SK281785B6 - Uhľohydrátmi modifikované cytostatiká, liečivá s ich obsahom a ich použitie - Google Patents

Abstract

Opísané uhľohydrátmi modifikované cytostatiká všeobecného vzorca (I), v ktorom k znamená nesubstituovaný alebo regioselektívny modifikovaný uhľohydrátový zvyšok, Sp znamená substituovanú arylénovú alebo alkylénovú skupinu, L znamená skupinu všeobecného vzorca (a) alebo (b), AA1 a AA2 znamenajú aminokyselinový zvyšok v D- alebo L-konfigurácii alebo priamu väzbu, C znamená cytotoxický zvyšok alebo zvyšok cytostatika alebo derivátu cytostatika a ich izoméry a soli, ktoré sú nádorovo špecifické. Vhodný spacer zaručuje sérovú stabilitu a súčasne intracelulárny účinok. Touto modifikáciou cytostatík sa zistila trieda konjugátov, ktoré sú pri spojení uhľohydrátov s cytostatikami sérovo stabilné. Ďalej sú opísané liečivá, obsahujúce uvedené zlúčeniny a ich použitie na výrobu liečiv.ŕ

Description

Vynález sa týka cytostatík, ktoré sú modifikáciou s uhľohydrátmi nádorovo špecifické. Vhodný spacer zaručuje sérovú stabilitu a súčasne intracelulámy účinok.

Doterajší stav techniky

Chemoterapia nádorových ochorení je sprevádzaná väčšinou vážnymi vedľajšími účinkami, spôsobenými toxicitou chemoterapeutík na proliferujúce bunky iných tkanív. Už veľa rokov sa zaoberajú vedci problémom zlepšenia selektivity používaných účinných látok. Často používaným krokom je syntéza prodrugu, ktoiý je viac alebo menej selektívne uvoľňovaný v cieľovom tkanive, napríklad zmenou hodnoty pH (Tietze a kol., napríklad DE-4 229 903), pôsobením enzýmov (napríklad glukoronidáz; Jacquesy a kol., EP-511 917; Bosselt a kol., EP-595 133) alebo pôsobením konjugátov protilátka - enzým (Bagshawe a kol., WO 88/07378; Senter a kol., US-PS 4 975 278; Bosselt a kol., EP-595 133). Problematická je pri týchto aplikáciách okrem iného stabilita konjugátov v iných tkanivách a orgánoch a najmä ubikvitáme rozdelenie účinnej látky, ktoré nadväzuje na extraceluláme uvoľňovanie účinnej látky v tkanive nádoru.

Významná lektínová vzorka na povrchu nádorových buniek (Gabius; Onkológie 12 (1989) 175) otvára principiálne možnosť adresovať tieto cielene na nádorové bunky pripojením korešpondujúcich uhľohydrátových stavebných prvkov na tieto cytostatiká. Táto perspektíva je obmedzená tým, že sa tiež v iných tkanivách, obzvlášť v pečeni, vyskytujú lektíny s podobnými uhľohydrátovými špecifitami (galaktóza, laktóza, manóza, N-acetyl-glukózamín, fruktóza a podobne) (Ashwell a kol., Annu. Rew. Biochem. 46 (1982), 531; Stahl a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 1521; Hill a kol., J. Biol. Chem. 262 (1986), 7433; Jansen a kol., J. Biol. Chem. 266 (1991), 3343). Vzhľadom na to sa musí počítať so značným obohatením účinnú látku obsahujúcich glykokonjugátov v pečeni a iných na lektín bohatých orgánoch, keď sa použijú takéto nemodifikované cukry.

Heterocyklický amín batracylin vzorca (1) o

<1>

má v rôznych modeloch rakoviny čreva dobrý protinádorový účinok (US-PS 4 757 072).

Peptidové konjugáty zlúčeniny vzorca (1) s dobrým účinkom in-vitro a so zlepšenou rozpustnosťou (US-4 180 343) sú pri pokusoch na zvieratách horšie tolerované ako batracylin. Konjugáty s fruktózou, opísané v EP-501 250, sa resorbujú veľmi silne v pečeni.

Chinolón-a vzorca (2) - kyselina 7[(3aRS,4RS,7aSR)-4-amino-l,3,3a,4,-7,7a-hexahydro-izoindol-2-yl]-8-chlór-l-cyklopropyl-6-fluór-l,4-dihydro-4-oxo-3-chinolín-kar-

má okrem svojej výraznej antibakteriálnej aktivity tiež veľmi dobrú účinnosť proti rôznym nádorovým bunkovým líniám (EP-520 240, JP-4 253 973). Tomu sú však na prekážku značné toxikologické problémy, napríklad genotoxicita, toxicita pre kostnú dreň, vysoká akútna toxicita in vivo a podobne).

Podstata vynálezu

Novou modifikáciou cytostatík sa zistila prekvapujúco nová trieda konjugátov, ktoré sa vyznačujú nasledujúcimi vlastnosťami: Nové spojenie uhľohydrátov s cytostatikami (napríklad batracylínom a chinolónom-a) vedie ku glykokonjugátom, ktoré sú sérovo stabilné. Účinok nezávisí od extracelulámeho uvoľňovania účinnej látky. Aktivity invitro proti rôznym nádorovým bunkovým líniám sú porovnateľné so zodpovedajúcimi cytostatikami. Bunkovo špecifický príjem je závislý od uhľohydrátu.

Regioselektívnou modifikáciou v uhľohydrátovej časti opisovaných konjugátov sa podstatne zlepší bunková a tkanivová selektivita (najmä nádor ku pečeni).

In vivo sa vyznačujú konjugáty podľa predloženého vynálezu podstatne zlepšenou znášanlivosťou v porovnaní so zodpovedajúcou účinnou látkou a zodpovedajúcimi peptidovými konjugátmi.

Okrem toho majú konjugáty podľa predloženého vynálezu v porovnaní so zodpovedajúcimi cytostatikami podstatne zlepšené vlastnosti pri rozpúšťaní.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu je možné opísať pomocou nasledujúceho všeobecného vzorca (I)

K - Sp - L - AA1 - AA2 - C (I), v ktorom

K znamená nesubstituovaný alebo regioselektívny modifikovaný uhľohydrátový zvyšok,

Sp znamená prípadne substituovanú arylénovú alebo alkylénovú skupinu

L znamená skupinu

pričom R znamená atóm chlóru alebo hydroxyalkylaminoskupinu a pričom spojenie s Sp je vykonané cez NH-skupinu,

AA1 znamená zvyšok aminokyseliny v D- alebo L-konfigurácii, ktorý prípadne nesie druhú skupinu K-Sp-L, v ktorej K, Sp a L môžu mať významy uvedené nezávisle od inej skupiny K-Sp-L- alebo znamená priamu väzbu. Aminokyselinový zvyšok môže byť spojený s L ako cez a -aminoskupinu, tak tiež prípadne cez aminofiinkciu alebo hydroxyfunkciu v bočnom reťazci a tiež cez obidve funkcie. Pokiaľ AA1 nesie ďalšie funkčné skupiny, tak sa môžu tieto vyskytovať deblokované alebo chránené známymi ochrannými skupinami. Ako ochranné skupiny sú vhodné napríklad acetylová skupina, allyloxykarbonylová skupina, benzyloxykarbonylová skupina, fluorenylmetoxykarbonylová skupina, terc.-butoxykarbonylová skupina, allylová skupina, benzylová skupina, metylová skupina alebo terc.-butylová skupina.

AA2 znamená aminokyselinový zvyšok v D- alebo L-konfigurácii, ktorý pripadne nesie druhú skupinu K-Sp-L- v ktorej K, Sp a L môžu mať významy uvedené nezávislé od inej skupiny K-Sp-L- alebo znamená priamu väzbu. Aminokyselinový zvyšok môže byť spojený s AA1 ako cez a

SK 281785 Β6

-aminoskupinu, tak tiež prípadne cez aminofunkciu alebo hydroxyfunkciu v bočnom reťazci a tiež cez obidve funkcie. Pokiaľ AA2 nesie ďalšie funkčné skupiny, tak sa môžu tieto vyskytovať deblokované alebo chránené známymi ochrannými skupinami. Ako ochranné skupiny sú vhodné napríklad acetylová skupina, allyloxykarbonylová skupina, benzyloxykarbonylová skupina, fluorenylmetoxykarbonylová skupina, terc.-butoxykarbonylová skupina, allylová skupina, benzylová skupina, metylová skupina alebo terc.-butylová skupina.

C znamená zvyšok cytostatika alebo derivátu cytostatika, ktorý môže niesť dodatočne aminoskupinu alebo hydroxyskupinu, C môže byť interkalierujúca substancia, inhibítor topoizomerázy, antimetabolit, alkylancia, tubulíninhibítor, inhibítor tyrozínfosfokinázy, inhibítor proteínkinázy-C alebo účinná látka s iným alebo neznámym cytostatickým alebo cytotoxickým účinným mechanizmom. C môže byť napríklad nukleozid, endiín-antibiotikum, kyselina chinolónkarboxylová, kyselina naftyridónkarboxylová alebo cytotoxické antibiotikum, napríklad z triedy dolastatínov, C môže byť bactracylín, chinolón-a, 5-fluóracil, cytozínarabinozid, metotrexat, etopozid, camptothecín, daunomycín, doxorubicín, taxol, vinblastín, vincristín, dynemicín, calicheamycín, esperamycín, quercetín, suramín, erbstatín, cyclophosphamid, mitomycín C, melphalan, cysplatín, bleomycín, staurosporín alebo iná antineoplastická aktívna účinná látka.

Štruktúrny prvok -Sp-L-AA1-AA2- dohromady predstavuje spacer, ktorý spája K a C.

Výhodné sú zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom

K znamená uhľohydrátový zvyšok všeobecného vzorca (II) ^Αγ^ο\/⁰ ηΑγΑ ^(Π)· R, v ktorom

A znamená metylovú skupinu, hydroxymetylovú skupinu, karboxyskupinu, ako i od nej odvodené estery a amidy, alkoxymetylovú skupinu, acyloxymetylovú skupinu alebo karboxyalkyloxymetylovú skupinu, ako i od nej odvodené estery a amidy. A môže tiež byť skupina CH₂-B, pričom B môže byť opäť cez anoméme centrum pripojený uhľohydrátový zvyšok všeobecného vzorca (II) a

R₂, R₃ a R4 znamenajú jednotlivo alebo spoločne rovnaký vodíkový atóm, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu, karboxyalkoxyskupinu, ako i od nej odvodené estery a amidy, hydroxyalkoxyskupinu, aminoalkoxyskupinu, acyloxyskupinu, karboxyalkylkarbonyloxyskupinu, sulfátovú skupinu, fosfátovú skupinu, atóm halogénu alebo ďalší v rovnakom rámci modifikovaný a cez anoméme centrum pripojený uhľohydrátový zvyšok všeobecného vzorca (II). R₂ môže znamenať dodatočne aminoskupinu alebo acylaminoskupinu. Dva zo zvyškov R₂, R₃, R4 môžu tiež spoločne znamenať epoxyskupinu.

Stereochémia na anomémom centre uhľohydrátového stavebného prvku môže byť a alebo β.

Stereochémiou na iných centrách sa môže získať glukokonfigurácia, manokonfigurácia, galaktokonfigurácia, gulokonfigurácia, rhamnokonfigurácia alebo fruktokonfigurácia.

Sp znamená arylénový zvyšok, ktorý je modifikovaný v orto-, metá- alebo para-polohe s K a L a okrem toho môže niesť ešte 1 až 4 ďalšie substituenty, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne a znamená vodíkový atóm, metylovú skupinu, metoxyskupinu, hydroxyskupinu, karboxyskupinu, metyloxykarbonylovú skupinu, kyanoskupinu, nitroskupinu, atóm halogénu, sulfonylovú skupinu alebo sulfónamidovú skupinu. Môže tiež znamenať lineárny alebo rozvetvený alkylénový zvyšok. L znamená skupinu s

alebo

pričom

R znamená atóm chlóru alebo hydroxyalkylaminoskupinu a AA1 znamená zvyšok aminokyseliny v D- alebo L-konfigurácii, ktorý prípadne nesie druhú skupinu K-Sp-L, v ktorej K, Sp a L môžu mať významy uvedené nezávislé od inej skupiny K-Sp-L- alebo znamená priamu väzbu. Aminokyselinový zvyšok môže byť spojený s L ako cez a-aminoskupinu, tak tiež prípadne cez aminofunkciu alebo hydroxyfunkciu v bočnom reťazci a tiež cez obidve funkcie. Pokiaľ AA1 nesie ďalšie funkčné skupiny, tak sa môžu tieto vyskytovať deblokované alebo chránené známymi ochrannými skupinami. Ako ochranné skupiny sú vhodné napríklad acetylová skupina, allyloxykarbonylová skupina, benzyloxykarbonylová skupina, fluorenylmetoxykarbonylová skupina, terc.-butoxykarbonylová skupina, allylová skupina, benzylová skupina, metylová skupina alebo terc.-butylová skupina.

AA2 znamená aminokyselinový zvyšok v D- alebo L-konfigurácii, ktorý prípadne nesie druhú skupinu K-Sp-L- v ktorej K, Sp a L môžu mať významy uvedené nezávislé od inej skupiny K-Sp-L- alebo znamená priamu väzbu. Aminokyselinový zvyšok môže byť spojený s AA1 ako cez a-aminoskupinu, tak tiež prípadne cez aminofunkciu alebo hydroxyfunkciu v bočnom reťazci a tiež cez obidve funkcie. Pokiaľ AA2 nesie ďalšie funkčné skupiny, tak sa môžu tieto vyskytovať deblokované alebo chránené známymi ochrannými skupinami. Ako ochranné skupiny sú vhodné napríklad acetylová skupina, allyloxykarbonylová skupina, benzyloxykarbonylová skupina, fluorenylmetoxykarbonylová skupina, terc.-butoxykarbonylová skupina, allylová skupina, benzylová skupina, metylová skupina alebo terc.-butylová skupina.

C znamená zvyšok nukleozidu, endiín-antibiotika alebo cytotoxické antibiotikum, napríklad zo skupiny dolastínov, alebo môže byť, ako je definované ďalej, kyselina chinolónkarboxylová alebo kyselina naftyridónkarboxylová. C môže byť napríklad bactracylín, 5-fluóracil, cytozínarabinozid, metotrexat, etopozid, camptothecín, daunomycín, doxorubicín, taxol, vinblastín, vincristín, dynemicín, calicheamycín, esperamycín, quercetín, suramín, erbstatín, cyclophosphamid, mitomycín C, melphalan, cysplatín, bleomycín, staurosporín alebo iná antineoplastická aktívna účinná látka. Cytostatikum je s AA2 spojené cez aminofunkcie alebo hydroxyfunkcie.

Celkom obzvlášť výhodné sú zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom

K znamená uhľohydrátový zvyšok všeobecného vzorca (II)

«3 v ktorom

A znamená metylovú skupinu, hydroxymetylovú skupinu, karboxyskupinu, ako i skupinu CH₂-B, pričom B môže byť opäť cez anoméme centrum pripojený uhľohydrátový zvyšok všeobecného vzorca (II) a

SK 281785 Β6

R₂, R₃ a R4 znamenajú jednotlivo alebo spoločne rovnaký vodíkový atóm, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu s 1 až 3 uhlíkovými atómami, karboxyalkoxyskupinu s 1 až 3 uhlíkovými atómami v alkoxyle, ako i od nej odvodené alkylestery s 1 až 3 uhlíkovými atómami v alkyle a amidy, hydroxyalkoxyskupinu, aminoalkoxyskupinu, acyloxyskupinu, karboxyalkylkarbonyloxyskupinu s 1 až 3 uhlíkovými atómami v alkyle, sulfátovú skupinu alebo ďalší v rovnakom rámci modifikovaný a cez anoméme centrum pripojený uhľohydrátový zvyšok v pozícii R₃ alebo R4. Dva zo zvyškov R₂, R₃, R4 môžu tiež spoločne znamenať epoxyskupinu.

Stereochémia na anomémom centre uhľohydrátového stavebného prvku môže byť a alebo β.

Stereochémiou na iných centrách sa môže získať L-glukokonfigurácia, D-manokonfigurácia, D-galaktokonfigurácia, L-gulokonfigurácia, D-glukokonfigurácia, L-rhamnokonfigurácia alebo L-fruktokonfigurácia.

Sp znamená arylénový zvyšok, ktorý je modifikovaný v para-polohe s K a L a okrem toho môže niesť ešte ďalší substituent, ktorým môže byť metoxyskupina, nitroskupina alebo atóm chlóru.

L znamená skupinu s

alebo

R

pričom

R znamená atóm chlóru alebo hydroxyalkylaminoskupinu a AAl znamená zvyšok aminokyseliny, ako je lyzln, alanín, kyselina asparágová, kyselina glutamová, glycín, omitín, tyrozín, valín alebo serín, v D- alebo L-konfigurácii alebo znamená priamu väzbu. Aminokyselinový zvyšok môže byť spojený s L ako cez α-aminoskupinu, tak tiež prípadne cez aminofimkciu v bočnom reťazci a tiež cez obidve funkcie, a teda nesie prípadne ďalšiu skupinu Κ-Sp-L-, ktorá je s prvou rovnaká alebo rôzna. Pokiaľ AAl nesie ďalšie funkčné skupiny, tak sú tieto výhodne deblokované.

AA2 znamená aminokyselinový zvyšok, ako je lyzín, alanín, glycín, serín, omitín alebo kyselina diaminopropiónová, v D- alebo L-konfigurácii alebo znamená priamu väzbu. Aminokyselinový zvyšok môže byť spojený s AAl ako cez α-aminoskupinu, tak tiež prípadne cez aminofunkciu v bočnom reťazci a tiež cez obidve funkcie, a teda nesie prípadne ďalšiu skupinu Κ-Sp-L-, ktorá je s prvou rovnaká alebo rôzna. Pokiaľ nesie AAl ďalšie funkčné skupiny, tak sú tieto výhodne deblokované.

C môže znamenať bactracylín, metotrexat, chinolón-a, etopozid, camptothecín, daunomycín alebo doxorubicín alebo ďalej definovanú chinolónkarboxylovú alebo naftyridónkarboxylovú kyselinu. Cytostatikum je sAA2 spojené cez aminofunkciu alebo hydroxyfiinkciu.

Ako edukty použité stavebné prvky C, kyselina chinolónkarboxylová a kyselina naftyridónkarboxylová, sa dajú znázorniť všeobecnou štruktúrou vzorca (III)

T-Q (III), v ktorom

Q znamená zvyšok vzorca

pričom

R^a znamená prípadne halogénom alebo hydroxyskupinou, raz alebo dvakrát substituovanú alkylovú skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómami, vinylovú skupinu, prípadne 1 alebo 2 atómami fluóru substituovanú cykloalkylovú skupinu s 3 až 6 uhlíkovými atómami, bicyklo [1.1.1 ]pent-l-ylovú skupinu, 1,1-dimetylpropargylovú skupinu, 3-oxetanylovú skupinu, metoxyskupinu, aminoskupinu, metylaminoskupinu, dimetylaminoskupinu, pripadne halogénom, aminoskupinou alebo hydroxyskupinou, raz alebo dvakrát substituovanú fenylovú skupinu alebo môže tiež spoločne s R^e tvoriť tiež tam opísaný mostík,

R^b znamená hydroxyskupinu, alkoxyskupinu s I až 3 uhlíkovými atómami alebo nitrometylovú skupinu,

R^c znamená vodíkový atóm alebo metylovú skupinu alebo tiež môže s R⁸ tvoriť tam opísaný mostík,

R^d znamená vodíkový atóm, metylovú skupinu, fluórmetylovú skupinu alebo metylénovú skupinu,

X¹ znamená vodíkový atóm, atóm halogénu alebo nitroskupinu,

X² znamená vodíkový atóm, atóm halogénu, aminoskupinu, hydroxyskupinu, metoxyskupinu, merkaptoskupinu, metylovú skupinu, halogénmetylovú skupinu alebo vinylovú skupinu,

Y znamená dusíkový atóm alebo skupinu C-R^e, pričom

R^e znamená vodíkový atóm, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu, metoxyskupinu, difluórmetoxyskupinu, metylovú skupinu, kyanoskupinu, etylénovú skupinu alebo acetylénovú skupinu alebo tiež spoločne s R“ môžu tvoriť mostík štruktúry -’0-CH₂-CH-CH₃, -*S-CH₂CH₂-, -*S-CH₂-CH-CHj, -*CH₂-CH₂-CH-CH₃ alebo -*O-CH₂-N-R^f, pričom * označený atóm je spojený s uhlíkovým atómom Y a pričom

R^f znamená vodíkový atóm, metylovú skupinu alebo formylovú skupinu a

D znamená dusíkový atóm alebo skupinu C-R⁸, pričom

R⁸ znamená vodíkový atóm, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu, metoxyskupinu, difluórmetoxyskupinu alebo metylovú skupinu alebo tiež spoločne s R^c môžu tvoriť mostík štruktúry -*O-CH₂-, -*NH-CH₂-, -*N(CH₃)-CH₂-, N(C₃H₅)-CH₂- alebo -S-CH₂-, pričom označený atóm je spojený s uhlíkovým atómom D, n znamená číslo 1, 2 alebo 3 a

T znamená zvyšok vzorca

R* pričom

R^h znamená skupiny -0-, -N-R^k-, -CH₂-O- alebo -CH₂-N-R^k, pričom

R^k znamená vodíkový atóm alebo metylovú skupinu a

R¹ znamená vodíkový atóm, alkylovú skupinu s 1 až 3 uhlíkovými atómami alebo cyklopropylovú skupinu.

Obzvlášť výhodné ako cytostatiká sú zlúčeniny všeobecného vzorca (III), v ktorom

Q znamená zvyšok vzorca

SK 281785 Β6

pričom

R^a znamená prípadne jedným atómom fluóru substituovanú alkylovú skupinu s 2 až 4 uhlíkovými atómami, prípadne jedným atómom fluóru substituovanú cyklopropylovú skupinu alebo prípadne fluórom raz alebo dvakrát substituovanú fenylovú skupinu,

R^b znamená hydroxyskupinu alebo alkoxyskupinu s 1 až 2 uhlíkovými atómami,

R^c znamená vodíkový atóm alebo metylovú skupinu alebo môže spoločne s R⁸ tvoriť tam opísaný mostík,

X¹ znamená atóm fluóru,

X² znamená vodíkový atóm alebo aminoskupinu,

Y znamená dusíkový atóm alebo skupinu C-R^c, pričom

R^e znamená vodíkový atóm, atóm fluóru alebo chlóru, trifluórmetylovú skupinu, metoxyskupinu, difluórmetoxyskupinu alebo acetylénovú skupinu alebo tiež spoločne s R^a môžu tvoriť mostík štruktúry - O-CH₂-CH-CH₃, alebo -’O-CH₂-N-R^f, pričom * označený atóm je spojený s uhlíkovým atómom Y a pričom

R^f znamená metylovú skupinu a

D znamená dusíkový atóm alebo skupinu C-R⁸, pričom

R⁸ znamená vodíkový atóm, atóm fluóru alebo chlóru, trifluórmetylovú skupinu, metoxyskupinu alebo metylovú skupinu alebo tiež spoločne s R^c môžu tvoriť mostík štruktúr -*O-CH₂-, -*NH-CH₂-, -*N(CH₃)-CH₂- alebo -S-CH_r, pričom ’ označený atóm je spojený s uhlíkovým atómom D a

T znamená zvyšok vzorca

pričom

R^h znamená skupiny -N-R^k-, pričom

R^k znamená vodíkový atóm alebo metylovú skupinu.

Rovnako obzvlášť výhodné sú glykokonjugáty s camptotecínom alebo jeho deriváty.

Obzvlášť význam majú ďalej zlúčeniny všeobecného vzorca (I), v ktorom znamená K, Sp a L vodíkový atóm a C znamená camptotecín. Tieto látky sú nové, môžu sa ako medziprodukty nechať reagovať na ďalšie deriváty zlúčenín všeobecného vzorca (I) a majú samotné už zaujímavé spektrum farmaceutického účinku, najmä ako cytostatiká.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu vyskytovať v stereoizomémych formách, napríklad ako enantioméry alebo diastereoméry alebo ako ich zmesi, napríklad ako racemát. Vynález sa týka ako čistých stereoizomérov, tak tiež ich zmesí.

Zmesi stereoizomérov sa môžu, ak je to potrebné, deliť pomocou známych spôsobov na stereoizoméme jednotné súčasti, napríklad chromatografiou alebo kryštalizačnými postupmi.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu sa môžu vyskytovať tiež vo forme svojich zmesí. Všeobecne je tu možné uviesť soli s organickými alebo anorganickými bázami alebo kyselinami, ako i inertné soli.

Ku kyselinám, ktoré sa môžu adovať, patria výhodne halogenovodíkové kyseliny, ako je napríklad kyselina chlorovodíková a kyselina bromovodíková, obzvlášť kyselina chlorovodíková, ďalej kyselina fosforečná, kyselina dusičná, kyselina sírová, monofiinkčné a bifunkčné karboxylové kyseliny a hydroxykarboxylové kyseliny, ako je napríklad kyselina octová, kyselina maleinová, kyselina malonová, kyselina šťaveľová, kyselina glukónová, kyselina jantárová, kyselina fumarová, kyselina vínna, kyselina citrónová, kyselina salicylová, kyselina sorbová a kyselina mliečna, ako i kyseliny sulfónové, ako je napríklad kyselina p-toluénsulfónová, kyselina 1,5-naftaléndisulfónová alebo kyselina camfersulfónová.

Fyziologicky neškodné soli môžu byť rovnako tak kovové ako amóniové soli zlúčenín podľa predloženého vynálezu, ktoré majú voľné karboxylové skupiny. Obzvlášť výhodné sú napríklad sodné, draselné, horečnaté alebo vápenaté soli ako i soli amóniové, ktoré sú odvodené od amoniaku alebo organických amínov, ako je napríklad etylamín, dietylamín, trietylamín, dietanolamín, trietanolamín, dicyklohexylamín, dimetylaminoetanol, arginín, lyzín, etyléndiamín alebo fenetylamín.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázku je znázornená proliferácia základných buniek kostnej drene.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Séria A: Biologické testy

Príklad A.1

Test inhibície rastu na stanovenie cytotoxických vlastností glykokonjugátov batracylínu a chinolónu-a

Bunkové línie ľudského hrubého čreva SW 480 a HT 29 (ATCC-Nr. CCL 228 a HBT-38), ako i Bunková línia myšieho melanómu B 16 F 10 sa dajú do misiek roux do RPMI 1640 média za prídavku 10 % FCS. Potom sa trypsinujú a v RPMI plus 10 % FCS sa nastaví počet buniek na 50 000 buniek/ml. 100 μΐ suspenzie buniek sa dá do mikrotitračnej doštičky s 96 miskami a inkubuje sa počas jedného dňa pri teplote 37 °C v atmosfére oxidu uhličitého v rozmnožovacej komore. Potom sa pridá ďalších 100 μΐ RPMI média a 1 μΐ DMSO so skúšanou látkou. Rast sa kontroluje po treťom a šiestom dni. Kvôli tomu sa ku každej mikromiske pridá 40 μΐ roztoku MTT [3-(4,5-dimetyl-tiazol-2-yl)2,5-difenyltetrazolínbromid] s východiskovou koncentráciou 5 mg/ml H₂O. Inkubuje sa počas 5 hodín v atmosfére oxidu uhličitého v pomnožovacej komore. Potom sa médium odsaje a pridá sa 100 μΐ izopropylalkoholu na jednu misku. Po tridsaťminútovom trepaní so 100 μΐ vody sa meria extinkcia pri 540 nm s použitím Titertek Multiskan MCC/340 (Flow).

Cytotoxický účinok opísaných glykokonjugátov batracylínu je uvedený v tabuľke la ako hodnota IC_J() pre Bunkové línie SW 480 a HT 29.

V tabuľke lb sú zhrnuté hodnoty IC₅₀ pre glykokonjugáty chinolónu-a na Bunkových líniách SW 480, HT 29 a B 16 F 10.

Tabuľka la

Tabuľka la (pokračovanie)

látka	IC 50 (μΜ] SW 480	IC 50 [μΜ] HT29
Bacracylín	25	20
32	100	75
3.4	100	65
3.7	55	n.g.
3.9	40	55
3.10	100	125
3.11	85	n.g.
3.14	40	n.g.
3.18	15	n.g.
3.19	75	n.g.
3.20	100	n.g.
3.21	90	n.g.
3.23	50	n.g.
3.24	95	n.g.
3.26	50	n.g.
3.27	110	n.g.
3.28	60	n.g.
3.29	110	n.g.
3.30	>250	n.g.
3.33	90	70
4.1	25	30
4.3	20	20

Tabuľka la (pokračovanie)

látka	IC 50 [μΜ] SW 480	™ 1 | IC 50 [μΜ] HT 29
6.2	40	50
6.3	70	105
6.7	60	>250
6.10	50	50
6.12	35	50
6.15	>250	>250
6.20	80	n.g.
6.21	150	n.g.
6.23	107	45
l·'23	50	40
628	40	25
6.29	95	130
6.30	60	70
6.32	60	60
634	50	n.g.
16,35	20	n.g.
1636	70	70
16 40	170	60
6.43	90	80
6.46	120	100
6.59	50	50
6.60	50	40
6.80	40	25

látka	IC 50 [μΜ] SW 480	IC 50 [μΜ] HT 29
4.4	30	25
4.5	15	15
4.6	10	10
4.7	15	15
4.8	50	40
4.9	20	30
4.10	30	30
4.11	15	15
4.12	15	9
5.1	55	45
5.2	20	55
5.6	>250	n.g.
5.8	100	>250
5.9	70	70
5.12	20	20
5.13	20	40
5.14	20	30
5.15	>250	70
5.19	35	25
1 5.20	50	30
1321	60	80
15,22	30	40
| 5.23	25	35

Tabuľka la (pokračovanie)

I látka	IC 50 [μΜ] SW 480	IC 50 [μΜ] HT 29
6.81	30	30
I 6.82	125	n.g
I 6.83	90	n.g
6.85	22	n.g.
7.1	40	40
7.2	40	30
7.3	50	n.g.
7.5	80	n.g,
7.7	100	>250
7.8	40	30
7.11	30	25
7.12	10	10
8.10	70	n.g.
8.11	45	n.g.
8.12	30	n.g

SK 281785 Β6

Tabuľkalb

látka .	IC 50 [μΜ] SW 480	IC 50 [uM] HT 29	IC 50 [μΜ] B 16 F 10
10.1	50	>250	15
10.2	4	3	S
10.3	5	4	0.7
11.2	30	M-	9
11.6	8	9	$
11.7	12	13	15
11.8	12	16	15
Π.9	12	12	9
11.10	8	20	2
11.16	10	10	1.5
11.17	7S	7$	8
11.13	v	3.5	0.5
12.1	1	1.5	o.l
12.2	4	n.d.	0.8
12.3	2	n.d.	03
115	1	4	0.2
12.6	4	7	0.3
12.7	60	>250	20
12.8	8	7	l
12.9	4	8	2
12.10	15	15	4
12.11	2	2	0,5

Tabuľka lb (pokračovanie)

•Utká	IC 50 [μΜ] SW 480	IC 50 [μΜ] HT 29	IC 50 [μΜ] B 16 F 10
12.12	8	n	0.5
12.13	35	100	1
12.14	1	2	0.3
12.15	0.3	1	0.1
14.1	0.8	1	1.5
14.2	1	6	1.5
143	8	4	4
14.4	1.5	1	0,4
15.1	20	20	2
15.2	$0	70	15
16.1	50	100	200
162	50	60	80
17.1	10	5	5
17.2	4	4	4
18.)	0,03	0,01	0.2
18.2	0,02	0,02	0,2
18.4	0.02	0,02	0,3
18.5	0.2	0,2	1
18.9	0,08	0,06	0.7
18.14	0,015	0.01	0.08

Závislosť biologického účinku od uhľohydrátu je dodatočne doložená neúčinnosťou porovnávacích zlúčenín bez uhľohydrátov podľa príkladov 5, 6 a 11, totiž N-[N^a]fa,N’^ps'^on-bis-(4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl)-lyzylj-batracylínu, N-fN“¹®¹, N^{cps on}-bis-(4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-batracylínu a N-jN“¹⁶, N^epsll°ⁿ-bis-(4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl)-D-lyzyl-chinolónu-a (hodnoty IC₅₀ > 250).

Príklad A.2

Skúška in-vitro štiepiteľnosti glykokonjugátov Kinetika štiepenia s ľudskou krvou

1,225 ml ľudskej krvi sa inkubuje s 1,25 ml PBS a 25 μΐ základného roztoku substrátu (1 mg/ml v 3 % DMSO v PBS) pri teplote 37 °C. Po jednej hodine a 24 hodinách sa odoberú vzorky 1 ml, zmiešajú sa s 1 ml etylalkoholu a nechajú sa stáť počas 20 minút pri teplote 4 °C. Po centrifugácii (5 minút pri 3500 otáčkach za minútu) sa odoberie 100 μΐ kvapaliny na HPLC-analýzu.

Kinetika štiepenia s bunkami

2,25 ml PBS sa inkubuje spoločne s 225 μΐ bunkovej suspenzie (30 mg/ml) a 25 μΐ základného roztoku substrátu (1 mg/ml v 3 % DMSO v PBS) pri teplote 37 °C. Po jednej hodine a 24 hodinách sa odoberú vzorky 1 ml, zmiešajú sa s 1 ml etylalkoholu a nechajú sa stáť počas 20 minút pri teplote 4 °C. Po centrifúgácii (5 minút pri 3 500 otáčkach za minútu) sa odoberie 100 μΐ kvapaliny na HPLC-analýzu.

Podmienky HPLC: Prístroj: zariadenie Waters

Stĺpec: Bischoff Hypersil OCS RP 18 5 pm 250 x 4 mm

A: 10 mM káliumfosťátového pufra pH 4,5 B: 80 % acetonitril/20 % voda

Tok: 1 ml/min. Vlnová dĺžka: 372 nm
Gradient: 0 min.	10% B
10 min.	60 % B
15 min.	60 % B
18 min.	10% B
20 min.	60 % B

Eluent na konjugáty chinolónu-a:

A: 100 % metylalkohol

B: 10 mM káliumfosfátový pufor pH 2,2 mM kyselina heptánsulfónová

Tabuľka 2a

Príklad	% štiepenia v ľudskej krvi	% štiepenia v SW-480	% štiepenia v hepatoma
	1 h.	24 h.	1 h.	24 h.	lh.	24 h.
3,4	n.d.	n.d.	74*	n.d.	98'	n.d.
3,9	0	sT~	28*	100’	32*	100’
4,4	0	0	0	0	0	0
5,9	0	0	0	0	0	0
6,2	n.d.	n.d.	0	0	0	0
6,12	n.d.	n.d.	0	0	0	0
7,3	0	0	0	0	0	0

produkt štiepenia je N-[D-alanyl]-batracylín

Tabuľka 2b

Príklad	% štiepenia v ľudskej krvi	% štiepenia v SW-480	% štiepenia v hepatoma
	lh.	24 h.	lh.	24 h.	1 h.	24 h.
11,2	0	0	0	0	0	0
11,6	0	11%	0	8%	0	12%
11,7	0	0	0	0	0	0
12,1	0	0	0	0	0	0
12,3	0	0	0	0	0	0
12,8	0	0	0	0	0	0

Príklad A.3

Skúška rozptýlenia v orgánoch

Na všetky experimenty sa používajú atymické lysé myši (kmeň NMRI nu/nu), ktoré boli vypestované v „Drug Development Laboratory, Oncotest GmbH“ prof. H. H. Fiebigom, Freiburg. Zvieratá sa udržiavali v macrolonových klietkach za podmienok laminar flow. Ako nádorový materiál sa použije tkanivo bunkovej línie SW 480, ktorá bola vopred spracovaná v niekoľkých pasážach v lysých myšiach.

až 8 týždňov starým lysým myšiam sa na každé zviera implantujú dva nádory subkutánne do obidvoch slabín. Až do okamihu randomizácie sa zvieratá nechajú 26 až 27 dní. Stredná veľkosť nádoru je potom 500 mg, čo zodpovedá priemeru nádoru asi 10 mm.

Farmakokinetika samotná prebieha nasledujúcim spôsobom:

Lysým myšiam sa injikuje skúšaná substancia a myši sa potom až do odberu vzoriek po 1/2 hod., prípadne po 4 hod. umiestnia do klietky. Odber vzorky samotnej začína odberom krvi. Kvôli tomu sa myši umŕtvia pomocou éteru na narkózu (čas 1/2 až 1 minúta). 0,5 hod., prípadne 4 hod. po injekcii substancie sa otvorí brušný otvor a myš sa v narkóze zbaví krvi cez vena cava caudalis v priebehu 1 až 2 minút, načo sa usmrtí zlomením väzu. Tým dochádza k pokojovému stavu centrálneho obehu a k zastaveniu perfuzie orgánov. Potom sa odpreparujú a vyberú jednotlivé orgány, čo je postup, ktorý zaberie asi 5 minút. Ihneď potom sa vzorky orgánov a potom zvyšné telo odváži a zmrazí sa v kvapalnom dusíku.

Substancia „konjugát 1“ sa aplikuje v dávke 300 mg/kg telesnej hmotnosti i.p. a substancia „konjugát 2“ sa aplikuje v dávke 100 mg/kg telesnej hmotnosti i.v. do chvostovej tepny. Na každú substanciu a časový úsek sa použije vždy 5 zvierat.

Súhrn výsledkov pre konjugát 1 je uvedený v tabuľke 3 a pre konjugát 2 v tabuľke 4.

A. Kalibračný rad:

5, 10, 50, 100 a 200 pg substancie, rozpustených v zmesi etylalkoholu a vody (1:1 v/v) sa pridá k 1 g hovädzej pečene, načo sa zmes rozotrie s 1 g morského piesku a 2,5 ml ochladenej zmesi etylalkoholu a vody (1:1 v/v) a vzorky sa odstredia počas 2 minút pri 3500 otáčkach za minútu. Po odobratí kvapaliny sa zvyšok znova rozmieša s 2,5 ml zmesi etylalkoholu a vody, odstredí sa a kvapaliny sa spoja. Potom sa odoberie 100 μΐ a analyzuje sa pomocou HPLC.

Podmienky HPLC: Prístroj: zariadenie Waters

Stĺpec: Bischoff Hypersil ODS RP18 5 pm 250 x 4 mm

A: 80 % acetonitril, 20 % voda

B: 10 mM káliumfosfátového pufra pH 4,5

Gradient: 0 min.	90 % B
10 min.	40 % B
15 min.	40 % B
18 min.	90 % B
20 min.	90 % B
Tok: 1 ml/min. Vlnová dĺžka: 372 nm
B. Spracovanie orgánov

Spracovanie orgánov sa vykonáva analogicky, ako je opísané v odseku A, pričom sa všetky orgány spracujú s 2,5 ml zmesou etylalkoholu a vody a extrahujú sa.

C. Spracovanie krvi

Odobraté množstvo krvi sa zmieša s 2 ml zmesi etylalkoholu a vody (1:1, v/v), odstredí sa počas 2 minúty pri 3 500 otáčkach za minútu a kvapalina sa oddekantuje. K zvyšku sa znova pridajú 2 ml zmesi etylalkoholu a vody (1:1, v/v), odstredia sa a kvapaliny sa spoja. 100 μΐ týchto spojených kvapalín sa analyzuje pomocou HPLC za podmienok, používaných v odseku A.

Tabuľka 3

Vyhodnotenie vzoriek orgánov
Orgán	Látka	Stredná hodnota 1 h. (pg/g orgán)	Stredná hodnota 4 h. (pg/g orgán)
krv	konjugát 1	31,2	-
	batracylín	-	-
nádor	konjugát 1	56,6	24,4
	batracylín	-	-
pečeň	konjugát 1	770	126
	batracylín	34,1	22,4
ľadviny	konjugát 1	81	78,4
	batracylín	26,1	27,5
mozog	konjugát 1	-	-
	batracylín	-	-

Tabuľka 4

Vyhodnotenie vzoriek orgánov
Orgán	Látka	Stredná hodnota 0.5 h. (pg/g orgán)	Stredná hodnota 4 h. (pg/g orgán)
krv	konjugát 2	6,5	-
	batracylín	-	-
nádor	konjugát 2	2,0	-
	batracylín	2,5	3,12
pečeň	konjugát 2	0,9	1,2
	batracylín	-	-
obličky	konjugát 2	17,5	0,5
	batracylín	10,7	0,8
mozog	konjugát 2	-	-
	batracylín	-	-

Príklad A.4

Stanovenie akútnej toxicity glykokonjugátov batracylínu (jednorazová aplikácia)

Akútna toxicita derivátov batracylínu sa stanovuje na nu/nu lysých myšiach.

