SU1701114A3

SU1701114A3 - Способ получени @ -интерферона лошади

Info

Publication number: SU1701114A3
Application number: SU874203834A
Authority: SU
Inventors: Хауптманн Рудольф; Химмлер Адольф; Светлы Петер
Original assignee: Берингер Ингельгейм Интернациональ Гмбх (Фирма)
Priority date: 1986-12-10
Filing date: 1987-12-09
Publication date: 1991-12-23
Also published as: ZA879245B; IE60404B1; EP0271824A2; JPS63233794A; FI99116C; FI875427L; AU616873B2; KR880007568A; NO180239B; AU8223387A; PT86332A; ES2058094T3; NO875136D0; ATE91722T1; JPH07258294A; CA1339776C; JPH07250690A; HUT46066A; EP0271824A3; DK645887D0

Abstract

Изобретение относитс к способу получени нового интерферона, в частности к способу получени лошадиного интерферона типа у. Способ получени у-интерферона лошади заключаетс в том, что из печени лошади выдел ют высокомолекул рную ДНК, которую обрабатывают эндонуклеэ- зой Sau ЗА, полученные фрагменты длиной 1020 т.п.н. отдел ют, дефосфорилируют. клонируют в л мбда-векторе и выдел ют ген интерферона из полученной библиотеки ДНК, реклонируют ген в векторы экспрессии, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют штаммы Е. coli с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

Description

Изобретение относитс к способу получени интерферона, в частности к способу получени лошадиного интерферона типа у.

Способ получени у-интерферона лошади заключаетс в том, что из печени лошади выдел ют высокомолекул рную ДНК, которую обрабатывают эндонуклеазой Sau ЗА, полученные фрагменты длиной 10-20 т.п.н. отдел ют, дефосфорилируют, клонируют в л мбда-векторе и выдел ют ген интерферона из полученной геномной библиотеки ДНК, реклонируют ген в векторы экспрессии, полученными рекомбинантными ДНК трансформируют штамм E.coli с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

Пример. Стади 1. Выделение лошадиной ДНК.

Замороженную печень лошади размалывают в жидком азоте до тонкого порошка и в течение Зч при 55°С инкубируют в 0,5 М

этилендиаминотетрауксусной кислоте (ЭД- ТУК), 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,5% додецил- сульфата натри (ДСН) и 0,1 мг/мл протеиназы К (20 мл/г ткани). Полученный в зкий раствор освобождают от белка путем однократной экстракции фенолом и трехкратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), диализуют в растворе 50 ммоль трис-HCI, рН 8,0, 10 ммоль ЭДТУК, 10 ммоль хлористого натри и ДНК осаждают двум обьемами этанола. После полного высушивани в вакууме ДНК раствор ют в ТЕ-буфе- ре (10 ммоль трис-HCI, рН 8.0, 1 мМ ЭДТУК) при 4°С, центрифугируют в растворе хлористого цези 1,273 г/мл при 40000 об/мин в течение 62 ч при 20°С, фракции, содержащие ДНК, диализуют в ТЕ-буфере, ДНК осаждают двум объемами этанола, промывают 70%-ным этанолом, высушивают и снова раствор ют в ТЕ-буфере при 4°С

VI

О

ы

Полученный препарат ДИК свободен от РНК и имеет длину более 50 т.п.н. (определено путем электрофореза на 0,45%-ном агарозном геле).

Стади 2, Частичное переваривание эн- донуклеазой и фракционирование по величине лошадиной ДНК.

50 мкг лошадиной ДНК вместе с 1,6 ед. Sau ЗА инкубируют при 37°С в 450 мкл реакционной среды (10 ммоль трис-HCI, рН 7,5, 10 ммоль хлористого магни , 1 ммоль дитиотреитола). Через 15, 25 и 40 мин отбирают по 150 мл аликвотной части и смешивают с 15 ммоль ЭДТУК и прогревают в течение 10 мин при 70°С дл остановки реакции . После добавлени 0,3 моль ацетата натри , рН 6,0, ДНК осаждают с помощью 2,5 объема этанола. После повторного растворени в ТЕ-буферг ДНК раздел ют по величине в ТВЕ-буфере (10-8 г/л трис, 5,5 г/л борной кислоты, 0,93 г/л динатриевой соли ЭДТУК) путем электрофореза при 1 В/см на 0,45%-ном агаоозном геле в течение ночи. ДНК расщепл ют рестриктазами EcoR1 и Hind 111 и выдел ют фрагменты ДНК длиной т.п.н. путем электроэлю- ации при 300 В в течение 3 ч (буфер 5 0,1 х ТВЕ), очищают на колонке марки Элютип Д и затем осаждают этанолом.

ДНК дефосфорилируют. Дл Этого ДНК вместе с 5 ед. кишечной бычьей фосфатазы инкубируют в течение 30 мин при 37°С в 140 мкл реакционной среды (50 ммоль трис-НС, рН 9,5, 10 ммоль хлористого магни , 0,1 ммоль ацетата цинка, 1 ммоль спермидина), добавл ют 5 ед. фермента и инкубируют в течение 30 мин. После добавлени ЭДТУК до конечной концентрации 25 ммоль ДНК экстрагируют однократно смесью фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1 по объему), двукратно смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1 по объему) и трехкратно простым диэтиловым спиртом, осаждают этанолом, высушивают и раствор ют в 0,1 хТЕ-буфере.

