SK8492002A3 - Angiogenesis and vascular permeability modulators and inhibitors - Google Patents

Description

Modulátory a inhibítory angiogenézy a vaskulárnej premeability

Oblasť techniky

Predkladaná patentová prihláška si uplatňuje prioritu série patentových prihlášok U.S. s číslom 09/470,881 podanej 22. decembra 1999, a 09/538,248, podanej 29. marca 2000, pričom si obe patentové -prihlášky uplatňujú prioritu medzinárodnej patentovej prihlášky číslo PCT/US99/11780, v ktorej je dezignované USA, podanej 28. mája 1999, a ktorá si uplatňuje prioritu provizórnej US patentovej série číslo 60/087,220 podanej 29. mája 1998.

Časť práce tohto projektu bola čiastočne podporená grantmi od NIH v mene Spojených štátov amerických. Preto má vláda Spojených štátov amerických určité práva na tento vynález.

Predkladaný vynález sa týka všeobecne oblasti medicíny a špecificky sa týka spôsobov a kompozícií na moduláciu a inhibíciu vaskulárnej permeability (VP).

Doterajší stav techniky

Angiogenéza je proces vaskularizácie tkaniva, ktorý zahŕňa rast nových vyvíjajúcich sa krvných ciev do tkaniva a tiež sa označuje ako neovaskularizácia. Tento proces je sprostredkovaný infiltráciou endotelových buniek a buniek hladkého svalstva. Tento proces postupuje ktorýmkolvek z troch spôsobov: cievy môžu pučať z už existujúcich ciev, de novo vývoj ciev môže nastať z prekurzorových buniek (vaskulogenéza) alebo existujúce malé cievy sa môžu zväčšiť v priemere. Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990). Aby nastala angiogenéza, musia endotelové bunky najprv degradovať a prestúpiť bazálnou membránou krvnej cievy podobným spôsobom ako tumorové bunky počas invázie a tvorby metastáz. Angiogenéza sa všeobecne nevyskytuje u dospelých a zrelých tkanív, avšak dochádza k nej pri hojení poranení a pri rastovom cykle žltého telieska (corpus luteum). Pozri napr. Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990).

Zatiaľ čo angiogenéza je dôležitý proces pri neonatálnom raste, tiež je dôležitá pri hojení rán a je faktorom v patogenéze širokej palety klinických ochorení vrátane zápalu tkaniva, artritídy, tumorového rastu, diabetickej retinopatie, makulárnej degenerácie neovaskularizáciou retiny a podobných stavov. Tieto klinické prejavy spojené s angiogenézou sa označujú ako angiogenetické ochorenia. Folkman et al., Science, 235:442-447 (1987).

Bolo navrhnuté, že inhibícia angiogenézy by bola vhodnou terapiou na zamedzenie rastu tumoru. Inhibícia angiogenézy bola navrhnutá spôsobmi: (1) inhibíciou uvoľňovania „angiogenetických molekúl ako je bFGF (základný fibroblastový rastový faktor), (2) neutralizáciou angiogenetických molekúl napr. použitím anti-pbFGF protilátok, (3) použitím inhibítorov vitronektínového receptora α_νβ3 a (4) inhibíciou odpovede endotelových buniek na angiogenetický podnet. Posledne menovaná stratégia získala pozornosť, Folkman et al., Cancer Biology, 3:89-96 (1992) opísali niekoľko inhibítorov odpovede endotelových buniek vrátane inhibítorov kolagenázy, inhibítorov obratu (turnover) bazálnej membrány, angiostatických steroidov, inhibítorov angiogenézy odvodených z plesní/húb, trombocytový faktor 4, trombospondín, lieky na artritídu ako je D-penicillamine a zlatý tiomalát (gold thiomalate), analógy vitamínu D₃, interferón alfa a podobné látky, ktoré by sa mohli použiť na inhibíciu angiogenézy. Pre ďalšie navrhnuté inhibítory angiogenézy pozri Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990) a U.S. patenty číslo 5,092,885; 5,112,946; 5,192,744; 5,202,352 a 5,766,591. Avšak žiadny z inhibítorov angiogenézy opísaný v prechádzajúcich odkazoch nezahŕňa proteíny Src.

Už je uvedené predtýmto, že angiogenéza závisí od interakcie medzi vaskulárnymi integrínmi a proteínmi extracelulárneho matrix. Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994). Okrem toho je uvedené, že programovaná smrť bunky, apoptóza, angiogenetických vaskulárnych buniek je iniciovaná interakciou, ktorá by bola inhibovaná určitými antagonistami vaskulárneho integrínu α_νβ₃. Brooks et al., Celí, 79:1157-1164 (1994). V súčasnosti sa uvádza, že viazanie matrixovej metaloproteináz.y-2 (MMP-2) na vitronektínový receptor α_νβ₅ sa môže inhibovať použitím antagonistov α_νβ₅ a takto inhibovať enzýmovú funkciu proteinázy. Brooks et al., Celí, 85:683-693 (1996). Integríny a_v sú známe ako dôležité komponenty v prežívaní endotelovej bunky v angiogenetických krvných cievach. Špecifické integrínové antagonisty integrínu a_v blokujú samostatný rastový faktor dráh indukovanej angiogenézy. Napríklad angiogenéza indukovaná vaskulárnym endotelovým rastovým faktorom (VEGF) je blokovaná antagonistami integrínu α_νβ5, kým angiogenéza indukovaná základným fíbroblastovým rastovým faktorom (bFGF) je blokovaná antagonistami integrínu α_νβ3·

Vaskulatúra mozgu je charakterizovaná vysoko obmedzujúcou hematoencefalickou bariérou, ktorá zabraňuje prepúšťaniu malých molekúl do okolitého mozgového tkaniva. Charakter hematoencefalickej bariéry u cicavcov bol špeciálnou starosťou farmakologických štúdií, pretože mnohé liečivá bežne neprejdú z vaskulatúry do tkaniva mozgu kvôli vysoko obmedzujúcej hematoencefalickej bariére. Predkladaný vynález zahŕňa neočakávaný objav, že VP, meraná vaskulárnym presakovaním krvi, sa môže modulovať pomocou Src alebo Yes. Naviac VP je asociovaná s angiogenézou a inými poruchami. Zápal indukovaný zvýšenou vaskulárnou permeabilitou je asociovaný s edémom a opuchom.·

I

Požiadavka tyrozínkinázovej aktivity Src pre, angiogenézu indukovanú VEGF ale nie idukovanú bFGF ukazuje, že existujú preukazné rozdiely v regulačných a aktivačných signáloch medzi týmito biochemickými dráhami ako na modeli kuracieho embrya tak aj na modeli myši. Eliceiri et al., Molecular Celí, 4:915-924 (1999).

Zmeny vaskulárnej permeability spôsobené angiogenetickými signálmi z tumorových buniek predstavujú model na skúmanie signálnych biochemických dráh spojených s nádorom, avšak vaskulárna permeabilita spôsobená poranením, ochorením alebo inou traumou krvných ciev je významnou príčinou vaskulárneho presakovania a edému spojeného s poškodením tkaniva. Napríklad cerebrovaskulárne ochorenie spojené s cerebrovaskulárnou príhodou (CVA) alebo iným vaskulárnym poranením v mozgu alebo miechových tkanivách sú najbežnejšie príčiny neorologického ochorenia a významným zdrojom postihnutia. Typicky poškodenie mozgu alebo tkaniva miechy v oblasti CVA zahŕňa vaskulárne presakovanie a/alebo edém. CVA môže zahŕňať poranenia zapríčinené ischémiou mozgu, prerušením normálneho krvného toku k mozgu; cerebrálnu nedostatočnosť vďaka krátkodobým poruchám v krvnom toku; infarkt, kvôli embólii alebo trombóze intra a extrakraniálnych artérií; hemorágiu; a artériovenózne malformácie. Ischemický záchvat a cerebrálna hemorágia sa môžu vyvinúť neočakávane a dopad tohto incidentu všeobecne ovplyvňuje poškodenú oblasť mozgu. (Pozri The Merck Manual, 16^th ed. Chp. 123, 1992).

Okrem CVA, infekcie alebo ochorenia centrálneho nervového systému môžu tiež ovplyvňovať krvné cievy mozgu a chrbtice a môžu zahŕňať zápal a edém, ako napríklad pri bakteriálnej meningitíde, vírusovej encefalitíde a tvorbe mozgových abscesov. (Pozri The Merck Manual, 16^th ed. Chp. 125, 1992). Systémové chorobné stavy môžu tiež oslabiť krvné cievy a viesť ku presakovaniu z ciev a edému ako je napr. diabetes, ochorenie obličiek, ateroskleróza a podobne. Teda vaskulárne presakovanie a edém sú kritické poruchy, odlišné a nezávislé od nádoru, ktoré je potrebné efektívne terapeuticky zasiahnuť v spojitosti s rôznymi zraneniami, traumami alebo chorobnými stavmi.

Zistilo sa, že selektívna inhibícia aktivity tyrozínkinázy rodiny Src znižuje zvýšenie VP v tkanivách asociovaných s porai nením alebo traumou a má za následok zmiernenie poruchy súvisiacej s presakovaním z krvných ciev a/alebo s edémom.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa týka modulácie vaskulárnej permeability (VP) tyrozínkinázou Src, tu tiež 'Všeobecne označovanou· ako Src, alebo tyrozínkinázou Yes, tu tiež všeobecne označovanou ako Yes, alebo selektívnou inhibíciou aktivity tyrozínkinázy rodiny Src.

Teda jeden aspekt vynálezu zahŕňa'farmačeutické kompozície na moduláciu VP v cieľovom tkanive cicavca. Kompozície podľa vynálezu obsahujú terapeuticky účinné VP modulujúce množstve zmesi tyrozínkinázového proteínu Src a Yes v terapeuticky prijateľnom nosiči.

V kompozíciách, ktoré obsahujú aktívne proteíny kináz Src a Yes, je očakávaná modulácia potenciácia alebo zvýšenie vaskulárnej permeability krvných ciev v cieľovom tkanive. Tam, kde je žiadaný proteín Src aktívnou kinázou, výhodný Src je Src-A. Ďalší výhodný aktívny proteín Src je ten, v ktorom aminokvselinový zvyšok na pozícii 527 proteínu Src je akýmkoľvek aminokyselinovým zvyškom okrem tyrozínu, serínu alebo treonínu. Výhodný aktívny proteín Yes bude mať kinázovú aktivitu ľudského Yes divého typu alebo takú ako proteín Yes-1. Ďalší výhodný aktívny Yes je ten, v ktorom je kinázu inaktivujúce fosforylačné miesto proteínu Yes mutované, aby sa odstránila alebo minimalizovala inaktivácia fosforylácie, podobne ako 'mutácia aminokyselinového zvyšku 527 Src na akýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyro6 zinu, serinu alebo treoninu.

Kde kompozícia obsahuje proteíny Src a Yes, ktoré sú inaktívnymi kinázovými proteinmi, očakávaná modulácia je inhibicia alebo zníženie vaskulárnej permeability krvných ciev v cielovom tkanive. Keď je žiadaným proteinom Src inaktívny proteín, výhodným Src je Src 251. Ďalší výhodný inaktívny Src je Src K295M. Výhodný inaktívny proteín Yes bude mať zníženú kinázovú aktivitu v porovnaní s proteinom divého typu.

Ďalší aspekt nárokovaného vynálezu je farmaceutická kompozícia obsahujúca terapeuticky účinné VP modulujúce množstvo nukleovej kyseliny schopnej expresie proteínu tyrozínkinázy Src a Yes, keď sa transfekuje do cieľovej bunky, vo vhodnom farmaceutickom nosiči. Exprimovatelné nukleové kyseliny kódujúce proteíny Src a Yes môžu obsahovať segmenty nukleovej kyseliny, ktoré opisujú celé proteíny alebo časti proteínov Src a Yes. Po prenose do cieľových buniek, v cielovej bunke dôjde k transkripcii a translácii sekvencie nukleovej kyseliny, aby sa exprimoval požadovaný proteín.

Kde je moduláciou potenciácia alebo zvýšenie vaskulárnej permeability krvných ciev v cieľovom tkanive, nukleová kyselina kódujúca Src bude kódovať aktívne formy kinázového proteínu Src, a nukleová kyselina kódujúca Yes bude kódovať aktívne formy kinázového proteínu Yes. Po prenose do cielovej hostiteľskej bunky bude nukleová kyselina exprimovaná touto hostiteľskou bunkou. Výhodná nukleová kyselina kódujúca Src kóduje aktívny proteín Src-A. Ďalej výhodná nukleová kyselina kódujúca Src kóduje mutantný aktívny Src, kde aminokyselinový zvyšok na pozícii 527 exprimovaného proteínu Src je akýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyrozínu, serinu alebo treoninu. Výhodná nukleová kyselina kódujúca Yes bude kódovať proteín divého typu alebo proteín modifikovaný, aby sa odstránilo alebo inhibovalo inaktivujúce fosforylačné miesto proteínu Yes podobným spôsobom, ako to je opísané pri mutácii na pozícii 527 Src.

Keď žiadaná modulácia je inhibícia alebo zníženie vaskulárnej permeability krvných ciev v cieľovom tkanive, výhodná nukleová kyselina kódujúca inaktívny Src kóduje proteín Src 251. Ďalšia výhodná nukleová kyselina kódujúca inaktívny Src kóduje inaktívny Src K295M. Výhodná nukleová kyselina kódujúca inaktívny Yes bude kódovať proteín, ktorý má zníženú kinázovú aktivitu.

Predpokladá sa, že kompozície podlá vynálezu môžu obsahovať zmes nukleových kyselín, kde každá nukleová kyselina môže obsahovať exprimovatelný gén Src alebo Yes.. Naviac sa predpokladá, že jedna nukleová kyselina môže obsahovať nukleovú kyselinu kódujúcu proteín Src aj nukleovú kyselinu kódujúcu proteín Yes. Na zlepšenie modulácie angiogenézy a VP v cieľových tkanivách môžu farmaceutické kompozície podľa vynálezu obsahovať zmes aktívneho a inaktívneho proteínu tyrozínkinázy Src, alebo proteínu tyrozínkinázy Yes. Podobne farmaceutické kompozície podľa vynálezu môžu obsahovať zmes nukleovej kyseliny schopnú exprimovať aktívny alebo inaktívny proteín tyrozínkinázy Src alebo proteín tyrozínkinázy Yes.

Použitím rôznych množstiev prvej tyrozínkinázy podávanej spolu s druhým vyšším množstvom druhej tyrozínkinázy, podľa obsahu tohto vynálezu, ,sa zlepšuje modulácia. V tomto uskutočnení s využitím rôzne exprimovatelných promótorov alebo iných regulačných jednotiek, prvý gén prvej tyrozínkinázy s nízkou expresiou sa môže podávať spolu s druhým génom druhej tyrczínkinázy s vysokou expresiou pódia predkladaného vynálezu. V tomto uskutočnení zvýšenie angiogenézy sa tiež môže dosiahnuť udržiavaním, minimalizáciou alebo obmedzením VP, s použitím prvého aktívneho génu Src s nízkou expresiou v kombinácii s druhým inaktívnym génom yes s vysokou expresiou. Toto spolu-podávanie sa môže dosiahnuť použitím oddelených expresných vektorov alebo jedného kombinovaného expresného vektorového konštruktu. Podobne sa môže dosiahnuť zníženie angiogenézy udržiavaním, potenciáciou alebo zvýšením VP, použitím prvého inaktívneho génu Src s nízkou expresiou v kombinácii s druhým aktívnym génom yes s vysokou expresiou. Ďalšie stupne modulácie sa môžu dosiahnuť rôznymi permutáciami vysoké/nízke a src/yes v kombinácii s výberom aktivity promótorových jednotiek a indukovatelných promótorov.

Existuje predstava, že jednotlivé gény src a yes môžu byť pod regulačnou kontrolou rovnakých alebo odlišných regulačných sekvencii nukleovej kyseliny ako takých, a nie obmedzených na zosilňovače (enhancery), represory a promótorové jednotky. Keď je dva alebo viac proteínov exprimovateľných z jedného vektora, zdá sa, že regulácia a kontrola transkripcie nezávislých génov proteínov môže byť pod kontrolou rovnakých regulačných jednotiek. Tiež sa predpokladá, že regulácia a kontrola transkripcie môže byť ovplyvnená dvomi alebo viacerými nezávisle pôsobiacimi regulačnými jednotkami. Regulačné jednotky sú známe v odbore a môžu byť konštitutívne aktívne alebo indukovateľné, zosilňovače, promótory, supresory a pod., sekvencie nukleových kyselín.

Predpokladá sa, že kompozície nukleovej kyseliny podľa vynálezu môžu obsahovať vírusové a/alebo nevírusové vektory na¹ prenos génov, ktoré obsahujú segment nukleovej kyseliny kódujúci proteíny Src a/alebo Yes. Retrovirusové a nevírusové vektory na prenos a expresiu génov sú v odbore známe a sú v skratke opísané ďalej.

Výhodná nukleová kyselina kóduje proteín Src-A. Ďalší výhodný aktívny proteín Src je ten, v ktorom aminokyselinový zvyšok na pozícii 527 proteínu Src je ktorýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyrozinu, serínu alebo treonínu.

Predpokladá sa, že zmes proteínu Src a Yes a/alebo nukleová kyselina kódujúca tento proteín, môže kombinovať aktívne a inaktívne formy proteínu, v závislosti od požadovanej úrovne modulácie a požadovaného koordinačného efektu na angiogenézu a VP, podľa predkladaného vynálezu.

Kompozícia poskytujúca proteiny Src alebo Yes môže obsahovať purifikovaný protein, biologicky aktívne fragmenty natívneho proteínu, rekombinantne pripravené proteiny Src alebo Yes alebo fragmenty proteínov alebo fúzne proteiny, alebo vektory na expresiu génu/nukleovej kyseliny na exprimovanie proteínu Src alebo Yes alebo ich zmesi.

Tam, kde je protein Src alebo Yes inaktivovaný alebo inhibovaný, moduláciou je inhibícia VP. Tam, kde je protein Src alebo Yes aktívny alebo aktivovaný, moduláciou je potenciácia VP.

Predkladaný vynález zahŕňa spôsoby ošetrenia tkaniva cicavca kompozíciou obsahujúcou terapeuticky účinné, VP modulujúce množstvo proteínu. Src alebo Yes alebo ich kombinácie. V spôsoboch pódia vynálezu protein tyrozínkinázy Src a Yes, alebo expresné vektory nukleovej kyseliny schopné exprimovať tento protein sa podá tkanivu trpiacemu chorobným stavom, ktorý reaguje na moduláciu VP.

Tam, kde je požadovaný terapeuticky účinný VP modulujúci efekt zvýšenie alebo potenciácia VP sa uvažuje, že sa môžu podávať aktívne formy proteínu Src a/alebo proteínu Yes. Podobne, spôsoby zahŕňajú podanie exprimovatelných nukleových kyselín, ktoré kódujú aktívne alebo inaktívne formy proteínu Src a/alebo proteínu Yes.

Tkanivo určené na ošetrenie môže byť ktorýmkoľvek tkanivom, v ktorom je modulácia VP požadovaná. Terapeutické ošetrenie sa dosiahne kontaktom cieľového tkaniva s účinným množstvom požadovanej modulujúcej kompozície a. ponechá sa dostatočný čas kontaktu proteínových komponentov alebo komponentov nukleovej kyseliny liečiva na vstup do cieľového tkaniva. Na inhibiciu VP je vhodné ošetrovať choré tkanivo tam, kde nastáva škodlivé presakovanie. Príklady tkanív zahŕňajú, zapálené tkanivo, tkanivá aso ciované s mŕtvicou, infarktom myokardu, alebo inou blokádou normálneho obehu, tkanivá podliehajúce restenóze a podobné tkanivá.

Na potenciáciu je vhodné ošetrovať pacientov s ischemickými končatinami, u ktorých je slabá cirkulácia v končatinách spôsobená diabetickými alebo inými stavmi, alebo podať liečivá do mozgu cez hematoencefalickú bariéru. Pacienti s chronickými ranami, ktoré sa neliečia a teda by mohlo byť zvýšenie proliferácie vaskulárnych buniek a neovaskularizácia modulovaná VP pre nich prínosom, môžu byť liečení tiež.

Ďalším aspektom predkladaného vynálezu sú výrobné artikle, ktoré obsahujú obalový materiál a farmaceutickú kompozíciu obsiahnutú v obalovom materiáli, kde farmaceutická kompozícia je schopná modulovať vaskulárnu permeabilitu v tkanive trpiacom chorobným stavom, kde obalový materiál obsahuje štítok, ktorý uvádza, že farmaceutická kompozícia sa môže použiť na liečenie chorobných stavov pomocou modulácie vaskulárnej permeability a kde farmaceutická kompozícia obsahuje terapeuticky účinné množstvo proteínu tyrozínkinázy Yes vo farmaceutický prijatelnom nosiči. Toto uskutočnenie zahŕňa protein Yes v aktívnej alebo inaktivnej forme a tiež nukleové kyseliny kódujúce aktívny alebo inaktivny protein Yes. Retrovirusové aj nevírusové vektory na prenos a expresiu génov môžu obsahovať segment nukleovej kyseliny kódujúci protein Yes buď v aktívnej forme alebo inaktivnej forme alebo v oboch formách. Keď sú prítomné obe, aktívna aj inaktívna forma génu proteínkinázy, uvažuje sa, že gény sú pod reguláciou oddelených indukovatelných promótorov, aby sa umožnila alternatívna expresia, ak je to žiaduce.

Ďalším aspektom predkladaného vynálezu sú výrobné artikle, kde farmaceutická kompozícia obsahuje terapeuticky účinné VP modulujúce množstvo proteínu tyrozínkinázy Src a Yes, vo farmaceutický prijatelnom nosiči. Výrobný artikel je balený tak, aby bolo uvedené, že ide o potenciačný VP modulujúci účinok a Src a

Yes sú v aktívnej forme. Výhodný aktívny protein Src je protein Src-A. Ďalší výhodný aktívny protein Src je ten, v ktorom aminokyselinový zvyšok na pozícii 527 proteínu Src je akýmkoľvek aminokyselinovým zvyškom okrem tyrozínu, serínu alebo treonínu.

Ďalším aspektom predkladaného vynálezu sú výrobné artikle, ktoré obsahujú farmaceutickú kompozíciu, kde farmaceutická kompozícia obsahuje terapeuticky účinné VP modulujúce množstvo inaktivneho proteínu tyrozínkinázy Src a Yes vo farmaceutický prijateľnom nosiči, kde požadovaná modulácia je inaktivácia alebo inhibícia VP. Výhodný inaktívny Src je protein Src 251. Ďalší výhodný inaktívny protein Src je Src K295M.

Podobne ďalším aspektom predkladaného vynálezu sú výrobné artikle, kde farmaceutická kompozícia obsahuje nukleovú kyselinu schopnú expresie proteínu tyrozíkinázy Src a Yes vo vhodnom farmaceutickom nosiči. Výhodný komponent nukleovej kyseliny tejto farmaceutickej kompozície výrobného artiklu kóduje aktívny proteín Src, kde požadovaná modulácia je potenciáciou alebo aktiváciou VP. Ďalej sa predpokladajú nukleové kyseliny kódujúce aktívny protein Yes. Výhodný aktívny Src je protein Src-A. Ďalšia výhodná nukleová kyselina kódujúca aktívny Src je tá, kde aminokyselinový zvyšok na pozícii 527 proteínu Src je akýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyrozínu, serínu alebo treonínu. Tiež sa predpokladá, že sa môže jedna nukleová kyselina skonštruovať tak, že bude exprimovať yes a src, buď nezávisle regulované alebo pod transkripčnou kontrolou rovnakého promótora, zosilňovača, supresora, represora alebo inej vhodnej regulačnej sekvencie nukleovej kyseliny.

Poškodenie tkaniva súvisiace s vaskulárnym presakovaním a/alebo edémom asociovaným so škodlivými zmenami vo vaskulárnej permeabilite sa môže zlepšiť inhibítorom tyrozínkinázy rodiny Src. S týmto cieľom sa podalo účinné, vaskulárnu permeabilitu modulujúce množstvo inhibítora tyrozínkinázy rodiny Src tkanivu, ktoré potrebovalo takéto ošetrenie. Týmto spôsobom sa môže zmierniť poškodenie tkaniva kvôli vaskulárnemu presakovaniu alebo edému.

Konkrétne predkladaný vynález poskytuje spôsob inhibicie zvýšenia vaskulárnej permeability v tkanive trpiacom chorobným stavom, ktorý je asociovaný s vaskulárnym presakovaním a/alebo edémom, kontaktovaním uvedeného tkaniva s terapeuticky účinným vaskulárnu permeabilitu inhibujúcim množstvom inhibítora tyrozinkinázy rodiny Src spolu s farmaceutický prijateľným nosičom. Vo výhodnom uskutočnení sa inhibítor špecifickej tyrozíkinázy Src podáva tkanivu.

Akákoľvek porucha, ktorá zahŕňa škodlivé poranením indukované zvýšenie vaskulárnej permeability a poškodenie tkaniva vďaka vaskulárnemu presakovaniu alebo edému, sa môže liečiť týmto spôsobom. Takéto patologické prípady zahŕňajú traumu krvných ciev, ako je fyzická ligatúra, blokovanie, separácia, oklúzia, trauma a podobne.

Ďalšie systematické patologické prípady ako ateroskleróza, diabetická retinopatia, zápalové ochorenie spôsobené infekciou mikróbnymi agensami, artritída a pod., sú tiež zodpovedajúco liečené spôsobom podľa vynálezu.

Spôsoby podlá predkladaného vynálezu sú vhodné na liečenie cerebrovaskulárneho ochorenia a traumy zlepšením poškodenia tkaniva spôsobeného zvýšeným vaskulárnym presakovaním a/alebo edémom s ním asociovaným. Konkrétne, spôsoby podľa predkladaného vynálezu sú vhodné na zmiernenie poškodenia tkaniva asociovaného so Src sprostredkovaným zvýšením vaskulárnej permeability indukovaným vaskulárnym endotelovým rastovým faktorom (VEGF). Spôsoby podlá predkladaného vynálezu nie sú limitované na VEGF-indukované zvýšenia vaskulárnej permeability, ale tiež sú vhodné na moduláciu zvýšenia vaskulárnej permeability sprostredkovaného tyrozínkinázou rodiny Src v odpovedi na iné regulačné signály.

Konkrétne, inhibovaním tyrozínkinázy Src (tu tiež všeobecne uvádzaná ako Src) a blízko príbuznej tyrozíkinázy Yes (tu tiež všeobecne uvádzaná ako Yes) ošetrované tkanivá môžu byť špecificky modulované, aby sa v nich inhibovalo zvýšenie vaskulárnej ‘l permeability asociované s poranením alebo ocho'rením.

Vhodný inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src na účely predkladaného vynálezu je chemický inhibítor vybraný zo skupiny obsahujúcej PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146, a Geldanamicin. Iné chemické inhibítory tyrozínkináz rodiny Src sú tiež vhodné na použitie v spôsoboch podía vynálezu.