SK 281785 Β6

Intravenózne aplikované substancie sa vstrekujú ako vodné roztoky a intraperitoneálne aplikované substancie sa vstrekujú ako DMSO-roztoky v koncentráciách až 400 mg substancie na kg myši.

Tolerovaná jednorazová dávka sa kalkuluje na základe úbytku hmotnosti zvierat až do 21. dňa po aplikácii a podľa počtu prežitých zvierat.

Tolerovateľné jednorazové dávky substancií sú uvedené v tabuľke 5.

Tieto tolerovateľné dávky sú pre substancie 3.16, 3.33,

3.9, 6.12, 6.14, 6.2, 6.81 a 8.2 cez 200 mg na kg myši. Pri substanciách 3.33, 6.12, 6.14, 6.2 a 6.81 nemožno ešte pri dávke 400 mg/kg preukázať žiadnu akútnu toxicitu.

Oproti tomu je cukru zbavený lyzyl-D-alanyl-batracylín (2.13) už pri jednorazovej dávke 25 a 50 mg/kg myši zreteľne toxický.

Tabuľka 5

Maximálne tolerovateľná jednorazová dávka derivátov batracylínu a chinolónu-a

Príklad	Tolerovaná jednorazová dávka v mg/kg myši
	i.p.	i.v.
2.13	50	25
3.4	200	< 100 (2 zvieratá zahynuli)
3.9	200	200
3.16	>200	n.d.
3.33	n.g.	>400
6.2	>400	n.g.
6.12	n.g.	>400
6.14	>400	n.g.
6.81	n.g.	>400
8.2	>200	n.d.
Chinolón-a	n.d.	<25
12.3	n.d.	>200

Príklad A.5

Stanovenie akútnej toxicity po viacnásobnej aplikácii

Substancia sa aplikuje sčasti i.v. a sčasti i.p., buď v dňoch 1 až 4 a 7 až 10 alebo v dňoch 1, 5 a 9. Dávkovanie je 400, 200 a 100 mg/kg/deň. Vyhodnotenie sa vykonáva podľa úbytku hmotnosti až do 21. dňa a podľa počtu prežívajúcich zvierat. Pri pokusoch sa na každú substanciu a dávku použije 5 zvierat. Výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 6.

Tabuľka 6

Maximálne tolerovateľná dávka pri viacnásobnej aplikácii

	Aplikácia	Dávok za deň	MTD mg/kg/g/deň
3.9	i.v.	1-4,7-10 1-4	-50 -100
3.33	i.v.	1,5,9	>400
6.2	i.p.	1-4,7-10 1,5,9	-400 >400
6.12	i.v.	1-4,7-10 1,5,9	>400 >400
6.14	i.p.	1,5,9	>400
6.81	i.v.	1-4,7-10 1,5,9	-200 >400
Batracylín	i.p.	1,5,9	-100

Príklad A.6

Hematopoetická aktivita glykokonjugátov chinolónu-a v porovnaní so zodpovedajúcou účinnou látkou

Materiál a metódy in vitro:

Bunky kostnej drene sa spláchnu zo stehennej kosti myši. 10³ buniek sa inkubuje v McCoy 5A-médiu (0,3 % agaru) spoločne s rekombinantným murínnym GM-CSF (Genenzyme; tvorba kolónií základných buniek) a so substanciami (10^-4 až 100 pg/ml) pri teplote 37 °C a 7 % CO₂. Po 7 dňoch sa spočítajú kolónie (> 50 buniek) a zhluky (17 až 50 buniek).

in vivo:

Myši sa subkutánne ošetria 1, 3, 10 a 30 mg/kg substanciou. V rôznych časových obdobiach (3, 24, 48 a 72 hodín po injekcii) sa stehenná kosť odstráni a izolujú sa bunky kostnej drene, 2 x 10⁵ buniek sa inkubuje, ako je opísané s GM-CSF a po 7 dňoch sa spočítajú kolónie a zhluky.

Výsledky:

Ako je zrejmé z tabuľky 7, majú skúšané glykokonjugáty inhibíciu proliferácie základných buniek kostnej drene, zníženú v porovnaní s chinolónom-a o faktor 10⁵ až 10³.

Tiež in vivo sa nepozoruje v porovnaní s chinolónom-a žiadna inhibícia proliferácie základných buniek zlúčeninou 12.3 až 30 mg/kg. Už s 3 mg/kg chinolónu-a sa indukuje masívna supresia proliferácie základných buniek.

Tabuľka 7

CSF-indukovaná proliferácia základných buniek kostnej drene myší

Príklady Chindon-a	ICW 0,0002	[μ^ΛηΙ]
11.2	224
11.7	2,9
12.1	0,21
12.3	0,27
12.6	0,3
I2.S	0,3
14.1	2,9
14.2	3,6
14.4	2í

Príklad A.7

Antineoplastická aktivita chinolón-a-konjugátov

In-vitro-aktivita glykokonjugátov chinolónu-a sa stanovuje na ľudskom tumorxenografte v systéme dvojvrstvovej kultúry mäkkého agaru podľa Hamburgera a Salomona (Science 197,461 -463).

Solidné nádory sa najprv pasážujú v atymických lysých myšiach (NMRI nu/nu), operatívne sa ziskajú a mechanicky sa rozdrvia. Jednotlivé bunky sa potom ziskajú inkubáciou v enzýmovej zmesi kolagenázy 0,05 %, DNA-ázy 0,07 % a hyaluronidázy 0,1 % v RPM1 pri teplote 37 °C počas 30 minút. Bunky sa dvakrát premyjú a potom sa prevedú cez sito s 200 pm a vzdialenosťou ôk 20 pm.

Použije sa nasledujúca kultivačná metóda:

Spodná vrstva obsahuje 0,2 ml Iscoves's Modified Dulbcccos Médium s 20 % fatálneho teľacieho séra a 0,7 % agaru. Na túto vrstvu sa nanesie v 24 nádobkovej platni 40 000 až 200 000 buniek v 0,2 ml toho istého média a 0,4 % agaru. Cytostatické substancie sa pridávajú v 0,2 ml média.

Kultúry sa inkubujú pri teplote 37 °C v 7 % atmosfére oxidu uhličitého počas 6 až 15 dní. Potom sa vzrastlé kolónie spočítajú v invertmikroskope, pričom sa 24 hodín pred vyhodnotením vyfarbia žijúce kolónie pomocou tetrazólium-chloridového farbiva.

Efekt účinnej látky sa vyjadruje v percentách prežívajúcich kolónií v porovnaní s počtom kolónií neošetrených platní (T/C = počet kolónií ošetrených x ÍOO/počet kolónií neošetrených).

Substancia je aktívna, keď hodnota T/C < 30 %.

V nasledujúcej tabuľke 8 je táto hodnota ako hodnota IC₇₀ v pg/ml.

Tabuľka 8

	ICrti / MS/ml
Pr.	11.7	12.1	12.3	12.5	Chinoíon-a
CXF28O	>100	70	5	<0.3	6
HT 29	56	6	S	II	20
SW 430	1$	8	11	10	3
LXFL 529	4	0,9	2	2	3
LXFS 538	18	0.4	0,5	<0,3	<0,3
MEXF989	3	<0,3	<0,3	0.5	<0.3
OVXF 899	234	45	162	55	2
OYXF 1023	136	12	10	9	0.5

Príklad A. 8

Pokusy in - vi vo: Metóda

Myši sa v deň 0 inokulujú 5 x 10⁶ nádorových buniek B16F10. Nádormi transplantované zvieratá vyvíjajú solidné peritoneálne nádory a ošetrujú sa potom denne testovanými substanciami, prípadne sa ošetrujú vehikulom ako kontrola. V kontrolnej skupine uhynie normálne 50 % zvierat medzi 14. a 20. dňom. Testované substancie sa aplikujú v pufri alebo v systéme organických rozpúšťadiel, pozostávajúcom z 20 % metylalkoholu a 20 % dimetylsulfoxidu v 0,7 % roztoku chloridu sodného.

Dávka vehikula nemá žiadny vplyv na prežitie zvierat. Terapeutický úspech vyplýva z predĺženia času prežitia ošetrených zvierat. Znášanlivosť zlúčenín sa paralelne analyzuje na zvieratách, ktoré nenesú nádor. Zo znášanlivosti a predĺženia času prežitia sa môže odvodiť terapeutický index.

Tabuľka 9 % prežívajúcich

Kontrola	DeňO	Deň 20	Deň 25	Deň 30	Deň 35
	100	70	30	10	10
11.12 1 mg/kg	100	90	60	30	30
11.12 (100 mg/kg)	100	100	100	90	90
Chinolón-a (0,1 mg/kg)	100	100	100	60	40
Etopozid (5 mg/kg)	100	90	80	80	70

Tabuľka 9 ukazuje terapeutickú účinnosť zlúčenín z príkladu 11.12 na myšiach, ktorým bol transplantovaný nádor BI 6F10.

Príklad A.9

In - vivo inhibícia rastu nádoru s použitím modelu lysých myší

Materiál:

Na všetky in - vivo experimenty na skúmanie inhibície rastu nádorov sa používajú atymické lysé myši (kmeň NMRI nu/nu). Zvolený veľkobunkový karcinóm pľúc LXFL 529 sa vyvinie sériovým pasážovaním na lysých myšiach. Ľudský pôvod nádoru je doložený izoenzymatickými a imunohistochemickými metódami. Stavba experimentu:

Nádor sa implantuje do obidvoch slabín lysých myší nu/nu vo veku 6 až 8 týždňov. Ošetrenie sa naštartuje len čo nádory dosiahnu priemer 5 až 7 mm. Myši sa zaradia do skupiny na ošetrenie a kontrolné skupiny (5 myší pre skupinu s 8 až 10 vyhodnotiteľnými nádormi) randomizáciou. Jednotlivé nádory kontrolnej skupiny rastú všetky progresívne. Veľkosť nádorov sa meria v dvoch rozmeroch pomocou posuvného meradla. Objem nádorov, ktorý dobre koreluje s počtom buniek, sa potom použije na všetky vyhodnotenia. Objem sa počíta podľa vzorca „dĺžka x šírka x šírka/2 ([a x b²]/2; a a b sú dva pravouhlo merané priemery)·

Hodnoty relatívneho objemu nádoru (RTV) sa počítajú pre jednotlivý nádor delením veľkosti nádoru v deň X veľkosťou nádoru v deň 0 (v okamihu randomizácie). Stredné hodnoty RTV sa potom použijú na ďalšie vyhodnotenie.

Inhibícia prírastku objemu nádoru (objem nádoru testovanej skupiny/kontrolnej skupiny, T/C, v percentách) je záverečná merná hodnota.

Ošetrenie:

Všetky zlúčeniny sa podľa plánu aplikujú v deň 1, 5 a 9. Ďalej sa všetky zlúčeniny aplikujú intraperitoneálne (i. p.) s použitím vody ako rozpúšťadla.

Tabuľka 10

Terapia	Látka“J (mg/kg/deň)	Cas prežitia (dni)	Počet nádorov	relat objem nádoru (% zo dňa 0)b>	opti málne: T/Cb)
Kontrolná skupina		19 > 21 >21 >21 14	10	1552	100%
12.6	100	23 >26 26> 26 >26	8	300,7	19,4 %
12.8	50	>21 >21 >21 >21 >21	9	502,2	32,3 7.
12.14	25	23 >26 19 26 >26	8	519,5	33,5 %

a) maximálne tolerovaná dávka (MTD)

b) v deň 19

Camptotecín - zlúčeniny série príkladov 18 majú v tomto teste spravidla porovnateľný alebo lepší účinok.

Séria príkladov B

Príklady syntézy

Príklad 1.1 p-Aminofenyl-2-O-metyl-0-L-fukozid

1.1 .a) p-Nitrofenyl-3,4-0-izopropylidén-B-L-fukozid

Roztok p-nitrofenyl-P-L-fiikozidu (750 mg, 2,63 mmól) v 40 ml zmesi dimetylformamidu a dioxánu (1 : 2) sa pri teplote 0 °C zmieša so 65 mg kyseliny p-toluénsulfónovej a v tridsaťminútových intervaloch s 5 x 10 μΐ 2-metoxypro10

SK 281785 Β6 pénu. Po šestnásťhodinovom miešaní pri teplote 20 °C sa reakčná zmes zahustí a čistí sa pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 99 : 1). Po zahustení sa získa 710 mg (83 %) bielej pevnej látky.

1.1 .b) p-Nitrofenyl-2-O-metyl-3,4-O-izopropylidén-B-L-íukozid

100 mg (0,307 mmól) zlúčeniny z príkladu 1.1.a) sa predloží spoločne s 96 μΐ metyljodidu do 10 ml tetrahydrofúránu a potom sa po častiach zmieša s 11 mg hydridu sodného (80 %). Po trojhodinovom miešaní pri teplote 20 °C sa ešte raz pridá 96 μΐ metyljodidu a 11 mg hydridu sodného. Po ďalších 16 hodinách miešania pri teplote 20 °C sa pridá malé množstvo vody a 100 ml dichlórmetánu. Vsádzka sa dvakrát vytrepe vodou, organická fáza sa zahustí a produkt sa potom čistí pomocou stĺpcovej chromatografie s použitím zmesi petroléteru a etylesteru kyseliny octovej (8 : 1).

Výťažok: 78 mg (75 %).

1.1. p-Aminofenyl-2-O-metyl-P-L-fúkozid mg (0,23 mmól) p-nitrofenyl-2-O-metyl-3,4-O-izopropylidén-B-L-fukozidu sa mieša počas 16 hodín pri teplote 20 °C v 3 ml 80 % kyseliny octovej. Potom sa kyselina octová vo vákuu odstráni, vsádzka sa zmieša s 10 ml metylalkoholu a po prídavku oxidu platičitého sa hydrogenuje vo vodíkovej atmosfére za mierneho pretlaku. Získaná suspenzia sa potom prefiltruje cez celite a filtračný koláč sa premyje metylalkoholom. Po chromatografickom čistení s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu (97,5 : 2,5) sa získa 77 mg (80 %) v názve uvedeného produktu (DC : : dichlórmetán/metylalkohol 9 :1: Rf = 0,42).

Príklad 1.2 p-Anúnofenyl-3-O-metyl-P-L-fukozid

1.2. a) p-Nitrofenyl-3-O-metyl-P-L-fukozid g (21 mmól) p-nitrofenyl-B-L-fukozidu v 300 ml absolútneho metylalkoholu sa zmieša so 7,84 g (31,5 mmól) dibutylcínoxidu a reakčná zmes sa zahrieva počas 2 hodín do varu pod spätným chladičom. Potom sa zahustí, získaný zvyšok sa vysuší a potom sa vyberie do 300 ml dimetylformamidu. Po prídavku 15,7 ml metyljodidu sa vsádzka mieša počas 40 hodín pri teplote 70 °C. Rozpúšťadlo sa potom vo vákuu odstráni a získaný zvyšok sa vyberie do 300 ml dichlórmetánu. Suspenzia sa prefiltruje, zvyšný roztok sa znova zahustí a podrobí sa okamihovej chromatografii s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu 99 : : 1. Po zahustení sa získa 3 815 mg (61 %) v názve uvedenej zlúčeniny.

1.2. p-Aminofenyl-3-O-metyl-P-L-fukozid

3,81 g (12,73 mmól) p-nitrofenyl-3-O-metyl-B-L-fukozidu sa hydrogenuje analogicky, ako je opísané v príklade

1.1. Výťažok: 3 g (88 %) (DC : dichlórmetán/metylalkohol 9:1; R_f= 0,53).

Príklad 1.3 p-Aminofenyl-3-O-metyl-a-L-fukozid

Výroba sa vykonáva analogicky, ako je opísané v príklade 1.2, pričom sa vychádza z p-nitrofenyl-a-L-fukozidu. Výťažok: 63 % cez dva stupne. (DC : dichlórmetán/metylalkohol 9 :1; R_f= 0,39).

Príklad 1.4 p-Aminofenyl-4-O-metyl-p-L-fukozid

OH

1.4. a) p-Nitrofenyl-2-0-benzyl-4-0-acetyl-p-L-fukozid g (3,5 mmól) p-nitrofenyl-B-L-fukozidu v 100 ml absolútneho tetrahydrofuránu sa zmieša s 31 mg kyseliny ptoluénsulfónovej a 1134 mg (7 mmól) trietylortoacetátu. Po pätnásťminútovom miešaní pri teplote 20 °C sa rozpúšťadlo vo vákuu oddestiluje, získaný zvyšok sa vyberie do 50 ml tetrahydrofuránu a 3 ml dimetylformamidu a zmieša sa so 4165 μΐ benzylbromidu a 210 mg hydridu sodného (60 %). Po jednohodinovom miešaní pri teplote 20 °C sa pridá 10 ml 80 % kyseliny octovej, zahusti sa a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu (99: 1). Po zahustení a usušení sa získa 1 236 mg (85 %) v názve uvedenej zlúčeniny.

1.4. b) p-Nitrofenyl-2-0-benzyl-3-0-acetyl-4-0-metyl-P-L-fukozid

1000 mg (2,39 mmól) p-nitrofenyl-2-O-benzyl-4-O-acetyl-B-L-fukozidu sa rozpustí v 60 ml benzénu. Po prídavku 2 988 μΐ metyljodidu a 1 109 mg oxidu strieborného sa reakčná zmes zahrieva počas 8 hodín do varu pod spätným chladičom. Vzniknutá zmes produktov sa rozdelí na komponenty pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu (99 : 1). Okrem 653 mg (63 %) izomémeho p-nitrofenyl-2-0-benzyl-3-0-metyl-4-O-acetyl-B-L-fukozidu sa ako biela pevná látka izoluje 239 mg (23 %) p-nitrofenyl-2-0-benzyl-3-0-acetyl-4-O-metyl-B-L-fukozidu.

1.4. p-Aminofenyl-4-O-metyl-P-L-fúkozid

224 mg (0,52 mmól) p-nitrofenyl-2-0-benzyl-3-0-acetyl-4-O-metyl-B-L-fukozidu sa rozpustí v 20 ml metylalkoholu a zmieša sa s 390 μΐ 1 N roztoku metylátu sodného. Po šestnásťhodinovom miešaní pri teplote 20 °C sa zmes neutralizuje 80 % kyselinou octovou, zahustí sa a vyberie sa do dichlórmetánu. Organická fáza sa premyje 1 N roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší sa a zahustí. Získaný zvyšok sa vyberie do 20 ml metylalkoholu a hydrogenuje sa na paládiu na aktívnom uhlí analogicky, ako je opísané v príklade 1.1. Po zahustení sa produkt vyberie do vody a lyofilizuje sa. Izoluje sa takto 119 mg (88 %) bielej amorfnej pevnej látky (DC : dichlórmetán/metylalkohol 9 : : 1; R_f=0,38).

Príklad 1.5 p-Aminofenyl-3-O-n-propyl-P-L-fúkozid

1.5.a) p-Nitrofenyl-2-0-benzyl-3-0-n-propyl-4-0-acetyl-P-L-fúkozid

Analogicky, ako je opísané v príklade 1.4.b), sa vyrobia zo zlúčeniny 1.4. a) s propyljodidom izoméme produkty 3a 4-propylácie a oddelia sa chromatograficky. Získa sa takto p-nitrofenyl-2-0-benzyl-3-0-n-propyl-4-0-acetyl-P-L-fúkozid v 49 % výťažku okrem p-nitrofenyl-2-O-benzyl-3-O-acetyl-4-O-n-propyl-B-L-fúkozidu v 29 % výťažku.

1.5 .b) p-Aminofenyl-3-O-n-propyl-p-L-fukozid

Syntéza sa vykonáva analogicky, ako je opísané v príklade 1.4. z produktu z príkladu 1.5.a) frakcie 1. Výťažok: 78 % (DC: dichlórmetán/metylalkohol 9 :1; R_f= 0,42).

Príklad 1.6 p-Aminofcnyl-3-dczoxy-P-L-fukozid

1.6. a) p-Nitrofenyl-3,6-didezoxy-3-chlór-4-0-acetyl-B-L-gulozid g (3,5 mmól) p-nitrofenyl-B-L-fúkozidu v 100 ml tetrahydrofiiránu sa zmieša s 31 mg kyseliny p-toluénsulfónovej a 1134 mg (7 mmól) trietylortoacetátu. Po pätnásťminútovom miešaní pri teplote 20 °C sa rozpúšťadlo vo vákuu oddestiluje a pridá sa 100 ml nasýteného roztoku chlorovodíka v dichlórmetáne. Po reakčnom čase 10 minút sa zmes zahustí a produkt sa čistí pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu (99 :1). Získa sa takto 793 mg (65 %) v názve uvedeného produktu,. (DC: dichlórmetán/metylalkohol 9:1; R_f=0,36).

1.6. b) p-Nitrofenyl-3,6-didezoxy-3-chlór-B-L-gulozid

375 mg (1,08 mmól) p-nitrofenyl-3,6-didezoxy-3-chlór-4-O-acetyl-B-L-gulozidu sa rozpustí v 25 ml metylalkoholu a zmieša sa s 10 kvapkami 1 N roztoku metylátu sodného. Po 20 minútach sa okyslí kyselinou octovou, zahustí sa a rozdelí sa medzi 400 ml dichlórmetánu a 60 ml vody. Organická fáza sa vysuší, zahustí a vyzráža sa zo zmesi dichlórmetánu a dietyléteru. Získa sa takto 315 mg (96 %) v názve uvedeného produktu.

1.6. p-Aminofenyl-3-dezoxy-P-L-fukozid

315 mg (1,04 mmól) p-nitrofenyl-3,6-didezoxy-3-chlór-B-L-gulozidu sa rozpustí v 40 ml metylalkoholu, zmieša sa s 200 mg paládia na aktívnom uhlí a s 290 μΐ trietylamínu a hydrogenuje sa vo vodíkovej atmosfére pri nepatrnom pretlaku počas 4 dní. Suspenzia sa potom prefiltruje, premyje, zahustí a produkt sa čistí pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu (97,5 : 2,5). Získa sa takto 160 mg (65 %) dezoxyzlúčeniny (DC: dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5, R_f= 0,18).

Príklad 1.7 p-Aminofenyl-3,4-didezoxy-B-L-fukozid

400 mg (1,16 mmól) p-nitrofenyl-3,6-didezoxy-3-chlór-4-O-acetyl-B-L-gulozidu (príklad 1.6.a)) sa rozpustí v 55 ml metylalkoholu, zmieša sa s 323 μΐ trietylamínu a hydrogenuje sa vo vodíkovej atmosfére za mierneho pretlaku s použitím paládia na aktívnom uhlí (10 %). Po šestnásťhodinovom miešaní pri teplote 20 °C sa zmes prefiltruje cez celíte, premyje sa, zahustí a znova sa vyberie do 100 ml metylalkoholu. Potom sa pridá 1,5 ml 1 N roztoku metylátu sodného a mieša sa počas 16 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa zneutralizuje kyselinou octovou, zahustí sa a vzniknuté produkty sa rozdelia pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu (97,5 : 2,5). Po zahustení zodpovedajúcich frakcií a prezrážaní zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru sa získa 120 mg (46 %) v názve uvedenej zlúčeniny (DC: dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5, R_f = 0,31) okrem 77 mg (28 %) p-aminofenyl-3-dezoxy-P-L-fukozidu (DC: dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5, R_f= 0,18).

Príklad 1.8 p-Aminofenyl-3,4-epoxy-p-L-fúkozid

mg (0,23 mmól) p-nitrofenyl-3,6-didezoxy-3-chlór-4-O-acetyl-B-L-gulozidu (príklad 1.6.a) sa vyberie do 10 ml metylalkoholu a zmieša sa s 345 μΐ 1 N roztoku metylátu sodného. Po jednohodinovom spracovaní ultrazvukom sa zmes okyslí 80 % kyselinou octovou, zahustí sa a chromatografuje sa s pomocou zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu (99 : 1). Po zahustení relevantných frakcií sa získaný zvyšok vyberie do metylalkoholu a hydrogenuje sa na paládiu na aktívnom uhlí analogicky, ako je uvedené v príklade 1.1. Získa sa takto 46 mg (75 %) v názve uvedenej zlúčeniny (FAB-MS: m/e = 238 = M + 1).

Príklad 1.9 p-Aminofenyl-4-dezoxy-p-L-fukozid

Táto zlúčenina sa vyrobí analogicky, ako je opísané v predpise T. Lindhorsta a J. Thiema v Carbohydr. Res. 209 (1991), 119, keď sa vychádza z p-nitrofenyl-B-L-fúkozidu cez p-nitrofenyl-2,3-di-O-benzoyl-4,6-didezoxy-4-jodo-B-L-fúkozid (DC: dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5, Rf = = 0,3).

Príklad 1.10 p-Aminofenyl-3-0-karboxymetyl-P-L-fiikozid

COOH

SK 281785 Β6

1.10. a) p-Nitrofenyl-3-0-metoxykarbonylmetyl-3-L-fukozid g (3,5 mmól) p-nitrofenyl-p-L-fukozidu a 1,3 g (5,2 mmól) dibutylclnoxidu sa zahrieva v 50 ml metylalkoholu počas 2 hodín do varu a pod spätným chladičom. Roztok sa potom zahustí, získaný zvyšok sa vyberie do 50 ml dioxánu, zmieša sa s 2 ml metylesteru kyseliny brómoctovej a 100 ml tetrabutylamóniumjodidu a zahrieva sa počas 16 hodín do varu pod spätným chladičom. Rozpúšťadlo sa potom odparí a získaný produkt sa čistí pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu 99 : 1. Po zahustení zodpovedajúcich frakcií a prezrážaní zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru sa získa 455 mg (37 %) v názve uvedenej zlúčeniny.

1.10. p-Aminofenyl-3-O-karboxymetyl-P-L-fukozid

282 mg (0,79 mmól) p-nitrofenyl-3-metoxykarbonylmetyl-B-L-fukozidu sa rozpustí v 20 ml metylalkoholu a zmieša sa so 440 μΐ 2 N roztoku hydroxidu litneho. Po dvojhodinovom miešaní pri teplote 20 °C sa hodnota pH zmesi nastaví pomocou kyslého iónomeniča SC108 na 3m a prefiltruje sa. K filtrátu sa pridá 250 mg paládia na aktívnom uhlí, hydrogenuje sa počas 1,5 hodiny vodíkom za mierneho pretlaku a katalyzátor sa oddelí a premyje sa metylalkoholom. Po zahustení, vybraní do vody a lyofllizácii sa získa v názve uvedená zlúčenina v 86 % výťažku (212 mg) (DC: acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5 : : 1 : 0,2, R_f = 0,24).

Príklad 1.11 p-Aminofenyl-3-0-metoxykarbonymetyl-P-L-fukozid

ΎχΎΐ HO'' OH NH,

COOMe

250 mg (0,7 mmól) p-nitrofenyl-3-metoxykarbonylmetyl-B-L-fukozidu (príklad l.lO.a) sa rozpustí v 20 ml metylalkoholu a počas 1,5 hodiny sa hydrogenuje vodíkom za mierneho pretlaku na paládiu na aktívnom uhlí. Katalyzátor sa potom oddelí a premyje sa metylalkoholom. Po zahustení, vybraní do vody a lyofilizácii sa získa 195 mg (85 %) v názve uvedenej zlúčeniny (DC: dichlórmetán/metylalkohol 95 :5, R_f = 0,43; FAB-MS: m/e = 328 = M + 1).

Príklad 1.12 p-Aminofenyl-3-0-hydroxyetyl-P-L-fukozid

1.12.a) p-Nitrofenyl-3-O-hydroxyetyl-P-L-fukozid

1000 mg (2,8 mmól) p-mtrofenyl-3-metoxykarbonylmetyl-B-L-fukozidu sa rozpustí v zmesi 160 ml tetrahydrofuránu a 40 ml vody a zmieša sa s 53 mg nátriumbórhydridu. Po 10 minútach sa rozpúšťadlo odparí a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu (95 : 5). Po zahustení zodpovedajúcich frakcií, vybraní do vody a lyofilizácii sa získa 362 mg (40 %) v názve uvedenej zlúčeniny.

1.12. p-Aminofenyl-3-0-hydroxyetyl-p-L-fukozid

Po hydrogenácii 362 mg zlúčeniny z príkladu 1.12.a) sa analogicky, ako je opísané v príklade 1.1 získa 270 mg (82 %) v názve uvedenej zlúčeniny (DC: acetonitril/ voda 10 : :l,R_f=0,43).

Príklad 1.13 p-Aminofenyl-2-O-karboxymetyl-P-L-fukozid

1.13. a) p-Nitrofenyl-2-O-metoxykarbonylmetyl-p-L-fukozid

250 mg (0,88 mmól) p-nitrofenyl-B-L-fukozidu sa rozpustí v 25 ml absolútneho tetrahydrofuránu a 3 ml dimetylformamidu, pridá sa 80 mg (2,64 mmól) 80 % hydridu sodného a po desaťminútovom miešaní pri teplote 20 °C 35 μΐ benzylesteru kyseliny brómoctovej. V desaťminútových intervaloch sa vykoná trikrát vždy prídavok 35 μΙ benzylesteru kyseliny brómoctovej, načo sa reakčná zmes mieša počas 30 minút a zriedi sa metylalkoholom. Po ďalších 10 minútach sa okyslí 5 ml 80 % kyseliny octovej. Potom sa zahustí a destiluje sa s dichlórmetánom. Čistenie pomocou okamihovej chromatografie sa začína s pohyblivou fázou dichlórmetán/metylalkohol/ ľadová kyselina octová 90 : ; 10 : 1, neskôr stúpa v rovnakom systéme pomer na 80 : : 20 :2. Po zahustení zodpovedajúcich frakcií sa zvyšky digerujú s dietyléterom a zo zodpovedajúceho eluátu sa získa 157 mg (42 %) v názve uvedenej zlúčeniny (DC: acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2, Rf = 0,65). Z neskorších eluátov sa získajú izoméry 3-O-alkylovanej zlúčeniny (33 %) (DC: acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5 :1:0,2, R_f= 0,54).

1.13. p-Aminofenyl-2-O-karboxymetyl-p-L-fukozid

Zmydelnenie a hydrogenácia 150 mg p-nitrofenyl-2-Ο-metoxykarbonylmetyl-B-L-fukozidu sa vykonáva metódou opísanou v príklade 1.10 s 83 % výťažkom na 109 mg v názve uvedenej zlúčeniny (DC: acetonitril/voda/ľado-vá kyselina octová 5:1: 0,2, R_f = 0,35).

Príklad 1.14.a)

Syntéza regioizomémych produktov monosukcinylácie p-nitrofenyl-B-L-fukozidu

1100 mg (3,86 mmól) p-nitrofenyl-B-L-fukozidu sa rozpustí v 50 ml pyridínu a zmieša sa s 580 mg (5,79 mmól) anhydridu kyseliny jantárovej. Po šestnásťhodinovom miešaní pri teplote 20 °C sa reakčná zmes zahustí a dvakrát sa destiluje s dichlórmetánom. Vyzráža sa zo zmesi dichlórmetánu a dietyléteru a získa sa 1 g nedeliteľnej zmesi látok. Táto sa vyberie do zmesi metylalkoholu a vody a zmieša sa s 846 mg (2,6 mmól) uhličitanu cézneho, rozpúšťadlo sa odparí a destiluje sa dimetylformamidom, získaný zvyšok sa vyberie do dimetylformamidu a zmieša sa so 618 μΐ benzylbromidu. Po jednohodinovom spracovaní ultrazvukom sa bromid cézny odfiltruje a filtrát sa zahustí. Získaný zvyšok sa rozdelí medzi 500 ml etylesteru kyseliny octovej a 50 ml vody. Organická fáza sa potom vysuší a zahustí. Pri delení komponentov pomocou okamihovej chromatografie s použitím pohyblivej fázy dichlórmetán/metylalkohol (99 :1) sa získa:

Frakcia 1: 87 mg (4,8 %) p-nitrofenyl-3-0-(3-benzyloxykarbonylpropionyl)-3-L-fukozidu (DC: dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5, R_f = 0,45)

Frakcia 2: 27 mg (1,5 %) p-nitrofenyl-2-O-(3-benzyloxykarbonylpropionyl)-P-L-fukozidu (DC: dichlórmetán/ metylalkohol95:5, R_f=0,34)

Frakcia 3: 190 mg (10,3 %) p-nitrofenyl-4-O-(3-benzyloxykarbonylpropionyl)-P-L-fukozidu (DC: dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5, R_r = 0,28)

Príklad 1.14 p-Aminofenyl-3-0-sukcinyl-P-L-fukozid

COOH mg (0,17 mmól) frakcie 1 z príkladu 1.13.a) sa rozpustí v 5 ml tetrahydrofuránu a 1 ml vody, pridá sa 20 mg oxidu platičitého a hydrogenuje sa počas 8 hodín. Katalyzátor sa potom odfiltruje, premyje sa zmesou tetrahydrofuránu a vody a filtrát sa zahustí. Získaný zvyšok sa vyberie do vody a lyofilizuje sa. Získa sa takto 57 mg (94 %) v názve uvedenej zlúčeniny (DC: acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1:0,2, R_f= 0,65).

Príklad 1.15 p-Aminofenyl-2-0-sukcinyl-p-L-fukozid

Frakcia 2 z príkladu 1.14.a) sa hydrogenuje analogicky, ako je uvedené v príklade 1.14. Výťažok je 16 mg (87 %) (DC: acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2, R_f=0,62).

Príklad 1.16 p-Ammofenyl-4-O-sukcinyl-P-L-fukozid

Frakcia 2 z príkladu 1.14.a) sa hydrogenuje analogicky, ako je uvedené v príklade 1.14. Výťažok je 125 mg (88 %) (DC: acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2, R_f=0,63).

Príklad 1.17 p-Aminofenyl-3,4-di-0-metyl-P-L-íukozid

1.17.a) p-Nitrofenyl-2-0-benzyl-3,4-0-izopropylidén-P-L-fukozid

377 mg (1,16 mmól) zlúčeniny z príkladu l.l.a) sa rozpustí v 30 ml absolútneho tetrahydrofuránu, postupne sa zmieša so 690 μΐ benzylbromidu a 52 mg hydridu sodného a mieša sa pri teplote 20 °C. Po 4 hodinách a 6 hodinách sa pridá ešte 690 μΐ benzylbromidu a hydrid sodný. Reakčná zmes sa spracuje analogicky, ako je opísané v príklade

1.1.b) a získa sa takto 245 mg (51 %) v názve uvedenej zlúčeniny.

1.17. b) p-Nitrofenyl-2-0-benzyl-3,4-di-0-metyl-p-L-fukozid

245 mg (0,59 mmól) p-nitrofenyl-2-O-benzyl-3,4-O-izopropylidén-B-L-fukozidu sa mieša počas 16 hodín pri teplote 20 °C v 80 % kyseline octovej. Potom sa reakčná zmes zahustí a získaný zvyšok sa rozmieša so zmesou dietyléteru a pentánu. Po odsatí a vysušení sa zvyšný produkt vyberie do 20 ml absolútneho tetrahydrofuránu, pridá sa 45 mg 80 % hydridu sodného a po 15 minútach sa vstrekne 160 μΐ metylj odídu. Po dvadsaťhodinovom miešaní pri teplote 20 °C sa pridá metylalkohol a ľadová kyselina octová, zahustí sa a získaný zvyšok sa rozdelí medzi dichlórmetán a vodu. Organická fáza sa vysuší a potom sa čistí pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu (100 : 1). Po zahustení a vysušení zodpovedajúcich frakcií sa získa 188 mg (79 %) v názve uvedenej zlúčeniny.

1.17. p-Aminofcnyl-3,4-di-O-metyl-P-L-fukozid

180 mg (0,45 mmól) zlúčeniny z príkladu 1.17.b) sa v zmesi 15 ml metylalkoholu a 3 ml dichlórmetánu po prídavku 50 mg paládia na aktívnom uhlí hydrogenuje počas dvoch dní pri teplote miestnosti. Katalyzátor sa potom odfiltruje, filtrát sa zahustí a čistí sa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu (97,5 :2,5). Získa sa takto 86 mg (68 %) v názve uvedenej zlúčeniny (DC: dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5, R_f = 0,21).

Príklad 1.18 p-Aminofenyl-3-0-karbamoylmetyl-|f-L-fukozid

r° CONH,

100 mg (0,305 mmól) zlúčeniny z príkladu 1.11 sa rozpustí v 10 ml metylalkoholu a zmieša sa s 0,5 ml 17 % roztoku hydroxidu amónneho. Po 4 hodinách sa reakčná zmes zahustí, vyberie sa do vody a lyofilizuje sa. Získa sa takto 95 mg (kvantitatívny výťažok) v názve uvedenej zlúčeniny (DC: acetonitril/voda 10 : 1; Rf = 0,43).

Príklad 1.19 p-Aminofcnyl-2-O-hydroxyetyl-fi-L-fukozid

Táto zlúčenina sa vyrobí tak, že sa vychádza z 200 mg (0,56 mmól) p-nitrofenyl-2-0-metoxykarbonylmetyl-P-L-fukozidu (príklad 1.13.a)), pričom sa postupuje analogicky, ako je opísané v príkladoch 1.12.a) a 1.12. Výťažok je 76 mg (45 % cez 2 stupne) (DC: dichlórmetán/metylalkohol 9: l,R_f= 0,2).

SK 281785 Β6

Príklad 1.20 p-Aminofenyl-3,6-didezoxy-3-chlór-B-L-gulozid

Cl mg (0,165 mmól) zlúčeniny z príkladu 1.6.b) sa hydrogenuje v 5 ml metylalkoholu na paládiu na aktívnom uhlí počas jednu hodinu. Katalyzátor sa potom odfiltruje, premyje sa, filtrát sa zahustí, získaný zvyšok sa vyberie do vody a lyofilizuje sa. Získa sa takto 45 mg (89 %) v názve uvedenej zlúčeniny (DC: dichlórmetán/metylalkohol 9 : 1, R_f=0,35).

Príklad 1.21 p-Aminofenyl-a-L-rhamnozid

Táto zlúčenina sa vyrobí analogicky, ako je uvedené v príklade 1.1., keď sa vychádza z 300 mg p-nitrofenyl-arhamnozidu (Sigma). Výťažok: 96 %.

Príklad 1.22 p-Aminofenyl-3-O-karboxymetyl-a-L-rhamnozid

COOH

1.22. a) p-Nitrofenyl-3-O-metoxykarbonylmetyl-a-L-rhamnozid

481 mg (1,63 mmól) p-nitrofenyl-a-L-rhamnozidu sa vyberie do 30 ml metylalkoholu a zmieša sa so 629 mg (2,45 mmól) dibutylcínoxidu. Reakčná zmes sa zahrieva počas 2 hodín do varu pod spätným chladičom, načo sa zahustí a vyberie sa do 30 ml dioxánu. Potom sa pridá 85 mg tetrabutylamóniumjodidu a 950 μΐ metylesteru kyseliny brómoctovej a zahrieva sa počas 16 hodín do varu pod spätným chladičom. Prípadne sa ešte raz pridá 1 ml metylesteru kyseliny brómoctovej a reakčný čas sa predĺži. Potom sa zmes zahustí a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie. Zmesou dichlórmetánu a metylalkoholu (99 : 1) sa eluuje p-nitrofenyl-3-O-metoxykarbonyl-metyl-a-rhamnozid a po usušení sa získa 408 mg (70 %) tejto látky (DC: dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5, R_f = = 0,36).

1.22. p-Aminofenyl-3-O-karboxymetyl-a-L-rhamnozid

Syntéza prebieha celkom analogicky, ako je opísané v príklade 1.10, keď sa vychádza z p-nitrofenyl-3-O-metoxykarbonylmetyl-a-L-rhamnozidu. Získa sa konečný produkt v 80 % výťažku: (DC: acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2, R_f = 0,26).

Príklad 1.23 p-Aminofenyl-p-D-galaktopyranozid

OH

OH

3,0 g (10 mmól) p-nitrofenyl-fl-D-galaktopyranozidu sa rozpustí v 50 ml zmesi metylalkoholu a vody (1 : 1) a po prídavku paládia na aktívnom uhlí (10 % Pd, 200 mg) sa hydrogenuje počas 3 hodiny vo vodíkovej atmosfére za mierneho pretlaku. Suspenzia sa prefiltruje cez celíte a filtračný koláč sa premyje 100 ml horúcej zmesi metylalkoholu a vody (1 :1). Po zahustení filtrátu vo vákuu a kryštalizácii z metylalkoholu sa získa bezfarebná kryštalická látka (211 g, 78 %), DC (metylalkohol) : R_f = 0,62; [a]²⁰ = = -39,5° (c = l,0/H₂O), 1.1. = 166 °C.

