FI99116C

FI99116C - Menetelmä valmistaa hevosen -interferonia

Info

Publication number: FI99116C
Application number: FI875427A
Authority: FI
Inventors: Rudolf Hauptmann; Peter Swetly; Adolf Himmler
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 1986-12-10
Filing date: 1987-12-10
Publication date: 1997-10-10
Also published as: ZA879245B; IE60404B1; EP0271824A2; JPS63233794A; FI875427L; AU616873B2; KR880007568A; NO180239B; AU8223387A; PT86332A; ES2058094T3; NO875136D0; ATE91722T1; JPH07258294A; CA1339776C; JPH07250690A; HUT46066A; EP0271824A3; DK645887D0; IL84780A

Description

- 99116

Menetelmä valmistaa hevosen γ-interferonia Käsillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa hevosen γ-interferonia (hevosinterferoni-γ, EqIFN-γ), tätä polypep-5 tidiä koodaavat DNA-sekvenssit, näitä DNA-sekvenssejä sisältävät sopivat vektorit ja isäntäorganismit sekä itse EqIFN-γ. Käsillä olevan keksinnön kohteena ovat edelleen DNA-osasekvenssit, jotka koodaavat polypeptidejä, jotka eroavat rakenteellisesti luonnonmukaisesta EqlFN-γ-polypeptidistä. Kuvauksen koh-10 teenä on myös proteiinien käyttö.

Interferonit ovat proteiineja, joita erittyy eukaroyyttisoluis- ta virusinfektioiden ja muiden ärsytysten jälkeen ja jotka toisaalta voivat suojata soluja virusinfektiolta. Toistaiseksi 15 tunnetaan kolme interferoniluokkaa: näistä käytetään nimityksiä interferoni-a, interferoni-β ja interferoni-γ (lyhennettynä ^ IFN-a, IFN-β ja IFN-γ) . Nämä eroavat toisistaan rakenteeltaan .·. : ja vaikutuksiltaan. Interferonit voivat siten vaikuttaa immuu- • « nijärjestelmän soluja tai myös soluen erikoistumista ja tuumo-/•2 0 rin kasvua säätelevästi.

• · • · • « · . F. Wheelock löysi 965 polypeptidin, joka suojasi määrättyjä soluja virusinfektioilta (Science 149. 310 (1965). Polypeptidejä, .. joilla on nämä ominaisuudet, kutsutaan nimillä imuuni-interfe- •_/25 roni, tyypin II interferoni, interferoni-γ tai IFN-γ, vaikkakin */ ' tällöin on kysymys lymfokineeneihin lukeutuvasta polypeptidi- : luokasta, γ-ihmisinterferonin lisäksi tunnetaan tähän mennessä ·«· « :***: naudan, hiiren ja rotan γ-interferonit. Kaikki tähän mennessä • · · tunnetuksi tulleet γ-interferonit ovat glykolysoidussa muodos- *30 sa, jolloin glykolysoitumisella ei kuitenkaan ole mitään vaiku-• · tusta biologiseen aktiivisuuteen (Keller et ai., J. Biol. Chem. 258. 8010 (1983) .

Interferonien uskottiin kauan vaikuttavan lajispesifisesti. In 35 vitro -kokeet kuitenkin osoittivat, että nautojen IFN-preparaa-tit saattoivat laukaista antiviraalisen vaikutuksen apinoilla - 99116 2 ja ihmisillä (Tovey, M.G. et ai. J. Gen. Virol 3.6, 341-344 (1977)). Tämä lajien välinen aktiivisuus riippuu mahdollisesti geenien tai proteiinien enemmän tai vähemmän suuresta homolo-giasta: tätä olettamusta ei ole voitu todistaa eläinperäisten 5 interferonien vähäisen määrän vuoksi.

Todetusta lajien välisestä aktiivisuudesta huolimatta on vieraan lajin interferoneja käytettäessä otettava huomioon sivuvaikutukset kuten antigeenisyys, jotka hoidon kannalta eivät 10 ole sallittavia.

Koska toisaalta kuitenkin hyötyeläinten ja kotieläinten hoidolla on merkittävä taloudellinen arvo, eri lajeille tarvitaan interferoneja, joita eläinlääkärit voivat käyttää.

15

Eri lajien pitkälle puhdistettu eläininterferoni tarjoaa lisäksi tervetulleen tilaisuuden tutkia interferonien vaikutusmekanismeja ja saada näin malleja, jotka voidaan siirtää ihmisiin.

« · ’•.'•20 Ensimmäiset tutkimukset eläinperäisillä interferoneilla suori-tettiin luonnon solumateriaalista saaduilla preparaateilla; · tällä menetelmällä valmistettujen interferonien saanto ja puh- • '· taus saattavat osoittautua sopimattomaksi lääkeaineiden valmis- : : : tamiseen.

I I

25

Rekombinantti-DNA-tekniikan kehittymisen kautta on mahdollista • .”·. tuottaa mikro-organismeilla heterologisia proteiineja. Näin on . *. valmistettu esimerkiksi myös ihmisinterferoneja (Hu-IFN); viime • · « ·;!/ aikoina myös erilaisia ei-ihmisperäisiä interferoneja.

*•••*30 • · · j Käsillä olevan keksinnön kohteena oli valmistaa geeniteknolo- ':"· gista tietä hevosen γ-interferonia ja tähän tarvittavia DNA-sekvenssejä. 1 li

Huomionarvoista on se, että EqIFN-Y:aa kuten myös kaikkia tähän mennessä tunnetuiksi tulleita γ-interferoneja koodaa kyseisessä 99116 3 organismissa yksi geeni, jossa on suurimmat sekvenssit, jotka katkaisevat rakennegeenin: geenit muodostuvat eksoneista ja introneista, jolloin vain eksonit koodaavat proteiinia. Vain määrätyt systeemit, esimerkiksi systeemit nisäkässoluissa voi-5 vat ymmärtää introneja. Introneja sisältävät DNA-sekvenssejä ei voida käyttää muissa systeemeissä, esimerkiksi E.colissa.

Käsillä olevan keksinnön tavoitteena oli siten valmistaa EqIFN-y:aa koodaava, introneja sisältämätön DNA-sekvenssi.

10

Keksinnön mukainen DNA-molekyyli tunnetaan siitä, että se käsittää hevos-interferoni-y:aa koodaavan sekvenssin:

R1 TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA 15 GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG

CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA

AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC

GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT

: '*· ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT

'.’*20 AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC

CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG

AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT

CAG AAG CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA

• « « 25 tai • · • · ·

R2 GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC

« « ·

AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG

: GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC

• · ·

‘•••*30 CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG

AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA

·:··: GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA

GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT

CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG

35 TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA

TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA

- 99116 4 jolloin R1 on ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC TAT, 5 ATG TAT tai TAT, 10 R2 ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC CAG, 15 ATG CAG tai CAG.

: ·* Tällaisen signaalisekvenssin avulla saadaan määrätyissä isäntä-organismeissa aikaan halutun polypeptidin erittyminen sytoplas-masta. Tällöin proteiini prosessoidaan ja signaalipeptidi loh-·.· kaistaan; saadaan valmis proteiini. "Keskeneräisen" polypepti-j ·.. din eristämiseksi on hajotettava isäntäorganismin, esimerkiksi :Y: E.coli-bakteerin solut, jotka eivät kykene prosessoimaan poly- 25 peptidejä, jotka sisältävät signaalipeptidisekvenssin. Käsillä olevan keksinnön kohteena ovat myös nämä "keskeneräiset" EqIFN-y:t, joissa on täydelliset tai epätäydelliset signaali- \ peptidisekvenssit.

• · · • · · • · · · • · · | · • ••*30 Valmiin EqIFN-y:n saamista varten voidaan aloitusmetioniini • · · : * : erottaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi CNBnlla ·:··: tai CNCl:lla.

Tämä EqIFN-y:aa koodaava DNA-sekvenssi sisältää kuitenkin vain 35 sellaisia kodoneja, joita E.coli käyttää voimakkaasti ekspres-

II

99116 5 soiduissa, soluille ominaisissa geeneissä (Gouy ja Gautier,

Nucl. Acids Res. 1ϋ, 7055 (1982)).

Käsillä olevan keksinnön tavoitteena oli edelleen valmistaa 5 ensi kertaa EqIFN~Y:aa homogeenisessa, puhtaassa muodossa:

Edellä jo mainittiin, että EqIFN-y:n eristäminen ja puhdistaminen luonnonmukaisesta solumateriaalista ei sovi tämän tavoitteen tyydyttävään saavuttamiseen. Keksinnön mukaisesti käyte-10 tään tämän tavoitteen saavuttamiseen siten keksinnön mukaisia DNA-sekvenssejä. Nämä sekvenssit varustetaan vastaavilla kont-rollisekvensseillä, liitetään sopiviin vektoreihin ja viljellään näillä transformoituja sopivia isäntäorganismeja tai isän-täsoluviljelmiä. Muodostuneet polypeptidit eristetään ja puh-15 distetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

Saadut polypeptidit vastaavat seuraavia kaavoja: : '·· 1 5 10 15 : -.:20 Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys ’’· 20 25 30

Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro * 35 40 45 • " Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys • · * · *2 5 50 55 60

Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75

Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr • · · 80 85 90 |30 Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser Γ": 95 100 105 • · »

Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp • · · ; ·’ 110 115 120 ’«·: Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met 35 125 130 135

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser 140 145

Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***

Kaava V

99116 6 tai

Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro 5 Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys

Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr

Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser

Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp 10 Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser

Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***

Kaava Va 15 Kromosomaalista sekvenssiä käytettäessä saadaan nisäkässolujen transformoinnin jälkeen EqIFN-γ luonnossa esiintyvässä, glyko-lysoidussa muodossa (autenttinen EqIFN-γ). Keksinnön mukaiset sekvenssit ovat erityisen sopivia valmistettaessa EqIFN-y:aa : “ mikro-organismeissa, erityisesti valmistettaessa EqIFN-y:aa :. ‘.:20 E.coli-bakteerissa, jolloin polypeptidi ekspressoituu glykoly-soi tumattomassa muodossa.

J '·. Käsillä olevan keksinnön tavoitteena oli edelleen valmistaa s : : luonnon EqlFN-y.n modifikaatioita.

25 j\. Proteiinin modifikaatioita voidaan valmistaa siten, että esi- j*:*. merkiksi joko proteiini derivatisoidaan tai pilkotaan entsyymi- . *. käsittelyllä tai proteiinia koodaava DNA-sekvenssi modifioidaan • · · deletoimalla tai fragmentoimalla ja tämä sekvenssi saatetaan t*“: , ..... .

♦y 30 ekspressoimaan sopivassa isantaorganismissa.

• · · • · · • ·

• I

·:··: Keksinnön mukaisesti syntetisoidaan kemiallisesti EqIFN-y:n modifiointia koodaavat DNA-sekvenssit. Jotta yksittäisten osien muuttamista varten olisi mahdollista manipuloida geeniä yksin-35 kertaisesti, rakennetaan täydelliseen DNA-sekvenssiin useita ainutkertaisia restriktioentsyymien katkaisukohtia.

99116 7

EqIFN-γιη muita modifioituja muotoja voidaan keksinnön mukaisesti saada siten, että erilaisia oligonukleotidejä rakennetaan yksinään tai erilaisina yhdistelminä, joissa on vastaavat kont-rollisekvenssit, sopiviin vektoreihin, viljellään näillä trans-5 formoituja isäntäorganismeja ja eristetään ja puhdistetaan muodostuneet proteiinit.

Asetettujen tavoitteiden saavuttamista varten eristettiin Blinin ja Staffordin modifioidulla menetelmällä (Blin, N.; 10 Staffod, P.W. Nucl. Acids Res. (1976), 2. (2303-2308)) suurimo-lekyylistä DNA:ta hevosen kudoksesta, parhaiten maksasta ja pilkottiin tilastollisesti erityisen endonukleaasien avulla.

Näin saadut eri kokoiset fragmentit fraktioitiin koon perusteella, parhaiten jotta muodostuisi 10 - 23 kb fragmentteja ja 15 jotta voitaisiin kloonata vektoriin, esimerkiksi Lambda-vektoriin, esimerkiksi Lambda EMBL3A-vektoriin. Tämän jälkeen näitä vektoreita kasvatettiin isäntäorganismissa, esimerkiksi E.coli-bakteerissa, transformoinnin jälkeen. Tämä hevos-DNA-kirjasto : " tutkittiin ihmisen "γ-interferoni-koettimen" avulla epästrigen-\'*:20 teissä hybridisointiolosuhteissa. Alhainen stringenttiys mah-,.Y dollistaa sellaisten DNA-sekvenssien löytämisen, joilla on ero-j.j : ja "koettimeen" nähden.

iY: Se voidaan valmistaa joko pilkkomalla kirjallisuudesta tunnet- 25 tujen plasmideja restriktioentsyymien avulla tai syntetisoimal-ϊ*.φ> la kemiallisesti sinänsä tunnetuilla oligonukleotidien syntee-simenetelmillä. Tällä "koettimella" on HuIFN-Y:aa koodaava sek- • · · ·, venssi. Positiivisia hybridisointisignaaleja antavia Lambda- • · · ·*!/ klooneja voitiin tunnistaa viisi.

*•••*3 0

j ·: Näistä eristetyistä rekombinantti-faageista puhdistettiin DNA

·:··· tavanomaisilla menetelmillä. Faagi-DNA:t karakterisoitiin hyb- ridisoimalla "HuIFN-Y-koettimen" kanssa sen jälkeen kun ne oli pilkottu eri restriktioentsyymeillä ja tämän jälkeen analysoitu 35 Southern-menetelmällä (Southern, J.Mol. Biol. 98: 503-517, 1975). Eristettiin yksi Lambda Eq-Y2-kloonin ainutkertaisesti 99116 8 hybridisoituva 4,6 kb pitkä BamHI-fragmentti ja kloonattiin pUC9-plasmidin (Vieira ja Messing, Gene 19: 259-268, 1982)

Bam-Hi-katkaisukohtaa.

5 E.coli-bakteerin, esimerkiksi JMlOl-kannan transformoinnin jälkeen valmistettiin saaduista pesäkkeistä plasmidi-DNA:ta mini-valmistusmenetelmällä (Birnboim ja Doly, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1423, 1979) ja karakterisoitiin pilkkomalla restriktioent-syymeillä. Plasmidille, jossa on haluttu BamHI-insertti, annet-10 tiin nimeksi pAHlll. M13mp8- tai M13mp9-vektoreihin (Vieira ja Messing, Gene 19, 259-268, 1982) viemisen jälkeen sekvenssoi-tiin pAHlll-plasmidin BamHI-insertin päätä Didesoxy-meneteläml-lä (Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977). Sekvenssien vertaaminen ihmisen γ-interferoni-geenin 15 kanssa (Gray ja Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) osoitti homologien olevan suuren ei-koodaavien 5'- ja 3'-alueiden kanssa. Tästä voitiin päätellä, että oli eristetty täydellinen EqIFN-Y-geeni.

:.*·:20 Plasmidin pAHlll 4,6 kb pitkä BamHI-insertti sekvensoitiin täy- dellisesti Didesoxy-menetelmällä. BamHI-fragmentin koko sek- ·,· · venssi saatiin yhdistämällä M13-alikloonien osasekvenssejä, I ·· jotka oli saatu kloonaamalla restriktiofragmentit (EcoRI, i:.· Hindlll, PstI, Pstl-Bglll, HindiII-BamHI) suunnatulla tavalla 25 vastaavasti katkaistuihin M13mp8- tai M13mp9-vektoreihin.

Osasekvenssejä saatiin lisää siten, että 2,0 kb pitkä BamHI- BGlII-fragmentti tai 2,0 kb pitkä Pstl-fragmentti kloonattiin . *. Mml3mp8-vektoriin "haulikkomenetelmällä". Saadut osasekvenssit • » · •*|/ yhdistettiin tietokoneohjelman avulla 4664 bp pitkäksi koko-| · •••*30 naissekvenssiksi, joka on esitetty kuviossa 1.

