SK5992000A3 - Modification of the tocopherol content of transgenic plants - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález sa týka nových sekvencií nukleovej kyseliny, ktoré kódujú geranylgeranyl-reduktázu, a metódy produkcie nových rastlín, ktoré obsahujú novú sekvenciu nukleovej kyseliny a ktorých obsah tokoferolu a/alebo chlorofylu v porovnaní s divoko rastúcimi rastlinami je modifikovaný, týchto nových rastlín, ich častí a produktov rastlinných buniek, ako tiež použitia týchto sekvencií nukleovej kyseliny na ovplyvnenie obsahu tokoferolu, chlorofylu a/alebo vitamínu Κ_Σ v transgénnych rastlinách, ich častiach a produktoch a rastlinných bunkách.

Doterajší stav techniky

Diterpén geranylgeranyl-pyrofosfát (GGPP) vzniká ako medziprodukt s 20 C v rastlinnej látkovej premene izoprenoidu. Je výsledkom adície jednej jednotky izopentylpyrofosfátu (IPP) na farnezyl-pyrofosfát, 15-C-seskviterpén. GGPP prechádza v rôznych cestách syntézy rastlinnou sekundárnou látkovou výmenou. Tak môžu napríklad dve molekuly GGPP koniec na koniec viest k zlúčeninám s 40 C, tetraterpénom, ktoré sa všeobecne označujú ako karotenoidy, a ku ktorým napríklad patrí β-karotén. Adíciou ďalšej molekuly IPP vstupuje GGPP do biosyntézy polyterpénov (ako kaučuku a gutaperči).

GGPP môže byt ďalej premenený na ďalšie diterpény, ako napríklad fytyl-pyrofosfát(PPP). 20-C-útvar fytol je povinný intermediát v biosyntéze tokoferolu (Soli a Schulz (1981) Biochem. Biophys. Res. Common. 99, 907-912) ako tiež syntézy chlorofylu (Dailey H.A., ed.) Mc Graw Hill, NY, 287-391). Žatia! čo základná štruktúra všetkých chlorofylov (chlorofyl a, b, c, atd.) je porfyrínový systém vybudovaný z štyroch pyro2 lových kruhov, na ktorom je viazaný fytol cez pyrolový kruh IV, vyznačujú sa tokoferoly štruktúrou skladajúcou sa homogenizátu a fytolového konca.

Skupina tokoferolov, ktoré sa označujú všeobecne ako vitamín E, zahŕňa rad štruktúrnych blízko príbuzných vitamínov rozpustných v tukoch, totiž α-, β-, δ- a e-tokoferol, z ktorých α-tokoferol je biologicky najdôležitejší. Tokoferoly sa vyskytujú v mnohých rastlinných olejoch, osobitne bohaté na tokoferoly sú oleje zo semien sóji, pšenice, kukurice, ryže, bavlníka, lucerny a orechov. Tiež ovocie a zelenina napríklad jahody, boby, hrach, fazuľa, paprika apod. obsahujú tokoferoly. Až dosiaľ boli známe tokoferoly výlučne v rastlinách respektíve syntetizované vo fotosynteticky aktívnych organizmoch

Tokoferoly na základe svojho redukčného potenciálu prispievajú k tomu, aby sa zabránilo oxidácii nenasýtených mastných kyselín vzdušným kyslíkom; u ľudí je α-tokoferol najdôležitejším antioxidantom rozpustným v tukoch. Predpokladá sa, že tokoferoly svojou funkciou ako antioxidanty prispievajú k stabilizovaniu biologických membrán, čím je dodržaná fluidita membrán ochranou nenasýtených mastných kyselín membránových lipidov. Podľa novejších poznatkov sa môže pravidelným prísunom relatívne vysokých dávok tokoferolu pôsobit proti artérioskleróze. Ako ďalšie priaznivé fyziologické vlastnosti tokoferolu boli opísané: oddialenie cukrovkou podmienených poškodení, zmenšenie rizík tvorby šedého zákalu, zníženie oxidatívneho stresu u fajčiarov, antikarcinogénne efekty, ochranný účinok proti poškodení kože ako je erytém a starnutie kože, apod.

Vďaka svojim vlastnostiam zabraňujúcim oxidácii sa tokoferoly používajú nie len v technológii potravín, ale tiež v náterových farbách založených na prírodných olejoch, v dezodorantoch a inej kozmetike, napríklad v ochranných slnečných prostriedkoch, prostriedkoch starostlivosti o kožu, rúžoch apod. Pritom sú zlúčeniny tokoferolu ako tokoferyl-acetát a tokoferyl-sukcinát obvyklými aplikačnými formami pre použitie ako vitamín E, v prekrvovacích prostriedkoch a prostriedkoch lipidy znižujúcich a ako prídavok ku krmivom vo veterinárnej medicíne.

V biosyntéze tokoferolov, najmä a-tokoferolu, sa zdá byt obmedzujúcim faktorom fytyl-pyrofosfát. Doterajšie výskumy poukazujú na to, že PPP vzniká z GGPP sekvenčnou hydrogenáciou izoprenoidnej skupiny, pričom ako intermediáty vznikajú dihydro GGPP a tetrahydro-GGPP (GGPP -> dihydro-GGPP -> tetrahydro-GGPP

I

-> PPP; pozri napríklad Bolivar et al. (1994) Biochemistry 33, 12763-12768).

Postupná hydrogenácia GGPP na PPP je - ako sa dnes nazdávame - katalyzovaná enzýmom geranylgeranyl-reduktázou (GGPPreduktáza, tiež označovaná geranylgeranyl-pyrofosfát-hydrogenáza respektíve GGPP-hydrogenáza), ktorá je kódovaná v rastlinách v géne Chl P. Enzým geranylgeranyl-reduktáza patrí k látkovej výmene izoprenoidu a funguje v dvoch cestách látkovej výmeny: syntéze tokoferolu a syntéze chlorofylu.

KÍúčový význam tohto enzýmu bol poprvýkrát ukázaný pre biosyntézu chlorofylu (Benz et al. (1980) Plánt Sci. Lett. 19, 225-230; Soli a Schulz (1981) Biochem. Biophys. Res. Commun. 99,907-912; Schoch et al. (1977) Z. Pflanzenphysiol. 83, 427436). Posledný krok biosyntézy chlorofylu je esterifikácia chlorofylidu, ktorá môže byt uskutočnená ako s fytylpyrofosfátom, tak tiež s geranylgeranyl-pyrofosfátom. Systematické skúmania mutantov Rhodobacter capsulatus mohli ukázat, že sa najskôr esterifikuje bakteriochlorofylid s GGPP a následne sa esterifikovaný chlorofyl-GG hydrogenuje (Katz et al. (1972) J. Am. Chem. Soc.94, 7938-7939). Vo vyšších rastlinách sa z najväčšej časti dokazuje fytyl-chlorofyl (chlorofyl-P) (Rudiger a Schoch (1991) v Chlorophylls (Scheer, H., Ed.) s. 451-464,

CRC Press, Boca Raton, Florida, USA). Dodnes nie je jasné, s ktorými substrátmi reakcia reduktázy v rastlinách prebieha.

V súčasnosti sa prijíma názor, že rastlinná geranylgeranylreduktáza je schopná transformovať ako chlorofyl-GG na chlorofyl-P (Schoch et al. (1978) Z. Pflanzenphysiol. 83, 427-436), tak aj hydrogenovat GGPP na PPP ktorá sa potom viaže s chlorofylidom (Soli et al. (1983) Plánt. Physiol. 71,849-854).

GGPP slúži ako substrát pre postupy syntézy tokoferolu a fylochinónu v chloroplastových vonkajších obalových membránach a pre syntézu chlorofylu v tylakoidových membránach. Redukciu GGPP na PPP poprvýkrát opísal v roku 1983 Soli et al. (1983, Plánt. Physiol. 71,849-854). Až dodnes sa však nepodarila izolácia a charakterizácia sekvencií nukleovej kyseliny, ktoré kódujú rastlinný enzým a môžu byt použité na ovplyvnenie obsahu tokoferolu v transgénnych rastlinách.

Významná úloha geranylgeranyl-reduktázy v látkovej výmene tokoferolu a chlorofylu robí tento enzým osobitne cenným nástrojom pre molekulárnu biotechnológiu. Pomocou techník molekulárnej biológie ako je prenos sekvencií DNA, kódujúcich geranylgeranyl-reduktázu, by mohli byt dosiahnuté zmeny v biosyntetickej produktivite tokoferolu a/alebo chlorofylu v rastlinách. Týmto spôsobom by bola možná napríklad výroba transgénnych rastlín so zvýšeným alebo zníženým obsahom tokoferolu. Také transgénne rastliny, respektíve ich časti, bunky, a/alebo produkty, by mohli byt potom použité ako potravinárske a kŕmne prostriedky, prípadne všeobecne ako výrobné miesta pre tokoferol, ktorý nachádza použitie v chemickom, farmaceutickom a kozmetickom priemysle.

Z toho vyplýva, že rastliny, ktoré oproti divoko rastúcim rastlinám vykazujú zvýšený obsah antioxidačné účinného toko5 ferolu, majú aj zvýšenú rezistenciu voči stresovým podmienkam, najmä proti oxidačnému stresu.

Preto je úlohou vynálezu pripraviť nové sekvencie nukleovej kyseliny, s ktorých pomocou bude možné ovplyvniť obsah tokoferolu v rastlinách a ich častiach, v rastlinných bunkách a/alebo v rastlinných produktoch.

Ďalšou dôležitou úlohou vynálezu je pripraviť transgénne rastliny, rastlinné bunky, rastlinné časti a produkty so zmeneným obsahom tokoferolu oproti divoko rastúcim rastlinám.

Ďalšia úloha spočíva v tom, ukázať možnosti použitia sekvencii DNA podlá vynálezu, ich génové produkty ako tiež transgénne rastliny podlá vynálezu, pre praktické pestovanie rastlín.

Ďalšie úlohy vynálezu sú zrejmé z nasledujúceho opisu. Tieto úlohy sú riešené a sú predmetom nezávislých nárokov, predovšetkým založených na poskytnutiu sekvencii DNA podlá vynálezu, ktoré sa bezprostredne podielajú na biosyntéze tokoferolu a na zmenenom obsahu tokoferolu ako výsledku prenosu týchto sekvencii DNA na rastliny.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa týka ako sekvencii DNA, ktoré kódujú proteín s biologickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy (nazývaná tiež ako geranylgeranyl-pyrofosfát-hydrogenáza), tak aj jeho biologický fragment. Biologicky aktívny fragment v súvislosti s týmto vynálezom znamená, že sprostredkovaná biologická aktivita dostačuje na ovplyvnenie obsahu tokoferolu. Osobitne sa vynález týka rastlinných sekvencii DNA, ktoré kódujú proteín s biologickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo jeho biologický fragment, predovšetkým sa vynález týka oznámenej sekvencie DNA v SEQ:ID č. 1 (pozri tie obrázok 1).

Ďalej sa vynález týka aliel a derivátov sekvencií DNA podía vynálezu, ktoré kódujú proteín s biologickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy, najmä molekúl nukleovej kyseliny, ktorých sekvencie sa na základe degenerácie genetického kódu odlišujú od sekvencií DNA podía vynálezu, a ktoré kódujú proteín alebo jeho fragment, ktorý vykazuje biologickú aktivitu geranylgeranyl-reduktázy.

