SK286518B6 - Purifikovaný a izolovaný polypeptidový fragment PAF-AH, spôsob jeho produkcie a použitia, farmaceutická kompozícia, izolovaný polynukleotid, DNA vektor a hostiteľská bunka - Google Patents

Abstract

Purifikovaný a izolovaný polypeptidový fragment ľudskej plazmovej acetylhydrolázy faktora aktivujúceho doštičky (PAF-AH), ktorému chýba až prvých dvanásť N-koncových aminokyselín zrelej aminokyselinovej sekvencie ľudskej PAF-AH SEQ ID NO:8, a jeho variant alebo variantný fragment. Izolovaný polynukleotid kódujúci PAF-AH, ako je DNA; DNA vektor odvodený od tejto DNA; hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná touto DNA; spôsob produkcie PAF-AH pestovaním hostiteľskej bunky a farmaceutická kompozícia obsahujúca PAF-AH. PAF-AH a farmaceutická kompozícia s jeho obsahom sa hodí na liečenie pleurísie, astmy, rinitídy, nekrotizačnej enterokolitídy, syndrómu akútneho respiračnéhodistresu, akútnej pankreatitídy, reperfúzneho poškodenia, septikémie, predčasného pôrodu alebo neurologickej choroby spojenej s infekciou HIV.

Description

Predkladaný vynález sa týka všeobecne PAF acetylhydrolázy (AH) (hydrolázy hydrolyzujúcej faktor aktivujúci doštičky) a špecifickejšie novopurifikovaných a izolovaných polynukleotidov kódujúcich ľudskú plazmovú PAF acetylhydrolázu a produktov PAF-AH kódovaných polynukleotidmi. Ďalej materiálov a metód produkcie produktov rekombinantnej PAF-AH a protilátok proti PAF-AH.

Doterajší stav techniky

PAF je biologicky aktívny fosfolipid syntetizovaný rôznymi typmi buniek. In vivo a pri normálnych koncentráciách 10-10 až 10-9 M PAF aktivuje cieľové bunky (ako napríklad krvné doštičky a neutrofily) väzbou na špecifické povrchové receptory spojené s G proteinmi (Venable et al., J. Lipid Res., 34, 691 - 701 (1993)). PAF má štruktúru l-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-fosfocholín. Aby bola biologická aktivita optimálna, musí byť na sn-1.pozícii chrbtice PAF naviazaný éterovou väzbou mastný alkohol a na sn-3 pozícii musí byť fosfocholínová vedúca skupina.

PAF pracuje pri normálnych fyziologických procesoch (napr. zápaloch, zástave krvácania a pôrode) a jeho úloha je predpokladaná v prípade patologických zápalových procesov (napr. astmy, anafylaxie, septického šoku a artritídy) (Venable et al., pozri predchádzajúce citácie, Lmdsberg et al., Ann. Neurob, 30: 117 - 129 (1991). Pravdepodobnosť úlohy PAF v patologických odpovediach viedla k pokusom modulovať aktivitu PAF. Najviac týchto pokusov bolo zameraných na vývoj antagonistov aktivity PAF, ktoré by interferovali s väzbou PAF na bunkové povrchové receptory. Pozri napr. Heuer et al., Clin. Exp. Allergy, 22: 980 - 983 (1992).

Syntéza a sekrécia PAF, jeho degradácia a vyčistenie sú zrejme vysoko kontrolované, a to do takej miery, že patologické pôsobenie PAF môže byť výsledkom zrútenia regulačných mechanizmov PAF. To vedie k jeho nadmernej produkcii, nepatričnej produkcii alebo neschopnosti degradácie. Alternatívny zdroj modulácie aktivity PAF by zahrnovalo napodobovanie alebo zväčšovanie prírodných procesov, ktorými dochádza k rozlíšeniu zápalu. Makrofágy (Stafforini et al., J. Biol. Chem., 265 (17): 9682 - 9687 (1990), hepatocyty a ľudské hepatómové bunkové línie HepG2 (Saton et al., J. Clin. Invest., 87: 476 - 481 (1991) a Tarbet et al., J. Biol. Chem., 266(25): 16667 - 16673 (1991) opísali uvoľňovanie enzymatickej aktivity, PAF acetylhydroláza (PAF-AH), ktorá inaktivuje PAF. Okrem toho, že inaktivuje PAF, PAF-AH tiež inaktivuje oxidatívne fragmentované fosfolipidy, ako sú napr. produkty arachidónovej kaskády, ktoré prenášajú zápal (pozri Stremler et al., J. Biol. Chem., 266(17): 11095 - 11103 (1991). Inaktivácia PAF PAF-AH je spôsobená predovšetkým hydrolýzou PAF na sn-2 acetylovanej skupine a PAF-AH metabolizuje oxidatívne fragmentované fosfolipidy tak, že odníma sn-2 acylskupinu. Dva typy PAF-AH boli identifikované: cytoplazmatická forma nájdená v rôznych typoch buniek a tkanív, ako sú endotelové a erytrocyty a extraceluláma forma nájdená v plazme a sére. Plazmová PAF-AH nehydrolyzuje intaktné fosfolipidy s výnimkou PAF a táto substrátová špecificita dovoľuje enzýmu cirkulovať in vivo v plne aktívnom stave bez nepriaznivých vplyvov. Plazmová PAF-AH sa zdá byť zodpovedná za všetky degradácie PAF v ľudskej krvi ex vivo (Stafforini et al., J. Biol. Chem., 162(9): 4223 - 430 (1987)).

Zdá sa, že zatiaľ čo cytoplazmatická a plazmová forma PAF-AH majú identickú substrátovú špecificitu, má plazmová PAF-AH biochemické vlastnosti, ktoré ju odlišujú od cytoplazmatickej PAF-AH a od iných lipáz. Konkrétne je plazmová PAF-AH asociovaná s lipoproteínovými časticami, je inhibovaná disopropyl fluórfosfátom, nie je ovplyvnená vápenatými iónmi, je relatívne insenzitívna proti proteolýze a má molekulovú hmotnosť 43000 Da (pozri Stafforini et al., (1987), pozri skôr). Rovnaký Stafforiniho článok opisuje postup čiastočnej purifikácie PAF-AH z ľudskej plazmy a ďalej aminokyselinové zloženie materiálu získaného použitím tohto postupu. Cytoplazmatická PAF-AH bola purifikovaná z erytrocytov (Stafforini et al.. J. Biol. Chem., 268(6): 3857 - 3865 (1993)) a desať aminokyselinových zvyškov z amino-konca cytoplazmatickej PAF-AH bolo v článku opísaných tiež. Hattori et al., J. Biol. Chem.. 268(25): 18748 - 18753 opísal purifikáciu cytoplazmatického PAF-AH z hovädzieho mozgu. Po tom, ako bol k tomu dokumentu podaný patentový návrh, bola poublikovaná nukleotidová sekvencia cytoplazmatického PAF-AH z hovädzieho mozgu v článku Hattori et al„ J. Biol. Chem., 269(237): 23150 - 23155 (1994). 5. Januára 1995, tri mesiace po podaní patentového návrhu k tomuto dokumentu bola publikovaná nukleotidová sekvencia lipoprotein asociovanej fosfolipázy A₂ (Lp-PLA₂) s Smithkline Beecham PLC Patent Cooperation Treaty (PTC) Intemational Publication No. W095/00469. Nukleotidová sekvencia Lp-PLA₂ sa odlišuje v jednej pozícii v porovnaní s nukleotidovou sekvenciou PAF-AH predchádzajúceho vynálezu. Rozdiel v nukleotide (zodpovedajúci pozícii 1297 SEQ ID NO: 7) viedol k rozdielu v aminokyseline medzi enzýmami, ktoré boli týmito polynukleotidmi kódované. Aminokyselina v pozícii 379 SEQ ID NO: 8 je valín, zatiaľ čo aminokyselina na príslušnej pozícii Lp-PLA₂ je alanín. Okrem toho zahrnuje nukleotidová sekvencia PAF-AH predkladaného vynálezu 124 báz na 5' konci a 20 báz na 3' konci nie je prítomných v sekvencii Lp-PLA₂. Po troch mesiacoch 10. aprí2

SK 286518 Β6 la 1995 bola do GenBank pod Accession No. 024577 uložená sekvencia Lp-PLA₂, ktorá sa odlišuje 11 pozíciami v porovnaní s nukleotidovou sekvenciou PAF-AH predkladaného vynálezu. Rozdiely v nukleotidoch (zodpovedajúce pozíciám 79, 81, 84, 85, 86, 121, 122, 904, 905, 911, 983 a 1327 SEQ ID NO: 7) viedli k rozdielom v štyroch aminokyselinách v prípade enzýmov kódovaných týmito polynukleotidmi. Aminokyseliny na pozíciách 249, 250, 274 a 389 SEQ ID NO: 8 sú lyzín, kyselina asparágová, fenylalanín a leucín, zatiaľ čo príslušné aminokyseliny na príslušných pozíciách v génovej banke (GenBank) sú izoleucin, arginín, leucín a serín.