Vaskulárna permeabilita v tkanive sa môže tiež modulovať podávaním inhibítora tyrozíkinázy rodiny Src, ktorý je proteínový inhibítor, taký ako inaktívny proteín Src napr. Src K295M alebo Src 251 alebo inaktívny proteín Yes alebo aktívny C-koncový proteín kinázy Src (CSK), tkanivu.

Vhodná na moduláciu vaskulárnej permeability v tkanive je tiež nukleová kyselina kódujúca proteín inhibítora tyrozínkinázy rodiny Src, ako sú inaktívny Src, inaktívny Yes alebo aktívny CSK. Takáto nukleová kyselina inhibítorov aktivity tyrozínkinázy rodiny Src môže zahŕňať jeden alebo viac retrovírusových expresných vektorov, nevírusových expresných vektorov alebo podobne. Nukleová kyselina inhibítorov môže obsahovať vhodné regulačné signály, ako sú promótory alebo zosilňovače pre jeden alebo viac exprimovateľných segmentov nukleovej kyseliny na akúkoľvek danú nukleovú kyselinu.

V ďalšom aspekte predkladaného vynálezu výrobné artikle obsahujú obalový materiál a farmaceutickú kompozíciu obsiahnutú v obalovom materiáli, kde farmaceutická kompozícia je schopná modulovať vaskulárnu permeabilitu v tkanive trpiacom chorobným stavom. Obalový materiál obsahuje štítok, na ktorom je uvedené, že sa farmaceutická kompozícia môže použiť na liečenie vaskulár neho presakovania alebo edému asociovaného s chorobnými stavmi a farmaceutická kompozícia obsahuje terapeuticky účinné množstvo inhibitora tyrozinkinázy rodiny Src vo farmaceutický prijateľnom nosiči.

I

Výrobný artikel podľa vynálezu môže obsahovať ako časť farmaceutickej kompozície inhibítor tyrozinkinázy rodiny Src, ktorý je chemickým inhibítorom. Obzvlášť výhodný chemický inhibítor tyrozinkinázy rodiny Src je vybraný zo skupiny obsahujúcej PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146, a Geldanamicin, alebo zlúčeniny s podobnou aktivitou inhibujúcou Src. Najvýhodnejší inhibítor je PP1.

Výrobný artikel podlá vynálezu tiež obsahuje tam, kde farmaceutická kompozícia obsahuje proteínový inhibítor tyrozinkinázy rodiny Src, ktorý je inaktívny protein Src, ako je Src K295M alebo Src 251, inaktívny protein Yes alebo aktívny protein CSK.

Alebo farmaceutická kompozícia obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu inhibítor tyrozinkinázy rodiny Src vo farmaceutický prijateľnom nosiči. V tejto farmaceutickej kompozícii inhibítor, ktorý kóduje nukleová kyselina, môže byť inaktívny protein Src, ako je Src K295M alebo Src 251, inaktívny protein Yes alebo aktívny protein CSK.

Výrobné artikle môžu zahŕňať jednu alebo viac farmaceutických kompozícií, ktoré obsahujú terapeutické inhibítory tyrozinkinázy rodiny Src alebo subterapeutické množstvá viac ako jedného z inhibitorov tyrozinkinázy rodiny Src vo farmaceutický prijateľnom nosiči.

Farmaceutické kompozície výrobných artiklov podlá vynálezu môžu obsahovať zmesi subterapeuticky účinného VP modulujúceho množstva jedného alebo viacerých inhibitorov tyrozinkinázy rodiny Src, ktoré pôsobia spolu, aby poskytli VP redukujúci účinok v ošetrovanom tkanive. Farmaceutická kompozícia výrobného artik lu sa môže líšiť v závislosti od požadovaného modulačného účinku a štítkovanie na obale sa bude tiež zodpovedajúco líšiť.

Farmaceutická kompozícia výrobného artiklu sa môže líšiť v závislosti od požadovaného modulačného alebo inhibičného účinku a štítkovanie na obale sa'bude tiež zodpovedajúco líšiť.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na výkresoch, ktoré tvoria súčasť tohoto vynálezu:

Na obr. 1 je sekvencia cDNA kuracieho c-Src, ktorá je kompletnou kódujúcou sekvenciou s deletovanými intrónmi ako ju prvý krát opísali Takeya et al., Celí, 32:881-890 (1983). Sekvencia je prístupná v databáze Genbank s prístupovým číslom J00844. Sekvencia obsahuje 1759 nukleotidov s časťou kódujúcou proteín, ktorá sa začína a končí na príslušných nukleotidových pozíciách 112 a 1713 (sekvencia SEQ ID NO: 2) .

Na obr. 2 je kódovaná sekvencia aminokyselinových zvyškov kódujúcej, sekvencie kuracieho c-Src na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 3). .

Na obr. 3 je cDNA sekvencia ľudského c-Src, ktorú prvý krát opísal Braeuninger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:10411-10415 (1991)'. Sekvencia je prístupná v databáze Genbank s prístupovým číslom X59932 X71157. Sekvencia obsahuje 2187 nukleotidov s časťou kódujúcou proteín, ktorá sa začína a končí na príslušných nukleotidových pozíciách 134 a 1486 (sekvencia SEQ ID NO: 4).

Na obr. 4 je kódovaná sekvencia aminokyselinových zvyškov ľudského c-Src kódujúcej sekvencie na obr. 3 (sekvencia SEQ ID NO: 5).

Obr. 5 znázorňuje aktiváciu endogénneho Src pomocou bFGF alebo VEGF ako je opísané v príklade 4. Horná časť obrázku ukazuje výsledky in vitro kinázovej analýzy s aktiváciou skladania (fold activation) endogénneho c-Src buď s bFGF alebo s VEGF. Spodná časť obrázku je blot kinázovej analýzy testovaný anti-Src protilátkou ako nanesenou kontrolou pre ekvivalentný obsah Src a I gG.

Obr. 6 ukazuje účinok retrovírusom sprostredkovanej génovej expresie c-Src A na angiogenézu kuracej CAM ako je opísané v príklade 4. 9 dní staré kuracie CAM sa vystavili pôsobeniu retrovírusov RCAS-Src A (aktívny mutovaný c-Src) alebo kontrolnému RCAS-GFP (zelený fluorescenčný proteín; fluorescenčný indikačný proteín) alebo tlmivému roztoku na 72 h.. Úroveň angiogenézy sa kvantifikovala, ako je ukázané na obr. 6A reprezentatívnymi mikrografmi (4x), ktoré na obr. 6B zodpovedajú každému ošetreniu odfotenému pod stereomikroskopom.

Obr. 7 ukazuje retrovírusovú expresiu c-Src A v aktivovaní fosforylácie vaskulárnej MAP kinázy. Obr. 7A ukazuje tkanivové extrakty 10 dní starých kuracích CAM, ktoré sa vystavili VEGF alebo PMA na 30 minút alebo sa infikovali retrovírusom c~src A počas 48 hodín. „NT znamená „žiadne ošetrenie. Src sa imunoprecipitoval z ekvivalentných množstiev celkového proteínového extraktu a podrobil sa in vitro imunokomplexovej kinázovej analýze (imir.une complex kinase assay) s použitím FAK-GST fúzneho protéínu ako substrátu, elektroforéze a prenosu na nitrocelulózu. V alikvotných častiach horeuvedených celých tkanivových lyzátov sa tiež merala fosforylácia endogénneho ERK imunopijakovaním s anti-fosfo-ERK protilátkou. Obr. 7B ukazuje 10 dní staré CAM, ktoré sa infikovali buď modelovo (mock) RCAS alebo RCAS obsahujúcim SRC A. Po dvoch dňoch sa CAM pitvali, kryokonzervovali v OCT a narezali na 4 pm. Rezy sa imunofarbili protilátkou proti ' fosforylovanej ERK (anti-phospho-ERK antibody) (New England Biolabs), premyli sa a detegovali sa kozou anti-králičou sekundárnou protilátkou konjugovanou s FITC. Fluorescenčné zo brazenia sa zachytili chladenou-CCD kamerou/fotoaparátom (Princeton Inst.).

Obr. 8 ilustruje selektívnu požiadavku na aktivitu Src počas angiogenézy indukovanej VEGF ale nie bFGF. 9 dní staré kuracie CAM sa vystavili pôsobeniu retrovírusom RCAS-Src 251 alebo kontrolnému RCAS-GFP alebo tlmivému roztoku na 20 hodín a potom sa inkubovali ďalších 72 hodín, v prítomnosti alebo neprítomnosti bFGF alebo VEGF. Úroveň angiogenézy sa kvantifikovala, obr. 8A, ako je uvedené predtýmto a reprezentatívne mikrografy ,(6x) sa fotili stereomikroskopom, ako je ukázané na obr. 8B. Obr. 8C ukazuje blot testovaný anti-Src' protilátkou, aby sa potvrdila expresia Src 251 v transfekovaných bunkách, ako je porovnané s modelovými (mock) ošetreniami.

Obr. 9 znázorňuje výsledky retrovírusového doručenia RCAS-Src 251 do ľudských tumorov. Obr. 9A je mikrograf, ktorý ukazuje fragment ľudského meduloblastómu infikovaný RCAS-GFP (RCAS - Green Fluorescent Proteín) exprimujúcim GFP výlučne v tumorových krvných cievach (hlavička šípky), ako sa detegovalo optickým rezaním s Bio Rad laserovým konfokálnym skenovacím mikroskopom (bar=500 pm) . Obr. 9B znázorňuje dáta z tumorov ošetrených topickou aplikáciou retrovírusu, ktoré sa nechali rásť 3 alebo 9 dní, potom sa urobila resekcia a určili sa hmotnosti za vlhka. Dáta sú vyjadréné ako priemerná zmena hmotnosti tumoru (cd počiatočnej hmotnosti tumoru 50 mg) +/- SEM 2 replikátov. Obr. 9C znázorňuje na reprezentatívnych mikrografoch meduloblastómové tumory chirurgicky odstránené z embryí (bar=350 pm). Spodné panely sú pohľady na každý tumor pod veľkým zväčšením a ukazujú detailnú vaskulatúru každého tumoru (bar=350 pm). Šípka indikuje prerušenie krvnej cievy v tumoroch ošetrených RCAS-Src251.

Obr. 10 je diagram znázorňujúci reštrikčnú mapu vektorového konštruktu RCASBP (RCAS) (sekvencia SEQ ID NO: 1).

Obr. 11 znázorňuje kódovanú sekvenciu aminokyselinových zvyškov ľudského proteínu c-Yes v jednopísmenovom aminokyselinovom kóde (sekvencia SEQ ID NO: 8).

Obr. 12 znázorňuje sekvenciu nukleovej kyseliny cDNA kódujúcej ľudský proteín c-Yes. Sekvencia je prístupná v databáze Genbank pod prístupovým číslom M15990. Sekvencia obsahuje 4517' nukleotidov s časťou kódujúcou proteín, ktorá sa začína a končí na príslušných nukleotidových pozíciách 208 a 1839 a translácia do aminokyselinovéj sekvencie je znázornená na obr. 11 (sekvencia SEQ ID NO: 7).

Obr. 13 znázorňuje výsledky doručenia Src 251 a CSK retrovírusom do subkutánneho myšieho modelu angiogenézy. Obr. 13A znázorňuje výsledky imunopijakovania na detekciu expresie flk. Obr. 13B znázorňuje výsledky imunopijakovania z analýzy na flk za podmienok stimulácie s VEGF a bFGF. Obr. 13C je graf, ktorý graficky znázorňuje počet CD34 pozitívnych krvných ciev (priemer z troch náhodných polí pri 20x - average of triplicate random fields at 20x) s ošetrením stimulovaným pomocou VEGF a bFGF v prítomnosti retrovírusu GFP, Src 251 alebo CSK.

Obr. 14 znázorňuje výsledky z modifikovanej Milesovej analýzy na VEGF indukovanú VP v pokožke myší deficientnych v Src, fyn a Yes. Obr. 14A sú fotografie ošetrených uší. Obr. 14B sú grafy experimentálnych výsledkov stimulácie rôznych deficientnych myší. Obr. 14C znázorňuje množstvo eluovaného farbiva Evanova modrá (Evan's blue dye) pri ošetrení.

Obr. 15 je graf znázorňujúci relatívnu veľkosť infarktu u Src+/-, Src-/-, divom type (WT) a s PP1 ošetrených myší divého typu. Ošetrenie s PP1 sa zahŕňalo 1,5 mg/kg telesnej hmotnosti.

Obr. 16 znázorňuje sekvenčné MRI vyšetrenia kontrolných a PP1 ošetrených myších mozgov, ktoré ukazujú menej infarktov mozgu u zvierat ošetrených s PP1 (vpravo) ako u kontrolných zvierat (vľavo).

Detailný opis vynálezu

A. Definície

Aminokyselinový zvyšok: Aminokyselina vytvorená chemickým štiepením (hydrolýzou) polypeptidu v jeho peptidových väzbách. Tu opísané aminokyselinové zvyšky sú výhodne v „L izomérnej forme. Zvyšky v „D izomérnej forme môžu byť substituované akýmkoľvek L-aminokyselinovým zvyškom, pokiaľ sa zachová funkčná vlastnosť polypeptidu. NH₂ je voľná aminoskupina prítomná na aminokonci polypeptidu. COOH je voľná karboxyskupina prítomná na karboxykonci polypeptidu. V súlade so štandardnou polypeptidovou nomenklatúrou (opísanou v J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) a prevzatou na 37 CFR §1.822 (b( (2)) .

. Je nutné poznamenať, že všetky sekvencie aminokyselinových zvyškov sú v tomto opise uvedené v podobe konvenčného zápisu od aminokonca ku karboxylovému koncu. Ďalej je potrebné poznamenať, že pomlčka na začiatku a konci sekvencie aminokyselinových zvyškov indikuje peptidovú väzbu k nasledujúcej sekvencií jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov.

Polypeptid: je lineárna séria aminokyselinových zvyškov spojených navzájom peptidovými väzbami medzi alfa-aminoskupinou a karboxyskupinou susediacich aminokyselinových zvyškov.

Peptid: v tomoto opise označuje lineárnu postupnosť najviac

50. aminokyselinových zvyškov navzájom spojených ako v polypeptide.

Cyklický peptid: je zlúčenina, ktorá má štruktúru heteroatómového kruhu, ktorá zahŕňa niekoľko amidových väzieb ako v typickom peptide. Cyklický peptid môže byť homodetický (homodetic) lineárny polypeptid cyklizovaný· head to tail, v ktorom N-koniec lineárneho peptidu vytvorí amidovú väzbu s C-koncovým karboxylátom lineárneho peptidu, alebo môže obsahovať kruhovú štru ktúru, v ktorej je polymér heterodetický (heterodetic) a obsahuje amidové väzby a/alebo iné väzby uzatvárajúce kruh, ako napr. disulfidové mostíky, tioesterové, tioamidové, guanidínové a podobné väzby.

Protein: označuje lineárnu postupnosť viac ako'50 aminokyselinových zvyškov navzájom spojených do polypeptidu.

Fúzny protein: označuje polypeptid obsahujúci aspoň dve rozdielne polypeptidové domény operatívne spojené typickou peptidovou väzbou („fúzované), kde tieto dve domény zodpovedajú peptidom, ktoré sa nenachádzajú fúzované v prírode.

Syntetický peptid: je chemicky pripravený reťazec aminokyselinových zvyškov spojených navzájom peptidovými väzbami, ktorý neobsahuje prirodzene sa vyskytujúce proteíny a ich fragmenty.

B. Všeobecné úvahy

Predkladaný vynález sa všeobecne týka (1) objavu, že VP indukovaná s VEGF je špecificky sprostredkovaná tyrozínkinázovými proteínmi Src a Yes, a že VP môže byť modulovaná poskytnutím buď aktívneho alebo inaktívneho proteínu Src alebo Yes na potenciáciu alebo inhibiciu angiogenézy tak ako je uvedené; (2) ďalší objav, že vaskulárne presakovanie a/alebo edém asociované s traumou, ochorením zo zvýšenia vaskulárnej permeability súvisiaceho so zranením, môžu byť špecificky modulované a zlepšené inhibíciou aktivity tyrozínkinázy rodiny Src; a (3) objav, že in vivo podanie inhibítora tyrozínkinázy rodiny Src znižuje poškodenie tkaniva spôsobené zvýšením vaskulárnej permeability, ktorá nie je asociovaná s nádorom alebo angiogenézou, spojené s ochorením alebo poranením.

Tento objav je dôležitý kvôli úlohe, ktorú hrá vaskulárna permeabilita v mnohých chorobných procesoch a v spojení s angiogenézou, vytváraním nových krvných ciev. Tam, kde tkanivá aso ciované s chorobným stavom vyžadujú angiogenézu pre rast tkaniva, je vhodné inhibovať angiogenézu a tým rast chorého tkaniva. Angiogenéza sa môže inhibovať účinnejšie simultánnym inhibovaním VP. Tam, kde poranené tkanivo vyžaduje angiogenézu pre rast a liečenie tkaniva, je vhodné potenciovať alebo podporovať VP a teda angiogenézu, a tým podporovať rast a liečenie tkaniva.

Tam, kde rast nových krvných ciev je príčinou alebo prispieva k poruche asociovanej s chorým tkanivom,, inhibíciou VP a tým angiogenézy sa znížia škodlivé účinky ochorenia. Inhibíciou VP asociovanej s angiogenézou sa môže zasahovať do ochorenia, môžu sa zmierniť symptómy, a v niektorých prípadoch vyliečiť ochorenie.

V niektorých prípadoch zvýšenie VP je vhodné pre. zvýšenie účinku doručenia liečiva prostredníctvom systémového podania. Hematoencefalická bariéra je termín použitý na opísanie pevnej regulácie VP a teda minimálneho prístupu aj malých molekúl liečiva z cirkulácie do mozgu. Schopnosť selektívne a špecificky modulovať permeabilitu hematoencefalickej bariéry prostredníctvom modulácie VP zúčastnených krvných ciev umožní podanie liečiv, ktoré by inak neboli schopné prestúpiť z cirkulácie do tkaniva mozgu.

Podobne mnohé poruchy a poškodenia indukované mŕtvicou sú podnietené náhlym zvýšením VP a teda schopnosť špecificky modulovať VP umožní nové a účinné ošetrovanie na zníženie nepriaznivých účinkov mŕtvice.

Spôsoby podlá predkladaného vynálezu sú účinné čiastočne, pretože terapia je vysoko selektívna pre VP a nie iné biologické procesy.

Predkladaný vynález sa z časti týka zistenia, že angiogenéza je sprostredkovaná proteínom tyrozínkinázy Src, a že angiogenéza môže byť modulovaná poskytnutím buď aktívneho alebo inaktívneho proteínu Src na potenciáciu alebo inhibíciu angiogenézy, ako je uvedené.

Toto zistenie je dôležité kvôli úlohe, ktorú hrá angiogenéza, vytváranie nových krvných ciev, v množstve rôznych chorobných procesov. Tam, kde tkanivo asociované s chorobným stavom vyžaduje angiogenézu na rast tkaniva, je vhodné inhibovať angiogenézu a tým aj rast chorého tkaniva. Tam, kde poranené tkanivo vyžaduje angiogenézu na rast a liečenie tkaniva, je vhodné potenciovať a podporovať angiogenézu a tým podporovať liečenie a rast tkaniva.

Tam, kde je rast nových krvných ciev príčinou alebo prispieva k poruche asociovanej s chorým tkanivom, inhibíciou angiogenézy sa znížia škodlivé účinky ochorenia. Inhibíciou angiogenézy sa môže zasahovať do ochorenia, môžu sa zmierniť symptómy, a v niektorých prípadoch vyliečiť ochorenie.

Príklady tkaniva asociovaného s ochorením a neovaskularizáciou, ktorému prospeje inhibičná modulácia angiogenézy, zahŕňajú reumatoidnú artritídu, diabetickú retinopatiu, zápalové ochorenia, restenózu a podobne. Tam, kde je rast nových krvných ciev vyžadovaný na podporu rastu škodlivého tkaniva, inhibícia angiogenézy zníži prítok krvi do tkaniva, a tým prispeje k redukcii tkanivovej masy založenej na požiadavkách krvného prítoku. Príklady zahŕňajú rast tumorov, kde je neovaskularizácia kontinuálnou požiadavkou, aby tumor narástol na viac ako pár milimetrov hrúbky a na založenie pevných tumorových metastáz.

Tam, kde sa predpokladá, že rast nových krvných ciev prispieva k liečeniu tkaniva, potenciácia angiogenézy napomáha liečeniu. Príklady zahŕňajú liečenie pacientov s ischemickými končatinami, kde je slabá cirkulácia v končatinách spôsobená diabetes .alebo inými stavmi. Tiež sú zahrnutí pacienti s chronickými ranami, ktoré sa neliečia, a teda by im prospel nárast proliferácie vaskulárnych buniek a neovaskularizácia.

Spôsoby podlá predkladaného vynálezu sú efektívne z časti, pretože terapia je vysoko selektívna pre angiogenézu a nie pre iné biologické procesy.

Ako je opísané predtýmto, angiogenéza zahŕňa množstvo procesov týkajúcich sa neovaskularizácie tkaniva vrátane pučania („sprouting), vaskulogenézy alebo zväčšovania ciev, z ktorých všetky sú ovplyvnené proteínom Src. S výnimkou liečenia traumatických rán, tvorby žltého telieska a ' embryogenézy, predpokladá sa, že väčšina procesov angiogenézy je asociovaných s chorobnými procesmi a teda použitie predkladaných' terapeutických spôsobov je selektívne pre ochorenie a nemá škodlivé vedľajšie účinky.

Predkladaný vynález sa z časti týka objavenia, že vaskulárne presakovanie a/alebo edém asociované s traumou, ochorením zo zvýšenia vaskulárnej permeability súvisiaceho so zranením, sa môže špecificky modulovať a zlepšiť inhibíciou aktivity tyrozinkinázy rodiny Src. Konkrétne predkladaný vynález sa týka zistenia, že in vivo podanie inhibítora tyrozínkinázy rodiny Src zníži poškodenie tkaniva spôsobené zvýšením vaskulárnej permeability, ktorá nie je spojená s rakovinou, alebo angiogenézou, súvisiacim s ochorením alebo poranením.

Keďže podanie inhibítora tyrozínkinázy rodiny Src moduluje zvýšenie VP indukované VEGF, špecifická inhibícia aktivity tyrozínkinázy rodiny Src zmierňuje poškodenie okolitých tkanív spôsobené vaskulárnym presakovaním a/alebo edémom, hoci kinázový signál rodiny Src je aktivovaný.

Vaskulárna permeabilita sa podieľa na množstve chorobných procesov nezávisle od priameho spojenia s angiogenézou. Napríklad mnohé poruchy a poškodenia indukované mŕtvicou sú zapríčinené náhlym zvýšením VP vďaka poraneniu krvnej cievy, a teda schopnosť špecificky modulovať VP umožní nové účinné liečby na zníženie škodlivých účinkov mŕtvice.

Príklady tkaniva spojeného s vaskulárnym presakovaním a/alebo edémom indukovaným ochorením alebo poranením, ktorému prospeje špecifická inhibičná modulácia s použitím inhibítora kinázy rodiny Src, zahŕňajú reumatoidnú artritídu, diabetickú retinopatiu, zápalové ochorenia, restenózu a podobne.

Trauma hlavy alebo chrbtice a ďalšie cerebrovaskulárne nehody typicky spôsobené ischemickou alebo hemoragickou príhodou sú hlavné príčiny neurologických porúch a súvisiaceho poranenia. Edém mozgu alebo vaskulárne presakovanie vychádzajúce zo zranení je život ohrozujúcou poruchou, ktorá spúšťa systemické a diseminované poškodenie mozgu a chrbtice (centrálny nervový systém; CNS) a schopnosť špecificky modulovať účinky vaskulárneho presakovania a edému poškodzujúce tkanivo v takýchto prípadoch je veľmi vhodné.

Infekcie CNS, meningitída, cerebritída, encefalitída, môžu mať za následok nepriaznivú poruchu vrátane mozgového edému. Liečba základnej infekcie sa môže doplniť špecifickou terapiou na zníženie vaskulárneho presakovania alebo edému.

Uvádza sa, že systemická neutralizácia proteínu VEGF použitím fúzneho proteínu VEGF receptora a IgG znižuje veľkosť infarktu po cerebrálnej ischémii, tento účinok prispel k zníženiu vaskulárnej permeability sprostredkovanej VEGF. N. van Bruggen et al., J. Clin. Inves. 104:1613-1620 (1999). Avšak VEGF nie je kritický mediátor zvýšenia vaskulárnej permeability, zistilo sa, že je to Src.

Iné ochorenia alebo stavy, kde zvýšenie vaskulárnej permeability sprostredkované Src je zahrnuté a ide teda o vhodné ciele na liečbu spôsobmi a kompozíciami podľa vynálezu, zahŕňajú: cerebrálnu hemorágiu, traumu mozgu a chrbtice, hypoxiou vyvolané poranenie mozgu a chrbtice; zápalové poruchy CNS: vírusové alebo bakteriálne infekcie (napr. meningitída, HIV encefalopatia), autoimunitné poruchy (napr. skleróza multiplex); ochorenia s chronickým zvýšením permeability hematoencefalickej bariéry (napr. Morbus Alzheimer); chirurgické zákroky, kde je potrebné dočasné zhoršenie perfúzie alebo okysličenia tkaniva, ako ochranný prostriedok; syndróm ťažkého dýchania u dospelých (ARDS adult respirátory distress syndróme); reumatoidnú artritídu; a diabetickú retinopatiu.

C. Proteíny tyrozínkinázy rodiny Src

Proteín tyrozíkinázy na použitie podľa predkladaného vynálezu sa môže líšiť v závislosti od zamýšľaného použitia. Termíny „proteín Src alebo „Src sa používajú pre rôzne formy proteínu tyrozínkinázy Src tu opísané, buď v aktívnych alebo inaktivnych formách. Termíny „proteín Yes alebo „Yes sa používajú pre rôzne formy proteínu tyrozínkinázy Yes tu opísané, buď v aktívnych alebo inaktivnych formách. Taktiež v obsahu opisu sú odkazy na sekvencie nukleových kyselín alebo gény kódujúce Src alebo Yes. Termín „rodina Src opisuje skupinu tyrozínkináz, ktoré sú príbuzné funkciou a aminokyselinovou sekvenciou Src.

„Aktívny proteín Src označuje množstvo rôznych foriem proteínu Src, ktoré potenciujú angiogenézu alebo VP. „Aktívny proteín Yes označuje množstvo rôznych foriem proteínu Yes, ktoré potenciujú VP. Analýzy použité na meranie potenciácie angiogenézy alebo VP sú tu opísané a nie sú chápané ako limitujúce. Proteín sa považuje za aktívny ak úroveň angiogenézy alebo VP je aspoň 10% väčšia, výhodne 25% väčšia a výhodnejšie 50% väčšia, ako je kontrolná úroveň, kde sa do analyzovaného systému nepridáva žiadny proteín.

Výhodná analýza na meranie potenciácie angiogenézy je CAM analýza s použitím vírusového' vektora RCAS ako je opísané v príkladoch, kde sa angiogenetický index vypočíta zrátaním vetviacich bodov.