Стади 3. Получение библиотеки лошадиной геномной ДНК,

Дефосфорилированные длиной 10-23 т.п.н. фрагменты лошадиной ДНК клонируют в л мбда-векторе, например л мбда- EMBL3 или EMBL ЗА, с выступающими G-A-T-C-концами путем удалени внутреннего Barn Н1-фрагмента фаговой ДНК.

Вектор выращивают в штамме E.coli с супрессорным фактором SupF., например Е.соН NM 526, 538 или 539, в LB-бульоне с 5 ммоль сульфата магни , осаждают полиэти- ленгликолем и очищают путем двукратного центрифугировани при 45000 об/мин и 20°С в течение 40 ч с использованием хлорида цези в качестве градиента плотности (0,71 г/мл раствора). После диализа в ТЕ-бу- фере фаговую ДНК освобождают от белка путем двукратной экстракции смесью фенола с хлороформом и изоэмиловым спиртом (25:24:1 по объему) и двукратной экстракции смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1 по объему), затем концентрируют путем осаждени этанолом.

0 Дл получени концевых фрагментов 2EMBL ЗА 50 мкг фаговой ДНК полностью переваривают с помощью Barn H1 в течение 2 ч при 37°С в 45 мкл реакционной среды (10 ммоль трис-HCI, рН 7,5, 10 ммоль хлорида

5 магни , 1 ммоль дитиотреитола), после чего реакцию прекращают путем добавлени 15 ммоль ЭДТУК на 10 мин при 70°С. ДНК осаждают этанолом.

Во избежание повторного лигировани

0 средний фрагмент режут с помощью EcoR1 и отдел емый при этом олигонуклеотид удал ют путем осаждени изопропанолом.

Полученную ДНК полностью переваривают с помощью EcoR1 в течение 2 ч при

5 37°С в 450 мкл 10 ммоль трис-HCI, рН 7,5, 100 ммоль хлористого натри , 10 ммоль хлористого магни и реакцию прекращают путем добавлени 15 ммоль ЭДТУК и 10-минутного прогревани при 70°С. После

0 добавлени ацетата натри до конечной концентрации 0,3 М три больших фрагмента ДНК осаждают с помощью 0,6 объема изо- пропанола в течение 15 мин при 0°С, промывают 2 раза 0,45 М ацетата натри (0,6

5 объема изопропанола) и однократно с помощью 0,3 М ацетата натри (2.5 объема этанола) и раствор ют в 15 мкл 0,1 х ТЕ-бу- фере. При этом линкеры Bam H1/EcoR1 осаждаютс в растворе.

0Фрагменты EMBL ЗА (8 мкг) объедин ют

примерно с 5 мкг лошадиной ДНК длиной 10-23 т.п.н, и 10 ед. Т4-ДНК-ли аэы и инкубируют в течение ночи при 14°С и один день при 4°С в 50 мкл среды лигировани (66

5 ммоль трмс-НС, рН 7,2, 0,1 М хлорида натри , 10 мМ хлорида магни , 1мМ ЭДТУК, 5 мМ дитиотреитола, 0,5 мМ трифосфата аде- нозина - АТФ). Цитированную смесь ДНК упаковывают в зрелые л мбда-фаговые час0 тицы.

Компоненты этой системы, т.е. ультразвуковой экстракт (УЭ), лизат, получаемый путем замораживани - размораживани (ЛЗР), буферы М1 и А приготавливают изве5 стным образом. 10 мкл аликвотной части смеси лигированной ДНК инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин вместе с 25 мкл УЭ, который так же, как и ЛЗР размораживают во льду в течение 30 мин, смешивают с 100 мкл ЛЗР и инкубируют далее в течение 60 мин при комнатной температуре. Полученную смесь разбавл ют 150 мкл л мбда-разбавител (100 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ сульфата магни , 1 мМ ЭДТУК) и хран т при 4°С.

Стади 4. Клонирование и анализ последовательностей гена дл лошадиного интерферона типа гамма.

Выделение клона полношго гена дл лошадиного интерферона типа гамма,

Бактериальную культуру, растущую в течение ночи в LB-питательном растворе (10 г/л хлористого натри , рН 7,4), содержащем 0,2% мальтозы, довод т до оптической плотности 2,0 (при 600 нм). По 0,5 мл этой суспензии инфицируют 50000 ед. л мбда- фагов библиотеки ДНК и с помощью сло м гкого агара распредел ют по LB-arapo- вым пластинкам, содержащим 10 мМ сульфата магни . Пластинки имеют диаметр 13,5 см. Скринингу подвергают всего 1,5 х 106 рекомбинантных л мбда-фагов. После инкубации в течение ночи при 37°С фаги каждой пластинки используют дл приготовлени двукратных репликонов на нитроцеллюлозе . После денатурации фаговой ДНК (1 мин 0,5 н.гидроокиси натри , 1,5 М хлористого натри ), нейтрализации (2 раза в течение 3 мин в 0,5 М трис-НС, рН 7,5, 1,5 М хлористого натри ) и промывки (1 мин в буферах 2xSSC, 1xSSC, 0,15 М хлористого натри , 15 мМ цитрата натри ) фильтры сушат на воздухе , ДНК фиксируют при 80°С в течение 2 ч. Фильтры промывают при 65°С в течение ночи в растворе 1,5 М хлористого натри , 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 0,1 % ДСН, подвергают предварительной гибридизации при 65°С в течение 4-6 ч (раствор дл гибридизации: 0,9 М хлористого натри , 50 мМ гидроген- фосфата натри , рН 7,4, 5 мМ ЭДТУК, 0,1% фиколла, 0,1% поливинилпмрролидона, 0,1% альбумина сыворотки крупного рогатого скота, 0,1 % ДСН, 20 мг/мл ДНК спермы лосос , подвергнутой ультразвуковой обработке и денатурации).

