SU1705338A1 - Штамм дрожжей CaNDIDa ReQUINII - продуцент алкогольдегидрогеназы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  штам- мамикроорганизма-продуцента алкогольдегидрогеназы (АДГ). Цель изобретени  - получение штамма дрожжей-проду- цента АД Г с более высокой и стабильной активностью фермента при росте на среде с этиловым спиртом. Штамм Candida regulnll ЛС-15 получен с использованием традиционных генетико-селекционных приемов и зарегистрирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКИ СРх-321Д. Штамм культивируют на синтетической среде с 2.0 об.% этанола при рН 4.5 и температуре 30°С в течение 14 ч. Активность алкогольдегидрогеназы составл ет 3,4 ед/мг - что превышает активность тЬго же фермента у известных штаммов Candida regulnll на 50-146%. 1 табл. г Ic

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  получени  штаммов - продуцентов алкогольдегидрогеназы, примен емой в молекул рной биологии, фармацевтической и медицинской промышленности.

Известны различные микроорганизмы, способные синтезировать алкогольдегидро- геназу. Широко примен ютс  дл  получени  препаратов алкогольдегидрогеназы штаммы хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Исходна  удельна  активность алкогольдегидрогеназы (АДГ) клеток этих штаммов составл ет 0.11- 0.76 ед/мг.

Наиболее близкими по достигаемому

Ъоложительному эффекту  вл ютс  штаммы

Candida regulnll 316 и Candida regulnl-232,

наход щиес  в музее культур Института

микробиологии АН БССР, образующие алкогольдегидрогеназу с удельной активностью 1.38 и 2,27 ед/мг соответственно.

Однако известные штаммы обладают сравнительно низким уровнем активности АДГ

Целью изобретени   вл етс  получение штамма - продуцента АДГ с более высокой и стабильной активностью фермента при росте на среде с этиловым спиртом.

Штамм Candida regulnll ЛС-15 прлучен с использованием традиционных генетико- селекционных приемов из штамма Candida regulnll 316. Процесс получени  штамма включает обработку сгущенной суточной суспензии клеток штамма C.regulnll мутаге- ном (0.0075М фенетил-ди-2-хлорэтиламин) и отбором мутантных клонов с использованием селектирующего агента - монофторук- сусна  кислота (7.8 г/л). Из выросших на среде с антиметаболитом (МФУ) 10-15 клонов целенаправленно отбирают штамм C.regulnll ЛС-15, обладающий наивысшей активностью алкогольдегидрогеназы.

Полученный штамм дрожжей Candida regulnll ЛС-15 депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКМ CR-321 Д.

Штамм характеризуетс  следующими культурально-морфологическими и физио- лого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки .

Клетки удлиненные, единичные, веретенообразные , длина 4.5-9,0 мкм, ширина 1,5-3,0 мкм.

Рост на жидких средах.

Солодовое сусло 7° по Баллингу, 26°С, двое суток

(без встр хивани )сера  пленка, сползающа  на стенки, небольшой осадок белого цвета,

среда без изменений

Через мес ц (17°С) при сто нии пленка на стенке сосуда, опускающа с  на дно (на качалке)

осветление среды

сильное помутнение среды, кольцо отсутствует выпадает обильный осадок белого цвета

осветление среды

Жидка  минеральна  среда с этанолом (2,0 об%), 3-е сут, качалка, 30°С

Сильное помутнение белого цвета, выпадает обильный осадок белого цвета, Через мес ц (17°С) при сто нии пленка не образуетс .

Подкисление среды с рН от 4,5 до 3,2.

Рост на плотных средах.

Сусло-агар, 30°С, трое суток, (посев штрихом) рост обильный, непрозрачный, край зубчатый, серо-белого цвета, колонии круглые, до 10 мм, матовые, край зубчатый, консистенци  пастообразна , профиль слабо выпуклый, серо-белого цвета.

Через мес ц (17°С) колонии кремового цвета, слегка гранулированы, опушенные псевдомицелием.

Минеральна  агаризованна  среда с этанолом (2,0 об.%), трое суток, 30°С, (посев штрихом): рост обильный, сплошной, переход щий в цепочку отдельных колоний, край ровный, серо-белого цвета, колонии круглые , 3,5 мм, матовые, край ровный, профиль слабо выпуклый, пастообразной консистенции , серо-белого цвета.