Výhodná analýza na meranie potenciácie VP je Milesova analýza použitím farbičky Evanova modrá na myšiach, ako je opísané v príkladoch, kde sa VP meria množstvom farbičky Evanova modrá presiaknutej z krvných ciev.

Výhodný aktívny protein Src alebo Yes prejavuje tiež tyrozínkinázovú aktivitu. Príkladné aktívne Src alebo Yes proteíny sú opísané v príkladoch a zahŕňajú Src-A a Yes-1.

„Inaktívny protein Src označuje množstvo rôznych foriem proteínu Src, ktoré inhibujú angiogenézu alebo VP. „Inaktívny protein Yes označuje množstvo rôznych foriem proteínu Yes, ktoré inhibujú VP. Analýzy na meranie inhibície zvýšenia VP sú tu opísané a nie sú považované za limitujúce. Src protein sa považuje za inaktívny, ak je úroveň angiogenézy aspoň 10% nižšia, výhodne 25% nižšia a výhodnejšie 50% nižšia, ako je kontrolná úroveň, kde sa do analyzovaného systému nepridáva žiadny exogénny protein Src.

Protein Src alebo Yes sa považuje za inaktívny ak úroveň VP je aspoň rovná, alebo 10% nižšia, výhodne 25% nižšia a výhodnejšie 50% nižšia ako je kontrolná úroveň, kde sa do analyzovaného systému nepridáva žiadny exogénny protein Src alebo Yes.

Výhodná analýza na meranie inhibície angiogenézy je CAM analýza s použitím vírusového vektora RCAS, ako je opísané v príkladoch, kde sa angiogenetický index vypočíta zrátaním vetviacich bodov.

Výhodná analýza na meranie inhibície VP je Milesova analýza s použitím farbičky Evanova modrá na myšiach, ako je opísané v príkladoch, kde sa VP meria množstvom farbičky Evanová modrá presiaknutej z krvných ciev.

Výhodný inaktívny protein Src alebo Yes tiež preukazujú zníženú tyrozínkinázovú aktivitu. Ukážkové inaktívne proteíny Src sú opísané v príkladoch a zahŕňajú Src-251 a Src K295M.

Src proteín užitočný v predkladanom vynáleze sa môže pripraviť akoukoľvek z množstva metód vrátane izolácie z prírodných zdrojov vrátane tkaniva, prípravy expresiou rekombinantnej DNA a purifikáciou a podobne. Proteín Src a/alebo Yes sa môže' poskytnúť in situ zavedením génového terapeutického systému do predmetného tkaniva, ktorý potom exprimuje proteín v tkanive.

Gén kódujúci proteín Src alebo Yes sa môže pripraviť množstvom metód, ktoré sú známe v odbore a vynález nie je v tomto ohľade limitovaný. Napríklad je veľmi dobre známe, že prírodná história Src zahŕňa množstvo homológov z druhov cicavcov, vtákov, vírusov a podobných druhov a gén sa môže ľahko klonovať použitím cDNA klonovacích metód z akéhokoľvek tkaniva exprimujúceho tento proteín. Výhodný Src na použitie vo vynáleze je celulárny proteín, ako je cicavčí alebo vtáčí homológ označený c-src. Konkrétne výhodný je ľudský c-src. Výhodný Yes na použitie vo vynáleze je ľudský celulárny proteín, c-yes. Konkrétne výhodný je ľudský c-yes-1 kódujúci aminokyselinovú sekvenciu znázornenú na obr. 11. Proteín Yes-1 z obr. 11 je kódovaný segmentom, sekvencie nukleovej kyseliny znázornenej na obr. 12 a identifikovaný ako segment kódujúcej domény.

D. Rekombinantné molekuly DNA a expresné systémy na expresiu proteínu Src alebo Yes

Vynález opisuje niekoľko nukleotidových sekvencii s konkrétnym použitím v predkladanom vynáleze. Tieto sekvencie zahŕňajú sekvencie, ktoré kódujú proteín Src užitočný v tomto vynáleze a rôzne DNA segmenty, molekuly rekombinantnej DNA (rDNA) a vektory konštruované na expresiu proteínu Src. Tieto sekvencie tiež zahŕňajú sekvencie, ktoré kódujú proteín Yes užitočný v tomto vynáleze a rôzne DNA segmenty, molekuly rekombinantnej DNA (rDNA) a vektory konštruované na expresiu proteínu Yes.

Molekuly DNA (segmenty) podľa vynálezu teda môžu obsahovať sekvencie, ktoré kódujú celé štruktúrne gény, fragmenty štruktúrnych génov alebo kombináciu génov a transkripčné jednotky ako je tu opísané ďalej.

Výhodný DNA segment je nukleová sekvencia, ktorá kóduje proteín Src alebo Yes, alebo oba ako je tu definované, alebo ich biologicky aktívny fragment.

Sekvencia aminokyselinových zvyškov a nukleotidová sekvencia výhodných Src a Yes je opísaná v príkladoch.

Výhodný DNA segment kóduje sekvenciu aminokyselinových zvyškov, ktorá je v podstate rovnaká a výhodne esenciálne pozostáva zo sekvencie aminokyselinových zvyškov alebo jej častí zodpovedajúcich proteínu Src alebo Yes tu opísaným. Reprezentatívne a výhodné DNA segmenty sú ďalej opísané v príkladoch.

Sekvencia aminokyselinových zvyškov proteínu alebo polypeptidu priamo súvisí genetickým kódom so sekvenciou deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) štruktúrneho génu, ktorý kóduje proteín. Teda štruktúrny gén alebo DNA segment môže byť definovaný v zmysle sekvencie aminokyselinových zvyškov, to znamená proteínu alebo polypeptidu, ktorý kóduje.

Dôležitá a dobre známa vlastnosť genetického kódu je jeho redundancia. To znamená, že pre väčšinu aminokyselín tvoriacich proteíny viac ako jeden kódujúci triplet nukleotidov (kodón) môže kódovať alebo určovať konkrétny aminokyselinový zvyšok. Teda množstvo rôznych nukleotidových sekvencií môže kódovať konkrétnu sekvenciu aminokyselinových zvyškov. Takéto nukleotidové sekvencie sú považované za funkčne ekvivalentné, keďže môžu produkovať rovnakú sekvenciu aminokyselinových zvyškov v celom organizme. Niekedy sa môže inkorporovať metylovaný variant purínu alebo pyrimidínu do danej nukleotidovej sekvencie. Avšak takáto metylácia neovplyvňuje žiadnym spôsobom kódovanie.

Nukleová kyselina je akýkoľvek polynukleotidový fragment alebo fragment nukleovej kyseliny, či už to je polyribonukleotid polydeoxyribonukleotidu, t. z. RNA alebo DNA alebo ich analógy. Vo výhodných uskutočneniach molekula nukleovej kyseliny je vo forme segmentu DNA duplexu. t. z., DNA segmentu, hoci pre určité metodológie molekulárnej biológie je uprednostňovaná jednovláknová DNA alebo RNA.

DNA segmenty sa pripravujú množstvom spôsobov vrátane chemických syntetických metód a rekombinantných prístupov, výhodne klonovanim alebo polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). DNA segmenty, ktoré kódujú časti proteínu Src sa môžu jednoducho syntetizovať chemickými technikami napríklad fosfotriesterovou metódou podľa Matteicciho et al., J. , Am. Chem. Soc., 103:31853191, 1981, alebo použitím automatizovaných metód syntézy. Naviac väčšie DNA segmenty sa môžu ľahko pripraviť dobre známymi metódami, ako je syntéza skupiny oligonukleotidov, ktoré definujú DNA segment, nasledovaná hybridizáciou a ligáciou oligonukleotidov, aby sa vytvoril kompletný segment. Inak metódy zahŕňajú izoláciu výhodného DNA segmentu pomocou PCR párom oligonukleotidových primárov použitých v cDNA knižnici, ktorá obsahuje členy, ktoré kódujú protein Src.

Samozrejme chemickou syntézou sa môže urobiť’ akákoľvek požadovaná modifikácia jednoducho substituovaním vhodných báz za tie, ktoré kódujú natívnu sekvenciu aminokyselinových zvyškov. Táto metóda je dobre známa a môže sa ľahko použiť na prípravu rozličných rôznych „modifikovaných” proteinov Src tu opísaných.

Naviac, DNA segmenty skladajúce sa esenciálne zo štruktúrnych génov kódujúcich protein Src alebo Yes môžu byť následne modifikované miestne špecifickou alebo náhodnou mutagené’zou, aby sa zaviedli požadované substitúcie.

1. Klonovanie génov Src alebo Yes

Gén Src alebo Yes podlá tohto vynálezu sa môže klonovať z vhodného zdroja genómovej DNA alebo messengerovej RNA (mRNA) rôznymi biochemickými metódami. Klonovanie týchto génov sa môže uskutočniť podlá všeobecných metód opísaných v príkladoch a známych z odboru.

Zdroje nukleových kyselín na klonovanie génu Src alebo Yes vhodné na použitie v metódach podlá tohto vynálezu môžu zahŕňať genómovú DNA alebo messengerovú RNA (mRNA) v podobe cDNA knižnice, z tkaniva exprimujúceho tieto proteíny. Výhodné tkanivo je tkanivo ľudských pľúc, hoci sa môže použiť akékoľvek iné vhodné tkanivo.

Výhodná klonovacia metóda zahŕňa prípravu DNA knižnice použitím štandardných metód a izolácie Src-kódujúcej alebo Yes-kódujúcej nukleotidovej sekvencie PCR amplifikáciou použitím páru nukleotidových primérov vychádzajúcich zo sekvencie tu opísanej. Alebo sa požadované cDNA klony môžu identifikovať a izolovať z cDNA knižnice alebo genómovej knižnice konvenčnými metódami hybridizácie nukleovej kyseliny s použitím hybridizačnej sondy vychádzajúcej ' zo sekvencií nukleovej kyseliny tu opísanej. Iné metódy izolácie a klonovania vhodných nukleových kyselín kódujúcich Src a Yes sú odborníkovi v odbore zrejmé.

2. Prenos génu a/alebo expresné vektory

Vynález sa týka rekombinantnej molekuly DNA (rDNA), ktorá obsahuje DNA segment kódujúci proteín Src alebo Yes, alebo obidva, ako je tu opísané. Exprimovatelná rDNA sa môže pripraviť operatívne (v rámci, exprimovatelne) spojením vektora s DNA segmentom kódujúcim Src alebo Yes podľa predkladaného vynálezu. Teda rekombinantná DNA molekula je hybridnou DNA molekulou, ktorá obsahuje aspoň dve nukleové kyseliny nukleotidových sekvencii, ktoré sa normálne spolu v prírode nevyskytujú.

Výber vektora, s ktorým je DNA segment podľa predkladaného vynálezu operatívne spojený, závisí priamo, ako je to známe v odbore, od požadovaných funkčných vlastností, napr. proteínovej expresie a od transformovanej hostiteľskej bunky. Charakteristické zretele v oblasti konštrukcie rekombinantných DNA molekúl. Vektor podľa predkladaného vynálezu je prinajmenšom schopný riadiť replikáciu a výhodne tiež expresiu štruktúrneho génu obsiahnutého v segmentoch vektorovej DNA, s ktorou je operatívne spojený.

Tam,	kde expresný vektor obsahuje exprimovateľnú nukleovú
sekvenciu	ako src tak aj yes, oba gény môžu byť regulované
rovnakými	regulačnými jednotkami po prúde (upstream) od prvého

génu, alebo môže byť každý individuálne regulovaný oddelenými regulačnými jednotkami.

Prokaryotické aj eukaryotické expresné vektory sú dôverne známe tým, ktorí majú bežnú kvalifikáciu v oblasti konštrukcie vektorov a opísali ich Ausebel, et al., in Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1993) a Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). V týchto odkazoch je tiež opísaných množstvo všeobecných metód rekombinantných DNA, na ktoré sú tu odkazy.

V jednom uskutočnení vektor podľa predkladaného vynálezu zahŕňa prokaryotický replikón, t. z. DNA sekvenciu ktorá má schopnosť priamej autonómnej replikácie a schopnosť udržať rekombinantnú DNA molekulu extrachromozomálne v prokaryotickéj hostiteľskej bunke, ako je bakteriálna hostiteľská bunka, ním transformovanej. Takéto replikóny sú v odbore dobre známe. Naviac tieto uskutočnenia, ktoré zahŕňajú prokaryotický replikón tiež zahŕňajú gén, ktorého expresia zabezpečí bakteriálnej bunke nim transformovanej rezistenciu na liečivo. Typické gény bakteriálnej rezistencie na liečivo sú tie, ktoré zabezpečujú rezistenciu na ampicilín alebo tetracyklín.

Tie vektory, ktoré obsahujú prokaryotický replikón môžu tiež obsahovať prokaryotický promótor schopný riadiť expresiu (transkripciu a transláciu) štruktúrneho génu v bakteriálnej hostiteľskej bunke, ako je E. coli, nimi transformovanej. Promótor je jednotka riadiaca expresiu tvorená sekvenciou DNA, ktorá umožňuje naviazanie RNA polymerázy a to, aby nastala transkripcia. Promótorové sekvencie kompatibilné s bakteriálnymi hostiteľmi sa typicky nachádzajú na plazmidových vektoroch obsahujúcich vhodné reštrikčné miesta na inzerciu DNA segmentu podľa predkladaného vynálezu. Charakteristické plazmidové vektory sú pUC8, pUC9, pBR322 a pBR329, ktoré sú k dispozícii od Biorad Laboratories, (Richmond, CA) , pRSET od Invitrogen (San Diego, CA) a pPL a pKK223 od Pharmacia, Piscataway, N.J..

Expresné vektory kompatibilné s eukaryotickými bunkami, výhodne tie, ktoré sú kompatibilné s bunkami stavovcov, sa môžu tiež použiť na vytvorenie rekombinantných DNA molekúl podlá predkladaného vynálezu. Expresné vektory eukaryotických buniek sú dobre známe v odbore a sú k dispozícii z rôznych komerčných zdrojov. Typicky tieto vektory obsahujú vhodné reštrikčné miesta na inzerciu požadovaného DNA segmentu. Typické takéto vektory sú pSVL a pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDTl (ATCC, #31255), pRc/CMV (Invitrogen, Inc.), výhodné vektory opísané v príkladoch a podobné eukaryotické expresné vektory.

Obzvlášť výhodný systém na génovú expresiu v kontexte tohto vynálezu zahŕňa komponent, ktorý doručí gén (a gene delivery component), t. z. schopnosť doručiť gén predmetnému tkanivu. Vhodné vektory sú „infekčné vektory, ako sú rekombinanté DNA vírusy, adenovírusové alebo retrovírusové vektory, ktoré sú zostrojené, aby exprimovali žiadaný protein a majú vlastnosti, ktoré umožnia infekciu vybraných cieľových tkanív. Obzvlášť výhodný je replikačne kompetentný vtáčí sarkómový vírus (RCAS), tu opísaný.

Bunkové systémy cicavcov, ktoré používajú rekombinanté vírusy alebo vírusové jednotky na priamu expresiu, sa môžu zostrojiť. Napríklad pri používaní adenovírusových expresných vektorov, kódujúca sekvencia polypeptidu sa môže ligovať s adenovírusových transkripčno/translačným riadiacim komplexom, napr. s neskorým promótorom a trojzložkovou vedúcou sekvenciou. Tento chimérický gén sa môže potom vložiť do adenovírusového genómu in vitro alebo in vivo rekombináciou. Inzercia do neesenciálnej oblasti vírusového genómu (napr. oblasť E1 alebo E3) poskytne rekombinantný vírus, ktorý je životaschopný a schopný exprimovať polypeptid v infikovaných hostiteľoch (pozri napr. Logan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3655-3659 (1984)). Alebo sa'môže použiť promótor 7.5K vírusu kravských kiahní (pozri napr. Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:7415-7419 (1982) ;

Mackett et al., J. Virol., 49:857-864 (1984)); Panicali et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:4927-4931 (1982)). Obzvlášť zaujímavé sú vektory založené na bovinnom papilomavíruse, ktoré majú schopnosť sa replikovať ako exptrachromozomálne jednotky (Sarver et al.. Mol. Celí. Biol., 1:486 (1981)). Krátko po vstupe tejto DNA do cieľových buniek sa plazmid replikuje na okolo 100 až 200 kópií na bunku. Transkripcia vloženej cDNA nevyžaduje integráciu plazmidu do.hostiteľského chromozómu, čím sa získava .vysoká hladina expresie. Tieto vektory sa môžu použiť na stabilnú expresiu zahrnutím selekčného markera do plazmidu, ako je neo gén. Alebo sa retrovírusový genóm môže modifikovať na použitie ako vektor schopný zaviesť a riadiť expresiu polypeptid kódujúcej nukleotidovej sekvencie v hostitelských bunkách (Cone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6349-6353 (1984)). Vysoká hladina expresie sa môže tiež dosiahnuť indukovatelnými promótormi vrátane, ale nie je to obmedzujúce, promótora metalotionínu IIA a promótorov teplotného šoku.

V súčasnosti sa študuje génová terapia dlhodobého prežívania založená na tymidínkináze (TK) pod vplyvom promótora cytomegalovírusu (CMV) versus promótora Rousovho sarkómu na nahých myšiach nesúcich ľudský ovariálny nádor. Účinnosť génovej terapie, založenej na TK vírusu herpes simplex pod vplyvom adenovírusom sprostredkovaného CMV promótora, zabíjať bunky sa ukázala byť 2 až 10 krát účinnejšia ako terapia závislá od RSV. (Tong et al., 1999, Hybridoma 18(1):93-97). Konštrukcia chimérických promótorov na použitia v génovej terapii, ktoré vyžadujú nízku hladinu expresie nasledovanú indukovateľnou vysokou hladinou expresie, bola tiež opísaná. (Suzuki et al., 1996, Human gene therapy 7:1883-1893).

Na dlhodobú produkciu rekombinantných proteínov - s vysokým výťažkom sa uprednostňuje stabilná expresia. Skôr ako používanie expresných vektorov, ktoré obsahujú vírusové počiatky replikácie, hostiteľské bunky sa môžu transformovať s cDNA riadenou vhodnými jednotkami riadiacimi expresiu (napr. promótorové alebo enhancerové sekvencie, terminátory transkripcie, polyadenylačné miesta atď.) a selekčným markerom. Ako je už spomenuté, selekčný marker v rekombinantnom plazmide prináša rezistenciu na selekciu a umožňuje, aby bunky stabilne integrovali plazmid do ich chromozómov a rástli tak, aby tvorili fókusy (jednotlivé kolónie), ktoré sa môžu klonovať a rozšíriť do bunkových línií.

Napríklad po introdukcii cudzej DNA, upravené bunky sa nechajú rásť 1-2 dni v obohatenom médiu a potom sa dajú na selekčné médium. Množstvo selekčných systémov sa môže použiť vrátane, ale nie je to limitujúce, génov tymidinkinázy vírusu herpex simplex (Wigler et al., Celí, 11:223 (1977)), hypoxantín-guanínfosforibozyltransferázy ( Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 48:2026 (1962)), a adenínfosforibozyltransferázy (Lowy et al., Celí, 22:817 (1980), ktoré sa môžu použiť v bunkách tk , hgprt', alebo aprt ako je uvedené. Gény prinášajúce rezistenciu na antimetabolit sa ťiež môžu použiť ako základ pre selekciu; napríklad gény pre dhfr, ktoré prinášajú rezistenciu na metotre xát (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:1527 (1981); gpt, ktorý prináša rezistenciu na kyselinu mykofenolovú (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:2072 (1981); neo, ktorý prináša rezistenciu na aminoglykozid G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981); a hydro, ktorý prináša rezistenciu na hydromycin (Santerre et al., Gene, 30:147 (1984). V súčasnosti sú opísané ďalšie selekčné gény menovite trpB, ktorý umožňuje bunkám využiť indol namiesto tryptofánu; hisD, ktorý umožňuje bunkám využiť histinol namiesto histidínu (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:804 (1988); a ODC· (ornitíndekarboxyláza) , ktorý prináša rezistenciu na inhibítor· ornitíndekarboxylázy, 2-(difluórmetyl)-DL-ornitín, DFMO (McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., (1987)).

Základné vektory uvažované pre génovú terapiu sú retrovírusového pôvodu. (Wilson, 1997, Clin. Exp. Immunol. 107(Sup.

1):31-32,- Bank et al., 1996, Bioessa'ys 18(12):999-1007,- Robbins et al., 1998, Pharmacol. The'r. 80(1):35-47). Terapeutický potenciál génového, prenosu a ' antisense terapie stimuloval vývoj mnohých vektorových systémov na liečenie rôznych tkanív, (vasculature, Stephan et al., 1997, Fundam. Clin. Pharmacol. 11(2):97110; Feldman et.al., 1997, Cardiovasc. Res. 35(3.):391-404/ Vassali et al., 1997, Cardiovasc,. Res. 35 (3):459-69,- Baek et al., 1998, Circ. Res. 82(3):295-305,- oblička, Lien et al., 1997, Kidney Int. Suppl. 61:S85-8; pečeň, Ferry et al., 1998, Hum Gene Ther. 9(14):1975-81; sval, Marshall et al., 1998, Curr. Opn. Genet. Dev. 8(3):360-5). Okrem týchto tkanív je kritickým cielom ľudskej génovej terapie rakovina, buď nádor sám osebe alebo asociované tkanivá. (Runnebaum, 1997, Anticancer Res. 17(4B):2887-90; Spear et al., 1998, J. Neurovirol. 4(2):133-47).

Špecifické príklady vektorových systémov vírusovej génovej terapie sú ľahko prispôsobitelné na použitie v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu a sú stručne opísané ďalej. Doručenie génu retrovirusom skúmajú v súčasnosti Federspiel a Hughes (1998, Methods in Celí Biol. 52:179-214), kde sa hlavne opisuje retrovírusová rodina vírusu vtáčej leukózy (AVL) (Federspiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4931 (1996); Federspiel et al.·, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:11241 (1994)). Retrovírusové vektory vrátane AVL a vírusu myšej leukémie (MLV) ďalej opisuje Svoboda (1998, Gene 206:153-163).

Modifikované retrovirusovo/adenovírusové expresné systémy sa môžu ľahko prispôsobiť praxi spôsobov podľa predkladaného vynálezu .

Napríklad systémy vírusu myšej leukémie (MLV) skúmal Karavanas et al., 1998, Crit. Rev.

in Oncology/Hematology

28:7-30.

Adenovírusové expresné systémy skúmali Von

Seggern a Nemerow v Gene Expression Systems (ed.

Fernandez &

Hoeffler,

Academic

Press, San Diego, CA, 1999, chapter 5, strany

112-157) .

Ukázalo sa, že proteínové expresné systémy majú účinnosť in vivo aj in vitro. Napríklad je opísaná účinnosť génového prenosu do karcinómu ľudských skvamóznych buniek pomocou amplikónového vektora (amplicon vector) vírusu herpes simplex (HSV) typu 1. (Carew et al., 1998, Am. J. Surg. 176:404-408). Herpes simplex vírus sa použil na prenos génu do nervového systému. (Goins et al., 1997, J. Neurovirol. 3(Sup. l):S80-8). Cielené samovražedné vektory používajúce HSV-TK sa testovali na pevných tumoroch. (Smiley et al., 1997, Hum. Gene Ther. 8(8):965-77). Vektor vírusu herpes simplex typu 1 sa použil v génovej terapii na bunkách karcinómu hrubého čreva. (Yoon et al., 1998, Ann. Surg. 228(3):366-74). Hybridné vektory boli vyvinuté s cieľom predĺžiť čas transfekcie, vrátane HSV/AAV (adenoasociovaný vírus) hybridov na liečenie hepatocytov. (Fraefel et al., 1997, Mol. Med. 3(12) :813-825) .

Vírus kravských kiahní bol vyvinutý na ľudskú génovú terapiu kvôli jeho veľkému genómu. (Peplinski et al., 1998, Surg. Oncol.

Clin. N. Am. 7(3):575-88). Vírus kravských kiahní s deletovanou tymidínkinázou exprimujúci purínnukleozidpyrofosforylázu bol opísaný na použitie ako vektor cielenej génovej nádorovej terapie. (Puhlman et al., 1999, Human Gene Therapy 10:649-657).

Adenoasociovaný vírus 2 (AAV) bol opísaný na použitie v génovej terapii, avšak AAV vyžaduje pomocný (helper) vírus (ako je adenovírus alebo herpes vírus) na optimálnu replikáciu a vbaľovanie vbunkách cicavcov. (Snoeck et al., 1997, Exp. Nephrol. 5(6):514-20; Rabinowitz et al., 1998, Curr. Opn. Biotechnol. .9(5):470-5). Avšak bolo opísané in vitro vbalovanie infekčného rekombinantného AAV, čo robí tento systém oveľa sľubnejším. (Ding et al., 1997, Gene Therapy 4:1167-1172). Ukázalo sa, že AAV sprostredkovaný prenos cDNA ekotropného (ecotropic) vírusového receptora umožňuje ekotropnú retrovírusovú transdukciu vytvorených a primárnych ľudských buniek. (Qing et al., 1997, J. Virology 71(7):5663-5667). Demonštrovala sa nádorová génová terapia používajúca AAV vektor exprimujúci ľudský p53 divého typu. (Qazilbash et al., 1997, Gene Therapy 4:675-682). Génový prenos do vaskulárnych buniek použitím AAV vektorov bol tiež. ukázaný. (Maeda et al., 1997, Cardiovascular Res. 35:514-521). AAV sa ukázal ako vhodný vektor na cielenú génovú terapiu pečene. (Xiao et al., 1998, J. Virol. 72(12):10222-6). AAV vektory boli demonštrované na použitie v génovej terapii tkaniva mozgu a centrálneho nervového systému. (Chamberlin et al., 1998, Brain Res. 793(1-2):169-75,- During et al., 1998, Gene Therapy 5(6):820-7). AAV vektory sa tiež porovnávali s adenovírusovými vektormi (AdV) na génovú terapiu pľúc a prenosu do epitelových buniek cystickej fibrózy. (Teramoto et al., 1998, J. Virol. 72(11):8904-12).