Ďalej sa vynález týka molekúl nukleovej kyseliny, ktoré sekvencie DNA podía vynálezu obsahujú, alebo z nich vznikajú prirodzene sa vyskytujúcim procesom alebo génovými technickými alebo chemickými procesmi a metódami syntézy, respektíve sú od týchto kyselín odvodené. Môže pritom íst napríklad o molekuly DNA alebo RNA, cDNA, génové DNA, mRNA apod.

Vynález sa takisto týka takých molekúl nukleovej kyseliny, v ktorých sú sekvencie DNA podía vynálezu spojené s pravidelnými prvkami, ktoré zaisťujú transkripciu a ked je to žiadúce, transláciu v rastlinnej bunke.

Tak môžu byť podía vynálezu sekvencie DNA, napríklad za kontroly konštitučných, ale tiež indukčných alebo tkanivovo alebo vývojovo špecificky regulačných elementov, najmä promotorov, exprimované do rastlinných buniek. Napríklad zatiaí čo použitie indukčného promotoru umožňuje cielene vyvolanú expresiu sekvencie DNA podía vynálezu v rastlinných bunkách, ponúka napríklad nasadenie tkanivovo špecifických promotorov, príkladne pre semeno špecifických promotorov, možnosť zmeniť obsah tokoferolu v určitom tkanive, napríklad v tkanive semien. A tak sú k dispozícii sekvencie DNA s výhodou formy uskutočnenia podía vynálezu v kombinácii s tkanivovo špecifickými promótormi, najmä promótormi špecifickými pre semeno.

Ί

Vynález sa ďalej týka proteínov s biologickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo ich aktívnych fragmentov, ktoré sú kódované sekvenciou DNA alebo molekulou nukleovej kyseliny podlá vynálezu. S výhodou ide o rastlinnú geranylgeranyl-reduktázu, prednostne z Nicotiana tabacum, osobitne výhodne o proteín s uvedenou sekvenciou aminokyselín v SEQ:ID č. 2 (pozri tiež obrázok 2) alebo jeho aktívny fragment.

Ďalšia úloha vynálezu spočíva v dodaní vektorov a mikroorganizmov, ktorých použitie umožňuje prípravu nových rastlín, v ktorých je možné dosiahnuť zmenený obsah tokoferolu. Táto úloha je riešená poskytnutím vektorov a mikroorganizmov podlá vynálezu, ktoré obsahujú sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej enzýmy s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy.

Tým sa predkladaný vynález tiež týka vektorov, najmä plazmidov, kozmidov, vírusov, bakteriofágov a iných v génovej technike bežných vektorov, ktoré obsahujú hore opísané molekuly nukleovej kyseliny podlá vynálezu, a môžu byt rovnako použité podlá vynálezu na prenos molekúl nukleovej kyseliny na rastliny, respektíve rastlinné bunky.

Takisto sa vynález týka transformovaných mikroorganizmov, ako baktérií, vírusov, hub, kvasiniek atď., ktoré obsahujú sekvencie nukleovej kyseliny podlá vynálezu.

Vo výhodnej forme rozpracovania sú molekuly nukleovej kyseliny obsiahnuté vo vektoroch prepojené s regulárnymi prvkami ktoré zaisťujú transkripciu a prípadne transláciu v prokaryotických a eukaryotických bunkách.

Prípadne môžu byt sekvencie nukleovej kyseliny podlá vynálezu doplnené sekvenciami enhancerov alebo inými regulárnymi sekvenciami. Tieto regulárne sekvencie obsahujú napríklad tiež sekvencie signálov, ktoré sa starajú o transport génového produktu k určitému kompartmentu.

Úlohou vynálezu je rovnako poskytnúť nové rastliny, rastlinné bunky, rastlinné časti alebo produkty, ktoré sa vyznačujú zmeneným obsahom tokoferolu, ktorý môže byť eventuálne spriahnutý - oproti divoko rastúcim rastlinám - s produktivitou chlorofylovej biosyntézy.

Tieto úlohy sa riešia prenosom molekúl nukleovej kyseliny a ich expresiou v rastlinách. Poskytnutím molekúl nukleovej kyseliny podía vynálezu existuje teraz možnosť, pomocou génových technických metód zmeniť rastlinné bunky tak, že v porovnaní s bunkami typu divoko rastúcich vykazujú novú alebo zmenenú aktivitu geranylgeranyl-reduktázy a v dôsledku toho dochádza k zmenenej produktivite biosyntézy tokoferolu a zmenenému obsahu tokoferolu.

V jednej výhodnej forme uskutočnenia vynálezu ide o rastliny, respektíve ich bunky a časti, v ktorých je - oproti divoko rastúcim rastlinám - zvýšený obsah tokoferolu na základe prítomnosti a expresie molekúl nukleovej kyseliny podía vynálezu. Vynález sa však týka tiež takých rastlín, v ktorých prenos molekúl nukleovej kyseliny podía vynálezu vedie k zmenšeniu obsahu tokoferolu a/alebo chlorofylu. Redukovaná produktivita biosyntézy tokoferolu a/alebo chlorofylu môže napríklad byť dosiahnutá prenosom anti-sense konštrukcií alebo inými potlačovacími mechanizmami, ako napríklad kosupresiou.

Predmetom vynálezu sú ďalej transgénne rastlinné bunky, respektíve rastliny obsahujúce také rastlinné bunky a ich časti a produkty, v ktorých sú integrované do rastlinného genómu nové molekuly nukleovej kyseliny.

Predmetom vynálezu sú takisto rastliny, v bunkách ktorých je sekvencia nukleovej kyseliny podlá vynálezu v samoreplikovatelnej forme, to znamená, že rastlinná bunka obsahuje cudziu DNA na jednej samostatnej molekule nukleovej kyseliny.

Pri rastlinách, ktoré sú transformované molekulami nukleovej kyseliny podlá vynálezu a v ktorých je na základe zavedenia takej molekuly syntetizované zmenené množstvo tokoferolu a/alebo chlorofylu, môže v zásade ísť o lubovolnú rastlinu. S výhodou je to úžitková jednoklíčna alebo dvojklíčna rastlina. Príkladom pre jednoklíčne rastliny sú rastliny, ktoré patria k rodu Avena (ovos), Triticum (pšenica), Secale (žito), Hordeum (jačmeň), Oryza (ryža), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorhum (proso), Zea (kukurica). Pri dvojklíčnych úžitkových rastlinách je možné vymenúvať okrem iných strukoviny, a osobitne lucernu, sóju, repku, rajčiak, cukrovú repu, zemiaky, ozdobné rastliny, stromy. Ďalšími úžitkovými rastlinami môže byť napríklad ovocie ( najmä jablká, hrušky, čerešne, vinič, citrusy, ananás, banány), palmový olej, čajovníky, kakaovníky a kávovníky, tabak, sisal, bavlna, lan, slnečnica, ako tiež liečivé rastliny a pastvinové trávy a kŕmne rastliny. S výhodou to najmä sú : obiloviny pšenica, žito, ovos, jačmeň, ryža, kukurica a proso, kŕmne obiloviny, cukrová repa, repka, sója, rajčiak, zemiaky, sladké trávy , kŕmne trávy a ďatelina.

Je samozrejmé, že vynález sa osobitne týka potravinárskych respektíve kŕmnych plodín. Okrem už spomínaných rastlín je možné tu ešte navyše uviesť podzemnicu olejnú, šošovicu, fazulu, pohánku, mrkvu, slnečnicu, topinambur, repicu, horčicu bielu, kvaku a kaleráb.

Predmetom vynálezu sú dalej rozmnožovacie materiály rastlín podlá vynálezu, napríklad semená, plody, sadenice, hluzy, korene, atd., pričom tento rozmnožovací materiál obsahuje hore uvedené opísané transgénne rastliny, ako tiež časti týchto rastlín, ako protoplasty, rastlinné bunky a vrúble.

Vynález sa týka rovnako rastlinných buniek, ktoré na základe prítomnosti a prípadne expresie molekúl nukleovej kyseliny podía vynálezu, ktoré v porovnaní s rastlinnými bunkami, ktoré tieto molekuly nukleovej kyseliny neobsahujú, vykazujú zmenený obsah vitamínu Kj. V tukoch rozpustný vitamín Κ_χ, ktorý je najmä obsiahnutý v rastlinách, má dôležitú funkciu pri tvorbe minima1izačných faktorov. Nedostatok vitamínu Kj vedie k zmenšeniu krvácania, a preto sa tiež označuje ako antihemoragický alebo koagulačný vitamín. Pretože expresia molekúl nukleovej kyseliny podía vynálezu pôsobí zmenenú aktivitu geranylgeranyl-reduktázy a preto aj zmenenú produktivitu PPP-syntézy a pretože ako vitamín K-^ označený fylochinón, obsahuje ako tokoferoly jednotku fytolu, sú tiež také rastlinné bunky respektíve rastliny predmetom vynálezu, ktoré samotné alebo v kombinácii so zmeneným obsahom tokoferolu vykazujú zmenený obsah vitamínu Kj.

S výhodou v jednej forme uskutočnenia ide o transgénne rastlinné bunky a ich časti a produkty, ktoré na základe prítomnosti a prípadne expresie kódujúcej sekvencie DNA geranylgeranyl-reduktázy z rastlín vykazujú oproti netransformovaným bunkám zmenený obsah tokoferolu. S výhodou ide - pri kódujúcej sekvencie DNA získanej v rastlinných bunkách - o sekvenciu, kódujúcu geranylgeranyl-reduktázu, pochádzajúcu z tabaku. Osobitne výhodne ide o sekvenciu DNA zobrazenú v SEQ:ID č. 1 (pozri tiež obr. 1). V jednej osobitne výhodnej forme uskutočnenia kódujú sekvencie DNA podía vynálezu predstupeň enzýmu geranylgeranyl-reduktázy, ktorý zahŕňa prenosovú sekvenciu pre translokáciu v plastidoch.

Vynález sa týka aj ďalších rastlín, v ktorých je exprimovaný popri Chl P-géne navyše gén pre hydroxyfenylpyruvát-dioxy genázu (HPD). Enzým HPD katalyžuje reakciu 4-hydroxyfenylpyruvátu na homogenizát, ktorý - ako bolo uvedené hore - predstavuje popri fytole druhý stavebný prvok tokoferolu. Enzým HPD ako tiež jeho úlohu v rastlinnej látkovej výmene izoprenoidu opísal inter alia Norris et al. (1995) The Plánt Celí 7, 2139-2149.

Spoločnou expresiou, s výhodou preexprimovaním sekvencií, ktoré kódujú geranylgeranyl-reduktázu a HPD, je možné podlá vynálezu navyše zvýšiť obsah tokoferolu v transgénnych rastlinách oproti takým rastlinám, ktoré obsahujú iba CH L kódujúcej sekvencie.