• · · • · · « · ψ · ·:·; Hevosen γ-interferonigeenin proteiinia koodaava alue saatiin analysoimalla avoin lukukehys tietokoneen avulla ja vertaamalla muiden lajien γ-interferonigeeneihin (Gray ja Goeddel, Nature 35 298: 859-863; Gray ja Goeddel, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et ai., EMBO J. 4: 761-767, 1985; 99116 9

Cerretti et ai., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986). Proteiinia koodaavan alueen katkaisee kolme intronia, jolloin ensimmäisessä eksonissa on koodattu 20 aminohappoa pitkä, hydrofobinen signaalipeptidi ja valmiin EqlFN-y-polypeptidin 18 amino-5 happoa (emäkset 366-479). Toinen eksoni koodaa aminohappoja 19-41 (emäkset 1639-1707), kolmas eksoni koodaa aminohappoja 42-102 (emäkset 1803-1985), neljäs eksoni koodaa karboksi-pää-tä, jossa on aminohapot 103-146 (emäkset 3307-3441). mRNArn polyadenylaation kaksi signaalisekvenssiä (AATAAA) ovat asemis-10 sa 4010 ja 4020. Valmiin EqlFN-γ-polypeptidin asemissa 86-88 on ainut mahdollinen N-glykolysoitumiskohta (Asn-Ser-Ser), joka osuu yhteen naudan γ-interferonin toisen N-glykolysoitumiskoh-dan (Asn-Gly-Ser) kanssa (kuvio 2). Valmis EqlFN-γ-polypeptidi sisältää yllättäen vain yhden ainoan kysteiiniryhmän asemassa 15 3, jolloin luonnonmukaisten ihmisen ja hiiren γ-interferonien kanssa analogisesti ensimmäiset kolme amino-terminaalista aminohappo (tässä tapauksessa Tyr-Tyr-Cyr) todennäköisesti lohkeavat kehossa proteolyyttisesti.

*:20 Jotta rekombinantti EqIFN-γ voisi ekspressoitua valmiissa muo-dossaan Excherichia coli -bakteerissa, rakennettiin oligonukle-:.·· otideista synteettinen geeni. Se koodaa samaa aminohapposek-| venssiä kuin luonnon EqlFN-y-geeni, mutta sisältää kuitenkin i :: ainoastaan sellaisia yksittäisten aminohappojen kodoneja, joita 25 käytetään E.colin runsaasti ekspressoimissa, solujen omissa geeneissä (Gouy ja Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055-7074, 1982) . Lisäksi rakennettiin mukaan useita ainutkertaisia rest- • · · . riktioentsyymien katkaisukohtia, jotka mahdollistavat geenin • m · ♦ · · ***.' yksinkertaisen manipuloinnin yksittäisten osien muuttamista i ··· 30 varten. Synteettinen geeni EqIFN-y:aa varten rakennettiin kah-·· · • tena muunnelmana yhteensä 16:ta erilaisesta oligonukleotidista.

Ensimmäinen muunnos koodaa valmista EqIFN-y:aa, jossa on 146 aminohappoa ja aloitusmetioniini, toinen muoto koodaa amino-päässä kolmen aminohapon verran (Tyr-Tyr-Cys) lyhennettyä poly-35 peptidiä ja aloitusmetioniinia muodossa, jossa se luultavasti luonnon organismissa esiintyisi.

99116 10

Synteettisen EqlFN-γ-geenin rakenne on esitetty kuviossa 3. Valmistamiseen käytetyt oligonukleotidit syntetisoitiin Applied Biosystems Model 381A DNA-syntetisointilaitteen avulla ja puhdistaminen ja suolojen poisto suoritettiin elektroforeesin 5 avulla. Kuviossa 3 esitetyllä oligonukleotideilla on seuraavat rakenteet:

EG-1 5'-TACTACTGCC AGGCTGCTTT CTTTAAAGAA ATCGAAAACC TGAAAGAATA

CTTCAACGCT CG-3'

10 EG-2 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTGGCA

GTAGTA-3'

EG-3 5'-TAACCCAGAC GTTGGTGACG GTGGTCCGCT GTTCCTGGAC ATCCTGAAAA

ACTGGAAAGA AGACTCTG-3'

EG-4 5'-TTCTTTCCAG TTTTTCAGGA TGTCCAGGAA CAGCGGACCA CCGTCACCAA

15 CGTCTGGGTT ACGAGCG-3'

EG-5 5'-ACAAAAAGAT CATCCAGTCT CAGATCGTTT CTTTCTACTT CAAACTGTTC

GAAAACCTGA AAGACAACC-3'

EG-6 5'-TTTCAGGTTT TCGAACAGTT TGAAGTAGAA AGAAACGATC TGAGACTGGA

: " TGATCTTTTT GTCAGAGTC-3'

*.*'.’20 EG-7 5 ' -AGGTTATCCA GAAATCGATG GACACTATCA AAGAAGATCT GTTCGTTAAA

..'!' TTCTTCAACT CG-3'

: EG-8 51-TCGACGAGTT GAAGAATTTA ACGAACAGAT CTTCTTTGAT AGTGTCCATC

! *.. GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTC-3 '

j’:*: EG-9 5 '-TCGACTTCTA AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATCCAGA TCCCAGTTAA

25 CGACCTGAAA-3'

·*·.. EG-10 5 '-GCTGAACTTT CAGGTCGTTA ACTGGGATCT GGATCAGTTT CTGGAAGTCT

TCCAGTTTAG AAG-3 ' • · ·

EG-11 5'-GTTCAGCGTA AGGCTATCTC TGAACTGATC AAAGTTATGA ACGACCTGTC

• « · : TCCAAAAGCT AA-3 ' • · ·

*••*30 EG-12 5 ' -CGCAGGTTAG CTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA TCAGTTCAGA

:’·’: GATAGCCTTA C-3' • ·

*:*·: EG-13 5 ' -CCTGCGTAAA CGTAAACGTT CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC

TTCAGTAAG-3'

EG-14 5'-GATCCTTACT GAAGAGCACG ACGACCACGG AATGGGTTCT GAGAACGTTT

35 ACGTTTA-3'

II

99116 11 EG-15 5'-CAGGCTGCTT TCTTTAAAGA AATCGAAAAC CTGAAAGAAT ACTTCAACGC TCG-3' EG-16 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTG-3' 5 Synteettisen EqlFN-y-geenin kokoaminen tapahtui kahtena palana. Geenin ensimmäinen osa valmistettiin kahdeksan oligonukleotidin EG-1 - EG-8 avulla sall-katkaisukohtaan asti ja geenin toinen puolisko valmistettiin kuudesta oligonukleotidista EG-9 - EG-14 Sall-katkaisukohdasta BamHI-katkaisukohtaan asti. Rakennettaes-10 sa EqIFN-y:an muoto, joka oli lyhennetty aminopäässä kolmen aminohapon verran, käytettiin oligonukleotidien EG-l ja EG-2 asemesta oligonukleotideja EG-15 ja EG-16.

Keksinnön kohteena eivät ole ainoastaan geeni-sekvenssit, jotka 15 koodaavat spesifisesti keksinnön mukaisia interferoneja, vaan myös modifikaatiot, jotka voidaan saada helposti ja rutiininomaisesti mutatoimalla, hajottamalla, transposoimalla tai addition avulla. Keksintö kattaa myös jokaisen sekvenssin, joka : " koodaa keksinnön mukaisia interferoneja {so. jolla on tässä *. *:20 yhteydessä kuvattu biologinen aktiivisuusspektri) ja joka on annettuihin sekvensseihin verrattuna degeneroitu; alan ammatti-:.· · ihmiset kykenevät degeneroimaan koodaavien alueiden DNA-sek- • '·· venssejä. Keksintöön sisältyy myös jokainen sekvenssi, joka » koodaa polypeptidiä, jolla on keksinnön mukaisten interferonien 25 aktiivisuusspektri ja joka hybridisoituu annettujen sekvenssien (tai niiden osien) kanssa tringenteissä olosuhteissa (esim.

·*·*· olosuhteissa, jotka selektoivat yli 85% :n, mieluummin yli 90% :n . *. homologian) .

• · i *·· · • · · t : *;· 30 Hybridisoinnit suoritetaan 6xSSC/5x Denhardtin liuos/0,1% SDS- • · · • \·* seoksessa 65°C:ssa. Stringenttiysaste määrätään pesuvaiheessa.

DNA-sekvenssien, joiden homologia on noin 85% tai enemmän, se-lektoimiseen sopivat olosuhteet ovat siten 0,2xSSC/0,01% SDS/65°C ja DNA-sekvenssien, joiden homologia on noin 90% tai 35 enemmän, selektoimiseen sopivat olosuhteet ovat 0,lxSSC/0,01% SDS/65°C.

99116 12

Keksinnön mukaisia interferoni-geenejä voidaan laittaa jokaiseen organismiin olosuhteissa, joissa saadaan korkeita saantoja. Sopivat isännät ja vektorit ovat alan ammattimiehen parhaiten tuntemia; esimerkkien suhteen viitattakoon patenttijulkai-5 suun EP-A-0.093.619.

Ekspressointiin käytetään parhaiten prokaryootteja, esimerkiksi E.coli K 12 kantaa 294 (ATCC No. 31 446) tai E.coli X1776 kantaa (ATCC No. 31.537). Edellä mainittujen kantojen kaltaisesti 10 voidaan käyttää myös E.coli W 3110 (F-, Lambda-, prototroofi, ATCC No. 27325) kantaa, basilleja kuten Bacillus subtilis -bakteeria ja muita Enterobacteriaceae-bakteereita kuten Salmonella typhimurium tai Sarratia marcescens -bakteereita ja erilaisia pseudomonades-bakteereita.

15 Näiden isäntien kanssa voidaan yleisesti sanoen käyttää plas-midi-vektoreita, jotka sisältävät isäntäsolujen kanssa yhteensopivista lajeista peräisin olevia kontrollisekvenssejä. Vekto-’· " rissa on tavallisesti replikaatiokohdan lisäksi tunnistamisse-:.*·:20 kvenssjä, jotka mahdollistavat transformoitujen solujen selek-toinnin fenotyypin perusteella. Esimerkiksi E.coli transformoi-·,· · daan tavallisesti pBR322:lla, so. E.coli-lajeista peräisin ole-i valla plasmidilla (Bolivar, et ai., Gene 2., 95 (1977)). pBR322 jV: sisältää geenin ampisilliini- ja tetrasykliiniresistenttiydel- 25 le, mikä antaa mahdollisuuden identifioida transformoidut so-lut. pBR322-plasmidin tai myös muiden plasmidien on lisäksi sisällettävä promoottoreita tai ne on varustettava promootto- , *. reillä, joita mikrobiorganismi voi käyttää omien proteiiniensa * * * **j#* ekspressointiin. Rekombinantti-DNA:n valmistamisessa useimmiten | · ♦♦·* 30 käytettyihin promoottoreihin kuuluvat β-laktamaasti- (penisil-j·: Iinaasi) ja laktoosipromoottori-systeemit (Chang et ai., Nature :··· 275. 615 (1978); Itakura et ai., Science 198. 1 + 056 (1977);

Goeddel et ai., Nature 281. 544 (1979)) ja tryptofaani(trp)-promoottorisysteemit (Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. &, 35 4057 (1980); EP-A-0.036.776). Näiden erityisen käyttökelpoisten promoottorien lisäksi on myös kehitetty ja käytetty muita mik- 99116 13 robipromoottoreita. Keksinnön mukaisten interferonien geenisekvenssi voidaan laittaa esimerkiksi bakteerifaagin Lambda (PL)

Leftward-promoottorin kontrollin alaiseksi. Tämä promoottori on erityisen tehokas, ohjattavissa oleva promoottori. Ohjauksen 5 mahdollistaa Lambda-repressori, josta tunnetaan vierekkäiset restriktiokatkaisukohdat. Tämän repressori-geenin lämpötila-herkkä alleeli voidaan liittää vektoriin, joka sisältää EqlFN-γ-sekvenssin. Jos lämpötila kohotetaan 42°C:een, repressori inaktivoituu ja promoottori aktivoituu. Tätä systeemiä käyttä-10 mällä on mahdollista muodostaa kloonipankki, jossa funktionaalinen IFN-sekvenssi sijaitsee ribosomin sitoutumiskohdan läheisyydellä eri etäisyyksillä Lambda-PL-promoottorista. Nämä kloonit voidaan tämän jälkeen tutkia ja selektoida niistä korkeimman saannon omaavat.

15

Keksinnön mukaisia proteiineja koodaavan sekvenssin ekspressio ja translaatio voi myös tapahtua muiden säätelysysteemien kontrollin alaisena, joita voidaan pitää "homologisina" organismin • " kanssa sen transformoimattomassa muodossa. Siten sisältää esi-:.'i20 merkiksi laktoosista riippuvan E.colin kromosomaalinen DNA ..'I' laktoosi- tai lak-operonin, joka mahdollistaa laktoosin hajot-·,; · tamisen erittämällä β-galaktositaasi-entsyymiä.

i‘\.

I · i : : Lak-kontrollielementit voidaan saada myös bakteerifaagista 25 Lambda-plac5, joka infektoi E.coli-bakteeria. Faagin lak-opero- ·*·.. ni voidaan saada transduktoimalla samoista bakteerilajeista.

* · · • · · 4 4 · * . *. Säätelysysteemejä, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisessa • « · **j/ menetelmässä, voidaan myös saada plasmidi-DNA:sta, joka on or-| · ·;·* 30 ganismille ominainen. Lak-promoottori-operaattori-systeemi voi-I*: daan indusoida IPTG:lla.

f »

Yhtä hyvin voidaan käyttää muitakin promoottori-operaattori-systeemejä tai niiden osia: esimerkiksi arabinoosi-operaattori, 35 kolisiini E1-operaattori, galaktoosi-operaattori, alkalinen 99116 14 fosfataasi-operaattori, trp-operaattori, ksyloosi-A-operaatto-ri, tae-promoottori jne.

Prokaryoottien lisäksi voidaan käyttää myös eukaryoottisia 5 mikro-organismeja kuten hiivaviljelmiä. Saccharomyces cere-visiae on eukaryoottisista mikro-organismeista yleisimmin käytetty, vaikkakin saatavissa on joukko muitakin lajeja. Saccharomyces-hiivassa ekspressointiin käytetään esimerkiksi plasmidia YRp7 (Stinchcomb et ai. Natur 282. 39 (1979); Kings-10 man et ai., Gene 7., 141 (1979); Tschumper et ai., Gene 3J), 157 (1980)) ja plasmidia YEpl3 (Bwach et ai., Gene 8., 121-133 (1979)) . Plasmidi YRp7 sisältää TRP1-geenin, joka tekee mahdolliseksi leimata selektointia varten hiivamutantin, joka ei kykene kasvamaan tryptofaanittomassa alustassa, esimerkiksi ATCC 15 No. 44076.

TRPl-vaurion läsnäoloa hiivaisännän genomin tunnusmerkkinä voidaan tällöin käyttää tehokkaana apukeinona transformaation • » ί " osoittamisessa, kun viljellään ilman tryptofaania. Aivan vas-* · V’j20 taavalla tavalla käyttäytyy plasmidi YEpl3, joka sisältää hii- vageenin LEU 2, jota voidaan käyttää LEU-2-miinus-mutantin täy- ·.· dentämiseen. Hiivavektoreille sopiviin promoottori-sekvenssei- • «

| hin kuuluvat seuraavien geenien 5' -viereinen alue: ADH I

(Ammere G., Methods of Enzymology 101. 192-201 (1983)) .

« « 25 3-fosfoglyseraatti-kinaasi (Hitzeman et ai., J. BIol. Chem.

255 r 2073 (1980) ) ja muut glyolyyttiset entsyymit (Kawasaki ja .Fraenkel, BBRC 108. 1107-1112 (1982)) kuten enolaasi, glyse- * * ψ riinialdehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasi, heksokinaasi, pyru- i · *··* 30 vaatti-dekarboksylaasi, fosfofruktokinaasi, glukoosi-6-fos-faatti-isomeraasi, fosfoglukoosi-isomeraasi ja glukokinaasi. Sopivien ekspressioplasmidien rakentamisessa voidaan käyttää näihin geeneihin liittyviä terminaatiosekvenssejä myös ekspres-siovektorissa ekspressoitavan sekvenssin 31-päässä mahdollista-35 maan mRNA:n polyadenylaatio ja terminaation.

- 99116 15

Muita promoottoreita, joilla lisäksi on etuna kasvuolosuhteiden kontrolloima transkriptio, ovat seuraavien geenien promoottorialueet: alkoholi-dehydrogenaasi-2-, isosytokromi C, hapan fos-fataasi, hajottavat entsyymit, jotka ovat kytkeytyneet typpi-5 metaboliaan, edellä mainittu glyseriinialdehydi-3-fosfaatti-dehydrogenaasi ja entsyymit, jotka vastaavat maltoosin ja ga-laktoosin käytöstä. Lämpötilaltaan säädellyissä systeemeissä voidaan käyttämällä lämpötilasta riippuvia sir mutaatioita käyttää promoottoreita, joita säätelevät hiivan Mating-tyyppi-10 nen locus, esimerkiksi geenien BARI, MFal. STE2. STE3. STE5.

promoottoreita, (Rhine Ph.D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz ja Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. part I, 181-209 (1981) . Gold Spring Harbor Laboratory). Nämä mutaatiot vaikuttavat hiivojen 15 lepäävien Mating-tyyppisten kasettien ekspressioon ja siten epäsuorasti Mating-tyypistä riippuviin promoottoreihin. Yleisesti sopii kuitenkin jokainen plasmidivektori, joka sisältää hiivan kanssa yhteen sopivan promoottorin, originääriset \ ' '* replikaatio- ja terminaatiosekvenssit.