Príklad 1.24 p-Aminofenyl-2-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

OH

OH CH,

1.24.a) p-Nitrofenyl-6-O-trifenylmetyl-P-D-galaktopyranozid

Roztok p-nitrofenyl-P-D-galaktopyranozidu (9,0 g, 30 mmól), chlórtrifenyl-metánu (16,7 g, 60 mmól) a N,N-dimetylaminopyridínu (609 mg, 5 mmól) v absolútnom pyridíne (100 mmól) sa zahrieva počas 4 hodiny na teplotu 60 °C. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok čistí pomocou okamihovej chromatografie (petroléter/etylacetát 2 : : 1 -> 3 : 2, vždy s 0,5 % trietylamínu). Získa sa takto bezfarebná kryštalická látka (9,23 g, 57 %); DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,55; t. t. = 82 °C.

1.24,b) p-Nitrofenyl-3,4-0-izopropylidén-6-0-trifenylmetyl-fi-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (8,7 g, 16 mmól) sa zmieša s dimetoxypropánom (400 ml) a katalytickým množstvom kyseliny (±)-camfer-10-sulfónovej (400 mg, 1,7 mmól). Po jednej hodine pri teplote miestnosti sa reakcia skončí prídavkom trietylamínu (240 ml, 1,7 mmól) a reakčná zmes sa vo vákuu zahustí. Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 1 : 1) sa získa bezfarebná penovitá látka (6,2 g, 66 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), R_f = 0,46, [á]²⁰ = = -42,l°(c = 0,94/CH₂Cl₂).

1.24. c) p-Nitrofenyl-2-O-metyl-3,4-O-izopropylidén-6-O-trifenylmetyl-p-D-gala-ktopyranozid

Zlúčenina 1.24.b) (5,83 g, 10 mmól) sa rozpustí v dimetylformamide (100 ml), zmieša sa s metyljodidom (25 ml, 40 mmól) a po častiach s 80 % suspenziou hydridu sodného v minerálnom oleji (450 mg, 15 mmól). Po 2 hodinách pri teplote miestnosti sa reakcia skončí prikvapkaním metylalkoholu (10 ml) a reakčná zmes sa vo vákuu zahustí. Získaný zvyšok sa vyberie do dichlórmetánu (1000 ml) a tento roztok sa silne rozmieša s vodou (500 ml). Organická fáza sa vysuší pomocou síranu horečnatého (50 g), vo vákuu sa zahustí a čistí sa pomocou okamihovej chromatografie (petroléter/etylacetát 12 : 1 —♦ 8 : 1). Získa sa bezfarebná penovitá látka (4,72 g, 79 %), DC (petroléter/etylacetát 1: 1), Rf = 0,72 [a]²⁰ = -35,7° (c = = 1,0/CHjOH).

1.24. d) p-Nitrofenyl-2-0-metyl-p-D-galaktopyranozid

Roztok uvedenej zlúčeniny (4,48 g, 7,5 mmól) v dichlórmetáne (200 ml) sa zmieša s 99 % kyselinou trifluóroctovou (20 ml) a mieša sa počas 3 hodiny pri teplote miestnosti. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok čistí pomocou okamihovej chromatografie (petroléter/etylester kyseli ny octovej 5 : 1 —> 2 : 1). Získa sa takto produkt vo forme bezfarebných kryštálov (1,09 g, 46 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), Rf = 0,42, t. t. = 177 ^DC.

1.24. p-Aminofenyl-2-O-metyl-p-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.24.d) (946 mg, 3 mmól) sa rozpustí v metylalkohole (50 ml) a po prídavku vody (0,5 ml) a bázického Raneyovho niklu (asi 200 mg) sa hydrogenuje počas 2 hodín vo vodíkovej atmosfére za mierneho pretlaku. Suspenzia sa potom prefiltruje cez celíte a filtračný koláč sa dôkladne premyje metylalkoholom (100 ml). Zahustením filtrátu vo vákuu sa získa hnedá penovitá látka (579 mg, 68 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15:3:: 0,2), R_f = 0,28, [á]²⁰ = -39,3° (c = 1,5/CH₃OH).

Príklad 1.25 p-Aminofenyl-3-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

OH

.O •v

1.25.a) p-Nitrofenyl-3-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

Roztok p-nitrofenyl-P-D-galaktopyranozidu (1,5 g, 5,0 mmól) v absolútnom metylalkohole (40 ml) sa zmieša s dibutylcínoxidom (1,87 g, 7,5 mmól) a reakčná zmes sa zahrieva pod spätným chladičom. Po 3 hodinách sa vo vákuu odparí a získaný zvyšok sa suší jednu hodinu vo vákuu olejovej vývevy. Potom sa vyberie do absolútneho dioxánu (40 ml), získaný roztok sa zmieša s metyljodidom (1,9 ml, 30 mmól) a vsádzka sa mieša počas 16 hodín pri teplote kúpeľa 100 °C. Potom sa rozpúšťadlo vo vákuu oddestiluje a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/petroléter 2:1-» etylacetát). Získa sa takto produkt vo forme bezfarebných kryštálov (1,32 g, 84 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,34,1.1. = 196 °C, [á]²⁰ = - 53,3° (c = = 1,0/CH₃OH).

1.25. p-Aminofenyl-3-O-metyl-p-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (946 mg, 3 mmól) sa redukuje a spracuje, rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Získa sa takto hnedavá kryštalická látka (656 mg, 77 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), Rf = = 0,21,1.1. = 196 °C, [a]²⁰ = -25,2 ° (c = 1,0/CH₃OH).

Príklad 1.26 p-Aminofenyl-4-O-metyl-P-D-galaktopyranozid, acctát

OH

OH

1.26. a) p-Nitrofenyl-3-O-benzyl-P-D-galaktopyranozid

Roztok p-nitrofenyl-P-D-galaktopyranozidu (1,5 g, 5,0 mmól) v absolútnom dioxáne (40 ml) sa zmieša s dibutylcínoxidom (1,87 g, 7,5 mmól) a zahrieva sa do varu pod spätným chladičom. Po 3 hodinách sa získaný roztok zmieša s benzylbromidom (3,6 ml, 30 mmól) a reakčná zmes sa mieša počas ďalších 48 hodín za varu pod spätným chladičom. Potom sa rozpúšťadlo vo vákuu oddestiluje a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/petroléter 2 : 1 -» 1 : 1). Získa sa takto produkt vo forme bezfarebných kryštálov (1,58 g, 81 %), DC (dich lórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = = 0,69,1.1. = 127 °C.

1.26. b) p-Nitrofenyl-3-0-benzyl-4,6-0-izopropylidén-B-D-gala-ktopyranozid

Zlúčenina 1.26.a) (6,26 g, 16 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.b) a produkt sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/petroléter 1 : 5 -» 1 : 3). Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej penovitej látky (6,54 g, 95 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), R_f = 0,34, [a]²⁰ = -25,2° (c = 1,O/CH₂C1₂).

1.26. c) p-Nitrofenyl-2,3-di-O-benzyl-4,6-O-izopropylidén-β-D-gala-ktopyranozid

Zlúčenina 1.26.b) (4,31 g, 10 mmól) sa rozpustí v dimetylformamide (100 ml), zmieša sa s benzylbromidom (12 ml, 100 mmól) a po častiach sa zmieša s 80 % suspenziou hydridu sodného v minerálnom oleji (450 mg, 15 mmól). Po 2 hodinách pri teplote miestnosti sa reakcia skončí prikvapkaním metylalkoholu (10 ml) a zmes sa vo vákuu zahustí. Získaný zvyšok sa vyberie do dichlórmetánu (1000 ml) a roztok sa dôkladne rozmieša s vodou (500 ml). Organická fáza sa potom vysuší pomocou bezvodého síranu horečnatého (50 g), vo vákuu sa zahustí a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/petroléter 1 : 20 —> 1: 15 —> 1 :10). Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej olejovitej látky (2,72 g, 52 %), DC (petroléter/etylacetát 1 :1), Rf = 0,62.

1.26. d) p-Nitrofenyl-2,3-di-0-benzyl-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (2,6 g, 5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.d). Po zahustení vo vákuu a rozvarením získaného zvyšku s dietyléterom sa získa produkt vo forme bezfarebných kryštálov (805 mg, 33 %), DC (petroléter/etylacetát 1 :1), Rf = 0,23,1.1. = 160 °C.

1.26. e) p-Nitrofenyl-2,3-di-0-benzyl-6-0-trifenylmetyl-p-D-gala-ktopyranozid

Zlúčenina 1.26.d) (722 mg, 1,5 mmól) sa trityluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.a). Po čistení pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/ petroléter 1:15-» -» 1 : 10 -» 1 : 5) sa získa produkt vo forme bezfarebnej penovitej látky (880 mg, 81 %),DC (petroléter/etylacetát 2:1), R_f = 0,79, [a]²⁰ = -25,3° (c = O,3/CH₂C1₂).

1.26. e) p-Nitrofenyl-2,3-di-0-benzyl-4-0-metyl-6-0-trifenylmetyl- β-D-gala-ktopyranozid

Zlúčenina 1.26.e) (724 mg, 1 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po čistení pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/petroléter 1:10-» -» 1 : 5) sa získa produkt vo forme bezfarebnej penovitej látky (662 mg, 90 %), DC (petroléter/etylacetát 5 : 1), Rf = = 0,66, [a]²⁰ = -38,7° (c = O,2/CH₂C1₂).

1.26. p-Aminofenyl-4-O-metyl-P-D-galaktopyranozid, acetát

Uvedená zlúčenina (590 mg, 0,8 mmól) sa rozpustí v 90 % kyseline octovej (50 ml) a po prídavku paládia na aktívnom uhlí (10 % Pd, 200 mg) sa hydrogenuje počas 16 hodín vo vodíkovej atmosfére za mierneho pretlaku. Suspenzia sa potom prefiltruje cez celíte a filtračný koláč sa dôkladne premyje metylalkoholom (100 ml). Po zahustení filtrátu vo vákuu a prezrážaní získaného zvyšku zo zmesi dietyléteru a petroléteru sa získa produkt vo forme bezfarebných kryštálov (253 mg, 92 %), DC (dichlórme

SK 281785 Β6 tán/metylalkohol 5 : 1), Rf= 0,12.

Príklad 1.27 p-Aminofenyl-6-O-metyl-p-D-galaktopyranozid

1.27.a) Benzylácia zlúčeniny 1.24.b)

Zlúčenina 1.24.b) (5,84 g, 10 mmól) sa benzyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.26.c). Po čistení pomocou okamihovej chromatografie (etylacetät/ petroléter 1 : 15 —> —» 1:10 —> 1 : 5, vždy s 0,5 % trietylamínu) sa získajú dve frakcie produktu:

Frakcia 1: p-nitrofenyl-2-O-benzyl-3,4-O-izopropylidén-6-O-trifenylmetyl-B-D-galaktopyranozid, žltkavá penovitá látka (1,71 g, 25 %), DC (petroléter/etylacetát 2 : 1), R_f = = 0,72, [a]²⁰ = - 8,1° (c = 1,O/CH₂C1₂).

Frakcia 2: p-nitrofenyl-2-O-benzyl-3,4-O-izopropylidén-B-D-galaktopyranozid, žltkavá olejovitá látka (806 mg, 19 %), DC (petroléter/etylacetát 2 : 1), R_f = 0,45, [a]²⁰ = = +2,8°(c= 1,2/CHjOH).

1.27.b)p-nitrofenyl-2-0-benzyl-3,4-0-izopropylidén-6-0-metyl-P-D-galakto-pyranozid

Frakcia 2 z príkladu 1.27.a) (777 mg, 1,8 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po čistení pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/petroléter 1 : 10 -> 1 : 8) sa získa produkt vo forme hnedavej olejovitej látky (730 mg, 91 %), DC (petroléter/etylacetát 2 : 1), R_f = 0,54 [a]²⁰ = -11,6° (c = = 1,1/CH₂C1₂).

1.27.c) p-Nitrofenyl-2-0-benzyl-6-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (668 mg, 1,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.d). Po zahustení vo vákuu a rozvarení získaného zvyšku s malým množstvom dietyléteru sa získa po ochladení na teplotu miestnosti produkt vo forme svetlo žltých kryštálov (388 mg, 64 %), DC (petroléter/etylacetát 1 :1), Rf = 0,15,1.1. = = 143 °C.

1.27. p-Aminofenyl-6-0-metyl-p-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.27.c) (324 mg, 0,8 mmól) sa redukuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24 počas 16 hodín. Po zahustení filtrátu vo vákuu a rozvarení získaného zvyšku s malým množstvom dietyléteru sa získa produkt vo forme béžových kryštálov (184 mg, 81 %), DC (etylacetát), R_f = = 0,05,1.1. = 115 °C (rozklad).

Príklad 1.28 p-Aminofenyl-2,3-di-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

,o

H,C

CH,

1.28.a) Izopropylidenácia p-nitrofenyl-B-D-galaktopyranozidu

Roztok p-nitrofenyl-p-D-galaktopyranozidu (7,5 g, 25 mól) v absolútnom acetóne (1 000 ml) sa zmieša s bezvodou kyselinou toluénsulfónovou (500 mg). Za normálneho tlaku sa v priebehu 30 minút oddestiluje acetón (250 ml) a zneutralizuje sa potom ihneď prídavkom uhličitanu draselného (500 mg). Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok rozmieša s dietyléterom (1 000 ml), prefíltruje sa a filtrát sa zahustí a čistí sa pomocou okamihovej chromatografie (petroléter/etylacetát 2 : 1 —> 1 : 1 —» 3 : 2). Pritom vypadnú dve frakcie produktov:

Frakcia 1: p-nitrofenyl-3,4-0-izopropylidén-B-D-galaktopyranozid, bezfarebná penovitá látka (3,74 g, 44 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,59, [a]²⁰ = -54,2° (c = 0,38/CH₃OH).

Frakcia 2: p-nitrofenyl-4,6-O-izopropylidén-B-D-galaktopyranozid, bezfarebná penovitá látka (4,3 g, 50 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f= 0,54, [a]²⁰ = -81,0° (c = 0,31/CH₃OH).

1,28.b) p-Nitrofenyl-2,3-di-O-metyl-4,6-O-izopropylidén-β-D-galakto-pyranozid

Frakcia 2 z príkladu 1.28.a) (4,1 g, 12 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 5 : 1 —> 2 : 1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej penovitej látky (2,3 g, 66 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), R_f = 0,42, [a]²⁰ = = 52,6° (c = 0,34/CH₃OH).

1,28.c) p-Nitrofenyl-2,3-di-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (2,77 g, 7,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.d). Po jednej hodine pri teplote miestnosti sa reakčná zmes vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa suší počas jednej hodiny za vákua olejovej vývevy. Digeráciou so zmesou dietyléteru a petroléteru 1 : 1 (100 ml) sa získa produkt vo forme bezfarebných kryštálov (1,11 g, 45 %), DC (etylacetát), Rf = 0,24, t. t. = 156 °C.

1.28. p-Aminofenyl-2,3-di-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.38.c) (989 mg, 3 mmól) sa redukuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej olejovitej kvapaliny (396 mg, 44 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : : 0,2), R_f '= 0,50, [a]²⁰ = -19,4° (c = O,16/CH₃OH).

Príklad 1.29 p-Aminofenyl-2,4-di-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

OH

1.29. a) Tritylácia zlúčeniny 1.26.a)

Zlúčenina 1.26.a) (11,7 g, 30 mmól) sa trityluje rovnako, ako je uvedené v príklade 1.24.a). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 10 : 1 —> 7 : 1 —5 : 1, vždy s 0,5 % trietylamínu) sa získajú dva produkty:

Frakcia 1: trifenylmetyl-2-O-(p-nitrofenyl)-3-O-benzyl-6-O-trifenylmetyl-P-D- galaktopyranozid, bezfarebná penovitá látka (8,5 g, 32 %), DC (petroléter/etylacetát 2 : : 1), R_f = 0,68, [a]²⁰ = +42,8° (c = 1,O/CH₂C1₂).

Frakcia 2: p-nitrofenyl-3-0-benzyl-6-0-trifenylmetyl-P-D-galaktopyra-nozid, bezfarebná penovitá látka (9,0 g, 47 %), DC (petroléter/etylacetát 2 : 1), Rf = 0,22, [a]²⁰ = = -22,6° (c = l,03/CH₂Cl₂).

1.29. b) p-Nitrofenyl-2,4-di-O-metyl-3-O-benzyl-6-O-trifenylmetyl-P-D-galakto-pyranozid

Frakcia 2 z príkladu 1.29.a) (7,6 g, 12 mmól) sa mety

SK 281785 Β6 luje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 15:1—>10:1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej penovitej látky (7,07 g, 89 %), DC (petroléter/etylacetát 2 : 1), R_f = 0,79, [a]²⁰ = = -35,8° (c = 1,09/CHjOH).

1.29. c) p-Aminofenyl-2,4-di-O-metyl-3-O-benzyl-p-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (6,0 g, 9 mmól) sa hydrogenuje počas 48 hodín, ako je opísané v príklade 1.26. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebných kryštálov (1,39 g, 40 %), DC (petroléter/etylacetát 2 : 1), Rf = 0,20,1.1. = 148 °C.

1.29. p-Aminofenyl-2,4-di-O-metyl-p-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.29.c) (779 mg, 2 mmól) sa hydrogenuje počas 5 dní rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po odparení spojených filtrátov vo vákuu a rozvarení získaného zvyšku s dietyléterom (2 x 50 ml) sa získa ľahko zelenkavá kryštalická látka (391 mg, 65 %), DC (etylacetát), R_f = = 0,16,1.1. = 260 °C (rozklad).

Príklad 1.30 p-Aminofenyl-2,6-di-O-metyl-p-D-galaktopyranozid

produkt vo forme žltkavej olejovitej látky (5,3 g, 85 %), DC (etylacetát/petroléter 2 : 1), R_f = 0,76, [a]²⁰ = +8,8 (c = = 1,3/CH₃OH).

1.31 .b) p-Nitrofenyl-2,6-di-O-benzyl-P-D-galaktopyTanozid

Uvedená zlúčenina (4,69 g, 9 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.d). Po 30 minútach pri teplote miestnosti sa vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa suší počas jednej hodiny za vákua olejovej vývevy. Rekryštalizáciou z etylalkoholu sa získa bezfarebná kryštalická látka (2,89 g, 67 %), DC (etylacetát/petroléter 2 : 1), R_f = = 0,42,1.1. = 133 °C [a]²⁰ = -64,2° (c = 1,0/CH₃OH).

1.31 .c) p-Nitrofenyl-2,6-di-O-benzyl-3,4-di-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (2,4 g, 5 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po rekryštalizácii zo zmesi etylalkoholu a n-hexánu sa získa bezfarebná kryštalická látka (1,74 g, 69 %), DC (etylacetát/petroléter 1 : 1), R_f = 0,74,1.1. = 149 °C.

1.31. p-Aminofenyl-3,4-di-0-metyl-P-D-galaktopyranozid, acetát

Zlúčenina 1.31.c) (1,52 g, 3 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.26. Získa sa takto bezfarebná kryštalická látka (664 mg, g7762 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = = 0,47,1.1. = 140 °C (rozklad).

1.3O.a) p-Nitrofenyl-2,6-di-O-metyl-3,4-O-izopropylidén-β-D-galakto-pyranozid

Frakcia 1 z príkladu 1.28.a) (4,1 g, 12 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 10:1 —> 8:1 —> -> 5 : 1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej olejovitej látky (3,25 g, 73 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), Rf = = 0,65.

Príklad 1.32 p-Aminofenyl-3,6-di-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

1.30.b) p-Nitrofenyl-2,6-di-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (2,77 g, 7,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.d). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 1 : 2) sa získa produkt vo forme bezfarebných kryštálov (1,63 g, 66 %), DC (etylacetát), Rf = 0,31,1.1. = 222 °C.

1.30. p-Aminofenyl-2,6-di-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.30.b) (989 mg, 3 mmól) sa redukuje rovnako, ako je opísané v príklade 1,24). Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej olejovitej látky (597 mg, 66 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f= 0,56, [á]²⁰ = - 53,1° (c = 0,49/CH₃OH).

Príklad 1.31 p-Aminofenyl-3,4-di-O-metyl-P-D-galaktopyranozid, acetát

OH

,0 H,C

1.31 .a) p-Nitrofenyl-2,6-di-O-benzyl-3,4-O-izopropylidén-β-D-galaktopyra-nozid

Frakcia 1 z príkladu 1.28.a) (4,1 g, 12 mmól) sa benzyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.26.C). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 6 : 1) sa získa

1.32. a).p-Nitrofenyl-3-O-metyl-6-O-(terc.-butyl-dimetylsilyl)-P-D-galaktopyra-nozid

Roztok zlúčeniny 1.25.a) (1,58 g, 5 mmól) v dimetylformamide (150 ml) sa zmieša simidazolom (1 g, 15 mmól) a terc.-butyldimetylsilyl-chloridom (1,25 g, 8 mmól) a mieša sa počas 24 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa reakcia prídavkom vody (100 ml) skončí. Reakčná zmes sa zriedi dichlórmetánom (1000 ml), organická fáza sa premyje vodou (2 x 1000 ml), vysuší sa pomocou bezvodého síranu horečnatého (20 g) a vo vákuu sa zahustí. Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 15 : 1 —> 10 : : 1 —> 5 : 1) sa získa produkt vo forme žltkavej penovitej látky (826 mg, 38 %), ktorá je ešte ľahko znečistená, DC (etylacetát), R_f = 0,65, [a]²⁰ = -56,3° (c = 1,0/CH₂Cl₂).

1.32. b) p-Nitrofenyl-2,4-di-0-benzyl-3-0-metyl-6-0-(terc.-butyldimetylsilyl)- β-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (446 mg, 0,9 mmól) sa benzyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.26.c). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 30:1—>5:l)sa získa produkt vo forme bezfarebnej penovitej látky (810 mg, 74 %), DC (petroléter/etylacetát 5:1), Rf = 0,58.

1.32. c) p-Nítrofenyl-2,4-di-O-benzyl-3-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1,32.b) (732 mg, 1,2 mmól) sa rozpustí v tetrahydrofuráne (6 ml) a pri teplote 0 °C sa zmieša s 1 M roztokom tetrabutylamóniumfluoridu v tetrahydrofúráne

SK 281785 Β6 (2,4 ml). Reakčná zmes sa mieša počas 40 minút pri teplote miestnosti a potom sa vo vákuu zahustí. Po okamihovej chromatografii (petroléter/ etylacetát 5 : 1 —> 3 : 1 —► 2 : 1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (512 mg, 86 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), R_f = 0,58,

1.1. = 177 °C.

1.32. d) p-Nitrofenyl-2,4-di-0-benzyl-3,6-di-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (446 mg, 0,9 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 20 : 1 —► 10 : 1 —> 8 : : 1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej olej ovitej látky (410 mg, 87 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), Rf = 0,70, [a]²⁰ = -56,5° (c = O,96/CH₂C1₂).

1.32. p-Aminofenyl-3,6-di-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.32.d) (357 mg, 0,7 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po odparení spojených íiltrátov vo vákuu a rozvarení získaného zvyšku s dietyléterom (20 ml) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (207 mg, 99 %), DC (petroléter/etylacetát 1:1), R_f = 0,02,1.1. = 280 °C (rozklad).

Príklad 1.33 p-Aminofenyl-4,6-di-O-metyl-p-D-galaktopyranozid

OH

1.33 .a) p-Nitrofenyl-2,3-di-O-benzyl-4,6-di-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.26.d) (2,4 g, 5 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 5 : 1 —> 3 :1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (1,89 g, 74 %), DC (petroléter/etylacetát 1.1), R_f = 0,76,1.1. = 100 °C.

1.33. p-Aminofenyl-4,6-di-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.33.a) (1,53 g, 3 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (890 mg, 99 %), DC (metylalkohol/etylacetát 1 :1), R_f = 0,71,1.1. = = 180 °C (rozklad).

Príklad 1.34 p-Aminofenyl-2,3,4-tri-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

1,34.a) p-Nitrofenyl-2,3,4-tri-O-metyl-6-O-trifenylmetyl-P-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.24.a) (1,63 g, 3 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 5 : 1 —> 3 :1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej penovitej látky (1,24 g, 71 %), DC (petroléter/etylacetát 1:1), R_f = 0,54, [a]²⁰ = -53,6° (c = 0,3/CHjOH).

1.34. b) p-Nitrofenyl-2,3,4-tri-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (1,17 g, 2 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.d). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 3 :1 —> 2 :1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (468 mg, 68 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), R_f = 0,12, t. t. = = 104 °C, [a]²⁰ = - 68,2 ⁰ (c = 0,47/CH₃OH).

1.34. p-Aminofenyl-2,3,4-tri-0-metyl-p-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.34.b) (343 mg, 1 mmól) sa redukuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Získa sa takto produkt vo forme béžovej kryštalickej látky (224 mg, 71 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,67,1.1. = 138 °C.

Príklad 1.35 p-Aminofenyl-2,3,6-tri-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

1.35.a) p-Nitrometyl-2,3,6-tri-O-metyl-p-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.30.b) (2,63 g, 3 mmól) sa selektívne metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.25.a). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 5 : 1 —> 2 : 1) sa získa produkt vo forme hnedastej olejovitej látky (890 mg, 32 %), DC (etylacetát), R_f = 0,37 [a]²⁰ = -63,3 ⁰ (c = = O,9/CH₂C1₂).

1.35. p-Aminofenyl-2,3,6-tri-O-metyl-p-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (858 mg, 2,5 mmól) sa redukuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Získa sa takto produkt vo forme béžovej penovitej látky (519 mg, 66 %), DC (etylacetát), R_f = 0,23, [a]²⁰ = -34,5° (c - 0,86/CHj OH).

Príklad 1.36 p-Aminofenyl-2,3,4-tri-O-metyl-P-D-galaktopyranozid o'^CH·

OH CH,

1.36.a) p-Nitrofenyl-2,4,6-tri-0-metyl-3-0-benzyl-P-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.26.a) (1,96 g, 5 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 10:1—>8:l)sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (1,47 g, 68 %), DC (petroléter/etylacetát 2 : 1), Rf = 0,46, t. t. = = 164 °C. 1.36. p-aminofenyl-2,4,6-tri-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (1,3 g, 3 mmól) sa redukuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.26. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (642 mg, 68 %), DC (etylacetát/petroléter 2 : 1), R_f = 0,12, t. t. = 147 °C (rozklad).

SK 281785 Β6

Príklad 1.37 p-Aminofenyl-3,4,6-tri-O-metyl-p-D-galaktopyranozid

,0 H,C

1.37. a) p-Nitrometyl-2-0-benzyl-p-D-galaktopyranozid

Frakcia 1 z príkladu 1.27.a) (1,17 g, 2 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.d). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 3:1-42: : 1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (468 mg, 68 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), Rf = = 0,12,1.1. = 104 °C, [a]²⁰ = -68,2° (c = 0,47/CH₃OH).

1.37. b) p-Nitrofenyl-2-O-benzyl-3,4,6-tri-O-mctyl-p-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (391 mg, 1 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 10:1 —> 5 :1) sa získa produkt vo forme svetlo žltej kryštalickej látky (303 mg, 70 %), DC (etylacetát), R_f = 0,81, [a]²⁰ = -76,5 ° (c = = 1,1/CH₂C1₂).

1.37. p-Aminofenyl-3,4,6-tri-0-metyl-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (260 mg, 0,6 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Získa sa takto produkt vo forme béžovej kryštalickej látky (161 mg, 86 %), DC (etylacetát), R_f= 0,20,1.1. = 132 °C.

Príklad 1.38 p-Aminofenyl-2,3,4,6-tetra-O-metyl-p-D-galaktopyranozid

1.38.a) p-Nitrofenyl-2,3,4,6-tetra-O-metyl-P-D-galaktopyranozid-p-nitrofenyl-P-D-galaktopyranozid (904 mg, 3 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 8 : 1 —> 6 : 1 -4 4 : 1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej voskovitej látky (633 mg, 59 %), DC (etylacetát), R_f = 0,67, [a]²⁰ = -55,7° (c = O,9/CH₂C1₂).

1.38. p-Aminofenyl-2,3,4,6-tetra-O-metyl-P-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.33.a) (536 mg, 1,5 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po odparení spojených filtrátov vo vákuu a vyvarení získaného zvyšku s dietyléterom (20 ml) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (412 mg, 84 %), DC (etylacetát), R_f = = 0,42,1.1. = 204 °C (rozklad).

Príklad 1.39 p-Aminofenyl-a-manopyranozid

OH

OH p-Nitrofenyl-a-D-manopyranozid (3,0 g, 10 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je uvedené v príklade 1.23. Vyzrážaním zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru sa získa bezfarebná kryštalická látka (2,03 g, 75 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,69, [a]²⁰ = +102,7° (c = l,0/H₂O), t. t. = = 161 °C.

Príklad 1.40 p-Aminofenyl-3-O-metyl-a-D-manopyranozid

1,40.a) p-Nitrofenyl-6-O-trifenylmetyl-a-D-manopyranozid p-Nitrofenyl-a-D-manopyranozid (30 g, 10 mmól) sa trityluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.a). Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (4,35 g, 80 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,52, [a]²⁰ = +104,0° (c = 1,0/CH₃OH), 1.1. = 102 až 104 °C.

1,40.b) p-Nitrometyl-3-O-metyl-6-O-trifenylmetyl-a-D-manopyranozid

Uvedená zlúčenina (2,72 g, 5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.26.a) s metyljodidom (2 ml, 30 mmól). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 2 : 1) a prezrážaní zo zmesi etylalkoholu a hexánu sa získa bezfarebná kryštalická látka (1,83 g, 66 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (25 %) 15 : 3 : : 0,2), R_f = 0,68 [a]²⁰ = + 106,4° (c = 1,0/CHjOH), t. t. = = 104 °C.

1.40. p-Aminofenyl-3-O-metyl-a-D-manopyranozid

Zlúčenina 1.40.b. (1,4 g, 2,5 mmól) sa rozpustí v metylalkohole (50 ml) a po prídavku paládia na aktívnom uhlí (10 % Pd, 300 mg) sa hydrogenuje počas 24 hodín vo vodíkovej atmosfére za mierneho pretlaku. Suspenzia sa prefiltruje cez celíte a filtračný koláč sa dôkladne premyje metylalkoholom (100 ml). Po zahustení filtrátu vo vákuu sa získaný zvyšok vyberie do vody (50 ml), prefiltruje sa a filtrát sa lyofilizuje. Ziska sa takto hnedastá amfotemá pevná látka (709 mg, 99 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,33, [a]²⁰ = + 92,9 ° (c=l,l/CH₃OH).

Príklad 1.41 p-Aminofenyl-2,3-di-O-metyl-a-D-manopyranozid

1.41 .a) p-Nitrofenyl-4,6-0-benzylidén-a-D-manopyranozid

Roztok p-nitrofenyl-a-D-manopyranozidu (6,0 g, 20 mmól) v dimetylformamide (120 ml) sa zmieša s benzaldehyd-dimetylacetalom (3,2 ml, 21,4 mmól) a 54 % roztokom kyseliny tetrafluórboritej v dietylétere (2,7 ml, 20 mmól). Reakčná zmes sa mieša počas 5 hodín pri teplote miestnosti, potom sa reakcia skonči prídavkom trietylamínu (2,8 ml, 20 mmól) a vo vákuu sa zahustí. Po okamihovej chromatografii (toluén -4 toluén/etylalkohol 20 : 1) sa získa bezfarebná kryštalická látka (6,48 g, 83 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,82,

SK 281785 Β6 [α]²⁰ = +170,7 ° (c = 1,O/CH₂C1₂), 1.1. = 116 °C.

1.41 .b) p-Nitrofenyl-2,3-di-0-metyl-4,6-0-benzylidén-a-D-manopyranozid

Uvedená zlúčenina (3,9 g, 10 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.C. Po okamihovej chromatografíi (petroléter/etylacetát 20 : 1 -> 7 : 1) a prezrážaní zo zmesi etylalkoholu a hexánu sa získa bezfarebná penovitá látka (3,2 g, 77 %), DC (etylacetát/petroléter 2 : : 1), Rf = 0,67, [a]²⁰ = + 167,3° (c = 1,05/CH₃OH).

1.41. p-Aminofenyl-2,3-di-0-metyl-a-D-manopyranozid

Zlúčenina 1.41.b) (1,25 g, 3 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.26. Po okamihovej chromatografii (etylacetát/petroléter 2 : 1 -> etylacetát so vždy 0,5 % trietylamínu) sa získa produkt vo forme červenkasto hnedej penovitej látky (480 mg, 53 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), Rf= 0,31, [a]²⁰ = + 83,6° (c = 0,76/CH₃OH).

Príklad 1.42 p-Aminofcnyl-3-O-metoxykarbonylmetyl-P-D-galaktopyranozid

1.42.a) p-Nitrofenyl-3-O-metoxykarbonylmetyl-P-D-galaktopyranozid

Roztok p-nitrofenyl-P-D-galaktopyranozidu (7,53 g, 25 mmól) v absolútnom dioxáne (180 ml) sa zmieša s dibutylcínoxidom (9,3 g, 37,5 mmól) a reakčná zmes sa zahrieva do varu pod spätným chladičom. Po 4 hodinách sa získaný roztok zmieša s metylesterom kyseliny brómoctovej (8,3 ml, 90 mmól) a tetrabutylamóniumjodidom (9,25 g, 25 mmól) a vsádzka sa mieša ďalšie 3 hodiny za varu pod spätným chladičom. Rozpúšťadlo sa potom vo vákuu oddestiluje a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 50 : 1 -> 20 : : 1). Okrem niektorých vedľajších produktov sa získa zlúčenina 1.42.a) vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (4,05 g, 43 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15:3: 0,2), R_f = 0,54, [a]²⁰ = - 62,0° (c = 1,0/CH₃OH), t. t. = 176 °C.

1.42. p-Aminofenyl-3-O-metoxykarbonylmetyl-p-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.42.a) (3,73 g, 10 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je uvedené v príklade 1.24. Vyzrážaním zo zmesi etylalkoholu a n-hexánu sa získa bezfarebná kryštalická látka (2,98 g, 87 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 :0,2), R_f = 0,39, [a]²⁰ = -36,3° (c = 1,07/CH₃OH), 1.1. = 155 °C.

Príklad 1.43 p-Aminofenyl-3-O-karboxymetyl-P-D-galaktopyranozid, sodná soľ

1.43 .a) p-Nitrofenyl-3-O-karboxymetyl-P-D-galaktopyranozid, sodná soľ

Roztok zlúčeniny 1.42.a) (3,73 g, 10 mmól) v metylalkohole sa zmieša s roztokom hydroxidu sodného (400 mg, 10 mmól) vo vode (5 ml) a mieša sa počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok suší počas 2 hodín vo vákuu olejovej vývevy a potom sa zmieša s etylalkoholom (100 ml). Reakčná zmes sa zahrieva do varu pod spätným chladičom počas 5 minút, po ochladení v ľadovom kúpeli sa prefiltruje a získa sa bezfarebná kryštalická látka (366 g, 96 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,62, [a]²⁰ = -50,0° (c = 1,0/CH₃OH), 1.1. = 180 až 185 °C.

1.43. p-Aminofenyl-3-O-karboxymetyl-P-D-galaktopyranozid, sodná soľ

Uvedená zlúčenina (3,05 g, 8 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po vyvarení s etylalkoholom (50 ml) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (2,03 g, 72 %), DC (metylalkohol), Rf = 0,70, [a]²⁰ = - 22,4° (c = 1,0/CH₃OH), 1.1. = 180 až 182 °C.

Príklad 1.44 p-Aminofenyl-3-0-karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozid

1.44,a) p-Nitrofenyl-3-O-karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozid

Roztok zlúčeniny 1.42.a) (373 mg, 1 mmól) v metylalkohole (30 ml) sa zmieša s 25 % vodným roztokom amoniaku (10 ml) a reakčná zmes sa mieša počas 15 minút pri teplote miestnosti. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok suší počas 2 hodín za vákua olejovej vývevy a potom sa zmieša s etylalkoholom (30 ml). Potom sa varí počas 5 minút pod spätným chladičom, po ochladení na ľadovom kúpeli sa prefiltruje a získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (306 mg, 85 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = = 0,14, [a]²⁰ = -41,7° (c = 1,0/CH₃OH), 1.1 = 229 °C (rozklad).

1.44. p-Aminofenyl-3-O-karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (287 mg, 0,8 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po vyzrážaní zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (207 mg, 79 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), Rf = 0,10,1.1. = 205 °C (rozklad).

Príklad 1.45 p-Aminofenyl-3-O-(N-metyl-karbamoylmetyl)-P-D-galaktopyranozid

SK 281785 Β6

1.45.a) p-Nitrofenyl-3-O-(N-metyl-karbamoylmetyl)-p-D-galaktopyranozid

Roztok zlúčeniny 1.42.a) (373 mg, 1 mmól) v metylalkohole (30 ml) sa zmieša s 30 % vodným roztokom metylamínu (10 ml) a mieša sa počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok suší počas 2 hodín vo vákuu olejovej vývevy a potom sa prekryštalizuje z etylalkoholu. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (372 mg, 100 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,33, [a]²⁰ = -36,7° (c = 1,0/CH₃OH), 1.1. = 205 °C.

1.45 p-Aminofenyl-3-O-(N-metyl-karbamoylmetyl)-P-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.45.a) (298 mg, 0,8 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po vyzrážaní zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (180 mg, 66 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f=0,16,1.1. = 239°C.

Príklad 1.46 p-Aminofenyl-3-0-(N-propyl-karbamoylmetyl)-P-D-galaktopyranozid

1.46. a) p-Nitrofenyl-3-O-(N-propyl-karbamoylmetyl)-p-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.42.a) (373 mg, 1 mmól) sa nechá rovnako, ako je opísané v príklade 1.45.a) reagovať s n-propylamínom (823 pl, 10 mmól). Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok prezráža v zmesi etylalkoholu a n-hexánu. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (340 mg, 85 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,49, [a]²⁰ = - 32,4° (c= 1,0/CH₃OH), 11. = 155 °C.

1.46. p-Aminofcnyl-3-O-(N-propyl-karbamoylmetyl)-p-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.46.a) (320 mg, 0,8 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po vyzrážaní zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (188 mg, 63 %), DC (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 ; 0,2), R_f=0,31, t t. = 154°C.

Príklad 1.47 p-Aminofenyl-3-0-(N-butyl-karbamoylmctyl)-P -D-galaktopyranozid

1.47.a) p-Nitrofenyl-3-O-(N-butyl-karbamoylmetyl)-P -D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.42.a) (373 mg, 1 mmól) sa nechá rovnako, ako je opísané v príklade 1.45.a) reagovať s n-butylamínom (900 μΐ, 10 mmól). Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok prezráža v zmesi etylalkoholu a n-hexánu. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (413 mg, 100 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f= 0,51, [a]²⁰ = - 26,8° (c = 1,0/CH₃OH),

1.1. = 92°C.

1.47. p-Aminofenyl-3-O-(N-butyl-karbamoylmetyl)-0-D-galaktopyranozid

Zlúčenina 1.47.a) (332 mg, 0,8 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po vyzrážaní zo zmesi etylalkoholu a n-hexánu sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (105 mg, 34 %), DC (dichlórmetán/ metylalkohoí/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), Rf = = 0,32,1.1. = 135 °C.

Príklad 1.48 p-Aminofenyl-3-O-metoxykarbonylmetyl-a-D-manopyranozid

1.48. a) p-Nitrofenyl-3-O-metoxykarbonylmetyl-a-D-manopyranozid

Zlúčenina 1.40.a) (13,6 g, 25 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.42.a). Po okamihovej chromatografii sa získa takto okrem niektorých vedľajších produktov produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (2,79 g, 18 %), DC (etylacetát/petroléter 2 : 1), Rf = 0,50, t. t. = 95 až 97 °C.

1.48. p-Aminofenyl-3-O-metoxykarbonylmetyl-a-D-manopyranozid

Zlúčenina 1.48.a) (1,23 g, 2 mmól) sa hydrogenuje a spracuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.40. Získa sa takto produkt vo forme hnedavej amorfnej pevnej látky (250 mg, 36 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f=0,45.

Príklad 1.49 p-Aminofenyl-3-O-karboxymetyl-a-D-manopyranozid

1.49.a) p-Nitrofenyl-3-0-benzoxykarbonylmetyl-6-0-trifenylmetyl- a-D-manopy-ranozid

Zlúčenina 1.40.a) (13,6 g, 25 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.42.a) s benzylesterom kyseliny brómoctovej (14,4 ml, 90 mmól). Po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 20 : 1 -> 10 : 1) sa získa takto okrem niektorých vedľajších produktov produkt vo forme žltkavej penovitej látky (5,0 g, 29 %), DC (etylacetát/petroléter 2 : 1), R_f = 0,66, [a]²⁰ = + 74,8° (c = = 1,O/CH₂C1₂).