V ďalšej forme uskutočnenia sa vynález týka hostitelských buniek, najmä prokaryotických a eukaryotických buniek, ktoré boli transformované respektíve infikované hore opísanou molekulou nukleovej kyseliny alebo vektorom a buniek, ktoré pochádzajú z týchto hostitelských buniek a obsahujú opísané molekuly nukleovej kyseliny alebo vektory. Hostitelskými bunkami môžu byt baktérie, rasy, bunky kvasiniek a hub, ako tiež rastlinné alebo živočíšne bunky. Predmetom vynálezu sú tiež také hostitelské bunky, ktoré obsahujú popri molekulách nukleovej kyseliny podlá vynálezu jedným alebo viacerými spôsobmi génovej technológie alebo prirodzenou cestou prenesené molekuly nukleovej kyseliny, ktoré nesú genetickú informáciu enzýmom, podielajúcim sa na biosyntéze tokoferolu, chlorofylu a/alebo vitamínu

Okrem toho je základom predkladaného vynálezu úloha, poskytnúť spôsob prípravy rastlinných buniek a rastlín, vyznačujúcich sa zmeneným obsahom tokoferolu.

Táto úloha sa rieši spôsobom, pomocou ktorého je možná produkcia nových rastlinných buniek a rastlín, ktoré na zákla12 de prenosu geranylgeranyl-reduktázu kódujúcich molekúl nukleovej kyseliny vykazujú zmenený obsah tokoferolu.

Okrem toho sa táto úloha rieši spôsobom, ktorého pomocou je možná produkcia nových rastlinných buniek a rastlín, ktoré na základe spoločného prenosu geranylgeranyl-reduktázu kódujúcich molekúl nukleovej kyseliny a HPD kódujúcich molekúl nukleovej kyseliny, alebo prenosu molekúl nukleovej kyseliny kódujúcej geranylgeranyl-reduktázu a molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich HPD, vykazujú oproti divoko rastúcim rastlinám zmenený obsah tokoferolu.

Na produkciu takých nových rastlín sa ponúkajú rôzne metódy. Jednak rastliny respektíve rastlinné bunky môžu byt tradičnými génovými technologickými transformačnými metódami modifikované tak, že nové molekuly nukleovej kyseliny sú integrované do rastlinného genómu, to znamená, že sa produkujú stabilné transformanty. Jednak môžu byt podlá vynálezu molekuly nukleovej kyseliny, ktorých prítomnost a prípadne expresia v rastlinnej bunke spôsobí zmenenú produktivitu biosyntézy tokoferolu, obsiahnuté v rastlinnej bunke respektíve rastline ako systému, ktorý sa sám replikuje. Tak môžu byt podlá vynálezu molekuly nukleovej kyseliny obsiahnuté napríklad vo vírusu, s ktorým rastlina respektíve rastlinná bunka príde do styku.

Podlá vynálezu sa rastlinné bunky, ktoré na základe expresie sekvencie nukleovej kyseliny podlá vynálezu vykazujú zmenený obsah tokoferolu, pripravujú spôsobom, ktorý zahŕňa tieto kroky:

a) Príprava kazety expresie, ktorá obsahuje nasledujúce sekvencie DNA:

- promotor, ktorý poskytuje záruku transkripcie do rastlinných buniek,

-aspoň jedna sekvencia nukleovej kyseliny podlá vynálezu, ktorá kóduje proteín alebo fragment s enzymatickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy, pričom sekvencia nukleovej kyseliny je viazaná v orientácii sense na 3'koniec promotoru a

- prípadne terminačný signál pre ukončenie transkripcie a adíciu poly-A-konca na zodpovedajúci prepis, ktorý je napojený na 3'-koniec kódujúcího úseku.

b) transformácia rastlinných buniek kazetou expresie, pripravenou v krokoch a).

c) regenerácia transgénnych rastlín a prípadne ich množenie .

Alternatívne sa môže jedna alebo viac sekvencii nukleovej kyseliny podlá vynálezu dodať do rastlinnej bunky respektíve do rastliny ako systém, ktorý sa sám replikuje.

Ako ďalšia alternatíva sa môže krok a) hore uvedeného spôsobu modifikovať tak, že aspoň jedna sekvencia nukleovej kyseliny podlá vynálezu, ktorá kóduje proteín alebo fragment s enzymatickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy, je viazaná v anti-sense orientácii na 3’-koniec promotoru.

Ďalšia úloha vynálezu spočíva v tom, ukázať používanie sekvencii, ako tiež tých molekúl nukleovej kyseliny, ktoré tieto sekvencie obsahujú.

Táto úloha je riešená podlá vynálezu používaním nových molekúl DNA na produkciu rastlinných buniek a rastlín, ktoré sa vyznačujú - v porovnaní s bunkami respektíve rastlinami divokého typu - zmeneným, s výhodou zvýšeným obsahom tokoferolu.

Ďalej sa vynález týka používania sekvencií nukleovej kyseliny podľa vynálezu na produkciu rastlín, ktoré sa vyznačujú zmeneným obsahom chlorofylu.

Ďalej sa vynález týka používania sekvencií nukleovej kyseliny podľa vynálezu na produkciu rastlín, ktoré sa vyznačujú zmeneným, s výhodou zvýšeným obsahom vitamínu Kj.

Ďalšia úloha vynálezu spočíva v tom, ukázať podľa vynálezu možnosti použitia rastlín respektíve ich buniek, častí a produktov.

Predmetom vynálezu je osobitne použitie rastlín podľa vynálezu ako kŕmnych a potravinárskych rastlín. V závislosti od dosiahnutého zvýšeného obsahu vitamínu E a/alebo vitamínu Kj v transgénnych úžitkových rastlinách respektíve ich častiach a produktoch môže byt - inak obvyklé a často tiež požadované primiešanie príslušných vitamínov, najmä vitamínu E - čo sa týka množstva obmedzené, prípadne je úplne zbytočné. Nezávisle na tom sa vynález týka všeobecne zvýšenia nutričnej hodnoty úžitkových rastlín zvýšením obsahu tokoferolov a/alebo fylochinónu.

Okrem toho sa vynález týka použitia rastlinných buniek, rastlín, ich častí a produktov ako miest produkcie vitamínu E a/alebo vitamínu K-p Popri použití na základe jeho vitamínového charakteru, napríklad v dietných a farmaceutických produktoch, kozmetike, produktoch na starostlivosť o kožu, všeobecne na doplňovanie vitamínu , apod., nachádzajú tokoferoly tiež použitie ako antioxidanty v chemických produktoch ako napríklad v tukoch a olejoch. Rastliny podľa vynálezu predstavujú tak dôležitý zdroj získavania tokoferolov a/alebo vitamínu v širokom spektre priemyselných účelov.

Predmetom vynálezu je rovnako použitie sekvencií nukleovej kyseliny podía vynálezu v kombinácii s promótormi špecifickými pre semeno na produkciu rastlín, pri ktorých sa tkanivo semien vyznačuje zmeneným, s výhodou zvýšeným obsahom to koferolu. Vo výhodnej forme uskutočnenia vynálezu ide o použi tie sekvencií nukleovej kyseliny podía vynálezu v kombinácii s USP- (Bäumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225,459-467) alebo promotor hordeínu (Brandt et al. (1985) Carlsberg Res. Commun. 50, 333-345).

Tieto uvedené promotory, najmä promotory špecifické pre semeno, sa hodia tiež osobitne na cielenú redukciu obsahu tokoferolu, respektíve chlorofylu v transgénnych semenách pri použití sekvencií DNA podía vynálezu v súvislosti s technikou anti-sense.

Ďalej sa vynález týka použitia génu geranylgeranyl-reduktázy na produkciu zmeneného obsahu tokofe rolu v rastlinách.

Ďalej sa vynález týka použitia proteínu s enzymatickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy, aby sa dosiahol zmenený obsah tokoferolu v rastlinách.

Okrem toho sa vynález týka použitia molekúl nukleovej kyseliny podía vynálezu, proteínov podía vynálezu s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy a/alebo transgénnych rastlín respektíve hostiteíských buniek podía vynálezu s novou respektíve zmenenou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy na identifikáciu nových herbicídnych účinných látok na ochranu rastlín. Vdfaka kíúčovému postaveniu geranylgeranyl-reduktázy vnútri biosyntézy chlorofylu a tokoferolu predstavujú sekvencie DNA podía vynálezu a nimi kódované proteíny vysoko cenný potenciál pre výskum herbicídov. Tak podía vynálezu môžu napríklad proteíny s enzymatickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy byť použité na štruktúrnu analýzu rôngenovými lúčmi, NMR spektroskopiu, molekulové modelovanie a design drôg, aby sa - na základe z týchto spôsobov získaných znalostí - identifikovali alebo syntetizovali inhibítory a/alebo efektory geranylgeranylreduktázy a tým aj potenciálne herbicídy.

Vynález sa ďalej týka použitia sekvencie nukleovej kyseliny podía vynálezu na prípravu rastlín, tolerantných k herbicídom. Tak môžu sekvencie kódujúce geranylgeranyl-reduktázu byt pomocou štandardných metód zmenené alebo rozšírené o nové sekvenčné elementy a nakoniec prenesené na rastlinné bunky. Zavedenie sekvencií, ktoré boli odvodené od sekvencií podía vynálezu, môže napríklad byt využité na to, zmenit vlastnosti rastlín tak ďaleko, že v transgénnych rastlinách je vytvorená viac alebo menej funkčne aktívna geranylgeranyl-reduktáza alebo variant geranylgeranyl-reduktázy so zmenenými vlastnosťami, alebo že hladina expresie chl P-génu v transgénnych rastlinách je znížená.

Tak môže byt dosiahnuté pomocou zvýšenia CHL P-aktivity zvýšenie tolerancie voči herbicídom, ktoré inhibujú biosyntézu chlorofylu. Rovnako môže byt napríklad expresia zmenených génov geranylgeranyl-reduktázy v transgénnych rastlinných bunkách spojená so zvýšením tolerancie k herbicídom.

Ďalej sa vynález týka použitia sekvencií nukleovej kyseliny podía vynálezu alebo nimi kódujúcich proteínov na prípravu protilátok.

Predkladaný vynález obsahuje tak každú možnú formu použitia molekúl nukleovej kyseliny podía vynálezu, ktorých prítomnosť a prípadne expresia v rastlinách ovplyvňuje zmenu obsahov tokoferolu a/alebo chlorofylu, ako tiež - podía vynálezu - použitia proteínov alebo ich fragmentov, ktorých enzymatická aktivita takú zmenu privodí.

Pre uvedený promotor prichádza do úvahy v princípe každý funkčný promotor - v zvolených rastlinách na transformáciu - ktorý splňuje podmienku, že expresia, ktorú reguluje, vedie k zmenenej výkonnosti syntézy tokoferolu. S ohľadom na použitie transgénnych rastlín ako potravinárskych respektíve kŕmnych plodín sa zdajú preto osobitne zmysluplné také promotory ktoré zaisťujú expresiu špecifickú pre semeno. Príkladmi pre také promotory sú USP-promotor, promotor horde í nu a promotor napínu.