· 20 „7 Mikro-organismien lisäksi sopivia isäntäorganismeja ovat myös ;,: · monisoluisten organismien viljelmät. Periaatteessa voidaan I käyttää jokaista tällaista viljelmää riippumatta onko se selkä- ; rankaisen tai selkärangattoman eläimen viljelmästä. Suurin mie- 25 lenkiinto kohdistuu kuitenkin selkärankaisten soluihin, ja si- ·*·,, ten selkärankaisten solujen kasvattaminen viljelmässä (kudos- viljelmä) on viime vuosina johtanut rutiinimaiseen menetelmään , (Tissue Culture, Academic Press, Kruse ja Patterson, toim.

« « · ·“/ (1973)). Tällaisista hyödyllisistä isäntäsolulinjoista ovat S · *;·' 30 esimerkkejä VERO- ja HeLa-solut, CHO-solut ja WI38, BHK, COS-7 • · · ' *#i ja MDCK-solulinjat. Näille soluille tarkoitetut ekspressiovek-torit sisältävät tavallisesti (tarvittaessa) replikaation aloituskohdan, promoottorin, joka sijaitsee ekspressoitavan geenin edellä yhdessä kaikkien tarvittavien ribosomien sitoutumiskoh-35 tien kanssa. RNA-katkaisukohdat, polyadenylaatiokohdat ja transkriptionaaliset terminaatiosekvenssit.

99116 16

Nisäkässoluissa käytettäessä ovat ekspressiovektoreiden kontrollifunktiot useimmiten peräisin virusmateriaalista. Tavallisesti käytetyt promoottorit ovat esimerkiksi peräisin Polyoma 5 Adenovirus 2:sta ja erityisen usein SV 40 -viruksesta (Simian Virus 40). SV 40 -viruksen varhaiset ja myöhäiset päätepromoot-torit ovat erityisen hyödyllisiä, koska kummatkin on helposti saatavissa viruksesta fragmenttina, joka sisältää vielä myös SV 40 -viruksen viraalisen replikaatiokohdan. (Fiers et ai., 10 Nature 273. 113 (1978)). Myös SV 40 -viruksen pienempiä tai suurempia fragmentteja voidaan käyttää, edellyttäen, että ne sisältävät lähes 250 bp pitkän sekvenssin, joka ulottuu HindiII-katkaisukohdasta viraalisen replikaation aloituskohdan Bgll-katkaisukohtaan asti. Lisäksi on myös mahdollista ja usein 15 suositeltavaa käyttää promoottori- tai kontrolli-sekvenssejä, jotka ovat normaalisti liittyneet haluttuihin geenisekvenssei-hin, edellyttäen että nämä kontrollisekvenssit sopivat yhteen isäntäsolusysteemien kanssa.

.”•.20 Replikaation aloituskohta voi olla joko varustettu vastaavalla vektorirakenteella jotta voitaisiin rakentaa mukaan eksogeeni- • « ·'· nen aloituskohta, esimerkiksi SV 40 -viruksesta tai muista vi- . ruslähteistä (esim. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, jne.) tai sen voi

• « « I

;·. antaa isäntäsolujen kromosomaalinen replikaatiomekanismi. Jos ,v25 vektori integroidaan isäntäsolun kromosomiin, viimeksi mainittu • · · toimenpide on useimmiten riittävä.

• · • · • ««

Parhaiten voidaan keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit ekspressoi- ♦ » · • · · *. da myös ekspressioplasmidissa pER103 (E. Rastl-Dworkin et ai., :.: :30 Gene 21, 237-248 (1983) ja EP-A-0.115.613 - tallennettu DMS- kokoelmaan numerolle DSM 2773 20.12.1983) plasmidissa parpER33 :v. (EP-A-0.115.613) tai plasmidissa pRHIOO, sillä nämä vektorit • · . <<<; sisältävät kaikki säätelyelementit, jotka saavat aikaan kloona tun geenin korkean ekspressoitumisasteen. Keksinnön mukaisesti 35 käytetään synteettisen EqlFN-y-geenin ekspresiovektorina plas-midia pRHIOO, joka sisältää säädeltävän tryptofaanipromoottorin

II

99116 17

Serratia marcescens -bakteerista ja keinotekoisen ribosomien sitoutumiskohdan. Ekspressioplasmidin pRHIOO valmistamista varten linearisoitiin plasmidi pER103 (Eva Dworkin-Rastl et ai.,

Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115.613) restriktioendonukleaa-5 silla Hindlll ja 51-terminaaliset fosfaattiryhmät poistettiin.

Tämä plasmidi-DNA sekoitettiin ja ligitoitiin fosforyloitu-jen oligonukleotidien d(AGCTTAAAGATGAGCT) ja d(CATCTTTA) kanssa. Ligaasireaktio suoritettiin pilkkomalla restriktioendonuk-10 leaasilla Sacl ja ligatoitiin lisäämällä T4-PNK:ia. Oligonuk-leotidit valmistettiin analogisesti patenttijulkaisussa EP-A- 0.115.613 kuvatun menetelmän kanssa. Tämän ligaasireaktion tuote lisättiin kompetentteihin E.coli HBlOl-soluihin ja inkuboi-tiin. Muodostuneista bakteeripesäkkeistä valittiin mielivaltai-15 sesti 12 ja näistä eristettiin plasmidit mikromitassa (Birnboim ja Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). Saatu DNA pilkottiin restriktioendonukleaasilla Sacl ja DNA erotettiin aga-roosigeelillä (1%, lx TBE-puskuri). DNA:n kulkeutuminen lineaarisena, noin 4400 bp suuruisena molekyylinä vahvasti Sacl-tun-."'.20 nistamiskohdan liittymisen plasmidiin. Yksi tällainen plasmidi valittiin mielivaltaisesti. E.coli HB101 transformoitiin vielä

I

kerran DNA: 11a, joka oli saatu tähän kuuluvasta minivalmistees- . .·. ta. Saaduista transformoiduista bakteereista valittiin yksi • « « · .··. pesäke ja tätä kasvatettiin suuremmassa mitassa. Tästä eristet- ,·.·25 ty plasmidi pilkottiin restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja

* · I

BamHI, DNA erotettiin 1-prosenttisella agaroosigeelillä ja pie- .. nempi fragmentti eristettiin geelistä elektroeluoimalla. Tämä • * « noin 460 bp pitkä EcoRI-BamHI-DNA-fragmentti sekvensoitiin • » » • 4 * *, Sangerin menetelmällä (F. Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

• · ;30 (1977) 5463-5467) . Tällä tavoin analysoidulle plasmidille an- nettiin nimeksi pRHIOO.

4 « I

« ,

Plasmidi pilkottiin Sacl-entsyymillä ja ylipitkät DNA-päät tasoitettiin käsittelemällä Klenowin fragmentilla (Amersham)

35 kaikkien neljän dosoksinukleotiditrifosfaatin läsnäollessa. Reaktio pysäytettiin uuttamalla fenoli/kloroformilla ja DNA

99116 18 väkevöitiin seostamalla etanolilla. Tämä käsittely tekee tryp-tofaanin promoottoriin liittyneenä tylpän DNA-pään, joka päättyy translaation aloituskodoniin "ATG". Tämän jälkeen pilkotaan linearisoitu plasmidi-DNA BamHI-.lla ja eristetään vektoriosa.

5 Näin esivalmisteltu pRHIOO plasmidi-vektori sekoitetaan liga-toitujen oligonukleotidien EG-1 - EG-8 ja EG-9 - EG-14 kanssa ja inkuboidaan ligatointipuskurissa T4 DNA-ligaasin kanssa. Kompetentiksi tehty E.coli, parhaiten JM101, transformoidaan 10 tällä ligatointiseoksella ja inkuboidaan yön yli. Saaduista transformanteista eristetään minipreparointimenetelmällä plasmidi-DNA ja rakenne selvitetään restriktioanalysoimalla ja sekvensoimalla Hindlll-BamHI-insertti. Plasmidille, jolla on haluttu rakenne valmiin EqIFN-y:n ekspressointia varten, anne-15 taan nimeksi pEqG-YYCl. Täysin analogisella tavalla kloonataan pRHIOO-vektorin oligonukleotidit EG-15,16 EG-3 - EG-8 ja EG-9 - EG-14 jotta saataisiin kolmen aminohapon verran lyhennetty EqIFN-γ. Plasmidille, jolla on haluttu rakenne, annetaan nimeksi pEqG-QAAl.

.**’.20

Solut voidaan transformoida vehikkeleillä lukuisilla menetel-·'· millä. Se voi tapahtua esimerkiksi kalsiumilla, jolloin joko ; solut pestään magnesiumissa ja DNA lisätään kalsiumiin suspen- doituihin soluihin tai solut saatetaan alttiiksi DNA:n ja kai- ,v£5 siumfosfaatin ko-sakalle. Seuraavassa geeniekspressiossa siir-• « « retään solut alustoille, jotka selektoivat transformoidut so- .. lut.

• « • »· « * · · • » ( « * « \ Jotta voitaisiin osoittaa E.coli JM101 solujen, jotka sisältä- » · ;30 vät plasmidin pEqG-YYCl tai pEqG-QAAl, ekspressoima interfero- • « · niaktiivisuus, bakteerit laitetaan inkuboinnin jälkeen sopivaan vil jelyalustaan ja supernatant is ta määritetään steriilisuoda- • 4 tuksen jälkeen interferoniaktiivisuus menetelmässä, joka mittaa VSV:n tai EMCV:n sytopaattisen vaikutuksen (CPE). Tähän käyte-35 tään NBL-6 soluja (ATCC CCL 57, hevosennahan epidermisoluja), jotka oli infektoitu VSV:lla (Vesicular-Stomatitis-virus), 99116 19 ja/tai A549-soluja (ATCC CLL185, ihmisen keuhkokarsinooma-solu-linja), jotka oli infektoitu EMCM:lla (Encaphalomyocarditis Virus) .

5 Ekspressoidut hevosinterferonit osoitetaan leimaamalla proteiinit maksisoluissa. Plasmidikoodatut proteiinit voidaan leimata selektiivisesti in vivo käyttämällä maksisolutekniikkaa (Sancar, A. Et ai., J. Bacteriol, 137. 692-693 (1979). E.coli CSR603 kannalla (CGSC 5830) ei ole mitään mekanismeja, joilla 10 korjata UV-säteilyn aiheuttamat DNA-vauriot. Säteilyttäminen sopivalla UV-säteilyannoksella tuhoaa bakteerikromosin, kun taas sitä vastoin oleellisesti pienemmät ja useampina kopioina solua kohti läsnäolevat plasmidi-DAN:t jäävät toimintakykyisiksi. Sen jälkeen kun kaikki vaurioitumattomat, lisääntyvät solut 15 on tapettu D-sykloseriini-antibiootilla ja endogeeninen mRNA on hajotettu, transkriptoidaan ja translatoidaan jäljelle jääneissä soluissa vain yhä plasmidissa koodatut geenit. Muodostuneet proteiinit voidaan leimata radioaktiivisesti ja osoittaa liittämällä mukaan 35S-metioniinia. E.coli CSR603 transformoidaan .**•.20 tavanomaisilla menetelmillä ekspressioplasmideilla ja transfor-moidut bakteerit selektoidaan ambisilliinipitoisella agar-mal-<·· joilla. Maksisolujen valmistaminen ja proteiininen leimaaminen . tapahtuu A. Sancarin ohjeiden mukaisesti. Molekyylipainon stan- * * » « dardina käytetään 14C-metyloitua proteiiniseosta (Amersham). ,•.*.25 Kontrolleina käytetään pER103-plasmidia, joka sisältää vain h « · promoottorin ilman interferonigeeniä, ja pER2l/l-plasmidia, .. joka sisältää kaksi kopiota humaania IFN-a2arg-geeniä.

• · · • · · • · · • 4 « *, Tunnetut biologiset ja immunologiset määritykset sopivat kek- • · ;.:;3 0 sinnön mukaisten tuotteiden karakterisoimiseen. Koska sekä a-, • · · β- että γ-interferoneille on ominaista PFU- ja CPE-määritykses-sä osoitettavissa oleva antiviraalinen ominaisuus, keksinnön mukaisen EqIFN-y:n erottamiseen a-EqIFN:sta ja/tai β-EqIFN-.sta käytetään hyödyksi interferonin erilaista antigeenisyyttä.

35 99116 20

EqIFN-ocn ja/tai EqIFN-£:n vastaiset antiseerumit eivät neutraloi keksinnön mukaisia polypeptidejä. Toiseksi erotuskriteerik-si sopii keksinnön mukaisten polypeptidien happolabiilisuus sekä herkkyys natriumdodekyylisulfaatille (SDS). Sekä inkuboin-5 ti 0,2%:sen SDS-liuoksen kanssa että polypeptidien inkubointi pH-arvolla 2 muutaman tunnin ajan 4°C:ssa tuhoaa virusten vastaisen aktiivisuuden lähes täydellisesti. EqIFN-α ja EqIFN-β ovat samoissa olosuhteissa stabiileja.

10 Hevosgenomin sekvenssien, joilla on korkea homologia interfe-ronigeenin kanssa, kokonaisluvun osoittamista varten pilkotaan suurimolekyylinen hevos-DNA täydellisesti vastaavilla restrik-tioentsyymeillä ja nämä pilkotut DNA:t erotetaan koon perusteella. Nitroselluloosasuodattimille suoritetun Southern-siir-15 ron, denaturoinnin ja DNA:n kiinnittämisen jälkeen jokainen suodatin hybridisoidaan nik-translatoimattomien koettimien kanssa. Koettimena EqIFN-y:lle käytetään plasmidista pEqG-YYCl saatua fragmenttia, joka sisältää koodaavan sekvenssin koko valmiille interferonille. Tämän jälkeen suodattimet pestään . *.20 stringenteissä olosuhteissa. Autoradiografia tapahtuu DuPont

Cronex röntgenfilmillä käyttämällä Kodak Lanex-Regular vahvis-·:· tuskalvoja 7 päivää -80°C:ssa.

• * « · ;·. Isännän suoritetun transformoinnin, geenin ekspression ja solu- •.*.25 jen viljelyn olosuhteissa, joissa keksinnön mukainen proteiini • « · ekspressoituu, jälkeen voidaan tuote erottaa tavalliseen tapaan tunnetuilla kromatografisilla erotusmenetelmillä, jolloin saa- • i « daan materiaalia, joka sisältää proteiineja, joissa on tai ei • « · • « * *. ole Leader- ja Tailing-sekvenssit. Keksinnön mukaiset interfe- • · :.·;30 ronit voidaan ekspressoida niin, että N-päässä on Leader-sek-venssi (Pre-IFN) , joka interferonit eräät isäntäsolut voivat :*.·. poistaa. Jos näin ei ole, Leader-polypeptidi (kun se on läsnä) on siten, lohkaistava pois jotta saataisiin valmista interferonia. IFN-klooni voidaan vaihtoehtoisesti modifioida niin, että 35 valmis proteiini muodostuu mikro-organismissa suoraan Pre-IFN:n asemesta. Tätä tapausta varten voidaan käyttää hiivan Mating- li 21 - 99116 feroraonin prekursori-sekvenssiä MF-α-Ι jotta taattaisiin fuusioidun proteiinin oikea "kypsyys" ja tuotteiden erottuminen kasvatusalustaan tai periplasmiseen tilaan. Funktionaalisen tai valmiin IFN:n DNA-sekvenssi voi olla liitetty MF-a-l:n kans-5 sa oletettuun katepsiinimäiseen katkaisukohtaan (Lys-Arg:in jälkeen) asemaan 256 aloituskodonista ATG lähtien (Kurjan, Herskowitz, Cell IQ., 933-943 (1982) .

Seuraavassa yleiskaaviossa on kuvattu menetelmä, jolla EqlFN-y 10 voidaan puhdistaa esimerkiksi bakteereista.

1. Solut uutetaan johtokyvyltään suuressa lyysauspuskurissa (noin pH 8) johtamalla homogenisaattorin läpi korkeassa paineessa; poistovirta jäähdytetään jäähauteessa.