Гибридизацию осуществл ют в свежем растворе с использованием 10б срт на фильтр с радиоактивно маркированной пробой человеческого гамма интерферона при 65°С в течение 20 ч. Фильтры промывают при 65°С в буфере 3xSSC, 0,1 % ДСН, сушат и подвергают ауторадиографии. После трехкратной очистки п тен идентифицируют п ть л мбдэ-клонов, которые про вл ют положительные сигналы гибридизации.

Из этих выделившихс рекомбиьантных фагов ДНК очищают известными приемами. После переваривани различными рестрикционными энзимами и последующего анализа по Саузерну фаговые ДНК характеризуют путем гибридизации пробой человеческого гамма-интерфероча. Выдел - 5 ют единственный гибридмзмрующийс ВгтН -фрагмент длиной 4,6 т п.и. клона лзмбда Eq- y2, который клонируют в место разреза Bam HI известной плазмидой pUC9.

0 После трансформации E.coli JM101 из полученных колоний по способу приготовлени мини-препаратов получают плазмид- ную ДНК, которую характеризуют путем переваривани рестрикционными энзима5 ми. Плззмиду с желаемой вставкой Bam H 1 обозначают как рАН111, После введени в известные векторы М i 3м р8 или М13мр9 BamHI-вставки плазмиды рАН111 подвергают анализу последовз0 тельностей по дмдезокси-методу. Сравнение последовательностей с геном человеческого интерферона типа гамма показывает большую гомологию с некодирующими 5 - и 3 -област ми. По этим

5 результатам заключают, что выделен полный ген лошадиного гамма интерферона.

Анализ последовательноегеГ. гена лошадиного интерферона типа гамма, выделенного из клочз л мбда Eq- v2

0Bam HI - вставку длиной 4,6 т.п. н. плазмиды рАН111 подвергают полному анализу последовательностей. Общую последовательность фрагмента Bam H1 определ ют путем сочетани частичных последователь5 ностей субклонов М13, которые получают путем направленного клонировани ре- стрикционныхфрагментов(EcoR1. Hind 111, Pst1, Pst1 - Bgi11, Hind 111 - Bam H1) в соответственно разрезанные векторы

0 М13мр8 или М13мр9 Дальнейшие частичные последовательности получают за счет клонировани фрагмента Bam H1-Bgl 11 длиной 2,0т.п.н. или фрагмента Pst1 длиной 2,0 т.п.н. в вектор М13мр8. Оба фрагмента

5 ДНК раздел ют на меньшие куски путем ультразвуковой обработки, концы ДНК делают тупыми путем инкубации ДНК-полиме- разой 1 из E.coli (фрагмент Кленова) в присутствии всех четырех дезоксинуклео0 тидтрифосфатов, каждый из которых примен ют в количестве 0,1 мМ (реакционный буфер: 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ хлорида магни , 1 мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого

5 скота, 1 ч, 25°С). После фракционировани в агарозном геле ДНК-фрзгменты длиной примерно 0,4-1.0 т.п.н. выдел ют и лигиру- ют з место разреза Sma1 вектора М13мр8. Полученные последовательности обьедин ют с помощью компьютерной программы с получением общей последовательности длиной 4664 пар оснований.

После анализа с использованием компьютера открытых рамок чтени и сравнени с генами интерферона типа гамма другого происхождени определ ют кодирующую область гена гамма-интерферона лошади. Кодирующа область включает три интрона, причем первый кодирует гидрофобный сигнальный пептид длиной 20 аминокислот и 18 аминокислот полипептида зрелого лошадиного интерферона типа гамма (основани 366-479). Второй эквон кодирует аминбкислоты 19-41 (основани 1639-1707), третий экзон - аминокислоты 42-102 (основани 1803-1985), а четвертый экзон - карбоксиконец с аминокислотами 103-146 (основани 3307-3441). В положени х 4010 и 4020 наход тс две сигнальные последовательности (ААТААА) дл полиаде- нилировани мРНК. В положени х 86-88 полипептида дл зрелого лошадиного гамма-интерферона находитс единственное возможное место N-гликозилировани (AsN-Ser-Ser), которое совпадает с вторым местом N-гликозилировани (Asn-Gly-Ser) бычьего интерферона типа гамма. Неожидаемым образом полипептид дл зрелого лошадиного гамма-интерферона содержит только один единственный цистеиновый остаток в положении 3, причем аналогично природным, человеческим и мышиным гам- магинтерферонам первые три аминоконце- вые аминокислоты (в .этом случае Tyr-Tyr-Cys) по всей поверхности протеоли- тически отщепл ютс в теле.