Через мес ц (17°С) колонии серого цвета , не гранулированы, край не опушен псевдомицелием .

Рост на глюкозо-картофельном агаре: на стекле отдельные клетки и псевдомицелий .

Кукурузный агар: на стекле (анаэробные

услови ) псевдомицелий и почкующиес  клетки.

Истинный мицелий и артоспоры отсутствуют , Растет без витаминов на среде Ри- дер+глюкоза.

0 Физиолого-биологические признаки

Температурный диапазон роста 8-43°С. Оптимальна  температура роста 28-38°С. Максимальна  скорость роста 37-40°С. Оптимум рН 3,8-4,5.

5 Растет на среде с 50% глюкозы, не растет на среде с 10% NaCI,

Сбраживает только глюкозу на среде: дрожжева  вода +2,0% углевода. Ассимилирует глюкозу, этанол, глицерин, молочную

0 кислоту,  нтарную кислоту, лимонную кислоту . Не ассимилирует галактозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, лактозу рафинозу, крахмал, ксилозу, L-арабинозу, D-арабино- зу, рибозу, рамнозу, маннит, инозит.

5Нитраты и нитриты не ассимилирует. Усваивает мочевину, аммонийные соли, пептон, аспарагин. не усваивает желатину, Обладает уреазной активностью (на среде Христенсена).

0 Хорошо хранитс  в лиофильно высушенном состо нии. Штамм не токсичен и не патогенен.

Штамм ВКМ ИБФМ АН СССР CR-321 Д идентифицирован как штамм вида Candida

5 regulnll,

Посевной материал получают выращиванием штаммов C.regulnil ЛС-15, C.regulnli 316-232, C.regulnll 316 в колбах в жидкой питательной среде следующего состава,

0 г/л: мочевина 2.0; NaH2POo 2H20 3,5; К2НР04 -ЗНаО 3,8; MgSOi 7Н20 1,4: концентрат микроэлементов 2 мл: этиловый спирт 2,0 об.%, вода дистиллированна  до 1 л. Величину рН довод т фосфорной кислотой

5 до 4,5. Этанол и соль Мд внос т в колбы после автоклавировани .

Полученный посевной материал в количестве 8-10% от объема питательной среды (50 мл) внос т в колбы со свежей средой

0 (состав приведен выше). Культивирование осуществл ют при 30°С на качалке (200 об/мин). По мере роста штаммов через определенные промежутки времени (1.5-2,0 ч) урожай биомассы (каждый раз берут отдель5 ные колбы) клеток отдел ют от культуральной жидкости с помощью центрифугировани  (3000 об/мин) и отмывают от компонентов питательной среды 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0). Затем клетки подвергают деструкции с помощью экструзии из

замороженного состо ни . Полученный дезинтеграт центрифугируют (12000 об/мин) в течение 20 мин дл  отделени  целых клеток, клеточных осколкоб и супер- натант анализируют на наличие алкогольде- гидрогеназой активности с использованием спектрофотометрического метода. Удельную активность фермента выражают в ед/мг - количество мкМ НАД, восстановленного ферментом за 1 мин. разделенное на количество белка (мг) внесенного в реакционную смесь.

В таблице привод тс  данные сопоставительного анализа по уровню активности АДГ и времени достижени  максимальной активности, полученные при экспериментальной (лабораторной) проверке всех трех штаммов.

Преимущества штамма C.regulnll ЛС- 15ВКМ CR-321 Д по сравнению со штаммом C.regulnll 316-232 и C.reguinll 316:

- более высокий уровень удельной активности алкогольдегидрогеназы (на 50% в среднем дл  штамма 316-323 и на 146% в среднем дл  штамма 316).

- менее короткий срок ферментации дл  достижени  максимальной активности, что позвол ет в услови х производства экономить электроэнергию, а также получать более высокий выход целевого продукта с единицы объема ферментационного оборудовани .

Таким образом, штамм Candida regulnll ЛС-15 CR-321 Д не только превосходит по уровню активности алкогольдегидрогеназы известные штаммы, но и  вл етс  более технологичным по своим свойствам.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Штамм дрожжей Candida regulnll BKM CR-321 Д - продуцент алкогольдегидрогеназы .