SK 281785 Β6

1.49. p-Aminofenyl-3-O-karboxymetyl-a-D-manopyranozid

Zlúčenina 1.49.a) (2,08 g, 3 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.40. počas 36 hodín. Po zahustení filtrátu sa získaný zvyšok prezráža zo zmesi etylalkoholu a n-hexánu. Premytím etylacetátom a novým prezrážaním zo zmesi etylalkoholu a dietyléteru sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (495 mg, 50 %), DC (metylalkohol), R₍= 0,53,1.1. = 205 až 207 °C.

Príklad 1.50 p-Aminofenyl-3-O-karbamoylmetyl-a-D-manopyranozid

1.50. a) p-Nitrofenyl-3-O-karbamoylmetyl-6-O-trifenylmetyl-a-manopyranozid

Zlúčenina 1.49.a) (1,04 g, 1,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.44.a). Po usušení vo vákuu olejovej vývevy sa získaný zvyšok čisti pomocou okamihovej chromatografie (petroléter/etylacetát 2 : 3). Získa sa takto produkt vo forme bielej kryštalickej látky (561 mg, 62 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 :3 : 0,2),R_f= 0,67,[a]²⁰ = + 91,3°(c = 1,O/CH₂C1₂),

1.1. = 125 až 127 °C.

1.50. p-Aminofenyl-3-O-karbamoylmetyl-a-D-manopyranozid

Uvedená zlúčenina (541 g, 0,9 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.40. počas 48 hodín. Po zahustení filtrátu sa získaný zvyšok dôkladne premyje metylalkoholom a získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (134 mg, 45 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 :0,2), R_f = 0,21, t. t. = 126 až 128 °C.

Príklad 1.51 p-Aminofenyl-3-dezoxy-P-D-galaktopyranozid

OH

1.51 .a) p-Nitrofenyl-2,6-di-0-benzyl-4-0-acetyl-P-D-galaktopyranozid

Roztok zlúčeniny 1.31.b) (2,7 g, 56 mmól) v dichlórmetáne (20 ml) sa zmieša s trietylortoacetátom (3 ml, 16,3 mmól) a kyselinou toluénsulfónovou (20 mg). Po 30 minútach pri teplote miestnosti sa vsádzka zriedi dichlórmetánom (200 ml), premyje sa nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (50 ml), organická fáza sa vysuší pomocou bezvodého síranu horečnatého a po filtrácii sa vo vákuu zahustí. Získaná bezfarebná penovitá látka sa rozpustí v 80 % kyseline octovej (15 ml). Po ďalších 30 minútach pri teplote miestnosti sa vleje vsádzka do nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (200 ml), extrahuje sa chloroformom (3 x 75 ml), spojené organické fázy sa premyjú vodou, vysušia sa pomocou bezvodého síranu horečnatého a po filtrácii sa vo vákuu zahustia. Vyzrážaním zo zmesi etylalkoholu a petroléteru sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (2,43 g, 83 %), DC (etylacetát/petroléter 2 : 1), R_f = 0,64, [a]²⁰ = - 62,1° (c = = 1,0/CH₂C1₂), 1.1. = 83 °C.

I. 51 .b) p-Nitrofenyl-2,6-di-O-benzyl-3-O-trifluórmetánsulfonyl-4-O-acetyl- β-D-galaktopyranozid

Roztok zlúčeniny 1.51.a) (2,3 g, 4,4 mmól) v zmesi dichlórmetánu (30 ml) a pyridínu (3 ml) sa pod argónovou atmosférou pri teplote -20 °C po kvapkách zmieša s roztokom anhydridu kyseliny trifluórmetánsulfónovej (2 ml,

II, 8 mmól) v dichlórmetáne (30 ml). Po jednej hodine pri teplote -20 °C sa vleje vsádzka do nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (200 ml), organická fáza sa oddelí, vysuší sa pomocou bezvodého síranu horečnatého a po filtrácii sa vo vákuu zahustí. Po okamihovej chromatografii získaného zvyšku (toluén -> toluén/etylacetát 20 : 1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (2,39 g, 83 %), DC (toluén/etylacetát 5 : 1), R_f = 0,55, [a]²⁰ = = - 61,4 ⁰ (c = 1,O/CH₂C1₂), 1.1. = 105 °C.

1.51 .c) p-Nitrofenyl-2,6-di-0-benzyl-3-dezoxy-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (1,31 g, 2 mmól) sa rozpustí v toluéne (25 ml) a zmieša sa s tetrabutylamónium-tetrabórhydrátom (1,54 g, 6 mmól). Po 2 hodinách pri teplote 80 °C sa vsádzka zriedi dichlórmetánom (200 ml), premyje sa raz vodou (50 ml), organická fáza sa vysuší pomocou bezvodého síranu horečnatého a po filtrácii sa vo vákuu zahustí. Po okamihovej chromatografii získaného zvyšku (toluén/etylacetát 7 : 1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (596 mg, 64 %), DC (toluén/etylacetát 5 : : 1), Rf = 0,10, [a]²⁰ = - 81,3° (c = 1,O/CH₂C1₂), 1.1 = 14 °C.

1.51. p-Aminofenyl-3-dezoxy-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (465 mg, 1 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.40. počas 6 hodín. Po zahustení filtrátu sa získaný zvyšok prezráža zo zmesi etylalkoholu a petroléteru a získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (206 mg, 81 %), DC (dichlórmetán/ metylalkohoí/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = = 0,22.

Príklad 1.52 p-Aminofenyl-3,4-didezoxy-P-D-galaktopyranozid

OH

1,52.a) p-Nitrofenyl-2,6-di-O-benzyl-3,4-di-O-trifluórmetánsulfonyl-P-D-gala-ktopyranozid

Zlúčenina 1.31.b) (2,12 g, 4,4 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.51.b) sanhydridom kyseliny trifluórmetánsulfónovej (4 ml, 23,6 mmól). Po okamihovej chromatografii získaného zvyšku (toluén -> toluén/etylacetát 50 : 1) sa získa produkt vo forme žltkavej olejovitej látky (2,75 g, 84 %), DC (toluén/etylacetát 5 : 1), R_f= 0,67, [a]²⁰ = - 22,5 ° (c = 1,O/CH₂C1₂).

1,52.b) p-Nitrofenyl-2,6-di-0-benzyl-3,4-didezoxy-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (1,49 g, 2 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.51 .c) s tetrabutylamónium-tetrabórhydrátom (2,31 g, 9 mmól). Po okamihovej chromatografii získaného zvyšku (toluén -> toluén/etylacetát 50 :1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (629 mg, 70 %), DC (toluén/etylacetát 5:1), R_f = 0,53, [a]²⁰ = -79,1° (c = 1,O/CH₂C1₂), 1.1 = 89 °C.

SK 281785 Β6

1.52. p-Aminofenyl-3,4-didezoxy-P-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (450 mg, 1 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.40. počas 5 hodín. Po zahustení filtrátu sa získaný zvyšok prezráža zo zmesi etylalkoholu a petroléteru a získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (183 mg, 76 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = = 0,22, [a]²⁰ = -115,1° (c = 1,0/CH₃OH), 11. = 187 °C.

Príklad 1.53 p-Aminofenyl-ó-O-acetyl-p-D-galaktopyranozid

1.53. a)p-Nitrofenyl-6-O-acetyl-0-D-galaktopyranozid

Roztok p-nitrofenyl-P-D-galaktopyranozidu (7,53 g, 25 mmól) v absolútnom acetonitrile (80 ml) sa pri teplote 0 °C po kvapkách zmieša s čerstvo pripraveným roztokom z pyridínu (2 ml, 25 mmól) a acetylchloridu (1,85 ml, 26 mmól) v acetonitrile (20 ml). Reakčná zmes sa mieša počas 30 minút pri teplote 0 °C a potom sa vo vákuu zahustí. Po okamihovej chromatografii získaného zvyšku (dichlórmetán/ metylalkohol 50 : 1 -» 20 : 1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (4,02, 47 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 :3 :0,2), Rf= 0,50.

1.53. p-Aminofenyl-6-O-acetyl-3-D-galaktopyranozid

Uvedená zlúčenina (1,72 g, 5 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.40. počas 2 hodín. Po zahustení filtrátu sa získaný zvyšok prezráža zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru a získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (1,34 g, 86 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = = 0,34, [a]²⁰ = - 41,0° (c = 0,56/CH₃OH), t t. = 187 °C (rozklad).

Príklad 1.54 p-Aminofenyl-3,4-di-O-metoxykarbonylmetyl-P-D-gala· ktopyranozid

OH

1.54.a) Acylácia zlúčeniny 1.24.a)

Zlúčenina 1.24.a) (1,36 g, 3 mmól) sa rozpustí v dimetylformamide (25 ml) a zmieša sa s metylesterom kyseliny brómoctovej (1 ml, 10,6 mmól) a po častiach s 80 % suspenziou hydridu sodného v minerálnom oleji (300 mg, 10 mmól). Po 3,5 hodinách pri teplote miestnosti sa pridá znova metylester kyseliny octovej (250 μΐ, 2,65 mmól) a hydrid sodný v minerálnom oleji (75 mg, 2,5 mmól). Po ďalších 2 hodinách sa reakcia skončí prikvapkaním metylalkoholu (5 ml) a vo vákuu sa reakčná zmes zahustí. Získaný zvyšok sa vyberie do dichlórmetánu (250 ml) a roztok sa dôkladne rozmieša s vodou (100 ml). Organická fáza sa oddelí, vysuší sa pomocou bezvodého síranu horečnatého (10 g), zahustí sa vo vákuu a čistí sa pomocou okamihovej chromatografie (petroléter/etylacetát 10 : 1 —► 7 : 1 —► 5 : : 1 —♦ 3 :1). Získajú sa takto tri frakcie produktov.

Frakcia 1: p-nitrofenyl-2,3,4-tri-O-metoxykarbonylmetyl-P-D-gala-ktopyranozid, bezfarebná penovitá látka (401 mg, 21 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), R_f = 0,47, [a]²⁰ = = -51,9°(c = 0,26/CH₃OH).

Frakcia 2: neidentifikované, bezfarebná penovitá látka (88 mg), DC (petroléter/etylacetát 1 : l), Rf = 0,39, [a]²⁰ = = -61,5°(c = 0,26/CH₃OH).

Frakcia 3: p-nitrofenyl-3,4-di-0-metoxykarbonylmetyl-β-D-galaktopyranozid, bezfarebná penovitá látka (275 mg, 16 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), R_f = 0,30, [a]²⁰ = = - 38,6° (c = 0,28/CH₃OH).

1.54. p-Aminofenyl-3,4-di-O-metoxykarbonylmetyl-0-D-galaktopyranozid

Frakcia 3 z príkladu 1.54.a) (206 mg, 0,3 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.40. počas 16 hodín. Po zahustení filtrátu sa získaný zvyšok rozvarí s dietyléterom (20 ml) a získa sa takto produkt vo forme šedej kryštalickej látky (45,6 mg, 37 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), R_f = 0,22,1.1. = 155 °C.

Príklad 1.55 p-Aminofenyl-2,3,4-tri-0-metoxykarbonylmetyl-P-D-galaktopyranozid

Frakcia 1 z príkladu 1.54.a) (380 mg, 0,5 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.40. počas 16 hodín. Po zahustení filtrátu sa získaný zvyšok rozvarí s dietyléterom (20 ml) a získa sa takto produkt vo forme žltohnedej olejovitej látky (46,8 mg, 19 %), DC (petroléter/etylacetát 1 : 1), Rf = 0,29,1.1. = 106 °C (rozklad).

Príklad 1.56 p-Aminofenyl-4-O-(P-D-galaktopyranozyl)-P-D-glukopyranozid

p-Nitrofenyl-4-O-(0-D-galaktopyranozyl)-p-D-galaktopyranozid (4,63 g, 10 mmól) sa hydrogenuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.23. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (3,04 g, 70 %), DC (metylalkohol), Rf = 0,55,1.1. = 235 až 237 °C (rozklad).

Príklad 1.57 p-Aminofenyl-4-O-(3'-sulfát-B-D-galaktopyranozyl)-P-D-glukopyranozid, sodná soľ

SK 281785 Β6

1.57. a) p-Nitrofenyl-4-O-(3 ',4'-0-izopropylidén-B-D-galaktopyranozyl)-3-D-glu-kopyranozid p-Nitrofenyl-4-0-(P-D-galaktopyranozyl)-P-D-glukopyranozid (23,2 g, 50 mmól) sa zmieša s dimetoxypropánom (400 ml) a katalytickým množstvom kyseliny (±)-camfer-10-sulfónovej (400 mg, 1,7 mmól). Po 3 dňoch pri teplote miestnosti sa reakcia skončí prídavkom trimetylamínu (240 μΐ, 1,7 mmól), vo vákuu sa zahustí a získaný zvyšok sa suší počas 2 hodín vo vákuu olejovej vývevy. Získaná kryštalická látka sa vyberie do zmesi metylalkoholu a vody 10 : 1 (500 ml) a varí sa počas 6 hodín pod spätným chladičom. Po zahustení vo vákuu a okamihovej chromatografii získaného zvyšku (dichlórmetán/metylalkohol 25 : 1 —> 10 :1, vždy s 0,5 % trietylamínu) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (15,2 g, 60 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), R_f = 0,49, t. t. = 253 až 255 °C (rozklad).

1.57. b)p-Nitrofenyl-2,3,6-tri-0-benzoyl-4-0-(2',6'-di-0-benzoyl-3',4'-0-izo-propylidén-B-D-galaktopyranozyl)-P-D-glukopyranozid

K roztoku zlúčeniny 1.57.a) (15,1 g, 30 mmól) v pyridíne (300 ml) sa pri teplote 0 °C pomaly prikvapká v priebehu 30 minút benzoylchlorid (50 ml, 430 mmól). Reakčná zmes sa nechá miešať počas 2 hodín pri teplote miestnosti a potom sa vleje za miešania do ľadovej vody (2000 ml). Po 15 minútach sa vyzrážané kryštály odfiltrujú a vyberú sa do dichlórmetánu (1 500 ml). Roztok sa potom premyje vodou (2 x 500 ml) a 1 N roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2 x 500 ml), organická fáza sa oddelí, vysuší sa pomocou bezvodého síranu horečnatého (50 g), zahustí sa vo vákuu a čistí sa kryštalizáciou z metylalkoholu. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (26,7 g, 87 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 50 1), R_f = = 0,49, [a] = + 23,6° (c = 1,O8/CH₂C1₂), 11. = 272 až 274 °C.

1.57. c) p-Nitrofenyl-2,3,6-tri-O-benzoyl-4-O-(2',6'-di-O-benzoyl-P-D-galakto-pyranozyl)-P-D-glukopyranozid

Roztok zlúčeniny 1.57.b) (20,5 g, 20 mmól) v dichlórmetáne (400 ml) sa zmieša s 99 % kyselinou trifluóroctovou (20 ml) a reakčná zmes sa mieša počas 20 minút pri teplote miestnosti. Potom sa premyje 1 N roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2 x 200 ml), organická fáza sa oddelí, vysuší sa pomocou bezvodého síranu horečnatého (10 g), zahustí sa vo vákuu a získaný zvyšok sa čistí prezrážaním zo zmesi dichlórmetánu a dietyléteru. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (18,0 g, 91 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 20 : 1), Rf= 0,18, t. t. = 234°C.

1.57. d) p-Nitrofenyl-2,3,6-tri-O-benzoyl-4-O-(2',6'-di-O-benzoyl-4'-O-acetyl-p-D-galaktopyranozyl)-P-D-glukopyranozid

Zlúčenina 1.57.c) (5,5 g, 5,6 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.51.a) a po okamihovej chromatografii (petroléter/etylacetát 3 : 1 —> 1 : 1) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (4,03 g, 70 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 20 : 1), Rf = 0,67, t. t. = 118°C.

1.57. d) p-Nitrofenyl-2,3,6-tri-O-benzoyl-4-O-(2',6'-di-O-benzoyl-3'-sulfát-4'-0-acetyl-B-D-galaktopyranozyl)-p-D-glukopyranozid, sodná soľ

Roztok zlúčeniny 1.57.d) (3,59 g, 3,5 mmól) v pyridíne (200 ml) sa zmieša s komplexom oxid sírový · pyridín (4,5 g, 28 mmól) a mieša sa najprv počas 2 hodín pri teplote °C a potom počas 16 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa reakcia skončí prikvapkaním metylalkoholu (50 ml) a reakčná zmes sa vo vákuu zahustí. Získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1). Získa sa takto pevný produkt, ktorý sa vyberie do zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu 1 : 1 (200 ml) a zmieša sa s Amberlite 1R120 (Na⁺-forma, 10 g). Táto zmes sa mieša počas jednu hodinu pri teplote miestnosti, prefiltruje sa a filtrát sa vo vákuu zahustí. Získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (3,64 g, 92 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 2 : 1), R_f = 0,87, t. t. = 168 °C.

1.57. f) p-Nitrofenyl-4-O-(3 ’-sulfát-p-D-galaktopyranozyl)-β-D-glukopyranozid, sodná soľ

Zlúčenina 1.57.e) (3,4 g, 3 mmól) sa rozpustí v absolútnom metylalkohole (150 ml), zmieša smetylátom sodným (200 mg) a mieša sa počas 7 hodín pri teplote 60 °C. Po ochladení na teplotu miestnosti sa neutralizuje pomocou Lewatitu SC108 (H⁺-forma) a potom sa prefiltruje. Hodnota pH filtrátu sa zvýši prikvapkaním 1 N hydroxidu sodného na pH 7 až 8, vo vákuu sa odparí a vyzrážaním zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru sa získa produkt vo forme ľahko nahnednutej kryštalickej látky (1,30 g, 77 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 2 : 1), Rf = 0,55, t. t. = 230 °C (rozklad).

1.57. p-Aminofenyl-4-O-(3 ’-sulfát-B-D-galaktopyranozyl)-β-D-glukopyranozid, sodná soľ

Uvedená zlúčenina (1,13 g, 2 mmól) sa redukuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po rozvarení s dietyléterom (50 ml) získa sa takto produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (983 mg, 92 %), DC (dichlórmetán/ metylalkohol 2:1), R_f = 0,22,1.1. = 176 °C (rozklad).

Príklad 1.58 p-Aminofenyl-4-O-(3'-O-metyl-P-D-galaktopyranozyl)^· -D-glukopyranozid

1.58.a) Selektívna metylácia p-nitrofenyl-4-O-(B-D- galaktopyranozyl)-p-D-glukopyranozidu p-Nitrofenyl-4-O-(p-D-galaktopyranozyl)-p-D-glukopyranozid (2,3 g, 5 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.25.a). Pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 20:1—>10:1—>5:l)sa získajú dva produkty:

Frakcia 1: p-nitrofenyl-2-O-metyl-4-O-(3'-O-metyl-B-D-galaktopyranozyl)-P-D-glukopyranozid, bezfarebné kryštály (264 mg, 11 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5:1), R_f = 0,46, [a]²⁰ = - 73,9° (c = 1,0/CH₃OH), 1.1. = 228 °C (rozklad).

Frakcia 2: p-nitrofenyl-4-O-(3'-O-metyl-B-D-galaktopyranozyl)-p-D-glukopyranozid, bezfarebné kryštály (1,0 g, 11 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), Rf = 0,29, [a]²⁰ = - 65,3° (c = 1,1/CHjOH), 1.1. = 220 °C.

1.58) p-Aminofenyl-4-O-(3 '-O-metyl-B-D-galaktopyranozyl)^-D-glukopyranozid

Frakcia 2 z príkladu 1.58.a) (955 mg, 2 mmól) sa redukuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po premytí dietyléterom (50 ml) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (894 mg, 100 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 :1), Rf = 0,08,11. = 129 °C (rozklad).

Príklad 1.59 p-Aminofenyl-2-O-metyl-4-O-(3'-O-metyl-B-D-galaktopyranozyl)-P-D-glukopyranozid

Frakcia z príkladu 1.58.a) (246 mg, 0,5 mmól) sa redukuje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24. Po premytí dietyléterom (50 ml) sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (186 mg, 81 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), R_f = 0,13, [a]²⁰ = - 3,6° (c = 1,0/CH₃OH),

1.1. = 105 °C.

Príklad 1.60 p-Aminofenyl-4-O-(3 ',4 ’-di-O-metyl-B-D-galaktopyranozyl)-P-D-glukopyranozid

1.60. a) p-Nitrofenyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2',6'-di-O-benzyl-3 ',4 '-0-izopro-pylidén-B-D-galaktopyranozyl)-p-D-glukopyranozid

Zlúčenina 1.57.á) (5,0 g, 10 mmól) sa nechá reagovať s benzylbromidom (30 ml, 250 mmól) rovnako, ako je opísané v príklade 1.26.c) počas 16 hodín. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok vyberie do etylesteru kyseliny octovej (300 ml) a získaný roztok sa premyje vodou (200 ml). Organická fáza sa oddelí, vysuší sa pomocou bezvodého síranu horečnatého (10 g), zahustí sa vo vákuu a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/petroléter 5 : 1 —> dichlórmetán). Získa sa takto produkt vo forme hnedavej olejovitej látky (5,3 g, 56 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 50 : 1), Rf = 0,70, [a]²⁰ = -23,2° (c = l,0/CH₂Cl₂).

1.60. b) p-Nitrofenyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2 ',6 '-di-O-benzyl-P-D-galaktopyranozyl)-p-D-glukopyranozid

Uvedená zlúčenina (4,77 g, 5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 1.57.c). Po zahustení vo vákuu a prezrážaní zo zmesi dietyléteru a petroléteru sa takto získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (3,94 g, 86 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 50 : 1), Rf=0,36,1.1. = 116 °C.

1.60. c)p-Nitrofenyl-2,3,6-tri-O-benzyl-4-O-(2',6'-di-O-benzyl-3 ',4 '-O-metyl-P -D-galaktopyranozyl)-P-D-glukopyranozid

Uvedená zlúčenina (1,8 g, 2 mmól) sa metyluje rovnako, ako je opísané v príklade 1.24.c). Po zahustení vo vákuu a prezrážaní zo zmesi dichlórmetánu a petroléteru sa získa produkt vo forme bezfarebnej kryštalickej látky (1,55 g, 82 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 50 : 1), Rf = = 0,74,1.1. = 161 až 162 °C.

1.60) p-Aminofenyl-4-O-(3',4'-di-O-metyl-B-D-galaktopyranozyl)-P-D-glukopyranozid

Zlúčenina 1.60.c) (1,41 g, 1,5 mmól) sa rozpustí v metylalkohole (50 ml) a po prídavku hydroxidu paladnatého na uhlí (vlhký, 20 % Pd, 500 mg) sa hydrogenuje počas 6 dní vo vodíkovej atmosfére za nepatrného pretlaku. Suspenzia sa prcfiltruje cez celíte a filtrát sa dôkladne premyje metylalkoholom (100 ml). Po zahustení filtrátu vo vákuu a premytí získaného zvyšku dichlórmetánom sa získa produkt vo forme hnedavej kryštalickej látky (425 mg, 61 %), 1.1. = 124 °C (rozklad).

Príklad 2.1.

N-Alanyl-batracylín

2.1 .a) N-[N-(terc.-Butoxykarbonyl)-alanyl]-batracylín

N-(terc.-Butoxykarbonyl)-alanín (3,3 g, 17,5 mmól) a 2-izobutoxy-1 -izobutoxykarbonyl-1,2-dihydro-chinolín (6,8 ml, 23 mmól) sa rozpustí v 100 ml dichlórmetánu. Po dvadsaťminútovom miešaní pri teplote miestnosti sa pridá roztok batracylínu (4,1 g, 16,5 mmól) v absolútnom dimetylformamide (350 ml) a vsádzka sa mieša počas 48 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa vo vákuu zahustí na objem 50 ml, doplní sa etylesterom kyseliny octovej na objem 300 ml a ihneď sa zahreje na 10 minút do varu. Potom sa nechá vychladnúť na teplotu miestnosti, prefiltruje sa a filtračný koláč sa znova vyvarí s etylesterom kyseliny octovej (200 ml). Ochladením za miešania na teplotu 0 °C a po filtrácii sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (6,18 g, 84 %), DC (etylacetát), R_f = 0,57, t t. = 246 až 247 °C (rozklad).

2.1) N-Alanyl-batracylín

Roztok zlúčeniny 2.1.a) (10,5 g, 25 mmól) vbezvodej kyseline trifluóroctovej (150 ml) sa mieša počas 15 minút pri teplote miestnosti. Po zahustení vo vákuu na objem 30 ml sa vsádzka za silného miešania vleje do nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (1 000 ml). Mieša sa ešte ďalej počas 10 minút, načo sa zmes premyje vodou, malým množstvom izopropylalkoholu a dietyléteru. Produkt vypadne vo forme žltej kryštalickej látky (7,15 g, 89 %), DC (etylacetát), R_f = 0,06, t. t. = 261 až 262 °C (rozklad).

Príklad 2.2.

N-(Lyzyl-alanyl)-batracylín, di-trifluóracetát

2.2.a) N-pf“¹, N^e’^BÍ10n -di(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-alanylj-batracylín

N,N-di-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzín (2,1 g, 6 mmól) a 2-izobutoxy-1 -izobutoxykarbonyl-1,2-dihydro-chinolín (2,4 ml, 8 mmól) sa rozpustí v 20 ml dichlórmetánu. Po dvadsaťminútovom miešaní pri teplote miestnosti sa pridá roztok zlúčeniny 2.1. (1,6 g, 5 mmól) v dimetylformamide (40 ml) a reakčná zmes sa mieša počas ďalších 16 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (petroléter/etylacetát 2:1-+1:1-+ etylacetát). Získa sa takto

SK 281785 Β6 produkt vo forme žltej kryštalickej látky (2,89 g, 89 %), DC (etylacetát), R_f = 0,52,1.1. = 203 až 204 °C.

2.2) N-(Lyzyl-alanyl)-batracylín, di-trifluóracetát

Suspenzia uvedenej zlúčeniny (2,6 g, 4 mmól) v dichlórmetáne (25 ml) sa zmieša s bezvodou kyselinou trifluóroctovou (10 ml) a získaný roztok sa mieša počas 30 minút pri teplote miestnosti. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok vykryštalizuje prídavkom dietyléteru (100 ml). Zrazenina sa potom odfiltruje a dôkladne sa premyje dietyléterom. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (2,68 g, 99 %), DC (etylacetát), R_f = 0,05,1.1. = 144 až 146 °C (rozklad).

Príklad 2.3.

N-(D-Alanyl)-batracylín

2.3 .a) N-(N-Benzyloxykarbonyl-D-alanyl)-batracylín

N-Benzyloxykarbonyl-D-alanín (3,9 g, 17,5 mmól) sa nechá reagovať a spracuje rovnako, ako je opísané v príklade 2.1.a). Získaná žltá kryštalická látka (6,4 g, 80 %) sa oddelí filtráciou a spojené filtráty sa po zahustení vo vákuu čistia pomocou okamihovej chromatografie (petroléter/etylacetát 3 :2 —>1:1). Získa sa takto ďalších 1,35 g produktu (17 %), DC (etylacetát), R_f = 0,45, [a]²⁰ = +75,1° (c = = 1,0/CH₂C1₂ + 0,5%C₃OH).

2.3) N-(D-Alanyl)-batracylín

Zlúčenina 2.3.a) (11,4 g, 25 mmól) sa rozpustí v 33 % roztoku bromovodíka v ľadovej kyseline octovej (100 ml). Po 30 minútach pri teplote miestnosti sa reakčná zmes vo vákuu zahustí na objem 30 ml, načo sa za silného miešania vleje do nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (1000 ml). Reakčná zmes sa mieša ďalších 10 πιίηΰζ produkt sa odfiltruje a premyje sa vodou, malým množstvom izopropylalkoholu a dietyléterom. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (7,87 g, 98 %), DC (etylacetát), R_f = 0,06,1.1. = 267 °C (rozklad).

Príklad 2.4

N-[N^ídfa-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-batracylín

2.4.a) N-fN^ -(terc.-Butoxykarbonyl)-N'^ps'^lo° -(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-batracylín

N“¹⁶¹ -(terc.-Butoxykarbonyl)-N^cpsllon -(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl (5,3 g, 11,3 mmól) a 2-izobutoxy-l-izobutoxykarbonyl-l,2-dihydro-chinolín (4 ml, 14 mmól) sa rozpustí v 40 ml dichlórmetánu. Po dvadsaťminútovom miešaní pri teplote miestnosti sa pridá roztok zlúčeniny 2.3. (3,2 g, 10 mmól) v dimetylformamide (80 ml) a reakčná zmes sa mieša počas ďalších 16 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa suspenduje v dichlórmetáne (100 ml). Získaná suspenzia sa doplní dietyléterom na objem 300 ml. Po odfiltrovaní a premytí filtračného koláča dietyléterom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (5,65 g, 65 %), DC (etylacetát), R_f = = 0,45,1.1. = 186 °C.

2.4) N-[N^alfa -(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-batracylín

Uvedená zlúčenina (5,6 g, 7,3 mmól) sa rozpustí v dimetylformamide (50 ml). Po prídavku piperidínu (50 ml) sa mieša počas 3 hodiny pri teplote miestnosti, potom sa vo vákuu zahusti a získaný zvyšok sa čisti pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 :3 : 0,1 —> 15: 5 : 0,1). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (2,5 g, 62 %), 1.1. = 217 °C (rozklad).

Príklad 2.5 N-[N^aHa-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-

2.5.a) N-jN“¹⁰¹ -(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)- N'’’⁵'¹“ -(terc.-butoxykarbonyl)ly-zyl-D-alanyl]-batracylín

N^alfa-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-N'^psil°”-(terc.-butoxykarbonyl)-lyzín (5,3 g, 11,3 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané v príklade 2.4.a). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (7,0 g, 80 %), DC (etylacetát), R_f= 0,51,1.1 = 223 °C.

2.5) N-[N^dfk -(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanylj-batracylín, trifluór-acetát

Zlúčenina 2.5.a) (6,17 g, 8 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 2.2. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok vyzráža zo zmesi dichlórmetánu a dietyléteru a produkt sa získa vo forme žltej kryštalickej látky (6,08 g, 97 %), DC (etylacetát), R_f = 0,05,11 = 224 °C (rozklad).

Príklad 2.6.

N-[N^eps,lon -(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-batracylin,trifluóracetát

Zlúčenina 2.4.a) (6,17 g, 8 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 2.2. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok vyzráža zo zmesi dichlórmetánu a dietyléteru a produkt sa získa vo forme žltej kryštalickej látky (5,97 g, 95 %), DC (etylacetát), Rf= 0,04,11 = 188 °C (rozklad).

Príklad 2.7.

N-(Lyzyl-D-asparagyl)-batracylín, di-trifluóracetát

SK 281785 Β6

2.7. a) N-[N-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-D-asparagyl-(P-terc.-butylester)]-batracylín

N-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-D-asparagyl-(P-terc.-butylester) (7,2 g, 17,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 2.1. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok vyberie do dichlórmetánu (1 000 ml) a premyje sa 1N kyselinou chlorovodíkovou (2 x 200 ml) a 1 N roztokom hydrogenuhličitanu sodného (1 x 200 ml). Po vysušení pomocou bezvodého síranu horečnatého (20 g), filtrácii, zahustení na objem 100 ml a prídavku petroléteru vypadne zlúčenina 2.7.a) vo forme žltej kryštalickej látky (9,7 g, 86 %), DC (etylacetát), R_f = 0,71,1.1. = 195 °C.

2.7. b)N-[D-asparagyl)-(P-terc.-butylester)]-batracylín

Uvedená zlúčenina (6,4 g, 10 mmól) sa rozpustí v dichlórmetáne (100 ml). Po prídavku morfolínu (50 ml) sa reakčná zmes mieša počas 5 hodín pri teplote miestnosti, potom sa vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/petroléter 4 : : 1 -> etylacetát -> etylacetát/etylalkohol 109 : 1). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (3,44 g, 82 %), DC (etylacetát), R_f = 0,21,1.1. = 209 °C.

2.7. c) N-jN“¹⁶ , N^eps,lon -di-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-D-asparagyl-(P-terc.-butylester)] -batracylín

Zlúčenina 2.7.b) (2,1 g, 5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 2.2.a). Produkt sa získa vo forme žltej kryštalickej látky (1,71 g, 46 %). DC (etylacetát), R_f= 0,61,11. = 142 °C.

2.7. N-(Lyzyl-D-asparagyl)-batracylín, di - trifluóracetát

Zlúčenina 2.7.c) (1,65 g, 2,2 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané v príklade 2.2. Produkt sa získa vo forme žltej kiyštalickej látky (1,5 g, 95 %), DC (metylalkohol/kyselina octová 10 : 1), Rf = 0,29,1.1. = 154 až 155 °C (rozklad).

Príklad 2.8.

N-(Lyzyl-D-glutamyl)-batracylín, di-hydrobromid

2.8. a) N-[N-(terc.-Butoxykarbonyl)-D-glutamyl-(3-benzylester)]-batracylín

N-(terc.-Butoxykarbonyl)-D-glutamyl-(p-benzylester) (5,9 g, 17,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 2.1.a). Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok čistí pomocou okamihovej chromatografie (pctroléter/etylacetát 1:1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (9,45 g, 95 %), DC (etylacetát), R_f = 0,61, [a]²⁰ = + 53,1° (c = l,0/CH₂Cl₂), 1.1. = 159 °C.

2.8. b) N-[D-Glutamyl-(p-benzylester)]-batracylín

Zlúčenina 2.8.a) (9,1 g, 10 mmól) sa rozpustí v kyseline mravčej (100 ml) a roztok sa mieša počas 6 hodín pri teplote miestnosti. Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok vyberie do metylalkoholu (100 ml) a hodnota pH roztoku sa upraví opatrným prídavkom 25 % vodného roztoku amoniaku na 8. Po novom zahustení vo vákuu a nasledujúcej okamihovej chromatografii (etylacetát/etylalkohol 10 : 1) sa získa produkt vo forme žltej olejovitej kvapaliny (4,2 g,

%), DC (etylacetát), R_f= 0,06.

2.8. c) N-[N^alfa , N“^¹⁰ -di-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-D-glutamyl- (P-benzyl-ester)]-batracylín

Uvedená zlúčenina (3,75 g, 8 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané v príklade 2.2.a). Produkt sa získa vo forme žltej amorfnej látky (2,26 g, 35 %), DC (etylacetát), R_f = 0,40, [á]²⁰ = + 32,1° (c = 1,2/CH₂C1₂).

2.8. N-(Lyzyl-D-glutamyl)-batracylín, di-hydrobromid

Zlúčenina 2.8.c) (2,0 g, 2,5 mmól) sa rozpustí v 33 % roztoku bromovodíka v ľadovej kyseline octovej (50 ml). Po jednej hodine pri teplote miestnosti sa reakčná zmes vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa dôkladne premyje dietyléterom. Produkt sa vyzráža vo forme žltočervených kryštálov (1,63 g, 98 %), 1.1. = 207 až 209 °C (rozklad).

Príklad 2.9

N-[Lyzyl-glycyl]-batracylín, di-trifluóracetát

2.9. a)N-[N-(terc.-Butoxykarbonyl)-glycyl]-batracylín

N-(terc.-Butoxykarbonyl)-glycín (3,07 g, 17,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade

2.1. a). Po 3 dňoch pri teplote miestnosti sa reakčná zmes vo vákuu odparí a získaný zvyšok sa vyberie do etylalkoholu (200 ml). Po tridsaťminútovom miešaní za varu pod spätným chladičom a filtrácii po ochladení sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (4,73 g, 66 %). DC (etylacetát), Rf= 0,44,1.1. = 279 °C.

2.9. b) N-Glycyl-batracylín, hydrochlorid

Uvedená zlúčenina (4,1 g, 10 mmól) sa za zahriatia rozpustí v ultrazvukovom kúpeli v dichlórmetáne (1200 ml). Po prídavku chlorovodíka v dietylétere (100 ml) sa reakčná zmes mieša počas 30 minút pri teplote miestnosti, potom sa vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa zmieša s etylalkoholom (200 ml). Po desaťminútovom miešaní za varu pod spätným chladičom a filtrácii po ochladení sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (3,21 g, 94 %),

1.1. =297 až 299 °C (rozklad).

2.9. C) N-[N* , N“⁵¹¹⁰ -di-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-glycylj-batracylín

N,N-di-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzín (2,1 g, 6 mmól) a 2-izobutoxy-1 -izobutoxykarbonyl-1,2-dihydro-chinol ín (2,4 ml, 8 mmól) sa rozpustí v 20 ml dichlórmetánu. Po dvadsaťminútovom miešaní pri teplote miestnosti sa pridá roztok zlúčeniny 2.9.b) (1,71 g, 5 mmól), etyldiizopropylamínu (0,86 ml, 5 mmól) a dimetylformamidu (40 ml) a reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/petroléter 1:1-¼ etylacetát). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (1,69 g, 53 %), DC (etylacetát), Rf = 0,31,

1.1. = 211 °C (rozklad).

2.9. N-[Lyzyl-glycyl]-batracylín, di-trifluóracetát

Uvedená zlúčenina (1,4 g, 2,2 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané v príklade 2.2. Produkt sa získa vo forme žltej kiyštalickej látky (1,33 g, 91 %), 1.1. = = 153 °C (rozklad).

Príklad 2.10.

G26GN-[Lyzyl-seryl]-batracylín, di-trifluóracetát

2.10. a) N-[N-(terc.-Butoxykarbonyl)-seryl]-batracylín

N-(terc.-Butoxykarbonyl)-serín (3,6 g, 17,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ak je opísané v príklade 2.1.a). Po 48 hodinách pri teplote miestnosti sa reakčná zmes vo vákuu odparí na objem 100 ml a získaný zvyšok sa zmieša s 2 1 dichlórmetánu. Získaný roztok sa premyje vodou (1 x x 500 ml), 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou (2 x 250 ml) a nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (1 x 250 ml). Po vysušení pomocou bezvodého síranu horečnatého (50 g), oddestilovaní rozpúšťadla vo vákuu a okamihovej chromatografii získaného zvyšku (petroléter/etylacetát 1 : : 1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (4,6 g, 64 %), DC (etylacetát/kyselina octová 100 : 1), R_f = 0,38, t. t. = 219 °C (rozklad), [a]²⁰ = - 61,0 ° (c = 0,5/CH₂Cl₂) + + 0,5%CH_}OH).

2. lO.b) N-Seryl-batracylín, hydrochlorid

Suspenzia uvedenej zlúčeniny (4,6 g, 10,4 mmól) v dioxáne (70 ml) sa za miešania zmieša s koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (10 ml) a potom sa reakčná zmes mieša počas 60 minút pri teplote miestnosti, načo sa vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa suší počas 2 hodín za vákua olejovej vývevy. Po prídavku etylalkoholu (100 ml) sa mieša za varu pod spätným chladičom počas 15 minút. Po ochladení a filtrácii sa získa produkt vo forme oranžovej kryštalickej látky (1,97 g, 96 %), DC (etylacetát), R_f = 0,05, [a]²⁰ = + 51,8° (c = l,0/H₂O), 1.1. > 270 °C (rozklad).

2.10. c) N-[N^aIfa , N^cpsilon -di-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-serylj-batracylín

Zlúčenina 2.10.b) (1,86 g, 5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je uvedené v príklade 2.9.c). Po okamihovej chromatografii (etylacetát/petroléter 2 : 1 —> etylacetát) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (1,18 g, 36 %), DC (etylacetát/kyselina octová 100 : 1), Rf= 0,24, t. t. = 188 °C (rozklad), [á]²⁰ = -13,1° (c = 0,5/CH₂Cl₂ + 0,5 % CHjOH).

2.10. N-[Lyzyl-seryl]-batracylín, di-trifluóracetát

Uvedená zlúčenina (1,0 g, 1,5 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané v príklade 2.2. Produkt sa získa vo forme žltej kryštalickej látky (1,0 g, 96 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,10,1.1. = 188 až 190 °C (rozklad).

Príklad 2.11

N-[Lyzyl-D-seryl]-batracylín, di-hydrobromid

2.11 .a) N-[N-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-O-(terc.-butyl)-D-seryl]-batracylín

N-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-0-(terc.-butyl)-D-se rín (6,7 g, 17,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 2.1.a). Po zahustení vo vákuu a okamihovej chromatografii získaného zvyšku (petroléter/etylacetát 1 : 1) sa získa zlúčenina 2.1 l.a) (5,64 g, 52 %) vo forme žltej kryštalickej látky, DC (dichlórmetán/metylalko-hol/amoniak (25 %) 15:3:0,2), Rf = 0,87, t. t. = 225 až 226 °C (rozklad).

