, 1Н) 5,34 (с, 2Н)J 5,69 (д, 5, 1Н) 6,06 (д, 5, 1Н) 6,17 (м, 1Н){ 6,26 (д, 11, 1Н){ 6,37 (м, 1Н); 6,46 (д, 10, 1Н)« 6,74 (к, 2, 1Н); 7,42 (м, 1H)Jf 7,7-7,9 (м,5Н){ 8,14 (с, ЗН) 8,40 (с, ЗН); 8,47 (с, ., ЗН) 8,61 (т, 11, 1H)J 8,96 (д, 7, J ЗН)} 9,06 (д, 7, 3H)J 9,02 (д, 7, Н),

9.13(к, 11, 1Н); 9,21 (д, 7 ЗН). Фактор В: 4,2-4,4 (м, 2Н)15 4,55

(к, 7, 111) 4,65 (шир. с, 1Н), 4,6- 20 4,8 (м, 2Н), 5,06 (м, 1Н) 5,3-5,5 (м, 2Н); 6,01 (д, 5, 110, 6,07 (д, 5, ПО, 6,12 (с, 1Н) 6,24 (д, 11, ПО; 6,24 (м, 110 J 6,3-6,5 (м, 2H);V 6,53 (с, ЗН); 6,73 (к, 2, 1Н), 7,62 (м, 1Н); 7,6-8,0 (м, 4H)J 8,22 (с, ЗН), 8,35 (д, 7, ЗН), 8,41 (с, ЗН) J 8,49 (с, ЗН), 8,62 (т, И, 1Н); 9,03 (д, 6, ЗН), 9,12 (к, 11, 1Н)- 9,22 (д, ЗН).

Фактор С: 4,29 (д, 11, т, 2, 1Н), 4,4-4,6 (м, ЗН){ 4,56 (шир. с, 110, 5 .14(дд, 15, 10, 1Н)} 5,23 (м, 111), 5;б5 (шир, с, 2Н); 5,72 (д, 6, 111) J 5,95 (д, 10, 1Н), 5,99 (д, 6, 1И) f 6,08 (щир. с, 1Н) 6,1-6,4 (м, 310/

35 6,62 (к, 3, 1Н); 7,7-8,1 (м, около 1H)J 7,18 (с, 3H)J 8,33 (с, ЗН)/ 8,48 (д, 1, ЗН) 8,64 (с, ЗН), 8,68 (т, 11, 1Н); 9,00 (д, 7), 9,08 (д, 7, ЗН) f 9,12 (к, 12, ПО.

40 Фактор D: 4,18-414 (м, 2Н)} 4,47- 4,82 (м, 4Н); 5,04 (м, 1Н)/ 5„35 (с, 2Н); 5,72 (д, 7, 1H)J 6,07 (д, 7, 1Н) 6,15-6,45 (м, 4Н); 6,74 (к, 4, 1Н), 7,45-8,1 (м, 8Н); 8,16 (с, ЗН); 8,41

45 (с, ЗН), 8,49 (с, ЗН) J 8,62 (т, 11, 1Н); 8,92-9,05 (м, 6Н) 9S21 (д, 7, ЗН).

йактор Es 491-493 (м, 21), 4,5-4,8 (м, 4Н всего)} 5,04 (м, 1Н); 5,2-5,5

50 (м, 2Н); 6,01 (д, 5, 1Н), 6,05 (д,5, 1H)J 6,11 (с, 1Н); 6,1-6,4 (м, ЗН)/ 6,45 (д, ПО 6,51 (с, ЗН){ 6,70 (к, 2, 1Н); 7,60 (м, 1Н){ 8,20 (с, 3H)J 8,41 (с, ЗН) 8,47 (с, ЗН), 8,60 (т,

55 11, 1Н)« 9,00 (т, 7, 3H)f 9,02 (д.

6,ЗН) 9,11 (к, 11, 1Н), 9,20 (д.

7,ЗН).

Фактор F: 4,2-4,4 (м, 2Н), 4,62 (с, in), около 4,70 (м, 2Н); 4,80 (д,

30

15

20

31

, 1Н)« 5,04 (м, 1H)J 5,2-5,5 (м, 2Н) ,99 (д, 5, 1Н); 6,05 (д, 5, 1Н); ,11 (с, 1H)J 6,1-6,3 (м, 2Н), около ,36 (м, 111); 6,45 (д, 10, 1Н) 6,51 (с, ЗН), 6,70 (к, 2, 1Н); 7,42 (м, 1Н); 7,58 (м, НО} 8,19 (с, ЗН) Г 8,40 (с, ЗН), 8,47 (с, ЗН) 8,60 (т, 11, 1IOJ 8,95 (д, ЗН); 9,05 (д, 7, ЗН), 9,01 (д, 7, ЗН), 9,10 (к, 11, 1Н), 9,21 (д, 6, ЗН).