Стади 5. Получение синтетического гена дл зрелого лошадиного интерферона типа гамма.

Синтетический ген дл зрелого лошадиного гамма интерферона конструируют в виде двух вариантов с использованием 16 различных олигонуклеотидов. Первый вариант кодирует зрелый интерферон с 146 аминокислотами плюс стартовый метионин, а второй вариант - на концевой аминогруппе укороченный на 3 аминокислоты (Туг-Туг- Суг) полипептид плюс с-артовый метионин, как в организме.

Синтез гена гамма-интерферона лошади осуществл ют в две стадии. На первой стадии осуществл ют конструкцию первой части гена с использованием восьми олигонуклеотидов EG-1 - EG-8 до места разреза Sail, а на второй стадии - конструкцию второй половины гена с использованием шести олигонуклеотидов EG-9 - EG-14, размещенных от места разреза Sail до места разреза Bam H1. Дл конструкции укороченного на три аминокислоты на концевой аминогруппе варианта лошадиного гамма- интерферона используют олигонуклеотиды Е6-15и EG-1 б вместо олигонуклеотидов EG1 и EG-2. Комплементарные олигонуклеотиды парами подвергают фосфорилированию на 5 -конце. По 100 пмоль обоих олигонуклеотидов (например, EG-3 и EG-4, EG-5 и EG-6 и т.д.) инкубируют Ч О ед. Т4-полинуклеотид0 ной киназы при 37°С в течение 10 мин в 9 мкл реакционного буфера (70 мМ трис-HCI, рН 7,6. 10 мМ хлористого магни , 5 мМ ди- тиотреитола), 2 мкКч ( ) АТФ. Затем добавл ют 1 мкл раствора 10 мМ АТФ и

5 инкубируют при 37°С в течение 50 мин. Реакцию прекращают путем 10-минутного нагрева до 95°С. В цел х предотвращени последующего св зывани концов ДНК олигонуклеотиды EG-1, EG-15, EG-9 и EG-14 не

0 фосфорилируют. После инактивации пол- инуклеотидкиназы их смешивают с соответствующимкомплементарным олигонулеотидом, нагревают до 95°С в течение 5 мин и охлаждают до комнатной

5 температуры. Смеси олигонуклеотидов EG-1 + EG-2 (или EG-15 и EG-16), EG-3 + EG-4, EG-5 + EG-6 и EG-7 + EG-8 объедин ют, смешивают с 1 мкл 5 М хлористого натри , нагревают до 70°С в теченине 5 мин и

0 охлаждают до комнатной температуры. К раствору добавл ют 5 мкл 10 мМ АТФ, 2 мкл дитиотреитола, 1,5 мкл 10 х буфера лигиро- вани (0,66 М трис-HCI, рН 7,2, 1 М хлористый натрий, 100 мМ хлористого магни , 10

5 мМ ЭДТУК, 50 мМ дитиотреитола) и 80 ед. Т4 ДНК-лигазы и инкубируют при 4°С в течение 48 ч. За ходом реакции лигировани наблюдают путем разделени электрофорезом в 5%-ном полиакрилэмидном геле фраг0 ментов ДНК небольшой части реакционной среды и последующей ауторадиографми. Аналогично св зывают один с другим шесть олигонуклеотидов EG-9 до EG-14. Реакцию прекращают экстракцией фенолом и хлоро5 формом, ДНК выдел ют осаждением этанолом .

Стади 6. Введение синтетического гена в плазмиду pRH-100,

10 мкг ллаэмиды pRH-ЮО расщепл ют

0 рестри ктазой Sad в 100 мкл реакционного буфера и этим инактивируют путем 10-минутного нагрева до 70°С. ДНК обрабатывают фрагментом Кленова при 25°С в течение 30 мин в присутствии всех четырех дезокси5 нукле отидтрифосфзтов, каждый из которых берут в количестве10 мкМ. Реакцию прекращают экстракцией смесью фенола с хлороформом , ДНК концентрируют осаждением этанолом. В результате этой обработки за триптофановым промотором образуетс тупой конец ДНК, который заканчиваетс трансл ционным стартовым кодоном АТС. Линеаризированную плазмидную ДНК расщепл ют рестриктазой ВатН1 и векторную часть выдел ют электрофорезом в агароз- ном геле.

50 нг подготовленного таким образом плазмидного вектора pRH-ЮО смешивают с 20 пмоль лигированных олигонуклеотидов EG-1 до EG-8 и EG-9 до EG-14 и в 10 кмл буфера лигировани (66 мМ трис-HCl, рН 7,2, 100 мМ хлорида натри , 10 мМ хлорида магни , 1 мМ ЭДТУК, 5 мМ дитиотрейтола, 1 мМ АТФ) инкубируют 1 ед. Т4-ДНК-лигазы при 14°С в течение 24 ч. Обработанные кальцием клетки E.coli 1M-101 трансформируют этой лигазной смесью и инкубируют при 37°С в течение ночи. Из полученных трансформатов выдел ют плазмидную ДНК, структуру которой определ ют ре- стрикционным анализом и анализом последовательностей вставки Hind 111-Bam H1, Плазмиду желаемой структуры дл экспрессии зрелого лошадиного интерферона типа гамма обозначают как pEqG-YYC1. Анало- гичным образом олигонуклеотиды EG-15, EG-16, EG-3 до EG-8 и EG-9 до EG-14 клонируют в вектор pRH-ЮО с тем, чтобы получить укороченный на три аминокислоты лошадиный интерферон типа гамма. Плазмиду же- лаемой структуры обозначают как pEqG-QAA1.