Chimérické vektorové systémy AdV/retrovírus na génovú terapiu, ktoré majú vhodné kvality každého vírusu s cieľom vytvoriť neitegračný AdV, ktorý je spravený funkčne integračný prostredníctvom prechodnej generácie retrovírusovej produkčnej bunky. (Eeng et al., 1997, Nat. Biotechnology 15(9):866-70; Bilbao et al., 1997, FASEB J 11(8):624-34). Táto silná nová generácia vektora génovej terapie sa adaptovala na cielenú nádorovú génovú terapiu. (Bilbao et al., 1998, Adv. Exp. Med. Biol. 451:365-74). Jedna injekcia AdV exprimujúceho p53 inhibovala rast subkutánnych tumorových nodulov buniek ľudskej rakoviny prostaty. (Asgari et al., 1997, Int. J. Cancer 71(3):377-82). Bol opísaný AdV sprostredkovaný génový prenos p53 divého typu pacientom s pokročilou „non-small celí rakovinou pľúc. (Schuler et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2075-2082). Tento typ rakoviny sa podrobil náhradnej p53 génovej terapii sprostredkovanej vektormi AdV. (Roth et al., 1998, Semin. Oncol. 25(3 Suppl 8):33-7). AdV sprostredkovaný génový prenos p53 inhibuje diferenciáciu endoteľových buniek a angiogenézu in vivo. (Riccioni et al., 1998, Gene Ther. 5(6):747-54). Adenovírusom sprostredkovaná expresia melanómového antigénu gp75 ako imunoterapia pre metastatický melanóm bola tiež opísaná. (Hirschowitz et al., 1998, Gene Therapy 5:975-983). AdV uľahčuje infekciu ľudských buniek ekotropným retrovírusom a zvyšuje účinnosť retrovírusovej infekcie. (Scott-Taylor, et al., 1998, Gene Ther. 5(5):621-9). AdV vektory sa používajú na prenos génu do vaskulárnych buniek hladkého svalstva (Li et al., 1997, Chin. Med. J. (Engl.) 110(12):950-4), do buniek kärcinómu skvamóznych buniek (Goebel et al., 1998, Otolarynol Head Neck Surg 119(4):331-6), do rakovinových buniek ezofágu (Senmaru et al., 1998, Int J. Cancer 78(3):366-71), do mezangiálnych buniek (Nahman et al., 1998, J. Investig. Med. 46(5):204-9), do gliových buniek (Chen et al., 1998, Cancer Res. 58(16):3504-7), a do kĺbov zvierat (íkeda et al., 1998, J. Rheumatol. 25(9):1666-73). V súčasnosti sa demonštroval perikardiálny génový prenos sprostredkovaný AcV vektormi založený na katétri. (March et al. , 1999, Clin. Cardiol. 22(1 Suppl 1):1239). Manipulácia AdV systému s náležitými riadiacimi genetickými jednotkami umožňuje AdV sprostredkovanú regulovateľnú cielenú génovú expresiu in vivo. (Burcin et al., 1999, PNAS (USA) 96 (2) :355-60) .

Na aplikácie v ľudskej génovej terapii sa vyvinuli alfavirusové vektory s vbaľovacími bunkovými líniami vhodnými na transformáciu expresnými kazetami vhodnými na použitie s vektormi odvodenými zo Sindbis vírusu a Semliki Forest vírusu. (Polo et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:4598-4603). Tiež boli vyvinuté systémy založené na necytopatickom flavivírusovom RNA replikóne. (Varnavski et al., 1999, Virology 255(2):366-75). Na bunkovo špecifické zacielenie do tumorových buniek sa použili vektory založené na sinbis víruse obsahujúce suičidálny HSV-TK gén. (Iijima et al., 1998, Int.· J. Cancer 80(1):110-8).

Retrovírusové vektory založené na ľudskom penovom víruse (HFV, human foamy vírus) sú tiež sľubné ako vektory génovej terapie. (Trobridge et al., 1998, Human Gene Therapy 9:25.17-2525). Vektory penového vírusu sa skonštruovali na samovražednú génovú terapiu. (Nestler et al., 1997, Gene Ther. 4(11):1270-7). Ako vektory zabezpečujúce vysokú úroveň expresie sa použili aj rekombinantné myšie cytomegalovírusové a promótorove systémy (Manning et. al., 1998, J. Virol. Meth., 73(1):31-9; Tong et. al., 1998, Hybridoma, 18(1):93-7).

Doručenie génov do nedeliacich sa buniek sa stalo uskutočniteľným vďaka generácii vektorov založených na Sendai víruse (Nakanishi et. al., 1998, J. Controlled Release, 54(1):61-8).

Pri ďalšom úsilí umožniť transformáciu nedeliacich sa somatických buniek sa skúmali lentivírusové vektory. Bola opísaná génová terapia cystickej fibrózy pomocou vektorov založených na víruse ľudskej imunodeficiencie (HIV) s porušenou replikáciou (Goldman et. al., 1997, Human Gene Therapy, 8:2261-2268). Demonštrovala sa aj neprerušovaná expresia génov doručených do pečene a svalov pomocou lentivírusových vektorov (Kafri et. al., 1997, Nat. Genet., 17(3):314-7). Avšak bezpečnostné záujmy sú rozhodujúce a vývoj zdokonalených vektorov postupuje výrazne dopredu (Kim et. al., 1998, J. Virol., 72(2):994-1004). Výskum HIV LTR a

Tat priniesol dôležité informácie o organizácii genómu, potrebné pre vývoj vektorov (Sadaie et. al., 1998, J. Med. Virol., 54(2):118-28)). Genetické požiadavky na efektívny vektor založený na HIV sú teraz teda lepšie pochopené (Gasmi et. al·., J. Virol., 1999, 73(3):1828-34). Boli opísané samoináktivujúce vektory alebo podmienečne vbalujúce bunkové línie (napr., Zuffery et. al., 1998, J. Virol., 72 (12) : 9873-80; Miyoshi et. al., 1998,

J. Virol., 72(10):8150-7; Duli et. al., 1998, J. Virol., 72 (11):8463-71,- a Kaul et. al., 1998, Virology, 249 (1):167-74). Pomocou HIV vektorov sa demonštrovala efektívna transdukcia ľudských lymfocytov a CD34+ buniek (Douglas et. al., 1999, Hum. Gene Ther., 10(6):935-45,- Miyoshi et. al., 1999, Science, 283(5492):682-6). Bola opísaná efektívna transdukcia nedeliacich sa ludských buniek pomocou lentivírusových vektorov vírusu mačacej imunodeficiencie (FIV), ktorý minimalizuje nebezpečenstvo použitia vektorov založených na HIV (Poeschla et. al., 1998, Náture Medicíne, 4(3):354-357). Demonštrovala sa produktívna infekcia ludských krvných mononukleárnych buniek pomocou FIV vektorov (Johnston et. al., 1999, J. Virol., 73(3):2491-8).

Zatiaľ čo sa s mnohými vírusovými vektormi ťažko manipuluje a kapacita inzertovanej DNA je limitovaná, venoval sa výskum aj týmto obmedzeniam a nevýhodám, vbalovacích bunkových línií sa vektory, odvodené od ľudského

Okrem zjednodušených vírusových napríklad vyvinuli minivírusové herpes vírusu, herpes simplex vírusu typu 1 (HSV-1) a vírusu Epsteina-Barrovej (EBV), s cieľom zjednodušiť manipuláciu s genetickým materiálom a generáciami vírusových vektorov (Wang et. al., 1996, J. Virology,

70(12):8422-8430). Ukázalo sa, že na zjednodušenie inzercie cudzorodej DNA do retrovírusových vektorov nezávislých od helperov je možné použiť adaptorové plazmidy (1987, J. Virology, 61(10):3004-3012).

Vírusové vektory nie sú jediným prostriedkom na uskutočňovanie génovej terapie, už sa tiež opísalo niekoľko nevírusových vektorov. Cielené nevirusové vektory doručujúce gény založené na použití polyplexu epidermálny rastový faktor/DNA (EGF/DNA) sa ukázali byť účinné a špecifické na doručovanie génov (Cristiano, 1998, Anticancer Res., 18:3241-3246). Demonštrovala sa génová terapia vaskulatúry a CNS pomocou katiónových lipozómov. (Yang et. al., 1997, J. Neutotrauma, 14(5):281-97). Pomocou katiónových lipozómov sa uskutočnila aj dočasná génová terapia pankreatitídy (Denham et. al., 1998, Ann. Surg., 227(6):812-20). Ako účinné pre doručenie génu sa ukázali komplexy vektor založený na chitózane/DNA. (Erbacher et. al., 1998, Pharm. Res., 15(9):13329). Bol opísaný nevírusový vektor doručujúci DNA založený na terplexovom systéme (Kim et. al., 1998, 53(1-3):175-82). Na účinný prenos génov sa použili aj lipozómové komplexy pokryté vírusovými .časticami (Hirai et. 'al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 241(1):112-8).

Demoštrovala sa génová terapia priamymi injekciami nevírusového vektora T7 kódujúceho gén tymidínkinázy do tumoru. (Chen et al., 1998, Human Gene Therapy, 9:729-736). Príprava plazmidovej DNA je dôležitá pre prenos génov priamou injekciou (Horn et. al., 1995, Hum. Gene. Ther., 6(5):656-73). Špecificky na priamu injekciu sa upravili modifikované plazmidové vektory (Hartikka et. al., 1996, Hum. Gene Ther., 7(10):1205-17).

V odbore je teda známa široká škála mnohých vektorov a konštruktov na prenos génov a génovú terapiu. Tieto vektory sú vhodne prispôsobené na použitie v spôsoboch podlá predkladaného vynálezu. Vhodnou manipuláciou pomocou techník rekombinantných DNA a molekulárnej .biológie, ktorými je možné vložiť operatívne spojené Src a Yes, alebo obidva (buď aktívne alebo neaktívne) do zvoleného expresného alebo doručovacieho vektora, je možné vytvoriť mnoho zodpovedajúcich vektorov vhodných na použitie v predkladanom vynáleze.

E. Spôsoby na moduláciu vaskulárnej permeability (VP)

Vynález poskytuje spôsob na moduláciu vaskulárnej permeability (VP) krvných ciev v tkanive asociovanom s chorobným procesom alebo stavom, a tým ovplyňuje udalosti v tkanive, ktoré závisia od VP. Všeobecne, spôsob zahŕňa podanie kompozície obsahujúcej VP modulujúce množstvo proteínu Src alebo Yes alebo ich zmesi, alebo vektor nukleovej kyseliny exprimujúci aktívny alebo inaktívny Src alebo Yes, alebo obidva, alebo inhibitor tyrozínkinázy rodiny Src, ako je chemický Src inhibitor, proteínový Src inhibitor, alebo inhibitor Src nukleovej kyseliny podľa spôsobov tohto vynálezu, tkanivu asociovanému, s chorobným procesom alebo stavom.

Ako je tu opísané, ktorékoľvek z množstva tkanív, alebo orgánov zložených z organizovaných tkanív, môže byť· miestom pre VP pri chorobných stavoch vrátane mozgu, kože, svalu, čreva, spojivového' tkaniva, kĺbov, kostí a podobného tkaniva, v ktorom sa nachádzajú krvné cievy.

V predkladanom vynáleze a v jeho mnohých uskutočneniach je ošetrovaný pacient vhodne ľudský pacient, hoci je pochopiteľné, že princípy predkladaného vynálezu sú účinné aj pokiaľ ide o všetky cicavce, ktoré sa dajú zahrnúť do termínu „pacient. V tejto súvislosti je cicavec chápaný ako akýkoľvek druh cicavca, u ktorého je žiadané liečenie tkaniva asociovaného s ochoreniami týkajúcimi sa angiogenézy, obzvlášť ide o hospodárske a domáce druhy cicavcov.

Takže spôsob obsahuje podanie terapeuticky účinného množstva fyziologicky tolerovateľnej kompozície obsahujúcej proteín Src alebo Yes, alebo ich zmes, alebo DNA vektor na expresiu proteínu Src alebo Yes, alebo oboch, alebo inhibitor tyrozínkinázy rodiny Src, ako je chemický inhibitor Src, proteínový inhibitor Src, alebo inhibitor Src nukleovej kyseliny, pacientovi.

Rozsah dávky na podanie proteínu Src alebo Yes závisí od formy proteínu a jeho účinnosti, ako je opísané ďalej, a sú množstvá dostatočne velké, aby mali žiadaný efekt, pri ktorom sú VP a chorobné symptómy sprostredkované VP zmiernené. Dávka by nemala byť tak velká, aby spôsobila škodlivé vedľajšie účinky, ako sú syndrómy hyperviskozity, pulmonálny edém, kongestívne zlyhanie srdca a pod. Všeobecne bude dávka rôzna v závislosti od veku, stavu, pohlavia a rozsahu ochorenia u pacienta a môže byť určená odborníkom v odbore. Dávka môže byť tiež upravená osobným lekárom v prípade akejkoľvek komplikácie.

Terapeuticky účinné VP modulujúce množstvo je množstvo proteínu Src alebo Yes alebo ich zmesi, alebo nukleovej kyseliny kódujúcej proteín Src alebo Yes, účinné na vyvolanie meratelnej modulácie VP v liečenom tkanive, t. z., VP modulujúce množstvo. Modulácia VP sa môže merať analýzou ako je tu opísaná, alebo inými metódami známymi odborníkovi v odbore. Modulácia VP sa môže merať Millerovou analýzou tu opísanou alebo inými metódami známymi odborníkovi v odbore.

Proteín Src alebo Yes alebo vektor nukleovej kyseliny exprimujúci proteín Src alebo Yes, alebo obidva, sa môžu podať parenterálne injekciou alebo postupnou infúziou v čase (over time). Hoci tkanivo určené na liečenie môže byť v tele prístupné systemickému podaniu a teda sa môže liečiť najčastejšie intravenóznym podaním farmaceutických kompozícií, iné tkanivá a prostriedky doručovania sú určené tam, kde existuje pravdepodobnosť, že cieľové tkanivo obsahuje cieľovú molekulu. Teda, kompozície podľa vynálezu sa môžu podávať intravenózne, intraperitoneálne, intramuskulárne,. subkutánne, inťrakavitárne, transdermálne a môžu sa doručiť peristaltickými prostriedkami.

Terapeutické kompozície obsahujúce proteín Src alebo Yes alebo vektor nukleovej kyseliny exprimujúci proteín Src alebo Yes sa môžu podávať konvenčné intravenózne, a to napríklad injekciou jednotkovej dávky. Termín „jednotková dávka sa používa ako odkaz na terapeutickú kompozíciu podľa predkladaného vynálezu, a označuje fyzicky samostatné jednotky vhodné ako jednotková dávka pre subjekt, pričom každá dávka obsahuje určené množstvo aktívnej látky vypočítané tak, aby prinieslo žiadaný terapeutický efekt v spojení s požadovaným riedidlom; t. ₍z. , nosičom alebo vehikulom.

Vo výhodnom uskutočnení sa reagent podáva v jednej dávke intravenózne. Lokalizované podanie sa môže uskutočniť priamou injekciou alebo využitím výhod anatomicky izolovaných kompartmentov, izolovaním mikrocirkulácie cieľových orgánových systémov, reperfúziou v systéme cirkulácie, alebo dočasnou oklúziou cieľových oblastí vaskulatúry asociovanej s chorými tkanivami, založenou na katétri.

Kompozície sú podávané spôsobom kompatibilným s dávkovou formuláciou a v terapeuticky účinnom množstve. Množstvo, ktoré sa má podať a načasovanie závisí od liečeného subjektu, od schopnosti systému subjektu využiť účinnú zložku, a stupňa požadovaného terapeutického účinku. Presné množstvá účinnej zložky požadovanej na podanie závisia od úsudku lekára praktika a sú charakteristické pre každého jedinca. Avšak tu zistené vhodné dávkové rozsahy na systemickú aplikáciu závisia od spôsobu podania. Vhodné režimy na podanie sú tiež rôzne a sú príkladom počiatočného podania nasledovaného opakovanými dávkami v jedno alebo viachodinových intervaloch dodatočnou injekciou alebo ďalším podaním. Alebo sa zváži kontinuálna intravenózna infúzia postačujúca na udržanie koncentrácií v krvi v rozsahu určenom pre in vivo terapie.

Existuje množstvo ochorení, pri ktorých sa inhibícia angiogenézy považuje za dôležitú, a tie sa označujú ako angiogenetické ochorenia vrátane, ale nie je to obmedzujúce, zápalových porúch ako sú imunitné alebo neimunitné zápaly, chronického artikulárneho reumatizmu a psoriázy, porúch asociovaných s nevhodnou alebo neprimeranou inváziou ciev ako je diabetická retinopatia, neovaskulárneho glaukómu, restenózy, kapilárnej proliferácie v aterosklerotických plakoch a osteoporózy, a porúch asociovaných s rakovinou ako sú pevné tumory, metastázy pevných tumorov, angiofibrómy, retrorentálna fibroplázia, hemangiómy, Kaposiho sarkóm a podobné typy rakoviny, ktoré vyžadujú neovaskularizáciu na podporu rastu tumoru.

Podobne vaskulárna permeabilita je dôležitou zložkou angiogenézy a je sama o sebe priamo asociovaná so škodlivými patológiami. Napríklad, poškodenie spôsobené mŕtvicou indukovanou vaskulárnou permeabilitou spúšťa zápal súvisiaci s poškodením.

Teda spôsoby, ktoré inhibujú vaskulárnu permeabilitu v tkanive asociovanom s chorobným stavom, zlepšujú symptómy ochorenia a v závislosti od ochorenia môžu prispieť k vyliečeniu ochorenia. V jednom uskutočnení je cieľom vynálezu inhibícia vaskulárnej permeability, per se, v tkanive asociovanom s chorobným stavom. Rozsah vaskulárnej permeability v tkanive, a teda rozsah inhibície dosiahnutej pomocou predkladaných spôsobov sa môže vyhodnotiť množstvom metód.

Teda v súvisiacom uskutočnení liečené tkanivo je zapálené tkanivo a vaskulárna permeabilita, ktorá sa má inhibovať, je spôsobepá VEGF sprostredkovanou stimuláciou. V tejto kategórii spôsob znamená inhibíciu VP v artritických tkanivách ako u pacienta s chronickým artikulárnym reumatizmom, v imunitné alebo neimunitne zapálených tkanivách, v psoriatickom tkanive a pod.

V ďalšom súvisiacom uskutočnení, liečené tkanivo je retinálne tkanivo pacienta s retinálnym ochorením ako je diabetická retinopatia, makulárna degenerácia alebo neovaskulárny glaukóm a VP, ktorá sa má inhibovať, je VP retinálneho tkaniva, kde je neovaskularizácia retinálneho tkaniva.

Tieto spôsoby sú obzvlášť účinné proti tvorbe metastáz, pre tože (1) ich tvorba vyžaduje vaskularizáciu primárneho tumoru, aby mohli metastatické bunky rakoviny opustiť primárny tumor a (2) ich založenie v sekundárnom mieste vyžaduje neovaskularizáciu na podporu rastu metastáz.

V súvisiacom uskutočnení je cieľom vynálezu vykonávanie spôsobu v spojení s inými terapiami ako je konvenčná chemoterapia namierená proti pevným tumorom a na kontrolu zakladania metastáz. Podávanie VP inhibítora sa deje počas alebo po chemoterapii, hoci je výhodné inhibovať VP po chemoterapeutickom režime v čase, kedy bude tumorové tkanivo odpovedať na toxické napadnutie indukovaním VP, aby sa obnovilo s podmienkou dodania krvi a živín tumorovému tkanivu. Naviac, je možné poskytnúť spôsoby inhibície vaskulárnej permeability po operácii, kde sa pevné tumory odstránili, ako profylaxiu proti metastázam.

Pokiaľ sa predkladané spôsoby využijú na inhibíciu vaskulárnej permeability súvisiacu s metastázami, tieto spôsoby sa môžu taktiež využiť na inhibíciu tvorby metastáz a na regresiu založených tumorov.

Restenóza je proces migrácie hladkej svalovej bunky (SMC) a proliferácia do tkaniva na mieste perkutánnej transluminálnej koronárnej angiopiastiky, čo bráni úspešnej angioplastike. Migrácia a proliferácia SMC počas restenózy sa dá považovať za proces VP, ktorý je inhibovaný predkladanými spôsobmi. Preto vynález tiež zahŕňa inhibíciu restenózy inhibovaním vaskulárnej permeability podľa predkladaných spôsobov u pacienta po angioplastickom zákroku. Na inhibíciu restenózy sa podáva inaktivovaná tyrozínkináza po angioplastickom zákroku, pretože stena koronárnej cievy je ohrozená restenózou typicky na od okolo 2 do okolo 28 dní a typickejšie na prvých asi 14 dní po zákroku.

Predkladaný spôsob na inhibíciu vaskulárnej permeability v tkanive asociovanom s chorobným stavom, a teda tiež na použitie spôsobov na liečenie ochorení spojených s vaskulárnou perme abilitou, zahŕňa kontaktovanie tkaniva, v ktorom sa vyskytla zvýšená vaskulárna permeabilita alebo existuje riziko, že sa v ňom vyskytne, s kompozíciou obsahujúcou terapeuticky účinné množstvo inaktivovaného proteínu Src a/alebo Yes alebo vektor exprimujúci tento proteín.

I

V prípadoch, kde sa požaduje podporenie alebo potenciácia VP, je vhodné podanie aktívneho proteínu Src a/alebo Yes tkanivu. Spôsob a načasovanie podania sú porovnateľné so spôsobmi na inhibíciu tu už opísanými.

Napríklad je tiež zahrnutá manipulácia s permeabilitou hematoencefalickej bariéry na moduláciu prístupu liečiv do tkaniva mozgu. Zvýšenie vaskulárnej permeability hematoencefalickej bariéry umožní liečivám, ktoré bežne neprestúpia bariérou, vstúpiť do tkaniva mozgu.

Presná modulácia angiogenézy v spojení s VP sa môže požadovať, a teda sa môže podať zmes aktívnych a inaktívnych foriem proteínu Src, proteínu Yes alebo exprimovatelných nukleových kyselín kódujúcich proteín Src alebo Yes.

Inhibícia alebo potenciácia angiogenézy sa jasne objavuje v priebehu 5 až 7 dní po počiatočnom kontakte s terapeutickou kompozíciou z príkladov. Podobne modulácia VP sa môže objaviť v podobnom časovom rámci. Účinky sa môžu objaviť v krátkom čase po podaní terapeutickej kompozície. Faktory limitujúce čas zahŕňajú rýchlosť absorpcie tkaniva, bunkový príjem, translokáciu proteínu alebo transláciu nukleovej kyseliny (v závislosti od terapeutika) a zacielenie proteínov. Teda, VP modulujúce účinky sa môžu objaviť ' v takom krátkom' čase, ako je jedna hodina po podaní. Môže sa urobiť dodatočná alebo predĺžená expozícia inaktívnemu proteínu Src a/alebo Yes, s využitím náležitých podmienok. Takže sa môže určiť množstvo žiadaných terapeutických časových rámcov modifikovaním takýchto parametrov.

Spôsob podľa vynálezu tiež obsahuje podávanie kompozície obsahujúcej inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src tkanivu asociovanému s chorobným procesom alebo s poranením krvnej cievy alebo traumatickým stavom. Inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src môže byť, chemický inhibítor, proteínový Src inhibítor alebo inhibítor Src nukleovej kyseliny.

Príklady vhodného chemického inhibítora tyrozínkinázy rodiny Src zahŕňajú, ale nie je to obmedzujúce, PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 a Geldanamycin a podobne.

PP1 (od Biomol, s licenciou od Pfizer), bol syntetický inhibítor Src použitý pre tieto štúdie. PP1 je časť pyrazolopyrimidinovej rodiny inhibítorov Src. Ďalšie syntetické Src inhibítory zahŕňajú PP2 (od Calbiochem, s licenciou od Pfizer), ktorý je štruktúrou príbuzný PP1 a ukázalo sa, že tiež blokuje aktivitu kináz rodiny Src. (Hanke et al·., 1996, J. Biol. Chem. 271(2): 695-701) . Ďalšie špecifické inhibítory kinázy Src zahŕňajú PD173955 (Moasser et al., 1999, Cancer Res. 59:6145-6152; Parke Davis), ktorého štruktúra bola publikovaná. PD162531 (Owens et al., 2000, Mol. Biol. Celí 11:51-64) je tiež špecifický inhibítor kinázy Src od Parke Davis, ale jeho štruktúra nie je prístupná v literatúre. Geldanamicin je tiež inhibítor kinázy Src, k dispozícii od Life Technologies. Radicicol, ktorý sa ponúka komerčne od rôznych spoločností (napr. Calbiochem, RBI, Sigma), je fungicídne makrocyklické laktónové antibiotikum, ktoré tiež účinkuje ako nešpecifický inhibítor proteínu tyrozínkinázy a ukázalo sa, že inhibuje aktivitu kinázy Src. Výhodné chemické inhibítory sú PP1 a PP2 alebo podobné, najvýhodnejší je chemický inhibítor PP1.

Dodatočné vhodné inhibítory tyrozíkinázy rodiny Src sa môžu identifikovať a charakterizovať s použitím štandardných analýz známych v odbore. Napríklad sa uskutočňuje skríning chemických zlúčenín na účinné a selektívne inhibítory Src a iných kináz a výsledkom je identifikácia chemických zložiek účinných v silných inhibítoroch tyrozinkináz rodiny Src.

Napríklad, katecholy sa identifikovali ako dôležité viažuce elementy pre množstvo inhibitorov tyrozinkinázy odvodených od prírodných produktov a našli sa v zlúčeninách vybratých kombinatorickou cieľovo vedenou selekciou na selektívne inhibítory c-Src. Malý, D.J., et al., (2000, „Combinatorial target-guided ligand assembly: Identification of potent subtype-selective c-Src inhibitors PNAS, (USA) 97(6): 2419-2424). Kombinatorická chémia založená na skríningu kandidátnych zlúčenín inihítorov, s použitím zložiek známych tým, že sú dôležité v inhibícii Src ako štartovací bod, je silný a efektívny prostriedok na izoláciu a charakterizáciu iných chemických inhibitorov tyrozinkináz rodiny Src.

Avšak, aj opatrná selekcia potenciálnych viažucich elementov založená na možnosti napodobovania účinkom (mimicking) širokého rozsahu funkčností polypeptidov a nukleových kyselín sa môže použiť na vykonávanie kombinatorických skríningov na aktívne inhibítory. Napríklad, O-metyloxímové knižnice sú obzvlášť vhodné na túto úlohu, keďže sa táto knižnica ľahko pripraví kondenzáciou O-metylhydroxylamínu s akýmkoľvek z veľkého počtu komerčne dostupných aldehydov. Vytvorenie O-alkyloxímu je kompatibilné s širokým rozsahom funkčností, ktoré s'ú stabilné pri fyziologickom pH. Malay et al., supra.

Ako už bolo opísané, vhodné inhibítory tyrozinkináz rodiny Src zahŕňajú aj VP inhibujúce množstvo inaktívneho proteínu Src alebo Yes, alebo ich zmes, alebo vektor nukleovej kyseliny exprimujúci inaktívny Src alebo Yes, alebo oba, podľa spôsobov tohto vynálezu.·

Iné vhodné inhibítory tyrozinkinázy rodiny Src zahŕňajú CSK, alebo vektor nukleovej kyseliny exprimujúci inaktivujúce množstvá CSK, podľa spôsobov tohto vynálezu.

Ako už bolo opísané, akékoľvek z množstva tkanív alebo orgánov obsahujúcich organizované tkanivá môže byť miestom pre VP pri chorobných stavoch vrátane mozgu, kože, čreva, spojivového tkaniva, kĺbov, kostí, a podobných tkanív, kde sa nachádzajú krvné cievy.