Отфильтрованный от шума спектр

| 0L

ЯМР-С при 25,05 11Гц раствора каждого оактора в дейтерохлороформе включает пики (в скобках даны величины о с мультиплетностью сигналов внерезо- нансного спектра).

Фактор А при 173;2 (с) 142,6 (д);

139.2(с); 137,6 (с){ 137,1 (с)/

137.0(д)- 130,4 (с); 123,1 (д),

120.1(д); 171,8 (д), 99,5 (с),

80.0(с); 79,0 (д) 76,5 (д) ; 69,0 (д),68, 67,4 (д); 48,2 (т), 45,4 (д),40,9 (т) 40,5 (т)} 35, 34,5 (т) 22,1 (к){ 34,5 (т) 26,6 (д)}

22.6(к), 22,0 (к)$ 19,7 (к) 15,3 (к)« 13,7 (к); 10,8 (к).

Фактор В при 173,4 (c)j 142,1 (д); 139,5 (с) 137,1 (с); 136,7 (с)/ 133,7 (с); 123,6 (д); 123,3 (д), 120,0(д); 119,3 (д) 118,2 (д)} 99,5 (с) 80,1 (с), 77,3 (д); 76,6 (д) 76,4 (д); 69,0 (д); 68,3 (д); 67,9 67, 57,5 (к);1 48,2 («) 45,4 (д);

40.7(т) 40,5 (т) 35, 34,5 (т);

22.1(к); 19,6 (к); 15,3 (к); 13,6 (к) 35 12,9 (к); 10,5 (к).

Лактор С при: 173,3 (с)} 142,2 (д);

140.3(с); 138,5 (с) 137 (с) 134,9 (с); 123,9 (д); 121,1 (д) 120,6 (д), 118,1 (д); 100,2 (с)$ 80,6 (с), 80,1 (д)«, 77,4 (д); 69,2 (д), 69,0 (д) 68, 68,0 (д){ 67,9 (д); 48,6 (т) у 46,3 (д)} 41,4 (т); 36, 36,3, 36,1 (д)1, 35,0 (т); 22,6 (к), 20,0 (к)}

15,4 (к); 14,3 (к), 13,1 (к); 10,8 (к).

25

17380

.Q

4S

30

40

Фактор D при: 173,2 (с), 142,5 (д)

139,1 (с); 137,5 (с); 137,1 (с); 132,1 (с); 131,4 (д); 123,1 (д) 120,1 (д); 117,8 (д)-, 99,5 (с); 79,9 (с); 79,2 (д); 76,5 (д) J 69,0 (д), 68,3, 68, 67, 67,4, 48,2 (т); 45,5 (д); 40,8 (т); 40,5 (т)/ 35, 34,5 (т); 22,0 (к) 20,6 (т), 19,6 (к); 15,3 (к); 13,7 (к); 13,6 (к); 10,7 (к).

Кривые кругового дихронизма дл  Аакторов А, В, С и D (концентраци 

15

20

35

;

}

25

73809032

растворов в метаноле около 0,1%) плохо разрешены в области 230-260 им, св занной поглощением диенового хромофора . Это указывает на то, что во всех четырех факторах абсолютные кон фигурации при атомах углерода Со, С 7 С и  вл ютс  одинаковыми.

Ниже следуют примеры рецептур сог- .Q ласно изобретению (активный компонент - вещество, полученное по предлагаемому способу, которое может представл ть собой один из факторов А, В, С, D, E или F.

Парэнтеральна  мно- годозна  инъекци  (интервал 1 - 5 вес./об%):

Активный компонент 4,0 Бензиловый спирт 2,0 Триацетат глицерина 30,0 Пропиленгликоль До 100,0 Активный компонент раствор ют в бензиловом спирте и триацетате глицерина . Добавл ют пропиленгликоль и довод т до объема. Раствор фильтруют, чтобы удалить любые твердые примеси. Продукт асептично заполн ют в ампулы дл  инъекций и закрывают резиновыми уплотнени ми или поршн ми, удерживаемыми на месте алюминиевыми колпачками . Окончательно стерилизуют продукт путем нагревани  в автоклаве.