Rekombinantná produkcia PAF-AH by umožnila použitie exogénneho PAF-AH na napodobenie či rozšírenie normálnych procesov rozoznania zápalu in vivo. Podávanie PAF-AH by poskytlo fyziologickú výhodu pred podávaním antagonistov receptora PAF, pretože PAF-AH je látka normálne sa vyskytujúca v plazme. Antagonisty receptora PAF, ktoré sú štruktúrne príbuzné PAF, tiež inhibujú natívnu aktivitu PAF-AH. Podávanie PAF-AH by tak chránilo žiaduci metabolizmus PAF a metabolizmus oxidatívne fragmentovaných fosfolipidov. Inhibícia aktivity PAF-AH pomocou antagonistov receptora PAF-AH tak vlastne marí kompetitívnu blokádu receptora PAF antagonistmi (pozri Stremler et al., pozri skôr). Okrem toho v mieste akútneho zápalu sa napríklad uvoľňujú oxidanty, ktoré vedú k inaktivácii natívneho enzýmu PAF-AH, a to ústi následne do zvýšenej lokálnej hladiny PAF a látok príbuzných PAF (PAF-like). Tieto látky môžu ďalej súťažiť s ktorýmkoľvek exogénne podaným antagonistom PAF receptora o väzbu na PAF receptor. Oproti tomu by ošetrenie rekombinantným PAF-AH zvýšilo endogénnu aktivitu PAF-AH, čím by sa kompenzovala akákoľvek inaktivácia endogénneho enzýmu. Existuje teda v tomto odbore potreba identifikácie a izolácie polynukleotidovej sekvencie kódujúcej ľudský plazmový PAF-AH a ďalej potreba vyvinúť materiál a metódy použiteľné na rekombinantnú produkciu PAF-AH a výrobu látok na detekciu PAF-AH v plazme.

Podstata vynálezu

Prvým aspektom predmetu vynálezu je purifikovaný a izolovaný polypeptidový fragment ľudskej plazmovej acetylhydrolázy doštičky-aktivujúceho faktora (PAF-AH), ktorému chýba až prvých dvanásť N-koncových aminokyselín zrelej aminokyselinovej sekvencie ľudskej PAF-AH SEQ ID NO: 8.

Vo výhodnom uskutočnení tento polypeptidový fragment PAF-AH

-je vybraný zo skupiny skladajúcej sa z

a) polypeptidu, ktorý má Met|₆ SEQ ID NO: 8 ako počiatočnú N-koncovú aminokyselinu,

b) polypeptidu, ktorý má Ala₄- SEQ ID NO: 8 ako počiatočnú N-koncovú aminokyselinu,

c) polypeptidu, ktorý má Ala₄₈ SEQ ID NO: 8 ako počiatočnú N-koncovú aminokyselinu a/alebo

- chýba mu až 30 C-koncových aminokyselín aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO: 8 a/alebo

- má ako svoj C-koncový zvyšok, zvyšok vybraný zo skupiny skladajúcej sa z:

a) Ile₄₂9

b) Leu₄₃| a

c) Asn₄₄|.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež ľudský (humánny) polypeptidový fragment PAF-AH obsahujúci Met₄₆ SEQ ID NO: 8 ako N-koncový zvyšok a Ile₄₂9 alebo Asn₄₄, ako C-koncový zvyšok.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež variantný polypeptidový fragment PAF-AH podľa základného uskutočnenia prvého aspektu vynálezu, ktorý vykazuje v sekvencii SEQ ID NO: 8 náhradu aminokyseliny, vybranú zo skupiny skladajúcej sa z

a) S 108 A

b) S 273 A

c) D 286 A

d) D 286 N

e) D 296 A

f) D 304 A

g) D 338 A

h) H 351 A

i) H 395 A

j) H 399 A

k) C 67 S

l) C 229 S

m) C 291 S

n) C 334 S a

o) C 407 S;

a ďalej tiež variantný ľudský polypeptid PAF-AH, ktorý vykazuje v sekvencii SEQ ID NO: 8 náhradu aminokyseliny, vybranú zo skupiny skladajúcej sa z

SK 286518 Β6

a) D 286 A

b) D 286 N a

c) D 304 A.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež izolovaný polynukleotid kódujúci ktorýkoľvek z uvedených polypeptidových fragmentov PAF-AH, jeho variantov alebo variantných fragmentov, predovšetkým potom izolovaný polynukleotid kódujúci ľudský fragment PAF-AH alebo variantný fragment vykazujúci Met₄₆ v SEQ ID NO: 8, ako N-koncový zvyšok, a Ilc₄₂9 alebo Asn_44], ako C-koncový zvyšok. Týmto polynukleotidom môže byť DNA.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež DNA vektor obsahujúci uvedenú DNA a hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná touto DNA spôsobom, ktorý umožní v tejto hostiteľskej bunke expresiu PAF-AH polypeptidového fragmentu, jeho variantu alebo variantného fragmentu.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež spôsob produkcie polypeptidového fragmentu PAF-AH, jeho variantu alebo variantného fragmentu plazmového PAF-AH kultiváciou uvedenej hostiteľskej bunky vo vhodnom živnom médiu, po ktorej sa izoluje PAF-AH fragment, jeho variant alebo variantný fragment z buniek alebo ich rastového média. Polypeptidový fragment PAF-AH, jeho variant alebo variantný fragment produkovaný týmto spôsobom rovnako patrí do rozsahu vynálezu.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež farmaceutická kompozícia obsahujúca uvedený fragment PAF-AH, jeho variant alebo variantný fragment a farmaceutický prijateľné riedidlo, adjuvans alebo nosič.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež opísaný polypeptidový fragment PAF-AH, jeho variant alebo variantný fragment a od neho odvodená farmaceutická kompozícia na použitie pri liečení cicavca susceptibilného k PAF-mediovanému patologickému stavu alebo postihnutého týmto stavom, pričom množstvo PAF-AH produktu alebo farmaceutickej kompozície postačuje na doplnenie PAF-AH aktivity a inaktiváciu patologických účinkov PAF pri cicavcovi. Uvedeným patologickým stavom je pleurísia, astma, rinitída, nekrotizačná enterokolitída, syndróm akútneho respiračného distresu, akútna pankreatitida, reperfuzne poškodenie, septikémia, predčasný pôrod alebo neurologická choroba spojená s infekciou HIV.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež použitie uvedeného polypeptidového fragmentu PAF-AH, jeho variantu alebo variantného fragmentu alebo uvedenej farmaceutickej kompozície na výrobu liečiva slúžiaceho na uvedené účely.

Predkladaný vynález poskytuje novopurifikovane a izolované polynukleotidy (napr. DNA a RNA - obidve vlákna) kódujúce ľudskú plazmovú PAF-AH alebo jej enzymaticky aktívne fragmenty. Preferovaná sekvencie DNA vynálezu zahrnujú genómové a cDNA sekvencie a tiež čiastočne alebo celkovo chemicky syntetizované sekvencie DNA. Vo vynáleze sú uvažované sekvencie DNA kódujúce PAF-AH, ktoré sú opísané v SEQ ID NO: 7 a sekvencie DNA, ktoré hybridizujú pri stringentných podmienkach s nekódujúcim vláknom tejto sekvencie alebo, ktoré by pre redundanciu genetického kódu hybridizovali. Vo vynáleze je tiež uvažovaná biologická repliky (napr. kópie izolovaných sekvencii DNA vytvorených in vivo alebo in vitro) sekvencii DNA vynálezu. Zaistené sú tiež autonómne sa replikujúce rekombinantné konštrukty, ako sú plazmidové a vírusové vektory s inkorporovanými sekvenciami PAF-AH a predovšetkým potom vektory, kde je DNA kódujúca PAF-AH operatívne zviazaná s endogénnymi alebo exogénnymi expresnými kontrolnými DNA sekvenciami a transkripčnými terminátormi.