V prípade, že také promotory nie sú známe alebo nie sú k dispozícii, je v každom prípade koncept na izoláciu takých promotorov odborníkovi známy. Pritom sa v prvom kroku izoluje z tkaniva semena poly(A)⁺RNA a založí sa banka cDNA. V druhom kroku sa pomocou klonov cDNA, ktoré sú založené na molekulách poly(A)⁺RNA z tkaniva, ktoré nepochádza zo semien, z prvej banky identifikujú prostredníctvom hybridizácie tie klony, ktorých zodpovedajúce molekuly poly(A)⁺RNA boli exprimované iba v tkanive semien. Nakoniec sa pomocou týchto takto identi f ikovaných cDNA izolujú promotory, ktoré tak potom môžu byt použité na expresiu tu opísaných kódujúcich sekvencií nukleovej kyseliny. Analogicky môžu byt podlá vynálezu izolované a použité aj iné tkanivovo špecifické alebo vývojovo špecifické alebo abiotickými stimulmi indukovatelné promotory.

Alternatívne môže byt žiadúce, aby rastliny v mnohých oblastiach na základe expresie molekúl nukleovej kyseliny podlá vynálezu vykazovali zmenený, s výhodou zvýšený obsah toko ferolu. V tomto prípade sa ponúka použitie konštitutívneho promotoru, napríklad promotoru 35S RNA z vírusu Cauliflover mozaic vírus.

Predmetom vynálezu sú rovnako molekuly nukleovej kyseliny, ktoré proteíny s biologickou aktivitou geranylgeranyl18 reduktázy kódujú alebo ich biologicky aktívne fragmenty a tie, ktoré hybridizujú s jednou z hore opísaných molekúl nukleovej kyseliny. Pojem biologicky aktívne fragmenty sa vzťahuje na fragmenty, ktoré môžu ovplyvniť zmenený obsah tokoferolu. Pojem hybridizácia znamená v rámci tohto vynálezu hybridizáciu za konvenčných hybridizačných podmienok, s výhodou za stringentných podmienok, ktoré sú opísané napríklad v publikácii Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Molekuly nukleovej kyseliny, ktoré hybridizujú s molekulami podlá vynálezu, môžu byť napríklad izolované z genómových knižníc alebo z knižníc CDA.

Identifikácia a izolácia týchto molekúl nukleovej kyseliny môže pritom prebiehať podlá vynálezu pri použití molekúl nukleovej kyseliny alebo častí týchto molekúl respektíve reverzných komplementov týchto molekúl, napríklad pomocou hybridizácie podlá štandardnej metódy (pozri napríklad Sambrook et al, supra). Na identifikáciu a izoláciu týchto molekúl nukleovej kyseliny môžu byť použité tiež následné sekvencie odvodené od sekvencií DNA podlá vynálezu, napríklad degenerovaný oligonukleotidový prajmer.

Tak vynález zahŕňa rovnako použitie získaných sekvencií DNA alebo ich častí na identifikáciu a izoláciu homologických sekvencií z rastlín alebo iných organizmov.

Ako hybridizačná sonda môžu byť použité napríklad molekuly nukleovej kyseliny, ktoré vykazujú exaktne alebo podstatne hore uvedené sekvencie nukleotidov alebo časti týchto sekvencií. Pri fragmentoch použitých ako hybridizačná sonda môže ísť tiež o syntetické fragmenty, ktoré môžu byt pripravené pomocou bežných syntéznych techník a ktorých sekvencie súhlasia v pod19 state s jednou z molekúl nukleovej kyseliny podlá vynálezu.

Keď sú gény, ktoré hybridizujú so sekvenciami nukleovej kyseliny podía vynálezu, identifikované a izolované, je potrebné určenie sekvencie a analýza vlastností proteínu, ktorý je touto sekvenciou kódovaný. Odborník má na to rad molekulárne biologických, biochemických a biotechnologických metód k dispozícii.

Molekuly hybridizované s molekulami nukleovej kyseliny podía vynálezu zahŕňajú tiež fragmenty, deriváty a alelické varianty hore opísaných molekúl DNA, ktoré kódujú geranylgeranyl-reduktázu, alebo biologicky - to znamená enzymaticky - aktívny fragment. Fragmentmi sa pritom rozumejú časti molekúl nukleovej kyseliny, ktoré sú dostatočne dlhé, aby kódovali polypeptid alebo proteín s enzymatickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo proteín s porovnateínou enzymatickou aktivitou, ktorá podmieňuje zmenený obsah tokoferolu. Výraz derivát v tejto súvislosti znamená, že sekvencie týchto molekúl sa odlišujú od sekvencií hore opísaných molekúl nukleovej kyseliny na jednom alebo viacerých miestach, a vykazujú vysoký stupeň homológie k týmto sekvenciám. Homológia pritom znamená identitu sekvencií minimálne 40 %, najmä identitu minimálne 60 %, s výhodou cez 80 % a osobitne výhodne cez 90 %. Odchýlky k hore opísaným molekulám nukleovej kyseliny môžu pritom vzniknúť vymazaním, adíciou, substitúciou, inzerciou alebo rekombináciou.

Homológia ďalej znamená, že existuje funkčná a/alebo štruktúrna ekvivalencia medzi uvedenými molekulami nukleovej kyseliny alebo nimi kódovaných proteínov. Pri molekulách nukleovej kyseliny, ktoré sú homologické k hore opísaným molekulám a predstavujú deriváty týchto molekúl, ide spravidla o variácie týchto molekúl, ktoré predstavujú modifikácie, ktoré vykonávajú rovnakú biologickú funkciu. Môže pritom íst ako o prirodzene sa vyskytujúce variácie, napríklad o sekvencie z iných organizmov, alebo o mutácie, pričom tieto modifikácie môžu nastat prirodzeným spôsobom alebo môžu byt zavedené cielenou mutagenézou. Ďalej môže pri variáciách íst o synteticky pripravené sekvencie. Pri alelických variantoch môže íst ako o prirodzene sa vyskytujúce, tak tiež o synteticky pripravené alebo rekombinačnými technikami DNA produkované varianty.

Zvyčajne vykazujú tie molekuly nukleovej kyseliny kódujúce proteíny z rôznych variantov a derivátov určité spoločné charakteristiky. K tým môžu patrit napríklad enzýmová aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita, konformácia apod. Ďalšie spoločné charakteristiky môžu byt fyzikálne vlastnosti ako napríklad priebehové správanie v gólových elektrof orézach, chromatografické správanie, sedimentačné koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, optimum pH, teplotné optimum atď. Okrem toho môžu pochopitelne produkty reakcií katalyzovaných proteínmi vykazovat spoločné alebo podobné znaky.

Na pripravenie zaviest cudzie gény do vyšších rastlín je k dispozícii velký počet klonovacích vektorov, ktoré obsahujú replikačný signál pre E. coli a markérovací gén na selekciu transformovaných buniek baktérií. Príkladom pre tieto vektory sú pBR322, pUC-séria, M13mp-séria, pACYC184 apod. Požadovaná sekvencia môže byt do vektoru zavedená na vhodnom reštrikčnom úseku. Získaný plazmid sa použije na transformáciu buniek E. coli. Transformované bunky E. coli sa pestujú vo vhodnom prostredí a potom zoberú a lyžujú. Získa sa opát plazmid. Ako analytické metódy na charakterizáciu získaného plazmidu DNA sa všeobecne používajú reštrikčné analýzy, gólové elektroforézy, a ďalšie biochemické metódy molekulárnej biológie. Po každej manipulácii je možné plazmidy štiepit a získané fragmenty viazat s inými sekvenciami DNA. Každá plazmidová sekvencia DNA môže byt klonovaná v rovnakom alebo inom plazmide.

Na zavedenie DNA do rastlinnej hostitelskej bunky je k dispozícii vela známych techník, takže odborník si bez problémov vhodne vyberie. Tieto techniky zahŕňajú transformácie rastlinných buniek s T-DNA pri použití Agrobacterium tumefaciens alebo Agrobacterium rhizogenes ako transformačný prostriedok, fúziu protoplastov, priamy prenos génu izolovanej DNA v protoplastoch, mikroinjektovanie a elektroporácie DNA, dodanie DNA pomocou biolistickej metódy, ako tiež ďalšie možnosti.

Pri injektovaní a elektroporácii DNA do rastlinných buniek per se nie sú kladené žiadne osobitné požiadavky na použité plazmidy. Podobne to platí aj pre priamy prenos génu. Môžu byt použité jednoduché plazmidy ako napríklad pUC-deriváty. Keď však majú byt z takto transformovaných buniek regenerované celé rastliny, je spravidla nutná prítomnosť markérového génu schopného selekcie. Odborníkovi sú bežné selekčné markéry známe a nemá problém si ho zvoliť.

Podlá metódy zavedenia môže byť popri žiadúcom géne alebo génoch potrebná prítomnosť ďalších sekvencii DNA. Keď sa použije napríklad na transformáciu rastlinnej bunky Ti-plazmid alebo Ri-plazmid, tak musí byť T-DNA obsahujúca Ti-plazmid alebo Ri-plazmid viazaná so zavádzanými génmi ako bočný úsek prinajmenšom sprava, často však hraničí sprava aj zlava. Keď sa na transformáciu použijú agrobaktérie, musí sa zavádzaná DNA klonovať do špeciálnych plazmidov a síce buď do intermediárneho alebo do binárneho vektoru. Intermediárne vektory môžu byť na základe sekvencií, ktoré sú homologické k sekvenciám v T-DNA, integrované homologickou rekombináciou do Tiplazmidu alebo Ri-plazmidu agrobaktérií. Ten obsahuje okrem toho vírusovú oblasť nutnú na prenos T-DNA. Intermediárne vektory nemôžu v agrobaktériách replikovat. Prostredníctvom pomocných plazmidov sa môže intermediárny vektor preniesť na Agrobacterium tumefaciens (konjugácia). Binárne vektory môžu replikovať ako v E. coli tak tiež v agrobaktériách. Obsahujú selekčný markérový gén a jeden linker alebo polylinker, ktoré rámujú sprava a zíava hraničnú oblast T-DNA. Môžu byt priamo transformované do týchto agrobaktérií (Holsters et al. (1978) Molecular a General Genetics 163,181-187). Agrobaktérie, slúžiace ako hostitelská bunka, má obsahovat plazmid, ktorý nesie vírusovú oblast. Táto vírusová oblast je nutná na prenos T-DNA do rastlinnej bunky. Môže byt k dispozícii aj doplnková T-DNA. Takto transformované agrobaktérium sa použije na transformáciu rastlinných buniek.

Použitie T-DNA na transformáciu rastlinných buniek je intenzívne študované a dostatočne opísané v EP 120515; Hoekema v: The Binary Plánt Vector System, Offsetdrokkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985) kap. V; Fraley et al.(1993) Crit. Rev. Plánt. Sci., 4, 1-46 a An et al. (1985) EMBO J. 4, 277-278.

Na prenos DNA do rastlinnej bunky môžu byt rastlinné explantáty účelne kultivované pomocou Agrobacterium tumefaciens alebo Agrobacterium rhizogenes. Z infikovaného rastlinného materiálu (napríklad listov, častí listov, segmentov stoniek, koreňov, ale tiež protoplastov alebo suspenzne kultivovaných rastlinných buniek) môžu potom vo vhodnom prostredí, ktoré môže obsahovat antibiotiká alebo biozidy na selekciu transformovaných buniek, byt regenerované opát celé rastliny. Regenerácia rastlín prebieha podlá obvyklých regeneračných metód pri použití známych živných prostredí. Takto získané rastliny môžu byt potom skúmané, či obsahujú zavedenú DNA. Iné možnosti zavádzania cudzej DNA pri použití biolistického postupu alebo transformácií protoplastov sú známe (porovnaj napríklad Wilmitzer L. (1993) Transgenic Plants, v: Biotechnology, A MultiVolume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler, eds.) Vol. 2, 627-659, V.C.H. Weinheim - New York - Basel - Cambridge).

