SK902006A3 - Spôsob fermentácie polymyxínu B pomocou produkčného mikroorganizmu Bacillus polymyxa - Google Patents

Description

Produkčný mikroorganizmus: Bacillus polymyxa

Publikované patenty týkajúce sa oblasti fermentácie polymyxínu B biosyntézou pomocou kmeňa Bacilluspolymyxa sú nasledovné:

1. United states patent office 2,595,605

V patente je popísané zloženie fermentačného média. Prídavok kukuričnej múky zvýšil produkciu antibiotika z 1200 IU/ml na 1800 - 2000 IU/ml za 88 h kultivácie, čo zodpovedá koncentrácii polymyxínu 0,251 g/1, stanoveného metódou kvapalinovej chromatografie, vzhľadom na vtedajší stupeň poznania nie je spomenuté, o aký konkrétny typ polymyxínu sa jedná.

2. United states patent office 2,5 71,104

V patente je opísaný mutagénny účinok UV žiarenia na bunky produkčného kmeňa, čím sa získal izolát s 5-násobne vyššiou produkciou polymyxínu oproti rodičovským izolátom. Získaný izolát má označenie Bacillus polymyxa NRRL B-719, je stabilný, svoje produkčné vlastnosti si zachováva po 40. generáciu, asimiluje nasledovné uhlíkaté substráty: glukóza, xylóza, škrob, ako zdroj aminokyselín je vhodný com-steep, arašidová múka, sójová múka, kvasničný extrakt, mleté zrno.

V patente je popísaný i spôsob jednorázového príkrmu fermentačného média v 72. hodine kultivácie. Uvádzaná dosiahnutá výťažnosť polymyxínu 1000 IU/ml za 116 h kultivácie zodpovedá koncentrácii 0,125 g/1.

3. United states patent office 2,602,041

Patent popisuje zlepšený izolačný proces a umŕtvovanie buniek producenta pomocou 0,4 % roztoku chloroformu.

Podľa vykonanej patentovej rešerše bol nájdený ruský patent, týkajúci sa spôsobu fermentácie polymyxínu M a japonské patenty, týkajúce sa fermentácie polymyxínov F, TI, SI.

Podstata vynálezu

Vynález sa vzťahuje na vedenie fermentačného procesu s dosiahnutím produkcie antibiotika Polymyxín B v koncentrácii 2,8 g/1 dosiahnutej v laboratórnom fermentore o objeme 801.

Produkčný kmeň Bacillus polymyxa rastie na agarovej pôde, ktorej hlavným zdrojom aminokyselín je sójová múka. Bakteriálna suspenzia produkčného kmeňa naočkovaná na Petriho misky s agarovou pôdou sa kultivuje v termostate pri teplote 28°C po dobu od 68 do 72 h. V laboratórnom meradle fermentácia prebieha na trepacom stroji pri miešaní 240 ot/min pri teplote 28°C. Najlepšie izoláty dosahujú produkciu cca 1,8 g polymyxínu B/ 1 filtrátu fermentačnej pôdy, stanovených metódou HPLC za 30 hodín kultivácie s vyhovujúcim zastúpením jednotlivých polymyxínov a s tvorbou vedľajšieho produktu do 3 %.

Inokulum v objeme od 1 do 10 % z objemu fermentačného média sa kultivuje vinokulačnom fermentore. Inokulačné médium, zloženie ktorého môže byť zhodné s produkčným médiom, sa očkuje od 0,05 % do 1 % bakteriálnej suspenzie, pripravenej zo šikmých agarov. Kultivácia prebieha za prísne aseptických podmienok od 18 do 24 h za pretlaku od 40 do 50 kPa, vzdušnenia od 0,4 do 1 wm a intenzívneho miešania. Pre dobre narastené inokulum je charakteristické: pH v oblasti od 5,2 do 6,5 v závislosti od použitej pôdy, pohyblivé krátke tyčinky produkčného mikroorganizmu v exponenciálnej fáze rastovej krivky.