2.11 .b) N-[O-(terc.-Butyl)-D-seryl]-batracylín

Uvedená zlúčenina (2,89 g, 4,7 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 2.7.b). Po zahustení vo vákuu a okamihovej chromatografii získaného zvyšku (petroléter/etylacetát 3: 2 -» etylacetát) sa získa zlúčenina

2.1 l.b) (1,15 g, 62 %) vo forme žltej kryštalickej látky, DC (etylacetát), R_f =0,11,1.1. = 197 °C.

2.11. c) N-fN¹¹⁶ , Ν'¹®¹¹⁰¹¹ -di-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-O-(terc.-butyl)-D-seryl]-batracylín

Uvedená zlúčenina (1,1 g, 2,8 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je uvedené v príklade 2.2.a). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (1,94 g, 96 %), DC (etylacetát), R_f = 0,59,1.1. = 208 °C.

2.11. d) N-[Lyzyl-O-(terc.-butyl)-D-seryl]-batracylín, di-trifluóracetát

Uvedená zlúčenina (1,08 g, 1,5 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je uvedené v príklade 2.2. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (1,1 g, 98 %), DC (metylalkohol/kyselina octová 10 : 1), Rf= 0,30, t. t. = 128 °C.

2.11) N-[Lyzyl-D-seryl]-batracylín, di-hydrobromid

Uvedená zlúčenina (1,05 g, 1,4 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je uvedené v príklade 2.8. Získa sa takto produkt vo forme žltočervenej kryštalickej látky (846 mg, 96%), 1.1. = 247-248 °C.

Príklad 2.12

N-[Lyzyl-D-treonyl]-batracylín, di-hydrobromid

2.12. a) N-[N -(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)- O-(terc.-butyl)-D-treonyl]- batracylín

N-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-O-(terc.-butyl)-D-treonín (6,96 g, 17,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 2.1.a). Po zahustení vo vákuu a okamihovej chromatografii získaného zvyšku (petroléter/etylacetát 1 :1) sa získa zlúčenina 2.12.a) (7,45 g, 68 %) vo forme žltej kryštalickej látky, DC (etylacetát), Rf = 0,63, t. t. = = 225 až 226 °C.

2.12. b) N-[O-(terc.-Butyl)-D-treonyl]-batracylín

Uvedená zlúčenina (3,8 g, 6 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 2.7.b). Po zahustení vo vákuu sa získa zlúčenina 2.1 l.b) (1,9 g, 78 %) vo forme žltej kryštalickej látky, DC (etylacetát), R_f = 0,21, t. t. = = 110ažlll°C.

2.12. C) N-[N^alfa .N'f’”¹™ -di-(tere.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-0-(terc.-butyl)-D-treonylj-batracylín

Uvedená zlúčenina (1,8 g, 4,5 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je uvedené v príklade 2.2.a). Získa sa takto

SK 281785 Β6 produkt vo forme žltej kryštalickej látky (2,6 g, 79 %), DC (etylacetát), R_f = 0,59,1.1. = 212 °C.

2.12.d) N-[Lyzyl-0-(terc.-butyl)-D-treonylJ-batracylín, di-trifluóracetát

Uvedená zlúčenina (2,5 g, 3,4 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je uvedené v príklade 2.2. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (2,5 g, 96 %), DC (metylalkohol/kyselina octová 10: 1), Rf = 0,30, t. t. = 142 °C (rozklad).

2.12) N-[Lyzyl-D-treonyl]-batracylín, di-hydrobromid

Uvedená zlúčenina (2,29 g, 3 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je uvedené v príklade 2.8. Získa sa takto produkt vo forme žltočervenej kryštalickej látky (1,86 g, 97 %), 11. = 232 °C (rozklad).

Príklad 2.13

N-[Lyzyl-D-alanyl]-batracylín, di-trifluóracetát

2.13.a) N-[N^dfa , Ν'¹™¹⁰” -bis-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-batracylín g (17,3 mmól) N^{a a},N^epsilon-bis-(terc.-butoxykarbonyl)-lyzínu sa rozpustí v 75 ml dimetylformamidu a pri teplote 0 °C sa zmieša s 3 g (26 mmól) N-hydroxysukcinimidu a 4,29 g (20,8 mmól) N,N'-dicyklohexylkarbodiimidu. Po 3 hodinách sa vytvorená močovina odfiltruje, k filtrátu sa pridá 5 g (15,6 mmól) N-[D-alanyl]-batracylínu (pr. 2.3) a reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote 20 °C. Potom sa odfiltruje ešte zvyšná močovina, filtrát sa zahustí a získaný zvyšok sa rozmieša s metylalkoholom a znova prefiltruje. Filtrát sa znova zahustí a spracuje metylalkoholom. Opäť sa prefiltruje a filtračné koláče sa spoja, načo sa rozpustia v zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu 10 : 1 a vyzrážajú sa dietyléterom. Získa sa takto 8,22 g (81 %) kryštalického produktu.

2.13 N-[Lyzyl-D-alanyl]-batracylín, di-trifluóracetát

Z 8,2 g zlúčeniny 2.13.a) sa analogicky, ako je opísané v príklade 2.2. získa 7,58 g (89 %) produktu.

Príklad 2.14

N-[N^cps,lon -(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl]-batracylín, trifluóracetát

2.14.a) N-IN^³ -(terc.-Butoxykarbonyl)-N^epsll°ⁿ-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)- lyzylj-batracylín

Príprava sa vykonáva analogicky, ako je opísané v príklade 2.4.a) z N“™ - (terc.-butoxykarbonyl)-N'^ps,l°^,’-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzínu a batracylínu. Výťažok je 78 %.

2.14. N-[N^qMil°ⁿ-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl]-batracylín, trifluóracetát

Príprava sa vykonáva analogicky, ako je opísané v príklade 2.5. zo zlúčeniny z príkladu 2.14.a). Výťažok je 90 %.

Príklad 2.15

N-[Lyzyl-N'^pslton-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl]-batracylín, di-trifluóracetát

2.15.a) N-[N^dfa , ν’¹”¹¹⁰ -di-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-N^eps'^lo-(íl_Uo_renyl-9-metoxyk_arbo_nyl)-ly_Zyl-b_atr_acyíín

3240 mg (4,54 mmól) zlúčeniny 2.14. sa rozpustí v 50 ml dimetylformamidu a zmieša sa s 2 550 mg (5,45 mmól) N“’®*, N^epsll°ⁿ -di-(terc.-butoxykarbonyl)-lyzín-p- nitrofenylesteru a s 938 μΐ etyldiizopropylamínu. Reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote 20 °C, načo sa zahustí a získaný zvyšok sa rozmieša s dietyléterom. Zmes sa prefiltruje a zvyšok na filtri sa ešte raz rozmieša so zmesou metylalkoholu a dietyléteru 1 : 1. Po odsatí a vysušení sa takto získa 3 811 mg (92 %) produktu.

2.15) N-[Lyzyl-N^epslIon-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl]-batracylín,di-trifluór-acetát

Deblokácia zlúčeniny 2.15.a) pomocou zmesi bezvodej kyseliny trifluóroctovej a dichlórmetánu 1 : 1 sa vykoná analogicky, ako je opísané v príklade 2.2. s výťažkom 95 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 6 : : 0,6, Rf = 0,08.

Príklad 2.16 N-[Lyzyl-N^beta-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-ň,p-diaminopropionyl]- batracylín,di-trifluóracetát

Tento peptidový konjugát sa vyrobí analogicky, ako je opísané v príkladoch 2.14. a 2.15. cez štyri stupne z batracylínu a N^alfh-(terc.-butoxykarbonyl)-N^beta -(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-diaminopropiónovej kyseliny, DC (dichlórmetán/ metylalkohol/fadová kyselina octová 5:1: : 0,2), R_f'= 0,15.

SK 281785 Β6

Príklad 2.17

Odštepenie Fmoc sa vykonáva analogicky, ako je opísané v príklade 2.4. z N-fN⁶¹“¹¹“¹ -(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl]-batracylín trifluóracetátu (príklad 2.14). Výťažok je 65 %.

Príklad 2.18

N-[Seryl-D-alanyl]-batracylín, trifluóracetát

2.18.a) N-[N-(terc.-Butoxykarbonyl)seryl-D-alanyl]-batracylín

Príprava prebieha analogicky, ako je uvedené v príklade 2.13.a) zN-(terc.-butoxykarbonyl)-serínu a N[D-alanyl]-batracylínu (príklad 2.3)). Výťažok je 77 %.

2.18) N-[Seryl-D-alanyl]-batracylín, trifluóracetát

Príprava prebieha analogicky, ako je uvedené v príklade 2.2. zo zlúčeniny 2.18.a). Výťažok je 98 %.

Príklad 2.19

N-[-D-Alanyl-D-alanyl]-batracylín, trifluóracetát

Príprava prebieha v dvoch stupňoch analogicky, ako je opísané v príklade 2.18.

Príklad 2.20

N-[Glutamyl-D-alanyl]-batracylín

COOH

Príprava prebieha v dvoch stupňoch analogicky, ako je opísané v príklade 2.18., keď sa vychádza zN-terc.-butoxykarbonyl-glutamyl-5-terc.-butylesteru a N-(D-alanyl)-batracylínu (príklad 2.3)). Po odštepeni Boe sa reakčná zmes zahustí, získaný zvyšok sa vyberie do vody, hodnota pH sa upraví pomocou 0,1 N hydroxidu sodného na 7 a betaín sa odsaje.

Príklad 3.1-3.34

Všeobecný vzorec

Príklad 3.1. N-{N^cpsll°ⁿ-[O-(P-L-Fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzy 1-D-alany 1} -batracy lín

3.1 .a) N- {N^alfi-(terc.-Butoxykarbonyl)-N'^ps'^lM-[0-(p-L-fúkozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl)-batracylín mg (0,22 mmól) p-aminofenyl-P-L-fukozidu sa v 10 ml zmesi dioxánu a vody 1 : 1 za miešania zmieša s tiofosgénom (34 μΐ, 0,44 mmól). Po 10 minútach sa reakčná zmes zahustí vo vákuu a získaný zvyšok sa suší počas jednu hodinu za vysokého vákua. Získaná olejovitá látka sa potom v absolútnom dimetylformamide kopuluje so 109 mg (0,21 mmól) N-[N^alfa-(terc.-butoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-batracylínom (príklad 2.4)) za prítomnosti 115 μί etyldiizopropylamínu. Po dvojnásobnom vyzrážaní surového produktu zo zmesi metylalkoholu a izopropylalkoholu sa získa 132 mg (75 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (dichlórmetán/metylalkohol 9 :1), Rf = 0,15.

3.1.N-{N^eps''°”-[O-(P-L-Fukozyl)-4-hydroxy-fenylaniino-tiokarbonylj-lyzy 1-D-alanyl} -batracy lín

127 mg (0,15 mmól) zlúčeniny z príkladu 3.1.a) sa v 10 ml dichlórmetánu mieša so 6 ml bezvodej kyseliny trifluóroctovej počas 2 hodín pri teplote 0 °C. Reakčná zmes sa potom zahustí, trikrát sa destiluje s 5 ml dichlórmetánu a chromatograflije sa s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : 0,2. Po nasledujúcej lyofilizácii sa získa 80 mg (71 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 4 : : 0,4), R, = 0,3.

Analogicky, ako je opísané v príklade 3.1. sa z čiastočne chráneného peptidového konjugátu z príkladu 2.4., prípadne z analogicky vyrobeného izomémeho N{N^-íterc.-butoxykarbonyl)-lyzyl-alanyl]-batracylínu vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 3.2 N-{N^eps'^toll-[O-(2-O-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.1.

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5 a konečného stupňa dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 2 : 0,2, výťažok: 55 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), Rf = 0,4.

Príklad 3.3 N-{N'^ps,lon-[O-(2-O-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl--alanyl} -batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.1.

Čistenie medzistupňa pomocou zrážania zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru a konečného stupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 2 : 0,2, výťažok: 65 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 5 : 2 : 0,2), R_f = 0,21.

Príklad 3.4 N-{N^{cp l}°ⁿ-[O-(3-O-Metyl-p-L-fiikozyl)-4-hydroxy-ťenylamino-tiokarbonyl]-lyzy 1-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.2.

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 97,5 :

: 2,5 a zrážanie konečného stupňa z metylalkoholu pomocou dietyléteru, výťažok: 59 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak 15 : 2 : 0,2), R_f = 0,19.

Príklad 3.5 N-{N'^psllon-[O-(3-O-Metyl-3-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-alanyl)-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.2.

Čistenie medzistupňa pomocou zrážania zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 :1 pomocou dietyléteru a konečného stupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 2 : 0,2, výťažok: 36 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 5:2:0,2), R_t= 0,57.

Príklad 3.6 N-{N'^psll0n-[O-(3-O-Metyl-a-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.3.

Čistenie medzistupňa pomocou zrážania z metylalkoholu pomocou dietyléteru a konečného stupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : 0,2, výťažok: 44 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 5 : :2:0,2), R_f=0,15.

Príklad 3.7 N-{N'^ps,lon-[0-(3-0-Dezoxy-P-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl)-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.6.

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5 a zrážanie konečného stupňa z metylalkoholu pomocou dietyléteru, výťažok: 35 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_r= 0,42.

Príklad 3.8 N-{N^epsilon-[O-(3,4-Epoxy-3-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.8.

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5 a viacnásobné zrážanie konečného stupňa z metylalkoholu pomocou dietyléteru a nasledujúce rozmiešanie s etylesterom kyseliny octovej, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1:0,2), R_f = 0,49.

Príklad 3.9 N-{N'^ps,l°”-[O-(3,0-Karboxymetyl-P-L-íukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, sodná soľ

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.10.

Čistenie medzistupňa rozmiešaním v metylalkohole a zrážaním pomocou dietyléteru a konečného stupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 3 : 0,3 neskôr v rovnakom systéme 15:6: 0,6. Zodpovedajúce frakcie sa zahustia, vyberú sa do vody a hodnota pH sa upraví pomocou 0,1 N hydroxidu sodného na 7. Odsaje sa, zvyšok na filtri sa vyberie do zmesi dimetylformamidu a vody 1:3a pridá sa ekvivalent 0,1 N hydroxidu sodného. Potom sa zmes zahustí, sodná soľ sa vyberie do vody a lyofilizuje sa. Výťažok: 43 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :4 : 0,5), R_f= 0,15.

Príklad 3.10 N-(N^epsllt>n-[O-(3,0-Karbamoylmetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, sodná soľ

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.18.

Čistenie medzistupňa rozmiešaním v metylalkohole a zrážaním pomocou dietyléteru a konečného stupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : 0,2, DC (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 3 : 0,3), R_f = 0,38,1.1. = 190 °C (rozklad).

Príklad 3.11 _N.|_Nq»iion-[_O-(₄,0-Metyl-P-L-fukozvl)-4-hydrox_y-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín, acetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.4.

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 95 : 5 a konečného stupňa pomocou zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %). Po zahustení sa získaný zvyšok zmieša s ekvivalentom ľadovej kyseliny octovej a 10 ml vody a lyofilizuje sa. Výťažok: 52 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), Rf = 0,4.FAB-MS: m/z = 760 = M + 1.

Príklad 3.12 N-{N^epsll°^I1-[0-(a-D-Glukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: p-aminofenyl-a-glukozid

Čistenie medzistupňa i konečného stupňa rozmiešaním v metylalkohole a zrážaním pomocou dietyléteru. Výťažok: 83 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 ; 8 : 0,8), R_f= 0,48.

Príklad 3.13 N-(N^eps,k>n-[O-(a-D-Glukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: p-aminofenyl-a-glukozid

Výroba prebieha analogicky, ako je uvedené v príklade 3.12.

Príklad 3.14 N-{N^epsll°ⁿ-[O-(3-O-Metyl-P-D-galaktop_yranozyl)-4-h_ydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

3.14.a) N- {N^ií&-(terc.-Butoxykarbonyl)-N^eprilon-[O-(3-O-metyl-3-D- galaktopyra-nozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]- lyzy 1-D-alany 1} -batracylín

Roztok zlúčeniny 1.25 (62,8 mg, 0,22 mmól) v zmesi dioxánu a vody 1 : 1 sa za miešania zmieša s tiofosgénom (33,5 ml, 0,44 mmól). Po 10 minútach sa zmes zahustí vo vákuu a získaný zvyšok sa suší počas jednu hodinu vo vákuu olejovej vývevy. Získaný izotiokyanát sa rozpustí v absolútnom dimetylformamide (10 ml) a zmieša sa so zlúčeninou 2.4 (109,7 mg, 0,2 mmól) a s etyldiizopropylamínom (0,5 ml). Reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti, potom sa vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 20 : 1). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (108,3 mg, 62 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), Rf = 0,42, t. t. = 194 až 195 °C (rozklad).

3.14) N- {N^epsllon-[0-(3-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín, trifluóracetát

Zo zlúčeniny 3.14.a) (105,1 mg, 0,12 mmól) sa odštepí analogicky, ako je opísané v príklade 2.2 terc.-butoxykarbonylová skupina. Po zahustení vo vákuu a prezrážam zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (57,4 mg, 54 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), R_f = 0,16,1.1. = 188 až 189 °C (rozklad).

Analogicky, ako je opísané v príkladoch 3.14.a) a 3.14. sa z peptidového konjugátu 2.4 (vždy 109,7 mg, 0,2 mmól) vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 3.15 N-{N^eps,bn-[0-(-D-Galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl)-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.23 (59,7 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (79,5 mg, 46 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,74,1.1. = 182 °C.

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (77,1 mg, 44 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,27,1.1. = 191 až 192 °C (rozklad).

Príklad 3.16 N-{N^ep,lto-[O-(3,4-di-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.31 (79 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografle s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 30 : : 1 —► 20 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (150,7 mg, 85 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1), R_f = 0,35,1.1. = 197 až 199 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (137 mg, 76 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1), Rf = 0,13,1.1. = 184 až 186 °C (rozklad).

Príklad 3.17 N-{N^ep5,ton-[0-(3-0-Metoxykarbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl)-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.42 (75,5 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 30 : : 1 —> 25 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (124,1 mg, 66 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,50,1.1. = 165 °C.

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (107 mg, 57 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 4 : 1), R_f = 0,53, t. t. = 183 °C (rozklad).

Príklad 3.18

N-{N^qKll°''-[O-(3-O-Karbonylmetyl-P-D-galaktopyTanozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: zlúčenina z príkladu 1.43 (77,3 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou zrážania s použitím zmesi etylalkohol/ dietyléter poskytne sodnú soľ vo forme žltej kryštalickej látky (172 mg, 91 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,71,11. = 225 až 228 °C.

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (136,5 mg, 73 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,12,1.1. = 217 až 220 °C (rozklad).

Príklad 3.19 N-{N^ep81l°”-[O-(3-O-Karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.44 (72,2 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (137,7 mg, 75 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 4 : 1), R_f = - 0,41,11. = 198 až 201 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (140,2 mg, 75 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 4 : 1), Rf = 0,16,1.1. = 188 až 190 °C (rozklad).

Príklad 3.20 N-{N^qsll0n-[O-(3-O-(N-Metyl-karbamoylmetyl)-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanylj-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.45 (75,3 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 7 : 1 : 0,1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (158,4 mg, 85 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,25, t. t. = 161 až 163 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (132,5 mg, 70 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = = 0,10,11. = 191 až 193 °C (rozklad).

Príklad 3.21 N-{N'^ps,1°’-[O-(3-O-(N-Propyl-karbamoylmetyl)-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.46 (81,5 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 8 : 1 : 0,1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (153,1 mg, 80 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 :0,2), Rf = 0,33, t. t. = 187 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (154,9 mg, 79 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), Rf= 0,2,

1.1. = 179 °C.

Príklad 3.22. N-(N'^psll°ⁿ-[O-(3-O-(N-Butyl-karbarnoylmetyl)-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanylj-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.47 (84,6 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 12 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (132,7 mg, 68 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15:3: 0,2), R_f= 0,54,1.1. = 180 až 182 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (115,2 mg, 58 %), DC (dichlórmetán/metylalkohoí/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = = 0,30,1.1. = 176 °C.

Príklad 3.23 N-(N^cps,lon-[0-(3,4-Didezoxy-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.52 (52,6 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 25 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (127,4 mg, 77 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15:3: 0,2), R_f= 0,60,1.1. = 166 až 167 °C.

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (103,1 mg, 61 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = = 0,44,1.1. = 173 až 175 °C (rozklad).

Príklad 3.24 N-(N^epsilon-[O-(6-O-Acetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.53 (78,2 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 25 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (88,3 mg, 49 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 4 : 1), R_f = = 0,61,1.1. = 196 až 199 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (89,6 mg, 49 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 4 : 1), Rf = 0,31, 1.1. = 186 °C (rozklad).

Príklad 3.25 N-{N^eiR'¹°”-[0-(a-D-Manopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.39 (59,7 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesí dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (101,7 mg, 59 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,79, t. t. = 180 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (103,1 mg, 59 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,34,1.1. = 177 až 178 °C (rozklad).

Príklad 3.26

N-{N^cps'^lon-[0-(3-0-Metyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.40 (62,8 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 20 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (56,6 mg, 32 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), R_f = = 0,38,1.1. = 191 až 192 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (46,6 mg, 26 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), R_f = 0,13,1.1. = 190 až 191 °C (rozklad).

Príklad 3.27 N-{N^epsll°ⁿ-[O-(2,3-di-O-Metyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.41 (66 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 25 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (77,8 mg, 44 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 4 : 1), R_t = = 0,65,1.1. = 182 až 183 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (66,1 mg, 37 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 4 :1), Rf = 0,40,1.1. = 181 °C.

Príklad 3.28 N-{N^epsll°-[O-(3-O-Metoxykarbonylmetyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.48 (75,5 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 18:1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (62,1 mg, 33 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,66,1.t. = 165 °C.

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (57,6 mg, 30 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = = 0,43,1.1. = 183 až 184 °C.

Príklad 3.29 N-{N^epsll°ⁿ-[0-(3-0-Karboxymetyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.49 (77,3 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou zrážania zo zmesi etylalkoholu a dietyléteru poskytne sodnú soľ vo forme žltej kryštalickej látky (173,4 mg, 92 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,57,1.1. = 201 až 205 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (171,7 mg, 92 %), DC (metylalkohol), Rf = 0,29,1.1. = 196 až 198 °C (rozklad).

Príklad 3.30 N-{N^epsllon-[0-(3-0-Karbamoylmetyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}•batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.50 (72,2 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1 poskytne produkt vo forme žltej kryštalickej látky (106,6 mg, 58 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 4 : 1), Rf = = 0,34,1.1. = 192 až 194 °C.

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.14, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (107,7 mg, 58 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 4 :1), R_f = 0,13,1.1. = 186 až 187 °C.

Príklad 3.31

N- {N'^psllo-[O-(3,4-di-0-Metyl-3-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylin

3.31 .a) N- (N^al&-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-N^epsllon-[0-(3,4-di-0-metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Roztok zlúčeniny 1.31 (79 mg, 0,22 mmól) v zmesi dioxánu a vody 1 : 1 (10 ml) sa za miešania zmieša s tiofosgénom (33,5 ml, 0,44 mmól). Po 10 minútach sa reakčná zmes vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa suší počas jednu hodinu vo vákuu olejovej vývevy. Získaný izotiokyanát sa rozpustí v absolútnom dimetylformamide (10 ml) a zmieša sa so zlúčeninou 2.5 (157 mg, 0,2 mmól) a s etyldiizopropylamínom (0,5 ml). Reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti, potom sa zahustí vo vákuu a vyberie sa do zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu 1:1. Produkt sa vyzráža prídavkom dietyléteru a premyje sa malým množstvom ľadového metylalkoholu. Získa sa takto produkt vo forme žltých kryštálov (191 mg, 94 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 :1), R_f= 0,35,11. = 203 °C (rozklad).

3.31. N-{N^epsilon-[O-(3,4-di-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylami-no-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zo zlúčeniny 3.3l.a) (182,2 mg, 0,18 mmól) sa rovnako, ako je opísané v príklade 2.4, odštepia fluorenyl-9-metoxykarbonylová skupina. Po zahustení vo vákuu a rozpustení získaného zvyšku v zmesi dichlórmetánu a metylalkoholu 1 : 1 sa produkt vyzráža prídavkom dietyléteru. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (127,1 mg, 89 %), DC (metylalkohol), Rf = 0,46,1.1 = 158 °C.

Analogicky, ako je opísané v príkladoch 3.3 l.a) a 3.31. sa zpeptidového konjugátu 2.5. (vždy 157 mg, 0,2 mmól) vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 3.32 N-{N^epsll°ⁿ-[O-(3-O-(Piperidyl-N)-karbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanylj-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.42 (75,5 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.31.a), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (191,2 mg, 91 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10:1), R_f= 0,28,1.1. = 208 °C (rozklad). Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.31, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (155,8 mg, 88 %), DC (metylalkohol), Rf = 0,47,1.1. = 120 °C (rozklad).

Príklad 3.33

N-{N^ep“^ll°ⁿ-[O-(3-O-Karbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, sodná soľ

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.43 (77,3 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.3l.a), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (192 mg, 90 %), DC (etylalkohol/metylalkohol 1 : 1), Rf = 0,05, t. t. = 211 až 213 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.31, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (110,6 mg, 66 %), DC (metylalkohol), Rf = 0,33,1.1. = 233 až 235 °C (rozklad).

Príklad 3.34 N-{N^epsll°-[0-(3-0-Karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.44 (72,2 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.31.a), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (159,2 mg, 76 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 :1), Rf= 0,04,1.1. = 177 °C (rozklad). Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 3.31, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (125,1 mg, 76 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,48,1.1. = 106 °C (rozklad).

Príklad 4.1

4.1 .a) N- {N^dfa-[O-(P-L-Fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-N^cpsilon-(fluo-renyl-9-metoxy-karbonyl)-lyzyl-D-alanyl} -batracylín

140 mg (0,55 mmól) p-aminofenyl-B-L-fúkozidu sa najprv prevedie podľa predpisu v príklade 3.l.a) na horčičný olej a potom sa so 430 mg (0,55 mmól) N-[N'^psllon(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl}-batracylínu, trifluóracetátu (príklad 2.5) kopuluje za prítomnosti 375 μΐ etyldiizopropylamínu. Po zrážaní surového produktu zo zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu sa tento čistí pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi acetonitrilu a vody 10 : 1. Po rozmiešaní získaného zvyšku s dietyléterom sa získa 358 mg (67 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (acetonitril/voda 10: 1), Rf = 0,48.

4.1. N- {N^al&-[0-(P-L-Fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín

356 mg (0,37 mmól) zlúčeniny z príkladu 4.1.a) sa rozpustí v 10 ml dimetylformamidu a 5 ml piperidínu a reakčná zmes sa potom mieša počas jednej hodiny pri teplote 20 °C. Potom sa zahustí a získaný zvyšok sa chromatografúje s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 6 : 0,6. Produkt sa získa v 46 % výťažku, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5), R_f=0,ll.

Analogicky, ako je opísané v príklade 4.1. sa vyrobia z čiastočne chráneného peptidového konjugátu 2.5. nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 4.2

N-(N^alfa-[O-(3-O-Metyl-p-L-fiikozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.10

Chromatografické čistenie medzistupňa sa vykonáva pomocou zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 3 :0,3, neskôr s rovnakým systémom 15 : 4 :0,5.

Čistenie konečného produktu na stupni betaínu sa vykonáva rozmiešaním s vodou; nasleduje prevedenie na sodnú soľ pomocou 0,1 N hydroxidu sodného a lyofilizácie zo zmesi dioxán/voda. Výťažok je 65 %, 1.1. = 220 °C.

Príklad 4.3 N-{N^alťa-[0-(4-0-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]- -lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.2

Čistenie medzistupňa sa vykonáva zrážaním z dichlórmetánu pomocou dietyléteru.

Čistenie konečného produktu sa vykonáva niekoľkonásobným zrážaním z dimetylformamidu pomocou dietyléteru. Výťažok je 88 %, DC (acetonitril/voda/ ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), Rf = 0,28.

Príklad 4.4

N-{14^-(0-(3,4-O-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl)-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.4

Čistenie medzistupňa sa vykonáva viacnásobným zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru.

Čistenie konečného produktu pomocou stĺpcovej chromatografie sa vykonáva s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 8 :0,8 a zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru. Výťažok je 74 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak(17 %) 10:10: 1), R_f= 0,19.

Príklad 4.5

N- {14^-(0-(3,4-di-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylaminotiokar-bonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

4.5.a) N-{N^dfa-[0-(3,4-di-0-Metyl-P-D-galakto-pyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl-N^epsllon-(fluorenyl-9-metoxy-karbo-nyl)]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Roztok zlúčeniny 1.31 (79 mg, 0,22 mmól) v zmesi dioxánu a vody 1 : 1 (10 ml) sa za miešania zmieša s tiofosgénom (33,5 ml, 0,44 mmól). Po 10 minútach sa reakčná zmes vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa suší počas jednu hodinu vo vákuu olejovej vývevy. Získaný izotiokyanát sa rozpustí v absolútnom dimetylformamide (10 ml) a potom sa zmieša so zlúčeninou 2.6 (157 mg, 0,2 mmól) a s etyldiizopropylamínom (0,5 ml). Reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti, načo sa vo vákuu zahustí. Viacnásobným prezrážaním získaného zvyšku zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru a záverečným premytím malým množstvom ľadového metylalkoholu sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (198 mg, 98 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10: 1), R_f= 0,23,1.1. = 175 °C.

4.5.14-(14^-(0-(3,4-di-O-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zo zlúčeniny 4.5.a) (172,1 mg, 0,17 mmól) sa rovnako, ako je opísané v príklade 2.4. vyrobí fluorenyl-9-metoxykarbonylová skupina. Po zahustení vo vákuu a rozpustení v zmesi metylalkohol/dichlórmetán 1 : 1 sa produkt vyzráža prídavkom dietyléteru. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (114,5 mg, 85 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 0 :1), R_f = 0,16,1.1. = 206 °C (rozklad).

Analogicky, ako je opísané v príkladoch 4.5.a) a 4.5. sa z peptidového konjugátu 2.6. (vždy 157 mg, 0,2 mmól) vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 4.6 N-(N^alfa-[O-(p-D-Galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.23 (59,7 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5.a), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (185,8 mg, 94 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1), R_f=0,09,1.1. = 182 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (134,3 mg, 88 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 1 :1), Rf = 0,04,1.1. = 221 °C (rozklad).

Príklad 4.7 N-(N^aKa-[0-(3-0-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.25 (62,8 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5.a), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (193,5 mg, 97 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1), R_f = 0,27,1.1. = 178 °C (rozklad). Čistenie konečného produktu sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 2 : : 1 —» 1 :1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (130,5 mg, 84 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 1:1), Rf = 0,09,1.1. = 206 °C (rozklad).

Príklad 4.8 N-{N^alfi“-[0-(3-0-Metoxykarbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.42 (75,5 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5.a), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (209,8 mg, 99 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 :1), Rf = 0,32,1.1. = 235 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (164,3 mg, 99 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 1:1), Rf = 0,05,1.1. = 217 °C (rozklad).

Príklad 4.9 N-{N^alfi-[0-(3-0-Karbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, sodná soľ

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.43 (77,3 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5.a), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (210,3 mg, 99 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10:1), Rf = 0,02,1.1. = 183 °C.

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5, pričom sa získaný zvyšok suspenduje vo vode (10 ml) a suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,05 N hydroxidom sodným, kým nevznikne číry roztok (pH < 10). Po lyofilizácii prefiltrované

SK 281785 Β6 ho roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (150,8 mg, 90 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 1: : l),Rf=0,04.

Príklad 4.10 N-(N^alf'‘-[0-(3-0-K.arbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl)-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.44 (72,2 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5.a), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (152,7 mg, 73 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 :1), R_f = 0,11,1.1. = 229 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5, pričom sa získaný zvyšok suspenduje v zmesi voda/dioxán 1 : 1 (20 ml). Po lyofilizácii prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfhej pevnej látky (98,4 mg, 61 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1), R_f = 0,10, [a]²⁰ = + 44,9° (c = = 0,2/H₂O).

Príklad 4.11 N-{N^alfa-[O-(a-D-Manopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracy lín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.39 (59,7 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5.a), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (179,6 mg, 91 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10:1), Rf = 0,07,1.1. = 176 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (137,5 mg, 90 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 1:1), R_f = 0,09,1.1. = 213 °C (rozklad).

Príklad 4.12 N-{N^^&-[0-(3-0-Metyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.40 (62,8 mg, 0,22 mmól)

Čistenie medzistupňa sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5.a), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (94,2 mg, 48 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10:1), R_f = 0,13,1.1. = 173 °C (rozklad).

Čistenie konečného produktu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 4.5, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (66,6 mg, 43 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 1:1), R_f= 0,07,1.1. = 215 °C (rozklad).

Príklad 5.1 až 5.23

Všeobecný vzorec

Príklad 5.1

N-{N^alfa-[O-(3-O-Karboxymetyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylaminotiokarbonyl]-N°^psil°ⁿ-[0-(3-0-metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylaminotiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín mg (0,16 mmól) p-aminofenyl-3-O-karboxymetyl-P-L-fiikozidu (príklad 1.10) sa v 10 ml zmesi dioxánu a vody 1 :1 zmieša za miešania s 30 μΐ (0,18 mmól) tiofosgénu. Po 10 minútach sa reakčná zmes zahustí a suší sa počas jednu hodinu za vysokého vákua. Získaná olejovitá kvapalina sa potom v absolútnom dimetylformamide kopuluje so 109 mg (0,144 mmól) konjugátu z príkladu 3.4. za prítomnosti 82 μΐ etyldiizopropylamínu. Potom sa zahustí a čistí sa pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 % 15 : 4 : 0,5). Látka, získaná po zahustení sa lyofilizuje z vody. Výťažok je 89 mg (56 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 % 15 : 6 : 0,6), R_f=0,22.

Analogicky, ako je opísané v príklade 5.1. sa získajú nasledujúce zmesné substituované konjugáty.

Príklad 5.2 \_{N^1Ifa-[O-(3-O-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylaminotiokarbonyl]-N^eps,l°ⁿ-[0-(3-0-karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylaminotiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Edukty: uhľohydrát z príkladu 1.2., konjugát z príkladu 3.10.

Čistenie sa vykonáva zrážaním surového produktu z metylalkoholu pomocou dietyléteru. Výťažok je 78 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), Rf = = 0,45.

Príklad 5.3 N-{N^alfa-[O-(3-O-Metyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-N'^psll0n-[4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}batracylín

Edukty: konjugát z príkladu 4.3., 4-hydroxy-anilín

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :2 : : 0,2). Výťažok je 60 %, DC (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : 0,2, Rf = 0,31.

Príklad 5.4 N-{N^slfa-[O-(3-O-Karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-N^eps,l°ⁿ-[4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracy lín

Edukty: konjugát z príkladu 4.2., 4-hydroxyanilín

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 4 : : 0,5). Potom sa získaný zvyšok rozmieša so zmesou metylalkoholu a dietyléteru. Výťažok je 55 %, DC (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :6:0,6), R_f = 0,3.

Príklad 5.5 N-fN^-tO-íd-O-Metyl-P-L-fiikozylH-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-N^ep’^lk>’-[4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracy lín

Edukty: konjugát z príkladu 4.4., 4-hydroxyanilín

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :2 : : 0,2). Potom sa získaný zvyšok zráža zo zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu pomocou dietyléteru. Výťažok je 49 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %), 15 : 2: 0,2), R_f=0,26.

Príklad 5.6 N-{N^alfa-[4-Hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N^epsll°ⁿ-[O-(4-O-metyl-p-L-fúkozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Edukty: konjugát z príkladu 3.11., 4-hydroxyanilín

SK 281785 Β6

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : : 0,2). Potom sa získaný zvyšok lyofilizuje zo zmesi vody a dioxánu. Výťažok je 50 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %), 15 : 2 :0,2), R_f = 0,29.

Príklad 5.7 N-{N^a'^fa-[4-Hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N^tpsilo”-[O-(3-0-metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín

Edukty: konjugát z príkladu 3.4., 4-hydroxyanilín

Čistenie sa vykonáva zrážaním z metylalkoholu pomocou dietyléteru. Výťažok je 76 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %), 15 :2 :0,2), R_f= 0,26.

Príklad 5.8 N-[N^alfa-[O-(3-O-Mctyl-p-L-fiikozyl)-4-hydroxyfcnylamino-tiokarbonyl]-N^eps,lon-[4-hydroxyetylamino-2-[0-(3-0-metyl-0-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino]-triazín-6-yl]]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín

Edukty: konjugát z príkladu 8.10., uhľohydrát z príkladu 1.2

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : : 0,2). Výťažok je 9 %, FAB-MS, m/z = 1 165 = M + 1, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %), 15 : 3 : 0,3), Rf=0,27.

Príklad 5.9 N-{N^alfa-[O-(3-O-Karboxymetyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N'^psll°'¹- [acetyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Edukty: N-[N^epsilon-(acetyl)-lyzyl-D-alanyl]-batracylín, uhľohydrát z príkladu 1.10

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : : 0,2, neskôr v rovnakom systéme 15 : 4 : 0,5). Potom sa získaný zvyšok lyofilizuje z vody. Výťažok je 40 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f=0,31.

Príklad 5.10 N-{N^alfa-[0-(4-0-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N^epsil0- [acetyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín mg (0,067 mmól) konjugátu z príkladu 4.4. sa v 5 ml dimetylformamidu zmieša s 10 μΐ acetánhydridu a mieša sa počas 30 minút pri teplote miestnosti. Potom sa reakčná zmes zahustí a zráža sa z metylalkoholu pomocou dietyléteru. Výťažok je 46 mg (86 %), DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f = 0,6.

Príklad 5.11 N-{N^alfa-[O-(P-L-Fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N^epsllon- [succinyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín, sodná soľ mg (0,027 mmól) konjugátu z príkladu 4.1. sa v 2 ml dimetylformamidu zmieša s 3 mg anhydridu kyseliny jantárovej a mieša sa počas 6 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa reakčná zmes zahustí a zráža sa z metylalkoholu pomocou dietyléteru. Získaný zvyšok sa vyberie do vody a pridá sa 27 μΐ 0,1 N hydroxidu sodného. Výťažok je 26 mg (86 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/ľadová kyselina octová 8:2: 0,2), R_f = 0,2.

Príklad 5.12

N-{N^alfa-[O-(3-O-Metoxykarbonylmctyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-N^eps'^lo”-[0-(3,4-di-O-metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Uhľohydrát 1.42 (37,7 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.31 (79 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a okamihovej chromatografii (dichlórmetán/metylalkohol 20 : 1 -> 10 : 1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (52,9 mg, 45 %), (dichlórmetán/metylalkohol 10 :1), R_f = 0,14,1.1. = 178 °C (rozklad).

Príklad 5.13 N-{N^alfa-[0-(3-0-Karboxymetyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N^cpsll°-[O-(3,4-di-O-metyl-0-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín, sodná soľ

Uhľohydrát 1.43 (38,6 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31.a), s pcptidovým konjugátom 3.31 (79 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a rozpustení získaného zvyšku v zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu 1 : 1 sa produkt vyzráža prídavkom dietyléteru. Získaný zvyšok sa suspenduje vo vode (10 ml) a suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,05 N hydroxidom sodným, kým nevznikne číry roztok (pH < 10). Lyofilizáciou prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (87,9 mg, 74 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,17, [a]²⁰ = + 56,0 ⁰ (c = 0,l/H₂O).

Príklad 5.14 N-{N^alfa-[O-(3-O-Karbamoylmetyl-P-D-galaktopyTanozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N^tp8ll°”-[O-(3,4-di-O-metyl-0-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín

Uhľohydrát 1.44 (36,1 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.31 (79 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a rozpustení v zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 :1 sa získa produkt vyzrážaním prídavkom dietyléteru vo forme žltej kryštalickej látky (45,9 mg, 39 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,38,1.1. = 219 °C (rozklad).

Príklad 5.15 N-{N^al&-[O-(3,4-di-O-Metyl-0-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokar-bonyl]-N^epsll°”-[O-(3-O-(piperidyl-N)-karbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Uhľohydrát 1.31 (39,5 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.32 (88,7 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a okamihovej chromatografii (díchlórmetán/metylalkohol 20 : 1 -4 10 :1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (38,8 mg, 32 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol), R_f = 0,79,1.1. = 205 °C (rozklad).