Аэрозольный распылитель (интервал 0,01-0,50 вес.%), вес./весЛ: Активный компонент 0,1 Трихлорэтан29,9

ТрихлорсЬорметан 35,0 Дихлорфторметан 35,0 Смешивают активный компонент с трихлорэтаном и заполн ют в аэрозольный контейнер. Продувают пространство головки газообразным распылителем и обжимают клапан на месте. Под давлением ввод т необходимое количество 4S жидкого распылител  через клапан. Устанавливают пускатель и внутреннюю крышку.

Таблетки. Способ

получени  - влажна  мг 50 гранул ци : Вес.%

Активный компонент 250,0 Стеарат магни  1 4,5 Кукурузный крахмал 5 22,5 Натрий-гликол т крах- 55 мала2 9,0

Лаурилсульфат натри  1 4,5

30

40

Микрокристаллическа  целлюлоза - дл  оболочки таблетки весом 450 мг.

К активному компоненту добавл ют достаточное количество 10%-ной крахмальной пасты дл  получени  удобной дл  гранулировани  влажной массы. Формуют гранулы и сушат, использу  сушильный поднос или сушилку в ожи- женном слое. Просеивают через сито, добавл ют оставшиес  компоненты и прессуют в таблетки.

В случае необходимости поверхность таблетки покрывают пленкой, использу  окснметилцеллюлозу или другой подобный пленкообразующий материал, примен   водную или неводную систему растворителей . В состав покрывающей пленки могут бить включены пластиЛи- катор и подход ща  краска.

Ветеринарна  таблетка дл  мелких домашних животных. Способ получени  - суха  гранул ци . Состав, мг: Активный компонент 50,0 Стеарат магни  7,5 Микрокристаллическа  целлюлоза дл  оболочки таблетки75,0

Смеиивают активный компонент со стеаратом магни  и микрокристаллической целлюлозой, йормуют из смеси черв чки . Разбивают черв чки, пропуска  их через роторный гранул тор, получают свободнотекучие таблетки. Прессуют в таблетки. Оболочки таблеток затем могут бптъ покрыты пленкой.

Ветеринарна  внутригрудна  инъекци  :

Активный компонент, мг 150 Полисорбат 60, вес.% До 3,0 Белый пчелиный воск, вес.%6,0

Арахисовое масло, вес.% 91 Нагревают арахисовое пасло, белый пчелиный воск и полисорбат 60 до . 160°С при перемешивании. Выдерживают 2 ч при этой температуре и затем охлаждают до комнатной температуры при перемешивании.

Асептично добавл ют активный компонент в носитель и диспергируют, использу  высокоскоростной смеситель. Очищают путем пропускани  через коллоидную мельницу. Асептично заполн ют продукт в стерильные пластиковые шприцы.

Ветеринарный пероральный м гчн- тель, вес/об.%:

Активный компонент 0,35 Полисорбат 85 5,0 - Бензиловый спирт 3,0 Пропиленгликоль 30,0

О

5

0

5

0

5

0

5

0

5

йосбатный буйер до рН 6,0-6,5 ВодаДо 100,0

Раствор ют активный компонент в полисорбате 85, бензиловом спирте и пропиленгликоле. Добавл ют часть воды и довод т рН до 6,0-6,5 фосфатным буфером (в случае необходимости). Добавл ют остальное количество воды. Заполн ют продукт в емкость м гчите- л .

Ветеринарна  пероральна  паста, вес.%:

Активный компонент 7,5 Сахарин25,О

Полисорбат 85 3,0 Дистеарат алюмини  5,0 Фракционированное масло кокосового ореха До 100,0 | Диспергируют дистеарат алюмини  во фракционированном кокосовом масле и полисорбате 85 путем нагревани . / Охлаждают до комнатной температуры и диспергируют сахарин в масл ном носителе . Распредел ют активный компонент в основе. Заполн ют в пластиковые шприцы.

Гранулы дл  ветеринарного назначени  в пищу, вес.%:

Активный компонент 2,5 Известкова  мука До 100,0 Смешивают активный компонент с известковой мукой. Формуют гранулы, использу  способ влажной гранул ции. Сушат, примен   сушильный поднос или сушилку в ожиженном слое.. Заполн ют в подход щие контейнеры. Эмульгируемый концентрат Активный компонент, г 50 Анионный эмульгатор (например, фенилсуль- гоопат CALX), г 40 Непоногенный эмульгатор (например, Сипе- роник NP 13), г 60 Ароматический растворитель (например, Сольвессо 100), л До 1 Смешивают все компоненты и перемешивают до растворени . Гранулы, г:

а)Активный компонент 50 Древесна  смола 40 Гипсовые гранулы, 20-60 меш (например, Агсорб 100 А) До 1000

б)Активный компонент 50 Сипероник NP 13 40 Гипсовые гранулы

(20-60 меш) До 1000

;351738090

Раствор ют все компоненты в летучем растворителе, например хлористом метилене, добавл ют к гранулам, обрабатывают в барабане-смесителе. Сушат , чтобы удалить растворитель.