15 2. DNA saostetaan lisäämällä polyetyleeni-iminiä samalla sekoittaen, esimerkiksi 4°C:ssa.

3. Bakteeriproteiinit saostetaan pH:n avulla, jolloin EqIFN-γ : *.20 jää jälleen liuokseen.

•:· 4. Kiintoaines erotetaan sentrifugoimalla 4°C:ssa.

• · · 5. Supernatantti väkevöidään (pH-arvon uudelleen säädön jäl- ,*.*.25 keen) esimerkiksi ultrasuodattamalla.

* · · • · 6. Konsentraatti dialysoidaan johtokyvyltään alhaista puskuria « · · ... vasten.

♦ · · • · ;30 7. Kiintoaines erotetaan sentrifugoimalla, jolloin EqIFN-γ jää • · · ‘..,ί liuokseen.

« · 8. Ioninvaihtokromatografoidaan karboksymetyyliselluloosalla eluoimalla gradientilla, jonka ionivahvuus kasvaa.

35 22 - 99116 9. Kromatografoidaan kalsiumfosfaatti-geelillä ja eluoidaan gradientilla, jonka ionivahvuus kasvaa.

10. Ioninvaihtokromatografoidaan karboksimetyyliselluloosalla 5 heikosti denaturoivissa olosuhteissa ja eluoidaan gradientilla, jonka ionivahvuus kasvaa.

11. Erotetaan geelisuodatuskromatografiän avulla.

10 Mainitulla menetelmällä on mahdollista päästä puhtaudeltaan yli 95%:n materiaalisaantoihin.

Tässä kohdassa mainittakoon, että keksinnön mukaisissa interferoneissa ei ole kysymys vain interferoneista, jotka on kuvattu 15 yksitellen, vaan myös näiden polypeptidien jokaisesta modifikaatiosta, joka ei oleellisesti muuta hevos-γ-IFN-aktiivisuut-ta. Näihin modifikaatioihin sisältyvät esimerkiksi molekyylin lyhentäminen, esimerkiksi N- tai C-terminaalisessa päässä, aminohappojen vaihtaminen muihin ryhmiin, molekyylin kemialli-. '.2.0 set ja biokemialliset sitomiset muihin molekyyleihin, jotka ovat inerttejä tai aktiivisia. Viimeksi mainituissa modifikaa-·’" tioissa voi olla kysymys esimerkiksi hybridimolekyyleistä, jot-

• ( I

:ka muodostuvat yhdestä tai useammasta keksinnön mukaisesta ini'. _ terferonista ja/tai tunnetuista a- tai β-interferoneista.

t • · 25 i : : • ·

Uusia, keksinnön mukaisia interferoneja voidaan käyttää biolo- ;·. giseen vaikutuskirjoonsa perustuen kaikenlaatuisissa hoidoissa, • · ♦ \..4 joihin myös tunnettuja interferoneja käytetään. Näihin kuuluvat • · » esimerkiksi herpes, nuhavirus, Equine-Abortion-virus, erilaiset • · :.::30 syöpälajit ja vastaavat. Uusia interferoneja voidaan käyttää • · · yksinään tai yhdistelmänä muiden tunnettujen interferonien tai biologisesti aktiivisten tuotteiden kanssa, esimerkiksi IFN-alfan, IL-2:n, muiden imuuni-modulaattoreiden ja vastaavien kanssa.

35 - 99116 23

Keksinnön mukaisia interferoneja voidaan antaa parenteraalises-ti tapauksissa, joissa tarvitaan tuumorien vastaista tai virusten vastaista hoitoa, ja tapauksessa, jossa esiintyy immunosup-ressiivisia ominaisuuksia. Annostelu ja annostelumäärät voivat 5 olla samanlaiset kuin mitä tällä hetkellä käytetään IFN-materi-aalien kliinisissä tutkimuksissa, esimerkiksi noin (1-10) x 106 yksikköä päivässä, ja preparaateilla, joiden puhtaus on yli 1%, esimerkiksi 5 x 107 yksikköön asti päivässä.

10 Kun kyseessä on oleellisesti homogeeninen, bakteereiden avulla tuotettu keksinnön mukainen IFN, voidaan tarkoituksenmukaista annostelumuotoa varten parenteraalisessa käytössä esimerkiksi liuottaa 3 mg EqIFN-y:aa 25 ml:aan 5%:sta eläinperäistä seeru-mialbumiinia, parhaiten hevos/koira-seerumialbumiinia. Tämä 15 liuos viedään sen jälkeen bakteerisuodattimen läpi ja suodatettu liuos jaetaan aseptisesti sataan pulloon, joista kukin sisältää 6 x 106 yksikköä puhdasta, parenteraaliseen antamiseen sopivaa interferonia. Ennen käyttöä pulloja säilytetään parhaiten kylmässä (-20°C). Keksinnön mukaiset aineet voidaan formu-; '..20 loida tunnetulla tavalla niin, että saadaan farmaseuttisesti : käyttökelpoisia aineita. Tällöin keksinnön mukainen polypepti- ·· di sekoitetaan farmaseuttisen, hyväksyttävän kantajan kanssa.

: Tavanomaisia kantajia ja niiden formulointia on kuvattu E.W.

I'. Martinin teoksessa Remington's Pharmaceutical Sciences, mihin jV.25 erityisesti viitataan. Sopivia farmaseuttisia aineita, jotka • · sopivat tehokkaaseen käyttöön vastaanottajalla (potilaalla), ;·. saadaan sekoittamalla keksinnön mukaiset interferonit mitatun • * * määrän kanssa kantajaa. Parhaiten käytetään parenteraalista • · · applikointia.

• · • · · :30 • · · Käsillä olevan keksinnön kohteena ovat edelleen monoklonaaliset :·.·. vasta-aineet keksinnön mukaisia polypeptidejä vastaan, hybrido- I t masolut, jotka tuottavat tällaisia vasta-aineita, ja näiden valmistusmenetelmät. Parhaiten pidetään hybridomasolulinjoja ja 35 näiden erittämiä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat spesifisesti EqIFN-y:n kanssa. Menetelmälle, jolla tällaisia 99116 24 monoklonaalisia vasta-aineita valmistetaan, on tunnusomaista, että pienet nisäkkäät, esimerkiksi kaniinit tai hiiret immunisoidaan keksinnön mukaisilla polypeptideillä, tällä tavoin immunisoitujen eläinten B-lymfosyytit fuusioidaan myeloomasolu-5 jen kanssa, muodostuneet hybridomasolut kloonataan, sen jälkeen viljellään in vitro tai injisoimalla hiiriin ja eristetään vasta-aineet viljelmistä.

Keksinnön kohteena ovat edelleen immuno-affiniteettikromato-10 grafia-pylväät ja immunomäärityksiin tarkoitetut testikitit, jotka sisältävät näitä vasta-aineita.

Keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti immunisoidaan hiiret, esimerkiksi Balb/c-hiiret, sinänsä tunnetuilla tavoilla. Erääs-15 sä hyvin pidetyssä suoritusmuodossa injisoidaan keksinnön mukaisia polypeptidejä noin kerran viikossa tai myös pidemmin välein useamman viikon aikana, esimerkiksi 5-12 viikon aikana, kunnes vasta-ainetta tuottavia B-lymfosyyttejä on muodostunut riittävä määrä.

:*’*.·20 : *.: Immunisoitujen hiirten B-lymfosyyttejä sisältävät elimet, ,:· esimerkiksi pernasolut poistetaan ja fuusioidaan sellaisten : myeloomasolujen kanssa, jotka mutaation vuoksi eivät kasva se- i’,, lektiivisessä viljelyalustassa. Tällaiset myeloomasolut ovat ,'.‘.25 tunnettuja, ja näitä ovat esimerkiksi solut, joista käytetään nimityksiä X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 ;·. NS/l tai SP2/0. Eräässä hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa • · · .···. fuusioidaan immunisoitujen hiirten pernasoluja solulinjan • · · X63-Ag8.6.5.3 myeloomasolujen kanssa. Fuusio suoritetaan sinän- • · * · · : 3O sä tunnetuilla menetelmillä sekoittamalla B-lymfosyyttejä ja • · · ‘,..· myeloomasoluja samalla kun lisätään solujen fuusiointiainetta kuten polyetyleeniglykolia, Sendai-viruksia, kalsiumkloridia « t ·...: tai lysolesitiiniä. Parhaiten fuusioidaan polyetyleeniglykolin, esimerkiksi polyetyleeniglykolin, jonka molekyylipaino on vä-35 Iillä 1000 ja 4000, läsnäollessa. Fuusion jälkeen viljellään muodostuneita hybridejä sinänsä tunnetulla menetelmällä selek-

II

99116 25 tiivisessä viljelyalustassa, joka on täydennetty hypoksantii-nilla, aminopteriinillä ja tymidiinillä (HAT-alusta). Fuusioi-tumattomat myeloomasolut eivät kykene kasvamaan tässä alustassa ja ne, kuten myös normaalit lymfosyytit kuolevat.

5

Hybridoma-viljelmien supernatanteista voidaan tutkia sinänsä tunnetuilla menetelmillä niiden spesifisten vasta-aineiden pitoisuus, esimerkiksi radio-immunomäärityksen tai aglutinoinnin avulla. Hybridomasolut, jotka tuottavat spesifisyydeltään halu-10 tunlaisia vasta-aineita, erotetaan kloonaamalla fuusioinnin muodostamasta mitä erilaisimpien hybridomasolujen seoksesta. Tätä varten valmistetaan sinänsä tunnetulla menetelmällä, josta käytetään nimitystä "limiting dilution", viljelmiä lähtemällä yhdestä ainoasta kasvavasta solusta.

15

Massatuotantoa varten viljellään hybridoma-soluklooneja, jotka tuottavat spesifisyydeltään halutunlaisia vasta-aineita, joko sinänsä tunnetuissa alustoissa in vitro tai niitä injisoidaan hiiriin niiden määrän lisäämiseksi. Eräässä hyvänä pidetyssä • · : *··20 suoritusmuodossa injisoidaan hybridomasoluja pristaanilla esi-i’.j käsiteltyihin hiiriin, poistetaan Aszites-neste ja vasta-aineet '· eristetään tästä saostamalla ammoniumsulfaattiliuoksella.

1 I l

I | t I

I·, Näiden hybridomasolujen avulla saatuja spesifisiä vasta-aineita < jV.25 voidaan käyttää sinänsä tunnetulla tavalla immunoaffiniteetti-• · kromatografia-pylväiden valmistamiseen. Keksinnön eräässä hyvä- ;·. nä pidetyssä suoritusmuodossa lisätään sopivaan kantajaan (joka • * * on suspendoitu puskuriliuokseen) vasta-aineliuosta, sitoutumat- • « t tomat osat pestään tämän jälkeen pois ja salvataan kantajamate- • ♦ • · ♦ :.::30 naalin vapaat paikat.

• · · i : ··♦ « j'.'. Vasta-aineita voidaan käyttää myös terapiassa.

Hybridomasolujen avulla saatuja spesifisiä vasta-aineita voi-35 daan käyttää sinänsä tunnetulla tavalla testikittien valmistamiseen. Nämä testikitit voivat perustua mitä erilaisimpiin me- . 99116 26 netelmiin, esimerkiksi radio-immunomääritykseen, lateksi-aglu-tanointiin, täplä-testeihin, kompetetiiviseen tai Sandwich-radio- immunomääritykseen, entsyymi-immunomääritykseen, immuno-fluorosenssiin tai immunokemiallisiin entsyymitesteihin.

5

Eriteltynä keksinnön kohteena ovat: polypeptidit oleellisesti puhtaassa muodossa - joilla on hevos-interferoni-γ:n (EqIFN-γ) biologiset ja immunologiset ominaisuudet; 10 - jotka eivät oleellisesti sisällä muita eläinperäisiä prote iineja; - joissa ei ole natiivia glykolysaatiota; - joissa on metioniini-aminohappo ennen N-pään 1. aminohappoa; - joilla on aminohapposekvenssi 15 15 10 15

Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys 20 25 30

Glu Tyr Phe Asn Ala Arg Asn Pro Asp Vai Gly Asp Gly Gly Pro : '··20 35 40 45

Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys 50 55 60 j Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe i'\, 65 70 75 i" ·' ·25 Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr • · 80 85 90

Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser • «· /;·. 95 100 105 • · *

Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Vai Asn Asp • · : 30 no 115 120 • · · *...· Leu Lys Vai Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Vai Met « 125 130 135

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser 140 145 35 Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin *** « 4 li - 99116 27 tai

Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Vai Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr

Ile Lys Glu Asp Leu Phe Vai Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser

Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin *** DNA-molekyyli, jotka koodaavat: 15 - polypeptidiä, jolla on EqIFN-Y:n biologiset ja immunologiset ominaisuudet; - edellä annettua polypeptidiä; - valmista EqIFN-γ.

« · : '>·20 DNA-molekyylit, jotka I t *11 *j - sisältävät täydellisen, luonnonmukaisen geenin EqlNF-yrlle; *" - nukleotidit

t I I I I I

I · , ,

ί ·, ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT

,V.25 i · · • ·

TTG GGT TCT TCT ACC TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA

f e « « « · \v ---------1 N T R 0 N I 1------- « « ·

ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGAC CTTTTAATAATACTTAC

• «

ί.! ί 3 0 TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT

I I ·

l...: ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT

• ;'. ‘: TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA

I |

•..,: GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT

i

AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG 3 5 ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC

. 99116 28

GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA 5 TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT 10 TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT

TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GDA

15 AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC

-------------------X N T R O N I 2-

TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT

• '-.20 TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG

III 4 I I 4

GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC

< « « 4 I (

! ·,. TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG

• V. 25 t · 4

AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC

( » t I < « ·

AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG AAT CAG ATT

» · I

« ♦ » « • · ·.· : 30 -----------1 N T R O N I 3-----------------------------

««I

CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT

»

i ” ’. TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC

• I

I i

.,.; TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT

< I

GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA 3 5 GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG

. 99116 29

AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT GGGTTCACTAAAATTT CTATGATCTTCTTTGCTCTATAAT C CTACAATTCTGTGGACAGA AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC 5 CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG 10 GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA 15 GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC

AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC

*•,‘120 ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG

: CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA

«II I • · I ' · * « * * *

25 TAG

• · • · • · · tai • « *

TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA

• · • · · · *••.*30 -----1 N T R O N I 1------- :*·'; ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC • ·

•. - ·; TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT

ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA 3 5 GAGACTTAGAGAGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG

. 99116 30

ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT 5 TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTCAAATTATTTGCT 10 TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT

15 TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GCA

AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC

: ’·· -------------------1 N T R O N I 2-

'.'•.'20 TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT

: : TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG

:V: GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC

25

*.*. TTC AAA CTC TTT GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG

• · · • · ·

AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC

• · • · « • · · · :···:30 AGC AGC ACC AGC AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT * • · · • · · ....: -----------I N T R O N I 3-----------------------------

CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT TACGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC 3 5 TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA

l! 99116 31

GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC CTTGTTCGTGAGATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG AGCAGTGGGAGGAGGGAGAAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT 5 GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGA AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT TTTGGAAATGCAAATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT 10 GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG GCCTGGATCTAAATGGGCTTGAATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA CAGGATTCGAACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT 15 TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC

V<'20 AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC

: ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG

CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA 25 ·· * * * • *

• I I

/:·. TAG

• · « · · 32 99116 50 55 60

AAA ΑΤΑ ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTC TTT

65 70 75

GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACC

5 80 85 90

ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGC

95 100 105

AAG CTG GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT CCG GTA AAT GAT

110 115 120

10 CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG

125 130 135

AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT

140 145

CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA TAG

15 tai '.:2 0 -11 5 10 15

; ATG TAC TAC TGC CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA

·!'·.. 20 25 30

GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG

25 35 40 45

CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA

• I · 50 55 60 « · ·

AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC

• · • « « :·: : 65 70 75 ··*

1..·:3 0 GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT

Γ·*: 80 85 90 • ·

·:·; ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT

95 100 105 AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC 35 110 115 120

CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA CTT ATG

I.