Narastené inokulum je naočkované do sterilného produkčného média v objeme od 1 do 10 %. Podmienky pre fermentáciu polymyxínu v produkčnom fermentore sú: pretlak od 40 do 70 kPa, vzdušnenie od 0,5 do 0,8 wm, regulácia pH v rozpätí od 5,2 do 5,6 roztokom čpavku, udržiavanie koncentrácie glukózy v rozmedzí od 0,5 do 2,5 g/1 pomocou kontinuálneho dávkovania roztoku glukózy (60%), udržiavanie koncentrácie amoniakálnych iónov v rozmedzí od 0,3 do 0,6 g/1 pomocou dávkovania roztoku síranu amónneho (20%), v prípade penenia dávkovanie rastlinného a syntetického odpeňovadla. Celý proces fermentácie prebieha za prísnych aseptických podmienok. Počas fermentácie sa koncentrácia rozpusteného kyslíka vo fermentačnej pôde udržuje nad 30 % nasýtenia. Zdrojom aminokyselín vo fermentačnom médiu sú sójová múka v koncentrácii od 0,5 do 2,0 %, pšeničná múka od 0,5 do 5%, pšeničné otruby v koncentrácii 5 až 15 g/1, comsteep od 0,2 do 2,5 %, ďalšie zložky sú glukóza v koncentrácii od 0,5 do 5 %, síran amónny od 0,1 do 1 %, dihydrofosforečnan draselný od 0,01 do 0,1%, heptahydrát síranu horečnatého od 0,01% do 0,1%, heptahydrát síranu železnatého od 0,001 do 0,01%, mikroelementy a vitamíny B v minimálnych koncentráciách. Fermentáciu považujeme za ukončenú pri náhlom vzostupe koncentrácie rozpusteného kyslíka a zastavení utilizácie glukózy.

Uvedený postup vedenia fermentačného procesu s produkčným kmeňom Bacillus polymyxa v štvrťprevádzkových objemoch do 35 1 fermentačnej pôdy obvykle trvá od 40 do 55 h. Dosiahnuté výťažnosti polymyxínu vo filtráte fermentačnej pôdy sú na úrovni od 1,8 do 2,8 g polymyxínu /1 filtrátu fermentačnej pôdy stanovené metódou HPLC. Takto popísaná fermentačná technológia, zloženie fermentačných médií a výťažnosti polymyxínu doposiaľ neboli patentované.

Popis kmeňa: Bacilluspolymyxa

Morfológia: - gram-pozitívne sporulujúce tyčinky Optimálne pH kultivácie: od 5 do 7

Utilizácia uhlíkatého substrátu: dobre utilizuje glukózu

Utilizácia aminokyselín z organických zdrojov: sójová múka, pšeničná múka, pšeničné otruby, com-steep

Optimálna teplota kultivácie: 28 ± 1°C Zastúpenie polymyxínov: BI. BII, B2, B3

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Vegetatívne inokulum sa kultivuje v laboratórnych fermentoroch s objemom 30 1 po dobu 18 až 20 hodín pri teplote 28°C pri miešaní od 200 do 300 ot./min v inokulačnej pôde zloženia: com-steep liquid 20 g/1, glukóza 50 g/1, síran amónny 4 g/1, uhličitan vápenatý 3 g/1, chlorid sodný 1 g/1, pH pôdy sa upraví pred sterilizáciou na hodnotu 6,8 až 7,0. Inokulum sa očkuje 0,1 % bakteriálnej suspenzie produkčného kmeňa Bacillus polymyxa pripravenej zo šikmého agaru. Fermentácia polymyxínu prebieha v laboratórnom fermentore plnenom 35 1 fermentačnej pôdy zloženia: pšeničná múka 12 g/1, sójová múka 12 g/1, glukóza 15 g/1, síran amónny 3 g/1, dihydrofosforečnan draselný 0,3 g/1, uhličitan vápenatý 1 g/1, pH pôdy sa upraví pred sterilizáciou na 6,8 až 7,0. Pôda sa naočkuje 4 % vegetatívneho inokula a kultivuje sa pri teplote 28°C, vzdušnení od 21 do 28 1, pretlaku 40 až 60 kPa. Intenzita miešania v priebehu fermentácie sa reguluje tak, aby bola zabezpečená saturácia rozpusteného kyslíka v pôde minimálne 60 %. Od 22. hodiny kultivácie sa prikrmuje roztokom glukózy na koncentráciu 1,5 až 2,5 g/1 a roztokom síranu amónneho na koncentráciu amoniakálnych iónov od 0,3 do 0,5 g/1. Pri poklese pH fermentačnej pôdy na hodnotu

5,2 sa dávkuje čpavková voda na udržanie hodnôt pH v rozmedzí od 5,2 do 5,6. Fermentačná pôda sa odpeňuje rastlinným olejom a syntetickým odpeňovadlom. Za týchto podmienok produkčný kmeň Bacilluspolymyxa dosahuje výťažnosť 2,3 g polymyxínu v 1 1 filtrátu fermentačnej pôdy.

Príklad 2

Vegetatívne inokulum sa kultivuje v laboratórnych fermentoroch s objemom 30 1 20 hodín na inokulačnej pôde zloženia: com-steep liquid 20 g/1, glukóza 20 g/1, síran amónny 4 g/1, uhličitan vápenatý 3 g/1, chlorid sodný 1 g/1, za rovnakých podmienok ako je uvedené v príklade 1.