Príklad 5.16 N-{N^,lfa-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N^epsilon-[O-(3-O-(piperidyl-N)-karbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín, sodná soľ

Uhľohydrát 1.43 (38,6 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.32 (88,7 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a rozpustení získaného zvyšku v zmesi metylal koholu a dichlórmetánu 1 :1 sa produkt vyzráža prídavkom dietyléteru. Získaný zvyšok sa suspenduje vo vode (10 ml) a suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,05 N hydroxidom sodným, kým nevznikne číry roztok (pH < 10). Lyofilizáciou prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (90,3 mg, 71 %), DC (etylalkohol), R_t= 0,05, [a]²⁰ = + 39,0 ° (c = 0,1/H₂O).

Príklad 5.17 N-{N^dfa-[0-(3-0-Karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N'^I>sllon-[0-(3-0-(piperidyl-N)-karbonylmetyl-P-D-galaktopyTanozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín

Uhľohydrát 1.44 (36,1 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.32 (88,7 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a rozpustení v zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 sa produkt vyzráža prídavkom dietyléteru vo forme žltej kryštalickej látky (44,8 mg, 36 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,06,1.1. = 223 °C (rozklad).

Príklad 5.18 N-{N^alfa-[O-(3,4-di-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N^epsil°”-[0-(3-0-karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín, sodná soľ

Uhľohydrát 1.31 (39,5 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.33 (84,2 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a rozpustení získaného zvyšku v zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu 1 : 1 (20 ml) sa produkt vyzráža prídavkom dietyléteru. Získaný zvyšok sa suspenduje vo vode (10 ml) a suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,05 N hydroxidom sodným, kým nevznikne číry roztok (pH < 10). Lyofilizáciou prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (80,7 mg, 68 %), DC (etylalkohol), R_t = 0,09, [a]²⁰ = + 35,0 ° (c = = 0,l/H₂O).

Príklad 5.19 N-{N“^1&-[O-(3-O-Metoxykarbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-N^qKllon-[0-(3-0-karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín, sodná soľ

Uhľohydrát 1.42 (37,7 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.33 (84,2 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a rozpustení získaného zvyšku v zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu 1 : 1 (20 ml) sa produkt vyzráža prídavkom dietyléteru. Získaný zvyšok sa suspenduje vo vode (10 ml) a suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,05 N hydroxidom sodným, kým nevznikne číry roztok (pH < 10). Lyofilizáciou prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (87,5 mg, 71 %), DC (etylalkohol), R_f =0,10, [a]²⁰ = + 24,6 ⁰ (c = = 0,l/H₂O).

Príklad 5.20 N-{N^dfa-[O-(3-O-Karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N'^:psilDI,-[0-(3-0-karboxymetyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín, sodná soľ

Uhľohydrát 1.44 (36,1 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.33 (84,2 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a rozpustení získaného zvyšku v zmesi metylal koholu a dichlórmetánu 1 : 1 (20 ml) sa produkt vyzráža prídavkom dietyléteru. Získaný zvyšok sa suspenduje vo vode (10 ml) a suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,05 N hydroxidom sodným, kým nevznikne číry roztok (pH < 10). Lyofilizáciou prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (78,6 mg, 65 %), DC (etylalkohol), R_t = 0,11, [a]²⁰ = - 44,0 ⁰ (c = = 0,13/H₂O).

Príklad 5.21 N-{N^aIía-[0-(3,4-di-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N'^psll°ⁿ-[0-(3-0-karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín

Uhľohydrát 1.31 (39,5 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.34 (81,9 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a okamihovej chromatografii (etylalkohol —> etylalkohol/ metylalkohol 2 :1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (17,4 mg, 15 %), DC (etylalkohol), R_f = = 0,20,1.1 > 205 °C (rozklad).

Príklad 5.22 N-{N^alía-[O-(3-O-Metoxykarbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-N'^ps‘¹°ⁿ-[0-(3-O-karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín

Uhľohydrát 1.42 (37,7 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.34 (81,9 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a rozpustení získaného zvyšku v zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu 1:1 sa produkt vyzráža prídavkom dietyléteru, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (72 mg, 60 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,21, t. t. = 222 °C.

Príklad 5.23 N-fN^-fCHB-O-Karboxyrnetyl-P-D-galaktopyranozyl)^-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-hT^ps,t,n-[0-(3-0-karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonylj-lyzyl-D-alanylj- batracylín, sodná soľ

Uhľohydrát 1.43 (38,6 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 3.31,.a), s peptidovým konjugátom 3.34 (81,9 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu a rozpustení získaného zvyšku v zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu 1:1 sa produkt vyzráža prídavkom dietyléteru. Získaný zvyšok sa suspenduje vo vode (10 ml) a suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,05 N hydroxidom sodným, kým nevznikne číry roztok (pH < 10). Lyofilizáciou prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (78,2 mg, 65 %), DC (etylalkohol), R_f= 0,07, [a]²⁰ = + 33,0 ° (c = 0,l/H₂O).

Príklad 6.1 až 6.89 Všeobecný vzorec

SK 281785 Β6

Príklad 6.1 N-{N^dfa ₎N^cpsilon-bis-[0-(2-0-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbo-nyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Roztok zlúčeniny 1.1 (50 mg, 0,19 mól) v zmesi dioxánu a vody 1 : 1 (10 ml) sa za miešania zmieša s tiofosgénom (30 μΐ, 0,4 mmól). Po 10 minútach sa reakčná zmes vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa suší počas jednu hodinu vo vákuu olejovej vývevy. Získaný izotiokyanát sa rozpustí v absolútnom dimetylformamide (10 ml) a zmieša sa so zlúčeninou 2.13 (61 mg, 0,09 mmól) a s etyldiizopropylamínom (0,5 ml). Reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti, potom sa zahustí vo vákuu a čistí sa pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : 0,2). Získaný zvyšok po zahustení sa z metylalkoholu vyzráža pomocou dietyléteru. Získa sa takto 48 mg (50 %) produktu vo forme žltej kryštalickej látky.

Analogicky, ako je opísané v príklade 6.1. sa z peptidového konjugátu z príkladu 2.13, prípadne zL-alanyl-izoméru (príklad 2.2.) vyrobia nasledujúce glykokonjugátyPríklad 6.2 N-{N^al&,N^epsi,on-bis-[O-(3-O-Metyl-P-L-íukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} - batracylín

Edukt: 100 mg (0,38 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1-2)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : : 0,5 : 0,5, neskôr v rovnakom systéme 15:1: 0,1) a potom zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol/ dietyléter. Výťažok: 59 %, t. t. = 178 °C (rozklad), DC (acetonitril/voda 10 :1), R_f= 0,51.

Príklad 6.3 N-{N^aJfa,N^cpsil0n-bis-[O-(4-O-Mctyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} - batracylín

Edukt: 115 mg (0,44 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.4)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : : 0,2) a potom zrážaním zo zmesi dichlórmetán/ metylalkohol (1 : 1 )/dietyléter. Výťažok: 58 %, 1.1. = 175 °C (rozklad), DC (acetonitril/voda 10 :1), R_f = 0,52.

Príklad 6.4 N-{N^alfa,N^epsilon-bis-[O-(3-O-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-alanyl}- batracylín

Edukt: 115 mg (0,44 mmól) uhľohydrátu z príkladu ^L2)a

Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol (1 : 1 )/dietyléter. Výťažok: 93 %, t. t. = = 192 °C (rozklad), DC (acetonitril/voda 10: 1), R_f = 0,46.

Príklad 6.5 N-{N^alfa,N^epsiloa-bis-[0-(3-0-Metyl-a-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylaminotiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín

Edukt: 100 mg (0,38 mmól) uhľohydrátu z príkladu ¹³⁾λ

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 1 : : 0,1) a potom zrážaním zo zmesi dichlórmetán/ metylalkohol (1 : l)/dietyléter. T. t. = 178 °C (rozklad), FAB-MS: m/z= 1 071 =M+ 1.

Príklad 6.6

N-{íT^lfc,ír^l’^,i,0n-bis-[O-(3-(>n-Propyl-p-L-fiikozyl)-4-liydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batiacylín

Edukt: 38 mg (0,127 mmól) uhľohydrátu z príkladu

1.5)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :1 : : 0,1) a potom zrážaním zo zmesi dichlórmetán/ metylalkohol (1 : l)/dietyléter. Výťažok: 42 %, 1.1. = 167 až 170 °C (rozklad), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak(17 %), R_f= 0,34.

Príklad 6.7 N-{N^al&,N^epsllo”-bis-[0-(3-Dezoxy-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín

Edukt: 40 mg (0,167 mmól) uhľohydrátu z príkladu

1.6)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15:2: : 0,2) a potom zrážaním zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru. Výťažok: 81 %, DC (acetonitril/voda 10 : 1), R_f = 0,46.

Príklad 6.8 N-{N^alfa,N'^psllo”-bis-[0-(3,4-Didezoxy-P-L-fÍikozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} - batracylín

Edukt: 41 mg (0,183 mmól) uhľohydrátu z príkladu ’Λ

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 95 : 5) a potom lyofilizáciou zo zmesi vody a dioxánu. Výťažok: 60 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol 9 :1), R_f= 0,22.

Príklad 6.9 N-{N^a,fa,N^epsllm-bis-[O-(3-Hydroxyetyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín

Edukt: 75 mg (0,25 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.12)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :2 : : 0,2, neskôr v rovnakom systéme 15:4: 0,5) a potom zrážaním zo zmesi metylaikohol/dietyléter. Výťažok: 66 %, DC (acetonitril/ voda 10 : 1), R_f=0,28.

Príklad 6.10 N-{N^alfa,N^epsil°-bis-[O-(2-Hydroxyetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylJ-lyzyl-D-alanyl}- batracylín

Edukt: 50 mg (0,167 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.19)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :3 : : 0,3) a potom zrážaním zo zmesi metylalkohol/ dietyléter a lyofilizáciou zo zmesi voda/acetonitril. Výťažok: 72 %, DC (acetonitril/ voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f = = 0,39.

Príklad 6.11 N-{N^alfa,N^epsilon-bis-[0-(2-0-Karboxymetyl-P-L-íukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl] -lyzyl-D-alanyl} - batracylín, dvoj sodná soľ

Edukt: 50 mg (0,16 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.13)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15:8: : 0,8, neskôr v rovnakom systéme 15 : 10 : 1) a potom sa získaný zvyšok digeruje s dietyléterom a lyofilizuje sa zo

SK 281785 Β6 zmesi voda/dioxán. Prevedenie na dvoj sodnú soľ sa vykoná s 2 ekvivalentmi 0,1 N hydroxidu sodného a lyofilizáciou z vody. Výťažok: 49 %, DC (acetonitril/ voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,5), R_f= 0,38, FAB: m/z = M - 2Na⁺ + + H⁺.

Príklad 6.12 N-{N^al6,N^epsta-bis-[O-(3-O-Karboxymetyl-p-L-fúkozyl> -4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín, dvoj sodná soľ

Edukt: 200 mg (0,64 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.10)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 4 : : 0,5, neskôr v rovnakom systéme 15 : 8 : 0,8 a nakoniec 15 : 10 : 1) a potom sa získaný zvyšok digeruje s dietyléterom a lyofilizuje sa zo zmesi voda/dioxán 1:1. Prevedenie na dvojsodnú soľ sa vykoná s 2 ekvivalentmi 0,1 N hydroxidu sodného a lyofilizáciou zvody. Výťažok: 59 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %), R_f=0,l.

Príklad 6.13 N-{N^alf!‘,N'^p5ÍI<>-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín

Edukt: 60 mg (0,19 mmól) uhľohydrátu z príkladu ¹¹⁸I

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 3 : : 0,3) a potom zrážaním získaného zvyšku zo zmesi metylalkohol/dichlórmetán 1 : 1 pomocou dietyléteru a lyofilizáciou zo zmesi voda/dioxán 1:1. Výťažok: 36 %, DC (acetonitril/ voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f = 0,46, 1.1. = 190 °C (rozklad).

Príklad 6.14 N-{N^aBa,hr^psil°ⁿ-bis-[O-(p-L-Fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- batracylín

Edukt: 100 mg (0,39 mmól) p-aminofenyl-B-L-fukozidu

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : : 0,2, neskôr v rovnakom systéme 15:4: 0,5) a potom zrážaním získaného zvyšku z dimetylformamidu pomocou dietyléteru. Výťažok: 48 %, 1.1. = 195 až 198 °C.

Príklad 6.15 N-{N^alľa,N'^ps,1°-bis-[0-(a-L-Rhamnozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} - batracylín

Edukt: 158 mg (0,61 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.21)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :3 : : 0,3, neskôr v rovnakom systéme 15:4: 0,5) a potom lyofilizáciou získaného zvyšku zo zmesi vody a dioxánu. Výťažok: 87 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 5 : 4 : 0,5), R_f=0,25.

Príklad 6.16 N-{N^alfa,N'^ps,lo-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-a-L-rhamnozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, dvojsodná soľ

Edukt: 208 mg (0,64 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.22)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 4 :

: 0,5, neskôr v rovnakom systéme 15 : 8 : 0,8 a nakoniec 15 : 10 : 1), nasledujúcou digeráciou s dietyléterom a potom lyofilizáciou získaného zvyšku zo zmesi vody a dioxánu 1 :1.

Analogicky, ako je opísané v príklade 6.1. sa z rôznych peptidových konjugátov batracylínu, ktoré obsahujú na amínovom konci úplne deblokovaný lyzínový stavebný prvok, vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 6.17 N-{N’^lfa,N^cps,lon-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-glycyl}-batracylín, dvojsodná soľ

Edukty: 32 mg (0,1 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.10, 32 mg (0,045 mmól) n(-lyzyl-glycyl)-batracylín, di-trifluóracetátu (príklad 2.9)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 8 : : 0,8, neskôr v rovnakom systéme 15 : 15 : 1,5), nasledujúcim zrážaním zo zmesi dimetylformamid/metylalkohol (1 : : 1) s dietyléterom a potom lyofilizáciou získaného zvyšku zo zmesi vody a dioxánu. Prevedenie na dvojsodnú soľ sa vykoná pomocou 2 ekvivalentov 0,1 N hydroxidu sodného a lyofilizáciou zvody. Výťažok: 25 %, DC (dichlórmetán/mctylalkohol/amoniak (17 %), 15:8: 0,8), R_f = 0,19, FAB-MS:m/z=l 189 = M+1.

Príklad 6.18 N-{N^alfa,N^epsilon-bis-[O-(3-O-Metyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-lyzyl-glycyl} - batracylín

Edukty: 60 mg (0,22 mmól) uhľohydrátu z príkladu

1.2), 66 mg (0,1 mmól) N-(lyzyl-glycyl)-batracylín, ditrifluóracetátu (príklad 2.9).

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/ľadová kyselina octová 90 :10 : 1), nasledujúcim zrážaním z metylalkoholu pomocou dietyléteru a potom lyofilizáciou získaného zvyšku zo zmesi vody a dioxánu. Výťažok: 68 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ľadová kyselina octová 80 : 20 : 2), R_f = = 0,62.

Príklad 6.19 N-{N^,lfa,N^ep“^ll0n-bis-[O-(P-L-Fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-lyzyl}- batracylín

6.19. a) N-{N^aUa,N^ep!,lon-bis-[0-(P-L-Fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-N^epslI°ⁿ-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzylj- batracylín

Edukty: 297 mg (1 mmól) p-aminofenyl-B-L-fukozidu, 66 mg (0,1 mmól) N-[lyzyl-N^cpsilon-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl]-batracylín, di-trifluóracetátu (príklad 2.15).

Čistenie sa vykonáva dvojnásobným zrážaním zo zmesi dichlórmetán/ metylalkohol 1:1) pomocou dietyléteru a premytím filtračného koláča dietyléterom. Výťažok: 89 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 4 : : 0,5), Rf= 0,31.

6.19. N-{N^alfa,N^epsiloa-bis-[0-(P-L-Fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-lyzyl-glycylj- batracylín

515 mg (0,39 mmól) zlúčeniny z príkladu 6.19.a) sa rozpustí v 5 ml dimetylformamidu a 5 ml piperidínu a reakčná zmes sa mieša počas 30 minút pri teplote 20 °C. Vsádzka sa potom zahustí a získaný zvyšok sa digeruje s dietyléterom, načo sa odsaje a filtračný koláč sa vyberie do dimetylformamidu. Po zrážaní dietyléterom a premytí

SK 281785 Β6 filtračného koláča sa získa 335 mg (78 %) produktu vo forme kryštalickej látky. FAB-MS: m/z = 1 100 = M + 1.

Príklad 6.20 N-{N^alla,N^{eps 0}-bis-[0-(3-0-Metyl-3-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-lyzyl-diaminopropionyl}- batracylín

6.20. a) N-ÍN^N^^-bis-tO-ÍS-O-Metyl-P-L-fukozyl)^-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-lyzyl-diaminopropionylj-batracylín

Syntéza sa vykonáva analogicky, ako je opísané v príklade 6.19.

Edukty: 60 mg (0,22 mmól) uhľohydrátu z príkladu

1.2), 100 mg (0,11 mmól) N-[lyzyl-N^epsil°”-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-diamino-propionyl]-batra-cylín, di-trifluóracetátu (príklad 2.16), 76 pl etyldiizopropylamínu

Čistenie sa vykonáva dvojnásobným zrážaním z metylalkoholu pomocou dietyléteru a premytím filtračného koláča dietyléterom. Výťažok: 105 mg (73 %).

6.20. N-{N^a*^fa,N^cpsilon-bis-[0-(3-0-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-lyzyl-diaminopropionyl}- batracylín

103 mg (0,079 mmól) zlúčeniny z príkladu 6.20.a) sa deblokuje piperidínom analogicky, ako je opísané v príklade 6.19. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak /17 %) 15 : 3 : 0,3), neskôr v rovnakom systéme 15 : 6 : 0,6 a potom lyofilizáciou získaného zvyšku zo zmesi vody a dioxánu. Výťažok: 21 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f = 0,32.

Príklad 6.21 N-{N^alfi,N^cpsilo-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-p-L-íukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-diaminopropionyl}- batracylín, dvojsodná soľ

Táto zlúčenina sa vyrobí analogicky, ako je opísané v príklade 6.20. cez dva stupne, pričom sa vychádza z uhľohydrátu z príkladu 1.0. a peptidového konjugátu z príkladu 2.16. Chromatografické čistenie môže odpadnúť, lebo vedľajšie produkty sa môžu odstrániť digeráciou s metylalkoholom a dietyléterom. Potom sa vykoná prevedenie na dvojsodnú soľ s 2 ekvivalentmi 0,1 N hydroxidu sodného. Výťažok: 66 % cez dva stupne, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 10:3:1,5), R_t= 0,3.

Príklad 6.22 N-{N^alfa,N^epsilon-bis-[O-(3-O-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-lyzyl-seryl}-batracylín

Edukty: 60 mg (0,22 mmól) uhľohydrátu z príkladu

1.2), 76 mg (0,11 mmól) N-lyzyl-seryl)-batracylín, di-trifluóracetátu (príklad 2.10)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :2 : : 0,2) a nasledujúcim zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol/dietyléter. Výťažok: 26 %, DC (acetonitril/voda 10 : 1). R_f = 0,39.

Príklad 6.23 N-{N^alfa,N^q’^sil°-bis-[O-(3-O-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbo-nyl]-lyzyl-D-seryl}-batracylín

Edukty: 60 mg (0,22 mmól) uhľohydrátu z príkladu

1.2), 69 mg (0,11 mmól) N-(lyzyl-D-seryl)-batracylín, di-hydrobromidu (príklad 2.11)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : : 0,2) a nasledujúcou lyofilizáciou zo zmesi dioxánu a vody. Výťažok: 29 %, DC (acetonitril/voda 10:1). R_f = 0,36.

Príklad 6.24 N-{N^a,fa,N^q’^sil0”-bis-[0-(3-0-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-lyzyl}- batracylín

Edukty: 80 mg (0,3 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.2), 53 mg (0,14 mmól) N-(lyzyl)-batracylínu (príklad 2.17)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 1 : : 0,1, neskôr v rovnakom systéme 15:2: 0,2), nasledujúcim zrážaním zo zmesi metylalkohol/dietyléter. Výťažok: 26 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : : 2 : 0,2), R_t= 0,22.

Príklad 6.25 N-{N^alft,N^cps,1°''-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl} - batracylín

Edukty: 60 mg (0,19 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.10), 24 mg (0,063 mmól) N-(lyzyl)-batracylínu (príklad 2.17)

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : : 0,2, neskôr v rovnakom systéme 15:4: 0,5) a nasledujúcou lyofilizáciou zvody. Výťažok: 26 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1:0,2), R_f= 0,25.

Príklad 6.26 N-{N^alfa,N'^psllo,1-bis-[O-(3,4-di-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzylj- batracylín

Roztok zlúčeniny 1.31 (79 mg, 0,22 mmól) v zmesi dioxánu a vody 1 : 1 (10 ml) sa za miešania zmieša s tiofosgénom (33,5 μΐ, 0,44 mmól). Po 10 minútach sa reakčná zmes zahustí vo vákuu a získaný zvyšok sa suší počas jednej hodiny vo vákuu olejovej vývevy. Získaný izotiokyanát sa rozpustí v absolútnom dimetylformamide (10 ml) a zmieša sa so zlúčeninou 2.17 (37,7 mg, 0,1 mmól) a s etyldiizopropylamínom (0,5 ml). Reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti, potom sa vo vákuu zahustí a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 30 : 1 —> 20 : 1 —» 10 : : 1). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (56,7 mg, 53 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2 : 1), R_f = = 0,72,1.1. = 125 °C (rozklad).

Príklad 6.27 N-{N^alfa,N^epsll°”-bis-[O-(3-O-Metoxykarbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}- batracylín

Zlúčenina 1.42 (75,5 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26. s peptidovým konjugátom 2.17. (37,7 mg, 0,1 mmól). Čistením okamihovou chromatografiou (dichlórmetán/metylalkohol 30 : 1 —> —> 20 : 1 —> 10 :1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (51,1 mg, 44 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,80, t. t. = 176 °C (rozklad).

Príklad 6.28 N-{N^alfe,N^ep’^il°-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl}- batracylín, dvojsodná soľ

Zlúčenina 1.43 (77,3 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26., s peptidovým

SK 281785 Β6 konjugátom 2.17 (37,7 mg, 0,1 mmól). Čistením zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 s použitím dietyléteru sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (53 mg, 47 %), DC (metylalkohol), Rf = 0,75,1.1 = > 260 °C (rozklad).

Príklad 6.29 N-{N^alfa,N^eps'^lo-bis-[O-(3-O-Karbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}- batracylín

Zlúčenina 1.44 (72,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26., s peptidovým konjugátom 2.17 (37,7 mg, 0,1 mmól). Čistením zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 s použitím dietyléteru sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (55,6 mg, 48 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,09,1.1. = 206 °C (rozklad).

Príklad 6.30 N-{N^alfa,N'^ps,l°-bis-[O-(3-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-seryl}-batracylín Zlúčenina 1.25 (62,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.10 (69,3 mg, 0,1 mmól). Po zahustení reakčnej zmesi vo vákuu sa získaný zvyšok vyberie zmesou dichlórmetánu a metylalkoholu 1 : 1 (10 ml), produkt sa vyzráža prídavkom dietyléteru (15 ml) a premyje sa malým množstvom ľadového metylalkoholu. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (46 mg, 41 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2 : 1), R_f = 0,12, t t. = 190 až 191 °C.

Príklad 6.31

N-{N^aífi‘,N^tps'^lol’-bis-[0-(P-L-Galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-lyzyl-seryl}- batracylín p-Aminofenyl-P-L-fukopyranozid (56,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.10 (69,3 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát -> etylalkohol) a zrážanie zo zmesi metylalkohol/dichlórmetán 1 : 1 pomocou dietyléteru, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (73,8 mg,

%), DC (etylalkohol), R_f= 0,15,1.1. = 123 °C.

Príklad 6.32 N-{N^alfa,N^epsilon-bis-[0-(3,4-di-0-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-seryl}- batracylín

Zlúčenina 1.31 (79 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.10 (69,3 mg, 0,1 mmól). Čistením okamihovou chromatografiou (etylacetát -> etylacetát/etylalkohol 7 : 1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (43,8 mg, 38 %), DC (etylacetát/ etylalkohol 2 : 1), Rf = 0,31,1.1. = = 176 °C.

Príklad 6.33 N-{N^alfa,N^eps'^lon-bis-[O-(3-O-Metoxykarbonylmetyl-3-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-seryl}- batracylín

Zlúčenina 1.42 (75,5 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.10 (69,3 mg, 0,1 mmól). Čistením okamihovou chromatografiou (etylacetát -> etylacetát/etylalkohol 3 : 1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (46,2 mg, 37 %), DC (etylacetát/ etylalkohol 2 : 1), Rf = = 0,12,1.1. = 161 °C.

Príklad 6.34 N-{N^aMa,hT^I’^sllon-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-seryl} -batracylín, dvojsodná soľ

Zlúčenina 1.43 (77,3 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26., s peptidovým konjugátom 2.10 (69,3 mg, 0,1 mmól). Čistením uvedeným vyššie sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (39,2 mg, 31 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,77,1.1. = 213 až 215 °C (rozklad).

Príklad 6.35 N-{N^alfa,N^epsil°ⁿ-bís-[O-(3-O-K.arbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-seryl}- batracylín

Zlúčenina 1.44 (72,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.10 (69,3 mg, 0,1 mmól). Čistením okamihovou chromatografiou (etylacetát/etylalkohol 2 : 1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (66,1 mg, 53 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2 : 1), Rf = 0,14,1.1. = 192 °C (rozklad).

Príklad 6.36 N-{N^al&,N'^psllon-bis-[O-(3-O-Metyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-seryl}-batracylín

Zlúčenina 1.40 (62,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.10 (69,3 mg, 0,1 mmól). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (48,9 mg, 44 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2 : 1), Rf = 0,10, 1.1. = = 204°C.

Príklad 6.37 N-{N^alfa,N^ep!Ílon-bis-[O-(2,3-di-O-Metyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-seryl} -batracylín

Zlúčenina 1.41 (66 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.10 (69,3 mg, 0,1 mmól). Čistením okamihovou chromatografiou (etylacetát -» etylacetát/etylalkohol 7 : 1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (52 mg, 45 %), DC (etylacetát/ etylalkohol 2 :1), Rf = 0,28,1.1 = = 164 až 165 °C (rozklad).

Príklad 6.38 N-{N^alfa,N'^psil°”-bis-[O-(4-O-(P-D-Galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-seryl}-batracylín

Zlúčenina 1.56 (95,4 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.10 (69,3 mg, 0,1 mmól). Po zahustení reakčnej zmesi vo vákuu sa produkt dôkladne premyje horúcim metylalkoholom (50 ml). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (61,6 mg, 44 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,32,1.1. = 222 °C (rozklad).

Príklad 6.39 N-{N^alfa,N^ep5,lt’-bis-[O-(P-L-Fukopyranozyl)-4-hydroxyfcnylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-seryl} - batracylín p-Aminofenyl-P-L-fukopyranozid (56,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.11 (62,6 mg, 0,1 mmól). Čistením pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát ->

SK 281785 Β6

-+ etylalkohol) a zrážaním získaného zvyšku zo zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu 1 : 1 pomocou dietyléteru sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (50,9 mg, 48 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,14,1.1. = 133 °C.

Príklad 6.40 N-{N^alfa,N^eps'^lon-bis-[0-(3,4-di-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-seryl} -batracylín

Zlúčenina 1.31 (79 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.11 (62,6 mg, 0,1 mmól). Čistením okamihovou chromatografiou (etylacetát -+ etylacetát/etylalkohol 5 : 1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (53,8 mg, 47 %), DC (etylacetát/ etylalkohol 2 :1), R_f = 0,38,1.1. = = 145 až 146 °C (rozklad).

Príklad 6.41 N-{N^alľa,N^cpsilon-bis-[O-(3-O-Metoxykarbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-seryl}- batracylín

Zlúčenina 1.42 (75,5 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.11 (62,6 mg, 0,1 mmól). Čistením okamihovou chromatografiou (etylacetát -+ etylacetát/etylalkohol 3 : 1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (52,4 mg, 42 %), DC (etylacetát/ etylalkohol 2 : 1), R_f = = 0,12,1.1. = 168 °C.

Príklad 6.42 N-{N^alfa,N^epsil'’-bis-[O-(3-O-Karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-seryl} - batracylín, dvoj sodná soľ

Zlúčenina 1.43 (77,3 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.11 (62,6 mg, 0,1 mmól). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky (69,2 mg, 55 %), DC (metylalkohol), R_f = 0,71,1.1. = 214 až 216 °C (rozklad).

Príklad 6.43 N-{N^alfl,N^eP^sil°”-bi_s-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfeny1amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-seryl}- batracylín

Zlúčenina 1.44 (72,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.11 (62,6 mg, 0,1 mmól). Čistením okamihovej chromatografie (etylacetát/etylalkohol 2 : 1) sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (46,4 mg, 38 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2 :1), Rf = 0,10,1.1. = 173 °C.

Príklad 6.44 N-{N^alfa,N^epsil°”-bis-[O-(P-L-Fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-asparagyl}- batracylín p-Aminofenyl-P-L-fukopyranozid (56,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.7 (72,1 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu 1 : 1 pomocou dietyléteru, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (69,4 mg, 64 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,14,1.1. = 185 až 187 °C.

Príklad 6.45 N-{N^aM‘,N^cp’^ilo-bis-[0-(3,4-di-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-asparagylj- batracylín

Zlúčenina 1.31 (79 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.7 (72,1 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/kyselina octová 200 : 1 -> etylacetát/etylalkohol 3:1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (99,5 mg, 85 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,59,1.1. = 145 °C (rozklad).

Príklad 6.46

N-fN^.N^-bis-IO-O-O-Karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-asparagylj- batracylín, dvoj sodná soľ

Zlúčenina 1.43 (77,3 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.7 (72,1 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu 1 : 1 pomocou dietyléteru, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (93,4 mg, 73 %), 1.1. = 220 °C (rozklad).

Príklad 6.47 N-{N^alfa,N^epsll°-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-asparagyl}- batracylín

Zlúčenina 1.44 (72,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.7 (72,1 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/etylalkohol/ kyselina octová 400 :100 : 2), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (69,7 mg, 57 %), DC (etylalkohol), Rf = 0,11,1.1. = 111 °C.

Príklad 6.48 N-{N^alfa,N^epsil°ⁿ-bis-[O-(p-L-Fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-asparagyl}- batracylín, sodná soľ

Zlúčenina 6.44 (21,7 mg, 20 mmól) sa suspenduje vo vode (10 ml) a suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,05 N hydroxidom sodným, kým nevznikne číry roztok (pH < 10). Lyofilizáciou prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (20,6 mg, 93 %).

Príklad 6.49 N-{N^alfa,N^epsilon-bis-[O-(3,4-di-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-asparagyl}- batracylín, sodná soľ

Zlúčenina 6.45 (23,5 mg, 20 pmól) sa nechá reagovať a spracovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.48. Získa sa takto produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (23,9 mg, 100 %).

Príklad 6.50 N-{N^llfa,N'^ps,lon-bis-[O-(3-O-Karboxymetyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-asparagyl}- batracylín, trojsodná soľ

Zlúčenina 6.46 (25,6 mg, 20 pmól) sa rozpustí vo vode (10 ml) a tento roztok sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,05 N hydroxidom sodným, kým sa nedosiahne pH 8. Lyofilizáciou prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (24 mg, 92 %).

Príklad 6.51 N-{N^alfa,N^cpsllon-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-asparagylj- batracylín, sodná soľ

SK 281785 Β6

Zlúčenina 6.47 (24,7 mg, 20 pmól) sa nechá reagovať a spracovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.48. Získa sa takto produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (23,0 mg, 92%).

Príklad 6.52 N-{N^al^N'^psllo”-bis-[O-(P-L-Fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-glutamyl} - batracylín p-Anúnofenyl-P-L-fukopyranozid (56,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, speptidovým konjugátom 2.8 (66,8 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/ kyselina octová 200 : 1 -> etylacetát/etylalko-hol/kyselina octová 10:1: 0,1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (39,5 mg, 36 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,09,1.1. = 138 až 139 °C (rozklad).

Príklad 6.53 N-{N^llfi',N^cpsil°^r,-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-glutamyl)-batracylín, dvojsodná soľ

Zlúčenina 1.43 (77,3 mg, 0,22 μπιόΐ) sa nechá reagovať s peptidovým konjugátom 2.8 (66,8 mg, 0,1 mmól) a spracovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26. Získa sa takto produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (97,4 mg, 92 %), 1.1. = 180 °C (rozklad).

Príklad 6.54 N-{N^alfa,N^eps'^k”-bis-[O-(3-O-Karboxymetyl-3-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-glutamylj-batracylln, trojsodná soľ

Zlúčenina 6.53 (25,6 mg, 20 pmól) sa nechá reagovať a spracovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.50. Získa sa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (24,3 mg, 92 %), [á]²⁰ = + 20,0° (c = 0,26/H₂O).

Príklad 6.55 N-{N^aIfa,N^epslk'-bis-[0-(p-L-Fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-lyzyl-glycyl} -batracylín p-Aminofenyl-P-L-fúkopyranozid (56,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, speptidovým konjugátom 2.9 (66,2 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát -> etylalkohol), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (62,2 mg, 60 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,12,1.1. = 176 °C.

Príklad 6.56 N-{N^alb,N^ep5,lo”-bis-[0-(3-0-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokaibonyl]-lyzyl-glycyl} -bairacy-lin

Zlúčenina 1.25 (62,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.9 (66,2 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/etylalkohol 10 : 1 -> 2 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (56,2 mg, 52 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2 : 1), R_f = 0,22,1.1. = 197 °C.

Príklad 6.57 N-{N^alfa,N'^p!llon-bis-[0-(3₎4-di-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-ammo-tiokarbonyl]-lyzyl-glycyl}-batracylín

Zlúčenina 1.31 (79 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, speptidovým konjugátom 2.9 (66,2 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/etylalkohol 10 : 1 -> 2 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (26,2 mg, 23 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2 : 1), R_ť= 0,39,1.1. = 209 °C.

Príklad 6.58 N-{N^alfa,N^epsilon-bis-[0-(3-0-Metoxykarbonylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-glycyl} -batracylín

Zlúčenina 1.42 (75,5 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.9 (66,2 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/etylalkohol 10:1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (22 mg, 18 %), DC (etylacetát/etyl-alkohol 2 : : 1), R_f= 0,06,1.1. = 194 až 195 °C (rozklad).

Príklad 6.59 N-{N‘^dfa,N^qMÍlon-bis-[O-(3-O-Karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-glycyl} -batracylín, dvojsodná soľ

Zlúčenina 1.43 (77,3 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.9 (66,2 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu sa získaný produkt dôkladne premyje metylalkoholom, dichlórmetánom a dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (86,8 mg, 71 %), 1.1. = 230 až 232 °C (rozklad).

Príklad 6.60 N-{N^a’^&,N^ep!'^lon-bis-[0-(3-0-Karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-glycyl} -batracylín

Zlúčenina 1.44 (72,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.9 (66,2 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu sa získaný produkt dôkladne premyje metylalkoholom, dichlórmetánom a dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (40,9 mg, 35 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2 : 1), R_f = 0,05, t. t. = 214 až 216 °C (rozklad).

Príklad 6.61 N-{N^albN^cplllo-bis-[0-(3-0-Metyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzy1-glycyl}-batracylín

Zlúčenina 1.40 (62,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.9 (66,2 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/etylalkohol 10 : 1 -> 2 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (72,2 mg, 66 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2:1), R_f = 0,18,1.1. = 175 °C.

Príklad 6.62 N-{N^alfa,N^epsilon-bis-[O-(2,3-di-O-Metyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-glycyl}-batracylín

Zlúčenina 1.41 (66 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, speptidovým konjugátom 2.9 (66,2 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/etylalkohol 10 : 1 -> 3 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (66,6 mg, 60 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2:1), R_f = 0,41,1.1. = 173 °C.

SK 281785 Β6

Príklad 6.63 N-{N^a,&,N^epsil°-bis-[O-(P-L-Fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-treonyl}-batracylín p-Aminofenyl-p-L-fukopyranozid (56,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.12 (64 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát -> etylalkohol) a prezrážaním produktu zo zmesi metylalkohol/dichlórmetán 1 : 1 dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (30,5 mg, 28 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,10,1.1. = 172 °C.

Príklad 6.64

N-{N“^l&,N'^ps,lo”-bis-[0-(P-D-Galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.23 (59,7 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 10 : 1 —» 1 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (68,3 mg, 64 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1), Rf = 0,49, t. t. = 222 až 224 °C (rozklad).

Príklad 6.65 N-{N^alfa,N'^ps'^lon-bis-[0-(2-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl] -lyzyl-D-alanyl} -batracylín

Zlúčenina 1.24 (62,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (69,6 mg, 63 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,24, t. t. = 208 °C (rozklad).

Príklad 6.66 N-{N^alfa,N'^,!Sll°'^,-bis-[0-(3-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.25 (62,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 15 :1 —»10:1 —> 5 :1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (94,3 mg, 85 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), R_f = 0,16,1.1. = = 212 ’C (rozklad).

Príklad 6.67 N-{N^alfä,N^epsil°-bis-[0-(4-0-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl)-batracylin

Zlúčenina 1.26 (62,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 15 :1 —> 10:1 —> 5 :1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (52,6 mg, 48 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), Rf = 0,88,1.1. = 192 °C (rozklad).

Príklad 6.68 N-fN^N'^-bis-tO-íó-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.27 (62,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (96,7 mg, 88 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5:1), R_f = 0,04,1.1. = 210 °C (rozklad).

Príklad 6.69 N-{N^alfa,N^epsil0n-bis-[O-(2,3-di-O-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.28 (65,9 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 20 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (57,4 mg, 51 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 :1), Rf = 0,40,1.1. = 148 °C (rozklad).

Príklad 6.70 N-{N^alfa,N^cpsi'^OI1-bis-[O-(2,4-di-O-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.29 (65,9 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 20 : 1 —> 15 : 1 —> 10 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (74,2 mg, 65 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 :1), Rf=0,40,11. = 140 °C (rozklad).

Príklad 6.71 N-{N^alfa,N^epsil°”-bis-[O-(2,6-di-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.30 (65,9 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 20 : 1 —> 15 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (43,9 mg, 40 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), R_f = 0,43,1.1. = 229 °C (rozklad).

Príklad 6.72 N-{N^alfa,N^eps,lon-bis-[O-(3,4-di-O-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanylj-batracylín

Zlúčenina 1.31 (79 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 10 :1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (66,2 mg, 59 %), DC (dichlóimetán/metylalkohol/amoniak 15:3:0^2), R_f = 0,39,11 = 184 “C.

Príklad 6.73 N-{N^alfa,N'^p!ll°ⁿ-bis-[0-(3,6-di-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.32 (65,9 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/

SK 281785 Β6 metylalkohol 15 : 1 —► 10 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (57,1 mg, 50 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), R_f= 0,42,1.1. = 190 °C.

Príklad 6.74 N-{N^alfc,br^psÍlo-bis-[0-(4,6-di-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.33 (79 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, speptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 20 :1 —> 10:1 —> 5 :1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (47,0 mg, 42 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 :1), R_f = 0,39,1.1. = 169 °C.

Príklad 6.75 N-{N^alfa,N'^ps,lo,l-bis-[0-(2,3,4-tri-0-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.34 (69 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 30 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (83,8 mg, 72 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 :1), R_f = 0,36,1.1. = 165 °C (rozklad).

Príklad 6.76 N-{N^alft,N^qBilo-bis-[O-(2,3,6-tri-O-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracy lín

Zlúčenina 1.35 (69 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, speptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (105 mg, 91 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 :1), R_f = 0,48,1.1. = 194 °C (rozklad).

Príklad 6.77 N-{N^al6,N^epsil°-bis-[0-(2,4,6-tri-0-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.36 (69 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 30 : 1 —> 10 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (67 mg, 58 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), Rf = 0,54,1 1. = 228 °C (rozklad).

Príklad 6.78

N-jN^“,^--018-(0-(3,4,6-tri-0-Metyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.37 (69 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 diéty léterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (109,3 mg, 94 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), Rf= 0,52,1.1. = 180 °C (rozklad).

Príklad 6.79 _N.{_N^_)N^«i™bi_s.[0-(2,3,4,Ď-tetra-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.38 (69 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, speptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (99,2 mg, 84 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 10:1), R_f = 0,73,1.1. = 188 °C (rozklad).

Príklad 6.80 N-{N^aIfa,N^epsilon-bis-[0-(3-0-Metoxykarbonylmetyl-3-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracy lín

Zlúčenina 1.42 (75,5 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (22 mg, 18 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), R_f= 0,33,1.1. = 194 až 195 °C (rozklad).