99116 33 125 130 135

AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT

140 145 CAG AAC CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA 5 tai -11 5 10 15

ATG CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC

10 20 25 30

AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG

35 40 45

GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC

50 55 60

15 CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG

65 70 75

AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA

80 85 90

: ’·· GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA

:.‘1:20 95 100 105

GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT

110 115 120

CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG

: V: 125 130 135

25 TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA

I1. 140 143 • « · «

TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA

• · · « • « · ja mahdollisesti lisäksi johto-sekvenssin ‘•••:30

:1·1: ATG ΑΑΤ TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT

• ·

·:··: TTG GGT TCT TCT ACC

tai ATG:n, - hybridisoituvat jonkin edellä mainitun DNA-molekyylin kanssa 35 olosuhteissa, joissa homologia on yli 85%, parhaiten yli 90%, jolloin nämä DNA-molekyylit voivat olla alkuperältään luonnon- 34 99116 mukaisia, synteettisiä tai puolisynteettisiä ja voivat olla lähisukuisia näiden DNA-tnolekyylien kanssa mutaatioiden, nukleotidi-substituoiden, nukleotidi-deleetioiden, nukleotidi-inserttien ja nukleotidien inversioiden kautta ja jotka koodaa-5 vat polypeptidejä, joilla on EqIFN-y:n biologinen ja immunologinen aktiivisuus.

DNA-molekyylit: jotka sisältävät nukleotidit 10

EG-1 51-TACTACTGCC AGGCTGCTTT CTTTAAAGAA ATCGAAAACC TGAAAGAATA

CTTCAACGCT CG-3' tai 15

EG-2 5’-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTGGCA

GTAGTA-3' : *' tai

EG-3 5 '-TAACCCAGAC GTTGGTGACG GTGGTCCGCT GTTCCTGGAC ATCCTGAAAA

ACTGGAAAGA AGACTCTG-3 ' I * · : : : tai 25

EG-4 5'-TTCTTTCCAG TTTTTCAGGA TGTCCAGGAA CAGCGGACCA CCGTCACCAA

.*:*· CGTCTGGGTT ACGAGCG-3 ' • · • « « • · · ··· " tai •:::=3o

Γ·': EG-5 5'-ACAAAAAGAT CATCCAGTCT CAGATCGTTT CTTTCTACTT CAAACTGTTC

• · ·:··: GAAAACCTGA AAGACAACC-3 ' tai li 35 99116 35

EG-6 5'-TTTCAGGTTT TCGAACAGTT TGAAGTAGAA AGAAACGATC TGAGACTGGA

TCATCTTTTT GTCAGAGTC-31

EG-7 5'-AGGTTATCCA GAAATCGATG GACACTATCA AAGAAGATCT GTTCGTTAAA

5 TTCTTCAACT CG-3' tai

EG-8 5'-TCGACGAGTT GAAGAATTTA ACGAACAGAT CTTCTTTGAT AGTGTCCATC

10 GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTC-3' tai

EG-9 5'-TCGACTTCTA AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATCCAGA TCCCAGTTAA

15 CGACCTGAAA-3' tai : *·* EG-10 5'-GCTGAACTTT CAGGTCGTTA ACTGGGATCT GGATCAGTTT CTGGAAGTCT \‘\:20 TCCAGTTTAG AAG-3 ' i tai

I < I

i (Y: EG-11 5 ' -GTTCAGCGTA AGGCTATCTC TGAACTGATC AAAGTTATGA ACGACCTGTC

25 TCCAAAAGCT AA-3' • · • · » · · tai • · · • · • · »

:;5.: EG-12 5 ' -CGCAGGTTAG CTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA TCAGTTCAGA

*•••*30 GATAGCCTTA C-3 ' • · « • · · • » • · tai EG-13 5'-CCTGCGTAAA CGTAAACGTT CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC 35 TTCAGTAAG-3' • 99116 36 tai EG-14 5'-GATCCTTACT GAAGAGCACG ACGACCACGG AATGGGTTCT GAGAACGTTT ACGTTTA-3' 5 tai EG-15 5'-CAGGCTGCTT TCTTTAAAGA AATCGAAAAC CTGAAAGAAT ACTTCAACGC TCG-3' 10 tai EG-16 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTG-3' 15 jotka koodaavat EqIFN-Y:n osa-alueita, ja näiden DAN-molekyylien koodaamat polypeptidit; - jotka hybridisoituvat jonkin edellä mainitun DNA-molekyylin kanssa olosuhteissa, joissa homologia on yli 85%, parhaiten yli « '· " 90%, jolloin nämä DNA-molekyylit voivat olla alkuperältään *. '120 luonnonmukaisia, synteettisiä tai puolisynteettisiä ja lähisu- i kua näiden DNA-molekyylien kanssa mutaatioiden, nukleotidisubs-; tituutioiden, nukleotidi-deleetioiden, nukleotidi-insertioiden '·· ja nukleotidien inversioiden kautta ja koodata EqIFN-y:n osa-: : : alueita, sekä näiden DNA-molekyylien koodaamat polypeptidit.

25

Rekombinantti-DNA-molekyylit, esimerkiksi vektorit, parhaiten * plasmidit, jotka sisältävät: , - edellä mainittua polypeptidiä koodaavan insertin; • · r *··/ - edellä mainitun DNA-molekyylin; | · ·;·*30 - edellä mainitun DNA-molekyylin funktionaalisessa yhteydessä « · * • ekspression kontrollisekvenssin kanssa niin, että se voi repli-'!"i koitua mikro-organismeissa kuten prokaryooteissa, esimerkiksi E.coli-bakteerissa, eukaryooteissa, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae-hiivassa, ja nisäkässoluissa, esimerkiksi hevosso-35 luissa;

II

37 99116 - vähintään kaksi nimillä EG-1 - EG-16 merkittyä DNA-molekyyliä liitettynä toisiinsa mielivaltaisena yhdistelmänä funktionaalisessa yhteydessä ekspression kontrollisekvenssin kanssa niin, että nämä voivat replikoitua mikro-organismeissa kuten prokary-5 ooteissa, esimerkiksi E.coli-bakteereissa, eukaryooteissa, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae-hiivassa ja nisäkässoluissa, esimerkiksi hevossoluissa.

Rekombinantti-DNA-molekyylit, kuten plasmidit pAHlll, pRH28l/5, 10 pRH282/5, pGNl, pGN3, pGN20, pEqGE-QAA2 tai pEqG-QAA3.

Isäntäorganismit, jotka on transformoitu jollakin edellä mainitulla rekombinantti-DNA-molekyylillä, esimerkiksi prokaryootit, parhaiten E.coli, erityisesti E.coli JM101 tai HB101, eukaryoo-15 tit, esimerkiksi Saccharomyces cerevisiae tai nisäkässolulin-jat, parhaiten hevossolulinjat.

Menetelmä valmistaa keksinnön mukaisia polypeptidejä, jolloin • « • «* « • * .:20 a) sopivat isäntäorganismit, esimerkiksi edellä mainitut, transformoidaan geneettisillä informaatioilla, jotka koodaavat - keksinnön mukaisia polypeptidejä, parhaiten edellä mainituilla

« I

| '·« rekombinantti-DNA-molekyyleillä, 4 t » ♦ ' I « i 25 b) ekspressoidaan informaatio, joka tuottaa keksinnön mukaiset polypeptidit isäntäorganismissa, ja * · « * · · • « · , c) eristetään keksinnön mukaiset polypeptidit.

• φ » * 4 ft Φ4 m * *44 i : ·*· 30 Polypeptidit, jotka voidaan valmistaa näillä menetelmillä.

• 4 *

l I I

* · ♦ 4 •!"; Keksinnön mukaisten polypeptidien käyttö terapeuttisessa hoi dossa ja/tai immunisoinnissa tai farmaseuttisten preparaattien valmistamiseksi.

35 99116 38

Terapeuttiseen hoitoon, esimerkiksi hevosten hoitoon tarkoitettu aine, jolle on tunnusomaista, että se sisältää farmaseuttisesti inerttien kantajien lisäksi tehokkaan määrän keksinnön mukaista polypeptidiä.

5

Menetelmä valmistaa monoklonaalisia vasta-aineita keksinnön mukaisia polypeptidejä vastaan, tunnettu siitä, että isäntä-eläimet immunisoidaan polypeptidillä, näiden isäntäeläimien B-lymfosyytit fuusioidaan myeloomasolujen kanssa, alikloonataan 10 monoklonaalisia vasta-aineita erittävät hybridi-solulinjat ja viljellään in vitro tai in vivo.

Hybridi-solulinjat, jotka erittävät monoklonaalista vasta-ainetta keksinnön mukaista polypeptidiä vastaan.

15

Monoklonaaliset vasta-aineet, jotka kokonaan tai osittain neutraloivat spesifisellä tavalla keksinnön mukaisten polypeptidien vaikutuksen tai jotka sitoutuvat spesifisesti johonkin mainit- * “ tuun polypeptidiin.

* « 9 4 4 . “.20 ’/ Monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö terapiassa ja/tai jonkin · keksinnön mukaisen polypeptidin kvalitatiiviseen ja/tai kvanti- j tatiiviseen määrittämiseen.

t I » « < I · · 4 · 25 Edellä mainittujen monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö jon-kin keksinnön mukaisen polypeptidin puhdistamiseen.

p 4 ♦· * t « * ♦ · % , *. Keksinnön mukaisten polypeptidien määrittämiseen tarkoitettu t · ♦ • · « ' testikitti, joka sisältää edellä mainittuja monoklonaalisia i *: 'j· 30 vasta-aineita.

t · · • · · • · t r

Kuvioiden selitykset:

Kuvio 1: Lambda Eq-y2:sta saadun 4664 bp pitkän BamHI-fragmen- 35 tin DNA-sekvenssi. Koodattu aminohapposekvenssi ja intronin asema on annettu. Negatiivisesti numeroidut 39 99116 aminohapot viittaavat hydrofobiseen signaalipepti-diin. Valmiin EqIFN-y:n ainoa potentiaalinen N-glyko-lysaatiokohta kohdassa 86-88 on alleviivattu. RNA-polymeraasin sitoutumiselle tärkeät sekvenssit CCATC 5 ja TATAAAA ovat alleviivattuja, kuten myös kaksi sig- naalisekvenssiä mRNA:n polyadenylaatiolle (AATAAA).

Kuvio 2: Eri lajien γ-interferonien aminohapposekvenssien ver tailu. Signaalipeptidi on osoitettu eteen asetetun 10 "S"-numeroidun aminohapon avulla. "Konsensus"-sek venssi isoina kirjaimina tarkoittaa jokaista aminohappoa, joka on kaikissa γ-interferoneissa identtinen, ja pieninä kirjaimina aminohappoja, joita esiintyy yli 75%:ssa γ-interferoneista.

15

Kuvio 3: Hevos-γ-interferoni-geenin kokonaissynteesiin käytet tyjen oligonukleotidien kaaviollinen esitys. Yksittäisten oligonukleotidien pituus sekä niiden nume-.. rointi on annettu. Restriktiokatkaisukohdat, joita on J20 synteettisen geenin sisällä vain kerran, on numeroi- * · ♦ ’· tu.

• · • · ·’” : Kuvio 4: Luonnollisen geenin (eq) ja synteettisen geenin (syn) - " valmista EqIFN-y:aa koodaavien sekvenssien vertailu, V.25 kun kyseessä on E.coli-bakteerissa optimoidun geenin ekspressio. Erilaiset emäkset on merkattu täydellä.

• · • · • · · • · « .1 Kuvio 5: Taulukko valmista EqIFN-y:aa varten käytetyille kodo- : neille. Vasemmalla reunalla on annettu kodonin ensim- • · « • 1.13 0 mäinen emäs, keskellä toinen emäs ja oikealla reunal- • · la kolmas emäs. Taulukossa on annettu käytettyjen • · · • « · : kodonien lukumäärä kyseiselle aminohapolle luonnolli- 35 Kuvio 6: Ekspressioplasmidin pRHIOO rakenne.

· sessa geenissä sekä suluissa synteettiselle geenille.

40 99116

Kuvio 7: pGN20:n rakenne ja restriktiokartta.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä yksityiskohtaisesti keksintöä rajoittamatta.

5

Materiaalit Lähtöaineet saatiin osittain kaupallisesti ja osittain EMBL-laitoksesta. Heidelberg. E.coli JM101, pUC9 ja M13mp8 saatiin 10 Bethesda Research Laboratories -laboratoriosta, E.coli-kannat, joissa oli supressorifaktori sup F, esimerkiksi E.coli NM526, 538 ja 539 ja vektorit Lambda-EMBL3 tai 3A olivat peräisin EMBL-laitoksesta ja niitä on myös saatavissa Stehelin/Basel-yhtiöstä (Sveitsi).

15 1. Hevos-DNA:n eristäminen

Pakastettu kudos, esimerkiksi hevosen maksa hienonnettiin nes-·, temäisessä typessä hienojakoiseksi jauheeksi ja sitä inkuboi-*. 20 tiin 3 tuntia 55°C:ssa seoksessa: 0,5M EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml proteinaasi K (20 ml/g kudosta).

I Proteiinit poistettiin saadusta viskoosista liuoksesta uutta-*;' 1 maila fenolilla ja uuttamalla kolme kertaa fenoli/klorofor-" mi/isoamyylialkoholi-seoksella (25/24/1 til.), dialysoitiin

• · I

‘•‘•'25 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl -seosta vasten ja DNA saostettiin kahdella tilavuudella etanolia. Kuivattiin täy- • * : ’·* dellisesti tyhjössä, minkä jälkeen DNA liuotettiin TE-puskuriin • · · *.* · (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) 4°C:ssa ja sitä ja 1,273 g •.*. CsCl/ml-liuosta sentrifugoitiin 62 tuntia nopeudella 40.000 • · · · .*•*.30 kierrosta minuutissa 20°C:ssa (Sorvali 50Ti-roottori) . CsCl-• · • · · kradientti poistettiin tipoittain, DNA-pitoiset jakeet dialy- • · · : ' soitiin TE-puskuria vasten ja sen jälkeen DNA saostettiin kahdella tilavuudella etanolia, pestiin 70%:11a etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin uudelleen TE-puskuriin (4°C).

li 35 99116 41

Valmiissa DNA-preparaatissa ei ollut RNA:a ja se oli pidempi kuin 50 kb (määritettiin elektroforeesin avulla 0,45%:sella agaroosigeelillä).

5 2. Hevos-DWA:n osittainen pilkkominen endonukleaasilla ia frak- tiointi koon perusteella

Kaksi kertaa 50 μg hevos-DNA:a inkuboitiin 37°C:ssa 1,6 yksikön kanssa Sau3A-entsyymiä 450 μΐ-.ssa reaktiomediumia (10 mM 10 Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 1 mM ditiotreitoli). 15, 25 ja 40 minuutin kuluttua otettiin 150 μ1:η näytteet ja näihin lisättiin 15 mM EDTA:a. Reaktio pysäytettiin lämmittämällä 10 minuuttia 70°C:ssa. Lisättiin 0,3 M Na-asetaattia, pH 6,0, minkä jälkeen DNA sekoitettiin 2,5 tilavuudella etanolia. TE-15 puskuriin uudelleenliuottamisen jälkeen DNA erotettiin koon perusteella elektroforeesikäsittelemällä yön yli jännitteellä noin lV/cm 0,45%:11a agaroosigeelillä TBE-puskurissa (10,8 g/1 Tris, 5,5 g/1 boorihappo, 0,93 g/1 Na2EDTA). Koemarkkereiden ··. (EcoRI:lla ja HindIII:lla kaksoispilkottu ja HindIII:lla pii- • « · ,·, £0 kottu Lambda-DNA) erotettiin leikkaamalla geelipala, jossa

• I I

’/ DNA:n pituus oli 10 - 23 kb, DNA elektroeluoitiin geelistä dia-lyysiletkussa 3 tunnin aikana 300 V:lla (puskuri 0,1 x TBE), ' puhdistettiin käyttöohjeen mukaisesti Elutip-D-pylvässä

I I

< | < , (Schleicher und Schull) ja tämän jälkeen saostettiin etanolil- '•'•'25 la.

• · • · • " Hevos-DNA-fragmenttien itsestään liittymisen, mikä toisaalta

• « I

V * voi johtaa hevos-DNA-sekvenssien keinotekoisiin hybrideihin ja • toisaalta liian suuriin ja siten ei enää Lambda-faageihin lai- • » · « i***.30 tettavissa oleviin DNA-paloihin, estämiseksi kokofraktioidut • · · hevos-DNA-palat defosforyloitiin.

Tätä varten DNA:a inkuboitiin 30 minuuttia 37°C:ssa 140 μΐ:ssa reaktiomediumia (50 mM Tris-HCl pH 9,5, 10 mM MgCl2, 0,1 mM 35 Zn-asetaatti, 1 mM spermidiini) yhdessä 5 yksikön kanssa nau-dansuolifosfataasia. Lisättiin vielä 5 yksikköä entsyymiä ja 42 99116 inkuboitiin 30 minuuttia. EDTA:a lisättiin 25 mM loppukonsent-raatioon, minkä jälkeen DNA uutettiin kerran fenoli/klorofor-mi/isoamyylialkoholi-seoksella (25/24/1 til.), 2 kertaa kloro-formi/isoamyylialkoholi-seoksella (24/1 til.), ja kertaa die-5 tyylieetterillä, saostettiin etanolilla, kuivattiin ja liuotettiin 0,1 x TE-puskuriin.