Стади 7. Экспресси интерфероновой активности штаммом E.col HB101, содержащим плазмиду pEq-YYC1 или pEqG- QAA1.

100 мл бактериальной культуры инкубируют при 37°С и при интенсивном встр хивании в следующей, не содержащей триптофана в среде (данные на литр среды): 10 г фосфата аммони , 3,5 г гидрогенфосфа- та кали , рН 7,3 с помощью гидроокиси натри , 0,5 г хлористого натри , 21 г Cas-аминокислот (подвергнутых кислотному гидролизу), 11 г глюкозы, 1 мМ сульфата магни , 0,1 мМ хлорида кальци , 1 мМ тиамина- HCI, 20 мг L-цистеина, 20 мгЗ-/3- индол акриловой кислоты. Кроме того, среда может содержать еще 50-100мг ампициллина . После инкубации среду центрифугируют при 4000 об/мин в течение 5 мин, осадок суспендируют э охлажденном буфере (50 мМ трис-HCl, рН 8,0, 30 мМ хлорида натри ), вз том в количестве 1/10. Клетки дважды в течение 30 с разрушают ультразвуком (при 20 кГц, 100 Вт) Остатки разрушенных клеток удал ют цен грифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин при 4°С и после стерилизующей фильтрации надосадочную жидкость провер ют на интерференовую

активность путем определени цитопатиче- ского эффекта везикул рного вируса стоматита (ВВС) или вируса энцефаломиокардита (ВЭМ).

Тест-система: клетки NBL-б (АТСС CCL 57, клетки лошадиного зпидермиса)/ВВС.

А 549 (АТСС CCL 185, клеточна лини опухоли легких человека)/ВЭМ. Титр нг клетках А 549 нормируют на международные единицы с помощью стандарта человеческого интерферона. Штамм E.coli CSR603 трансформируют плазмидами, бактерии селекционируют на содержащих ампициллин агаровых плитках. Дл приготовлени макси-клеток и маркировки протеинов клетки выращивают при 37°С до оптической плотности 0,5 при 600 нм в 15 мл среды (см. стадию 7) без индолакриловой кислоты и 10 мл этой культуры в качающейс чашке Петри, облучают в течение 5 с с помощью установленной на рассто нии 50 см от чашки лампой (15 Вт), после чего инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Культуры смешивают с 100 мкг/мл D-циклосерина, инкубируют при 37°С в течение 14 ч, бактерии отдел ют путем центрифугировани . Клетки дважды промывают 5 мл солевого раствора Хершей, в 5 мл среды Хершей суспендируют 20 мкг/мл индоакриловой кислоты и инкубируют при 37°С в течение 2 ч. К каждой культуре добавл ют 5 мкКи/мл 35S- метионина (1000 Ci/ммоль) и встр хивают при 37°С в течение 1 ч. Клетки отдел ют, лизуют в буфере дл электрофореза, содержащем ДСН и 2-меркаптоэтанол, и протеиныраздел ютв15%-ном полиакригамидном геле.

Состав солеЕС-го раствора Хершей (на 1 л):

NaCI5-4 г

KCI3,0 г

,1 г

CaCl2 2H2015мг

MgCb 6H200,2 г

бНаО0,2 мг

КН2Р0487 мг

Трис-НС 12,1 г

рН7,4.

Состав среды Хершей (на 100 мл солевого раствора Хершей):

2 мл20% глюкозы

0,5 мл2% треонина

1,0 мл1 % лейцина

1,0 мл2% пролинз

1,0мл2% аргинина

0,1 MI0,1% тиамина

Ауторадиографию высушенного гел осуществл ют 2 дн при -80°С на рентгеновской пленке с использованием усиливающей пленки. В качестве стандарта

(Л

олекул рного веса примен ют смесь С- етилированных протеинов. В качестве контрол примен ют плазмиду pER103, коора содержит только промотор без гена интерферона, и плазмиду pER21/1, котора содержит две копии гена человеческого инерферона типа АльфзЗаго.

Стади 8, Доказательство наличи гомологичных последовательностей в лошаином геноме с геном ЕдИФ-у.

30 мкг высокомолекул рной лошадиной НК (см. стадию 1) полностью переваривают с помощью 60 ед. соответствующего ре- стракционного фермента в 200 мкл реакционного объема и каждый раз 10 мкг этой разрезанной ДНК раздел ют по вели- чине в 0,8%-ном агарозном геле. После переноса на нитроцеллюлозные фильтра, денатурации и фиксации ДНК каждый фильтр гибридизуют 17 ч при 65°С, бхбуфер SSC, 5 х раствор Денхардта, 0,1 % ДСН, 20 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосос в присутствии примерно 6х106срт радиоактивно маркированной пробы.