Zatial čo transformácia dvojklíčnych rastlín cez Ti-plazmidové vektorové systémy pomocou Agrobacterium tumefaciens sa už vžila, poukazujú novejšie práce na to, že tiež jednoklíčne rastliny sú dobre prístupné transformácii pomocou vektorov založených na Agrobacteriu. (Chán et al.(1993) Plánt Mol. Biol. 22, 491-506; Hiei et al.(1994) Plánt J. 6, 271-282; Deng et al.(1990) Science in China 33, 28-34; Wilmink et al. (1992) Plánt Celí Reports 11, 76-80; May et al. (1995) Bio/ Technology 11, 1553-1558; Conner a Domiss (1992) Int. J. Plánt Sci. 153, 550-555; Ritchie et al. (1993) Transgenic Res. 2, 252-265).

Alternatívne systémy na transformáciu jednoklíčnych rastlín sú transformácie prostredníctvom biolistickej násady zárodku (Wan a Lemaux (1994) Plánt Physiol. 104,37-48; Vasil et al.(1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al. (1994) Plánt Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al. (1990) Theor. Appl Genet. 79, 625-631; transformácie protoplastov, elektroporácie čiastočne permeabilných buniek, podanie DNA pomocou sklenených vláken.

Špecificky sa v literatúre rôzne opisuje transformácia kukurice (porovnaj napríklad WO 95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm et al.(1990) Biotechnology 8, 833-844; GordonKamm et al. (1990) Plánt Celí 2, 603-618; Koziel et al. (1993) Biotechnology 11, 194-200). V EP 292 435 je opísaný spôsob, vychádzajúci z bezhlienového, mäkkého, granulovitého kukuričného kalusu (vrúbľa), pomocou ktorého môžu byť získané úrodné hojné rastliny. Shillito et al. ((1989) Bio/Technology 7, 581) v tejto súvislosti pozorovali, že pre regenerovateínosť na úrodné rastliny je ďalej nezbytné vyjsť zo suspenzie vrúbľovaných kultúr, z ktorých je pripraviteľná jedna oddeliteľná protoplazmová kultúra, so schopnosťou regenerovať na rastliny. Po čase kultivácie in vitro sedem až osem mesiacov získali Shillito et al. rastliny s životaschopným potomstvom.

Prioli a Sôndahl ((1989) Bio/Technology 7, 589) opisujú regeneráciu a získavanie úrodných rastlín z kukuričných protoplastov, pestovaním Cateto-kukurice rovnakej odrody Cat 100-1. Autori sa domnievajú, že regenerácia protoplastov na úrodné rastliny je závislá od množstva rôznych faktorov, ako napríklad od genotypu, od fyziologického stavu donorových buniek a od podmienok kultivácie.

Tiež úspešná transformácia iných druhov obilia bola už opísaná, napríklad pre jačmeň (Wan a Lemaux, supra; Ritala et al., supra) a pre pšenicu (Nehrá (1994) Plánt. J. 5,285-297? Alpeter et al. supra).

Keď je raz zavedená DNA integrovaná v genóme rastlinnej bunky, tak je tam spravidla stabilná a zostáva tiež v potomstve pôvodne transformovanej bunky zachovaná. Normálne obsahuje selekčný markér, ktorý sprostredkováva rezistenciu transformovaných rastlinných buniek voči biozidu alebo antibiotiku ako je kanamycín, G418, bleomycín, hygromycín, metotrexat, glyfosát, streptomycín, sulfonyl-močovina, gentamycín alebo fosfinotricín apod. Individuálny markér by mal preto dovolit selekciu transformovaných buniek oproti bunkám, ktorým zavádzaná DNA chýba.

Transformované bunky rastú vnútri rastliny obvyklým spôsobom (pozri tiež McCormick et al. (1986) Plánt Celí Reports 5, 81-84). Výsledné rastliny môžu byt normálne pestované a krížené s rastlinami, ktoré majú rovnaké transformované dedičné vlohy alebo iné dedičné vlohy. Takto vzniknuté hybridné indivídua majú zodpovedajúce fenotypové vlastnosti. Z rastlinných buniek je možné získat semená.

Mali by sa vypestovat dve alebo viac generácií, aby bola istota, že fenotypový znak zostáva stabilný a dedí sa. Tiež by mali byť zobrané semená, aby bolo isté, že príslušný fenotyp alebo iné charakterové zvláštnosti zostali zachované.

Práve tak môžu byt obvyklými metódami určené transgénne línie, ktoré sú pre nové molekuly nukleovej kyseliny homozygotne a skúma sa ich fenotypové správanie s ohíadom na zmenený obsah tokoferolu a porovná sa s homozygotnými líniami.

Expresia proteínov s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy podía vynálezu sa môže vykonávať pomocou tradičných metód molekulárnej biológie a biochémie. Odborníkovi sú tieto techniky známe a je bez problémov schopný zvoliť vhodnú metódu dôkazu, napríklad analýzu Northern-Blot na dôkaz špecifickej RNA geranylgeranyl-reduktázy respektíve na stanovenie výšky akumulácie špecifickej RNA geranylgeranyl-reduktázy, analýzu Southern-Blot na identifikáciu sekvencií DNA kódujúcich geranylgeranyl-reduktázu, alebo analýzu Western-Blot na dôkaz sekvenciami DNA kódujúceho proteínu podía vynálezu, s výhodou CHL P. Dôkaz enzymatickej aktivity geranylgeranyl-reduktázy je možné uskutočniť napríklad podía práce Enzymassay o tvorbe chlorofyl-fytylu, ktorú opísali Soli a Schulz (1981) v Biochem. Biophys. Res. Commun. 99, 907-912.

Vynález sa zakladá na úspešnej izolácii geranylgeranylreduktázu kódujúceho klonu cDNA z knižnice cDNA z Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1. Sekvencia tohto klonu cDNA, ktorá obsahuje úplný otvorený čítací rámec, je znázornená v SEQ:ID č.l. Pri použití tejto sekvencie podía SEQ:ID č.l sa podarila produkcia transgénnych rastlín, ktoré oproti divoko rastúcim rastlinám vykazujú zmenený obsah tokoferolu.

Tento kloň cDNA obsahujúci sekvenciu DNA podía SEQ:ID

č.l bol transformovaný v Escherichia coli a príslušný kmeň E.

coli deponovaný 16. 10. 1997 pri Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen und ZeUkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg lb,

D-38124 Braunschweig, pod číslom uloženia DMS 11816 podlá budapeštianskej zmluvy.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Klonovanie cDNA tabaku, ktorá kóduje geranylgeranyl-reduktázu (CHL P)

Na identifikáciu tabakovej cDNA kódujúcej geranylgeranyl-reduktázu bol podlá predpisu vykonaný screening Lambda ZAP II cDNA knižnice (Nicotiana tabacum SRI, stratagene, USA) pri použití EST z Arabidopsis thaliana, kódujúcej locus 4D9T7P. Použitá sekvencia EST vykazuje podobnosť so známou beh P/chl P-sekvenciou z Rhodobacter capsulatus (Young et al. (1989)

Mol. Gen. Genet. 218, 1-12? Bollivar et al. (1994) J. Mol. Biol. 237, 622-640; Bollivar et al. (1994) Biochemistry 33, 12763-12768) a Synechocystis PCC6803 (Addlesee et al. (1996) FEBS Lett. 389, 126-130).

Použitá hybridizačná sonda zahŕňa oblasť EST sekvencie zobrazenej v 4D9T7P (Accession No. T04791) od bázy 1 po bázu 364. Sonda bola izolovaná ako Notl/Sall reštrikčný fragment z PRL2-Library A. thaliana (Vektor: ZipLox) (Newman et al. (1994) Plánt Physiol. 106:1241-1255) a rádioaktívne značená [a-³²P]dCTP pomoci nicktranslácie (Life Technologies, Eggenstein).

Hybridizácia bola vykonaná podlá nasledujúceho protokolu.

2h predhybridizácia pri 55C hybridizačným roztokom s nasledujúcim zložením: 5 x SSC, 0,1% SDS, 5 x Denhardovo činidlo, 100 g/ml denaturovanej DNA lososej spermy;

12h vlastná hybridizácia pri 55’C čerstvým hybridizačným roztokom s hore opísaným zložením a rádioaktívne značenou sondou;

vymytie: 2 x 10 min. pri 55^eC 2 x SSC a 0,1% SDS a 1x5 min. pri 55*C 1 x SSC a 0,1% SDS

Plazmidová DNA získaná screeningom banky cDNA bola sekvenovaná. Identifikovaná chl Ρ-cDNA sekvencia, zobrazená v SEQ:

ID č.l, obsahuje 1510 nukleotidov (bez polyA-konca), z ktorých nukleotidy 1 až 1392 kódujú proteín s veľkosťou 52 kDa a 464 aminokyselinami (počítané vrátane štart-metionínu a bez stopkodónu (nukleotidy 1393-1395)). Odvodenú sekvenciu aminokyselín CHL P ukazuje SEQ:ID č.2. Sekvencia nukleotidov zobrazená na SEQiID č. 1 zahŕňa 3' netranslatovanú oblasť nukleotidov 1396 až 1510.

Na izoláciu DNA-RNA, sekvenčnú analýzu, reštrikciu, klonovanie, gélovú elektroforézu, rádioaktívne značenie, Southern, Northern a Western Blot analýzy, hybridizáciu a podobne boli použité zodpovedajúce metódy, ktoré sú opísané v súvisiacich laboratórnych príručkách, ako je Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: Spring Harbor, New York.

Príklad 2

Transformácia tabakových rastlín a regenerácia intaktných rastlín

Pri výrobe transgénnych rastlín, ktoré preexprimujú CHL P, a preto vykazujú zvýšený obsah tokoferolu oproti netransformovaným rastlinám, bola podľa SEQ:ID č.l z vektoru vystrihnutá sekvencia DNA pomocou reštrikčného enzýmu BamHI a Sali na viacnásobnom klonovacom úseku pBluescript vektoru. V orientácii sense v binárnom vektore BinAR-TX (Hôfgen and Willmitzer (1990) Plánt Science 66, 221-230), pSJB-derivát (Becker (1990) Nucleic Acid Res. 18, 203), ktorý bol substrátom pre rovnakú reštrikčnú endonukleázu, bola pripojená za CaMV 35S promotorom. Za účelom objasnenia je pripojená reštrikčná karta vektoru BinAR-TX ako obrázok 3.

Miesto menovaného binárneho vektoru BinAR-TX môže byt na prípravu chimérického génu použitý hocijaký vektor vhodný na transformáciu rastlín. Tento gén vzniká fúziou promotoru CaMV 35S alebo iného promotoru, ktorý je zodpovedný za transkripciu a transláciu v rastlinných bunkách.