3. Hevosaenomi-DNA-kiri aston rakentaminen 10 Defosforyloidut 10 - 23 kb hevos-DNA-fragmentit kloonattiin

Lambda-vektorissa, esimerkiksi vektoreissa Lambda-EMBL3 tai -3A (Frischauf, A.M. et ai. J. Mol. Biol. , 12S2., 827-842 (1983), jossa on G-A-T-C kohesiivit päät, poistamalla faagi-DNA:n sisäinen BamHI-fragmentti.

15

Vektoria kasvatettiin E.coli-kannassa, jossa oli supressorifak-tori sup F, esimerkiksi E.coli NM526, 538 tai 539 (Frischauf, A.M. et ai. J. Mol. Biol., 170. 827-842 (1983), LB-liemessä .. (Miller; Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor \ 20 Lab. Cold Spring Harbor, New York) 5 mM MgS04:n kanssa, saos-

t I I

’· '· tettiin polyetyleeniglykolilla ja puhdistettiin CsCl-tiheys-' kradientti-sentrifugoimalla kaksi kertaa (0,71 g CsCl/ml liuos-: ta, 40 tuntia nopeudella 45.000 kerrosta minuutissa, 20°C) .

: Dialysoitiin TE-puskuria vasten, minkä jälkeen proteiinit pois- l.:.*25 tettiin faagi-DNA:sta uuttamalla kaksi kertaa fenoli/klorofor-mi/isoamyylialkoholi-seoksella (24/1 til.) ja väkevöitiin saos- • · • ’·· tamalla etanolilla.

I I i • · * • · · , \t EMBL3A-vektorin pääte fragment it saatiin pilkkomalla BamHI :11a • * i *1!.*3 0 täydellisesti 50 μg f aagi-DNA: a 2 tuntia 37°C:ssa 450 μl:ssa *** fraktiomediumia (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM di- • · · ; tiotretoli) , pysäyttämällä reaktio 15 mM EDTA:lla 10 minuutin aikana 70°C:ssa ja saostamalla DNA etanolilla.

li - 99116 43

Uudelleenliittymisen välttämiseksi keskifragmentti jälkipilkot-tiin EcoRI:lla ja eronnut oligonukleotidi poistettiin seostamalla isopropanolilla.

5 BamHI-pilkottua Lambda-DNA:a pilkottiin tätä varten täydellisesti EcoRIilla 2 tunnin aikana 37°C:ssa seoksessa: 450 μΐ 10 mM Tris-HCl pH 7,5 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 15 mM EDTA:a ja lämmittämällä 10 minuuttia 70°C:ssa. Na-asetaattia lisättiin 0,3 M loppukonsentraati-10 oon asti, minkä jälkeen 3 suurta DNA-fragmenttia saostettiin 0,6 tilavuuksilla isopropanolia 15 minuutin ajan 0°C:ssa, pestiin 2 kertaa 0,45 M Na-asetaatti/0,6 til. isopropanolilla ja 1 kerta 0,3 M Na-asetaatti/2,5 til. etanolilla ja liuotettiin 15 /xl:aan 0,1 x TE-puskuria. BamHI/EcoRI-linkkerit jäävät tässä 15 menetelmässä liuokseen. EMBL3A-fragmentit (8 μg) yhdistettiin noin 5 μg) yhdistettiin noin 5 μg:n kanssa 10 - 23 kb hevos-DNA:a ja 10 yksikön kanssa T4-DNA-likaasia (NEN) ja inkuboitiin yön yli 14°C:ssa ja yksi päivä 4°C:ssa 50 /xl:ssa ligatointime-diumia (66 mM Tris-HCl pH 7,2, 0,1 m NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ,20 EDTA, 5 mM ditiotreitoli, 0,5 mM ATP) . Ligatoitu DNA-seos pa-

« I I

'· / kattiin valmiisiin Lambda-faagipartikkeleihin in vitro-Lambda- • · ; pakkaussysteemissä (Schalenghe, F. et ai; Chromosoma, 82.

: 205-216 (1981) ) .

V.;25 Tämän systeemin komponentit, so. ultraääniuute (SE) , pakastus-sulatus-lysaatti (FTL), puskurit Ml ja A valmistettiin mainitun • * { ’·· artikkelin (Schalenghe. F. et ai; Chromosoma, £2, 205-216 • · · : (1981)) mukaisesti. Ligatoidun DNA-seoksen 10 μ1:η suuruisia ; .·, eriä inkuboitiin 2 minuuttia huoneen lämpötilassa 25 μ1:η kans- • · · • ••#30 sa SE-uutetta, joka myös oli sulatettu jäistä 30 minuutin aika- t · ’·’ na kuten FTL-lysaattikin, lisättiin 100 μΐ FTL-lysaattia ja • · · • · # • inkuboitiin edelleen 60 minuuttia huoneen lämpötilassa. Pak- kausseos laimennettiin 150 μ1:1ΐ3 Lambda-laimenninta (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgS04 1 Mm EDTA) ja säilytettiin 4°C:ssa. 35 44 99116 4. Hevos-v-interferonin (EqIFN-v) geenin kloonaus ia sekvens-sointi A. Täydellisen EqlFN-y-geeni-kloonin eristäminen 5 E.coli NM528 (supF) kannan infektointiin käytettiin hevos-DNA-kirjastoa. Bakteeriviljelmä, jota oli yli yön kasvatettu LB-ravintoliuoksessa (10 g/1 tryptoni, 5 g/1 hiivauute, 10 g/1 NaCl, pH 7,4) joka sisälsi 0,2% maltoosia, säädettiin 10 mM 10 MgS04:ssa 2,0 optiseen tiheyteen (600 nm). Tämän suspension kulloinkin 0,5 ml:n suuruiset erät infektoitiin 50.000 pfu-yk-siköllä (plakinmuodostusyksikkö) DNA-kirjaston Lambda-faageja ja levitettiin LB-pehmytagarkerroksen kanssa LB-agar-maljoille, jotka sisälsivät 10 mM magnesiumsulfaattia (halkaisija 15 13,5 cm). Rekombinantti-Lambda-faageja seulottiin yhteensä 1,5 x 106. Viljeltiin yön yli 37°C:ssa, minkä jälkeen jokaisen maljan faageista valmistettiin kaksinkertaiset kopiot nitrosel-luloosalla (Benton ja Davis, Science 196:180-182, 1977)). Faagi-DNA:n denaturoinnin jälkeen (1 minuuttia seoksessa: 0,5 N .·, '20 NaOH, 1,5 M NaCl) , neutraloinnin (2 kertaa 3 minuuttia seokses- I t

sa: 0,5 M Tris-HCl pH 7,5 1,5 M NaCl) ja huuhtelun jälkeen ’ (1 minuuttia seoksessa: 2 x SSC, 1 x SSC, 0,15 M NaCl, 15 mM

‘ Na-sitraatti) kuivattiin suodattimen ilmassa ja DNA kiinnitet-, tiin paistamalla 2 tuntia 80°C:ssa. Suodattimia pestiin yön yli **25 65°C:ssa liuoksessa 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,1% SDS, ja esihybridisoitiin 4-6 tuntia 65°C:ssa (hybridisoin- • ’·* tiliuos: 0,9 M NaCl, 50 mM NaH-,P04, pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,1% • ·« " * • · e V 1 Ficoll, 0,1% polyvinyylipyrrolidoni, 0,1% naudanseerumialbumii- • ni, 0,1% SDS, 20 mg/ml ultraäänikäsitelty ja denaturoitu • · · · ,***.30 lohensperma-DNA) . Hybridisointi suoritettiin 20 tunnin aikana • · · 65°C:ssa juuri valmistetussa liuoksessa, joka sisälsi suodatin- • · · ' ta kohti 106 cpm tavanomaisilla menetelmillä radioaktiivisesti leimattua HuIFN-γ "koetinta". Suodattimet pestiin ei-stringen-teissä olosuhteissa 3 x SSC, 0,1% SDS-seoksessa 65°C:ssa ja 35 autoradiografoitiin. Kolmen plakkipuhdistuksen suorittamisen li 99116 45 jälkeen voitiin tunnistaa viisi Lambda-kloonia, jotka antoivat positiiviset hybridisoitumissignaalit.

DNA puhdistettiin näistä eristetyistä rekombinantti-faageista 5 tavanomaisilla menetelmillä (Maniatis et ai., Ibid.). Erilaisilla restriktioentsyymeillä pilkkomisen ja tämän jälkeisen Southern-analyysin (Southern, J.Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) jälkeen faagi-DNA:t karakterisoitiin hybridisoimalla HuIFN-y "koettimen" kanssa. Eristettiin yksi ainutkertaisesti hybridi-10 soituva kloonin Lambda Eq-y2 4,6 kb pitkä BamHI-fragmentti ja tämä kloonattiin pUC9-plasmidin BamHI-katkaisukohtaan (Vieira ja Messing, Gene 19: 259-268, 1982). E.coli JMlOl-kannan trans-formoinnin jälkeen valmistettiin saaduista pesäkkeistä minipre-parointimenetelmällä (Birnboim ja Doly, Nucl. Acids Res. 7: 15 1513-1523, 1979) plasmidi-DNA ja karakterisoitiin pilkkomalla restriktioentsyymeillä. Plasmidille, jolla oli haluttu BamHI-insertti, annettiin nimeksi pAHlll. Plasmidin pAHlll BamHI-insert in päät, sen jälkeen kun mukaan oli laitettu M13mp8- tai ·, M13mp9-vektorit (Vieira ja Messing, Gene 19, 259-268, 1982), \ 20 sekvenssoitiin Didesoxy-menetelmällä (Sanger et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977). Sekvenssien vertaa-! minen ihmis-y-interferonigeenin (Gray ja Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) kanssa osoitti homologia olevan suuren koodaa-\ mattomien 5'- ja 31-alueiden välillä. Tästä voitiin päätellä, i « '·'· 25 että oli eristetty täydellinen EqlFN-y-geeni .

: *· B. Kloonista Lambda Eq-y2 saadun hevos-y-interferonigeenin sek-• · · : venssointi.

• · * · » • « · • ♦ · · ,*”.30 pAHlll-plasmidin 4,6 kb pitkä BamHI-insertti sekvenssoitiin • » · "•m täydellisesti Didesoxy-menetelmällä. BamHI-fragmentin koko sek-• · · ' ’ venssi saatiin yhdistämällä M13-alikloonien osasekvenssit, jotka oli saatu kloonaamalla suunnatulla tavalla restriktiofrag-mentit (EcoRI, Hindlll, PstI, Pstl-Bglll, Hindlll-BamHI) vas-35 taavasti pilkottuihin M13mp8 tai M13mp9-vektoreihin. Lisää osasekvenssejä saatiin siten, että 2,0 kb pitkä BamHI-Bgllll- 99116 46 fragmentti tai 2,0 kb pitkä Pstl-fragmentti kloonattiin "hau-likkomenetelmällä" M13mp8-vektoriin. Kummatkin DNA-fragmentit hajotettiin ultraäänen avulla pienemmiksi palasiksi ja DNA-päät tasattiin inkuboimalla E.coli DNA-polymeraasin I (Klenowin 5 fragmentti) kanssa, kun mukana oli 0,1 mM kutakin neljää desok-sinukleotidifosfaattia (reaktiopuskuri: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreiitti, 0,5 mg/ml naudanseerumialbu-miini: 1 h 25°C:ssa). Fraktioitiin koon perusteella agaroosi-geelissä, minkä jälkeen eristettiin DNA-fragmentit, joiden pi-10 tuus oli noin 0,4 - 1,0 kb, ja ligatoitiin M13mp8-vektorin

Smal-katkaisukohtaan. Saadut osasekvenssit yhdistettiin tietokoneohjelman avulla 4664 bp pitkäksi kokonaissekvenssiksi, joka on esitetty kuviossa 1.

15 Hevos-γ-interferonigeenin proteiineja koodaava alue saatiin avoimen lukukehyksen tietokoneen tukeman analyysin avulla ja vertaamalla muiden lajien γ-interferonigeeneihin (Gray ja Goeddel, Nature 298: 859-863; Grau ja Goeddel, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et ai., EMBO J. 4: .·, 20 761-767, 1985; Gerretti et ai., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986). Proteiineja koodaavan alueen katkaisee kolme intronia, jolloin ensimmäisessä eksonissa on koodattu 20 aminohappoa pitkä, hydrofobinen signaalipeptidi ja valmiin EqlFN-y-polypepti-din 18 aminohappoa (emäkset 366-479). Toinen eksoni koodaa * ‘ 25 aminohappoja 19 - 41 (emäkset 1639 - 1707) , kolmas koodaa aminohappoja 42 - 102 (emäkset 1803 - 1985) ja neljäs eksoni » « koodaa karboksi-päätä, jossa on aminohapot 103 - 146 (emäkset * * * 3307 - 3441) . Kohdissa 4010 ja 4020 on mRNA:n polyadenylaation j:*· 2 signaalisekvenssiä (AATAAA). Valmiin EqlFN-y-polypeptidin I**";30 asemissa 86 - 88 on ainoa mahdollinen N-glykolysaatiokohta (Asn-Ser-Ser) , joka sopii yhteen naudan γ-interferonin toisen N-glykolysaatiokohdan (Asn-Gly-Ser) kanssa (kuvio 2). Valmis EqIFN-Y-polypeptidi sisältää yllättäen vain yhden ainoan kyste-iiniryhmän asemassa 3, jolloin luonnonmukaisten ihmis- ja 35 hiiri-y-interferonien kanssa analogisesti ensimmäiset kolme 99116 47 amino-terminaalista aminohappoa (tässä tapauksessa Tyr-Tyr-Cys) todennäköisesti lohkaistaan protolyyttisesti organismissa.

5. Synteettisen geenin valmistaminen valmiille EaIFN-v:lle 5

Rekombinantti-EqlFN-yrn ekspressoimiseksi valmiissa muodossaan Escherichia coli -bakteerissa rakennettiin synteettinen geeni oligonukleotideistä. Se koodaa samaa aminohapposekvenssiä kuin luonnonmukainen EqlFN-y-geeni, mutta se sisältää kuitenkin ai-10 noastaan sellaisia yksittäisiä aminohappojen kodonia, joita käytetään E.colin suuresti ekspressoimissa, solun omissa geeneissä (Gouy ja Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055-7074, 1982). Lisäksi rakennettiin mukaan useita ainutkertaisia restriktio-entsyymien katkaisukohtia, mikä mahdollistaa geenin yksinker-15 täisen manipuloinnin, kun halutaan muuttaa yksittäisiä paloja. EqlFN-ytn synteettinen geeni rakennettiin kahtena muunnelmana yhteensä 16 erilaisesti oligonukleotidista. Ensimmäinen muunnelma koodaa valmista EqlFN-yraa, jossa on 146 aminohappoa plus ··. aloitus-metioniini ja toinen muoto koodaa aminopäässä kolmen « '20 aminohapon verran (Tyr-Tyr-Cys) lyhennettyä polypeptidiä plus aloitus-metioniinia, jollaisena se luultavasti saattaa esiintyä luonnonmukaisessa organismissa.

, Synteettisen EqIFN-y:n rakenne on esitetty kuviossa 3. Valmis- i : ‘ ‘ 25 tamiseen käytetyt oligonukleotidit syntetisoitiin Applied Bio-systems Model 381A DNA-syntetisointilaitteen avulla, puhdistet- • « • ’* tiin elektroforesoimalla denaturoiduissa 12-prosenttisissa po-• · « • · c *·* c lyakryyliamidigeeleissä (7 M urea) ja suolat poistettiin eks- : kluusiokromatograf iän avulla Sephadex G-25:lla (Pharmacia).

• · « · » : 30 • · ·

OliQonukleotidien kokoaminen synteettiseksi EcIFN-v-aeeniksi • · ·

Synteettisen EqlFN-y-geenin rakentaminen tapahtui kahtena palana. Geenin ensimmäinen osa valmistettiin kahdeksan oligonukleo-35 tidin EG-1 - EG-8 avulla Sall-katkaisukohtaan asti ja geenin toinen puolisko kuudesta oligonukleotidista EG-9 - EG-14 Sall- * 48 99116 katkaisukohdasta BamHI-katkaisukohtaan asti. Aminopäässä kolmen aminohapon verran lyhennettyyn EqlFN-γ-muotoon käytettiin oligonukleotideja EG-15 ja EG-16 oligonukleotidien EG-l ja EG-2 asemesta.