Podľa ďalšej stránky vynálezu sú prokaryotické a eukaryotické hostiteľské bunky stabilne transformované sekvenciami DNA vynálezu spôsobom dovoľujúcim požadovanú expresiu PAF-AH vnútri týchto buniek. Hostiteľské bunky exprimujúce PAF-AH produkty môžu slúžiť na rozličné užitočné ciele. Takéto bunky vytvárajú hodnotný zdroj imunogénov na vývoj protilátkových substancií špecificky imunoreagujúci s PAFAH. Hostiteľské bunky podľa vynálezu sú jasne použiteľné pri metódach produkcie PAF-AH vo veľkých objemoch, pri ktorých sú bunky pestované vo vhodných kultivačných médiách a požadované polypeptidové produkty sú izolované z týchto buniek alebo z média, v ktorom boli bunky pestované, napríklad imunoafinitnou purifikáciou.

Neimunologické metódy uvažované vynálezom purifikácie PAF-Ah z plazmy zahrnujú tieto kroky: a) izoláciu nízkohustotných lipoproteínových častíc; b) solubilizáciu uvedených nízkohustotných lipoproteínových častíc v pufri obsahujúcom lOmM CHAPS. Takto je vytvorený prvý roztok PAF-AH enzýmu; c) nanesenie uvedeného prvého roztoku enzýmu PAF-AH na DFAF anión innexovú kolónu; d) premytie uvedenej DEAE anión-ionexovej kolóny pufrom s pH približne 7,5 obsahujúcim lmM CHAPS e) elúciu enzýmu PAF-AH z uvedenej DEAF anión-ionexovej kolóny do frakcií pufrom s pH približne 7,5 obsahujúcim gradient NaCl 0 až 0,5M; f) spojenie frakcií majúcich enzymatickú aktivitu PAF-AH eluovaných z uvedenej DFAF anión-ionexovej kolóny, g) prevedenie uvedených spojených aktívnych frakcií z uvedenej DEAE anión-ionexovej kolóny do lOmM CHAPS, tak bol vytvorený druhý roztok PAF-AH enzýmu; h) nanesenie uvedeného druhého roztoku enzýmu na afinitnú kolónu s blue dye ligandom; i) elúciu enzýmu PAF-AH z uvedenej afinitnej kolóny s blue dye ligandom pufrom obsahujúcim lOmM CHAPS a chaotropické soli; j) nanesenie eluátu z uvedenej afinitnej kolóny s blue dye ligandom na afinitnú kolónu s Cu ligandom; k) elúciu enzýmu PAF-AH z uvedenej afinitnej kolóny s Cu ligandom pufrom obsahujúcim lOmM CHAPS a imi4

SK 286518 Β6 dazol; 1) nanesenie eluátu z uvedenej afinitnej kolóny s Cu ligandom na SDS-PAGE a m) izoláciu približne 44kDa enzýmu PAF-AH z SDS polyalkrylamidového gélu. Prednostne je pufer v kroku b) 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, pH 7,5; pufer v kroku d) je 25mM Tris-HCl, lmM CHAPS; kolóna kroku h) je kolóna s Blue Sepharose Fast Flow; pufer v kroku i) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5 KSCN, pH 7,5; kolóna v kroku j) je Cu Chelating Sepharose kolóna a pufer kroku k) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl, 50mM imidazol pri pH v rozmedzí okolo 7,5 - 8,0.

Metóda uvažovaná vo vynáleze na purifikáciu enzymaticky aktívneho PAF-AH z E. coli produkujúcej PAF-AH zahrnuje tieto kroky: b) nanesenie uvedeného centrifugačného supematantu na afinitnú kolónu s blue dye ligandom; c) elúciu enzýmu PAF-AH z uvedenej afinitnej kolóny s blue dye ligandom pufrom obsahujúci lOmM CHAPS a chaotropické soli; d) nanesenie eluátu z uvedenej afinitnej kolóny s blue dye ligandom na afinitnú kolónu s Cu ligandom; e) elúciu enzýmu PAF-AH z uvedenej afinitnej kolóny s Cu ligandom pufrom obsahujúcim lOmM CHAPS a imidazol. Prednostne je kolóna kroku b) kolóna s Blue Sepharose Fast Flow; pufer kroku c) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M KSCN, pH 7,5; kolóna v kroku d) je Cu Chelating Sepharose kolóna a pufer kroku e) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl, 50mM imidazol, pH 7,5.

Vo vynáleze je uvažovaná ešte iná metóda purifikácie enzymaticky aktívneho PAF-AH z E. coli produkujúcej PAF-AH. Táto metóda zahrnuje tieto kroky: a) príprava centrifugačného supematantu z lyzovanej E. coli produkujúcej enzým PAF-AH; b) zriedenie uvedeného centrifugačného supematantu v pufri s nízkym pH obsahujúcim lOmM CHAPS; c) nanesenie uvedeného zriedeného centrifugačného supematantu na katión-iemexovú kolónu ekvilibrovanú na pH okolo 7,5; d) elúciu enzýmu PAF-AH z uvedenej katiónionexovej kolóny IM soľou; e) zvýšenie pH uvedeného eluátu z uvedenej katión-ionexovej kolóny a upravenie koncentrácie solí uvedeného eluátu na koncentráciu solí okolo 0,5M; f) nanesenie uvedeného eluátu z uvedenej katión-ionexovej kolóny na afinitnú kolónu s blue dye ligandom; g) elúciu enzýmu PAF-AH z uvedenej afinitnej kolóny s blue dye ligandemi pufrom obsahujúcim soli s koncentráciou okolo 2M až 3M; h) dialýzu uvedeného eluátu z uvedenej afinitnej kolóny s blue dye ligandom použitím pufra obsahujúceho asi 0,1 % Tween. Prednostne je pufer v kroku b) 25mM MES, lOmM CHAPS, lmM EDTA, pH 4,9; kolóna v kroku c) je S Sepharose kolóna ekvilibrovaná v 25mM MES, lOmM CHAPS, lmM EDTA, 50mM NaCl, pH 5,5; PAF-AH je v kroku d) eluovaná lmM NaCl; pH eluátu v kroku e) je upravená na pH 7,5 použitím 2M Tris-bázy; kolóna v kroku f) je kolóna sepharosy; pufer v kroku g) je 25mM 1 ris, lOmM CHAPS, 3M NaCl, lmM EDTA, pH 7, 5 a pufer v kroku h) je 25mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,1 % Tween 80, pH 7,5.

Vo vynáleze je uvažovaná ešte jedna metóda purifikácie enzymaticky aktívneho PAF AH z E. coli. Táto metóda zahrnuje nasledujúce kroky: a) prípravu extraktu E. coli, ktorá vedie po lýze v pufri obsahujúcom CHAPS k supematantu obsahujúcemu solubilizovaný PAF-AH; b) riedenie uvedeného supematantu a jeho aplikáciu na anión-ionexovú kolónu ekvilibrovaného na pH okolo 8,0; c) elúciu enzýmu PAF-Ah z uvedenej anión-ionexovej kolóny; d) nanesenie uvedeného adjustovaného eluátu z uvedenej anión-ionexovej kolóny na afinitnú kolónu obsahujúcu „blue dye ligand“; d) elúciu uvedenej kolóny obsahujúcej „blue dye ligand“ pufrom obsahujúcim 3,0M soľ; f) zriedenie eluátu z kolóny obsahujúcej „blue dye ligand“ do pufra vhodného na realizáciu hydroxylapatitovej chromatografie; g) realizáciu hydroxylapatitovej chromatografie, kde je premytie a elúcia uskutočnená pomocou pufrov (s obsahom či bez obsahu CHAPS); h) nariedenie uvedeného hydroxylapatitového eluátu na koncentráciu soli vhodnú na katión-ionexovú; i) nanesenie uvedeného nariedeného hydroxylapatitového eluátu na katión-ionexovú kolónu pri pH pohybujúcom sa v rozmedzí približne 6,0 až 7,0; j) elúciu PAF-AH z uvedenej katión-ionexovej kolóny vhodným pufrom s vhodným zložením; k) realizáciu katión-ionexovej chromatografie pri chlade; a 1) zloženie kvapalnej alebo zmrazenej formy PAF-AH v neprítomnosti CHAPS.