Активность факторов Л, В, С, D, Е и F определ ют, использу  множество вредителей и ихл хоз ев, включа  следующие: Tetranyc husurticae (обыкновенна  фасоль и мирабель В), Myzus persicae (капуска китайска  и редька), Heliotlus virescens (хлопок), Chilo- portellus (фароль Рейпа), Meloidogyne

36

СН3Н

.Q где Rj - изопропил или иметил,

этил;

Rg водород или метил, заключающийс  в анаэробном куль ровании штаммов Stpertomyces th

incop,nita (золотиста  фасоль), Panon- archaensis NC1B 12015, или NC1B

, . / „ т т.1JU.. 3

chus ulmi (мирабель В), Phorodon hu- muli (хмель), Aulacorthus circurafle- xutn (цикламен) .

Продукт используют в виде жидкого препарата (например, раствора в ацетоне ) . Затем эти растворы разбавл ют, водой, содержащей 0,1 или 0,01 вес.% увлажн ющего агента, до тех пор пока жидкие препараты не будут содержать требуемую концентрацию продукта.

Методика испытани , прин та  с учетом каждого вредител , включает помещение нескольких вредителей в среду, которой обычно  вл етс  растение-хоз ин , и эту среду обрабатывают препаратом (остаточное испытание). В случае Tetranyc urticae препаратом обрабатывают как вредителей, так и v среду (контактное испытание).

Использу  эту методику, наход т, что факторы A-F  вл ютс  эффективными при концентраци х (по весу продукта) до 500 ч. на млн или менее.

Claims (6)

1. Способ получени  антибиотика S 54-j формулы

12111, или NC1B 12112, или NC1B 12113, или NC1B 12114 на жидкой тательной среде, содержащей ист углерода, дзота и минеральные со 20 при 28-34°0 при рН 5,4-7,2 в теч 5-10 сут с последующим выделени левого соединени  путем экстракц водорастворимым растворителем.

2.Ытамм стрептомицета Strep 2$ ees thermoarchaensis NC1B 12112

продуцент антибиотика S 541

3.Штамм стрептомицета Strep ces thermoarchaensis NC1B 12015 продуцент антибиотика

у. 4. Штамм стрептомицета Strept ces thermoarchaensis NC1B 12111 продуцент антибиотика

5. Итамм стрептомицета Strept ces thermoarchaensis NC1B 12113 продуцент антибиотика К

6. Штамм стрептомицета Strept ces thermoarchaensis NC1B 12114 продуцент антибиотика S54(

Приоритет по пунктам и призна 14.09.84 по п. 1 антибиотик S 0 штамм 12015, имеет признаки, хар ризующие услови  способа;

21.12.84по п.З/

36

СН3Н

где Rj - изопропил или иметил, или

этил;(

Rg водород или метил, заключающийс  в анаэробном культивировании штаммов Stpertomyces thermoarchaensis NC1B 12015, или NC1B

12111, или NC1B 12112, или NC1B 12113, или NC1B 12114 на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, дзота и минеральные соли, при 28-34°0 при рН 5,4-7,2 в течение 5-10 сут с последующим выделением целевого соединени  путем экстракции водорастворимым растворителем.

2.Ытамм стрептомицета Streptomy- ees thermoarchaensis NC1B 12112 продуцент антибиотика S 541

3.Штамм стрептомицета Streptomy- ces thermoarchaensis NC1B 12015 - продуцент антибиотика

4. Штамм стрептомицета Streptomy- ces thermoarchaensis NC1B 12111 - продуцент антибиотика

5. Итамм стрептомицета Streptomy- ces thermoarchaensis NC1B 12113 - продуцент антибиотика 6. Штамм стрептомицета Streptomy- ces thermoarchaensis NC1B 12114 - продуцент антибиотика S54(

Приоритет по пунктам и признакам: 14.09.84 по п. 1 антибиотик S щ, штамм 12015, имеет признаки, характеризующие услови  способа;

21.12.84по п.З/

13.09.85по пп. 1, 2, 4-6.