Pacient, ktorý sa môže liečiť spôsobom uskutočneným v predkladanom vynáleze je vhodne ludský pacient, hoci je pochopiteľné, že princípy tohto vynálezu ukazujú, že predkladané spôsoby sú účinné aj pokial ide o všetky cicavce. Preto sú následne zahrnuté v termíne „pacient, ako sa tu uvádza. V tejto súvislosti je cicavec chápaný ako akýkoľvek druh cicavca, u ktorého je žiaduce liečenie vaskulárneho presakovania a edému asociovaného s poškodením tkaniva, obzvlášť ide o hospodárske a domáce druhy cicavcov.

Spôsob uskutočňujúci tento vynález obsahuje: podávanie terapeuticky účinného množstva fyziologicky tolerovatelnej kompozície obsahujúcej chemický inhibitor tyrozínkinázy rodiny Src, inaktívny proteín Src alebo Yes, aktívny proteín CSK, nukleovú kyselinu kódujúcu takýto proteín alebo ich zmes cicavčiemu pacientovi, pri vykonávaní spôsobov tohto vynálezu.

Rozsah dávok na podávanie chemických inhibitorov tyrozínkinázy rodiny Src, ako je PP1 môže byť v rozsahu okolo .1 mg/kg telesnej hmotnosti do 10 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo môže byť v rozsahu miery rozpustnosti aktívneho činidla vo farmaceutickom nosiči. Výhodne sa typické dávky môžu pohybovať od okolo 1 mg/kg telesnej hmotnosti do okolo 9 mg/kg telesnej hmotnosti. Nižšie dávky ako od .1 mg/kg telesnej hmotnosti do okolo 1 mg/kg telesnej hmotnosti sa môžu optimalizovať pre mnohonásobné podávanie na liečenie chronických stavov. Typické dávky na liečenie akútnych stavov, ktoré sú menej kritické, ľahko prístupné a kde spôsob podávania je priamejší, môžu byť od okolo 1 mg/kg telesnej hmotnosti do okolo 3 mg/kg telesnej hmotnosti. V závislosti od zavážnosti poranenia, umiestnenia alebo spôsobu podávania, sa môže použiť vyššia dávka od okolo 3 mg/kg telesnej hmotnosti do 10 mg/kg telesnej hmotnosti (alebo v rozsahu miery rozpustnosti činidla vo farmaceutickom nosiči), keď ide o vážne poranenie, ťažko dostupné miesto, alebo kde sa podávanie môže robiť len nepriamou systemickou cestou.

V prípade akútneho poranenia alebo traumy je najlepšie podať ošetrenie najskôr, ako je to možné potom, ako sa udalosť stala. Avšak čas na účinné podanie inhibítorov tyrozínkinázy rodiny Src môže byť v rámci 48 hodín od začiatku poranenia alebo traumy, v prípade akútnych nehôd. Uprednostňuje sa podanie v rámci asi 24 hodín od začiatku, v rámci 12 hodín je lepšie a najvýhodnejšie sa podanie uskutoční v rámci 6 hodín od začiatku. Podanie po 48 hodinách od počiatočného poranenia je primerané na zlepšenie ďalšieho poškodenia tkaniva kvôli postupujúcemu vaskulárnemu presakovaniu a edému, avšak účinok na prvotné poškodenie tkaniva sa môže do veľkej miery znížiť.

Tam, kde má profylaktické podávanie zamedziť vaskulárnemu presakovaniu alebo edému spojenému s chirurgickým zákrokom, alebo sa uskutočňuje s ohľadom na predispozičné diagnostické kritérium, podávanie sa uskutočňuje pred akýmkoľvek aktuálnym zvýšením VP, alebo počas udalosti spôsobujúcej zvýšenie VP. Na ošetrovanie chronických stavov, ktoré vedú k zvýšeniu VP a asociovanému vaskulárnemu presakovaniu a edému, sa podávanie aktívnych inhibítorov tyrozínkinázy rodiny Src uskutočňuje kontinuálnym dávkovacím režimom.

Rozsah .dávok na podávanie inaktívneho proteínu Src alebo Yes, alebo aktívneho proteínu CSK závisí od formy proteínu a jeho potencie, ako je tu ďalej opísané, a sú to množstvá dostatočne veľké,· aby mali žiadaný efekt, pri ktorom sa zlepší VP a chorobné symptómy sprostredkované VP. Dávka by nemala byť taká veľká, aby mala škodlivé vedľajšie účinky, ako sú syndrómy hyper viskozity, pulmonálny edém, kongestivne zlyhanie srdca a pod.

Terapeuticky účinné VP modulujúce množstvo je množstvo aktívneho proteínu CSK alebo inaktívneho proteínu Src alebo Yes, alebo ich zmesi alebo nukleovej kyseliny kódujúcej takýto proteín, dostatočné na spôsobenie meratelnej modulácie VP v liečenom tkanive, t. z., VP modulujúce množstvo. Modulácia VP sa dá merať analýzou, ako je tu opísané, alebo inými metódami známymi v odbore. Modulácia VP sa môže merať Millerovou analýzou, ako je tu opísané, alebo inými metódami známymi odborníkom v odbore.

Všeobecne sa môže dávka líšiť podlá veku, stavu, pohlavia a rozsahu ochorenia u pacienta a môže byť určená odborníkom v odbore. Dávku môže upraviť osobný lekár v prípade akýchkoľvek komplikácií.

Farmaceutické kompozície podľa vynálezu sa môžu podávať parenterálne injekciou alebo postupnou infúziou v čase (over time). Aj keď je tkanivo, ktoré sa má liečiť v tele prístupné systemickému podaniu, a teda je najčastejšie ošetrované intravenóznym podaním terapeutickej kompozície, iné tkanivá a prostriedky doručenia sa predpokladajú tam, kde existuje pravdepodobnosť, že cieľové tkanivo obsahuje cieľovú molekulu. Teda kompozície podľa vynálezu sa môžu podať intravenózne, intraperitoneálne, intramuskulárne, subkutánne, intrakavitárne, transdermálne a môžu sa doručiť peristaltickými prostriedkami.

Intravenózne podanie sa napríklad uskutočňuje injekciou jednotkovej dávky. Termín „jednotková dávka” sa používa ako odkaz na terapeutickú kompozíciu podľa predkladaného vynálezu, a označuje fyzicky samostatné jednotky vhodné ako jednotková dávka pre subjekt, pričom každá dávka obsahuje určené množstvo aktívnej látky vypočítané' tak, aby prinieslo žiadaný terapeutický efekt v spojení s požadovaným riedidlom; t. z., nosičom alebo vehikulom.

Vo výhodnom uskutočnení sa aktívna látka podáva v jednej dávke intravenózne. Lokalizované podanie sa môže uskutočniť priamo injekciou, alebo využitím výhod anatomicky izolovaných kompartmentov, izolovaním mikrocirkulácie cieľových orgánových systémov, reperfúziou v systéme cirkulácie, alebo dočasnou oklúziou cieľových oblastí vaskulatúry asociovanej s chorými tkanivami, založenou na katétri.

Kompozície sú podávané spôsobom kompatibilným s dávkovou formuláciou a v terapeuticky účinnom množstve. Množstvo, ktoré sa má podať a načasovanie závisí od liečeného subjektu, od schopnosti systému subjektu využiť účinnú zložku, a stupňa požadovaného terapeutického účinku. Presné množstvá účinnej zložky, ktorá sa má podať, závisia od úsudku lekára praktika a sú charakteristické pre každého jedinca. Avšak vhodné dávkové rozsahy na systemickú aplikáciu sú tu uvedené a závisia od spôsobu podania. Vhodné režimy na podávanie sú tiež rôzne a sú reprezentované počiatočným podaním nasledovaným opakovanými dávkami v jedno alebo viachodinových intervaloch dodatočnou injekciou alebo ďalším podaním. Alebo sa uváži kontinuálna intravenózna infúzia postačujúca na udržanie koncentrácií v krvi v rozsahu určenom pre in vivo terapie.

Spôsoby podľa vynálezu zlepšujúce poškodenie tkaniva spôsobené vaskulárnym presakovaním alebo edémom asociovaným s chorobným stavom, poranením alebo traumou zlepšujú symptómy ochorenia a v závislosti od ochorenia môžu prispieť k vyliečeniu ochorenia. Rozsah vaskulárnej permeability v tkanive a teda rozsah inhibície dosiahnutej predkladanými spôsobmi sa môže vyhodnotiť rôznymi metódami. Zvlášť sú tieto spôsoby vhodné na zlepšenie mŕtvice alebo iného poranenia CNS spojeného s cerebrovaskulárnou príhodou, ku ktorým dochádza kvôli poranením indukovanému zvýšeniu VP a následnému poškodeniu asociovaných tkanív vaskulárnym presakovaním a/alebo edémom.

V ďalšom súvisiacom uskutočnení, liečené tkanivo je zapálené tkanivo a vaskulárna permeabilita, ktorá sa má inhibovať, je spôsobená VEGF sprostredkovanou stimuláciou. Pre tento druh postihnutia spôsob predpokladá inhibíciu VP v artritických tkanivách ako u pacienta s chronickým artikulárnym reumatizmom, v imunitné alebo neimunitne zapálených tkanivách, v psoriatickom tkanive a pod.

V ďalšom súvisiacom uskutočnení, liečené tkanivo je retinálne tkanivo u pacienta s retinálnym ochorením ako je diabetická retinopatia, makulárna degenerácia alebo neovaskulárny glaukóm a VP, ktorá sa má inhibovať, je VP retinálneho tkaniva, kde je neovaskularizácia retinálneho tkaniva.

Predkladaný spôsob na inhibíciu vaskulárnej permeability v tkanive asociovanom s poranením alebo chorobným stavom, a teda tiež na vykonávanie spôsobov liečenia ochorení spojených s vaskulárnou permeabilitou, obsahuje kontaktovanie tkaniva, v ktorom nastáva zvýšená vaskulárna permeabilita, alebo v ktorom je riziko, že v ňom nastane, s kompozíciou obsahujúcou terapeuticky účinné množstvo inhibítora ťyrozínkinázy rodiny Src.

Modulácia VP a zlepšenie poškodenia tkaniva spôsobeného vaskulárnym presakovaním alebo edémom môže nastať v krátkom čase po podaní terapeutickej kompozície. Väčšina terapeutických účinkov sa dá vizualizovať v rámci 3 dni podávania, v prípade akútneho poranenia alebo traumy. Typicky, účinky chronického podávania nebudú hneď zjavné.

Časovo obmedzujúce faktory zahŕňajú rýchlosť vstrebávania v tkanive, bunkový príjem, translokáciu proteínu alebo transláciu nukleovej kyseliny (v závislosti od terapeutika) a zacielenie proteínu. Teda účinky modulácie poškodeného tkaniva’ sa môžu objaviť v tak krátkom čase ako hodinu po podaní inhibítora. Môže sa urobiť dodatočná alebo predĺžená expozícia inhibítorom tyro55 zínkinázy rodiny Src, využijúc náležité podmienky. Takže sa môže určiť množstvo žiadaných terapeutických časových rámcov modifikovaním takýchto parametrov.

F. Terapeutické kompozície (Všeobecné úvahy)

Predkladaný vynález zahŕňa terapeutické kompozície vhodné na uskutočňovanie terapeutických spôsobov tu opísaných. Terapeutické kompozície podlá predkladaného vynálezu obsahujú fyziologicky tolerovatelný nosič spolu s proteínom Src a Yes alebo vektorom schopným exprimovať proteín Src a/alebo Yes, ako je tu opísané, alebo inhibítorom tyrozínkinázy rodiny Src ako je tu opísané, ako je chemický Src inhibítor, proteínový inhibítor Src, alebo inhibítor Src nukleovej kyseliny, rozpusteným alebo dispergovaným v tomto ako aktívna zložka. Vo výhodnom uskutočnení nie je terapeutická kompozícia, keď sa podáva cicavcovi alebo ľudskému pacientovi na terapeutické účely, imunogénna.

Proteín Src a Yes môže byť aktívny, inaktívny alebo ich zmes v závislosti od požadovanej modulácie. Výhodné formy Src a Yes sú'tu už opísané. Proteín CSK je v aktívnej forme.

I

Tu používané pojmy „farmaceutický akceptovateľný, „fyziologicky tolerovatelný a ich gramatické varianty, ktoré sa vzťahujú na kompozície, nosiče, rozpúšťadlá a činidlá, sa používajú zameniteľné a označujú, že materiál sa môže podávať cicavcom bez spôsobenia nežiadúcich fyziologických účinkov ako nauzea, závraty, žalúdočné problémy a podobne.

Príprava farmakologickej kompozície, ktorá obsahuje aktívne zložky v nej rozpustené alebo rozptýlené, je v odbore dobre známa a nesmie byť na základe formulácie limitujúca. Typicky sú takéto kompozície pripravené v podobe injekcií, buď ako tekuté roztoky alebo suspenzie, avšak možno pripraviť aj pevné formy vhodné na rozpustenie alebo rozsuspendovanie v tekutine pred použitím. Prípravok sa okrem toho môže emulgovať alebo pripraviť v podobe lipozómovej kompozície.

Aktívna zložka sa môže zmiešať s vehikulami, ktoré je farmaceutický prijateľné a kompatibilné s aktívnou zložkou, a v množstvách vhodných na použitie v tu opísaných terapeutických spôsoboch. Medzi vhodné vehikulá patrí napríklad voda, fyziologický roztok (saline), dextróza, glycerol, etanol a podobne a ich kombinácie. Okrem toho, ak je to potrebné, môže kompozícia obsahovať minoritné množstvá pomocných látok ako zvlhčujúce alebo emulgačné činidlá, činidlá tlmiace pH a podobne, ktoré zvyšujú účinnosť aktívnej zložky.

Terapeutická kompozícia podľa predkladaného vynálezu môže obsahovať farmaceutický prijateľné soli komponentov. Farmaceutický prijateľné soli zahŕňajú kyslé aditívne soli (tvorené voľnými aminoskupinami polypeptidu), ktoré sa pripravujú pomocou anorganických kyselín ako napr. kyselina chlorovodíková alebo fosforečná, alebo pomocou organických kyselín ako kyselina octová, vínna, mandľová a podobne. Soli vytvorené s voľnými karboxylovými skupinami môžu byť odvodené aj od anorganických báz ako napr. hydroxidu sodného, draselného, amónneho, vápenatého alebo železitého, a pomocou organických báz ako izopropylamín, trimetylamin, 2-etylaminoetanol, histidín, prokaín a pod.

Fyziologicky tolerovatelné nosiče sú v odbore dobre známe. Medzi príklady tekutých nosičov patria sterilné vodné roztoky bez akýchkoľvek látok okrem aktívnych zložiek a vody, alebo obsahujú tlmivý roztok ako napr. fosforečnan sodný pri fyziologických hodnotách pH, fyziologický roztok alebo obidva, ako napr. fosfátom pufrovaný fyziologický roztok. Okrem toho môžu vodné nosiče obsahovať jednu alebo viac tlmivých solí, ako aj soli ako chlorid sodný a draselný, dextrózu, polyetylénglykol a iné rozpustené látky.

Tekuté kompozície môžu obsahovať aj inú tekutú fázu okrem a na úkor vody. Príkladmi takýchto ďalších tekutých fáz sú gly cerín, rastlinné oleje, ako napr. olej bavlníkových semien, a vodno-olejové emulzie.

F(i) VP modulujúce terapeutické kompozície podlá predkladaného vynálezu

V uskutočnení podlá predkladaného vynálezu terapeutická kompozícia obsahuje vaskulárnu permeabilitu modulujúce množstvo proteínu Src a/alebo Yes, alebo postačujúci rekombinatný DNA expresný vektor na expresiu účinného množstva proteínu Src a/alebo Yes, a je typicky formulovaná, aby obsahovala množstvo aspoň 0,1% hmotn. proteínu Src alebo Yes na celkovú hmotnosť terapeutickej kompozície. Hmotnostné percento je pomer hmotnosti proteínu Src alebo Yes k celkovej kompozícii. Teda, napríklad 0,1% hmotn. je 0,1 g proteínu Src alebo Yes na 100 g celkovej kompozície. Pre DNA expresné vektory podané množstvo závisí od vlastností expresného vektora, liečeného tkaniva a podobných zreteľov.

F(ii) Terapeutické kompozície podľa predkladaného vynálezu obsahujúce inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src

Chemické terapeutické kompozície podľa predkladaného vynálezu obsahujú fyziologicky tolerovateľný nosič spolu s inhibítorom tyrozínkinázy rodiny Src rozpusteným alebo dispergovaným ako aktívna zložka v tomto nosiči.

Proteínové terapeutické kompozície podľa predkladaného vynálezu obsahujú fyziologicky tolerovateľný nosič spolu s inaktívnym proteinom Src, inaktívnym proteinom Yes, alebo aktívnym proteinom CSK, rozpusteným alebo dispergovaným v tomto nosiči, ako inhibítorom tyrozínkinázy rodiny Src.

Terapeutické kompozície podľa predkladaného vynálezu obsahujúce nukleovú kyselinu obsahujú fyziologicky tolerovateľný nosič spolu s nukleovou kyselinou, ktorá kóduje inaktívny proteín Src, inaktivny proteín Yes, alebo aktívny proteín CSK, rozpustenou alebo dispergovanou v tomto nosiči, ako inhibítorom tyrozínkinázy rodiny Src.

Vhodné inhibítory tyrozínkinázy rodiny Src budú špecificky inhibovať biologickú tyrozínkinázovú aktivitu tyrozínkináz rodiny Src. Najvhodnejší inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src bude mať primárnu špecificitu na inhibovanie aktivity proteínu ^pp60Src a sekundárne bude inhibovať najviac príbuzné tyrozínkinázy rodiny Src ako je Yes. Príklady zvlášť vhodných inhibitorov tyrozínkinázy rodiny Src zahŕňajú PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 a Geldanamycin. Ďalšie vhodné chemické inhibítory tyrozínkinázy rodiny Src sa môžu identifikovať a charakterizovať použitím štandardných analýz známych v odbore.

Mutácie v Src, ktoré inhibujú VP namiesto aby ju stimulovali, sa označujú ako inaktívne Src mutácie. Proteíny, ktoré majú mutáciu, ktorá prináša túto inhibičnú aktivitu sa označujú ako dominantne negatívne proteíny Src, pretože inhibujú VP, vrátane tej, ktorá je výsledkom endogénnej aktivity Src ako aj posilnenej aktivity Src vychádzajúcej zo stimulácie rastovým faktorom. Teda určité mutácie c-Src divého typu podľa predkladaného vynálezu môžu tiež slúžiť ako dominantne negatívne, pokiaľ ide o ich schopnosť blokovať rast krvných ciev >a VP, a napríklad preto znižovať VP in vivo. Teda ďalšie vhodné inhibítory tyrozínkinázy rodiny Src môžu zahŕňať inaktívne formy proteínu Src a Yes, ktoré môžu antagonizovať aktivitu Src alebo Yes s výslednou inhibíciou alebo znížením vaskulárnej permeability krvných ciev v cieľovom tkanive. Výhodný inaktivny proteín Src je Src 251. Ďalší výhodný inaktivny proteín Src je Src K295M. Výhodný inaktivny proteín Yes bude znižovať kinázovú aktivitu v porovnaní s proteínom divého typu.

Ďalšie inhibítory tyrozínkinázy rodiny src môžu byť antisense nukleové kyseliny, analógy nukleových kyselín alebo pro teinové nukleové kyseliny, ktoré inhibujú expresiu génov Src alebo Yes v cieľových bunkách. Antisense molekuly môžu byť terapeuticky účinné VP modulujúce, keď môže uvedená antisense nukleová kyselina, schopná hybridizovať s mRNA kódujúcou proteín Src alebo Yes, hybridizovať s takouto mRNA s výslednou inhibíciou bunkovej expresie proteínu tyrozínkinázy Src alebo Yes, po transfekcii do cieľovej bunky vo vhodnom farmaceutickom nosiči.

Ako bolo opísané, výhodný inhibičný proteín c-Src zahŕňa Src 251, v ktorom sa exprimuje len prvých '251 aminokyselín zo Src. Tomuto konštruktu chýba celá kinázová doména a preto sa označuje ako proteín Src bez kinázovej aktivity („kinase dead Src protein). Druhý konštrukt je Src (K295M) mutácia, v ktorej je aminokyselinový zvyšok 295 lyzín mutovaný na metionín. Táto bodová mutácia v kinázovej doméne zabraňuje väzbe. ATP a blokuje funkcie Src závislé od kinázy spojené so signalizáciou (signaling) a proliferáciou vaskulárnej a tumorovej bunky.

Pokiaľ ide o bodové mutácie, akákoľvek mutácia s výslednou požadovanou inhibičnou aktivitou je zahrnutá na použitie v tomto vynáleze. Fúzne proteínové konštrukty s kombináciou požadovaného proteínu Src (mutácia alebo jeho fragment) s exprimovanými amihokyselinovýmu značkami (tags), antigénnymi epitopmi, fluorescenčnými proteínmi alebo inými takými proťeínmi alebo peptidmi, sú tiež zahrnuté, pokiaľ sa zachová požadovaný modulujúci účinok proteínu Src.

Podobne pridanie exogénneho inhibítora aktivity proteínu Src alebo stimulácia expresie takéhoto inhibítora v cieľových tkanivách, ako je CSK (C-koncová Src kináza) , je tiež prostriedok na inhibíciu aktivity Src. Fosforylácia tyrozín-inaktivujúceho Src je prostriedkom na negatívnu reguláciu pomocou C-koncovej Src kinázy, Označovanej ako CSK. (Nada et al., 1991, Náture 351: 6972; Okada et al., 1991, J. Biol. Chem. 266(36) 24249-24252). Keď CSK fosforyluje aa527 (aa = aminokyselina) v Src divého typu, protein Src je inaktivovaný. Teda CSK je vhodný a silný inhibítor aktivity Src. Sekvencia ľudského CSK proteínu má 450 aminokyselín, je identifikovaná pod prístupovým číslom P41240 a dá sa nájsť vo švajčiarskej databáze proteínov. Sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca mRNA ľudskej CSK je identifikovaná pod prístupovým číslom NM 004383 v databáze Genbank.

V uskutočnení podľa vynálezu farmaceutická kompozícia obsahuje vaskulárnu permeabilitu modulujúce množstvo proteínu Src, Yes a/alebo CSK, alebo postačujúci expresný vektor na expresiu účinného množstva inaktívneho proteínu Src, Yes alebo aktívneho proteínu CSK, a je typicky formulovaná, aby obsahovala množstvo aspoň 0,1% hmotn. proteínu na celkovú hmotnosť farmaceutickej kompozície. Teda napríklad 0,1% hmotn. je 0,1 g proteínu na 100 g celkovej kompozície. Pre expresné vektory podávané množstvo závisí od vlastnosti expresného vektora, liečeného tkaniva a podobných zreteľov. Účinné množstvo inhibítora tyrozínkinázy rodiny Src vo farmaceutickej kompozícii je množstvo, ktoré má za následok terapeuticky účinnú moduláciu vaskulárnej permeability regulovanej Src. Terapeutické množstvo akejkoľvek farmaceutickej kompozície je také, ktoré má samo osebe za následok zlepšenie poškodenia tkaniva súvisiaceho s vaskulárnym presakovaním a edémom.

G(i) Všeobecné úvahy; Výrobný artikel

Tu používaný pojem obalový materiál označuje materiál ako sklo, plasty, papier, fóliu a podobné, ktoré umožňujú udržanie farmaceutického prostriedku. Obalový materiál teda môže predstavovať napríklad plastové alebo sklenené liekovky, laminované schránky a podobné kontajnery používané na uskladnenie farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje farmaceutický prostriedok.

Vo výhodných uskutočneniach zahŕňa obalový materiál štítok, ktorý predstavuje jednoznačné vyjadrenie opisujúce obsah výrob ného artikla a použitie farmaceutického prostriedku, ktorý sa v ňom nachádza.

G(ii) VP modulujúce terapeutické kompozície; Výrobný artikel

I ’ '

Vynález zahŕňa výrobný artikel, ktorý obsahuje označený kontajner, na poskytnutie terapeuticky účinného množstva zmesi proteínu Src a proteínu Yes. Výrobný artikel pozostáva z obalového materiálu a farmaceutického prostriedku obsiahnutého v tomto obalovom materiáli.

Farmaceutický prostriedok vo výrobnom artikli predstavuje ľubovoľnú z ' kompozícií' podľa predkladaného vynálezu vhodnú na poskytnutie proteínu Src a Yes, formulovanú do farmaceutický prijateľnej formy, ako je tu opísané, v súlade s priloženými údajmi. Kompozícia teda môže obsahovať protein Src a Yes, alebo molekulu DNA, ktorá je schopná expresie proteínu Src, DNA, ktorá je schopná expresie proteínu Yes, alebo DNA, ktorá je schopná expresie oboch proteínov. Výrobný artikel obsahuje také množstvo farmaceutického prostriedku, ktoré postačuje na použitie na liečenie tu opísaného stavu, a to buď v jednotkových alebo viacnásobných dávkach.

Protein Src alebo Yes môžu byť aktívne alebo inaktívne, alebo ich zmes, v závislosti od úrovne požadovanej modulácie. Výhodné formy aktívneho a inaktívneho Src a Yes sú tu už opísané.

Obalový materiál obsahuje štítok, na ktorom je uvedené ppužitie obsiahnutého farmaceutického prostriedku, napr. na liečenie stavov pomocou inhibície alebo potenciácie vaskulárnej permeability, a podobných stavov, tu uvedených. Štítok môže ešte obsahovať návod na použitie a pridružené informácie požadované marketingom. Obalový materiál môže zhŕňať kontajner (kontajnery) na uskladňovanie farmaceutického prostriedku.

G(iii) Kompozícia obsahujúca inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src;

Výrobný artikel

Vynález zahŕňa aj výrobný artikel obsahujúci označený kontajner, na poskytnutie terapeuticky účinného množstva inhibitora tyrozínkinázy rodiny Src. Inhibitor môže byť zabalená chemikália, proteín alebo nukleová kyselina ako inhibitor tyrozínkinázy rodiny Src, kombinácie viacerých alebo ich zmesi. Výrobný artikel pozostáva z obalového materiálu a farmaceutického prostriedku obsiahnutého v obalovom materiáli. Výrobný artikel môže tiež obsahovať dva alebo viac subterapeuticky účinných množstiev farmaceutickej kompozície, ktoré majú spolu synergický účinok a majú za následok zlepšenie poškodenia tkaniva spôsobeného vaskulárnym presakovaním alebo edémom.

Farmaceutický prostriedok vo výrobnom artikli je akákoľvek z kompozícií podľa predkladaného vynálezu vhodná na poskytnutie inhibitora tyrozínkinázy rodiny Src, formulovaná do farmaceutický prijateľnej formy, ako je tu opísané, v súlade s priloženými údajmi. Teda kompozícia môže obsahovať chemické inhibítory ako sú PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 a Geldanamycin, proteínový inhibitor, ako je inaktívny proteín Src, inaktívny proteín Yes, aktívny proteín CSK alebo, molekulu nukleovej kyseliny, ktorá je schopná exprimovať takýto proteín alebo kombináciu proteínov. Výrobný artikel obsahuje množstvo farmaceutického prostriedku postačujúce na použitie na liečenie stavu tu opisovaného, a to buď v jednotkovej alebo viacnásobných dávkach.