Najlepšie je v uvedenom kroku: a) lyzovací pufer má zloženie: 25mM Tris, lOOmM NaCl, lmM EDTA, 20mM CHAPS, pH 8,0; v kroku b) riedenie supematantu pre: anión-ionexovú chromatografiu je 3 - 4 krát do 25mM Tris, lmM EDTA. lOmM CHAPS, pH 8,0 a kolóna je Q-Sepharosová kolóna ekvilibrovaná 25mM Tris, lmM EDTA, 50mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku c) je anión-ionexová kolóna vymývaná s použitím 25mM Tris, lmM EDTA, 350mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku d) je eluát z kroku c) aplikovaný priamo na afinitnú kolónu s „blue dye ligandom“; v kroku e) je kolóna eluovaná pufrom obsahujúcim 3M NaCl, lOmM CHAPS, 25mM Tris, pH 8,0; v kroku f) je eluát z Blue dye zriedený pre hydroxylapatitovú chromatografiu. Eluát je zriedený lOmM fosforečnanom sodným, lOOmM NaCl, lOmM CHAPS, pH 6,2; v kroku g) je hydroxylapatitová chromatografia sprevádzaná použitím hydroxylapatitovej kolóny ekvilibrovanej lOmM fosforečnanom sodným, lOOmM NaCl, lOmM CHAPS. Elúcia je uskutočňovaná s použitím 50mM fosforečnanu sodného, lOOmM NaCl (s či bez lOmM CHAPS), pH 7,5; v kroku h) je uskutočňované nariedenie uvedeného hydroxylapatitového eluátu pre katión-ionexovou chromatografiou pomocou pufra s pH v rozmedzí približne 6,0 až 7,0 a obsahujúcim fosforečnan sodný (s či bez CHAPS); v kroku i) je kolóna s S-Sepharosou ekvilibrovanou 50mM fosforečnanom sodným (s či bez lOmM CHAPS), pH 6,8; v kroku j) je elúcia uskutočnená pufrom vhodného zloženia ako napríklad 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. asparágová, 125mM NaCl, pH 7,5 a obsahujúceho 0,01 % Tween 80; v kroku k) je uskutočnená katión5

SK 286518 Β6 ionexová chromatografia pri 2 - 8 °C. Príkladom na vhodné zloženie pufra použiteľného v kroku 1), ktorý stabilizuje PAF-AH je 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. asparágová, 125mM NaCl, pH približne 7,4 (s či bez prídavku Tween 80 a/alebo Plurinicu F68) alebo 25mM fosfátový (K+) pufer obsahujúci (prinajmenšom) 125mM NaCl, 25mM arginín a 0,01 % Tween-80 (s či bez Pluronicku F68 v koncentrácii približne 0,1 a 0,5 %).

Ešte jedna metóda purifikácie enzymaticky aktívneho rPAF-AH produktu E. coli je uvažovaná vo vynáleze. Táto metóda zahrnuje nasledujúce kroky: a) prípravu extraktu E. coli, ktorá po lýze v pufri obsahujúcom Triton X-100 vedie k solubilizovanému supematantu produktu rPAF-AH; b) nariedenie uvedeného supematantu a jeho nanesenie na afinitnú „exchange“ kolónu s imobilizovaným kovom ekvilibrovanú na pH okolo 8,0; c) elúciu produktu rPAF AH z uvedenej afinitnej „exchange“ kolóny s imobilizovaným kovom pufŕom obsahujúcim imidazol; d) úpravu koncentrácie solí a nanesenie uvedeného eluátu z afinitnej „exchange“ kolóny s imobilizovaným kovom na hydrofóbnu kolónu (hydrophobic mteraction column (HIC#1); e) elúciu uvedenej H1C#1 znížením koncentrácie solí a/alebo zvýšením koncentrácie detergentov; f) titráciu uvedeného eluátu z H1C#1 na pH okolo 6,4; g) nanesenie uvedeného upraveného eluátu z H1C#1 na katiónionexovú kolónu (CEX#1) ekvilibrovanú na pH cca 6,4; h) elúciu uvedenej CEX#1 s použitím koncentrácie chloridu sodného; i) úpravu uvedeného eluátu z CEX#1 pomocou chloridu sodného na koncentráciu okolo 2,0M; j) nanesenie uvedeného eluátu z CEX#1 na hydrofóbnu kolónu (hydrophobic interaction column (H1C#2) ekvilibrovanú na pH okolo 8,0 a koncentráciu chloridu sodného okolo 2,0M; k) elúciu uvedenej H1C#2 znížením koncentrácie soli a/alebo zvýšením koncentrácie detergentov; 1) nariedenie uvedeného eluátu z H1C#2 a úpravu pH na hodnotu okolo 6,0; m) nanesenie uvedeného upraveného eluátu z H1C#2 na katión-ionexovú kolónu (CEX#2) ekvilibrovaní na pH okolo 6,0; n) elúciu produktu rPAF-AH z uvedenej CEX#2 pufrom s vhodným zložením.

Najlepšie je použiť v uvedenom kroku a) lyzovací pufer 90mM TRIS, 0,125 % Triton X-100, 0,6M NaCl, pH 8,0. Lýza je uskutočnená vo vysokotlakovom homogenizátore; v kroku b) je supematant nariedený ekvilibračným pufrom (20mM TRIS, 0,5M NaCl, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0), zinková chelátová kolóna (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia, Uppsala, Švédsko) je nabitá a ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom. Na kolónu j e nanesený nariedený supematant a kolóna je premytá pufrom so zložením 20mM TR1 S, 0,5M NaCl, 4M močovina, 0,1 % Triton X-100, pH 8,0 a ďalej premytý 20mM TRIS, 0,5M NaCl, 0,02 % Triton X-100, pH 8,0; v kroku c) je elúcia dokonalá pomocou roztoku so zložením 20mN Tris, 50mM imidazol, 0,02 % Triton X-100, pH 8,0; v kroku d) je eluát upravený na lmM EDTA a 2M NaCl, kolóna Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia) je ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom (2,0M NaCl, 25mM Tris, 0,02 % Triton X-100, pH 8, 0) a je na ňu nanesený eluát z kroku c) pri izbovej teplote. Kolóna je premytá ekvilibračným pufrom a ďalej je premytá roztokom so zložením 25mM NaPO₄, 0,20 % Triton X-100, pH 6,5 rýchlosťou 30 cm/hod.; v kroku e) je elúcia dokonalá pomocou roztoku 25mM NaPO₄, 3 % Triton X-100, pH 6,5; v kroku g) je kolóna Macroprep High S Column (Bio-Rad Labs, Richmond, CA, USA) ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom (20mM NaPO₄, 0,02 % Triton X-100, pH 6,4). Upravený eluát z kroku f) je nanesený na kolónu, premytý ekvilibračným pufrom a ďalej premytý pufrom so zložením 25mM NaPO₄, 0,02 % Triton X-100, pH 8,0; v kroku h) je elúcia dokonalá pomocou roztoku so zložením 25mM NaPO₄, 0,02 % Triton X-100, 1,3M NaCl, pH 8,0; v kroku j) je Bakerbond Wide Póre Hi-Propyl C₃ (Baker, Philipsburg, NJ) ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom (0,02 % Triton X-100, 2M NaCl, 25mM Tris, pH 8,0). Upravený eluát z kroku i) je nanesený pri izbovej teplote na túto kolónu, kolóna je premytá ekvilibračným pufrom a ďalej je premytá roztokom so zložením 0,20 % Triton X-100, 25mM Tris, pH 8,0 rýchlosťou 30 cm/hod.; v kroku k) je elúcia dokonalá pri použití roztoku so zložením lOmM Tris, 3,0 % Triton X-100, pH 8,0; v kroku 1) je nariedenie do ekvilibračného pufra (20mM sukcinát, 0,1 % PLURONIC F68 pH 6,0); v kroku m) je kolóna SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrovaná ekvilibračným pufrom kroku 1) a na ňu ďalej nanesený eluát z kroku 1) kolóna je premytá ekvilibračným pufrom; a v kroku n) je elúcia dokonalá pomocou roztoku so zložením 50mM NaPO₄, 0,7M NaCl, 0,1 % PLURONIC F68,0,02 % TWEEN 80, pH 7,5.

PAF-AH produkty môžu byť získané ako izoláty z prírodných bunkových zdrojov alebo môžu byť chemicky syntetizované.