Rekombinantný vektor pCHLPbin bol potom prenesený do Agrobacteriun tunefaciens (Stamm GV2260; Horsch et al. (1985) Science 227, 1229-1231) a použitý na transformáciu tabakových rastlín (SNN) transformačnou technikou listových terčíkov (Horsch et al., supra).

Kultúra príslušného klonu Agrobacteriun tunefaciens bola po nočnej kultivácii odcentrifugovaná počas 10 minút pri 5000 rpm a baktérie boli resuspendované v médie 2YT. Mladé tabakové listy zo sterilnej kultúry (Nicotiana tabacun cv. Sansun NN) boli rozkrájané na malé, asi 1 cm² velké kúsky a na krátky čas naložené do bakteriálnej suspenzie. Potom boli kúsky listov naložené do média MS (Murashige a Skoog (1962) Physiol. Plánt. 15, 473; 0,7 % agar) a dva dni inkubované v temne. Nakoniec boli kúsky listov naložené do média MS (0,7% agar) s 1,6% glukózy, 1 mg/l 6-benzylaminopurínu, 0,2 mg/l kyseliny naftyloctovej, 500 mg/l claforanú (Cefotaxim, Hoechst, Frankfurt) a 50 mg/l kanamycínu, aby došlo k indukcii výhonkov. Médium bolo menené každých sedem až osem dní. Keď sa vyvinuli výhonky, kúsky listov boli prenesené do sklenených nádob obsahujúcich rovnaké médium. Vzniknuté výhonky boli odrezané a vložené do MS média s 2% sacharózy a 250 mg/l claforanu a regenerované do vzniku celých rastlín.

Príklad 3

Analýza transgénnych tabakových rastlín, ktoré obsahujú rekombinantný vektor pCHLPbin

Transgénne tabakové rastliny boli transformované, selektované a regenerované tak, ako to bolo opísané hore. Po zakorenení v sterilnej kultúre bolo asi 100 nezávislých transformantov prenesených do skleníka do pôdy. Tabakové rastliny boli umiestnené v skleníku pri 60% vlhkosti vzduchu a 20-25*C na 16 hodín na svetle a 18-20*C na 8 hodín v temne.

Transformanty s normálnym alebo zvýšeným obsahom tokoferolu eventuálne chlorofylu nevykazovali v porovnaní s kontrolnými rastlinami odlišný vzhlad, pokial sa týka ich fenotypu a ani odlišné prírastky.

Niektoré primárne transformanty vykazovali oproti divoko rastúcim rastlinám 4 až 5-krát zvýšený obsah tokoferolu. Tento vzrast obsahu tokoferolu mohol byt dodatočne zvýšený v potomstve generácie Tl a T2 a v homozygotných dcérskych rastlinách, ktoré boli získané obvyklým samoopelovaním a konečným určením vzoru štiepenia semien v médie obsahujúcom kanamycín.

Ďalej je možné pozorovať, že obsah tokoferolu v transgénnych rastlinách môže byť oproti kontrolným rastlinám ďalej zvýšený za stresových podmienok, ako napríklad pestovaním pri nízkych alebo vysokých teplotách eventuálne pri prudkom osvetlení, a v senescentných listoch.

Určenie obsahu tokoferolu prebiehalo podlá nasledujúceho protokolu: Kúsky listov boli homogenizované v tekutom dusíku a trikrát extrahované do metanolu. Extrakty sa zberali a na kolóne LiCrospher 100 HPLC RP-18 (Merck, Darmstadt, Nemecko) eluovali prietokom 1 ml/min nasledujúcich gradientov: 94% mo30 bilná fáza B (100% metanol) / 6% mobilná fáza A (30% metanolu, 10% O,1M octanu amónneho, pH 5,1) počas 7 min, ďalších 7 min 99% mobilná fáza B / 1% mobilná fáza A, potom ďalších 26 min 94% mobilná fáza B / 6% mobilná fáza A.

Alternatívne sa analýza zobraných extraktov pomocou HPLC vykonávala v izokratickom gradiente (gradient sa skladá z 2% z roztoku A [10% metanol a 10% kyselina octová] a z 98% z metanolu (roztok B); rýchlosť prietoku 1 ml/min). Pracovalo sa so zariadením Waters LC-Modul s fluorescenčným detektorom Schimadzu RF 551 (295 nm^ex, 325 nm^em).

Výsledok analýzy obsahu tokoferolu formou stĺpcového diagramu predstavuje obrázok 4. Porovnanie listov 6, 9, 12 (počítané od špičky rastlín) transformantov 28 a 30 so zodpovedajúcimi listmi kontrolných rastlín (SNN) dokazuje až 6-krát zvýšený obsah tokoferolu v transgénnych líniách.

Transgénne tabakové rastliny boli tiež nezávisle na svojej schopnosti rásť v médie obsahujúcom kanamycin analyzované v Southern Blot. Tu sa po hybridizácii so značeným cDNA fragmentom pre CHL P objavili oproti kontrolným rastlinám ďalšie rádioaktívne značené pruhy genómovej DNA štiepenej reštrikčnými enzýmami.

Analýza Northern Blot vykázala v transformantoch oproti obsahu CHL P RNA v kontrolných rastlinách zvýšené množstvo špecifickej RNA.

Zvýšená expresia geranylgeranyl-reduktázy v transgénnych rastlinách môže byt tiež preukázaná Western Blot analýzou. Transformanty vykazujú v porovnaní s kontrolnými rastlinami zvýšené množstvo proteínu CHL P.

Ďalej sa v experimentoch s importom plastidov (vykonané podlá Grimma et al. (1989) Plánt Mol. Biol. 13, 583-593) potvrdilo, že CHL P-predstupeň proteínu, kódovaný sekvenciou ,podlá SEQ:ID č.1, bol po in vitro transkripcii a translácii importovanýdo plastidov.

Príklad 4

Príprava konštrukcií anti-sense CHL P a prenos na tabak

Zatial čo transgénne rastliny pripravené a analyzované v príkladoch 2 a 3 vykazujú zvýšený obsah tokoferolu na základe preexprimovania sekvencií DNA podlá vynálezu, bola na prípravu transgénnych tabakových rastlín, ktoré vykazujú zníženú aktivitu CHL P, pripravená nasledujúca anti-sense konštrukcia a prenesená na tabak.

Sekvencia cDNA podlá SEQ:ID č. 1 bola pomocou reštrikčného enzýmu KpnI a Xbal vystrihnutá z vektoru na viacnásobnom klonovacom úseku vektoru pBluescript a fúzována s promotorom 35S vírusu Cauliflower Mosaic v orientácii anti-sense do binárneho vektoru BinAR-TX (pozri príklad 2), ktorý je substrátom pre rovnaké reštrikčné enzýmy. Takto vzniknutý rekombinantný vektor pCHLPASbin bol pomocou transformácie listových terčíkov sprostredkovanej Agrobacterium tumefaciens prenesený na tabak, ako je opísané v príklade 2. Nakoniec boli regenerované transgénne rastliny. Bolo regenerovaných približne 100 nezávislých transgénnych línií a inzercia kópií transgénu sa potvrdila obvyklými metódami (napr. hybridizáciou Southern Blot).

Transformanty vykazovali vzhíadom na kontrolné rastliny znížený rast, bledý fenotyp, redukovaný obsah RNA a proteínu pre CHL P, zvýšený obsah geranygeranyl-chlorofylu (až 50% celkového obsahu chlorofylu v porovnaní sa 100% fytyl-chlorofylu divoko rastúcich rastlín) a tiež znížený obsah chlorofylu a tokoferolu.

Príklad 5

Preexprimovanie geranylgeranyl-reduktázy v Escherichia coli

Na prípravu expresie klonov, ktoré preexprimujú rekombinantný CHL P v E. coli, bol amplif ikovaný otvorený čítací rámec pre pravdepodobne zrelý (procesovaný) proteín pomocou oligonukleot idového prajmeru

- CSYN 1 5'-cgc cat ggg ccg caa tct tcg tgt tgc ggt-3' a

CSYN 2 5¹ -gca gat ctg tcc att tcc ctt ctt agt gca-3 ’ zo sekvencie DNA podlá SEQ:ID č.l pomocou PCR (1 min. 94’C;

min. 60’C; 3 min. 72’C na 25 cyklov). Amplif ikovaný fragment PCR bol vyčistený a rozstrihaný reštrikčnými enzýmami Ncol a BglII a vložený do vektoru expresie pQE60 (Qiagen, Hilden), ktorý je substrátom pre rovnaké enzýmy. Za iniciačným kodónom ATG (súčasť rozpoznávacej sekvencie pre Ncol) nasledovala kódujúca sekvencia Chl P, ktorá začína nukleotidom č.148 otvoreného čítacieho rámca CHL P-cDNA-sekvencie. Výsledkom je zabudovanie glycínu po metionínu (aminokyselina č.50 z proteínu preloženého zo sekvencie cDNA).

Na expresiu rastlinného CHL P boli rekombinantným vektorom transformované kmene E. coli XL 1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA, USA) alebo SG 13009 (Gottesman et al. (1981) J. Bacteriol. 148, 265-273). Po indukcii transkripcie rekombinantného génu prostredníctvom IPTG bol v kmeňoch E. coli exprimovaný proteín s molekulovou hmotnosťou asi 47 kDa. Proteín bol preukázaný v peletovatelnej frakcii bakteriálneho extraktu a za denaturujúcich podmienok vyčistený z úhrnného extraktu cez stĺpec s Niafinitou podlá inštrukcií výrobca (Quiagen, Hilden). Vyčistený proteín bol injekčné podaný králikovi, aby došlo k tvorbe protilátok.

V kombinovanom stanovení enzýmov Enzymassay s bakteriálnou bakteriochlorofylsyntázou pri použití chlorofylidu a GGPP vykazoval proteín z úhrnného extraktu geranylgeranylreduktázovú aktivitu. Stanovenie bolo uskutočnené podía protokolu Oster et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 9671-9676.

Oddelenie chlorofylu-GG a chlorofyl-fytolu bolo vykonané pomocou HPLC na kolóne RP-18 pri použití zmesi rozpúšťadiel roztoku A (60% acetón) a roztoku B (100% acetón). Gradient rozpúšťadiel bol nastavený: t° 75% roztoku A a 25% roztoku B, min.; počas t^2-4 45% roztoku A a 55% roztoku B; počas t⁴“¹³ 30% roztoku A a 70% roztoku B; počas t^{13 17} 100% roztoku B; počas t^17-21 100% roztoku B izokraticky; konečne počas 5 min. 75% roztoku A a 25% roztoku B; potom ďalších 5 min. 75% roztoku A a 25 % roztoku B izokraticky. Na detekciu tetrahydropyrolov bol použitý fluorescenčný detektor (λ_βχ 425 nm,X_em 665 nm).