Príklad 6.81 N-{N^alfa,N^eps'^lo”-bis-[O-(3-O-Karboxymetyl-3-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanylj-batracylín, dvojsodná soľ

Zlúčenina 1.43 (77,3 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva tam uvedeným spôsobom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (99,7 mg, 81 %), DC (metylalkohol), Rf = 0,80,1.1. = 230 °C (rozklad).

Príklad 6.82 N-{N^alfa,N^cpsll°-bis-[O-(3-O-Karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanylj-batracylín

Zlúčenina 1.44 (72,2 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 7:1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (29,4 mg, 25 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 3:1), Rf= 0,23,1.1. = 201 až 202 °C.

Príklad 6.83 N-{N^al&,N^epsllon-bis-[O-(3,4-Didezoxy-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracy lín

Zlúčenina 1.52 (52,6 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 17 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (38,8 mg, 37 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), Rf = 0,40, t. t. = 175 °C.

Príklad 6.84 N-{N^alf\N^epsil°ⁿ-bis-[O-(a-D-Manopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.39 (59,7 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykoná va pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 10 : 1 —> 1 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (52 mg, 48 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 1 :1), R_f = 0,19,1.1. = 196 °C.

Príklad 6.85 N-{N^alfa,N'^psilo”-bis-[O-(3,4-di-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.31 (79 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.2 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 10 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (77,6 mg, 69 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 15 : 3 : 0,2), R_f = 0,33, t. t. = = 186 °C.

Príklad 6.86 N-{N^alfa,N^epsilo-bis-[O-(4-O-Metyl-(B-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, dvojsodná soľ

Zlúčenina 1.56 (95,4 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Po zahustení vo vákuu sa získaný zvyšok dôkladne premyje horúcim metylalkoholom (50 ml), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (102,8 mg, 73 %), DC (metylalkohol), R_f= 0,27,1.1. = 225 až 226 °C.

Príklad 6.87 N-{N^alf,,N^epsil°^,,-bis-[O-(4-O-(3'-Sulfát-e-D-galaktopyranozyl)-P-D-gluko-pyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, dvojsodná soľ

Zlúčenina 1.57 (117,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (152,8 mg, 95 %), 1.1. = 232 °C (rozklad).

Príklad 6.88 N-{N^a,ft,N^epsil<”-bis-[O-(4-O-(3'-O-Metyl-B-D-galaktopyranozyl)-p-D-gluko-pyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín

Zlúčenina 1.58 (98,4 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (118,2 mg, 83 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 1 :1), R_f= 0,58,1.1. = 221 °C (rozklad).

Príklad 6.89

N-{N^alfil,N^epsilon-bis-[O-(2-O-Mety 1-4-0-(3’-O-metyl-B-D-galaktopyranozyl)-p-D-glukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.59 (101,5 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 6.26, s peptidovým konjugátom 2.13 (67,7 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol 15 :1 —> 10 :1 —> 5 :1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (101,3 mg, 70 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 2 : 1), Rf = 0,58,1.1. = 233 °C (rozklad).

Príklad 7.1 až 7.13

Všeobecný vzorec

Keď sa vychádza z iných aminokyselinových alebo peptidových konjugátov batracylínu alebo z batracylínu, vyrobia sa analogicky, ako je opísané v príklade 4.1.a) nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 7.1

N-{N-[0-(3-0-Metyl-P-L-fúkozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl}-batracylín

Edukty: uhľohydrát z príkladu 1.2, aminokyselinový konjugát z príkladu 2.3.

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 1 : : 0,1) a lyofílizácie zo zmesi dioxánu a vody. Výťažok: 42 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : : 2 : 0,2), R_f=0,31.

Príklad 7.2 N-{N-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl}-batracylín, sodná soľ

Edukty: uhľohydrát z príkladu 1.10, aminokyselinový konjugát z príkladu 2.3.

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 3 : : 0,3) a lyofílizácie zo zmesi dioxánu a vody. Nasledujúce prevedenie na sodnú soľ sa vykonáva pomocou 0,1 N hydroxidu sodného. Výťažok: 43 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :4:0,5), R_f = 0,14.

Príklad 7.3 N-{N-[O-(P-L-Fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-seryl-D-alanyl} -batra-cylín

Edukty: p-aminofenyl-P-L-fukozid, aminokyselinový konjugát z príkladu 2.18.

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 3 : : 0,3) a lyofílizácie zo zmesi dioxánu a vody. Výťažok: 93 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : : 3 :0,3), R_f = 0,28, FAB-MS: m/z = 705 = M + 1.

Príklad 7.4

N-{N-[0-(-P-L-Fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl-D-alanyl} -batracylín

Edukty: p-aminofenyl-p-L-ftikozid, aminokyselinový konjugát z príkladu 2.19.

Čistenie sa vykonáva digeráciou s metylalkoholom a zrážaním zo zmesi metylalkoholu a dichlórmetánu éterom. Výťažok: 65 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5 : 1 :0,2), R_f= 0,78.

Príklad 7.5 N-{N-[0-(P-L-Fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-glutamyl-D-alanyl} -batracylín

Edukty: p-aminofenyl-P-L-fukozid, aminokyselinový konjugát z príkladu 2.20.

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 4 : : 0,5 a neskôr rovnaký systém 15:6: 0,6) a lyofílizácie zo

SK 281785 Β6 zmesi dioxánu a vody. Výťažok: 93 %, DC (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 8 :0,8), R_f = 0,55.

Príklad 7.6 N-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fiikozyl)-4-hydroxyfenylamino-tíokarbonyl]-batracylín

250 mg (1 mmól) batracylínu sa rozpustí v 50 ml dioxánu a po prídavku 184 μΐ tiofosgénu sa reakčná zmes mieša počas 2 hodín pri teplote 20 °C. Potom sa zahustí, digeruje sa dietyléterom a prefiltruje sa. Zvyšok na filtri sa suší počas 16 hodín za vysokého vákua a potom sa vyberie do 30 ml dimetylformamidu. Pridá sa 312 mg (1 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.10. a 500 μΐ etyldiizopropylamínu a reakčná zmes sa spracováva počas 4 hodiny ultrazvukom. Potom sa zahustí a čistí sa pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 : : 0,2, neskôr v rovnakom systéme 15:6: 0,6). Relevantné frakcie sa zahustia a lyofilizujú sa zo zmesi dioxánu a vody. Výťažok: 363 mg (60 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15:6: 0,6), R_f= 0,38.

Príklad 7.7 N-[0-(3-0-Metyl-P-L-íukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-batracylín

Výroba prebieha analogicky, ako je opísané v príklade 7.6, pričom sa vychádza z batracylínu a z uhľohydrátu z príkladu 1.2. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 ; 1 : 0,1). Výťažok: 58 %, DC (dichlóimetán/metylalkohol/amomak (17 %) 15:2: 0,2), R_f = 0,39, FAB-MS: m/z = 561=M+l.

Príklad 7.8 N-{N-[O-(3,4-di-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.31 (37,5 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať speptidovým konjugátom 2.3 (32 mg, 0,1 mmól) rovnako, ako je opísané v príklade 6.26. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 30 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (49,3 mg, 75 %), DC (etylacetát/etylalkohol 2:1), R_f= 0,81,11. = 185 °C (rozklad).

Príklad 7.9 N-{N-[O-(2,3,4-tri-O-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl} -batracylín

Zlúčenina 1.34 (34,5 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať speptidovým konjugátom 2.3 (32 mg, 0,1 mmól) rovnako, ako je opísané v príklade 6.26. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 40 : 1 —> 15 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (54,9 mg, 81 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 20 : 1), Rf = 0,15, t. t. = 190 °C (rozklad).

Príklad 7.10 N-{N-[0-(3-0-Metoxykarbonylmetyl-p-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylami-no-tiokarbonyl]-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.42 (37,8 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať s peptidovým konjugátom 2.3 (32 mg, 0,1 mmól) rovnako, ako je opísané v príklade 6.26. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 20 : 1 —> 10 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (44,3 mg, 63 %), DC (etylalkohol), R_f= 0,85,1.1. = 195 °C (rozklad).

Príklad 7.11 N-{N-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl}-batracylín, sodná soľ

Zlúčenina 1.43 (38,6 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať speptidovým konjugátom 2.3 (32 mg, 0,1 mmól) rovnako, ako je opísané v príklade 6.26. Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 dietyléterom, pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (63,8 mg, 89 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,15,1.1. = = 217 °C (rozklad).

Príklad 7.12 N-{N-[0-(3-0-Karbamoylmetyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl}-batracylín

Zlúčenina 1.44 (37,8 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať s peptidovým konjugátom 2.3 (32 mg, 0,1 mmól) rovnako, ako je opísané v príklade 6.26. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 20:1—>10:1—>5:1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (20 mg, 29 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,15,1.1. = 184 °C (rozklad).

Príklad 7.13 N-{N-[0-(p-L-Fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl)-batracylín p-Aminofenyl-P-L-fukopyranozid (28,1 mg, 0,11 mmól) sa nechá reagovať s peptidovým konjugátom 2.3 (32 mg, 0,1 mmól) rovnako, ako je opísané v príklade 6.26. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (etylacetát/ petroléter 2 : 1 —> 5 ; 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (49,8 mg, 81 %), DC (etylalkohol), R_f = 0,50,1.1. = 173 °C.

Príklad 8.1. až 8.12.

Všeobecný vzorec

Príklad 8.1 N-{N^epsilon-[2-Chlór-4-[O-(3-O-metyl-B-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino] -triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín, trifluóracetát

8.1 .a) N-{N^a,fa-[terc.-Buto.xykarbonyl]-N^eps'^lon-[2-chlór-4-[0-(3-0-metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino]-triazín-6-yl]-lyzy l-D-alanyl} -batracylín

265 mg (0,98 mmól) p-aminofenyl-3-O-metyl-P-L-fukozidu (príklad 1.2) a 181 mg (0,98 mmól) kyanurchloridu sa rozpustí v 50 ml zmesi dioxánu a vody 1:1, ochladí sa na teplotu -5 °C a po prídavku 83 mg hydrogenuhličitanu sodného sa pri tejto teplote mieša počas 15 minút. Potom sa pridá 538 mg (0,98 mmól) N-{N^alfa-[terc.-butoxykarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylínu (príklad 2.4), rozpustených v 14 ml dimetylformamidu a ďalších 83 mg hydrogenuhličitanu sodného a reakčná zmes sa nechá zahriať na teplom miestnosti. Po 16 hodinách miešania pri teplote 20 °C sa reakčná zmes zahustí a získaný zvyšok sa spracuje s vodou. Zmes sa odsaje a zvyšok na filtri sa za vysokého vákua usuší, pričom sa získa 890 mg (96 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 :1), Rf = 0,26.

8.1. N-{N^epsil°-[2-ChIór-4-[O-(3-O-metyl-p-L-fúkozyl)-4-hydroxy-fenylamino]-triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

100 mg (0,11 mmól) zlúčeniny z príkladu 8.l.a) sa rozpustí v 3 ml dioxánu, načo sa pridá 60 mg uhličitanu draselného a 6,5 ml 0,1 N roztoku etanolamínu v dioxáne a reakčná zmes sa mieša počas 18 hodín pri teplote 80 °C. Potom sa zahustí.

Príklad 8.2 N-{N^epsil°ⁿ-[4-Hydroxyetylamino-2-[O-(3-O-metyl-P-L-fúkozyl)-4-hydroxyfenylamino]-triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín, trifluóracetát

8.2. a) N-{N^alfe-[terc.-Butoxykarbonyl]-N'^psilon-[4-hydroxyfenylamino-2-[0-(3-0-metyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino]-triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín

100 mg (0,11 mmól) zlúčeniny z príkladu 8.l.a) sa rozpustí v 3 ml dioxánu, pridá sa 60 mg uhličitanu draselného a 6,5 ml 0,1 N roztoku etanolamínu v dioxáne a reakčná zmes sa mieša počas 18 hodin pri teplote 80 °C. Potom sa zahusti a získaný zvyšok sa rozmieša s vodou, prefiltruje sa a zvyšok na filtri sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 1 : : 0,1). Po zahustení relevantných frakcií a vysušení získaného zvyšku za vysokého vákua sa získa 83 mg (80 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 2 : 0,2), R_f= 0,23.

8.2. N-{N^cpsllon-[4-Hydroxyfenylamino-2-[O-(3-O-metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino] -triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanylj-batracylín, trifluóracetát mg (0,07 mmól) zlúčeniny z príkladu 8.2.a) sa deblokuje analogicky, ako je opísané v príklade 8.1. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 2 ; 0,2). Nasledujúce zrážanie zo zmesi metylalkoholu a dietyléteru vedie k produktu v 90 % výťažku, FAB-MS m/z = 854 = M + 1.

Analogicky, ako je opísané v príklade 8.1, sa vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 8.3 N-{N^epsllon-[2-Chlór-4-[O-(2-O-metyl-B-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino]-triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylm, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.1.

Výťažok: 76 %, FAB-MS: m/z = 829 = M + 1

Príklad 8.4 _N.{_N^iion._[2._chlór.4.[_O.(_B._L._filkozyp.₄._hydroxyfenyl. amino]-triazin-6-yl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: p-aminofenyl-P-L-fukozid

Výťažok: 76 %, FAB-MS: m/z = 815 = M + 1, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5), R_f=0,44

Príklad 8.5 N-{N^epsil°ⁿ-[2-Chlór-4-[O-(3-dezoxy-B-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino] -triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl} -batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.6

Výťažok: 56 %, FAB-MS: m/z = 799 = M + 1, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1:0,2), R_f = 0,54

Analogicky, ako je uvedené v príkladoch 8.l.a), 8.2.a) a

8.2. sa z peptidového konjugátu batracylinu z príkladu 2.4, prípadne zo zodpovedajúcim spôsobom vyrobiteľných L-alanyl-izomérov, vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 8.6

N-{N^epsll°”-[4-Hydroxyetylamino-2-[O-(2-O-metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenyl-amino]-triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.1

Výťažok: 78 %, FAB-MS: m/z = 854 = M + 1, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5), R_f = = 0,33.

Príklad 8.7

N-{N^eps'^lol'-[4-Hydroxyetylamino-2-[O-(4-O-metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenyl-amino]-triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.4

Výťažok: 38 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17%) 15:4: 0,5), R_f =0,4

Príklad 8.8

N-{N'^psllon-[4-Hydroxyetylamino-2-[0-(3-dezoxy-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenyl-amino]-triazin-6-yl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.6

Výťažok: 78 %, FAB-MS: m/z = 824 = M + 1, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5), Rf = = 0,37

Príklad 8.9

N-{N^epsll°^,l-[4-Hydroxyetylamino-2-[O-(p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino] -triazín-6-yl] -lyzyl-D-alanyl} -batracylín, trifluóracetát

Edukt: p-aminofenyl-P-L-fukozid

Výťažok: 52 %, FAB-MS: m/z = 820 = M + 1, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5), Rf = = 0,37

Príklad 8.10

N-{N^epsilon-[4-Hydroxyctylamino-2-[0-(3-0-mctyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenyl-amino]-triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.2

Výťažok: 88 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5), R_f= 0,35

Príklad 8.11

N-{N^epsllon-[4-Hydroxyetylamino-2-[O-(2-O-metyl-3-L-fukozyl)-4-hydroxyfenyl-amino]-triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.1

Výťažok: 88 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5), R_f = 0,40

Príklad 8.12

N-{N'^psil°-[4-Hydroxyetylamino-2-[O-(4-O-metyl-p-L-fiikozyl)-4-hydroxyfenyl-amino]-triazín-6-yl]-lyzyl-D-alanyl}-batracylín, trifluóracetát

Edukt: uhľohydrát z príkladu 1.4

Výťažok: 88 %, FAB-MS: m/z = 854 = M + 1, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5), Rf = = 0,37

SK 281785 Β6

Príklad 9.1

N-[D-Alanyl]-chinolón-a, trifluóracetát

9.1 .a) N-[N-(terc.-Butoxykarbonyl)-D-alanyl]-chinolón-a

V 200 ml dimetylformamidu sa rozpustí n-(terc.-butoxykarbonyl)-D-alanín (3,6 g, 19,2 mmól) a 2-izobutoxy-l-izobutoxykarbonyl-l,2-dihydro-chinolín (5,8 g, 19,2 mmól) a po osemhodinovom miešaní pri teplote miestnosti sa pridá chinolín-a (4 g, 9,6 mmól) a 3,3 ml etyldiizopropylamínu a vsádzka sa spracuje počas 10 hodín ultrazvukom. Potom sa zahustí, získaný zvyšok sa vyberie do dichlórmetánu a vyzráža sa dietyléterom. Po filtrácii, premytí dietyléterom a vysušení za vysokého vákua sa získa 4,58 g (81 %) v názve uvedenej zlúčeniny, ktorá sa nechá bez ďalšieho čistenia ďalej reagovať.

9.1. N-[D-Alanyl]-chinolón-a, trifluóracetát

4,56 g (7,75 mmól) zlúčeniny z príkladu 9.1.a) sa pri teplote 0 °C rozpustí v 50 ml dichlórmetánu a 50 ml bezvodej kyseliny trifluóroctovej a reakčná zmes sa mieša pri tejto teplote počas jednej hodiny. Potom sa zahusti, destiluje sa s dichlórmetánom a vyzráža sa z metylalkoholu pomocou dietyléteru. Získa sa takto 4,07 g (87 %) kryštalickej látky uvedenej v názve, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f = 0,34.

Príklad 9.2

N-[Alanyl]-chinolón-a, trifluóracetát

Syntéza sa vykonáva rovnako ako syntéza izoméru v príklade 9.1.

Príklad 9.3

N-[Lyzyl-D-alanyl]-chinolón-a, di-trifluóracetát

9.3.a) N-[N^a,f\N^cpslbn-bis-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-chinolón-a

341 mg (9,84 mmól) N^.N^^-bis-íterc.-butoxykarbonyl)-lyzínu sa rozpustí v 10 ml dimetylformamidu a pri teplote 0 °C sa zmieša s 200 mg (1,48 mmól) N-hydroxybenzotriazolu a 227 mg (1,18 mmól) N’-(3-dimetylaminopropyl)-N- etylkarbodiimidu hydrochloridu. Po trojhodinovom miešaní pri teplote 10 °C sa pridá 432 mg (0,82 mmól) zlúčeniny z príkladu 9.1. a reakčná zmes sa mieša počas ďalšie 2 hodiny pri teplote 20 °C. Potom sa zahustí, získaný zvyšok sa premieša trikrát s 50 ml vody, načo sa vyberie do dichlórmetánu a vysuší sa pomocou bezvodého síranu sodného. Zrážanie sa vykonáva pomocou dietyléteru, pričom sa získa 516 mg (78 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (acetonitril/voda 10: 1), R_f = 0,55.

9.3. N-[Lyzyl-D-alanyl]-chinolón-a, di-trifluóracetát

Vykoná sa deblokácia 512 mg (0,63 mmól) zlúčeniny z príkladu 9.3.a) z etylesteru kyseliny octovej pomocou dietyléteru analogicky, ako je opísané v príklade 9.1., pričom sa dosiahne výťažok 479 mg (90 %), DC (acetonitril/ voda/ľadová kyselina octová 10 : 3 :1,5), Rf= 0,3.

Príklad 9.4

N-[Lyzyl-alanyl]-chinolón-a, di-trifluóracetát

Syntéza sa vykonáva rovnako, ako syntéza izoméru v príklade 9.3.

Príklad 9.5 N-[N^dfe-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-alanyl]-chinolón-a

9.5.a) N-[N^aIfa-(terc.-Butoxykarbonyl)-N^ei,s'¹⁰ⁿ-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-chinolón-a

1,57 g (3,36 mmól) N^alfl-(terc.-butoxykarbonyl)-N^eps'^l°-(fl_UOrenyl-9-metoxykarb_Onyl)-lyzínu sa rozpustí v 25 ml dimetylformamidu a pri teplote 0 °C sa zmieša so 600 mg (5,04 mmól) N-hydroxysukcinimidu a 820 mg (4,03 mmól) Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu. Po 3 hodinách sa odfiltruje vzniknutá močovina, k filtrátu sa pridá

1.5 g (2,86 mmól) zlúčeniny z príkladu 9.1. a reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti. Zvyšok močoviny sa odfiltruje a filtrát sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 97,5 : 2,5, neskôr v rovnakom systéme 90: 10), načo sa vyzráža zo zmesi dichlórmetán/ dietyléter 1 : 1 pomocou dietyléteru. Výťažok je 1,5 g (56 %), DC (dichlórmetán/ metylalkohol : 1), R_f= 0,47.

9.5 N-[N^<df“-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-chinolón-a

Odštiepenie Fmoc zo zlúčeniny z príkladu 9.5.a) sa vykonáva pomocou piperidínu v dimetylformamide. Zrážanie surového produktu z dimetylformamidu sa vykonáva pomocou dietyléteru. Výťažok je 72 %. DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1:0,2), R_f = 0,43.

Príklad 9.6

N-[N^eps,l°ⁿ-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-chinolón-a trifluóracetát

Odštiepenie Boe zo zlúčeniny z príkladu 9.5.a) sa vykonáva analogicky, ako je opísané v príklade 9.1. Zrážanie surového produktu sa vykonáva zo zmesi metylalkohol/dietyléter. Výťažok je 80 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :4 :0,5), R_f = 0,36.

Príklad 9.7 N-[N^al6‘-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl-alanyl]-chinolón-a

Syntéza sa vykonáva rovnako ako syntéza izoméru v príklade 9.5.

Príklad 9.8

N-[Lyzyl]-chinolón-a, di-trifluóracetát

9.8. a) N-[N^a,faN'^psilon -bis-(terc.-Butoxykarbonyl)-lyzyl]-chinolón-a

1317 mg (3,8 mmól) N^lfeN^<'^,*^,lon -bis-(terc.-butoxykarbonyl)-lyzínu sa spojí podľa predpisu v príklade 9.1. s chinolónom-a. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 :1 : 0,1). Získa sa takto 1 010 mg (71 %) v názve uvedenej zlúčeniny.

9.8. N-[Lyzyl]-chinolón-a, di-trifluóracetát

1005 mg (1,347 mmól) zlúčeniny z príkladu 9.8.a) sa deblokuje rovnako, ako je uvedené v príklade 9.1. Po zrážaní zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru sa získa 966 mg (93 %) v názve uvedenej zlúčeniny vo forme kryštalickej látky DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 10:5: 3), Rf = 0,33.

Príklad 9.9

N-[D-Lyzyl]-chinolón-a, di-trifluóracetát

Syntéza sa vykonáva rovnako ako syntéza izoméru v príklade 9.8.

Príklad 9.10

N-[N^alfa-(terc.-Butoxykarbonyl)- lyzyl]-chinolón-a

9.10. a) N-[N^alfe-(terc.-Butoxykarbonyl)-N^cpsilon-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl]-chinolón-a

1350 mg (2,88 mmól) N^alfa-terc.-butoxykarbonyl-N'P^s'^k’^,,-(fi_uorenyl-9-_metoxy-karbo_nyl)-lyzí_nu sa spojí podľa predpisu v príklade 9.1. s chinolónom-a. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 1 : 0,1, neskôr v rovnakom systéme 15:2: 0,2). Získa sa takto 1025 mg (82 %) v názve uvedenej zlúčeniny.

9.10. N-[N^alfa-(terc.-Butoxykarbonyl)- lyzylj-chinolón-a

Odštiepenie Fmoc zo zlúčeniny z príkladu 9. lO.a) sa vykonáva analogicky, ako je opísané v príklade 9.5. Dvojnásobné zrážanie surového produktu z metylalkoholu sa vykonáva pomocou dietyléteru. Výťažok je 86 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), Rf = = 0,48.

Príklad 9.11

N-[N^epsll°-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)- lyzyl]-chinolón-a, trifluóracetát

Odštiepenie Boe zo zlúčeniny z príkladu 9.10.a) sa vykonáva analogicky, ako je opísané v príklade 9.1. Zrážanie surového produktu sa vykonáva zo zmesi metylalkohol/dietyléter. Výťažok je 92 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15:4: 0,5), R_f = 0,44.

Príklad 10.1. -10.3.

Všeobecný vzorec

Príklad 10.1 N-{N^epsll°-[O-(3-O-Karboxymetyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-chinolón -a

10.1 .a) N- {Netere.-Butoxykarbonyl)-N'^psilon-[O-(3-O-karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}- chinolón -a mg (0,25 mmól) p-aminofenyl-3-O-karboxymetyl-p-L-fukozidu (príklad 1.10) sa v 15 ml zmesi dioxánu a vody 1 : 1 zmieša za miešania so 47 μΐ (0,28 mmól) tiofosgénu. Po desaťminútovom miešaní pri teplote 20 “C sa reakčná zmes zahustí a suší sa počas jednu hodinu za vysokého vákua. Získaná olejovitá látka sa potom spojí v absolútnom dimetylformamide so 180 mg (0,25 mmól) N-fN^-jterc.-butoxykarbonyl)-lyzyl-D-alanyl]-chinolónu-a (príklad 9.5) za prítomnosti 86 μΐ etyldiizopropylamínu. Po dvojnásobnom zrážaní surového produktu zo zmesi dichlórmetánu a dietyléteru a nasledujúcom rozmiešaní s vodou a lyofilizácii zo zmesi dioxánu a vody sa získa 210 mg (78 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), Rf = 0,62.

10.1 N-{N'^psll°ⁿ-[O-(3-O-Karboxymetyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino- tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-chinolón -a

208 mg (0,193 mmól) zlúčeniny z príkladu lO.l.a) sa mieša počas jednej hodiny pri teplote 0 °C v 10 ml dich

SK 281785 Β6 lórmetánu a 10 ml bezvodej kyseliny trifluóroctovej. Potom sa reakčná zmes zahustí, destiluje sa s 15 ml metylalkoholu a chromatografiije sa s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 10 : 10 : 0,8. Po nasledujúcom zrážaní z dimetylformamidu s použitím dietyléteru sa získa 52 mg (28 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1:0,2), R_f = 0,53.

Analogicky, ako je opísané v príklade 10.1, sa z čiastočne chránených peptidových konjugátov podľa príkladov 9.5., 9.7., prípadne 9.10., vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 10.2 N-(N'^psllon-[0-(3-0-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-alanyl}-chinolón -a

Edukty: uhľohydrát z príkladu 1.2., peptidový konjugát z príkladu 9.7

Čistenie medzistupňa sa vykonáva viacnásobným zrážaním z metylalkoholu pomocou dimetyléteru. Čistením konečného stupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %), neskôr s rovnakým systémom 15 : 8 : 0,8 sa získa v názve uvedená zlúčenina vo výťažku 20 %, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 8 : 0,8), R_f = 0,15.

Príklad 10.3 N-(N^cp!llon-[O-(3-O-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylaminotiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón -a

Čistenie medzistupňa sa vykonáva zrážaním z metylalkoholu pomocou dimetyléteru. Čistením konečného stupňa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %), sa získa v názve uvedená zlúčenina vo výťažku 39 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1:0,2), R_f = 0,33.

Príklad 11.1-11.18

Všeobecný vzorec

Príklad 11.1

N-(N^alfa,N^,!psilo’-bis-[O-(3-O-Metyl-P-L-fúkozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl] -lyzyl-D-alanyl} - chinolón-a mg (0,19 mmól) p-aminofenyl-3-O-metyl-B-L-fukozidu (príklad 1.2) sa podľa predpisu z príkladu lO.l.a) najprv prevedie na olejovitú látku a potom sa nechá reagovať v 5 ml dimetylformamidu so 68 mg (0,08 mmól) N-(lyzyl-D-alanyl)-chinolónu a di-trifluóracetátu (príklad 9.3) za prítomnosti 55 μΐ etyldiizopropylamínu. Reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti, načo sa zahustí a čistí sa pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/ ľadová kyselina octová 85 : 15 : 1,5. Zrážaním z metylalkoholu s použitím dietyléteru sa získa 62 mg (63 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (dichlórmetán/metylalkohol/ ľadová kyselina octová 80 : 20 : 2), R_f = 0,5, MS-MALDI: m/z = 1 242 = M + 1.

Analogicky, ako je opísané v príklade 11.1, sa z peptidových konjugátov podľa príkladov 9.3., 9.4., 9.8., prípadne 9.9., vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 11.2 N-{N^{a i},bf^p!'^l°-bis-[0-(3-0-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbony 1] -lyzyl-alanyl} -chinolón-a

Edukty: 50 mg (0,19 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.2., 0,08 mmól peptidový konjugát z príkladu 9.4.

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/ľadová kyselina octová 90 : 10 : 1 a zrážaním z metylalkoholu pomocou dietyléteru sa získa v názve uvedená zlúčenina vo výťažku 79 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f= 0,42.

Príklad 11.3 N-{N^alra,N^cpsil°”-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-alanyl} - chinolón-a

Edukty: 52 mg (0,166 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.10,0,07 mmól peptidový konjugát z príkladu 9.4.

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/ľadová kyselina octová 80 :20:2 a rozmiešaním získaného zvyšku s metylalkoholom, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 10:3:1,5), R_f = 0,62.

Príklad 11.4 N-{N^al&,N^qB'^lo-bis-[O-(3-O-Karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-lyzyl-alanyl} - chinolón-a

Edukty: 44 mg (0,14 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.10, 0,06 mmól peptidový konjugát z príkladu 9.3.

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/ľadová kyselina octová 80 :20 :2 a rozmiešaním získaného zvyšku s metylalkoholom. Výťažok je 57 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 10:3:1,5), R_f = 0,62.

Príklad 11.5 N-{N^al&,N'^ps'^10I1-bis-[0-(a-L-Rhamnozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzy 1-alanyl} - chinolón-a

Edukty: 44 mg (0,166 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.21, 0,07 mmól peptidový konjugát z príkladu 9.4.

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/Fadová kyselina octová 80 : 20 : 1 a rozmiešaním získaného zvyšku so zmesou metylalkohol/dietyléter. Výťažok je 90 mg (89 %), DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: : 0,2), R_f= 0,62, MS-ESI: m/z = 1 212 = M + 1.

Príklad 11.6 N-{N^aJfa,N^epsíl°-bis-[O-(3-O-Mctyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-a

Edukty: 70 mg (0,258 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.2, 0,11 mmól aminokyselinový konjugát z príkladu 9.8.

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/ľadová kyselina octová 90 : 10 : 1, zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru a rozmiešaním získaného zvyšku s vodou. Výťažok je 41 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1:0,2), R_f = 0,65.

Príklad 11.7 N-{N^alfa _>N'^psilo-bis-[0-(3-0-Metyl-fl-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbony 1] -D-lyzyl} -chinolón-a

Edukty: 50 mg (0,19 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.2, 0,08 mmól aminokyselinový konjugát z príkladu 9.9.

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/ľadová kyselina octová 90 : 10 : 1, zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru a rozmiešaním získaného zvyšku s vodou. Výťažok je 67 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f = 0,65, MS-FAB:m/z=l 169 = M+1.

Príklad 11.8 N-{N^alfa,N^eps‘^lon-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-a, dvojsodná soľ

Edukty: 50 mg (0,16 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.10, 0,07 mmól aminokyselinový konjugát z príkladu 9.8.

Po zahustení reakčnej zmesi, vybraní do 10 ml dimetylformamidu a prídavku 8 ml 0,1 N hydroxidu sodného sa reakčná zmes mieša počas 2 hodín pri teplote 20 °C. Po novom zahustení sa vyberie získaný zvyšok do vody a hodnota pH sa nastaví na 5. Potom sa lyofilizuje a digeruje s metylalkoholom a potom so zmesou metylalkohol/dietyléter. Získa sa takto 68 mg (65 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: : 0,2), R_f = 0,26.

Príklad 11.9 N-{N^alfa,N’^p511on-bis-[O-(3-O-Karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-lyzyl}-chinolón-a, dvojsodná soľ

Edukty: 100 mg (0,32 mmól) uhľohydrát z príkladu

I. 10,0,13 mmól aminokyselinový konjugát z príkladu 12.9.

Po zahustení reakčnej zmesi, vybraní do 10 ml dimetylformamidu a prídavku 16 ml 0,1 N hydroxidu sodného sa reakčná zmes mieša počas 2 hodín pri teplote 20 ’C. Po novom zahustení sa vyberie získaný zvyšok do vody a hodnota pH sa nastaví na 5. Potom sa lyofilizuje a digeruje s metylalkoholom a potom so zmesou metylalkohol/dietyléter. Získa sa takto 160 mg (77 %) v názve uvedenej zlúčeniny, 1.1. = 218 až 220 ’C, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 10:3:1,5), Rf= 0,69.

Príklad 11.10 N-(N^alfaN'^pslloll-bis-[O-(3-O-Metyl-a-L-fukozyl)-4-hydroxy fenylamino-tiokarbonyl] -D-lyzyl} -chinolón-a

Edukty: 50 mg (0,19 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.3, 0,08 mmól aminokyselinový konjugát z príkladu 9.9.

Príprava prebieha analogicky, ako je opísané v príklade

II. 7. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 10 : : 10 : 1) a nasledujúcim zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1:1 dietyléterom, výťažok: 66 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f = = 0,62.

Príklad 11.11 N-(N^alfa,N’^psllo”-bis-[O-(a-L-Rhamnozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbony l]-D-lyzyl} -chinolón-a

Edukty: 50 mg (0,19 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.21, 0,08 mmól aminokyselinový konjugát z príkladu 9.9.

Príprava prebieha analogicky, ako je opísané v príklade 11.7, výťažok: 57 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f = 0,63.

Príklad 11.12 N-{N^alfa,N^cpsilon-bis-[O-(3-O-Mctyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-lyzyl}-chinolón-a, sodná soľ mg (0,05 mmól) zlúčeniny z príkladu 11.7 sa suspenduje vo vode a prevedie sa s jedným ekvivalentom 0,1 N hydroxidu sodného na sodnú soľ. Po lyofilizácii sa získa 60 mg v názve uvedenej zlúčeniny.

Príklad 11.13 N-{N^a,fa,N'^p!il<]n-bis-[0-(3-0-Metyl-3-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-a, sodná soľ

Roztok zlúčeniny 1.25 (62,8 mg, 0,22 mmól) v zmesi dioxánu a vody 1 : 1 (10 ml) sa za miešania zmieša s tiofosgénom (33,5 ml, 0,44 mmól). Po 10 minútach sa reakčná zmes zahustí vo vákuu a získaný zvyšok sa suší počas jednej hodiny vo vákuu olejovej vývevy. Získaný izotiokyanát sa rozpustí v absolútnom dimetylformamide (10 ml) a zmieša sa so zlúčeninou 9.8 (77,4 mg, 0,1 mmól) a s etyldiizopropylamínom (0,5 ml), načo sa reakčná zmes mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti, zahustí sa vo vákuu a čistí sa pomocou okamihovej chromatografíe (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 10 : 10 : 1 —> metylalkohol/amoniak (25 %) 20 : 1). Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky, ktorá sa suspenduje vo vode (10 ml). Suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,05 N hydroxidom sodným, kým nevznikne číry roztok (pH < 10). Lyoíilizáciou filtrátu tohto roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (39,7 mg, 32 %), (a]_D ²⁽⁾ = + 25,8° (c = 0,26/H₂O).

Príklad 11.14 N-{N^al6,N^epsll°”-bis-[0-(4-0-(3'-0-Metyl-b-D-galaktopyranozyl)-b-D- glukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl)-chinolón-a, sodná soľ

Zlúčenina 1.58 (98,4 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané v príklade 11.13, s peptidovým konjugátom 9.8 (77,4 mg, 0,1 mmól). Získa sa takto produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (62,5 mg, 40 %), [a]_D ²⁰ = + 12,9° (c = 0,26/H₂O).

Príklad 11.15

N-{N^al&,N*^|BÍIo’-bis-[O-(2-O-Metyl-4-O-(3'-O-metyl-b-D-galaktopyranozyl)-b-D-glukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-a, sodná soľ

Zlúčenina 1.59 (101,5 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané vpríklade 11.13, speptidovým konjugátom 9.8 (77,4 mg, 0,1 mmól). Čistenie sa vykonáva zrážaním zo zmesi metylalkohol/dichlórmetán 1 : 1 pomocou dietyléteru a vyvarením s etylalkoholom. Získa sa takto žltá kryštalická látka, ktorá sa prevedie uvedeným spôsobom na sodnú soľ, pričom sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (51,1 mg, 32 %), [a]_D ²⁰ = + + 27,9’ (c = 0,24/H₂O).

Príklad 11.16 N-{N^alfa,N'^ps'^lo’-bis-[O-(3-O-Metyl-b-D-galaktopyranozyl)-b-D-gluko-pyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-D-lyzyl}-chinolón-a, sodná soľ

Zlúčenina 1.25 (62,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané vpríklade 11.13, s peptidovým konjugátom 9.9 (77,4 mg, 0,1 mmól). Získa sa takto produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (77,3 mg, 63 %), [a]_D ²⁰ = - 23,8° (c = 0,63/H₂O).

SK 281785 Β6

Príklad 11.17 N-{N^al&,N^ep’^ilo”-bis-[0-(3-0-Metyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxyfeny lamino-tiokarbonyl j -D-lyzyl} -chinolón-a, sodná soľ

Zlúčenina 1.40 (62,8 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané v príklade 11.13, s peptidovým konjugátom 9.9 (77,4 mg, 0,1 mmól). Získa sa takto produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (33,6 mg, 27 %), [a]_D ²⁰ = + 0,7° (c = 0,28/H₂O).

Príklad 11.18

N-{N^,N^íp,ilon-bis-[0-(4-0-(3'-0-Metyl-b-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-D-lyzyl}-chinolón-a, sodná soľ

Zlúčenina 1.58 (98,4 mg, 0,22 mmól) sa nechá reagovať a čistiť rovnako, ako je opísané v príklade 11.13, s peptidovým konjugátom 9.9 (77,4 mg, 0,1 mmól). Získa sa takto produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (63 mg, 41 %), [a]_D ²⁰ = - 21,8° (c = 0,22/H₂O).

Príklad 12.1 -12.15

Príklad 12.1 N-{N'-[0-(3-0-Metyl-B-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylaminotiokarbonyl]-D-alany 1} -chinolón-a

447 mg (1,66 mmól) p-aminofenyl-3-O-metyl-B-L-fukozidu (príklad 1.2) sa podľa predpisu podľa príkladu

10.1.a) najprv prevedie na olejovitú látku a potom sa v 40 ml dimetylformamidu nechá reagovať s 1 g (1,66 mmól) N-(D-alanyl)-chinolónu-a, trifluóracetátu (príklad 9.1) za prítomnosti 568 μΐ etyldiizopropylamínu. Reakčná zmes sa mieša počas 2 hodín pri teplote miestnosti, načo sa zahustí a čistí niekoľkonásobným zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru. Potom sa získaný zvyšok na filtri rozmieša ešte dvakrát s vodou. Získa sa takto 876 mg (66 %) v názve uvedenej zlúčeniny, 1.1. = = 198 °C, DC (acetonitril/ voda/ľadová kyselina octová 5 : : 1 : 0,2), R_f= 0,63.

Analogicky, ako je opísané v príklade 12.1, sa z aminokyselinových konjugátov z príkladov 9.1, prípadne 9.2, vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 12.2 N-{N'-[0-(3-0-Metyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylaminotiokarbonylj-alanyl} -chinolón-a

Edukt: 25 mg (0,092 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.2

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/ľadová kyselina octová 90 : 10 : 1), zrážaním zo zmesi dichlórmetán/ metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru a rozmiešaním zvyšku na filtri s vodou. Výťažok je 53 mg (52 %), DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1:0,2), R_f = 0,65.

Príklad 12.3 N-{N'-[0-(3-0-Karboxymetyl-B-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl}-chinolón-a, monosodná soľ

Edukt: 523 mg (1,67 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.10, 840 mg (1,39 mmól) zlúčenina z príkladu 12.1

Po šesťhodinovom reakčnom čase sa reakčná zmes zahustí a rozmieša sa s vodou. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 8 : 0,8, neskôr v rovnakom systéme 10 :1 :1) a lyofilizácie zo zmesi dioxán/voda. Potom sa vyberie získaný zvyšok do vody a zmieša sa s jedným ekvivalentom 0,1 N hydroxidu sodného a znova sa lyofilizuje. Výťažok je 525 mg (45 %), DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f= 0,39.

Príklad 12.4 N-{N'-[0-(a-L-Rhamnozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl] -D-alanyl} -chinolón-a

Edukt: 20 mg (0,076 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.21

Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/ metylalkohol/ľadová kyselina octová 90 : 10 : 1) a zrážaním z metylalkoholu pomocou dietyléteru. Výťažok je 20 mg (34 %), DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), Rf = 0,42.