Prednostne sú ale produkované rekcimbinantnými postupmi zahrnujúcimi hostiteľské eukaryotické a prokaryotické bunky tohto vynálezu. PAF-AH produkty, ktoré majú časť alebo celú aminokyselinovú sekvenciu opísanú v SEQ ID NO: 8 sú uvažované v tomto vynáleze. Predovšetkým sú uvažované fragmenty, ktorým chýba až prvých dvanásť N-koncových aminokyselín ľudských aminokyselinových sekvencií PAF-AH, ktoré sú opísané v SEQ ID NO: 8. Prednostne tie, ktoré majú ako iniciačnú N-koncovú aminokyselinu Met₄₆, Ala₄₇ alebo Ala₄₈ SEQ ID NO: 8. Uvažované sú tiež fragmenty tohto, ktorým chýba až tridsať C-koncových aminokyselín aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO: 8, predovšetkým tie, ktoré majú Ile₄₂₉ a Leu₄₃₁ ako C-koncový zvyšok. Uvažované sú ďalej obmeny PAF-AH alebo PAF-AH alebo tie, ktoré majú v sekvencií SEQ ID NO: 8 nahradenú aminoskupinu a ktoré sú vybrané zo skupiny zloženej z S 108 A, S 273 A, D 286 A, D 286 N, D 296 A, D 304 A, D 338 A, H 351 A, H 395 A, H 399 A, C 67 S, C 229 S, C 291 S, C 334 S, C 407 S, D 286 A, D 286 N a D 304 A. Ako je poznamenané, sú polynukleotidy (vrátane DNA) kó6 dujúce takéto fragmenty alebo obmeny fragmentov zaistené vynálezom. Vynálezom sú zaistené tiež spôsoby rekombinantnej produkcie týchto fragmentov alebo obmien pestovaním hostiteľských buniek obsahujúcich takéto DNA. Súčasne uprednostňované PAF-AH produkty zahrnujú prokaryotické polypeptidové expresné produkty DNA kódujúce aminokyselinové zvyšky Met₄₆ až Asn₄₄₁ SEQ ID NO: 8 označované ako rPH.2 a prokaryotické polypeptidové expresné produkty DNA kódujúce aminokyselinové zvyšky Met₄₆ až Ile₄₂₉ SEQ ID NO: 8 označované ako rPH.9. Obidva produkty (rPH.2 a rPH.9) vykazujú nižšiu aminokoncovú heterogénnosť ako, napríklad, zodpovedajúce prokaryotické polypeptidové expresné produkty DNA kódujúce celú sekvenciu PAF-AH s predchádzajúcim translačným iniciačným kodónom. Okrem toho rPH.9 vykazuje vyššiu karboxykoncovú homogenitu (konzistenciu). Použitie cicavčích hostiteľských buniek je predpokladané, aby boli zaistené také posttranslačné modifikácie (napr. myristolácia, glykozylácia, skrátenie, lipidácia a tyrozín-, serín- a treonínfosforylácia), ktoré môžu byť potrebné na udelenie optimálnej biologickej aktivity rekombinantných expresných produktov vynálezu. PAF-AH produkty opísané vo vynáleze môžu mať plnú dĺžku, môžu to byť fragmenty alebo obmeny. Obmeny môžu obsahovať PAF-AH analógy, kde je jedna alebo viac špecifikovaných (napr. prirodzene kódovaných) aminokyselín vybraných alebo nahradených alebo kde je jedna alebo viac nešpecifikovaných aminokyselín pridaných 1) bez straty jednej alebo viacerých enzymatických aktivít alebo imunologických charakteristík špecifických pre PAF-AH alebo 2) so špecifickou neschopnosťou konkrétnej biologickej aktivity PAF-AH. Proteíny alebo ďalšie molekuly, ktoré sa viažu na PAF-AH, môžu byť použité na moduláciu jej aktivity.

V predkladanom vynáleze sú tiež uvažované „protilátkové“ substancie (napr. monoklonálne a polyklonálne protilátky, jednoreťazcové protilátky, chimerické protilátky, CDR vrúbľované protilátky a pod.) a ďalšie väzbové proteíny špecifické pre PAF-AH. Konkrétne demonštratívne väzbové proteíny vynálezu sú monoklonálne protilátky produkované hybridómami 90G11D a 90F2D, ktoré boli uložené v Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, 30 septembra 1994 a boli im pridelené Accession Nos. HB 11724 a HB 11725. Ďalší demonštratívny väzbový proteín vynálezu je monoklonálna protilátka produkovaná hybridómom 143A, ktorý bol uložený v ATCC 1. júna 1995 a jemu pridelené Accession No. je HB 11900. Proteíny alebo iné molekuly (napr. lipidy alebo malé molekuly), ktoré sa špecificky viažu na PAF-AH môžu byť identifikované použitím PAF-AH izolovanej z plazmy, rekombinantného PAF-AH, obmien PAF-AH alebo buniek exprimujúcich takéto produkty. Väzbové proteíny sú použiteľné následne v zmesiach na imunizáciu a tiež na purifikáciu PAF-AH. Sú tiež použiteľné na detekciu alebo kvantifikáciu PAF-AH v tekutinách a tkanivových vzorkách pomocou známych imunologických postupov. Uvažované sú tiež antiidiotypické protilátky špecifické pre PAF-AH špecifické protilátkové substancie.

Vedecká hodnota informácií poskytnutých cez odhalenie DNA a aminokyselinové sekvencie predkladaným vynálezom je zrejmá. Jedna zo série príkladov znalosť sekvencie cDNA pre PAF-AH umožňuje pri použití hybridizácií DNA/DNA izoláciu genómových DNA sekvencii kódujúcich PAF-AH a špecifikáciu PAF-AH expresných kontrolných regulačných sekvencii, ako sú promótory, operátory a pod. Postupy DNA/DNA hybridizácií uskutočňovaných so sekvenciami DNA vynálezu pri štandardných podmienkach stringencie takisto zrejme dovolia izoláciu DNA kódujúcich alelické varianty PAF-AH, ďalších štruktúrne príbuzných proteínov, ktoré majú spoločné jednu alebo viac biochemických a/alebo imunologických vlastností PAF-AH a tiež proteínových homológov PAF-AH z iných (ako ľudských) zdrojov. DNA sekvenčné informácie poskytované predkladaným vynálezom dovoľujú tiež pomocou homológnych rekombinácií alebo „knockout“ stratégií (pozri napr. Kapecchi, Science. 244, 1288 - 1292 (1989)), vývoj hlodavcov, ktoré nevedia exprimovať funkčný enzým PAF-AH alebo exprimovať obmenu PAF-AH enzýmu. Vhodne označené polynukleotidy opísané vo vynáleze sú použiteľné pri hybridizačných testoch na detekciu kapacity buniek syntetizovať PAF-AH. Polynukleotidy opísané vo vynáleze môžu byť tiež základom diagnostických metód užitočných pri identifikácii a genetických úpravách v PAF-AH centre, ktoré vyzdvihujú stav alebo stavy choroby. Dostupný robí vynález tiež antisence polynukleotidy, významné pri regulácii expresie PAF-AH tými bunkami, ktoré zvyčajne epxrimujú to isté.

Je uvažované podávanie preparátov PAF-AH vynálezu cicavčím subjektom, predovšetkým ľuďom s cieľom ameliorácie patologických zápalových stavov. Na základe dôkazov o zapojení PAF v patologických zápalových stavoch je podávanie PAF-AH indikované napr. pri ošetrení astmy (Miwa et al., J. Clin Invest., 82: 1983 - 1991 (1988); Hsieh et al., J. Allergy Clin. Immunol., 91: 650 - 657 (1993); a Yamashida et al., Allergy, 49: 60 - 63 (1994)), anafylaxie (Venable et al., pozri skôr), šoku (Venable: et al., pozri skôr), reperfuzneho poranenia a ischémie centrálneho nervového systému (Lindsberg et al. (1991), pozri skôr), antigénmi vyvolanej artritídy (Zarco et al.. Clin. Exp. Immunol., 88: 318 - 323 (1992)), aterogenézy (Handley et al., Drug Dev. Res., 7: 361 - 375 (1986)) Crohnovej choroby (Denizot et al., Digestive Diseases and Sciences, 37(3): 432 - 437 (1982)), ischemickej nekrózy čreva/nekrotizujúcej enterokolitídy (Denizot et al., pozri skôr a Caplan et al., Acta Paediatr., Suppl. 396, 11 - 17 (1994)), ulceróznej kolitídy (Denizot et al., pozri skôr), ischemickej mozgovej príhody (Saton et al., Strake 23: 1090 - 1092 (1992)), ischemického poranenia mozgu (Lindsberg et al., Stroke, 21: 1452 - 1457 (1990) a Lindsberg et al., (1991), pozri skôr), systémového lupus erythematosus (Matsizaki et al., Clinica Chimica Acta, 210: 139 - 144 (1992)), akútnej pankreatitídy (Kald et al.,

SK 286518 Β6

Pancreas, 8(4): 440 - 442 (1993)), otravy krvi (Kald et al., pozri skôr), akútnej poststreptokokovej glomerulonefritídy (Mezzano et al., J. Am. Soc. Nephrol., 4: 235-242 (1993), pľúcneho opuchu ako rekcie na liečenie IL-2 (Rabinovici et al., J. Clin. Invest., 89: 1669 - 1673 (1992)), alergického zápalu (Watanabe et al., Br. J. Pharmacol., 111: 123 - 130 (1994)), ischemického zlyhania obličiek (Grino ela., Annals oflntemal Medicíne , 121(5): 345 - 347 (1994)), predčasného pôrodu (Hoffman et. al., AM. J. Obstet. Gynecol., 162(2): 525 - 528 (1990) a Maki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 728 - 732 (1988)), syndrómu respiračnej nedostatočnosti dospelých (Rabinovici et al., J. Appl. Physiol., 74(4): 1791 - 1802 (1993), Matsumoto et al., Clin. Exp, Pharmacol. Physiol., 19: 509 - 515 (1992) a Rodriguez-Roisin et al., J. Clin Invest., 93: 188 - 194 (1994). Použitie PAF-AH prípravkov na ošetrenie HIV infekcie centrálneho nervového systému je tiež vo vynáleze uvažované. „Ošetrenie“, ako je tu používané, zahrnuje tak profylaktické, ako aj terapeutické ošetrenie.