Príklad 6

Koexpresia génu CHL P a génu HPD v Nicotiana tabacum

Pomocou oligonukleotid-prajmeru

- hpdolil 5’-tta ggt acc atg ggc cac caa aac gcc gcc gtt tca g-3’ a

- hpdoli2 5’-tga gtc gac cac aat cct tta gtt ggt tct tct tct tg-3' bola ämplifikovaná, klonovaná a pridaná sekvencia HPD-cDNA Arabidopsis thaliana z knižnice cDNA (Accession No.: AF 000228) medzi nukleotidy 37 a 1404. Fragment bol štiepený reštrikčnými endonukleázami KpnI a Sali a zavedený do binárneho vektoru Bin-Hyg-TX rozštiepeného KpnI/Sall. Pri vektore Bin-Hyg-TX ide (ako pri vektore BinAR-TX použitom v príklade 2) o derivát pBIB (Becker, supra), ktorý umožňuje expresiu do viacnásobného miesta klonovania vkladanej kódujúcej oblasti za kontroly promotoru 35S RNA z vírusu Cauliflower Mosaic. Na rozdiel od vektoru BinAR-TX, vloženého na expresiu génu CHL P, ktorý umožňuje v rastlinných bunkách selekciu kanamycínu, nesie binárny vektor Bin-Hyg-TX ako markér selekcie rastlinných buniek gén rezistencie k hygromycínu. Za účelom objasnenia je pripojená reštrikčná karta vektoru Bin-Hyg-TX ako obrázok 5.

Namiesto menovaného binárneho vektoru Bin-Hyg-TX sa môže na prípravu chimerického génu, vznikajúceho fúziou promotoru CaMV 35S alebo iného promotoru, ktorý zaisťuje transkripciu a transláciu v rastlinných bunkách, a sekvenciách DNA, ktoré kódujú HPD, použiť akýkolvek vektor vhodný na transformáciu rastlín.

Ďalej došlo k prenosu pripraveného rekombinantného vektoru pBinHygHPD na tabak SNN pomocou Agrobacterium tumefeciens, ako je opísané v príklade 2, pričom boli transgénne výhonky tabaku selektované v médie obsahujúcom hygromycín. Rastliny získané po regenerácii slúžili ako kontrolné rastliny.

Dodatočne boli pomocou transformácie listových terčíkov s rekombinantným vektorom pBinHygHPD transformované transformanty 28 a 30 opísané v príklade 2 a iné zvolené trans formanty, ktoré preexprimujú gén CHL P za kontroly promotoru 35S RNA a boli regenerované celé rastliny za selekcie na kanamycín a hygromycín.

V všetkých transgénnych rastlinách bol úspešný prenos a expresie chimerického HPD génu preukázaný vhodnými experimentmi Southern a Northern Blot pri použití hore menovaného fragmentu PCR pre HPD ako sondy.

Porovnanie obsahu tokoferolu (analýza ako v príklade 3) v listoch rastlín, ktoré exprimujú iba gén CHL P (pozri príklad 3, transformanty 28 a 30), a listoch rastlín, ktoré spoločne exprimujú gén HPD a gén CHL P (transformanty 28+HPD a 30+HPD), ukázalo, že obsah tokoferolu môže byt dodatočne zvýšený súčasnou expresiou génu hydroxyfenylpyruvát-dioxygenázy.

Transgénne rastliny, ktoré exprimujú ako gén CHL P tak tiež gén HPD, môžu byt alternatívne takisto pripravené krížením homozygotných CHL P-línií s homozygotnými HPD-líniami.

Je možné očakávat, že k dodatočnému zvýšeniu obsahu toko ferolu v dvojnásobných transformantoch (event. dvojnásobných krížencoch) dôjde za stresových podmienok (napr. zvýšená teplota, svetelný stres a iné).

Okrem skôr opísaných dvojnásobných transformantov, ktoré exprimujú HPD a CHL P, bol skúmaný obsah tokoferolu a vplyv stresových podmienok na obsah tokoferolu v transgénnych HPDlíniách. Ukázalo sa, že preexprimovanie expresie HPD v tabakových listoch spôsobuje dvojnásobné až trojnásobné zvýšenie obsahu tokoferolu a že oproti netransgénnym kontrolným rastlinám stúpa hodnota najmä za stresových podmienok.

Obrázok 6 znázorňuje obsah tokoferolu v listoch 4, 7 a 10 z 12 týždňov starých transgénnych tabakových líniách (# 2, 6 a 33), ktoré preexprimujú enzým arabidopsis hydroxyfenylpyruvát-dioxygenázu (HPD), v porovnaní s kontrolnými rastlinami. Rastliny boli odčítané buď pri 38’C alebo 10’C a intenzite svetla asi 200 μπιοί fotónov/m²/s. S rastúcim starnutím listov sa obsah tokoferolu v rastlinách silne zvyšuje. Osobitne v starších listoch raste obsah tokoferolu v rastlinách pestovaných pod 38’C oveía rýchlejšie a dosahuje dvojnásobné hodnoty oproti kontrolným rastlinám. Naproti tomu je obsah tokoferolu v transformantoch v chladne oproti divoko rastúcim rastlinám len ľahko zvýšený.

Výsledky svedčia o tom, že HPD napomáha pri zvýšenej potrebe tokoferolov, teda najmä za stresových podmienok, regenerácii tohto antioxidantu v transgénnych rastlinách.

Príklad 7

Zvýšená rezistencia transgénnych rastlín proti oxidatívnemu stresu

Vplyv inhibičných a oxidatívnych substancií na transgénne rastliny pripravené podľa príkladov 2 a 3 boli skúmané v pokuse s inkubáciou listových terčíkov. 15 klíčkov bolo inkubovaných v 20 nM tlmivom roztoku fosforečnanu draselného (pH 7,1) počas 10 hodín na svetle. Popri kontrolných vzorkách (voda) boli inkubované rastliny vo vzorkách s 3,3 μΜ (nízka koncentrácia = NK) alebo 33 μΜ (vysoká koncentrácia = HK) acifluorfenu (BASF, Ludwigshafen, Nemecko), inhibítorom protoporfirinogen-oxydázy, a v ďalších vzorkách s 1,7 μΜ (nízka koncentrácia = NK) alebo 17 μΜ (vysoká koncentrácia = HK) bengálskej červene (4,5,6,7-tetrachlór-2',4',5',7'-tetrajódfluorescein, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Nemecko), výrobcom reaktívnych špécií kyslíka. Obsah tokoferolu je v skúmaných transgénnych líniách (28, 30), ako tiež v kontrolných pokusoch s tlmivým roztokom, tak tiež za oxidatívnych stresových podmienok oproti divoko rastúcim rastlinám (SNN) dvojnásobne až trojnásobne zvýšený. Výsledky sú znázornené na obrázku 7.

Tieto výsledky svedčia o tom, že skúmané rastliny vykazujú zvýšenú rezistenciu voči oxidatívnemu stresu, spôsobenú zvýšeným obsahom tokoferolu v porovnaní s divoko rastúcimi rastlinami. Je možné teda očakávať, že v skúmaných rastlinách dochádza k zvýšenej antioxidatívnej ochrane bunkových membrán proti reaktívnemu kyslíku.

Príklad 8

Obsah tokoferolu v semenách transgénnych rastlín

Hore opísanými postupmi bol tokoferol extrahovaný zo semien transgénnych rastlín, ktoré vykazovali oproti divoko rastúcim rastlinám zvýšený obsah tokoferolu, ktorý je spôsobený expresiou CHL P kontrolovanou promotorom CaMV 35S (pozri príklad 2). Výsledky kvantifikácie tokoferolu pomocou HPLC v porovnaní s kontrolnými rastlinami tabaku znázorňuje obrázok 8.

Popri α-tokoferolu bol kvántifikovaný tiež τ-tokoferol. Ten sa zvyčajne vyskytuje v tabakových rastlinách vo väčšom množstve; pomer t- a α-tokoferolu v tabakových semenách robí asi 10:1. V transgénnych rastlinách so zvýšenou expresiou geranylgeranyl-reduktázy je obsah obidvoch foriem tokoferolu, najmä α-tokoferolu, dvojnásobne až trojnásobne zvýšený.

Tieto výsledky, reprodukujúce vplyv konštitutívnej expresie CHL P kontrolovanej promotorom 35S na obsah tokoferolu v semenách, jasne ukazujú, že pri nasadení promotoru špecifického pre semená (event. promotoru v semenách indukovateíného) môže byť v semenách transgénnych rastlín dodatočne zvýšená expresia geranylgeranyl-reduktázy a tým aj obsah tokoferolu.

Pokiaí by molekulárne biologické úkony boli akokoívek nedostatočne opísané, boli uskutočnené podía štandardných metód, ako sú uvedené v knihe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Pokial sa týka transformácie rastlín, odkazujeme na všeobecne známe prehíadné články a na hore spomínané publikácie.

Prehíad obrázkov na výkresoch

Vynález bude bližšie vysvetlený prostredníctvom konkrétnych príkladov uskutočnenia znázornených na výkresoch, na ktorých predstavuj e obr. 1 sekvenciu SEQ:ID č. 1 nukleotidov chl P-cDNA geranylgeranyl-reduktázy (CHL P) z Nicotiana tabacum.

obr. 2 sekvenciu SEQ:ID č. 2 aminokyselín enzýmu CHL P z Nicotiana tabacum, odvodenú zo SEQ:ID č. 1, ukázanú na obrázku 1.

obr. 3 reštrikčnú kartu binárneho vektoru BinAR použitého na rastlinnú transformáciu. BinAR (Hôfgen a Willmitzer (1990) Plánt Science 66,221) je Binl9derivát (Bevan (1984) Nucl. Acids Res. 12, 8711), ktorý obsahuje usporiadanie (kazetu) expresie pre konštitutívnu expresiu chimérických génov v rastlinách, pričom kazeta expresie je klonovaná cez EcoRI- a HindlII-reštrikčné rozhranie. Kazeta obsahuje jeden fragment 770 Βρ.-EcoRI/HindIII, ktorý obsahuje CaMV 35S-promotor, čiastočný pUCl8-polylinker a terminačný signál génu oktopinsyntázy (OCS). Na oznámenie kódujúcich sekvencií sa osobitne hodí unikálne rozhranie pUCl8-polylinkeru, totiž KpnI, Smal, BamHi, Xbal a Sali. Ako markér rastlinnej selekcie nesie binárny vektor BinAR gén resistencie ku kanamycínu.

obr. 4 stĺpcový diagram, ukazujúci obsah tokoferolu v listoch 6,9,12 (počítané od špičky rastliny) transgénnych tabakových rastlín (línie 28 a 30) versus zodpovedajúce listy kontrolných rastlín (SNN).

obr. 5 obr. 6 obr. 7 obr. 8 reštrikčnú kartu binárneho vektoru Bin-Hyg-TX, pričom ide o pBIB-derivát (Becker, supra; Bevan, supra) ktorý obsahuje výrazovú kartu expresie pre konštitutívny výraz chimerických génov v rastlinách. Na oznámenie kódujúcej sekvencie sa osobitne hodí unikálne rozhranie pUC18-polylinkeru, totiž Hpal, Kpnl, Smal, Xbal a Sali. Ako markér rastlinnej selekcie nesie binárny vektor Bin-Hyg-TX gén rezistencie k hygromycínu.

stĺpcový diagram obsahu tokoferolu v listoch 4, 7al0avl2 týždňov starých transgénnych líniách (# 2, 6, 33), ktoré Arabidopsis-enzým HPD preexpri mujú, a v kontrolných rastlinách (SNN).

obsah tokoferolu v 12 dní starých klíčkoch, ktoré boli inkubované počas 10 hodinového osvetlenia v 20 mM káliumfosfátového tlmivého roztoku (pH 7,1, kontrola = voda), s 3,3 μΜ (NK) respektíve 17 μΜ (HK) acifluorfenu alebo s 1,7 μΜ (NK) respektíve 17 μΜ (HK) bengálskej červene (SNN = kontrolné rastliny divoko rastúce, 28 a 30 = transgénne línie) relatívne hodnoty α-tokoferolu a τ-tokoferolu v semenách transgénnych tabakových rastlín (7, 39, 67, 96) a tabakových rastlín divoko rastúceho typu (SNN). 100% α-tokoferolu zodpovedá 6 ng/mg semien; 100% τ-tokoferolu zodpovedá 62,8 ng/mg semien.