Z čiastočne chránených N-(lyzyl)-chinolón-a-konjugátov, prípadne N-(lyzyl-D-alanyl)-chinolón-a-konjugátov, sa vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 12.5 N-{N^alfa-[0-(3-0-Metyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N^epsl -[fluorenyl-9-metoxykarbonyl]-lyzyl} -chinolón-a

12.5. a) N-{N^dfc-[O-(3-O-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-N^tpsilo”-[fluorenyl-9-metoxykarbonylj-lyzyl} -chinolón-a mg (0,34 mmól) p-aminofenyl-3-O-metyl-B-L-fukozidu (príklad 1.2) sa podľa predpisu podľa príkladu 10.1.a) najprv prevedie na olejovitú látku a potom sa v 20 ml dimetylformamidu nechá reagovať s 300 mg (0,34 mmól) N-[N^ep51to,’-[fl_UOrenyl-9-meto_Xyk_arb_0nyl]-ly_Zyl}-chi_noló_nU-a, trifluóracetátu (príklad 9.11) za prítomnosti 116 μΐ etyldiizopropylamínu. Reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti, načo sa zahustí a čistí zrážaním z dichlórmetánu pomocou dietyléteru. Potom sa získaný zvyšok na filtri rozmieša ešte s vodou a lyofilizuje sa zo zmesi dioxánu a vody. Získa sa takto 290 mg (79 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (acetonitril/voda 10 :1), Rf = 0,6.

12.5. N-fN^’-fO-O-O-Metyl-P-L-fukozylj^-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-a

288 mg (0,267 mmól) zlúčeniny z príkladu 12.5.a) sa rozpustí v 20 ml dichlórmetánu a zmieša sa s 8 ml pyridínu. Po tridsaťminútovom miešaní pri teplote 20 “C sa reakčná zmes zahustí a získaný zvyšok sa zráža z dichlórmetánu pomocou dietyléteru. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 10:10: 2). Získaný zvyšok sa rozmieša s dietyléterom a lyofilizuje sa z vody. Získa sa takto 90 mg (39 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (dichlórmetán/mety 1alkohol/amoniak (17 %) 10 : 10:5), R_t = 0,4.

Analogicky, ako je opísané v príklade 12.5. sa z konjugátov z príkladov 9.11, prípadne 9.6, vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 12.6 N-{N^alfa-[O-(3-O-Karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-a, dvojsodná soľ

Edukty: 63 mg (0,2 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.10, 158 mg (0,18 mmól) zlúčenina z príkladu 9.11

Čistenie medziproduktu sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5, neskôr v rovnakom systéme 10 : 10 : 1) a v konečnom stupni viacnásobným rozmiešaním s metylalkoholom a premytím zvyšku na filtri dietyléterom. Výťažok je 44 %. Získaný zvyšok sa suspenduje vo vode a zmiešaním s dvoma ekvivalentmi 0,1 N hydroxidu sodného sa vyrobí dvojsodná soľ a roztok sa lyofilizuje. DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 10:3:1,5), R_f= 0.39.

Príklad 12.7 N-[N^alfa-[O-(3-O-Karboxymetyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl}-chinolón-a

Edukty: 147 mg (0,47 mmól) uhľohydrát z príkladu 1.10,448 mg (0,47 mmól) zlúčenina z príkladu 9.6

Čistenie medziproduktu sa vykonáva pomocou dvojnásobného zrážania zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : : 1, pomocou dietyléteru a rozmiešaním zvyšku na filtri s vodou. Výťažok je 92 %. Čistenie konečného stupňa sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 10 : 10 : 2) a zrážaním z dimetylformamidu pomocou dietyléteru. Výťažok je 59 % (acetonitril/voda/ ľadová kyselina octová 10 : 3 : 1,5), Rf = = 0,4.

Príklad 12.8 N-{N^alfa-[0-(3-0-Metyl-b-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-a, hydrochlorid

Edukty: 62,8 mg (0,22 mmól) zlúčenina z príkladu

1.25.180 mg (0,2 mmól) peptidového konjugátu z príkladu

9.11

Čistenie medziproduktu sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1 —> —> 7 : 1 —> 2 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (145,7 mg, 67 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 :1), R_f = 0.48. Potom sa rovnako, ako je uvedené v príklade 4.5, odštiepi fluorenyl-9-metoxykarbonylová skupina a vykoná sa čistenie. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky, ktorý sa suspenduje vo vode (10 ml). Táto suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou, kým nevznikne číry roztok (pH > 3). Lyofilizáciou sfiltrovaného roztoku sa získa vo forme žltej amorfnej pevnej látky (119,4 mg, 66 %), [a]_D ²⁰= + 33,8° (c = 0,28/H₂O).

Príklad 12.9 1^-(14^-(0-(3,6-di-O-Metyl-b-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-a, hydrochlorid

Edukty: 65,9 mg (0,22 mmól) zlúčenina z príkladu

1.32.180 mg (0,2 mmól) peptidového konjugátu z príkladu

9.11

Čistenie medziproduktu sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 10 :1 —> -> 7 : 1 -> 2 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (115,0 mg, 52 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5:1), Rf = 0,44. Potom sa rovnako, ako je uvedené v príklade 4.5, odštiepi fluorenyl-9-metoxykarbonylová skupina a vykoná sa čistenie. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky, ktorý sa suspenduje vo vode (10 ml). Táto suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou, kým nevznikne číry roztok (pH > 3). Lyofilizáciou sfiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (94,3 mg, 51 %), [a]_D ²⁰ = + 44,2° (c = 0,34/H₂O).

Príklad 12.10

N-(N^alfa-[0-(3-0-Metyl-a-D-manopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-a, hydrochlorid

Edukty: 62,8 mg (0,22 mmól) zlúčenina z príkladu

1.40,180 mg (0,2 mmól) peptidového konjugátu z príkladu

9.11

Čistenie medziproduktu sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1 —> —> 5 : 1 —► 1 : 1), pričom sa získa produkt vo forme žltej kryštalickej látky (96,7 mg, 44 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol 5 : 1), R_f = 0,47. Potom sa rovnako, ako je uvedené v príklade 4.5, odštiepi fluorenyl-9-metoxykarbonylová skupina a vykoná sa čistenie. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky, ktorý sa suspenduje vo vode (10 ml). Táto suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou, kým nevznikne číry roztok (pH > 3). Lyofilizáciou sfiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfiiej pevnej látky (78,2 mg, 43 %), [a]_D ²⁰= - 157,2° (c = 0,30/H₂0).

Príklad 12.11

N- (N^alfa-[O-(4-O-(3 '-O-Metyl-b-D-galaktopyranozyl)-b-D-glukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-a, hydrochlorid

Edukty: 98,4 mg (0,22 mmól) zlúčenina z príkladu 1.58, 180 mg (0,2 mmól) peptidového konjugátu z príkladu

9.11

Čistenie medziproduktu sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 20 : 10 : 1 —» 10 : 10 : 1 -> metylalkohol/amoniak (25 %) 20 : 1), pričom sa získa produkt vo forme béžovej kryštalickej látky (132,1 mg, 53 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 10 : 10 : 3), Rf = 0,60. Potom sa rovnako, ako je uvedené v príklade 4.5, odštiepi fluorenyl-9-metoxykarbonylová skupina a vykoná sa čistenie. Získa sa takto produkt vo forme žltej kryštalickej látky, ktorý sa suspenduje vo vode (10 ml). Táto suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou, kým nevznikne číry roztok (pH > 3). Lyofilizáciou sfiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (90,0 mg, 42 %), [<x]_D ²⁰ = + 192,2° (c = 0,27/H₂O).

Keď sa vychádza z nesubstituovaného chinolónu-a, vyrobia sa podľa predpisu podľa príkladu 12.1 nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 12.12 N-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylammo-tiokarbonyl]-chinolón-a, dvojsodná soľ

Edukty: 78,5 mg (0,25 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.10,70 mg (0,167 mmól) chinolón-a

Po šesťhodinovom reakčnom čase sa reakčná zmes zahustí, vyberie sa do dimetylformamidu a zmieša sa so 4 ml 0,1 N hydroxidu sodného. Čistenie sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5). Potom sa hodnota pH nastaví pomocou 0,1 N hydroxidu sodného na pH 7 a lyofilizuje sa. Výťažok je 60 mg (44 %), DC (acetonitril/ voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), Rf = 0,42, FAB-MS: m/z = 773 = M-2Na⁺+ 3H⁺.

Príklad 12.13 N-[0-(3-0-Metyl-p-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl] -chinolón-a

Edukty: 32 mg (0,12 mmól) uhľohydrátu z príkladu 1.2, 50 mg (0,12 mmól) chinolón-a

Po dvojhodinovom reakčnom čase sa čistenie vykonáva

SK 281785 Β6 pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/ľadová kyselina octová 90 : 10 : 1) a zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru. Výťažok je 59 mg (51 %), DC (acetonitril/voda 10 : 1), R_f = 0,43.

Príklad 12.14 N-{N^aJfa-[O-(3-O-Metyl-P-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}chinolón-a, hydrochlorid mg (0,1 mmól) zlúčeniny z príkladu 12.5 sa vyberie do vody a prevedie sa s jedným ekvivalentom 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej na soľ. Po lyofilizácii sa získa 88 mg v názve uvedenej zlúčeniny.

Príklad 12.15 N-jN^-fO-Q-O-Metyl-P-L-fukozylH-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-diamino-propionyl}chinolón-a, hydrochlorid

Keď sa vychádza z kyseliny N^alfa-(terc.-butoxykarbonyl)-N^beta-(fluorenyl-9- metoxykarbonyl)-L-diaminopropiónovej a chinolónu-a, tak sa vyrobí analogicky, ako je opísané v príklade 12.14 cez viacero stupňov glykokonjugát 12.15, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: : 0,2), R_f=0,3.

Príklad 13 Všeobecný vzorec

Príklad 13.1

N-{N'-[O-(3-O-Metyl-B-L-fúkozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl}-chinolón-a

13.1.a) Chinolón b: 4-Amino-7-[(3aRS, 4RS, 7aSR)-4-amino-1,3,3 a,4,7,7a-hexahydro-izoindol-2-yl]-1 -cyklopropyl-6-fluór-1,4-dihydro-8-metoxy-4-oxo-3 -chinolínkarbónová kyselina

310 mg (1 mmól) kyseliny 5-amino-l-cyklopropyl-6,7-diíluór-1,4-dihydro-8-metoxy-4-oxo-3 -chinolínkarboxylovej sa v zmesi 4 ml acetonitrilu a 2 ml dimetylformamidu zmieša so 170 ml (1,5 mmól) l,4-diazabicyklo[2.2.2]oktánu a 152 mg (1,1 mmól) (3aRS, 4RS, 7aSR)-4-amino-l,3,3a,4,7,7a-hexahydro-izoindolu a reakčná zmes sa zahrieva počas jednej hodiny do varu pod spätným chladičom. Zmes sa potom vo vákuu zahustí, získaný zvyšok sa rozmieša v asi 20 ml vody a vyzrážaný zvyšok sa odsaje a vysuší sa pri teplote 100 °C vo vákuu. Výťažok je 301 mg (70 % teória), 1.1 = 237 až 239 °C (rozklad).

13.1 .b) N-[D-Alanyl]-chinolón-b, trifluóracetát

Keď sa vychádza zo zlúčeniny 13.1.a) a N-(terc.-butoxykarbonyl)-D-alanínu, tak sa analogicky, ako je opísané v príklade 9.1, vyrobí v názve uvedená zlúčenina.

13.1 N-{N'-[0-(3-0-Metyl-B-L-fukozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbony 1-D-alanyl} -chinolón-b

Keď sa vychádza zo zlúčeniny 13.1.b) a p-aminofenyl-3-O-metyl-P-L-fukozidu (príklad 1.2), tak sa analogicky, ako je opísané v príklade 12.1, vyrobí v názve uvedená zlúčenina.

Chinolón c: kyselina 8-(2-amino-5-metyl-8-azabicyklo[4.3.0]-non-3-én-8-yl)-l-metyl-7-fluoro-5-oxo-5H-tiazolo[3.2-a]-chinolín-4-karboxylová

Príklad 14.1 N-ÍN^-tO-OO-Metyl-b-D-galaktopyranozylH-hydroxyfenylamino-tiokarbonylj-lyzyl} -chinolón-c, hydrochlorid

14.1 .a) N-[N^epsllon-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl-lyzyl)-chinolón c, trifluóracetát

Edukty: N^alfa-(terc.-butoxykarbonyl)-N^epsllon-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl-lyzín (1,4 g, 370 mmól), chinolón-c (820 mg, 1,9 mmól)

Výroba medziproduktu sa vykonáva analogicky, ako je opísané v príklade 9.1.a). Prezrážaním zo zmesi etylalkohol/dietyléter sa získa produkt vo forme svetlo žltej kryštalickej látky (1,37 g, 82 %), z ktorej sa analogicky, ako je opísané v príklade 9.1.b), uvoľní zlúčenina 14.1.a). Získa sa takto produkt vo forme oranžovej kryštalickej látky (1,25 g, 74 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 30:10: l),R_f=0,7, t. t.= 180°C.

14.1 N- {N^alfa-[O-(3-O-Metyl-b-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-c, hydrochlorid

Analogicky, ako je opísané v príklade 12.5, sa nechá reagovať zlúčenina 1.25 (62,8 mg, 0,22 mmól) s peptidovým konjugátom 14.1.a) (178,4 mg, 0,2 mmól). Čistenie medzistupňa sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 30 : 6 : 1 -> -> 30 : 10 : 1). Získa sa takto produkt vo forme svetlo žltej kryštalickej látky (97,0 mg, 44 %), DC (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (25 %) 30 : 10 : 1), Rf = 0,23. Potom sa, ako je opísané, odštiepi fluorenyl-9-metoxykarbonylová skupina. Získa sa produkt vo forme žltej kryštalickej látky, ktorá sa suspenduje vo vode (10 ml), načo sa suspenzia za miešania po kvapkách zmieša s 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou, kým sa nezíska číry roztok (pH > 3). Lyofilizáciou prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (75,8 mg, 41 %), [a]_D ²⁰ = + 12,5° (c = 0,27/H₂O).

Analogicky, ako je opísané v príklade 14.1, sa z peptidového konjugátu 14.1.a) vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 14.2

N-{N^alfa-[0-(3-0-Metyl-b-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-c, hydrochlorid

Edukty: 59,5 mg (0,22 mmól) zlúčenina z príkladu 1.2, 178,4 mg (0,2 mmól) peptidového konjugátu z príkladu

4.1.a)

Čistenie medziproduktu sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 30:6:1 —> 30:10:1), pričom sa získa produkt vo

SK 281785 Β6 forme svetlo žltej kryštalickej látky (146,6 mg, 67 %), DC (dichlórmetán/ metylalkohol/amoniak (25 %) 30 : 6 : 1), Rf = 0,48. Potom sa rovnako, ako je uvedené, odštiepi fluorenyl-9-metoxykarbonylová skupina a prevedie sa na hydrochlorid. Získa sa takto produkt vo forme žltej amorfiiej látky (107,7 mg, 60 %), [a]_D ²⁰ = + 51,6 ⁰ (c = 0,36/H₂O).

Príklad 14.3 N-jN^tO-P-O-Karboxymetyl-P-L-fukozylH-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-c, dvojsodná soľ

Keď sa vychádza zo zlúčeniny 14.1.a), tak sa analogicky, ako je opísané v príklade 12.6, vyrobí cez niekoľko stupňov glykokonjugát 14.4, FAB-MS: m/z = 911 = = M-2Na+3h.

Príklad 14.4 N-{N^alfa-[O-(3-O-Metyl-p-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-lyzyl}-chinolón-c, hydrochlorid

Konjugát sa vyrobí analogicky ako izomér v príklade 14.2, FAB-MS: m/z = 867 = M + H.

Príklad 15

Chinolón d: kyselina 4-(2-amino-8-azabicyklo[4.3.0]-non-4-én-8-yl)-l-cyklopropyl- 6,8-difluoro-l,4-dihydro-4-oxo-chinolín-4-karboxylová

Príklad 15.1 N_{N^a,&.[O.(3.O_Metyl-b-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl)-chinolón-d, hydrochlorid

15.1 .a) N-(N^cpsll°ⁿ-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl}-

-chinolón-d, trifluóracetát

N^alíi-(terc.-Butoxykarbonyl)-N^ep511on-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzín (1,4 g, 3,0 mmól) sa nechá reagovať rovnako, ako je opísané v príklade 9.1 .a), s chinolónom d, hydrochloridom (1,28 mg, 2,8 mmól). Zrážaním zo zmesi dichlórmetán/metylalkohol 1 : 1 pomocou dietyléteru sa získa produkt vo forme béžovej kryštalickej látky (1,97 g, 83 %), z ktorej sa analogicky, ako je opísané v príklade

9.1.b), uvoľní zlúčenina 15.1. Získa sa takto produkt vo forme béžovej kryštalickej látky (1,7 g, 70 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 28 : 14 : 1), R_f = = 0,60,1.1. = 215 °C.

15.1 N-{N^idfa-[0-(3-0-Metyl-b-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-d, hydrochlorid

Analogicky, ako je opísané v príklade 12.5, sa nechá reagovať zlúčenina 1.25 (62,8 mg, 0,22 mmól) s peptidovým konjugátom 15.1.a) (173,2 mg, 0,2 mmól). Čistenie medzistupňa sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 28 : 14 : 1 —> -> metylalkohol/amoniak (25 %) 20 : 1). Získa sa takto produkt vo forme béžovej kryštalickej látky (140,8 mg, 65 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 28 : 14 : 1), R_f = 0,06. Potom sa odštiepi, ako je opísané, fluorenyl-9-metoxykarbonylová skupina a produkt sa čistí. Získa sa takto béžová kryštalická látka, ktorá sa suspenduje vo vode (10 ml) a suspenzia sa za miešania po kvapkách zmieša s 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou, kým nevznikne číry roztok (pH >3). Lyofilizáciou prefiltrovaného roztoku sa získa produkt vo forme žltej amorfnej pevnej látky (102,6 mg, 57 %), [a]?²⁰ = - 49,0⁰ (c = 0,26/H₂O).

Analogicky, ako je opísané v príklade 15.1, sa z peptidového konjugátu 15.1.a) vyrobia nasledujúce glykokonjugáty:

Príklad 15.2 N-{N^alfa-[0-(4-0-(3'-0-Metyl-b-D-galaktopyranozyl)-b-D-glukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl}-chinolón-d, hydrochlorid

Edukty: 98,4 mg (0,22 mmól) zlúčenina z príkladu 1.58,173,2 mg (0,2 mmól) peptidového konjugátu z príkladu 15.1 .a)

Čistenie medziproduktu sa vykonáva pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 20 : 10 : 1 —> 10 : 10 : 1 —► metylalkohol/ amoniak (25 %) 20 : 1), pričom sa získa produkt vo forme béžovej kryštalickej látky (106,5 mg, 43 %), DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (25 %) 10 : 10 : 3), R_f = 0,51. Potom sa rovnako, ako je uvedené, odštiepi fluorenyl-9-metoxykarbonylová skupina a prevedie sa na hydrochlorid. Získa sa takto produkt vo forme žltej amorfnej látky (82,0 mg, 39 %), [ajo²⁰ = + 22,8 ⁰ (c = 0,29/H₂O).

Príklad 16

Glykokonjugáty s melfalanom Všeobecný vzorec a

n-1.2

Príklad 16.1 N-{N'-[O-(3-O-Metyl-B-L-fiikopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl}-melfalan

16.1 .a) N-terc.-Butoxykarbonyl-D-alanyl-melfalan

114 mg (0,6 mmól) N-terc.-butoxykarbonyl-D-alanínu sa rozpustí v 10 ml dimetylformamidu a pri teplote 0 °C sa zmieša so 138 mg N'-(3-dimetylaminopropyl)-N-etylkarbodiimidu, hydrochloridu a s 1-hydroxy-benzotriazolom. Po 10 minútach sa pridá 153 mg melfalanu a reakčná zmes sa mieša počas 16 hodín pri teplote miestnosti. Potom sa zahustí a rozdelí sa medzi dichlórmetán a vodu. Organická fáza sa premyje, vysuší sa pomocou bezvodého síranu sodného, zahustí a potom sa čistí pomocou okamihovej chromatografie s použitím zmesi dichlórmetán/metylalkohol/ amoniak (17 %) 15 : 2 : 0,2 —> 15 : 4 : 0,5. Získa sa takto 134 mg (56 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (dichlórmetán/metylalkohol/amoniak (17 %) 15 : 4 : 0,5), R_f = = 0,45.

16.1 N-{N'-[0-(3-0-Metyl-B-L-fukopyranozyl)-4-hydro- xyfenylamino-tiokarbonyl]-D-alanyl}-melfalan

Odštiepenie ochrannej skupiny a populácie s uhľohydrátom sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 9.1, prípadne 12.1, DC (acetonitril/voda 10 : 1), R_f = 0,26, FAB-MS: m/z = 685 = M + H.

SK 281785 Β6

Príklad 16.2

N-{N'-[O-(3-O-Metyl-B-L-fiikopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-alanyl}-melfalan

Táto zlúčenina sa môže vyrobiť cez niekoľko stupňov analogicky, ako je opísané v príklade 16.1, DC (acetonitril/voda 10:1), R_f= 0,2, FAB-MS: m/z = 756 = M + H.

Príklad 17

Glykokonjugáty s doxorubicínom (adriamycín) Všeobecný vzorec

Príklad 17.1 N-{N'-[0-(3-0-Metyl-B-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-alanyl-alanyl}-doxorubicín

17.1 .a) N-[0-(3-0-Metyl-P-L-fiikopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-alanyl-alanyl

160 mg (1 mmól) alanyl-alanínu sa vyberie do 20 ml zmesi dioxán/voda 1:1a zmieša sa s 1 ml Httnnigovej bázy. 1,2 mmól p-aminofenyl-2-O-metyl-B-L-fiikozidu (príklad 1.2) sa podľa príkladu 10.1.a) najprv premení na olejovitú látku a potom sa pridá k roztoku dipeptidu. Reakčná zmes sa nechá miešať počas 16 hodín pri teplote miestnosti a potom sa zahustí a získaný zvyšok sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (acetonitril/voda 15 : 1). Po zahustení zodpovedajúcich frakcií sa produkt vyzráža zo zmesi metylalkohol/dietyléter. Výťažok je 267 mg (57 %).

17.1 N-{N'-[O-(3-O-Metyl-B-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-alanyl-alanyl}-doxorubicín mg (0,1 mmól) zlúčeniny z príkladu 17.1.a) sa rozpustí v 10 ml dimetylformamidu a zmieša sa s 23,1 mg N'-(3-dimetylaminopropyl)-N-etyl-karbodiimidu, hydrochloridu a s 21 mg 1-hydroxy-benzotriazolu. Po 5 minútach sa pridá 30 mg doxorubicínu a 35 μΐ Httnnigovej bázy a reakčná zmes sa mieša počas 30 minút pri teplote miestnosti. Potom sa zahustí a čistí sa pomocou okamihovej chromatografie (dichlórmetán/metylalkohol 88 : 12). Zodpovedajúce frakcie sa zahustia a lyofilizujú sa zo zmesi dioxán/voda. Získa sa takto 20 mg (40 %) v názve uvedenej zlúčeniny, DC (dichlórmetán/metylalkohol 10 : 1), R_f = 0,17, ES1: m/z = 997 = M + H.

Príklad 17.2 N-{N^alfa,N'^psilo-bis-[O-(3-O-Metyl-P-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl] -D-lyzyl-alanyl} -doxorubicín

17.2.a) N- {N^a‘^fa,N^epsilo-bis-[0-(3-0-Metyl-3-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-lyzyl-alanín

580 mg (1,31 mmól) bis-trifluóracetátu D-lyzyl-alanínu sa nechá reagovať rovnako, ako je uvedené v príklade

17.1.a), za prítomnosti 1,3 ml Httnnigovej bázy s 2,2 ekvi valentmi uhľohydrátu z príkladu 1.2. Po čistení pomocou okamihovej chromatografie so zmesou acetonitril/voda 10 : : 1 sa získa 446 mg (41 %) v názve uvedenej zlúčeniny.

17.2 N- {N^alfa,N'^psil°ⁿ-bis-[O-(3-O-Metyl-P-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-D-lyzyl-alanyl} -doxorubicín

Reakcia 59 mg zlúčeniny z príkladu 17.2.a) s 20 mg doxorubicínu sa vykonáva rovnako, ako je opísané v príklade 17.1, pričom sa získa 15 mg konjugátu, DC (dichlórmetán/metylalkohol 85 : 15), Rf = 0,43, FAB : MS: m/z = 1 365 = M + H.

Príklad 18

Glykokonjugáty s camptothecínom Všeobecný vzorec

Príklad 18.1 20-0-{N^a*^fa,N'^T5,,on-bis-[0-(3-0-Metyl-P-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl] -lyzyl-alanyl} -camptotecín

18.1. a) 20-O-(Alanyl)-camptotecín, trifluóracetát

500 mg (1,44 mmól) camptotecínu sa rozpustí v 20 ml dimetylformamidu a potom sa zmieša s 50 mg 4-dimetylaminopyridínu a s N-terc.-butoxykarbonyl-alanín-N-karboxyanhydridu. Po 3 hodinách sa pridá ďalších 775 mg N-terc.-butoxykarbonyl-alanín-N-karboxy-anhydridu a suspenzia sa počas 16 hodín spracováva ultrazvukom. Potom sa zahustí, surový produkt sa vyberie do 50 ml dichlórmetánu a pri teplote 0 °C sa pridá do 5 ml kyseliny trifluóroctovej, po tridsaťminútovom miešaní sa zmes znova zahustí a produkt sa čistí pomocou okamihovej chromatografie (acetonitril/voda 20 : 1). Zodpovedajúce frakcie sa spoja, zahustia a lyofilizujú sa zo zmesi dioxánu a vody. Získa sa takto 712 mg (93 %) v názve uvedenej zlúčeniny, FAB-MS: m/z = 420 = M + H.

18.1. b) 20-O-(Lyzyl-alanyl)-camptothecín, bis-trifluóracetát

Konjugát z príkladu 18.1.a) sa nechá reagovať podľa štandardného predpisu s N^alfa,N^q>s'^lon-bis(terc.-butoxykarbonyl)-lyzínom a potom sa deblokuje. Získa sa takto v názve uvedená zlúčenina v 65 % výťažku.

18.1 20-0- {N^N^-bis-tO-ÍS-O-Metyl-P-L-fokopyranozyl)4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-alanyl}-camptothecín

Analogicky, ako je opísané v príklade 11.1, sa nechá reagovať p-aminofenyl-3-O-metyl-B-L-íukozid (príklad 1.2) s konjugátom z príkladu 18.1.b), výťažok; 40 %, DC (acetonitril/voda 10 :1), Rf = 0,44.

SK 281785 Β6

Príklad 18.2 20-0-{N^a,fa-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fúkopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-alanyl}-camptothecín

18.2. a) 20-0-{N^eps,l°-(Fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzyl-alanyl} -camptothecín

Konjugát z príkladu 18.1.a) sa podľa štandardného predpisu nechá reagovať s N^dfa-(terc.-butoxykarbonyl)-N^epsll°ⁿ-(fluorenyl-9-metoxykarbonyl)-lyzínom a potom sa na α-aminofúnkciu deblokuje. Získa sa takto v názve uvedená zlúčenina v 24 % výťažku, DC (acetonitril/voda 20 : : 1), Rf= 0,15.

18.2. b)20-0-{N^alfa-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-N'^psilon-(fluoreny l-9-metoxykarbonyl)-lyzyl-alanyl} -camptothecín

Zlúčenina z príkladu 18.1.a) sa modifikuje analogicky, ako je opísané v príklade 12.6, prípadne 12.5 s derivátom uhľohydrátu z príkladu 1.10. Surový produkt, ktorý sa dá čistiť digeráciou s vodou, sa lyofilizuje zo zmesi dioxán/voda a dá sa použiť bez ďalšej charakterizácie v nasledujúcom stupni.

18.2 20-0-{N^alfa-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukopyranozyl)- 4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonylJ-lyzyl-alanyl) -camptothecín

Konjugát 18.2.b) sa deblokuje piperidínom v dimetylformamide. Po 30 minútach sa zahustí a získaný zvyšok sa digeruje dvakrát s dichlórmetánom. Potom sa vyberie do dimetylformamidu a zráža sa pomocou zmesi metylalkohol/dietyléter. Produkt sa odsaje, premyje sa dietyléterom a lyofilizuje sa zo zmesi dioxán/voda. Výťažok je 86 %, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5:1: 0,2), R_f = = 0,17.

Príklad 18.3 20-0-{N^dfa-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fúkopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-alanyl}-camptothecín, sodná soľ mg (0,074 mmól) konjugátu z príkladu 18.2 sa vyberie do zmesi dioxán/ voda a prevedie sa pomocou ekvivalentu 0,1 N hydroxidu sodného na sodnú soľ. Výťažok je kvantitatívny, DC (acetonitril/voda/ľadová kyselina octová 5: 1 : 0,2), R_f= 0,17.

Analogicky, ako je opísané v príkladoch 18.1 a 18.2, sa vyrobia nasledujúce glykokonjugáty camptothecínu:

Príklad 18.4 20-0-{N^al&,bF^IKÍlo-bis-[0-(3-0-Metyl-P-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-D-alanyl} -camptothecín

Príklad 18.5 20-0-{N^aHa,N^cp”^lol’-bis-[0-(3-0-Metyl-p-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl] -lyzyl-valinyl} -camptothecín

Príklad 18.6 20-0-{N^alťa-[0-(3-0-Karboxymetyl-B-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl] -lyzyl-valinyl} -camptothecín

Príklad 18.7 20-0-{N^alfil-[0-(3-0-Metyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl]-lyzyl-valinyl}-camptothecín

Príklad 18.8

20-0-{N^alfa-[0-(3-0-Mctyl-P-D-galaktopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl] -lyzyl-alanyl} -camptothecín

Príklad 18.9

20-0-{N^alfl-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-íukopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl] -lyzyl-valinyl} -camptothecín, hydrochlorid

Zlúčenina 18.6 sa prevedie s jedným ekvivalentom 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej na hydrochlorid.

Príklad 18.10

20-0-{N^al&-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenylamino-tiokarbonyl] -lyzyl-alanyl} -camptothecín, hydrochlorid

Zlúčenina 18.2 sa prevedie s jedným ekvivalentom 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej na hydrochlorid.

Príklad 18.11

20-0-{N^alfa-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonylj-lyzyl-fenylalanyl)-camptothecín, hydrochlorid

Príklad 18.12 20-0-{N^al&,N^<:psilon-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-alanyl}-camptothecín, sodná soľ

Príklad 18.13 20-0-{N^al&,N'^psi,on-bis-[0-(3-0-Karboxymetyl-P-L-fukopyranozyl)-4-hydroxy-fenylamino-tiokarbonyl]-lyzyl-valinylj-camptothecín, sodná soľ

Príklad 18.14 20-0-{N^alfa-bis-[0-(3-0-Metyl-P-L-fúkopyranozyl)-4-hydroxyfenyl-amino-tiokarbonyl] -lyzyl-alanyl} -camptothecín, sodná soľ

Claims (10)

1. Uhľohydrátmi modifikované cytostatiká všeobecného vzorca (1)

K-Sp-L-AAl-AA2-C (I), v ktorom

K znamená nesubstituovaný alebo regioselektívny modifikovaný uhľohydrátový zvyšok,

Sp znamená prípadne substituovanú arylénovú alebo alkylénovú skupinu

L znamená skupinu

R pričom

R znamená atóm chlóru alebo hydroxyalkylaminoskupinu a AA1 znamená zvyšok aminokyseliny v D- alebo L-konfigurácii, ktorý prípadne môže niesť ochranné skupiny alebo druhú skupinu K-Sp-L, v ktorej K, Sp a L môžu mať významy uvedené nezávislé od inej skupiny K-Sp-L- alebo znamená priamu väzbu,

AA2 znamená aminokyselinový zvyšok v D- alebo L-konfigurácii, ktorý prípadne môže niesť druhú skupinu K-Sp-L- v ktorej K, Sp a L môžu mať významy uvedené nezávislé od inej skupiny K-Sp-L- alebo znamená priamu väzbu a

SK 281785 Β6

C znamená cytotoxický zvyšok alebo zvyšok cytostatika alebo derivátu cytostatika, ktorý môže niesť dodatočne aminoskupinu alebo hydroxyskupinu a ich izoméry a soli.

2. Uhľohydrátmi modifikované cytostatiká podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I), v ktorom

K znamená uhľohydrátový zvyšok všeobecného vzorca (II) %

v ktorom

A znamená metylovú skupinu, hydroxymetylovú skupinu, karboxyskupinu, ako i od nej odvodené estery a amidy, alkoxymetylovú skupinu, acyloxymetylovú skupinu alebo karboxyalkyloxymetylovú skupinu, ako i od nej odvodené estery a amidy alebo môže tiež znamenať skupinu CH₂-B, pričom B môže byť opäť cez anoméme centrum pripojený uhľohydrátový zvyšok všeobecného vzorca (II) a

R₂, R₃ a R4 znamenajú jednotlivo alebo spoločne rovnaký vodíkový atóm, hydroxyskupinu, alkoxyskupinu, karboxyalkoxyskupinu, ako i od nej odvodené estery a amidy, hydroxyalkoxyskupinu, aminoalkoxyskupinu, acyloxyskupinu, karboxyalkylkarbonyloxyskupinu, sulfátovú skupinu, fosfátovú skupinu, atóm halogénu alebo ďalší v rovnakom rámci modifikovaný a cez anoméme centrum pripojený uhľohydrátový zvyšok všeobecného vzorca (II), pričom R₂ môže znamenať dodatočne tiež aminoskupinu alebo acylaminoskupinu alebo dva zo zvyškov R₂, R₃, R, môžu tiež spoločne znamenať epoxyskupinu.

a Sp, L, AA1, AA2 a C majú uvedený význam, a ich izoméry a soli.

3. Uhľohydrátmi modifikované cytostatiká podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I), v ktorom

Sp znamená arylénový zvyšok, ktorý je modifikovaný v orto-, metá- alebo para-polohe s K a L a okrem toho môže niesť ešte 1 až 4 ďalších substituentov, ktoré môžu byť rovnaké alebo rôzne a znamená vodíkový atóm, metylovú skupinu, metoxyskupinu, hydroxyskupinu, karboxyskupinu, metyloxykarbonylovú skupinu, kyanoskupinu, nitroskupinu, atóm halogénu, sulfonylovú skupinu alebo sulfónamidovú skupinu alebo môže tiež znamenať lineárny alebo rozvetvený alkylénový zvyšok a K, L, AA1, AA2 a C majú uvedený význam, a ich izoméry a soli.

4. Uhľohydrátmi modifikované cytostatiká podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I), v ktorom

C znamená nukleozid, endiín-antibiotikum, cytotoxické peptidové antibiotikum, kyselinu chinolónkarboxylovú alebo kyselinu naftyridónkarboxylovú, batracylín, 5-fluorouracil, cytozínarabinozid, metotrexat, etopozid, camptothecín, daunomycín, doxorubicín, taxol, vinblastín, vinkristín, dynemicín, calicheamycín, esperamycín, quercetín, suramin, erbstatín, cyclophosphamid, mitomycín C, melphalan, cysplatín, bleomycín, staurosporín alebo iné antineoplasticky aktívne účinné látky, a K, L, AA1, AA2 a Sp majú uvedený význam, a ich izoméry a soli.

5. Uhľohydrátmi modifikované cytostatiká podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I), v ktorom

AA1 znamená zvyšok aminokyseliny, odvodenej od lyzínu, alanínu, kyseliny asparáge vej, kyseliny glutamovej, glycínu, omitínu, tyrozínu, valínu alebo serínu, v D- alebo L-konfigurácii, ktorý je prípadne spojený s ďalšou skupinou K-Sp-L- alebo znamená priamu väzbu, a K, L, C, AA2 a Sp majú uvedený význam, a ich izoméry a soli.

6. Uhľohydrátmi modifikované cytostatiká podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I), v ktorom

AA2 znamená zvyšok aminokyseliny, odvodenej od lyzínu, alanínu, glycínu, omitínu, kyseliny diaminopropiónovej alebo serínu, v D- alebo L-konfigurácii, ktorý je pripadne spojený s ďalšou skupinou K-Sp-L- alebo znamená priamu väzbu, a K, L, C, AA1 a Sp majú uvedený význam, a ich izoméry a soli.

7. Uhľohydrátmi modifikované cytostatiká podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I), v ktorom

C znamená zvyšok všeobecného vzorca (III)

T-Q (III), v ktorom

Q znamená zvyšok vzorca pričom

R¹ znamená prípadne halogénom alebo hydroxyskupinou, raz alebo dvakrát substituovanú alkylovú skupinu s 1 až 4 uhlíkovými atómami, vinylovú skupinu, pripadne 1 alebo 2 atómami fluóru substituovanú cykloalkylovú skupinu s 3 až 6 uhlíkovými atómami, bicyklo[l.l.l]pent-l-ylovú skupinu, 1,1-dimetylpropargylovú skupinu, 3-oxetanylovú skupinu, metoxyskupinu, aminoskupinu, metylaminoskupinu, dimetylaminoskupinu, prípadne halogénom, aminoskupinou alebo hydroxyskupinou, raz alebo dvakrát substituovanú fenylovú skupinu alebo môže tiež spoločne s R' tvoriť tiež tam opísaný mostík,

R^b znamená hydroxyskupinu, alkoxyskupinu s 1 až 3 uhlíkovými atómami alebo nitrometylovú skupinu,

R^c znamená vodíkový atóm alebo metylovú skupinu alebo tiež môže s R⁸ tvoriť tam opísaný mostík,

R^d znamená vodíkový atóm, metylovú skupinu, fluórmetylovú skupinu alebo metylénovú skupinu,

X¹ znamená vodíkový atóm, atóm halogénu alebo nitroskupinu,

X² znamená vodíkový atóm, atóm halogénu, aminoskupinu, hydroxyskupinu, metoxyskupinu, merkaptoskupinu, metylovú skupinu, halogénmetylovú skupinu alebo vinylovú skupinu,

Y znamená dusíkový atóm alebo skupinu C-R', pričom

R^e znamená vodíkový atóm, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu, metoxyskupinu, difluórmetoxyskupinu, metylovú skupinu, kyanoskupinu, etylénovú skupinu alebo acetylénovú skupinu alebo tiež spoločne s R^a môžu tvoriť mostík Štruktúry -*O-CH₂-CH-CH₃, -’S-CH₂CH₂-, -*S-CH₂-CH-CH₃, -*CH₂-CH₂-CH-CH₃ alebo -’0-CH₂-N-R^f, pričom označený atóm je spojený s uhlíkovým atómom Y a pričom

R^f znamená vodíkový atóm, metylovú skupinu alebo formylovú skupinu a

D znamená dusíkový atóm alebo skupinu C-R⁸, pričom

SK 281785 Β6

R⁸ znamená vodíkový atóm, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu, metoxyskupinu, difluórmetoxyskupinu alebo metylovú skupinu alebo tiež spoločne s R^c môžu tvoriť mostík štruktúry -*O-CH₂-, -*NH-CH₂-, -’N^j-CHr, N(C₃H₅)-CH₂- alebo - S-CH₂-, pričom označený atóm je spojený s uhlíkovým atómom D, n znamená číslo 1,2 alebo 3 a

T znamená zvyšok vzorca ícO* / pričom

R^h znamená skupiny

-0-, -N-R^k-, -CH₂-O- alebo -CH₂-N-R^k, pričom

R^k znamená vodíkový atóm alebo metylovú skupinu a R' znamená vodíkový atóm, alkylovú skupinu s 1 až 3 uhlíkovými atómami alebo cyklopropylovú skupinu, a K, L, AA1, AA2 a Sp majú uvedený význam, a ich izoméry a soli.

8. Uhľohydrátmi modifikované cytostatiká podľa náro- pričom

R^h znamená skupiny -N-R^k-, pričom

R^k znamená vodíkový atóm alebo metylovú skupinu a

R¹ znamená vodíkový atóm alebo metylovú skupinu a ich izoméry a soli.

9. Liečivo, obsahujúce jednu alebo niekoľko zlúčenín podľa nárokov 1 až 8.

10. Použitie zlúčenín všeobecného vzorca (I) podľa nárokov 1 až 8 na výrobu liečiv.

1 výkres ku 7 všeobecného vzorca (I), v ktorom Q znamená zvyšok vzorca