5

Keskenään komplementtiset oligonukleotidit fosforyloitiin kulloinkin parittain 5'-päässä. Kulloinkin 100 pmoolia kumpaakin oligonukleotidia (esimerkiksi EG-3 ja EG-4, tai EG-5 tai EG-6 jne.) inkuboitiin 10 minuuttia 37°C:ssa 9 μΐ-.ssa kinaasi-pusku-10 ria (70 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreiitti), 2 μCi [γ"32Ρ]ΑΤΡ (Amersham) käyttämällä 10 yksikköä T4-polynuk-leotidikinaasia (New England Biolabs), tähän lisättiin 1 μΐ 10 mM ATP-liuosta ja inkuboitiin vielä 50 minuuttia 37°C:ssa. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla 10 minuuttia 95°C:ssa. DNA-15 päiden myöhempi liittyminen estettiin jättämällä fosforyloimat-ta oligonukleotidit EG-l, EG-15, EG-9 ja EG-14. Ne sekoitettiin kyseisen komplementtisen oligonukleotidin kanssa vasta polynuk-leotidikinaasin inaktivoinnin jälkeen, kuumennettiin 5 minuut-·. tia 95°C:ssa ja jäähdytettiin huoneen lämpötilaan.

/, 20

Oligonukleotidin EG-1+2 (tai toisessa osassa EG-15+16), EG-3+4, EG-5+6 ja EG-7+8 seokset yhdistettiin, seokseen lisättiin 1 μΐ 5 M natriumkloridia, kuumennettiin 5 minuuttia 70°C:ssa ja jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Tähän liuokseen lisättiin * - 25 5 μΐ 10 mM ATP:a, 2 μΐ ditiotreiittia, 1,5 μΐ 10 x ligatointi- puskuria, (0,66 M Tris-HCl pH 7,2, IM NaCl, 100 mM MgCl2, • · * 10 mM EDTA, 50 mM ditiotreiitti) ja 80 yksikköä T4 DNA-ligaasia • · · V (new England Biolabs) ja inkuboitiin 48 tuntia 4°C:ssa. Ligaa- • :*· sireaktion kulkua seurattiin erottamalla geelielektroforeetti-··« * i***.30 sesti pienen reaktioerän DNA-fragmentit 5%:sessa, ei-denaturoi-··· vassa polyakryyliamidigeelissä ja sen jälkeen autoradiokrafoi- « · ♦ maila. Samalla tavalla liitettiin keskenään kuusi oligonukleotidia EG-9 - EG-14. Reaktio pysäytettiin uuttamalla fenolin ja kloroformin seoksessa ja DNA saatiin saostamalla etanolilla.

35 99116 49 6. Ekspressioplasmidin pRH 100 rakentaminen

Kaikki entsyymireaktiot suoritettiin valmistajien antamissa olosuhteissa.

5 7 μg plasmidia pER103 (Eva Dworkin-Rastl et ai., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115-613) linearisoitiin 50 μΐ:ssa reaktiomediu-mia restriktioendonukleaasilla Hindlll. Inkuboitiin 1 tunti 37°C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 50 μΐ 2 X DIP-puskuria (2 x 10 CIP-puskuri = 20 mM Tris, pH =9,2, 0,2 mM EDTA). 5'-terminaaliset fosfaattiryhmät poistettiin lisäämällä 2 yksikköä vasi-kansuolesta saatua alkalista fosfataasia (CIP); inkubointi kesti 30 minuuttia 45°C:ssa. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 4 μΐ 0,5 mM EDTA-liuosta sekä lisäämällä 10 μΐ IM Tris, pH = 8,0 15 liuosta. Proteiinit poistettiin uuttamalla 2 kertaa fenolilla ja kerran fenolilla ja kloroformilla. DNA saostettiin vesifaa-sista lisäämällä 0,1 til. 3 M natriumasetaattiliuosta pH =5,5 ja 250 μΐ etanolia ja DNA-sakka pestiin sentrifugoinnin jälkeen ··. kerran 70% :11a etanoliliuoksella. DNA kuivattiin ja sen jälkeen

« I I

,·, 20 pelletti liuotettiin 20 μΐ-.aan TE-puskuria (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA).

! 1 μg kutakin synteettisesti valmistettua oligonukleotidia , d(AGCTTAAAGAATGAGCT) ja d(CATCTTTA) fosforyloitiin kulloinkin i « i · * ‘ 25 10 μΐ-.ssa reaktioliuosta lisäämällä 10 yksikköä T4-PNK-entsyy miä (polynukleotidikinaasi) sekä 1 mM rATP:a. Reaktio tapahtui • · : ·· 37°C:ssa ja kesti 45 minuuttia. Reaktio pysäytettiin kuumenta-««· *·* * maila 10 minuuttia 70°C:ssa.

« * • · * • « « ··« ♦ i’*‘;30 Sekoitettiin kulloinkin 5 μΐ plasmidiliuosta ja fosforyloitua • « · oligonukleotidia ja lämmitettiin 5 minuuttia 70°C:ssa. Tämän « · · jälkeen liuos jäähdytettiin 0°C:een ja lisättiin 2 μΐ 10 x li-gaasipuskuria (500 mM Tris, pH = 7,5), 100 mM MgCl2:a, 200 mM DTT:a (ditiotreiitti), 1 mM rATP:a, 500 μg/ml BSA:a (nauhasee-35 rumialbumiini) sekä 2 μΐ vettä ja 10 yksikköä T4-DNA-ligaasia.

50 99116

Reaktio kesti 40 tuntia ja se suoritettiin 4°C:ssa. Reaktio pysäytettiin kuumentamalla 10 minuuttia 70°C:ssa.

2 μΐ tätä ligaasireaktioseosta yhteensä 30 μΐ-.ssa. liuosta pil-5 kottiin 3 tunnin aikana 37°C:ssa 10 yksiköllä restriktioendo-nukleaasia Sacl (New England Biolabs). Reaktio pysäytettiin kuumentamalla 10 minuuttia 70°C:ssa. 5 ml tätä reaktioseosta ligatoitiin 16 tuntia 14°C:ssa yhteensä 3 0 μl:ssa lisäämällä 10 yksikköä T4-PNK-entsyymiä.

10 200 μΐ-.aan kompetentteja E.coli HBlOl-bakteereita lisättiin 10 μΐ tätä ligaasireaktioseosta. Bakteereita pidettiin 45 minuuttia jäillä ja sen jälkeen lämmitettiin 2 minuuttia 42°C:ssa DNA:n sisään viennin mahdollistamiseksi. Tämän jälkeen baktee-15 risuspensiota inkuboitiin jälleen 0°C:ssa 10 minuuttia. Tämän jälkeen transformoidut bakteerit siveltiin LB-agarille, joka sisälsi 50 μg/ml ampisilliiniä.

”.ti Muodostuneista bakteeripesäkkeistä valittiin 12 mielivaltaises- 4 .·, ;20 ti ja näistä eristettiin plasmidit mikromitassa (Birnboim ja ,!, Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). Saatu DNA katkais- ·, tiin restriktioendonukleaasilla Sacl ja DNA erotettiin agaroo- sigeelillä (1%, 1 X TBE-puskuri) . DNA:n kulkeutuminen lineaa- « < - . risena noin 4400 bp suuruisena molekyylinä vahvisti Sacl-tun-

< I

* I I

’ ‘ 25 nistamiskohdan liittymisen plasmidiin. Yksi tällainen plasmidi valittiin mielivaltaisesti. E.coli HB101 transformoitiin vielä • · • · • ** kerran siihen kuuluvan minipreparaatin DNA:11a. Saaduista 4 r » *·* ‘ transformoiduista bakteereista valittiin yksi pesäke ja sitä ? viljeltiin suuremmassa mitassa. Tästä eristetty plasmidi pii- *«« « l*‘*;30 kottiin restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI. DNA erotet-»·· tiin l%:lla agaroosigeelillä ja pienempi fragmentti eristettiin t * * ' geelistä elektroeluoimalla. Tämä noin 460 bp pitkä EcoRI-BamHI- DNA-fragmentti sekvenssoitiin Sangerin menetelmällä (F. Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (1977) 5463-5467). Tällä tavoin 35 analysoiduille plasmidille annettiin nimeksi pRHIOO.

li 51 99116

7. Synteettisen EqlFN-y-geenin vienti ekspressioplasmidiin pRHIOO

10 μg plasmidia pRHIOO pilkotaan täydellisesti 100 μΐ-.ssa reak-5 tiopuskuria Sacl:lla ja entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla 10 minuuttia 70°C:ssa. Ylipitkät DNA-päät tasataan käsittelemällä Klenowin fragmentilla (Amersham) , kun mukana on 10 μτη kutakin neljää desoksinukleotiditrifosfaattia (30 minuuttia, 25°C). Reaktio pysäytetään uuttamalla fenoli/kloroformilla ja 10 DNA väkevöidään saostamalla etanolilla. Näiden käsittelyjen avulla muodostuu tryptofaanipromoottoriin liittyen tylppä DNA-pää, joka päättyy translaation aloituskodoniin "ATG". Lineari-soitu plasmidi-DNA jälkipilkotaan BamHI:lla ja vektoriosa eristetään agaroosigeelistä elektroforeettisen erottamisen jälkeen. 15 50 ng edellä kuvatulla tavalla esivalmistettua pRHIOO plasmi-divektoria sekoitettiin 20 pmoolin kanssa ligatoituja oligo-nukleotideja EG-1 - EG-8 ja EG-9 - EG-14 ja inkuboidaan 24 tun-)’*ti tia 14°C:ssa 10 μΙ’.εβΆ ligatointipuskuria (66 mM Tris-HCl pH | 20 7,2, 100 mM NaCl, · 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM ditiotreiitti, 1 mM ATP) yhden yksikön kanssa T4 DNA-ligaasia (Boehringer . Mannheim). Tällä ligatointiseoksella transformoidaan kalsium- ; kloridikäsittelyllä kompotentiksi tehty E.coli JM101 ja inku- i . . boidaan yön yli 37°C:ssa. Saaduista transformanteista eriste- 25 tään plasmidi-DNA minipreparointimenetelmällä ja rakenne selvi-tetään HindiII-BamHI-insertin restriktioanalyysin ja sekvens- ♦ 4 soinnin avulla. Plasmidille, jolla on valmiin EqIFN-y:n eks- • ♦ · *·* pressoinnille haluttu rakenne, annetaan nimeksi pEqG-YYCl. Täy- l sin analogisella tavalla kloonataan oligonukleotidit EG-15,16, l'm': 30 EG-3 - EG-8 ja EG-9 - EG-14 pRHIOO-vektoriin, jotta saataisiin kolmen aminohapon verran lyhennetty EqIFN-γ. Rakenteeltaan ha- « · ' lutulle plasmidille annetaan nimeksi pEqG-QAAl.

35 99116 52 8. E.coli JM101 bakteereiden. -jotka sisältävät plasmidin pEqG-YYC1 tai pEqG-OAAl. interferoniaktiivisuuden ekspressio 100 ml bakteeriviljelmää inkuboidaan 37°C:ssa voimakkaasti 5 ravistellen seuraavassa tryptofaanittomassa alustassa (luvut alustalitraa kohti): 10 g (ΝΗ4)2Ρ04, 3,5 g KH2P04 pH 7,3 NaOH:lla, 0,5 g NaCl, 21 g cakaminohapot (happohydrolysoidut), 20 mg L-kysteiini, 20 mg 3-β-indoliakryylihappo (IAA, trypto-faanioperonin indusori) haluttaessa 50 - 100 mg ampisilliini.

10 Tämän jälkeen bakteerit pelletoidaan sentrifugoimalla 5 minuuttia nopeudella 4000 kierrosta minuutissa, suspendoidaan 1/10 viljelytilavuudella jääkylmään 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 30 mM NaCl -puskuria ja hajotetaan jäissä jäähdyttäen 2 kertaa 30 sekunnin ajan ultraäänielektrodin avulla (20 kHz, 100 Wattia).

15 Solujäännökset poistetaan 10 minuutin aikana nopeudella 10000 kierrosta minuutissa (4°C) ja steriilisuodatuksen jälkeen testataan supernatantista interferoniaktiivisuus määrityksessä, joka mittaa VS-viruksen (Vesicular Stomatitis virus) tai EMC-viruksen (Encephalomyocarditis virus) sytopaattisen vaikutuksen /,'20 (CPE).

i

Testaussvsteemi: ii. · t ! I .

, . NBL-6 solut (ATCC CCL 57, hevosen ihon epidermisolut)/VSV A549 < i I «

’ ‘ 25 (ATCC CCL 185, ihmisen keuhkokarsinooma-solulinja)/EMCV

9· • « • A 549-solujen tiitteri normitetaan ihmisen interferonistandar-« · * • t · ’ din avulla kansainvälisiksi yksiköiksi.

« « • · · ' · i · t“’i30 9. Ekspressoitujen hevos-interferonien osoittaminen leimaamalla

f II

proteiinit maksisoluissa • * · “ ♦ *

« I

I I I .

Plasmidikoodattuja proteiineja voidaan leimata selektiivisesti in vivo käyttämällä maksisolutekniikkaa. E.coli CSR603 trans-35 formoidaan tavanomaisella menetelmällä ekspressioplasmideilla ja transformoidut bakteerit selektoidaan ambisilliinipitoisella 99116 53 agar-maljoilla. Maksisolujen valmistaminen ja proteiinien leimaaminen tapahtuu A. Sancarin (a.a.o.) ohjeen mukaisesti. Soluja viljellään 15 ml:ssa alustaa (kts. esimerkki 8) ilman indo-liakryylihappoa 37°C:ssa optiseen tiheyteen OD600nni=0,5 asti ja 5 10 ml tätä viljelmää säteilytetään petrimaljalla 5 sekuntia 50 cm:n etäisyydeltä UV-germisidi-lampulla (15 wattia) samalla käännellen ja inkuboidaan edelleen 1 tunti 37°C:ssa. Viljelmiin lisätään 100 ^g/ml D-sykloseriiniä, inkuboidaan 14 tuntia 37°C:ssa ja sen jälkeen bakteereista poistetaan tumat sentrifu-10 goimalla. Solut pestään 2 kertaa 5 ml :11a Hershey-suolaliuosta, suspendoidaan 5 ml:aan Hershey-alustaa, jossa on 20 μg/ml indoliakryylihappoa, ja inkuboidaan 2 tuntia 37°C:ssa. Jokaiseen viljelmään lisätään 5 ^Ci/ml 35S-metioniinia (1000 Ci/mMol) ja ravistellaan 1 tunti 37°C:ssa. Solusta poistetaan tumat SDS-15 liuoksessa ja lyysataan 2-merkaptoetanoli-pitoisessa elektro-foreesi-koetinpuskurissa ja proteiinit erotetaan 15%:11a poly-akryyliamidigeelillä.

Hershey-suolaliuos Hershey-alusta (100 ml:aa : “20 (litraa kohti) kohti Hershey-suolaliuosta)

• I

« ( i I l 5,4 g NaCl 2 ml 20 % glukoosi ·,· : 3,0 g KCl 0,5 ml 2 % treoniini : 1,1 g NH4C1 1,0 ml 1 % leusiini :::25 15 mg CaCl2.2H20 1,0 ml 2 % proliini 0,2 g MgCl2·6H20 1,0 ml 2 % arginiini j*. # 0,2 mg FeCl3.6H20 0,1 ml 0,1% tiamiini .·*.·. 87 mg KH2P04 12,1 g Tris-HCl pH 7,4 • · · *·· *30 • · · • · *···* Kuivatun geelin autoradiogrammi valmistetaan 2 päivän jälkeen : ; valottamalla DuPont Cronex röntgenfilmillä käyttämällä Kodak ·;·: Lanex-Regular vahvistusfoliota -80°C:ssa. Molekyylipainostan- dardina käytetään 14C-metyloitua proteiiniseosta (Amersham).

35 Kontrolleina toimivat plasmidi pER103, joka sisältää nyt pro- 99116 54 moottorin ilman interferonigeeniä, ja plasmidi pER2l/l, joka sisältää kaksi kopiota humaani IFN-a2arg-geeniä.

10. EqIFN-v:n kanssa hvbridisoituvien sekvenssien osoittaminen 5 qenomisessa hevos-DNA:ssa

Seuraavalla tavalla osoitetaan niiden sekvenssien kokonaismäärä hevosgenomissa, joilla on korkea homologia interferonigeenin EqIFN-γ kanssa. 30 μg suurimolekyylistä hevos-DNA:a (esimerkki 10 1) pilkotaan täydellisesti 100 yksiköllä vastaavaa restriktio- entsyymiä 300 μ1:η reaktiotilavuuksissa ja kulloinkin erotetaan koon perusteella 10 μg tätä pilkottua DNA:a rataa kohti 0,8%:11a agaroosigeelillä.