В качестве пробы дл ЕдИФ-у примен ют фрагмент из плазмиды pEaG-YYd, кото- рый содержит последовательность/ кодирующую весь зрелый интерферон. Затем фильтры промывают 4 раза в течение 45 мин при 65°С с помощлью 0,3xSSC./45 мМ хлрида натри , 4,5 мМ цитрата натри , 0,1 % ДСН. Ауторздиографию осуществл ют на рентгеновской пленке с использованием усиливающей пленки при -80°С 8 течение 7 дней.

Стади 9. Экспресси лошадиного интерферона типа ) в E.coli HB101/pEG- QAA2 и HB101/pEgG-QAA3.

Дл достижени улучшенной экспрессии используют улучшенные экспрессион- ные векгоры и улучшенное место рибосомального св зывани .

Улучшенные экспрессионные векторы основаны на промоторе trp из Serratia marcescens (Sma), который в облгсти -35 путем замены основани (pRH281) приравнен к консенсусной области -35, или на гибридном промоторе trp, который имеет первую богатую А/Т область Е.coil (Eco) или вторую богатую А/Т область плюс промотор Sma (pRH282), В качестве места рибосомального св зывани испочьзуют энтеротоксин II из E.coli.

pRH281/5.

Известным образом Синтезируют следующие олигонуклеотиды: Trp-1: 51 -AATTGACGCTG-31 ; Trp-3:51ATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTT-GACATTGCCTTCGCGAACCAGTTAACTAGT АСАСА-31 ;

Trp-5:51-AGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTT

AATATGAGCTCGAATTCAT-31 ; Trp-2: 51 -TTAGCGATCAGCGTC-31; Trp-4:51-CGTGAACTTGTGTACTAGTTAACTGGTTCG CGAAGGCAATGTCAACCCTCTTTTTGCAAT

GTT-31 ;

Trp-6:51-CGATGAATTCGAGCTCATATTAAACCTCCT TACCGTCTCGAGC-31 ,

По 100 пмоль олигонуклеотидов Тгр-2 Тгр-5 раздельно фосфорилируют в 10 мкл реакционного раствора. Тгр-1 и -2, Тгр-3 и -4 и Тгр-5 и -6 подвергают гибридизации путем кип чени и медленного охлаждени . Растворы пар олигонуклеотидов соедин ют и

добавлением Т4-ДКА лигазы. 3 мкг рАЕ153 режут с помощью EcoR1 и С1а1. После очистки большого фрагмента к нему прибавл ют приблизительно 20 пмоль олигонуклеотидов и лигируют. Затем ДНК

трансформируют в E.coli HB101 и плазмиды из полученных колоний выдел ют. Фрагмент Pst-Hind111, содержащий промотор, подвергают анализу последовательностей. После подтверждени желаемой последовательности выбирают плазмиду и обозначают как pRH281/5.

Последовательность промоторной части следующа :-35 5LGAATTGACGCTGATCGCTAAAACATTGT

GCAAAAAGAGGGTTGACATTGC

3 -CTTAACTGCGACTAGCGATTTTGTAACA CGTTTTTCTCCCAACTGTAACG

Xho1

/-10 Transkriptionsstart

CTTCGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGT- -TCACGGCTCGAGACGGTAAG GAAGCGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCA - -AGTGCCGAG CTCTGCCATTC RBS Sst1 EcoRi Cla i

GAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCATCGAT-31

CTCCAAATTATAC.TCGAGCTTAAGTAGCTA-51

Преимуществами нового экспрессион- ного вектора вл ютс оптимальна область - 35 в промоторе trp-Sma; единственное место Xho1 перед местом рибосомального св зывани (МРС), что допускает замену

МРС на другое; экспрессионна плазмида содержит трансл ционный старт ATG на рассто нии 5 нуклеотидов от МРС; G этого ATG вл етс первым основанием последовательности опознавани Sst 1 (GAGCTC). Путем разреза с помщью Sst 1 и последую51щего получени пр мого конца получают экспрессионный вектор с трансл ционым стартом АТС, с которым можно лигировать чужой ген, начина с первого основани рамки считывани ; св зь MPC-ATG не содержит ни G ни С; выбором последовательности олигонуклеотидов на 5 -конце разрушаетс первоначальное место разреза EcoRI, благодар чему на З -конце промотора можно получать место мультиклонировани , состо щее из Sst1, EcoR1, Cla1 и Hind 111 (уже в рАТ153).

PRH282/5.

Аналогичным образом конструируют экспрессионный вектор pRH-282/5. Олиго- нуклеотиды Тгр-1 и Тгр-2 замен ют олиго- нуклеотидами Тгр-7 и Тгр-8: Trp-7;51VATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCG CCGACATCATCATGCT-3 ; Тгр-8:

TTAGCGATCAGCATGATGATGTCTCGGCGC AAAAAACATTATCCAGAACGGGC-31.