Pre mnohé z predtým uvedených patologických stavov bol opísaný pokusný zvierací model. Napríklad myšací model pre astmu a rinitidu je opísaný v príklade 16 tohto dokumentu; králičí model pre artritídu je opísaný v Zarco et al.. pozri skôr; potkanie modely pre ischemickú nekrózu čriev/nekrotizujúcu enterokolitídu sú opísané v Furukawa et al., Ped. Res., 34(2): 237 - 241 (1993) a Caplan et al., pozri skôr; králičí model pre mŕtvicu je opísaný v Lindsberg et al., (1990), pozri skôr; myšací model pre lupus je opísaný v Matsuzaki et al., pozri skôr; potkaní model pre akútnu pankreatitídu je opísaný v Kald et al., pozri skôr; potkaní model pre opuch pľúc ako výsledok terapie IL-2 je opísaný v Rabinovici et al., pozri skôr; potkaní model alergického zápalu je opísaný v Watanable et al., pozri skôr; psí model pre obličkový aloimplantát je opísaný vo Watson et al., Transplantation, 56(4), 1047 - 1049 (1993) a potkanie a morčacie modely syndrómu respiračnej nedostatočnosti dospelých sú samostatne opísané v Rabinovici et al., pozri vyššie a Lellouch-Tubiana. Am. Rev. Respir. Dis., 137: 948 - 954 (1988).

Mimoriadne uvažované sú vo vynáleze zmesi PAF-AH použiteľné pri metóde ošetrenia cicavcov ľahko podliehajúcich alebo trpiacich patologickými stavmi spôsobenými PAF. Takéto ošetrenie zahrnuje podávanie: PAF-AH cicavcom v množstvách dostatočných na doplnenie endogénnej aktivity PAF-AH a na inaktiváciu patologických množstiev PAF u týchto cicavcov.

Terapeuticko-farmakologická zmes uvažovaná vo vynáleze zahrnuje PAF-AH produkty a fyziologicky akceptovateľné riedidlá alebo nosiče. Môže tiež zahrnovať ďalšie látky majúce protizápalové účinky. Indikované množstvo dávky by bolo dostatočné na doplnenie endogénnej aktivity PAF-AH a inaktiváciu patologických množstiev PAF. Na všeobecnú úvahu o dávkach pozri Remmington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition. Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Dávky sa budú pohybovať medzi 0,1 až asi 100 pg PAFAH/kg telesnej hmotnosti. Terapeutické zmesi vynálezu môžu byť podávané rôznymi cestami v závislosti od patologických stavov, ktoré majú byť liečené. Podávanie môže byť napríklad intravenózne, subkutánne, orálne, vo forme čapíkov a/alebo pľúcnymi cestami.

V prípade patologických stavov pľúc je podávanie PAF-AH pľúcnymi cestami prednostne indikované. Pri pulmonálnom podávaní je zvažované široké spektrum „doručovacích“ zariadení bežných pre tieto ciele, napr. nebulizéry, inhalátory s meraním a práškové inhalátory. „Doručenie“ rôznych proteínov a obehového systému inhaláciou aerosólových zmesí bolo opísané v Adjei et al., Pharm. Res., 7(6): 565 - 569 (1990) (leuprolide acetat); Braquet et al., J. Cardio. Pharm., 13(Supp.5): s. 143 - 146 (1989) (endothelin-1); Hubbard et al., Annals oflntemal Medicíne, 111(3), 206 - 212 (1989) (αΐ-antitrypsin); Smith et al., J. Clin Invest., 84: 1145 - 1146 (1989) (α-1-proteinase inhibítor); Debs et al., J. Immunol., 140: 3482 - 3488 (1993) (rekombinanntý gamainterferón a tumorový nekrotický faktor alfa); Patent Cooperation Treaty (PCT) Intemational Publication No. WO 94/20069 publikovaný 15. septembra 1994 (rekombmant pegylated granuloezyte colony stimulating factor).

Prehľad obrázkov na výkresoch

Množstvo ďalších stránok a výhod predkladaného vynálezu bude zrejmé po zvážení nasledujúcich detailných vysvetlení, v ktorých bude odkazované na obrázky, kde je:

Obr. 1: Fotografia PVDF membrány obsahujúcej PAF-AH purifikovaný z ľudskej plazmy.

Obr. 2: Graf ukazujúci enzymatickú aktivitu rekombinantnej ľudskej plazmovej PAF-AH.

Obr. 3: Schematický nákres znázorňujúci rekombinantné fragmenty PAF-AH a ich katalytické aktivity.

Obr. 4: Hmotnostná spektroskopia rPH.2 rekombinantného produktu PAF-AH.

Obr. 5: Hmotnostná spektroskopia rPH.9 - rekombinantného produktu PAF-AH.

Obr. 6: Stĺpcový graf ilustrujúci blokádu edému nohy potkana vyvolaného PAF lokálne podaným rekombinantným PAF-AH tohto vynálezu.

Obr. 7: Stĺpcový graf ilustrujúci blokádu edému nohy potkana vyvolaného PAF intravenózne podaným rekomblnantným PAF-AH.

Obr. 8: Stĺpcový graf znázorňujúci, že PAF-AH blokuje edém vyvolaný PAF, ale nie edém vyvolaný zymosanom A.

Obr. 9Λ a 9B: Antizápalová aktivita PAF-AH v prípade edému nohy potkana - závislosť od veľkosti dávky. Obr. 10A a 10B: Časová závislosť in vivo účinnosti jednej dávky PAF-AH.

Obr. 11: Čiarový graf znázorňujúci farmakokinetiky PAF-AH v krvnom obehu potkana.

Obr. 12: Stĺpcový graf znázorňujúci protizápalové účinky PAF-AH v porovnaní s nižším účinkom antagonistov PAF v prípade edému nohy potkana.

Obr. 13: Znázornenie výsledkov indikujúcich, že PAF-AH neutralizuje apoptické účinky média z HIV-1 infikovaných a aktivovaných monocytov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce uvedené príklady slúžia na ilustráciu vynálezu. Príklad 1 uvádza novú metódu purifikácie PAF-AH z ľudskej plazmy. Príklad 2 opisuje mikrosekvencovanie aminokyselinových zvyškov PAF-AH purifikovaného z ľudskej plazmy. V príklade 3 je opísané klonovanie cDNA celého génu (full lenth cDNA) kódujúceho ľudský plazmatický PAF-AH. V príklade 4 sú opísané rôzne varianty zloženia génu kódujúceho ľudský plazmatický PAF-AH. Klonovanie génových sekvencií kódujúcich ľudský plazmatický PAF-AH je opísané v príklade 5. Príklad 6 opisuje klonovanie homológov cDNA pre ľudský plazmatický PAF-AH pre psie, myšacie, hovädzie, kuracie, hlodavčie cDNA a cDNA z makaka. V príklade 7 sú opísané výsledky testu dokazujúceho enzymatickú aktivitu rekombinantného PAF-AH transientne exprimovaného v bunkách COS 7. Príklad 8 opisuje expresiu DNA reprezentujúcu kloň s plnou dĺžkou DNA, skrátenú DNA a chimérické DNA pre ľudský PAF-AH v E. coli, S. cerevisiae a cicavčích bunkách. Príklad 9 uvádza protokol purifikácie rekombinantného PAF-AH z E. coli a testy potvrdzujúce jeho enzymatickú aktivitu. Príklad 10 opisuje rôzne rekombinantné produkty pre PAF-AH vrátane analógov vzniknutých substitúciou aminokyselinových zvyškov a produktov vzniknutých skrátením na amino a karboxykoncoch. Ďalej je tu opísaný pokus dokazujúci, že natívny PAF-AH izolovaný z plazmy je glykozylovaný. Výsledky analýz uskutočnených pomocou Northem blotu na dôkaz expresie ľudskej plazmatickej PAF-AH RNA v rôznych tkanivách a bunkových líniách sú prezentované v príklade 11, zatiaľ čo výsledky hybridizácie in situ sú uvedené v príklade 12. Príklad 13 opisuje vývoj monoklonálnych a polyklonálnych protilátok špecifických pre ľudský plazmatický PAF-AH. Príklady 14, 15, 16, 17, 18 a 19 opisujú na zvieracích modeloch in vivo terapeutické vplyvy podávania rekombinantných produktov PAF-AH podľa vynálezu na akútne zápaly; zápal pohrudnice, astmu, nekrotizujúcu enterokolitidu (črevný katar), syndróm dychovej nedostatočnosti dospelých a pankreatitídu. Príklad 20 opisuje in vitro vplyv rekombinantného produktu PAF-AH na neurotoxicitu spojenú s infekciou HIV. Príklad 21 ukazuje výsledky imunologického vyšetrenia séra ľudských pacientov vykazujúcich deficienciu v aktivite PAF-AH a opisuje identifikáciu genetických porúch u pacientov, ktoré sú zrejmé zodpovedné za túto nedostatočnosť.