15 DNA Southern-siirretään nitroselluloosasuodattimille, denaturoidaan ja kiinnitetään, minkä jälkeen jokainen suodatin hybri-disoidaan noin 6xl06 cpm radioaktiivisesti leimatun "koettimen" kanssa (17 tuntia 65°C:ssa, 5 x SSC, 5 x Denhardtin liuos, .. 0,1% SDS, 20 μg/ml denaturoitua lohensiittiö-DNA:a). EqlFN-ym *t 20 "koettimena" käytetään plasmidista pEqG-YYCl saatua fragment-'' tia, joka sisältää koko valmista interferonia koodaavan sek- ·· venssin. Tämän jälkeen suodattimet pestään stringenteissä olo- isuhteissa: 4 x 45 minuuttia 65°C:ssa seoksella: 45 mM NaCl, i ' 4,5 mM Na3 sitraatti), 0,1% SDS. Autoradiografia tapahtuu V.;25 Du-Pont Cronex röntgenfilmillä käyttämällä Kodak Lanex-Regular vahvistusfolioita 7 päivää -80°C:ssa.

• · • · · • 11. Hevos-interferonien (OAA) eksoressio E.coli HBlOl/pEaGr . OAA2 : ssa ia HB101/pEctG-QAA3 : ssa • « · I _ .

... 30 : : *1* Jotta ekspressio saataisiin paremmaksi, käytettiin a) parannet-: tuja ekspressiovektoreita ja b) parannettua ribosomaalista si- toutumiskohtaa. Parannetut ekspressiovektorit perustuvat Serra-tia marcescens -bakteerista (Sma) saatuun trp-promoottoriin, 35 joka yksi emäs vaihtamalla tulee -35 alueella yhtäläiseksi yhteisen -35 alueen kanssa (pRH281), tai hybridi-trp-promootto- 55 99116 riin, jossa on Escherichia coli -bakteerin (Eco) ensimmäinen A/T-rikasalue tai toinen A/T-rikasalue plus Sma:n promoottori (pRTH282, S. Itoh, Gene 44 (1966), 29-36) . Ribosomaalisina sitoutumiskohtina käytettiin E.coli enterotoksiini II:n kohtia.

5 a) pRH28l/5

Seuraavat oligonukleotidit valmistettiin Applied Biosystems DNA Synthesizer 381A laitteen avulla: 10

Trp-1: 5'-AATTGACGCTG-3 '

Trp-3: 5'-ATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGATTGACATTGCCTTCGCGAACCA GTTAACTAGTACACA-3'

Trp-5: 5'-AGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCAT-3' 15 Trp-2: 5'-TTAGCGATCAGCGTC-3'

Trp-4: 5'-CGTGAACTTGTGTACTAGTTAACTGGTTCGCGAAGGCAATGTCAACCCT CTTTTTGCACAATGTT_3,

Trp-6: 5'-CGATGAATTCGAGCTCATATTAAACCTCCTTACCGTCTCGAGC-3' • ’’20 100 pmoolia kutakin oligonukleotidia Trp-2 - Trp-5 fosforyloi- • · ' *· ' tiin erikseen 10 μΐ-.ssa.. Trp-1 ja -2, Trp-3 ja -4 sekä Trp-5 < < * ·« < ja -6 hybridisoitiin kiehauttamalla ja jäähdyttämättä hitaas- : ti. Oligonukleotidipariliuokset yhdistettiin ja ligatoitiin I t i ·' lisäämällä T4-DNA-ligaasia. 3 μg pAT153:a kaksoispilkottiin V.*25 EcoRIrlla ja Clal:lla. Suuren fragmentin puhdistamisen jälkeen tähän lisättiin noin 20 pmoolia oligonukleotideja ja ligatoi- tiin. Tämän jälkeen DNA transformoitiin E.coli HB101:ssa ja joidenkin saatujen pesäkkeiden plasmidit eristettiin. Promoot- . torin sisältä Pst-HindIII-fragmentti sekvensoitiin. Halutun • · · -- *I!.*30 sekvenssin toteamisen jälkeen voitiin yksi plasmidi ja tälle t : T annettiin nimeksi pRH28l/5.

• · · "·"· Promoottoriosan sekvenssi on: 35 -35 56 99116

5'-GAATTGACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGC 3'-CTTAACTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACG

5 Xhol -10 Itranskription alku

CTTCGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAG GAAGCGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTC

10 RBS SstI EcoRI Clal GAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCATCGAT-3' CTCCAAATTATACTCGAGCTTAAGTAGCTA-5'

Uuden ekspressiovektorin etuja ovat: 15 1) optimaalinen -35 alue trp-Sma promoottorissa 2) ainutkertainen Xhol-kohta ennen ribosomaalista sitoutumiskohtaa (RBS) mahdollistaa RBS:n vaihtamisen toiseen : 20 ;' 3) ekspressioplasmidi sisältää yhden translaation aloituskohdan ATG viiden nukleotidin verran RBS:n jälkeen I ' 4) tämä ATG:n G on SstsI-tunnistamissekvenssin (GAGCTC) ensim- : : 25 mäinen emäs. Katkaisemalla Sstl:lla ja sen jälkeen muodos tamalla suora pää saadaan käyttöön ekspressiovektori, jolla on translaation aloitusviiva ATG ja jonka viereen voidaan ligatoida vieras geeni alkaen lukukehyksen ensimmäisestä . *. emäksestä • I « * · · ... . 30 • · · *·;·* 5) yhdistelmä RBS-ATG ei sisällä lainkaan G:a tai C:a 6) alkuperäinen EcoRI-katkaisukohta tuhottiin valitsemalla oligonukleotidisekvenssi 5'-päähän. Promoottorin 31-päähän 35 voidaan siten muodostaa monikloonauskohta, joka muodostuu li 57 99116

Sstlrsta, EcoRIrsta, Clalrsta ja HindIII:sta (jo pAT153-osassa).

b) pRH282/5 5

Samalla tavoin rakennettiin ekspressiovektori pRH282/5. Oli-gonukleotidit Trp-1 ja Trp-2 korvattiin oligonukleotideilla Trp-7 ja Trp-8: 10 Trp-7:5'-AATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATCATGCT-3'

Trp-8:5'-TTAGCGATCAGCATGATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGC-3'

Promoottoriosan sekvenssi pRH282/5:ssa on:

15 5'-GAATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATCATGCTGAT

3'-CTTAACGGGCAAGACCTATTACAAAAAACGCGGCTGTAGTAGTACGACTA

-35

CGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGCCTTCGCGAACCAGT '20 GCGATTTTGTAACACGTTTTT CTC C CAACTGTAACGGAAGCGCTTGGTCA

XhoI

-10 (transkription alku RBS

! ' TAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGA

\:· 2 5 ATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTCCTCCAAATTATACT

SstI EcoRI Clal GCTCGAATTCATCGAT-3' ; . CGAGCTTAAGTAGCTA-5· *”.*30 t : c) pGNl 1 μg plasmidia pUC18 kaksoispilkottiin BamHI:lla ja Sali :11a.

10 /xg:sta EqG-QAAl plasmidia eristettiin BamHI-Sall-kaksois-35 pilkkomisen avulla synteettisen hevos-γ-interferoni-geenin toinen puolisko ja tämä defosforyloitiin. Noin 20 nanogrammaa vek- 99116 58 toria ligatoitiin 100 nanogramman kanssa inserttiä ja DNA transformoitiin E.coli JMlOl-.ssa. Yhden pesäkkeen plasmidi tutkittiin pilkkomalla restriktioentsyymeillä ja tälle annettiin nimeksi pGNl.

5 d) pGN3

Synteettisen geenin ensimmäinen puolisko koottiin yhdessä ri-bosomaalisen sitoutumiskohdan kanssa oligonukleotideistä: 10

EqG-1: 5'-AGCTTCCCTCGAGAGGTTGAGGTGATTTATGCAGGCTGCTTTCTTTAAAG

AAATCGAAAACCTGAAAGAATACTTCAACGCTCGTAACCCAGACGTTGGT-3' EqG- 2 : 5'-GACGGTGGTCCGCTGTTCCTGGACATCCTGAAAAACTGGAAAGAAGACTC TGACAAAAAGATCATCCAGTCTCAG-3' 15 EqG-3: 51-ATCGTTTCTTTCTACTTCAAACTGTTCGAAAACCTGAAAGACAACCAGGT TATCCAGAAATCGATGGACACTATCAAAGAAGATCTGTTCGTTAAATTCT TCAACTCGTCGACTCCG-3'

EqG-4: 51-AATTCGGAGTCGACGAGTTGAAGAATTTAACGAACAGATCTTCTTTGATA GTGTCCATCGATTTCTGGATAACCTGGTTGTCTTTCAGGTTTTCGAACAG • " 20 TTTGAAGTAGAAAGAAACGATCTGAGACTG-3'

! · EqG-5: 5'-GATGATCTTTTTGTCAGAGTCTTCTTTCCAGTTTTTCAGGATGTCCAGGA

ACAGCGGACCACCGTCACCAACGTC-3'

EqG-6: 5'-TGGGTTACGAGCGTTGAAGTATTCTTTCAGGTTTTCCATTTCTTTAAAGA AAGCAGCCTGCATAAATCACCTCAACCTCTCGAGGGA-3' l.V 25 50 moolia kutakin oligonukleotidia fosforyloitiin, erityisesti: EqG-2 yhdessä EqG-5:n kanssa 7 μl:ssal EqG-3 ja EqG-8 yksinään kulloinkin 8 μΙ'.ββΆ. Kinaasireaktio pysäytettiin kuumentamalla * 100°C:een. EqG-3:een lisättiin 50 pmoolia EqG-4:aa (1 μΐ) ja • « * *“.*30 EqG-8:aan lisättiin 50 pmoolia EqG-l:a (1 μΐ) ja EqG-8:aan li- i : ”* sättiin 50 pmoolia EqG-l:a {1 μΐ). Nämä liuokset kuumennettiin vielä kerran 100°C:een ja jäähdytettiin hitaasti. Oligonukleo-tidipariliuokset yhdistettiin ja ligatoitiin T4-DNA-ligaasin kanssa yhteensä 30 μ1:3ΏΆ. 2 μg pUC18-plasmidia kaksoispilkot-35 tiin EcoRi:lla ja HindIII:lla, vektoriosa geelipuhdistettiin ja liuotettiin 50 μΐ-.aan vettä. 40 nanogrammaa vektoria ja 59 99116 noin 2 pikomoolia ligatoituja oligonukleotideja lagatoitiin 10 μΐ:ssa ja tämän jälkeen DNA transformoitiin E.coli JM101:ssa.

5 Yhden saadun plasmidin EcoRI-Hindlll-insertti kloonattiin uudelleen plasmidin M13mp9 ja tutkittiin sekvenssi. Valittiin plasmidi, jolla oli odotetunlainen sekvenssi, ja tälle annettiin nimeksi pGN3.

10 e) pGN20

Noin 3 μg plasmideja pGNl ja pGN3 kaksoispilkottiin HindIII:lla ja Sällillä. pGN3:n insertti ja pGNlista saadun Eq-y-interfe-roni-geenin vektori/2. puolisko geelipuhdistettiin. 0,2 μg pGN-15 3-plasmidia ligatoitiin noin 0,05 μg:n kanssa pGN3-inserttiä ja DNA transformoitiin E.coli JMlOlissa. Saadun kloonin plasmidi valittiin restriktiokuvion tutkimisen jälkeen ja tälle annettiin nimeksi pGN20.

\ " 20 f) pEqG-QAA2 tai pEqG-QAA3 · Noin 10 μg:sta plasmidia pGN20 eristettiin XhoI-EcoRI-insertti, joka sisältää synteettisen hevos-γ-interferoni-geenin yhdessä : E.coli enterotoksiini II:n ribosomaalisen sitoutumiskohdan l.1.125 kanssa (C.H. Lee et ai., Infect. Immun. 42 (1983), 264-268; S.L. Moseley et ai., Infect. Immun. 39 (1983), 1167-1174)).

• 1.. pRH28l/5 tai pRH282/5 kaksoispilkottiin Xholilla ja EcoRIilla.

« ♦ · : : : 20 nanogrammaa vektoria ligatoitiin 20 nanogramman kanssa in- • serttiä ja DNA transformoitiin E.coli HBiOlissa. Valittiin • « · 35 11.130 muutama pesäke, eristettiin plasmidit ja nämä tutkittiin res-t · *11 triktioanalyysin avulla. Kulloinkin valittiin yksi plasmidi • « m ja tälle annettiin nimeksi pEqG-QAA2 (vektori: pRH281/5) tai pEqG-QAA3 (vektori pRH282/5).

99116 60 g) Lysaattitesti interferoni-γ-aktiivisuudelle Yön yli vanha E.coli HB101/pEqG-QAA2 tai HB101/pEqG-QAA3-viljelmä laimennettiin 1:100 LB/Amp:lla (LB: 10 g/1 tryptoni, 5 5 g/1 hiivauute, 5 g/1 NaCl, 50 mg/1 ampisilliini) ja inkuboi- tiin edelleen 37°C:ssa. Kun optiseksi tiheydeksi (600 nm) oli saavutettu 0,3, lisättiin 50 mg/1 indoliakryylihappoa ja viljelmää inkuboitiin vielä 2 tuntia 37°C:ssa. Bakteerit erotettiin sentrifugoimalla ja hajotettiin ultraäänen avulla. Sterii-10 lisuodatetusta supernatantista testattiin NBL-6 soluilla (ATCC CCL 57) γ-interferoniaktiivisuus, jolloin viruksena käytettiin VSV (Vesicular Stomatitis virus) -virusta. Kummankin transformoidun bakteeriviljelmän (E.coli HB101/pEqG-QAA2 tai HB101/pEqG-QAA3) lysaattien interferoniaktiivisuudet olivat 15 noin 0,1 - 1 miljoonaa yksikköä/ml. Kontrollia varten testattiin identtisesti valmistettu E.coli HB10l/pRH281 lysaatti.

Tämän kontrollilysaatin aktiivisuus oli alle 100 yksikköä/ml.

i . .

♦ · • « : \.

♦ · · • · • « · * • ·

• · O

• « · • · « · « ♦ ♦ 1 1.

• ♦ ♦ · ·

Claims

99116

1. Rekombinantti DNA-molekyy li, tunnettu siitä, että se käsittää hevos-interferoni-γ:aa koodaavan sekvenssin: 5 R1 TAC TGC CAG GOT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC

10 GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT

15 CAG AAG CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA tai R2 GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC " 20 AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG i i GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG ·'· AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT ATC AAA GAA i GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA V.-25 GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA ♦ m · I*. 30 jolloin R1 on i : « · · ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC TAT, 1 ATG TAT tai 99116 TAT, R2

2. Rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se hybridisoituu jonkin patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-molekyylin kanssa olosuhteissa 6xSSC/5x Denhardt'in li- 15 uos/0,1 % SDS lämpötilassa 65°C (85 % homologia) tai 0,lxSCC/0,01 % SDS/65°C (90 % homologia), jolloin tämä DNA-molekyyli voi olla synteettistä tai puolisynteettistä alkuperää ja joka koodaa EqIFN-γ biologisen ja immunologisen ak-.. tiivisuuden omaavan polypeptidin. 20

3. Rekombinantti-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen DNA- ; molekyylin. l.1 2.‘ 25

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen rekombinantti-DNA-molekyy- li, tunnettu siitä, että saatu DNA-molekyyli liit- • « • 3 tyy funktionaalisesti ekspression kontrollisekvenssiin ja • · · V 1 että se on replikoitavissa prokaryooteissa, erityisesti : .·. E.coli-bakteerissa. ♦ · · ··« · ,‘•‘.30 II 35

5. Escherichia coli-bakteeri, tunnettu siitä, että 2 • · · 3 se on transformoitu jonkin patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukaisella rekombinantti-DNA-molekyylillä, jolloin se on parhaiten E.coli JM101 tai HB101. 99116

5 ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC CAG, ATG CAG tai

10 CAG.

6. Menetelmä valmistaa EqIFN-γ, tunnettu siitä, että a) Escherichia coli-bakteeri transformoidaan patenttivaatimuksen 1-4 mukaisella DNA-molekyylilla, 5 b) transformoituja bakteereja viljellään sopivassa viljely-alustassa ja c) mainittu polypeptidi eristetään. i < ( l . . « · • · • · • « · • « e • « • · « 9 « t • · ' • · · c- • · · i : • « « 1 · ♦ 99116