Последовательность промоторной части в pRH282/5 следующа :

51GAATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGC- GCCGACATCATCATGCTGAT

з CTTAACGGGCAAGACCTATTACAAAAAACG - CGGCTGTAGTAGTACGACTA -35CGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGA CATTCCCTTCGCGAACCAGT GCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACGGAAGCGCTTGGTCA Xho1

-10lTranskriptionsstart RBS TAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGACGG TAAGGAGGTTTAATATGA ATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTCCTCCAAATTATACT Sst EcoRI Clal G CTCG AATTCATCG AT-31 CG AG CTTAACTAG CTA-51

1 мкг pUC18 разрезают с помощью Bam H1 и5аИ,Из10мкгЕдСС)АА1 путем разреза с помощью Bam H1 и Sail выдел ют и дефосфорилируют вторую половину гена лошадиного интерферона типау.20 нг вектора лигируют с 100 нг вставки и ДНК трансформируют в E.colt JM101. Плазмиду одной колонии анализируют путем переваривани рестрикционными энзимами и обозначают как рСМ1.

pCN3.

Первую половину синтетического гена вместе с местом рибосомального св зывани конструируют из олигонуклеотидов:

5 5 EqG-1:5L

-AGCTTCCCTCGAGAGGTTGAGGTGATTTAT GCAGGCTGCTTTCTTTAAAGAAATCGAAAA CCTGAAAGAATACTTCAACGCTCGTAACCC 5 AGACGTTGGT-31:

EqG-2:5L

-GACGGTGGTCCGCTGTTCCTGGACATCCT GAAAAACTGGAAAGAAGACTCTGACAAAAA GATCATCCAGTCTCAG-31;

0 EqG-3:51-ATCGTTTCTTTCTACTTCAAACTGTTCGAAA ACCTGAAGAAAGACAACCAGGTTATCCAGA AATCGATGGACACTATCAAAGAAGATCTGT TCGTTAAATTCTTCAACTCGTCGACTCCG-31

5 ;

EqG-4:

-AATTCGGAGTCGACGAGTTGAAGAATTTAA CGAACAGATCTTCTTTGATAGTGTCCATCG ATTTCTGGATAACCTGGTTGTCTTTCAGGTT

0 TTCGAACAGTTTGAAGTAGAAAGAAAACGA TCTGAGACTG-31 ; EqG-5:51-GATGATCTTTTTGTCAGAGTCTTCTTTCCAG TTTTTCAGGATGTCCAGGAACAGCGGACCA

5 CCGTCACCAACGTC- 31 :

EqG-6:

-TGGGTTACGAGCGTTGAAAGTATTCTTTCA GGTTTTCCATTTCTTTAAAG AAAG CAG CCT GCCATAAATCACCTCAACCTCTCGAGGA-31.

0 По 50 пмоль олигонуклеотидов фосфо- рилируют, а именно EqG-2 вместе с EqG-5 в 7 мкл, EqG-З и EqG-8 раздельно в 8 мкл. Реакцию прекращают .путем нагрева до 100°С. К EqG-З добавл ют 50 пмоль EqG-4 (1

5 мкл), а к EqG-8 - 50 пмоль EqG-1 (1 мкл). Растворы еще раз нагревают до 100°С и медленно охлаждают. Растворы олигонук- леотидных пар соедин ют и лигируют Т4- ДНК-лигазой в 30 мкл, 2 мкг pUC18

0 расщепл ют EcoRI и Hindi 11, векторную часть очищают в геле и раствор ют в 50 мкл воды. 40 нг вектора и около 2 пмоль лигиро- ванных олигонуклеотидов подвергают лиги- рованию в среде 10 кмл, Полученной ДНК

5 трансформируют клетки E.coli JM101, Вставка EcoR1-Hind111 некоторых из полученных плазмйд переклонируют в М13тр9 и устанавливают последовательность, Выбирают плазмиду с требуемой последова0 тельностью и обозначают как pGN3. pGN20.

Около 3 мкг pGN1 и pGN3 расщепл ют Hindi 11 и Sail. Очищают в геле вставку pGNS H вектор (втора половина гена Eq5 ИФ- у из pGN1). 0,2 мкг pGN3 лигируют примерно с 0,05 мкг вставки pGN3 и ДНК трансформируют в E.coli JM101. Плазмиду полученного клона выбирают после проверки рестрикционного рисунка и обозначают как pGN20.

pEqG-QAA2 или pEqG-QAA3,

Примерно из 10 мкг pGN20 выдел ют Xho1-EcoR1 фрагмент, содержащий ген синтетического гамма-интерферона лошади вместе с местом рибосомзльного св зывани зн еротоксинз III из E.coll. рЯН281/5 или pRH282/5 расщепл ют рестриггаэамин Xhol и EcoRI. 20 нг вектора лигируют с 20 нг фрагмента, полученной ДНК трансформируют клетки E.coli НВ10, из которых затем выдел ют плэзмиды и провер ют рестрикцмонным анализом. Выбирают плазмиду, которую обозначают как pEqG- QAA2 (вектор pRH281/5) или (вектор: pRH282/5).

Опыт по проверке активности интерфе- °рона типа гамма.