Príklad 1

S cieľom získania materiálu pre aminokyselinovú sekvenáciu ľudského plazmatického PAF-AH bola uskutočnená purifikácia.

A. Optimalizácia purifikačných podmienok

Najprv sa z plazmy odstránili lipoproteínové častice s nízkou hustotou (low density lipoprotein - LDL) a to pomocou precipitácie fosovolfrámanom z plazmy a následnou solubilizáciou v 0,1 % Tween 20. Ďalej nasledovala chromatografia na stĺpci DEAE (Pharmacia, Oppsala, Sweden) postupom opísaným Stafforinim a ďalšími (1987), pozri skôr, ale nekonzistentná elúcia aktivity PAF-AH zo stĺpca DEAE si vyžiadala prehodnotenie solubilizácie a následných podmienok purifikácie.

Tween 20, CHAPS (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) a oktylglukozid boli hodnotené v použitých centrifugačných metódach a gélovej filtiačnej chromatografii na svoju schopnosť solubilizovať častice LDL. CHAPS vykázal o 25 % väčšiu návratnosť aktivity v rozpustnej frakcii ako Tween 20 a o 300 % väčší výťažok aktivity ako oktylglukozid. Precipitát LDL solubilizovaný lOmM CHAPS sa potom delil na stĺpci DEAE Sepharosy Fast Flow (je to stĺpec aniónového meniča; Pharmacia) pomocou pufŕa obsahujúceho lmM CHAPS. Tak sa získalo veľké množstvo čiastočne načisteného PAF-AH („DEAE pool“), ktoré slúžilo na hodnotenie ďalších stĺpcov.

DEAE pool bol použitý ako štartovný materiál na testovanie ďalších rôznych chromatografických stĺpcov, ktoré boli použité na ďalšie čistenie aktivity PAF-AH. Medzi testovanými stĺpcami boli: Blue Sepharose Fast Fleiw (Pharmacia), stĺpec pre afinitnú chromatografiu s farebným ligandom; S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), katiónový menič; Cu Chelating Sepharose (Pharmacia), stĺpec na afinitnú chromatografiu využívajúci kovové ligandy; Fractogel S (EM Separations, Gibbstown, NJ), katiónový menič a Sephaacryl - 200 (Pharmacia), stĺpec na gélovú filtráciu. Všetky tieto chromatografické postupy však priniesli len nízky stupeň načistenia, ak sa použil lmM CHAPS. Následná gólová chromatografia na Sephacryle S-200 v lmM CHAPS poskytla enzymaticky aktívnu frakciu, ktorá sa však vymývala zo stĺpca vo väčšom rozsahu veľkostí, ako bola predpokladaná veľkosť zodpovedajúca približne: 44 kDa. Z tohto zistenia vyplýva záver, že LDL proteíny sú v roztoku agregované.

Rôzne vzorky LDL sa preto hodnotili pomocou analytickej gélovej filtrácie, keď sa hodnotil stupeň agregácie a jeho vplyv na aktivitu PAF-AH. Vzorky z DEAE poolu a čerstvo rozpustené LDL precipitáty sa analyzovali na stĺpci Superose 12 (Pharmacia) ekvilibrovanom pufrom s lmM CHAPS. Obidve vzorky sa eluovali zo stĺpca v širokom rozmedzí molekulových hmotností, najvyššia aktivita bola zistená vo frakcii s molekulovou hmotnosťou vyššou ako 150 kDa. Ak sa vzorky analyzovali na stĺpci Superose 12 ekvilibrovanom lOmM CHAPS, najväčšie množstvo aktivity sa nachádzalo vo frakcii s molekulovou hmotnosťou približne 44 kDa, čo je oblasť, kde bola aktivita predpokladaná. Vzorky, ktoré obsahovali aktivitu vo frakciách s vyššou molekulovou hmotnosťou, zodpovedali agregátom.

Aktivita ostatných vzoriek sa po nasledujúcom testovaní pomocou gélovej filtrácie nachádzal výhradne v rozsahu molekulovej hmotnosti zodpovedajúcej 44 kDa. Tieto vzorky boli precipitáty LDL rozpustené v lOmM CHAPS v prítomnosti 0,5 M NaCl a ďalej vzorky z DEAE poolu, ktoré boli upravené po elúcii zo stĺpca pomocou 10 mM CHAPS. Získané výsledky potvrdzujú, že aby sa zamedzilo agregácii vzoriek PAF-AH, je nutné použiť minimálne 10 mM CHAPS. Zvýšenie koncentrácie CHAPS z 1 mM na 10 mM po chromatografii na stĺpci DEAE celulózy, ale pred ďalšími krokmi, purifikačného postupu, navodilo dramatické zmeny v purifikačnom postupe. Napríklad, stupeň načistenia PAF-AH na stĺpci S-Sepharosy FAST Flow sa zvýšilo z dvojnásobku na desaťnásobok. Aktivita PAF-AH sa viaže v 1 mM CHAPS na stĺpec Blue Sepharosy Fast Flow ireverzibilné, ale ak sa použije s 10 mM CHAPS, vymyje sa zo stĺpca veľmi vysoká hladina aktivity. Chromatografia na stĺpci DEAE sa však pridaním 10 mM CHAPS oproti predchádzajúcim chromatografiám nezlepšila.

Chromatografia na stĺpci Cu Chelating Sepharosy, ktorá nasledovala po chromatografii na Blue Sepharose Fast Flow, zvýšilo aktivitu PAF-AH pätnásťkrát. Tiež sa zistilo, že aktivita PAF-AH sa môže obnoviť po elektroforéze na redukujúcom SDS polyakrylamidovom géli, vzorka sa však pred elektroforézou nesmie variť. Aktivita materiálu získaného elúciou zo stĺpca Cu Chelating Sepharose, sa po elektroforéze na SDS polyakrylamidovom géli a následnom farbení striebrom, vyskytovala v hlavnom prúžku proteínu.

B. Protokol na purifikáciu PAF-AH

Nový protokol na purifikáciu PAF-AH pre ciele aminokyselinového sekvencovania obsahuje nasledujúce kroky, ktoré sú uskutočňované pri 4 °C. Ľudská plazma sa rozdelila po 900 ml alikvotoch do 1-litrových fliaš firmy Nalgene a upravila sa hodnota pH na 8,6. LDL častice sa potom precipitovali pridaním 90 ml 3,85 % fosfovolfrámanu sodného a potom následným pridaním 2M MgCl₂. Plazma sa potom centrifugovala 15 minút pri 3600 g. Peleta bola resuspendovaná v 800 ml 0,2 % citrátu sodného. LDL častice sa opäť vyzrážali pomocou pridania 10 g NaCl a 24 ml 2N MgCl₂. LDL častice získané z 5 1 ľudskej plazmy sa rozpustili v 5 1 pufri A (25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, pH 7,5) a nechali sa miešať cez noc. Rozpustené LDL častice sa centrifugovali pri 3600 g počas 1,5 hodiny. Supematant sa schraňoval, potom sa prefiltroval cez filtračný papier Whatman 113, čím sa odstránili zvyšné pevné častice. Solubilizované LDL častice sa nasadili na stĺpec DEAE Sepharosy Fast Flow (11 x 10 cm; objem živice 1 1; 80 ml/min.), ktorý bol ekvilibrovaný pufrom B (25mM Tris-HCl, lmM CHAPS, pH 7,5). Stĺpec sa premýval 8 1 gradientu 0 - 0,5 M NaCl a zozbierali sa 480 ml frakcie. Tento krok bol nevyhnutný na naviazanie látok na stĺpec Blue Sepharosy Fast Flow tak, ako je to opísané ďalej. Frakcie boli testované na aktivitu acetylhydrolázy, a to metódou, ktorá je opísaná v príklade 4.