γ y om -zwo

Claims (46)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sekvencia nukleovej kyseliny, vyznačujúca sa t ý m, že kóduje rastlinný proteín s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo jeho aktívny fragment.
2. 2. Sekvencia nukleovej kyseliny podía nároku 1, vyznačujúca sa tým, že kóduje proteín z tabaku.
3. 3. Sekvencia nukleovej kyseliny podía SEQ:ID č.l
4. 4. Sekvencia nukleovej kyseliny, vyznačuj úca sa t ý m, že k sekvencií nukleovej kyseliny podía niktorého z nárokov 1 až 3 vykazuje minimálne 60 % identitu sekvencií a kóduje rastlinný proteín s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo jeho aktívny fragment.
5. 5. Sekvencia nukleovej kyseliny podía nároku 4, vyznačujúca sa tým, že identita sekvencie je viac ako 80 %.
6. 6. Sekvencia nukleovej kyseliny podía nároku 1, v y z n ačuj úcasatým, že je obsiahnutá v klone DSM 11816.
7. 7. Alely a deriváty sekvencie nukleovej kyseliny podía ktoréhokoľvek predchádzajúceho nároku, vyznačujúca sa t ý m, že kódujú proteín s aktivitou geranylgeranylreduktázy alebo jeho aktívny fragment.
8. 8. Molekula nukleovej kyseliny, vyznačuj úca sa t ý m, že zahŕňa sekvenciu nukleovej kyseliny podía niektorého z predchádzajúcich nárokov.
9. 9. Molekula nukleovej kyseliny podía nároku 8, vyznačujúca sa tým, že zahŕňa sekvenciu nukleovej kyseliny podlá niektorého z nárokov 1 až 7 v kombinácii s regulačnými prvkami, ktoré zaisťujú transkripciu a transláciu v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách.
10. 10. Molekula nukleovej kyseliny podlá nároku 8 alebo 9, vyznačujúca sa tým, že zahŕňa sekvencie nukleovej kyseliny podlá niektorého z nárokov 1 až 7 v kombinácii s promótormi, ktoré zaisťujú transkripciu a transláciu v rastlinných bunkách.
11. 11. Molekula nukleovej kyseliny podlá nároku 10, vyznačujúca sa tým, že pri promotore ide o konštitutívny, indukovatelný, tkanivovo špecifický alebo vývojovo špecifický promotor.
12. 12. Molekula nukleovej kyseliny podlá nároku 11, vyznačujúca sa tým, že pri promotore ide o promotor špecifický pre semeno.
13. 13. Molekula nukleovej kyseliny podlá niektorého z nárokov 8 až 12, vyznačujúca sa tým, že navyše zahŕňa sekvencie enhancerov, signálne peptidy kódujúce sekvencie alebo iné regulačné sekvencie.
14. 14. Molekula nukleovej kyseliny podlá niektorého z nárokov 8 až 13, vyznačujúca sa tým, že kódujúca sekvencia nukleovej kyseliny je v orientácii sense.
15. 15. Molekula nukleovej kyseliny podlá niektorého z nárokov 8 až 13, vyznačujúca sa tým, že kódujúca sekvencia nukleovej kyseliny je v orientácii anti-sense.
16. 16. Proteín s biologickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo jeho aktívny fragment, vyznačujúci sa tým, že je kódovaný sekvenciou DNA alebo molekulou nukleovej kyseliny podlá niektorého z predchádzajúcich nárokov.
17. 17. Proteín s biologickou aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo jeho fragment, vyznačujúci sa tým, že vykazuje sekvenciu aminokyselín ukázanú v SEQ:

    ID č. 2.
18. 18. Mikroorganizmus, vyznačujúci sa tým, že obsahuje sekvenciu nukleovej kyseliny alebo molekulu nukleovej kyseliny podlá niektorého z nárokov 1 až 15.
19. 19. Transgénne rastliny, vyznačujúce sa tým, že obsahujú sekvenciu nukleovej kyseliny, od nej odvodenú sekvenciu nukleovej kyseliny alebo molekulu nukleovej kyseliny, respektíve tú, ktorá kóduje proteín s aktivitou geranylgeranylreduktázy alebo jeho aktívny fragment, ako tiež časti týchto rastlín a ich transgénny rozmnožovací materiál, ako protoplasty, rastlinné bunky, vrúble, semená, hluzy, alebo sadenice atd., ako tiež transgénne potomstvo týchto rastlín.
20. 20. Rastliny podlá nároku 19, v ktorých sekvencia nukleovej kyseliny alebo molekula nukleovej kyseliny je sekvencia nukleovej kyseliny prípadne molekula nukleovej kyseliny podlá niektorého z nárokov 1 až 15.
21. 21. Rastliny podlá nárokov 19 alebo 20, vyznačujúce sa tým, že vykazujú zmenený obsah tokoferolu oproti divoko rastúcim rastlinám.
22. 22. Rastliny podlá nároku 21,vyznačujúce sa tým, že vykazujú zvýšený obsah tokoferolu oproti divoko rastúcim rastlinám.
23. 23. Rastliny podľa nárokov 19 alebo 20, vyznačujúce satým, že vykazujú zmenený obsah vitamínu oproti divoko rastúcim rastlinám.
24. 24. Rastliny podľa nároku 23, vyznačujúce sa tým, že vykazujú zvýšený obsah vitamínu oproti divoko rastúcim rastlinám.
25. 25. Rastliny podľa nárokov 19 alebo 20, vyznačujúce sa tým, že vykazujú zmenený obsah chlorofylu oproti divoko rastúcim rastlinám.
26. 26. Rastliny podľa nároku 25,vyznačujúce sa tým, že vykazujú zvýšený obsah zvýšený oproti divoko rastúcim rastlinám.
27. 27. Dvojklíčne rastliny podľa niektorého z nárokov 19 až

    26.
28. 28. Rastliny podľa nároku 27,vyznačujúce sa tým, že ide o úžitkové rastliny, potravinárske rastliny a/alebo kŕmne rastliny, najmä repku, sóju, rajčiak, zemiaky, cukrovú repu, ďatelinu.
29. 29. Jednoklxčne rastliny podľa niektorého z nárokov 19 až

    26.
30. 30. Rastliny podľa nároku 29,vyznačujúce sa tým, že ide o úžitkové rastliny, potravinárske rastliny a/alebo kŕmne rastliny, najmä obiloviny, ako pšenicu, jačmeň, kukuricu, žito, ryžu, sladké a pastvinové trávy.
31. 31. Rastliny podľa niektorého z nárokov 19 až 30, v yznačujúce satým, že ich sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín s aktivitou geranylgeranyl44 reduktázy alebo jeho aktívny fragment, existuje integrovaná v genóme rastliny, ako tiež časti týchto rastlín a ich transgénny rozmnožovací materiál, ako protoplasty, rastlinné bunky, vrúble, semená, hľuzy, alebo sadenice atdf., ako tiež transgénne potomstvo týchto rastlín.
32. 32. Transgénne rastlinné bunky, vrátane protoplastov, ktoré obsahujú sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín s aktivitou geranylgeranylreduktázy alebo jeho aktívny fragment.
33. 33. Rastlinné bunky podľa nároku 32, vrátane protoplastov, ktoré oproti netransformovaným rastlinným bunkám vykazujú zmenený najmä zvýšený obsah tokoferolu, vitamínu Kj a/alebo chlorofylu.
34. 34. Rastliny, respektíve rastlinné bunky podľa niektorého z nárokov 19 až 33, ktoré navyše obsahujú sekvenciu nukleovej kyseliny, kódujúcu hydroxyfenylpyruvát-dioxygenázu.
35. 35. Spôsob prípravy rastlín respektíve rastlinných buniek podľa niektorého z nárokov 19 až 34, zahŕňajúci nasledujúce kroky:

    a) spôsob prípravy sekvencie nukleovej kyseliny, v yznačujúci sa tým, že sa skladá z nasledujúcich zložiek, ktoré sú popri sebe usporiadané v 5'-3’-orientácii:

    - v rastlinách funkcieschopný, najmä pre semeno špecifický promotor,

    - aspoň jedna sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá proteín s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy a jeho aktívny fragment kóduje a

    - prípadne terminačný signál na ukončenie transkripcie a adíciu poly-A-konca na príslušný prepis, ako tiež eventuálne od neho odvodené sekvencie DNA;

    b) prenesenie sekvencie nukleovej kyseliny z a) na rastlinné bunky a prípadne integráciu sekvencie nukleovej kyseliny do rastlinného genómu,

    c) pokial je to žiadúce, regeneráciu úplne transformovaných rastlín a prípadne množenie týchto rastlín.
36. 36. Použitie rastliny podlá niektorého z nárokov 19 až 31 a 34 ako potravinovej alebo kŕmnej rastliny.
37. 37. Použití rastliny podlá niektorého z nárokov 19 až 31 a 34 ako miesta produkcie tokoferolu a/alebo vitamínu K^.
38. 38. Použitie sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo jeho aktívny fragment, na identifikáciu, izoláciu alebo amplifikovanie sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo jeho aktívny fragment .
39. 39. Použitie sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo jeho aktívny fragment, alebo proteínu s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy na príprave protilátok.
40. 40. Použitie sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo jeho aktívny fragment, na prípravu transgénnych rastlín respektíve rastlinných buniek.
41. 41. Použitie podía nároku 40, pričom rastliny respektíve rastlinné bunky vykazujú zmenený obsah tokoferolu.
42. 42. Použitie podía nároku 40, pričom rastliny respektíve rastlinné bunky vykazujú zmenený obsah chlorofylu.
43. 43. Použití podlá nároku 40, pričom rastliny respektíve rastlinné bunky vykazujú zmenený obsah vitamínu K·^
44. 44. Použitie podlá nároku 40, pričom rastliny respektíve rastlinné bunky vykazujú oproti divoko rastúcim rastlinám zvý šenú toleranciu voči herbicídom.
45. 45. Použitie podlá niektorého z nárokov 40 až 44, pričom rastliny respektíve rastlinné bunky navyše obsahujú sekvenciu nukleovej kyseliny, kódujúcu hydroxyfenylpyruvát-dioxygenázu.
46. 46. Použitie sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín s aktivitou geranylgeranyl-reduktázy alebo z neho aktívny fragment, alebo proteínu s aktivitou geranylgeranylreduktázy na vyhladávanie efektorov rastlinnej geranylgeranyl reduktázy.