Росшую в течение ночи культуру Е.соН HB101/pEqG-QAA2 или HB101/pEqG-QAA3 разбавл ют в соотношении 1:100 LB-буфе- ром (100 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л хлористого натри . 50 мг/л ампициллина) и далее инкубируют при 37°С. После достижени оптической плотности 0,3 (600 нм) добавл ют 50 мг/л ивдолакри- ловой кислоты и культуру инкубируют в течение дальнейших 2 ч при 37°С. Бактерии1 отдел ют центрифугированием и разрушают путем ультразвуковой стерильной фильтрации ., надосадочную жидкость испытывают на клетках NBL-6(ATCCCCL57) на активность гамма-интерферона, причем в качестве вируса используют везикул рный вирус стоматита. Лизаты обеих трансформированных бактериальных культур (Е.соН HB101/pEqG QAA2 или HBIOI/pEqG- QAA3) про вл ют около 0,1-1 мпн ед,/мл мнтерфероновой активности. В качестве контрол испытывают идентично полученный лизат Е.соН HB101/pRH281. Этот контрольный лизат про вл ет меньше чем 100 ед./мл.

Claims

Формула изобретени

Способ получени -интерферона лошади , закпючающийс в том, что v, печени лошади при рН 8,0 экстрагируют ДНК с использованием фенола, элгаат дич мзуют ДНК осаждают этанолом, центрифугируют в буфере рН 8,0, дизлизуют и осаждают этанолом ДНК размером более 50 т.п.н,, полученную ДНК расщепл ют эндонуклеазой Sau ЗА при рН 7,5, Фракционируют с помощью электрофореза, выдел ют фрагменты длиной 10-23 т.п.н., дефосфорилируют их и клонируют в векторе EMBL 3 (-ЗА), путем скрининга клонированных фрагментов ДНК отбирают фрагмент, гомологичный гену гамма-интерферона человека, отобранный фрагмент размером 4,6 т.п.н. расщепл ют рестрмктазой Bam HI, встраивают в вектор pUC9, полученными рекомби- нантными ДНК трансформируют бактерии Escherlchia coll JM101, отбирают плазмиду рАН111, содержащую Bam H1, синтезируют

фрагмент, состо щий из 14-ти олигонуклео- тидоа EG 1 - EG 14, который встраивают в плазмиду рННЮО по сайту рестрикции Sac путем затуплени выступающих концов ДНК обработкой фрагментом Кленова в при0 сутствии четырех дезоксинуклеотидтрифос- фатов и дополнительным гидролизом Ват Н1, далее полученной рекомбинантной ДНК трансформируют бактерии Е.соН JM101, продукты трансформации, содержащие

5 плазмиду pEqG-YYC1 или pEqG-QAA1, культивируют , анализируют на интерфероновую активность выделенный и очищенный ионообменной хромаюграфией и гель-хроматографией белок, синтезируют олигонуклеотиды

0 Тгр 1-6 или Тгр 7-8 со следующими нуклео- тидными последовательност ми: Тгр-1: 5 -AATTGACGCTG--3 : Trp-3:51-ATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTT

5 GACATTGCCTTCGCGAACCAGTTAACTAGT АСАСА-31 ;

Trp-5:51-AGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTT AATATGAGCTCGAATTCAT-31 ;

0 Тгр-2: 5 -TTAGCGATCAGCGTC-3 : Trp-4:51-CGTGAACTTGTGTACTAGTTAACTGGTTCG CGAAGGCAATGTCAACCCTCTTTTTGCACA ATGTT-31 ;

5 Trp-6:51-CGATGAATTCGAGCTCATATTAAACCTCCT TACCGTCTCGAGC-31 ; Trp-7:51-AATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGC

0 CGACATCATCATGCT-3 ; Тгр-8:5-TTAG CGATCAG CATGATGATGTCGG CG САА AAAACATTATCCAGAACGGGC-3 затем получают фрагменты, кодирующие

5 промотор и место рибосомного св зывани , лигируют их с большим фрагментом разрезанной EcoRI и СЫ плазмиды рАТ153, трансформируют полученной ДНК штамм бактерии E.coii HB101 и выдел ют плазми0 ды pRH281/5 или pRH282/5, параллельно вектор PUC18 обработанный Bam H1 и Sail эндонуклеазой, лигируют с второй половиной синтетического фрагмента, полученного в результате переваривани плазмиды

5 EqG-QAA1 эндонуклеазами Bam H1 и SaM и дефосфорилировани , полученной ДНК трансформируют бактерии Е.соН JM101 и выдел ют плазмиду pGN1 или вектор pUC18, обработанный эндонуклеазами EcoRI и Hind 111, лигируют с олигонуклеогидами EqG-1 - EqG-6 или EG3 - ЕС6,пол- учениой ДК трансформируют бактерии E.coli JM101, выдел ют плазмиду pGN3, плаэмиды pGN1 и pGN3 обрабатывают Hind 111 и Sail, подвергают гель-очистке с последующим лигированием, трансформируют полученной ДНК бактерии E.coli JM101 и выдел ют плазмиду pGN20, далее выдел ют Xho1-EcoR1 фрагмент ДНК, содержащий синтетический гену-интерферона с местом

рибосомного св зывани E.coll Enterotoxln И, который лигируют с плазмидами pRH 281/5 и pRH 282/5, обработанными Xho1 и EcoR1, эндонуклеазами, полученной ДНК трансформируют штамм бактерии E.coli НВ101, продукты трансформации, содержащие плазмиду pEqG-QAA2 или pEqG-QAA3, культивируют с последующим выделением интерферона и его очисткой путем ионообменной хроматографии и гель-хроматографии.