Obalový materiál pozostáva zo štítka, na ktorom je uvedené použitie. obsiahnutého farmaceutického prostriedku, napr. na .liečenie stavov pomocou inhibície zvýšenia vaskulárnej permeability a podobných stavov, tu uvedených. Štítok môže ešte obsahovať inštrukcie na použitie a pridružené informácie vyžadované marketingom. Obalový materiál môže zhŕňať kontajner (kontajnery) na uskladňovanie farmaceutického prostriedku.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady súvisiace s týmto vynálezom sú ilustratívne, a preto sa vzhľadom na vynález Samozrejme nemajú považovať za limitujúce. Okrem toho variácie vynálezu, ktoré sú teraz známe, alebo budú vynájdené neskôr, ktoré by odborník v odbore zaradil do rozsahu predkladaného vynálezu, sú tiež nárokované.

1. Príprava kohštruktov na expresiu c-src alebo c-yes

Na prípravu expresných konštruktov vhodných na moduláciu VP a angiogenézy pomocou spôsobov podľa predkladaného vynálezu je do expresného konštrujctu/vektora vložená upravená c-src cDNA.

cDNA sekvencia kódujúca divý (t. j. endogénny) typ kuracieho c-src je znázornená na obr. 1 (sekvencia SEQ ID NO: 2) s kódujúcou sekvenciou aminokyselinových zvyškov znázornenou na obr. 2 (sekvencia SEQ ID NO: 3) . Kódujúca sekvencia proteínu je preložená z cDNA nukleotidov od pozície 112 po 1713. Sekvencia nukleovej kyseliny zodpovedajúca sekvencií nukleovej , kyseliny ľudského c-src cDNA (sekvencia SEQ ID NO: 4) a kódovaná sekvencia aminokyselinových zvyškov (sekvencia SEQ ID NO: .5) sú znázornené na obr. 3 a obr. 4. Pre ľudskú proteínovú sekvenciu kódujúca sekvencia začína na pozícii nukleotidu 134 po 1486 cDNA.

Pripravil sa divý typ ako aj počet mutovaných c-src cDNA. Mutované c-Src konštrukty sa pripravili miestne špecifickou mutagenézou, ako opísali Kaplan et al., EMBO J., 13:4745-4756 (1994). Mutované c-Src konštrukty kódujúce mutované proteíny Src na použitie v spôsoboch podľa predkladaného vynálezu sú opísané v Kaplan et al., id., Kaplan et al. opisujú rôzne mutované konštrukty c-Src a kódované proteíny použiteľné v predkladanom vynáleze. Napríklad Kaplan et al., opisujú niekoľko produktov alel kuracieho c-src na ich obr. 1, vrátane SrcA a Src251.

Predkladaný vynález opisuje dve kategórie c-Src funkcie na moduláciu VP. Ako sa už spomínalo, jedna kategória obsahuje molekuly Src, ktoré zvyšujú VP, a teda sú považované za aktívne proteíny. Src divého typu spolu s rôznymi mutáciami podlá predkladaného vynálezu navodzujú VP. Jedna mutácia c-src divého typu, ktorá funguje v tejto súvislosti čo sa týka jeho schopnosti navodzovať rast krvných ciev a VP, je Src A mutant majúci bodovú mutáciu na pozícii aminokyselinového (aa) zvyšku 527 meniacu tyrozín 527 na fenylalanín. Toto miesto je normálne miesto pre negatívnu reguláciu kinázou c-Src, označovanou ako kináza CSK. Keď CSK fosforyluje aa527 v divom type Src, proteín sa inaktivuje. Avšak v mutovanom Src A na aa527, regulačný tyrozín konvertoval na fenylalanín, čím sa proteín stal konštitutívne (permanentne) aktívny proteín, ktorý sa nedá inaktivovať fosforyláciou.·

Iné mutácie v Src majú opačný modulačný účinok na VP, inhibujú VP namiesto stimulovania. Takéto mutácie sa označujú ako inaktívne Src mutácie. Proteíny majúce mutáciu, ktorá prináša inhibičnú aktivitu sa tiež označujú ako dominantne negatívne, proteíny Src, keďže inhibujú VP, vrátane tej, ktorá vyplýva z endogénnej aktivity Src ako aj z posilnenej aktivity Src vyplývajúcej zo stimulácie rastovým faktorom. Teda určité mutácie c-src divého typu podľa predkladaného vynálezu môžu tiež fungovať ako dominantne negatívne vzhľadom na ich schopnosť blokovať rast krvných ciev a VP, napríklad teda znižovať VP in vivo.

Výhodný inhibičný proteín c-Src zahŕňa Src 251, v ktorom sa exprimuje len prvých 251 aminokyselín zo Src. Tomuto konštruktu chýba celá kinázová doména a je preto označovaný ako proteín Src bez kinázovej aktivity („kinase dead Src) . Druhý konštrukt je Src (K295M) mutácia, v ktorej je aminokyselinový zvyšok 295 lyzin mutovaný na metionín. Táto bodová mutácia v kinázovej doméne zabraňuje väzbe ATP a tiež blokuje funkcie Src závislé od kinázy spojené so signalizáciou (signaling) a proliferáciou vaskulárnej a tumorovej bunky.

Pokiaľ ide o bodové mutácie, akákoľvek mutácia, ktorá má za následok požadovanú inhibičnú alebo stimulačnú aktivitu je zahrnutá na použitie v tomto vynáleze. Fúzne proteínové konštrukty s kombináciou požadovaného proteínu Src (mutácia alebo jeho fragment) s exprimovanými aminokyšelinovými značkami (tags), antigénnymi epitopmi, fluorescenčnými proteínmi alebo inými takými proteínmi alebo peptidmi, sú tiež zahrnuté, pokiaľ sa zachová požadovaný modulujúci účino,k proteínu Src.

Napríklad ak ide o aktivujúcu mutáciu Src na zvyšku 527, pokiaľ výsledný mutovaný aminokyselinový. zvyšok nie je tyrozin, serin alebo treonín, predkladaný vynález predpokladá, 'že prítomnosť náhradnej aminokyseliny na žiadanej pozícii bude mať za následok proteín Src s požadovanou aktívnou, VP podporujúcou modulačnou aktivitou.

Kináza Yes rodiny Src už bola opísaná, ale nevie sa veľa o jej funkcii v bunke. (Burčk et al., 1988, The Oncogenes, Springer-Verlag, New York, pp. 133-155; Marth et al., 1985, Celí, 43-393; Semba et al., 1986, PNAS (USA) 83:5459; Shibuya et al., 1982, J. Virol. 42:143; Yoshida et al., 1985, Jpn. J. Cancer Res. 76:559). Výhodný aktívny ľudský proteín Yes je kódovaný nukleovou kyselinou, ktorú opísal Sukegawa et al. (1987, Mol. Celí Biol. 7:41-47). Inaktivujúce modifikácie ľudského proteínu Yes a nukleových kyselín kódujúcich Yes sa môžu uskutočniť ako je opísané pre Src.

Tabuľka I

Src/Mutácia	Src	Funkcia	Účinok na VP a angiogenézu
c-Src	+	aktívny	stimuluj e
SrcA (T527F)	+	aktívny	stimuluje
Src527 (bod.)	+	aktívny	stimuluj e
Src251	-	inaktívny	inhibuj e
Src (skrátený)	-	inaktívny	inhibuj e
Src(K295M)	-	inaktívny	inhibuje
Src295 (bod.)	-	inaktívny	inhibuj e

Výhodný expresný konštrukt na použitie v predkladanom vynáleze je RCASBP (A) konštrukt (sekvencia SEQ ID NO: 1) . Tento expresný vektor je založený na sérii replikačne kompetentných vtáčích sarkómových vírusov s posilnenou Bryan polymerázou (BP) na zlepšenie titra a je špecifický na obalový glykoproteín typu A exprimovaný v normálnych vtáčích bunkách (uvedené v Methods in Celí Biology, 52:179-214 (1997); pozri tiež Hughes et al., 1987, J. Virol. 61:3004-3012; Fekete & Cepko, 1993, Mol.· Cellular Biol. 13 (4) :2604-2613; Itoh et al., 1996, Development 122:291300; a Stott et al., 1998, BioTechniques 24:660-666). Kompletná sekvencia RCASBP (A) (sekvencia SEQ ID NO: 1) je v Zozname sekvencií a reštrikčná mapa konštruktu je znázornená na obr. 10, a označuje sa tu ako RCAS.

Pôvodný Src251 konštrukt subklonoval Dr. Pam Schwartzberg, na NIH v laboratóriu Dr. Harolda Varmusa. Stručne, klonovanie src cDNA sekvencie na jej expresiu sa uskutočnilo, inzerciou linkera obsahujúceho Notl-BstBl-NotI reštrikčné miesta do jedinečného Nôti miesta na 5'konci Src 251. Src má jedinečné Clal mies to na 3'konci. Výsledkom štiepenia Src 251 BstBl a Clal bol BstBl-Clal fragment, ktorý sa potom ligoval do Clal miesta na RCASBP(A). BstBl prečnievajúci koniec umožňuje ligáciu s Clal prečnievajúcim koncom, ktorý sa nebude opätovne štiepiť s Clal.

Src konštrukty vhodné na použitie v predkladanom vynáleze sa jednoducho izolujú z uvedeného vektora prvým štiepením vektora RCAS obsahujúceho Src251 s Notl a Clal (na DAM+ pozadí) s cieľom umožniť inzerciu podobne štiepených Src cDNA. Preto tento počiatočný RCASBP (A) konštrukt obsahujúci Src 251 sa ďalej použil na subklonovanie všetkých ďalších Src konštruktov, ako je už opísané tu a v Kaplan et al. (1994, The EMBO J. 13 (20) : 4745-4756)', do RCASBP(A) cez Notl-Clal fragment utvorený cez konštrukciu Src 251. Na prípravu požadovaných c-src mutácií v cDNA sa použili postupy štandardnej miestne špecifickej mutagenézy dôverne známe odborníkom v odbore. PCR priméry skonštruované na inkorporovanie požadovaných mutácií sa tiež skonštruovali s reštrikčnými miestami tak, aby uľahčili nasledujúce klonovacie kroky. Celé segmenty sekvencií nukleovej kyseliny kódujúcej Src sa deletujú z konštruktov nukleovej kyseliny pomocou techník PCR amplifikácie založených na známych cDNA sekvenciách kuracích, ľudských a podobných homológov Src a následným vytvorením nových konštruktov.

V jednom uskutočnení podľa vynálezu 3'PCR primér, ktorý sa použil na amplifikáciu src nukleových kyselín tiež kóduje sekvenciu v čítacom rámci. Použitie tohto priméra pridá 9E10-myc epitopovú značku (epitope tag) na karboxylový koniec následného Src konštruktu. Nasledujúce aminokyseliny sa pridali po aminokyseline 251. Src, aby sa vytvorili vektorové konštrukty obsahujúce 9E10-myc epitopovú značku: VDMEQKLIAEEDLN (sekvencia SEQ ID NO: 6) . Urobili sa dve oddelené PCR pre každý konštrukt a dosiahli sa podobné výsledky. Všetky mutantné konštrukty skonštruované pomocou PCR sa tiež sekvenovali. pomocou PCR, aby sa potvrdila predpokladaná DNA sekvencia klonov. cDNA Src divého typu a mutovaného Src na použitie v expresných systémoch podlá predkladaného vynálezu sú tiež prístupné od Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY, ktoré predávajú vtáčí ako aj ludský src a niekolko „kinase dead, teda bez kinázovej aktivity, a aktivovaných mutovaných foriem.

Alternatívne expresné vektory používané na expresiu proteínov Src alebo Yes predkladaného vynálezu zahŕňajú aj adenovírusové vektory opísané v US patente č. 4 797 368, č. 5 173 414, č. 5 436 146, č. 5 589 377 a č. 5 670 488. Alternatívne spôsoby doručenia modulačných proteínov Src alebo Yes zahŕňajú doručenie Src alebo Yes cDNA pomocou nevírusového vektorového systému opísaného v US patente č. 5 675 954 a doručenie samotnej cDNA ako čistej (nahej) DNA, ako je opísané v US patente č. 5 589 466. Doručenie konštruktov podlá vynálezu tiež nie je limitované na topické použitie vírusového vektora, ako je opísané ďalej pri CAM analýze. Napríklad, vírusové vektorové preparáty sa injikujú tiež intravenózne na systemické doručenie do vaskulárneho riečiska. Tieto vektory sú tiež zameratelné na miesta so zvýšenou neovaskularizáciou, napríklad lokalizovanou injekciou do tumoru.

In vitro exprimované proteíny sú tiež zahrnuté na ich doručenie po expresii a purifikácii vybraného proteínu Src spôsobmi vhodnými na doručenie proteínov alebo polypeptidov. Jeden takýto spôsob zahŕňa lipozómové doručovacie systémy, ako je opísané v US patentoch č. 4 356 167, č. 5 580 575, č. 5 542 935 a č. 5 643 599. Ďalšie vektorové a proteínové doručovacie systémy použiteľné pri expresii a/alebo doručení proteínov Src alebo Yes podlá predkladaného vynálezu sú odborníkom v odbore dobre známe.

2. Charakterizácia neošetrenej kuracej chorioalantoickej membrány (CAM)

A. Príprava CAM

Angiogenéza sa môže na kuracej chórioalantoickej membráne (CAM) indukovať potom, ako vznikli zrelé krvné cievy normálnou embryonálnou angiogenézou. Ukázalo sa, že angiogenéza je indukovaná pri odpovedi na špecifické cytokiny alebo t.umorové fragmenty, ako opísali autori Leibovich et al., Náture, 329:630 (1987) a Ausprunk et al. , Am. J. Pathol., 79:597 (1975). CAM sa pripravili z kuracích embryí na následnú indukciu angiogenézy a na jej inhibiciu. 10 dňové kuracie embryá sa získali z hydiny Mclnytre Poultry (Lakeside, CA) a inkubovali sa pri 37°C a 60% vlhkosti. Na hrote vajíčka, priamo nad vzdušným vakom, sa pomocou malej vŕtačky (Dremel, Division of Emerson Electric Co. Racine WI) vyvŕtal do škrupiny malý otvor. Druhý otvor sa vyvŕtal na širokej strane vajíčka, v oblasti zbavenej embryonálnych krvných ciev vopred určenej pomocou presvecovania vajíčka. Na originálny otvor sa aplikoval negatívny tlak, ktorý spôsobil uvoľnenie CAM (chorioalantoickej membrány) od škrupinovej membrány, čím sa nad CAM vytvoril falošný vzdušný vak. Cez škrupinu sa pomocou malého brúsneho kolieska (Dremel) vyrezal nad uvoľneným CAM štvorcový otvor s veľkosťou 1,0 cm x 1,0 cm. Tento malý výrez umožnil priamy prístup k základnej CAM.

Výsledný CAM preparát sa potom použil buď v 6 dňoch embryogenézy, v štádiu vyznačujúcom sa aktívnou neovaskularizáciou, bez ďalšieho ošetrenia CAM zobrazujúc model použitý na vyhodnotenie účinkov na embryonálnu neovaskularizáciu, alebo sa použil v 10 dňoch embryogenézy, kde došlo k poklesu angiogenézy. Druhý uvedený preparát sa teda použil v tomto vynáleze na indukciu obnovenej angiogenézy v odpovedi na ošetrenie cytokínom alebo na kontakt s tumorom, ako je opísané ďalej.

3. CAM analýza angiogenézy

A. Angiogenéza indukovaná rastovými faktormi.

ΊΟ

Ukázalo sa, že angiogenéza je indukovaná cytokinmi alebo rastovými faktormi. Angiogenéza sa indukovala uložením 5 mm x 5 mm veľkého filtrového disku Whatman (Whatman Filter páper No. 1) nasýteného Hanksovým vyváženým soľným roztokom (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) alebo HBSS obsahujúcim 2 pg/ml rekombinantného základného fibroblastového rastového faktora (bFGF) alebo rastového faktora vaskulárnych endotelových buniek (VEGF) (Genzyme, Cambridge, MA) na CAM buď 9 alebo 10 dňového kuracieho embrya v oblasti zbavenej krvných ciev a výrezy sa následne zalepili lepiacou páskou. Pri indukcii rastu krvných ciev sú účinné aj iné koncentrácie rastových faktorov. Pre analýzy, pri ktorých sa inhibícia angiogenézy hodnotí pomocou intravenóznych injekcií antagonistov, sa angiogenéza najskôr indukuje s 1-2 pg/ml bFGF alebo VEGF vo fibroblastovom rastovom médiu. Angiogenéza sa monitorovala fotomikroskopiou po 72 hodinách.

B. Embryonálna angiogenéza

CAM preparát na hodnotenie účinku inhibítorov angiogenézy na prirodzenú tvorbu embryonálnej vaskulatúry je 6 dňové kuracie embryo, ako je opísané predtýmto. V tomto štádiu vývoja prechádzajú krvné cievy rastom de novo a teda poskytujú vhodný systém na stanovenie modulácie angiogenézy pomocou proteínov Src podlá predkladaného vynálezu. CAM systém sa pripraví, ako je tu opísané, s výnimkou toho, že analýza sa uskutoční radšej v 6. embryonálnom dni než v 9. alebo 10.

4. Modulácia angiogenézy ako sa merala v CAM analýze

Na vyhodnotenie účinku proteínov Src na angiogenézu sa uskutočnili nasledovné analýzy na 10 dní starých kuracích CAM preparátoch. 5 pg konštruktov RCAS pripravených, ako je opísané v príklade 1 sa transfekovala imortalizovaná kuracia fibroblastová línia DF-1 (dar Douga Fostera, U. of Minn.). Táto bunková línia ako aj fibroblasty primárneho kuracieho embrya, boli schopné produkovať vírus, avšak bunková línia DF-1 produkovala vyšší titer. Vírusové supernatanty sa získali zo subkonfluentných línií produkčných buniek DF-1 v CLM médiu bez séra [zloženie: médium založené na F-10 s prídavkom DMSO, kyseliny listovej, kyseliny glutámovej a vitamínového roztoku MEM]. 35 ml vírusového supernatantu sa koncentrovalo ultracentrifugáciou pri 4°C počas 2 hodín pri 22 000 rpm. Tieto koncentrované vírusové pelety sa resuspendovali v 1/100 pôvodného objemu v CLM médiu bez séra, rozdelili sa na alikvotné časti a uchovali sa pri -80°C. Titer sa stanovil sériou riedení kontrolného vírusového vektora s nukleotidovou sekvenciou kódujúcou zelený fluorescenčný proteín (GFP), označovaný ako RCAS-GFP, infekciou primárnych fibroblastov kuracích embryí, ktoré sa inkubovali 48-72 hodín. Titer získaných vírusových vzoriek sa bežne pohyboval nad 10⁸

I.u./ml. Pre CAM analýzu využívajúcu tieto vírusové zásobné roztoky sa pripravili filtrové disky Whatman s priemerom 6 mm nasýtené v 3 mg/ml octanu kortizónu počas 30 minút v 95% etanole. Disky sa vysušili pod poklopom s laminárnym prúdením a potom sa namočili do 20 μΐ vírusového zásobného roztoku na disk počas 10 minút. Tieto disky sa aplikovali na preparáty CAM 9 alebo 10 dňových kuracích embryí a zalepili sa celofánovou lepiacou páskou a inkubovali pri 37°C 18-24 hodín. Aby sa zvýšil prísun vírusu k tkanivu CAM, pridalo sa k preparátom CAM buď modelové (mock) PBS alebo rastové faktory v koncentrácii 5 pg/ml v 20 μΐ zodpovedajúceho vírusového zásobného roztoku. Po 72 hodinách sa CAM odobrali a stanovili sa zmeny angiogenetického indexu určeného „double blind rátaním (double blind counting) počtu vetviacich bodov v CAM pod diskom. Pre kinázové analýzy sa tkanivo pod diskom odobralo do RIPA, homogenizovalo sa motorizovaným drvičom a Src sa imunoprecipitoval z ekvivalentných množstiev celkového proteínu a podrobil sa in vitro kinázovej analýze s použitím FAK-GST fúzneho proteínu ako substrátu. Na, imunofluorescenčné štúdie sa CAM tkanivo pod diskom zmrazilo v OCT, kryokonzervačnom prostriedku, narezalo sa na 4 ym, fixovalo sa v acetóne 1 minútu, inkubovalo v 3% normálnom kozom sére 1 hodinu, nasledovala inkubácia v primárnej králičej protilátke proti fos forylovanej ERK, ako je opísané predtýmto (Eliceiri et al., J. Celí Bíól., 140:1255-1263 '(1998), premylo sa v PBS a detegovalo sekundárnou fluorescenčnou protilátkou.

A. Aktivácia endogénneho Src pomocou bFGF alebo VEGF

Na vyhodnotenie účinkov rastových faktorov na aktivitu Src pri modulácii angiogenézy sa uskutočnili nasledovné analýzy. Extrakty tkaniva 10 dní starých kuracích CAM, ktoré sa vystavili pôsobeniu bFGF alebo VEGF (2 yg/ml) na 2 hodiny, sa lyžovali. Endogénny Src sa imunoprecipitoval z ekvivalentných množstiev celkového proteínu a podrobil sa in vitro imunokomplexovej kinázovej analýze s použitím FAK-GST fúzneho proteínu ako substrátu, elektroforéze a prenosu na nitrocelulózu.

Výsledky analýzy sú na obr. 5, kde je zvýšenie aktivity Src evidentné vo zvýšenej hustote gélu buď pri ošetrení s bFGF alebo VEGF v porovnaní s neošetrenými (modelovými (mock)) vzorkami, ktoré predstavujú základnú aktivitu Src v CAM analýze. Obidva bFGF aj VEGF majú za následok približne dvojnásobné zvýšenie endogénnej aktivity Src v CAM. Blot kinázovej analýzy uvedený hore sa testoval s anti-Src protilátkou ako nanesenou kontrolou pre ekvivalentný obsah Src a IgG.

B. Účinok retrovírusom sprostredkovanej génovej expresie Src A na angiogenézu v kuracích CAM

Nasledovná analýza sa uskutočnila na vyhodnotenie účinku mutovaných proteínov Src na angiogenézu v preparátoch CAM. Na analýzu sa 9 dní staré kuracie CAM vystavili pôsobeniu RCAS-Src A alebo RCAS-GFP exprimujúcim retrovírusy alebo tlmivému roztoku na 72 hodín podľa protokolu t.u už opísaného..

Výsledky tejto analýzy sú na obrázku 6A, kde sa úroveň angiogenézy kvantifikovala, ako je už opísané. Reprezentatívne fotomikrografy (4x) sa urobili pomocou stereomikroskopu ako je na obr. 6B. Základná endogénna aktivita má angiogenetický index približne 50. Naproti tomu posilnenie (indukcia) angiogenézy s angiogenetickým indexom približne 90 bolo výsledkom u CAM ošetrených retrovírusovým vektorom exprimovaným RCAS-Src A s bodovou mutáciou na aminokyselinovom zvyšku 527 z tyrozínu na fenylalanín. Posilnenie Src-A sprostredkovanej angiogenézy je tiež evidentné na fotografiách na obr. 6B.

C. Retrovírusová expresia Src A aktivuje fosforyláciu vaskulárnej kinázy MAP.

Účinok Src A v porovnaní s rastovými faktormi VEGF a PMA na fosforyláciu vaskulárnej kinázy MAP sa hodnotil aj po analýzach tu už opísaných. Extrakty tkaniva 10 dní starých kuracích CAM vystavených VEGF alebo PMA (ďalší mitogén v porovnateľnej koncentrácii) na 30 minút sa porovnali s tými, ktoré sa infikovali retrovírusom exprimujúcim SRC A na 48 hodín. Src sa potom imunoprecipitoval z ekvivalentných množstiev celkového proteínového extraktu a podrobil sa in vitro imunokomplexovej kinázovej analýze s použitím fúzneho proteínu FAK-GST ako substrátu, elektroforéze a prenosu na nitrocelulózu.

Výsledky tejto analýzy sú na obr. 7A, kde neošetrené CAM (NT) vykazujú základnú endogénnym Src sprostredkovanú fosforyláciu vaskulárnej kinázy MAP. VEGF a PMA mali za následok približne dvojnásobné zvýšenie nad základnou hladinou. Naproti tomuto, Src A posilnilo aktivitu 5 až 10 násobne, než aká bola u neošetrených vzoriek.

V alikvotných častiach horeuvedených celých tkanivových lys použitím imunoblotukázané na obr.

zátov sa merala endogénna fos'forylácia ERK tingu s anti-fosfo-ERK protilátkou, Na toto vyhodnotenie sa 10 dní s modelovým (mock) RCAS alebo RCAS, ako je staré

CAM infikovali ktorý exprimuje Src A.

7B.

buď

Po 2

dňoch sa CAM pitvali, kryokonzervovali v OCT a narezali na 4 pm. Rezy sa imunofarbili s protilátkou proti fosforylovanej ERK (New England Biolabs), premyli a detegovali kozou anti-králičou sekundárnou protilátkou konjugovanou s FITC. Fluorescenčné zobrazenie sa zachytilo na chladenú CCD kameru/fotoáparát (Princeton Inst.). Fotomikrografy znázorňujú posilnenú imunofluorescenciu preparátov ošetrených s Src A v porovnaní s modelovými kontrolami .

D. Selektívna požiadavka na aktivitu Src počas angiogenézy indukovanej VEGF, ale nie bFGF.

Na vyhodnotenie účinku modulačnej aktivity Src na angiogenézu indukovanú rastovým faktorom sa uskutočnili nasledovné analýzy. 9 dní staré kuracie CAM sa vystavili účinku retr'ovírusového vektorového preparátu, ktorý exprimoval dominantne negatívnu Src mutáciu označovanú ako Src 251 alebo Src K295M ako je už opísané. CAM sa vystavili pôsobeniu retrovírusov RCAS-Src 251 alebo kontrolnému RCAS-GFP alebo tlmivému roztoku na 20 hodín a inkubovali sa ďalších 72 hodín v prítomnosti alebo neprítomnosti bFGF alebo VEGF.

Úroveň angiogenézy, kvantifikovaná ako je opísané predtýmto, je na obr. 8A. Reprezentatívne fotomikrografy (6x), znázornené na obr. 8B, sa fotili pomocou stereomikroskopu. Obr. 8C ukazuje blot testovaný anti-Src protilátkou, aby sa potvrdila expresia Src 251 v transfekovaných bunkách, ako je porovnané s modelovými ošetreniami.

Výsledky analýz hore opísaných indikujú, že CAM ošetrené bFGF aj VEGF v prítomnosti RCAS-GFP kontroly indukovali angiogenézu nad základnú úroveň angiogenézy sprostredkovanej Src pozorovanú na modelových (mock) alebo neošetrených CAM preparátoch. Exprimovaný dominantne negatívny mutant Src 251 bol účinný pri inhibícii VEGF-indukovanej angiogenézy naspäť na základnú úroveň, zatiaľ čo bol neúčinný pri inhibícii bFGF-indukovanej angiogenézy. Fotomikrografy na obr. 8B obrazovo potvrdzujú dáta ukázané na obr. 8A. Teda, retrovirusovo exprimovaný Src-251 je účinný inhibitor angiogenézy, keď je angiogenéza indukovaná s VEGF.