Fermentácia polymyxínu prebieha v laboratórnom fermentore plnenom 35 1 fermentačnej pôdy zloženia: pšeničná múka 40 g/1, pšeničné otruby 10 g/1, glukóza 15 g/1, síran amónny 4 g/1, dihydrofosforečnan draselný 0,3 g/1, uhličitan vápenatý 3 g/1, pH pôdy sa upraví pred sterilizáciou na 6,8 až 7,0. Pôda sa naočkuje 4% vegetatívneho inokula a kultivuje sa pri teplote 28°C a podmienok ako je uvedené v príklade 1. Za týchto podmienok produkčný kmeň Bacilluspolymyxa dosahuje výťažnosť 2,4 g polymyxínu B /1 filtrátu fermentačnej pôdy.

Príklad 3

Vegetatívne inokulum sa pripravuje v dvoch stupňoch. Inokulačná pôda v oboch stupňoch obsahuje: com-steep, síran amónny, uhličitan vápenatý a glukózu, pH pôdy sa upraví pred sterilizáciou na hodnotu 6,8 až 7,0. Prvý stupeň inokula sa očkuje 1,0 % bakteriálnej suspenzie produkčného kmeňa Bacillus polymyxa zo šikmého agaru. Kultivuje sa v Erlenmayerových bankách na trepacom stroji pri teplote 28°a miešaní 240 ot/min po dobu 14 až 18 hodín. Vegetatívne inokulum sa v množstve 0,1% preočkuje do druhého inokulačného stupňa a kultivuje v laboratórnom fermentore 14 až 18 h. Vegetatívne inokulum v objeme 4 % sa naočkuje do fermentačnej pôdy nasledovného zloženia: pšeničná múka 12 g/1, sójová múka 12 g/1, glukóza 15 g/1, síran amónny 3 g/1, dihydrofosforečnan draselný 0,3 g/1, uhličitan vápenatý 1 g/1, pH pôdy sa upraví pred sterilizáciou na 6,8 až 7,0. Fermentácia v objeme 35 1 prebieha 44 až 54 hodín za podmienok ako je uvedené v príklade 1 a 2. Fermentácia je ukončená pri zastavení utilizácie glukózy, zastavení biosyntézy polymyxínu B a náhleho vzostupu koncentrácie kyslíka vo fermentačnej pôde. Za týchto podmienok produkčný kmeň Bacillus polymyxa dosahuje výťažnosť

2,8 g polymyxínu B/l filtrátu fermentačnej pôdy.

Priemyselná využiteľnosť

Produkčný mikroorganizmus Bacillus polymyxa počas fermentácie v priemyselnej výrobe produkuje antibiotikum polymyxín B v koncentrácii od 1,8 do 2,8 g /1 filtrátu fermentačnej pôdy.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob kultivácie produkčného mikroorganizmu Bacillus polymyxa sa vyznačuje tým, že kultivácia sa realizuje pri teplote 28°C vo fermentore miešaním a prevzdušňovaním fermentačnej pôdy, pričom počas kultivácie sa udržiava hodnota pH v rozmedzí 5,3 až 5,6, koncentrácia glukózy pomocou glukózového roztoku na úrovni 0,5 až 2,5 g/Ί, koncentrácia amoniakálnych iónov na úrovni 0,25 až 0,5 g/1 a dosiahnutá koncentrácia produkovaného polymyxínu B je v rozpätí 1,8 až
2. 2,8 g na 11 filtrátu fermentačnej pôdy za 44 až 56 hodín kultivácie stanovených metódou HPLC.

   2. Spôsob podľa nároku 1 sa vyznačuje tým, že kultivácia sa vykonáva vo fermentačnej pôde s počiatočnou koncentráciou fosfátu v rozpätí 50 až 80 mg/1.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1 a 2 sa vyznačuje tým, že kultivácia sa vykonáva vo fermentačnej pôde s počiatočnou koncentráciou glukózy v rozpätí 10 až 20 g/1.
4. 4. Spôsob podľa nároku 1, 2 a 3 sa vyznačuje tým, že kultivácia sa vykonáva vo fermentačnej pôde s počiatočnou koncentráciou amoniakálnych iónov v rozpätí 0,5 až 1,5 g/1.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3 a 4 sa vyznačuje tým, že v priebehu fermentácie sa udržuje pH pôdy roztokom čpavku.
6. 6. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3, 4 a 5 sa vyznačuje tým, že fermentačná pôda sa naočkuje vegetatívnym inokulom v množstve od 1 do 10% objemu fermentačnej pôdy.
7. 7. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3, 4, 5 a 6 sa vyznačuje tým, že počas fermentácie sa intenzita miešania reguluje tak, aby bola zabezpečená saturácia rozpusteného kyslíka v pôde na hodnotu minimálne 60%.
8. 8. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6, a 7 sa vyznačuje tým, že inokulum sa očkuje bakteriálnou suspenziou v množstve od 0,05 % do 1% objemu inokulačnej pôdy.
9. 9. Spôsob podľa nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 8 sa vyznačuje tým, že inokulum je kultivované v 1 alebo v 2 stupňovom procese.