Aplikácie proteínov Src pódia tohto vynálezu s ďalšími modelmi angiogenézy, ako sú opísané v príkladoch ďalej, sú zahrnuté v predkladanom vynáleze.

5. Regresia rastu tumorového tkaniva pomocou Src, modulátorov meraná in vivo analýzou na modeli oka králika.

Účinok Src modulátorov na angiogenézu indukovanú rastovým faktorom sa môže pozorovať na prirodzene transparentných štruktúrach, ktorých príkladom je. očná rohovka. Nové krvné cievy rastú od okraja rohovky, ktorý je bohato zásobený krvou, smerom do stredu rohovky, ktorý normálne nie je zásobený krvou. Keď sa stimulátory angiogenézy, ako je bFGF, aplikujú na rohovku, indukujú rast nových krvných ciev od okraja rohovky. Antagonisty angiogenézy aplikované na rohovku inhibujú rast nových krvných ciev od kraja rohovky. Teda, rohovka podstupuje angiogenézu prostredníctvom invázie endotelových buniek z okraja rohovky do rohovkového tkaniva plného tuhého kolagénu,. ktoré je lahko viditeľné. Analýza na modeli oka králika teda poskytuje in vivo model· na priame pozorovanie stimulácie a inhibície angiogenézy, ktorá nasleduje po implantácii zlúčenín priamo do očnej rohovky.

In vivo analýza na modeli oka králika demonštruje angiogenézu indukovanú rastovými faktormi.

Angiogenéza sa indukuje v in vivo analýze na modeli oka králika rastovými faktormi bFGF alebo VEGF a je opísaná v nasledujúcich častiach.

Pelety z hydrónového polyméru (hydron polymér pellets), kto ré obsahujú rastový faktor sa pripravia ako opísali D'Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:4082-4085 (1994). Jednotlivé pelety obsahujú 650 ng rastových faktorov oddelene naviazaných na sukralfát (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation) na stabilizáciu rastového faktora a zabezpečenie jeho pomalého uvoľňovania do okolitého tkaniva. Naviac, hydrónové pelety sa pripravia tak, aby obsahovali požadovaný retrovírus exprimujúci Src, ako sa už opísalo. Pelety sa dajú do špeciálne pripravených teflónových zátok (teflon pegs), ktoré majú 2,5 mm jadro navŕtané do ich povrchu. Približne 12 pl odlievacieho materiálu sa umiestni do každej zátky a nechá sa cez noc polymerizovať v sterilnom kryte. Pelety sa potom sterilizujú pod ultrafialovým žiarením. Účinky proteínov Src sa hodnotia, ako je opísané predtýmto.

6. In vivo regresia rastu tumorového tkaniva pomocou Src modulátorov ako sa stanovilo analýzou chimérického modelu myš:človek

In vivo chimérický model myš:človek sa vytvoril nahradením časti kože SCID myši ľudskou neonatálnou predkožkou. In vivo chimérický model myš:človek sa pripravil v podstate ako opísali Yan, et al., J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993). Stručne, štvorcová plocha kože s veľkosťou 2 cm² sa chirurgicky odstráni zo SCID myši (vo veku 6-8 týždňov) a nahradí sa ľudskou predkožkou. Myš sa podrobí anestézii a z plochy 5 cm² na každej strane laterálnej abdominálnej oblasti sa odstránia chlpy oholením. Pripravia sa dve kruhové transplantátové lôžka s veľkosťou 2 cm² odstránením celej hrúbky kože až po fasciu. Transplantáty ľudskej kože s úplnou hrúbkou a s rovnakou veľkosťou odvodené z ľudskej neonatálnej predkožky sa umiestnia na ranové lôžka a zošijú sa na mieste. Transplantát sa pokryje náplasťou, ktorá sa spojí stehmi k pokožke. Látková lepiaca páska Micropore sa tiež aplikuje na pokrytie rany.

Ľudská melanómová bunková línia M21-L alebo bunková línia karcinómu prsníka MDA 23.1 (ATCC HTB 26; α_νβ3 negatívny imunoreaktivitou tkanivových rezov s monoklonálnou protilátkou LM609) tvoria pevné ľudské tumory na transplantátoch ľudskej kože na SCID myšiach. Suspenzia z jedného klonu buniek s 5 x 10⁶ M21-L alebo MDA 23.1 buniek sa intradermálne injikuje do transplantátov ľudskej kože. Myši sa potom pozorovali 2 až 4 týždne, aby narástli merateľné ľudské tumory.

Potom ako sa vytvoril merateľný, tumor, do žily myšieho chvosta sa injikovali retrovírusové preparáty podľa predkladaného vynálezu alebo PBS. Po 2-3 týždňovej perióde sa tumor odstránil a analyzovala sa jeho hmotnosť a histológia. Účinok exprimovaných proteínov Src podľa predkladaného vynálezu na tumory sa vyhodnotil.

7. In vitro regresia rastu ľudského tumorového tkaniva pomocou Src modulátorov meraná CAM analýzou

Rast tumoru závisí od angiogenézy (Folkman, 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-10934; Weidner et al., 1991, N.E. J. Med. 324:1-8; Brooks et al., 1994, Celí 79:1157-1164) . V skutočnosti sa v súčasných štúdiách naznačuje, že rast tumoru je ovplyvniteľný anti-angiogenetickými účinkami antagonistov receptora VEGF (Kim et al., 1993, Náture 362:8451-844). Preto sme vyšetrili, či supresia angiogenézy doručením Src 251 s odstránenou kinázou bude ovplyvňovať rast ľudského meduloblastómu (DAOY), vysoko angiogenetického tumoru, ktorý je známy tým, že produkuje VEGF ale len veľmi málo bFGF.

a 6 dňové analýzy rastu meduloblastómového tumoru DAOY sa uskutočnili na kuracom CAM, v podstate ako už je opísané (Brooks et al., 1994, supra) . 5 x 10⁶ DAOY' buniek kultivovaných v RPMI 1640 obsahujúcom 10% fetálne teľacie sérum sa premylo a nasadilo sa na CAM 10 dňového embrya, aby sa vytvorili fragmenty DAOY tumoru. Po 7 dňoch sa 50 mg fragmenty tumoru pitvali, opäť sa nasadili na ďalšie 10 dňové embryo a inukubovali sa ďalších 3 alebo 6 dní s topickou aplikáciou (25 μΐ) buď kontrolného retrovírusu RCAS-GFP, RCAS-Src 251 alebo modelovým (mock) ošetrením. Použitím konfokálneho zobrazenia celého tkaniva infikovaných tumorov ako pomôcky sme boli schopný určiť, že okolo a vo vnútri fragmentu tumoru s týmto topickým prístupom bola preukazná expresia konštruktov RCAS. Tumorové resekcie a váženie sa uskutočnilo „double blind spôsobom odstraňujúc len ľahko definovateľnú hmotu pevného tumoru (Brooks et al., 1994, supra). Hmotnosti tumorov za vlhka po 3 alebo 6 dňoch sa porovnali s pôvodnou hmotnosťou a určila sa percentuálna zmena hmotnosti tumoru pre každú skupinu.

Tieto tumory ľahko rastú na CAM a zapríčiňujú aktívnu angiogenézu (obr. 9), pričom umožňujú selektívne zacieliť vaskulatúru tumoru odvodeného od vtáčieho, s použitím vtáčieho špecifického retrovírusu RCAS.

Na obr. 9 sú znázornené výsledky, ktoré zobrazujú retrovírusové doručenie RCAS-Src 251 ľudským tumorom rastúcim na kuracích CAM, ktoré obracia rast tumoru. Obr. 9A znázorňuje ľudské meduloblastómy, ktoré rástli na CAM kuracích embryí ako je už opísané. Retrovírus obsahujúci RCAS-GFP alebo RCAS-Src 251 sa topicky aplikoval na už vytvorené tumory väčšie ako 50 mg. Reprezentatívny mikrograf fragmentu meduloblastómového tumoru infikovaného RCAS-GFP exprimujúcim GFP odhaľuje výhradnú expresiu v krvných cievach tumoru (šípka), ako je detegované optickým rezaním s BioRad laserovým konfokálnym skenovacím mikroskopom (bar=500 pm). Obr. 9B ukazuje výsledky z tumorov ošetrených ako je uvedené hore, ktoré sa nechali rásť 3 alebo 6 dní, potom sa podrobili resekcii a určila sa hmotnosť za vlhka. Dáta sú vyjadrené ako priemerná zmena hmotnosti tumoru (od počiatočnej hmotnosti tumoru 50 mg) +/- SEM 2 replikátov. RCAS-Src 251 mal preukazný vplyv na rast tumoru po 3 dňoch (*, P<0.002) a 6 dňoch (**, P<0.05). Obr. 9C ukazuje reprezentatívne stereomikrografy meduloblastómových tumorov chirurgicky odstránených z embryí, snímaných stereomikroskopom Olympus (bar=350 pm). Na nižšom paneli je mikrograf každého tumoru znázorňujúci detailnú vaskulatúru každého tumoru (bar=350 pm), s vysokým zväčšením. Šípka označuje prerušenie krvnej cievy v tumoroch ošetrených RCA-Src 251.

Výsledky ukazujú, že doručenie RCAS obsahujúceho Src 251 do už vytvorených meduloblastómov malo za následok selektívnu vírusovú expresiu v krvných cievach asociovaných s tumorom (obr. 9A) a toto nakoniec viedlo k regresii týchto tumorov v rozpätí 6 dní (obr. 9B) . Dôležité je, že krvné cievy asociované s tumorom u zvierat ošetrených vírusom obsahujúcim Src 251 boli vážne narušené a v menšom počte v porovnaní s cievami tumoru u kontrolných zvierat (obr. 9C) . Skutočnosť, že tumory infikované RCAS-GFP preukázali lokalizáciu GFP len vo vaskulatúre tumoru naznačuje, že protinádorové účinky pozorované pri retrovírusom doručenom Src 251 boli spôsobené jeho antiangiogenetickými vlastnosťami .

8. Src požiadavka na prežitie endotelových buniek v priebehu angiogenézy sprostredkovanej VEGF ale nie bFGF

Súčasný dôkaz naznačuje, že receptory rastových faktorov (Choi and Ballermann et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:2114421150; Satake et al., 1998, Biochem Biophys. Res. Comm. 244:642646) a integríny (Meredith et al., 1993, Mol Biol, Celí 4:953961; Brooks et al., 1994a, Science 264:569-571) podporujú prežitie angiogenetických endotelových buniek. Skutočnosť, že oba rastové faktory a adhézne receptory tiež regulujú aktivitu Src podnietila skúmanie úlohy Src v prežití endotelovej bunky počas angiogenézy. CAM stimulované buď bFGF alebo VEGF sa infikovali retrovírusom obsahujúcim Src 251 a kryostatické rezy týchto tkanív sa vyšetrili na prítomnosť apoptózových buniek.

Stručne, kryorezy CAM ošetrených RCAS-GFP alebo RCAS-Src 251 ošetrené s bFGF alebo VEGF sa analyzovali na apoptózové bunky použitím súpravy Apoptag Kit (Oconor, Gaithersburg, MD). Rezy sa imunofarbili králičou polyklonálnou anti-vWf (Biogenix, San Ramon, CA) a kontrastne sa farbili s 1 pg/ml DAPI. Fluorescenčné snímky sa zachytili chladenou CCD kamerou/fotoaparátom (Roper, Trenton, NJ), a fluorescenčné snímky sa vyvolali a porovnali podľa snímok (exposure matched) medzi experimentálnymi ošetreniami, ako je už opísané (Ellcelri et al., 1998, supra).

Na meranie apoptózového indexu tkaniva CAM infikovaného retrovirusom sa anexin V konjugovaný s FITC (Clontech, Palo Alto, CA) použil na farbenie bunkových suspenzií a premyté bunky sa analyzovali prietokovou cytometriou. Bunkové suspenzie CAM buniek sa pripravili z modelovo (mock) infikovaných a vírusom infikovaných CAM natrávením s 0,1% (w/v) kolagenázou typu IV (Wothington Biochemicals, Lakewood, NJ) , v RPMI 1640 z mletého tkaniva CAM trepaním 1 hodinu pri 37’C, ako je už opísané predtým (Brooks et al., 1994b) a prefiltrovali sa cez 100 μΜ nylonovú sieť (Becton Dickinson, Fountain Lakes, NJ) . Fluorescencia sa merala prietokovým cytometrom FACscan (Becton Dickinson) na zrátanie 10 000 buniek.

Meranie vWf farbenia pomocou FACs sa uskutočnilo s paralelnými bunkovými preparátmi kolagenázou natráveného CAM tkaniva, ktoré sa fixovali v 1,8% paraformaldehyde, permeabilizovali sa v 70% etanole, inkubovali sa s anti-vWf protilátkou a detegovali so sekundárnou protilátkou konjugovanou s FITC.

Doručenie Src 251 podporilo rozsiahle TUNEL farbenie medzi krvnými cievami pozitívnymi na antigén príbuzný s faktorom VIII (von Willebrandov faktor [vWf]) v CAM stimulovaných VEGF ale nie bFGF. V skutočnosti sa pozorovala minimálna apoptóza medzi inými typmi buniek v týchto CAM, čo naznačuje špecifickú požiadavku endotelových buniek na aktivitu kinázy Src na bunkové prežitie vo VEGF aktivovaných krvných cievach. V druhej sérii experimentov sa retrovirusom infikované CAM stimulované VEGF alebo bFGF podrobili- limitovanému natráveniu kolagenázou, aby sa pripravila suspenzia z jedného klonu buniek (a single celí suspension). Ukázalo sa, že tieto bunky odvodené od CAM obsahujú približne 20%-50% endotelových buniek (vWf pozitívnych) a tieto bunky sa analyzovali na apoptózu detekciou prietokovou cytometriou annexin Vr-pozitívnych buniek, skorého apoptózového markera. Bunky odvodené od CAM stimulovaných VEGF a infikovaných Src 251 mali preukazne zvýšené farbenie annexinom V vzhľadom k bunkám z CAM infikovaných modelovo s RCAS-GFP ošetrených VEGF. Naproti tomu bunky odvodené od modelovo infikovaných CAM alebo tých, ktoré sa infikovali s RCAS-Src 251 a stimulovali s bFGF prejavovali malé alebo žiadne farbenie annexinom V. Naviac medzi bunkami odvodenými od nestimulovaných alebo bFGF stimulovaných CAM nebolo detegované farbenie annexinom V. Tieto dáta demonštrujú aktivita kinázy Src je selektívne požadovaná na prežitie endotelových buniek počas angiogenézy sprostredkovanej VEGF ale nie bFGF v CAM.

9. Selektívna požiadavka na aktivitu kinázy Src v subkutánnom myšom modeli angiogenézy

Na ďalšiu analýzu úlohy Src pri angiogenéze sa použil myší model. V tomto prípade sa angiogenéza indukovala subkutánnou injekciou matrigelu s redukovaným rastovým faktorom doplneného buď bFGF (100 ng/ml) alebo VEGF (400 ng/ml)· atýmusovým wehl (nu/nu) dospelým myšiam a analyzovala sa po 5 dňoch (Passaniti et al., 1992). Angiogenéza sa kvantifikovala odstránením a homogenizáciou tkaniva, izolovaním proteínov a imunoblottingom s protilátkou na VEGF receptor (flk-1) (obr. 13A), ktorá je špecifická na endotelové bunky. Ako sa pozorovalo u kuraťa expresia cDNA Src 251 s odstránenou kinázou blokuje angiogenézu indukovanú VEGF v tomto myšom modeli, zatiaľ čo nemá vplyv na angiogenézu indukovanú bFGF (obr. 13A). Na zistenie úlohy endogénneho Src v tomto modeli sa tkanivá infikovali retrovirusom exprimujúcim Cak, ktorý inhibuje endogénnu aktivitu Src fosforyláciou C-koncového regulačného miesta (Nada et al., 1991, Náture, 361:68-72). Expresia Cak blokovala angiogenézu indukovanú VEGF ale nie bFGF (obr. 13), čo potvrdilo úlohu endogénnej aktivity Src v angiogenéze indukovanej VEGF. Neovaskularizácia týchto vírusom infikovaných thanív stimulovaných VEGF sa potvrdila priamou imunofluorescenciou s protilátkou anti-DC34 konjugovanou s FITC alebo s anti-flk-1 protilátkou a kvantifikovala sa vyrátaním počtu pozitívne sfarbených CD34 krvných ciev v každom kryoreze (obr. 13C).

Stručne, angiogenéza sa indukovala subkutánnou injekciou matrigelu s redukovaným rastovým faktorom obsahujúceho fyziologický roztok alebo VEGF (400 ng/ml) s 2 x 10⁶ ektropických (ectropic) zbalovacích buniek exprímujúcich GFP retrovírus do slabiny atýmusovým wehl (nu/nu) myší a analyzovala sa po 5 dňoch inkubácie. Neovaskularizácia sa kvantifikovala imunoblottingom s protilátkou na receptor VEGF (flk-1), ktorá je špecifická pre endotelové bunky. Obr. 15A znázorňuje výsledky imunoblottingu. Účinky Src 251 s deletovanou kinázou, Csk alebo GFP retrovírusu na angiogenézu indukovanú VEGF (400 ng/ml) alebo bFGF (400 ng/ml) sa analyzovali imunoblottingom tkanivových lyzátov s protilátkou anti-flk-1. Príklad týchto výsledkov je znázornený na obr. 15B. Účinok retrovírusov exprímujúcich Src 251 a Csk na neovaskularizáciu indukovanú VEGF sa kvantifikoval vypočítaním počtu CD34 pozitívnych ciev v krížových rezoch tkaniva nepriamou imunofluorescenciou v troch náhodných poliach pri 20x. Kryorezy zátok (plugs) sa tiež podrobili imunofluorescenčnému farbeniu s protilátkou anti-CD34 alebo s protilátkou anti-flk, odfotili sa a kvantitatívne vyjadrili ako je opísané v prípade CAM analýz angiogenézy.

Celkové množstvo priamej fluorescencie tumorových fragmentov infikovaných RCAS-GFP sa dosiahlo narezaním fragmentov tumoru a zobrazením nefixovaného tkaniva priamo na podložnom sklíčku laserovým konfokálnym mikroskopom (MRC 1024: Bio-Rad, Hercules, CA) .

10. Účinok intradermálnej expresie VEGF v ušiach src’^/_ alebo src^+/' myší.

Po výsledkoch získaných z angiogenetických modelov kuriat a myši sa použil genetický prístup na vyšetrenie intradermálnej angiogenézy indukovanej VEGF u src‘^/_ myší. Tiež sa vyšetrili účinky na vaskulárnu permeabilitu, keďže je známe, že VEGF iniciuje rast nových krvných ciev a môže tiež podporovať vaskulárnu permeabilitu (Senger et al., 1983 Science 218:983-985; Ferrera and Davis-Smyth, 1997, Endocr. Rev. 16:4-25).

Intradermálne injekcie adenovírusu exprimujúceho ľudskú VEGF cDNA sa podali do ucha src‘^/_ a src^+/~ myší, kým kontrolný adeno.vírus exprimujúci β-galaktozidázu sa injikoval do druhého ucha každej myši. Rast nových krvných ciev závislý od VEGF v src^+/’ ušiach sa najprv detegoval počas 48 hodín a neovaskularizácia sa analyzovala po 5 dňoch.

V skratke, pp60^c’^src, pp60^c-yes, pp60^c_fyn, deficientne myši (129/8v/Ev x C57B16/J) sa pripravili ako sa opísalo predtým (Soriano et al., 1991, Celí 64:693-702). Prídavné zásobné roztoky sa získali od Jackson labs. Do uší myší sa intradermálne injikovalo (Eriksson et al., 1980, Microvasc. Res.. 19:374-378) 5 μΐ adenovírusu exprimujúceho buď VEGF alebo β-galaktozidázu a uši sa odfotografovali po 5 dňoch stereoskopom.

Zistilo sa, že u src'^/_ a src^+/_ boli rovnaké hladiny vírusovej expresie, ako sa určilo pomocou X-gal farbenia uší, do kto rých sa injikoval adenovírus obsahujúci β-galaktozidázu. V src‘^/_ ušiach, do ktorých sa injikoval VEGF, nebolo preukazné zníženie angiogenézy, ako sa zistilo počítaním vetviacich bodov (p<0,05). Avšak prekvapujúco naj zreteľnej ši fenotyp u týchto zvierat bola úplná blokáda vaskulárneho presakovania v porovnaní so src^+/' ušami, do ktorých sa injikoval VEGF. Vyšetrenie uší, do ktorých sa injikoval VEGF potvrdzuje rozsah vaskulárneho presakovania u src^+/_ myší, ktoré sa v podstate nevyskytuje u src‘^/_ myší. Vaskulárne presakovanie u týchto zvierat naznačuje, že VP aktivita, ktorá je asociovaná s angiogenézou in vivo (Dvorak et al., 1995, Am. J. Pathol. 148:1029-1039), sa môže selektívne prerušiť u myší deficientnych na pp60^c‘^src.

11. VEGF neoslabuje hematoencefalickú bariéru myší s nedostatkom pp60^c_src

Vaskulatúra mozgu je charakteristická vysoko obmedzujúcou hematoencefalickou bariérou, ktorá zabraňuje prestupovaniu malých molekúl do okolitého tkaniva mozgu. Rast tumoru v rámci mozgu môže oslabovať túto bariéru z časti vďaka produkcii angiogenetických rastových faktorov, ako je VEGF. Preto sa vyšetrila povaha hematoencef alicke j bariéry u src^+/_ alebo src’^/_ myší. V tomto prípade sa VEGF alebo fyziologický roztok stereotakticky injikoval do pravej alebo ľavej hemisféry mozgu, ako je uvedené. Všetky myši dostali systemické injekcie farbičky Evanova modrá, aby sa umožnilo monitorovanie VP aktivity.

Stručne, fyziologický roztok alebo VEGF (200 ng v 2 μΐ) sa stereotakticky injikoval do ľavého alebo pravého frontálneho laloku 92 mm napravo alebo naľavo od stredovej čiary, 0,5 mm rostrálne (predne) od bregmy (temeno) a 3 mm do hĺbky od dura mater (pevnej pleny), ako je uvedené. Zvieratá dostali roztok Evanovej modrej intravenózne 30 min. po injekcii, ako je tu už opísané. Po ďalších 30 min. sa myši podrobili perfúzii a mozgy sa odobra85

11. Fluorescencia Evanovej modrej sa pozorovala použitím konfokálnej laserovej mikroskopie čerstvých nefixovaných kryorezov mozgu.

Vaskulárne presakovanie krvi sa lokalizovalo v hemisfére injikovanej VEGF u src^+/_ myši, ale u src'^/_ myší sa vaskulárne presakovanie vôbec nevyskytlo. Toto bol tiež prípad, kedy sa vyšetrovanie VP určované akumuláciou Evanovej modrej detegovalo epifluorescenčnou analýzou kryostatických rezov uvedených mozgov. Teda VEGF oslabuje hematoencefalickú bariéru spôsobom, ktorý je závisí od aktívneho pp60^c’^src.

12. VEGF sprostredkovaná VP, ale nie VP asociovaná so zápalom, závisí od pp60^{c src}

Na ďalšiu analýzu a kvantitatívne vyjadrenie účinku VEGF ako VP faktora u src^+/ alebo src'^z‘ myší, použila sa Milesova analýza (Miles & Miles, 1992) na kvantitatívne meranie vaskulárnej permeability v koži týchto zvierat. VEGF sa injikoval intradermálne src^+/ alebo src'^/_ myšiam, ktoré dostali intravenóznu systemickú dávku farbičky Evanova modrá. Počas 15 min. po injekcii VEGF sa pozoroval trojnásobný nárast VP u src^+/_ myší. Avšak u src^_/' myší sa nepozorovala detegovatelná VP aktivita. Elúcia farbičky škvŕn kože, do ktorých sa dala injekcia, sa kvantifikovala a porovnala s kontrolným fyziologickým roztokom a bFGF. Kontroly bFGF alebo fyziologický roztok sa injikovali v blízkosti VEGF a nepreukazovali preukazné zvýšenie VP.

Stručne, Milesova analýza (Miles et al., 1962) sa upravila pre myši injikovaním 10 μΐ VEGF (400 ng/ml) , alylizotiokyanátu (horčičný olej, 20% w/v v parafínovom oleji), alebo fyziologického roztoku .intradermálne myšiam, ktorým sa predtým intravenózne injikovalo 100 μΐ 0,5% Evanovej modrej. Po 15 min., sa škvrny kože pitvali, fotografovali a eluovali pri 58 “C formalínom a kvantifikovali spektrofotometrom.

Je známe, že vaskulárne presakovanie/permeabilita sa objavuje počas zápalu, čo umožňuje akumuláciu adhezivneho proteínu asociovaného so sérom a zápalových buniek v tkanivách. V skutočnosti zápalové mediátory samé osebe priamo podporujú vaskulárne presakovanie. Preto sa taký zápalový mediátor, alylizotiokyanát, tiež známy ako horčičný olej (Inoue et al., 1997, supra), testoval na src^+/‘ alebo src‘^/_ myšiach na jeho schopnosť vyvolať VP. Na rozdiel od toho, čo sa pozorovalo u src^_/‘ zvierat stimulovaných VEGF, zníženie VP vyvolané injekciou zápalového mediátora alylizotiokyanátu sa nepozorovalo. Dá sa preto predpokladať, že Src hrá selektívnu úlohu vo VP aktivite indukovanej VEGF a nemá vplyv na VP asociovanú so zápalovým procesom.

13. VEGF sprostredkovaná aktivita VP závisí od Src a Yes, ale nie od Fyn

Špecifita požiadavky Src na VP sa skúmala vyšetrovaním VEGF indukovanej VP aktivity asociovanej s SFK, ako sú Fyn alebo Yes, ktoré podobne ako Src, sú známe tým, že sa exprimujú v endotelových bunkách (Bull et al., 1994, FEBS Letters, 361:41-44; Kiefer et al., 1994, Curr. Biol. 4:100-109). Potvrdilo sa, že tieto tri SFK boli exprimované ekvivalentne v aortách myší divého typu. Ako src'⁷~ myši, zvieratá deficientne v Yes sú tiež defektné na VP indukovanú VEGF. Avšak, prekvapujúco si myši postrádajúce Fyn zachovali vysokú VP ako odpoveď na VEGF, ktorá nebola preukazne rozdielna od kontrolných zvierat. Prerušenie VP indukovanej VEGF u src’⁷' alebo yes’⁷’ myší demonštruje, že kinázová aktivita špecifických SFK je esenciálna pre VEGF sprostredkovanú signálnu udalosť vedúcu k VP aktivite, ale nie angiogenéze.

Vlastnosti vaskulárnej permeability VEGF v koži src⁺⁷‘ (obr. 14A, lavý panel) alebo src'⁷' (obr. 14A, pravý panel) myší sa determinovali intradermálnou injekciou fyziologického roztoku alebo VEGF (400 ng) myšiam, ktorým sa predtým intravenózne injikovala Evanova modrá. Po 15 min. sa kožné škvrny fotografovali (scale bar, 1 mm). Hviezdičky ukazujú miesta injekcie. Oblasti obklopujúce miesta injekcie VEGF, bFGF alebo fyziologického roztoku sa pitvali a VP sa kvantifikovala elúciou Evanovej modrej vo formamide pri 58’C 24 hodín a absorbancia sa merala pri 500 nm (obr. 14B, ľavý graf). Schopnosť zápalového mediátora (alylizotiokyanátu), známeho tým, že indukuje zápal spojený s VP, sa testovala u src^+/_ alebo src^_/' myší (obr. 14B, vpravo).

Schopnosť VEGF indukovať VP sa porovnala u src’^/_, fyn^_/ alebo yes^_/ myší v Milesovej analýze (obr. 14C). Dáta každej z Milesových analýz sa vyjadrili ako stredná hodnota ± štandardná odchýlka z troch zvierat. src'^/_ alebo yes^-/ VP poruchy porovnané s kontrolnými zvieratami boli štatisticky preukazné (*p<0,05, párový t test), kým VP poruchy u fyn^/_ myší ošetrených VEGF ani u myší src^+/‘ ošetrených alylizotiokyanátom neboli štatisticky preukazné (**p<0,05).

14. Myši ošetrené inhibítorom tyrozínkinázy rodiny Src a src’^/_ myši preukazujú znížené poškodenie tkaniva asociované s traumou alebo poranením krvných ciev než neošetrené myši divého typu

Špecifické podanie inhibítorov kináz rodiny Src pôsobí ako inhibícia patologického vaskulárneho presakovania a permeability počas vaskulárneho poranenia alebo porúch ako je mŕtvica. Vaskulárny endotel je dynamický bunkový typ, ktorý odpovedá na mnohé podnety s cieľom regulovať procesy ako je pučanie nových krvných ciev počas angiogenézy tumoru, regulácia permeability steny cievy počas mŕtvicou indukovaného edému a poškodenia tkaniva.

Zníženie vaskulárnej permeability na dvoch myších modeloch mŕtvice pomocou inhibície Src biochemickej dráhy liečivom, je postačujúce na' inhibíciu poškodenia mozgu znížením vaskulárneho úniku indukovaného ischémiou. Náviac u myší geneticky deficient nych v Src, ktoré majú znížené vaskulárne presakovanie/permeabilitu, je objem infaktu tiež znížený. Kombinácia dát syntetického inhibítora Src s podporujúcim genetickým dôkazom zníženia vaskulárneho presakovania v mŕtvici a iných príbuzných modeloch demonštruje fyziologickú významnosť tohto prístupu pri znižovaní poškodenia mozgu, ktoré nasleduje po mŕtviciach. Inhibícia týchto biochemických dráh so skupinou inhibítorov kináz rodiny Src týchto signálnych kaskád, ktoré sú k dispozícii, je terapeutickým prínosom zmierňovania poškodenia mozgu spôsobeného poškodením tkaniva súvisiacim s vaskulárnou permeabilitou.

Použili sa dva rôzne spôsoby na indukciu fokálnej cerebrálnej ischémie. Oba zvieracie modely fokálnej cerebrálnej ischémie sú dobre pripraviteľné a široko používané vo výskume mŕtvice. Oba modely sa predtým použili na zisťovanie patofyziológie cerebrálnej ischémie ako aj na testovanie nových liečiv proti mŕtvici .

a) Myši sa anestézovali avertinom a teplota tela sa udržovala držaním zvierat na vyhrievanej podložke. Urobila sa incízia medzi pravým uchom a pravým okom. Lebka sa odkryla retrakciou temporálneho (spánkového) svalu a navŕtal sa malý otvor v oblasti nad strednou cerebrálnou artériou (MCA, middle cerebral artery). Mozgové pleny sa odstránili a pravá MCA sa okludovala koaguláciou použitím žeraviaceho vlákna. Zvieratá sa nechali zotaviť a vrátili sa do klietok. Po 24 hodinách sa mozgy podrobili perfúzii, vybrali sa a narezali na 1 mm krížové rezy. Rezy sa ponorili do 2% 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloridu (TTC) a oblasti mozgu s infarktom sa identifikovali ako nesfarbené (biele) tkanivo obklopené životaschopným (červeným) tkanivom. Objem infarktu sa definoval ako suma nesfarbených oblastí rezov vynásobená ich hrúbkou.

Myši deficientne v Src (Src-/-) sa použili na štúdium úlohy Src pri cerebrálnej ischémii. Src+/~ myši slúžili ako kontrola.

Zistilo sa, že infarktový objem u Src-/- myší sa znížil z 26 ± 10 mm³ na 16 ± 4 mm³ v kontrolách 24 hodín po poškodení. Účinok bol ešte viac zvýraznený, keď sa myšiam C57B16 divého typu injikovalo 1,5 mg/kg PP1 intraperitoneálne (i.p.) 30 min. po oklúzii cievy. Veľkosť infarktu sa znížila z 31 ± 12 mm³ v neošetrenej skupine na 8 ± 2 mm³ v skupine ošetrenej PP1.

b) V druhom modeli fokálnej cerebrálnej ischémie sa MCA okludovala umiestnením embolu na začiatok MCA. Jedna intakthá 24 hodín stará homológna zrazenina bohatá na fibrín sa umiestnila na začiatok MCA s použitím modifikovaného katétra PE-50. Indukcia cerebrálnej ischémie sa potvrdila znížením cerebrálneho krvného toku v ipsilaterálnej hemisfére v porovnaní s kontralaterálnou hemisférou. Po 24 hodinách sa mozgy vybrali, pripravila sa' séria rezov a farbila sá s hematoxylín-eozínom (HE). Objem infarktu sa určil sčítaním infarktových oblastí v sérii HE rezov vynásobených vzdialenosťou medzi každým rezom.

Dávka PP1, ktorá sa použila v tejto štúdii (1,5 mg/kg i.p.) sa vybrala empiricky. Je známe, že VEGF sa najprv exprimuje asi 3 hodiny po cerebrálnej ischémii v mozgu s maximom po 12 až 24 hodinách. V tejto štúdii sa PP1 podal 30 min. po začiatku infarktu, aby kompletne blokovalo zvýšenie vaskulárnej permeability indukovanej VEGF. Podľa časového priebehu typickej expresie VEGF, potenciálne terapeutické okno na podanie inhibítorov Src by bolo do 12 hodín po mŕtvici. Pri ochoreniach asociovaných s trvalým zvýšením vaskulárnej permeability je vhodné chronické podávanie Src ihibujúcich liečiv.

Obr. 15 je graf, ktorý znázorňuje porovnávajúce výsledky priemerného infarktového objemu (mm³) v mozgoch myší po poranení, kde boli myši heterogénne Src (Src+/-), dominantne negatívne Src mutanty (Src-/-), myši divého typu (WT) alebo myši divého typu ošetrené s 1,5 mg/kg PP1 (PP1).

Obr. 16 znázorňuje vzorku následných MRI snímok izolovaného myšieho mozgu podrobeného perfúzii po ošetrení na indukciu poranenia CNS, kde vývoj snímok u zvieraťa ošetreného s PP1 (vpravo) jasne ukazuje menší infarkt ako vývoj snímok u kontrolne ošetreného zvieraťa (vlavo).

Spôsoby podľa predkladaného vynálezu sú čiastočne vhodné na špecifický zásah do poškodenia tkaniva indukovaného VP, pretože cielená inhibícia akcie tyrozínkinázy rodiny Src zameriava inhibíciu VP bez dlhodobého účinku na iné odpovede indukované VEGF, ktoré môžu byť prospešné na zotavenie sa zo zranenia. Na rozdiel od neutralizácie proteínu VEGF, inhibícia Src neinterferuje s kumulatívnym angiogenetickým účinkom VEGF, ktorý môže byť prospešný v neskoršom štádiu ochorenia.

Použitie syntetických inhibítorov s malými molekulami je vo všeobecnosti bezpečnejšie a zvládnuteľnéjšie ako použitie veľkých' proteínov. Použitie rekombinantných proteínov, ako je fúzny protein receptor VEGF-myší imunoglobulín, je potenciálne škodlivé a neumožňuje opakované podávanie z obavy, aby sa nevyvolala alergická reakcia, keď sa používa u ľudí (napr. ľudská anti-myšia protilátka; ΗΑΜΆ - human anti-mouse antibody).

Na záver, VEGF nie je jediný aktivátor po prúde od Src (downstream Src), ďalšie cytokíny sa zúčastňujú na patofyziológii cerebrálnej ischémie, ktoré môžu ovplyvniť vaskulárnu permeabilitu, ako je IL-6 a TNF-α. Teda inhibícia VEGF nemusí inhibovať celú následnú aktiváciu Src spojenú s poranením. V skutočnosti zníženie veľkosti infarktu pomocou PP1 je viac potvrdené ako pomocou antagonizmu VEGF, čo ukazuje, že iné biochemické dráhy môžu aktivovať kinázy Src uľahčujúce zvýšenie permeability.

Predchádzajúci opis sa považuje za dostatočný na to, aby umožnil odborníkovi v odbore uskutočniť vynález. Predkladaný vynález nie je limitovaný v rozsahu žiadnym depozitom bunkovej línie, keďže akékoľvek uvedené uskutočnenie je zamýšľané ako jedna ilustrácia jedného aspektu vynálezu a akákoľvek bunková línia, ktorá je funkčne ekvivalentná je v rámci rozsahu vynálezu. Predkladaný materiál nezahŕňa prehlásenie, že tu obsiahnutý opis je inadekvátny na to, aby umožnil uskutočniť ktorýkoľvek aspekt vynálezu, vrátane jeho najlepšieho spôsobu, ani nie je chápaný ako limitujúci pre rozsah nárokov na špecifické ilustrácie, ktoré reprezentuje. Z predchádzajúceho opisu budú odborníkom v odbore zjavné mnohé modifikácie vynálezu naviac k tým, ktoré sú opísané a ukázané, a ktoré spadajú do rozsahu priložených nárokov.

Claims (1)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmaceutická kompozícia obsahujúca proteíny tyrozínkinázy

   Src a . Yes, spolu s farmaceutický prijateľným nosičom. 2. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 1, kde proteín Src je Src -A. 3. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 1, kde proteín Src má na aminokyselinovom zvyšku 527 akýkoľvek aminokyselinový zvyšok

   okrem tyrozínu, serínu alebo treonínu.

   4 . Farmaceutická kompozícia podľa nároku 1, kde Src proteín je inaktívny. 5. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 4, kde proteín Src je Src K295M. 6. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 4, kde proteín Src je Src 251. 7 . Farmaceutická kompozícia podľa nároku 1, kde proteín Yes je ina ktívny proteín Yes. 8. Farmaceutická kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu, ktorá

   má nukleotidovú sekvenciu schopnú exprimovať proteíny tyrozínkinázy Src a Yes, spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.

   9. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 8, kde proteín Src je Src-A.

   10. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 8, kde uvedený proteín Src má na aminokyselinovom zvyšku 527 akýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyrozínu, serínu alebo treonínu.

   11. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 8, kde uvedený proteín Src je inaktívny Src.

   12. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 11, kde uvedený proteín Src je Src K295M.

   13. Farmaceutická kompozícia .podľa nároku 11, kde uvedený proteín Src je Src 251

   14. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 8, kde uvedený proteín Yes je inaktívny proteín Yes.

   15. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 8, ktorá obsahuje vírusový vektor na prenos génov.

   16. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 8, ktorá obsahuje nevírusový vektor na prenos génov.

   17. Farmaceutická kompozícia obsahujúca nukleovú kyselinu, ktorá má nukleotidovú sekvenciu schopnú exprimovať proteín tyrozínkinázy Src a nukleovú kyselinu, ktorá má nukleovú sekvenciu schopnú exprimovať proteín tyrozínkinázy Yes spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.

   18. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 17, kde proteín Src je Src-A.

   19. Farmaceutická kompozícia podlá nároku 17, kde uvedený protein Src má na aminokyselinovom zvyšku 527 akýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyrozínu, serinu alebo treoninu.

   20. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 17, kde protein Src je inaktívny Src. 21. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 20, kde protein Src je Src K295M. 22. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 20, kde protein Src je Src 251. 23. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 17, kde protein Yes je inaktívny protein Yes. 24. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 17, ktorá obsahuje vi-

   rusový vektor na prenos génov.

   25. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 17, ktorá obsahuje nevirusový vektor na prenos génov.

   26. Spôsob modulovania vaskulárnej permeability v tkanive trpiacom chorobným stavom a zahŕňajúci kontaktovanie uvedeného tkaniva s terapeuticky účinným VP modulujúcim množstvom farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje protein tyrozínkinázy vybraný zo skupiny obsahujúcej Src, Yes alebo ich zmes.

   27. Spôsob podľa nároku 26, kde protein tyrozínkinázy je aktívny Src a uvedená modulácia potenciuje vaskulárnu permeabilitu.

   28. Spôsob podlá nároku 27, kde aktívny proteín Src je Src-A.

   29. Spôsob podlá nároku 27, kde proteín Src má na aminokyselinovom zvyšku 527 akýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyrozínu, serinu alebo treoninu.

   30. Spôsob podlá .nároku 26, kde proteín tyrozínkinázy je aktívny Yes a uvedená modulácia potenciuje vaskulárnu permeabilitu.

   31. Spôsob podľa nároku 26,. kde proteín tyrozínkinázy je zmes aktívneho proteínu Src a proteínu Yes a uvedená modulácia potenciuje vaskulárnu permeabilitu.

   32. Spôsob podľa nároku 26, kde proteín tyrozínkinázy je inaktívny proteín Src a uvedená modulácia inhibuje vaskulárnu permeabilitu .

   33. Spôsob podľa nároku 32, kde inaktívny proteín Src je Src K295M.

   34. Spôsob podľa nároku 32, kde uvedený inaktívny proteín Src je Src 251.

   35. Spôsob podľa nároku 26, kde proteín tyrozínkinázy je inaktívny proteín Yes a uvedená modulácia inhibuje vaskulárnu permeabilitu.

   36. Spôsob podľa nároku 26, kde proteín tyrozínkinázy je zmes, ktorá obsahuje inaktívny proteín Src a uvedená modulácia inibuje vaskulárnu permeabilitu.

   37 . Src Spôsob K295M. podľa nároku 36, kde inaktívny proteín Src je 38. Spôsob podľa nároku 36, kde inaktívny proteín Src je Src 251. 39. Spôsob podľa nároku 26, kde proteín tyrozínkinázy je zmes, ktorá obsahuje inaktívny proteín Yes a uvedená modulácia inibuje

   vaskulárnu permeabilitu.

   40. Spôsob modulovania vaskulárnej permeability v tkanive trpiacom chorobným stavom zahŕňajúci kontaktovanie uvedeného tkaniva s terapeuticky účinným VP modulujúcim množstvom farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu schopnú exprimovať proteín tyrozínkinázy vybraný zo skupiny obsahujúcej proteín Src, proteín Yes alebo ich zmes.

   41. Spôsob podlá nároku 40, kde farmaceutická kompozícia obsahuje retrovírusový expresný vektor.

   42. Spôsob podlá nároku 40, kde farmaceutická kompozícia obsahuje nevírusový expresný vektor.

   43. Spôsob podlá nároku 40, kde nukleová kyselina je schopná exprimovať aktívny proteín Src a uvedená modulácia je potenciácia vaskulárnej permeability.

   44. Spôsob podlá nároku 43, kde proteín Src je Src-A.

   45. Spôsob podlá nároku 43, kde proteín Src má na aminokyselinovom zvyšku 527 akýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyrozínu, kde nukleová kyselina je schopná serinu alebo treonínu

   46. Spôsob podlá nároku 40, exprimovať inaktívny protein Src a uvedená modulácia je inhibicia vaskulárnej permeability.

   47. Src Spôsob K295M. podľa nároku 46, kde inaktívny protein Src je 48 . Spôsob podľa nároku 46, kde inaktívny protein Src je Src 251.

   49. Spôsob podľa nároku 40, kde nukleová kyselina je schopná exprimovať inaktívny protein Yes a uvedená modulácia inhibuj e vaskulárnu permeabilitu.

   50. Spôsob podľa nároku 40, kde nukleová kyselina je schopná exprimovať aktívny protein Yes a uvedená modulácia potenciuje vaskulárnu permeabilitu.

   51. Spôsob podľa nároku 40, kde nukleová kyselina je schopná exprimovať inaktívny protein Src a inaktívny protein Yes a uvedená modulácia inhibuje vaskulárnu permeabilitu.

   52. Spôsob podľa nároku 40, kde nukleová kyselina je zmes, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu schopnú exprimovať inaktívny protein Yes.

   53. Spôsob podľa nároku 40, kde nukleová kyselina je zmes, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu schopnú exprimovať inaktívny protein Src.

   54 . Src Spôsob K295M. podlá nároku 53, kde inaktívny proteín Src je 55. Spôsob podlá nároku 53, kde inaktívny proteín Src j e Src 251. 56. Spôsob podlá nároku 53, kde inaktívny proteín tyrozínkinázy Src je zmesou inaktívneho proteínu Src 251 a Src K295M. 57. Spôsob podlá nároku 40, kde nukleová kyselina je schopná

   exprimovať aktívny proteín Src a aktívny proteín Yes.

   58. Spôsob podlá nároku 40, kde nukleová kyselina je zmesou, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu schopnú exprimovať aktívny proteín Yes.

   59. Spôsob podľa nároku 40, kde nukleová kyselina je zmesou, ktorá obsahuje nukleovú kyselinu schopnú exprimovať aktívny proteín Src.

   60. Výrobný artikel obsahujúci obalový materiál a farmaceutickú kompozíciu obsiahnutú v tomto obalovom materiáli, kde uvedená farmaceutická kompozícia je schopná modulovať vaskulárnu permeabilitu v tkanive trpiacom chorobným stavom, kde uvedený obalový materiál obsahuje štítok, na ktorom je uvedené, že farmaceutická kompozícia sa môže použiť na liečenie chorobných stavov moduláciou vaskulárnej permeability, a kde uvedená farmaceutická kompozícia obsahuje proteín tyrozínkinázy Src a proteín tyrozinkinázy Yes, vo farmaceutický prijateľnom nosiči.

   61. Výrobný artikel podlá nároku 60, kde proteín Src je aktívny

   Src.

   62. Výrobný artikel podľa nároku 61, kde aktívny protein Src je Src-A.

   63. Výrobný artikel podľa nároku 61, kde protein Src má na aminokyselinovom zvyšku 527 akýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyrozínu, serínu alebo treonínu.

   64. ny. Výrobný artikel podľa nároku 60, kde protein Src je inaktív- 65. Výrobný artikel podľa nároku 64, kde protein Src je Src K295M.

   66. Výrobný artikel podľa nároku 64, kde protein Src je Src 251. 67. Výrobný artikel podľa nároku 60, kde protein Yes je aktívny. 68. Výrobný artikel podľa nároku 60, kde protein Yes je inaktív-

   ny.

   69. Výrobný artikel obsahujúci obalový materiál a farmaceutickú kompozíciu obsiahnutú v tomto obalovom materiáli, kde uvedená farmaceutická kompozícia je schopná modulovať vaskulárnu permeabilitu v tkanive trpiacom chorobným stavom, kde uvedený obalový materiál obsahuje štítok, na ktorom je uvedené, že farmaceutická kompozícia sa môže použiť na liečenie chorobných stavov moduláciou vaskulárnej permeability, a kde uvedená farmaceutická kompozícia obsahuje nukleovú kyselinu schopnú exprimovať protein tyrozínkinázy Src a protein tyrozínkinázy Yes, vo farmaceutický prijateľnom nosiči.

   100

   70. Výrobný artikel podlá nároku 69, kde uvedený proteín Src je aktívny Src. 71. Výrobný artikel podľa nároku 70, kde aktívny proteín Src je Src-A. 72. Výrobný artikel podľa nároku 70, kde proteín Src má na ami-

   nokyselinovom zvyšku 527 akýkoľvek aminokyselinový zvyšok okrem tyrozínu, serínu alebo treonínu.

   73. ny. Výrobný artikel podľa nároku 69, kde proteín Src je inaktív- 74 . Výrobný artikel podľa nároku 73, kde proteín Src Src K295M. 75. Výrobný artikel podlá nároku 73, kde proteín Src je Src 251. 76. Výrobný artikel podľa nároku 69, kde proteín Yes je aktívny. 77 . Výrobný artikel podľa nároku 69, kde proteín Yes je inaktív-

   ny.

   78. Výrobný artikel podľa nároku 69, kde uvedené proteiny Src a Yes sú kódované zmesou nukleových kyselín schopných exprimovať proteín Src a schopných exprimovať proteín Yes vo farmaceutický prijateľnom nosiči.

   79. Výrobný artikel obsahujúci obalový materiál a farmaceutickú kompozíciu obsiahnutú v tomto obalovom materiáli, kde uvedená farmaceutická kompozícia je schopná modu'lovať vaskulárnu permeabilitu v tkanive trpiacom chorobným stavom, kde uvedený obalový

   101 materiál obsahuje štítok, na ktorom je uvedené, že farmaceutická kompozícia sa môže použiť na liečenie chorobných stavov moduláciou vaskulárnej permeability, a kde uvedená farmaceutická kompozícia obsahuje nukleovú kyselinu schopnú exprimovať protein tyrozínkinázy Yes, vo farmaceutický prijateľnom nosiči. .

   80. Výrobný artikel podľa nároku 79, kde protein Yes je aktívny. 81. Výrobný artikel podľa nároku 79, kde protein Yes je inaktív- ny- 82. Výrobný artikel obsahuj úci obalový materiál a farmaceutickú

   kompozíciu obsiahnutú v tomto obalovom materiáli, kde uvedená farmaceutická kompozícia je schopná modulovať vaskulárnu permeabilitu v tkanive trpiacom chorobným stavom, kde uvedený obalový materiál obsahuje štítok, na ktorom je uvedené, že farmaceutická kompozícia sa môže použiť na liečenie chorobných stavov moduláciou vaskulárnej permeability, a kde uvedená farmaceutická kompozícia obsahuje protein tyrozínkinázy Yes vo farmaceutický prijateľnom nosiči.

   83. Výrobný artikel podľa nároku 82, kde protein Yes je aktívny.

   84. Výrobný artikel podľa nároku 82, kde protein Yes je inaktívny.

   85. Spôsob na zmienenie poškodenia tkaniva, ktoré súvisí s vaskulárnym presakovaním alebo edémom, zahŕňajúci kontaktovanie uvedeného tkaniva s vaskulárnu permeabilitu modulujúcim množstvom farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src.

   86. Spôsob podľa nároku 85, kde inhibítor tyrozínkinázy rodiny

   102

   Src je chemický inhibítor.

   87. Spôsob podľa nároku 86, kde chemický inhibítor je vybraný zo skupiny obsahujúcej PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531,

   Radicicol R2146 a Geldanamycin.

   88. Spôsob podľa nároku 87,kde inhibítor je PP1.

   89. Spôsob podľa nároku 85, kde inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src je inaktivny proteín Src.

   90. Spôsob podľa nároku 89, kde uvedený inaktivny proteín Src je Src K295M.

   91. Spôsob podľa nároku 89, kde inaktivny proteín Src je Src 251.

   92. Src Spôsob podľa nároku je inaktivny proteín 85, kde Yes. inhibítor tyrozínkinázy rodiny 93. Spôsob podľa nároku 85, kde inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src je aktívny C-koncový kinázový proteín Src (CSK). 94. Spôsob podľa nároku 85, kde inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src je nukleová kyselina kódujúca inhibičný proteín tyroz ínkiná- zy rodiny Src. 95. Spôsob podľa nároku 94, kde farmaceutická kompozícia obsahu-

   je retrovírusový expresný vektor.

   96. Spôsob podľa nároku 94, kde farmaceutická kompozícia obsahuje nevírusový expresný vektor.

   103

   97. Spôsob podlá nároku 94, kde inhibičný proteín je vybraný zo skupiny obsahujúcej inaktivny proteín Src, inaktívny proteín Yes, aktívnu C-koncovú kinázu Src (CSK) a ich zmes.

   98. Src Spôsob K295M. podľa nároku 97, kde inaktívny proteín Src je 99. Spôsob podľa nároku 97, kde inaktívny proteín Src . 7^e

   Src 251.

   100. Spôsob podlá nároku 85, kde inhibítorom je'inhibítor tyŕozínkinázy Src.

   101. Výrobný artikel obsahujúci obalový materiál a farmaceutickú kompozíciu obsiahnutú v tomto obalovom materiáli, kde uvedená farmaceutická kompozícia je schopná modulovať zvýšenie vaskulárnej permeability v tkanive trpiacom chorobným stavom, kde uvedený obalový materiál obsahuje štítok, na ktorom je uvedené, že farmaceutická kompozícia sa môže použiť na liečenie vaskulárneho presakovania alebo edému asociovaných s týmito chorobnými stavmi, a kde uvedená farmaceutická kompozícia obsahuje inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src a farmaceutický prijateľný nosič pre tento inhibítor.

   102. názy Výrobný artikel podľa rodiny Src je chemický nároku 101, inhibítor. kde inhibítor tyrozínki- 103. Výrobný artikel podľa nároku 102, kde inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src je vybraný zo skupiny obsahujúcej PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 a Geldanamycin. 104. Výrobný artikel podľa nároku 102, kde inhibítor tyrozínki-

   104 názy rodiny Src je PP1.

   105. Výrobný artikel podľa nároku 101, kde inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src je inaktívny proteín Src.

   106. Výrobný je Src K295M. artikel podľa nároku 105, kde inaktívny proteín Src 107. Výrobný artikel podľa nároku 105, kde inaktívny proteín Src je Src 251. 108. Výrobný artikel podľa nároku 101, kde inhibítor tyrozínki-

   názy rodiny Src je inaktívny proteín Yes.

   109. Výrobný artikel podľa nároku 101, kde inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src je aktívny C-koncový proteín kinázy Src (CSK).

   110. Výrobný artikel obsahujúci obalový materiál a farmaceutickú kompozíciu obsiahnutú v tomto obalovom materiáli, kde uvedená farmaceutická kompozícia je schopná modulovať vaskulárnu permeabilitu v tkanive trpiacom chorobným stavom, kde uvedený obalový materiál obsahuje štítok, na ktorom je uvedené, že farmaceutická kompozícia sa môže použiť na liečenie vaskulárneho presakovania alebo edému asociovaných s týmito chorobnými stavmi, a kde uvedená farmaceutická kompozícia obsahuje nukleovú kyselinu kódujúcu inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src, vo farmaceutický prijateľnom nosiči

   111. Výrobný artikel podľa nároku 110, kde inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src je inaktívny proteín Src.

   112. Výrobný artikel podľa nároku 111, kde inaktívny proteín Src je Src K295M.

   105

   113. Výrobný artikel podlá nároku 111, kde inaktivny proteín Src je Src 251.

   114. Výrobný artikel podlá nároku 110, kde inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src je inaktivny proteín Yes.

   115. Výrobný artikel podlá nároku 110, 'kde inhibítor tyrozínkinázy rodiny Src je aktívny C-koncový proteín kinázy Src (CSK).