Frakcie vykazujúce aktivitu sa zliali a pridalo sa také množstvo CHAPS, aby v celom objeme frakcií koncentrácia dosiahla lOmM. Všetky frakcie získané po chromatografii na DEAE sa nanášali cez noc rýchlosťou 4 ml/min. na stĺpec Blue Sepharosy Fast Flow (5 cm x 10 cm, mŕtvy objem 200 ml) ekvilibrovaný pufrom obsahujúcim 0,5 M NaCl. Stĺpec sa premýval ekvilibračným pufrom rýchlosťou 16 ml/minútu, a to až do tej doby, než sa absorbancia vrátila na hodnotu pre absorbancie namerané pred aplikáciou vzorky. Aktivita PAF-AH sa vymývala zo stĺpca pomocou krokovej elúcie pufrom A obsahujúcim 0,5 M KSCN (chaotropná soľ), a to rýchlosťou 16 ml/min. Zbierali sa 50 ml frakcie. Tento krok viedol k viac ako tisícnásobnému načisteniu enzýmového preparátu. Zbierali sa aktívne frakcie, potom sa v celom ich nazbieranom objeme upravilo pH na hodnotu 8,0, a to pomocou IM Tris-HCl, pH 8,0. Aktívna frakcie získané po chromatografii na stĺpci Blue Sepharosy Fast Flow sa naniesla na stĺpec Cu Chelatin Sepharosy (2,5 x 2 cm, mŕtvy objem 10 ml; prietoková rýchlosť 4 ml/min.), ktorý bol ekvilibrovaný pufrom C (25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 8,0, je možné použiť aj pufer s pH 7,5). Stĺpec bol vymývaný objemom 50 ml pufra C. Aktivita PAF-AH sa vymývala zo stĺpca 100 ml 50mM imidazolu v pufri C a zozbierali sa 10-ml frakcie. Eluent s aktívnym PAF-AH sa zhromaždil a nechal sa dialyzovať proti pufru A. Okrem toho, že sa týmto krokom 15-krát zvýšila aktivita daného enzýmového preparátu PAF-AH, chromatografia na stĺpci Cu Chelating Sepharose dala len veľmi malé načistenie. Aktívny eluent zo stĺpca Cu Chelating Sepharose bol redukovaný v 50mM DTT počas 15 minút pri 37 °C a potom bol nanesený na 0,75 mm 7,5 % polyakrylamidový gél. Gélové platne boli nakrá10

SK 286518 Β6 jané na prúžky so šírkou 0,5 cm a vložené do centrifugačnej mikrokyvety na jedno použitie obsahujúcej 20 μΐ 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 150mM NaCl. Prúžky boli potom rozotrené a ponechané inkubovať v kyvete cez noc pri 4 °C. Supematant vzniknutý centrifugáciou týchto rozdrvených gélových prúžkov sa potom testoval na aktivitu PAF-AH, tým sa určilo, ktorý prúžok na géli SDS-PAGE obsahuje PAF-AH. Aktivita PAF-AH bola nájdená v prúžku, ktorý zodpovedá molekulovej hmotnosti približne 44 kDa. Proteíny z duplicitného gélu boli prenesené elektricky na PVDF membránu (Immobilon-P, Millipore) a ofarbené Comassie Blue. Fotografia PVDF membrány je na obrázku 1.

Tak, ako je ukázané v tabuľke č. 1 ďalej v texte, z 5 1 ľudskej plazmy sa získalo približne 200 pg PAFAH načisteného 2 x 10⁶. Na porovnanie Stafforini a ďalší (1987), pozri skôr, opísal vo svojom postupe načistenie aktivity 3 x 10⁴.

Tabuľka 1

Vzorka	Objem (ml)	Aktivita (cpmx 106)	Celková aktivita (cpmx 106)	Kone, proteínov (mg/ ml)	Špecifická aktivita (cpmx 106)	% návratnosti aktivity (cpmx 106)		Násobok načistenia
						krok	celk.	krok	celk.
plazma	5000	23	116	62	0,37	100	100	1	1
LOL	4500	22	97	1,76	12	84	84	33	33
DEAE	4200	49	207	1,08	46	212	178	3,7	124
Blue	165	881	14	0,02	54200	70	126	1190	1,5 x 105
Cu	12	12700	152	0,15	82200	104	131	1,5	2,2 x 105
SDS-PAGE	-	-	-	-	-	-	-	'10	2,2 x 105

Súhrnne môžeme konštatovať, že na úspešnú purifikáciu PAF-AH z plazmy s cieľom mikrosekvencovania sú unikátne a kritické nasledujúce kroky: (1) rozpustenia a chromatografia na v 10 mM CHAPS, (2) afinitná chromatografia na stĺpci s modrým ligandom, ako je Blue Sepharose Fast Flow, (3) chromatografia na Cu ligandovom afinitnom nosiči, ako je Cu Chelating Sepharose a (4) elúcia PAF-AH z gélu po SDS-PAGE.

Príklad 2

Prúžok s proteínmi s veľkosťou asi 44 kDa bol vystrihnutý z PVDF membrány obsahujúcej PAF-AH (opísané v príklade 1), sekvencia prítomných bielkovín bola stanovená pomocou proteínového sekvenátora Applied Biosystems 473A. Analýza sekvencií N-koncovej oblasti proteínov migrujúcich v oblasti asi 44 kDa, ktorá vykazuje PAF-AH aktivitu, naznačila prítomnosť dvoch majoritných a dvoch minoritných sekvencií. Pomer obidvoch majoritných sekvencií bol 1:1, preto bolo ťažké interpretovať sekvenčné dáta.

Aby bolo možné odlíšiť sekvencie obidvoch majoritných proteínov rozdelených na SDS géli, bol duplikát PVDF membrány s prúžkom okolo 44 kDa rozpolený a horná aj dolná časť bola sekvencovaná oddelene.

Sekvencia N-konca získaná z dolnej polovice membrány je takáto:

SEQ ID NO: 1

FKDLGEEAFKALVLIAF

Po prehľadaní databáz proteínov bola táto sekvencia stotožnená s fragmentom ľudského sérumalbumínu. N-koncová sekvencia stanovená v prípade materiálu z hornej polovice tej istej PVDF membrány je takáto:

SEQ ID NO: 2

IQ VLM A A ASFGQTKIP

Táto sekvencia nemala náprotivok v žiadnom proteíne zo skúmaných databáz a líšila sa od N-koncovej sekvencie aminokyselín:

SEQ ID NO: 3

MKPLVVFVLGG opísanej v prípade erytrocytového cytoplazmatického PAF-AH v Stafforini et al. (1993), pozri skôr. Nová sekvencia (SEQ ID NO: 2) bola využitá pri klonovani cDNA ľudskej plazmatickej PAF-AH, ako je to opísané ďalej v príklade 3.

SK 286518 Β6

Príklad 3

Kloň kódujúci úplnú ľudskú plazmatickú PAF-AH bol izolovaný z makrofágovej cDNA knižnice.

A. Konštrukcia makrofágovej cDNA knižnice

Z makrofágov periférnej krvi odvodených od monocytov bola izolovaná poly A+ RNA. Dvojreťazcová, tupo zakončená cDNA bola získaná pomocou súpravy Invitrogen Copy Kit (San Oiego, CA), k nej boli ligáciou pripojené adaptory BstXI a potom bola vložená do cicavčieho expresného vektora pRc(CMV (Invitrogen). Vzniknutý’ plazmid bol vnesený elektroporáciou do E. coli XL-1 Blue. Transformované baktérie boli vysiate na 978 platní v hustote asi 3000 kolónii na platňu. Plazmidová DNA pripravená oddelene z každej platne bola uložená v jednotlivých súboroch, bola tiež spojená do väčších súborov, reprezentujúcich 300 000 klonov.

B. Testovanie knižnice pomocou PCR

Makrofágová knižnica bola testovaná pomocou polymerázovej reťazovej reakcie s využitím degenerovaných „antisense“ primárov navrhnutých na základe novej N-koncvej aminokyselínovej sekvencie opísanej v príklade 2. Sekvencia priméru je uvedená v súlade s nomenklatúrou IUPAC, „I“ znamená inozín.

SEQ ID NO: 4

5' ACATGAATTCGGIATCYTTIGTYTGICCRAA 3’

Tabuľka výberu kodónov (Wada et al., Muc. Acids Res., 19S: 1981 - 1986 (1991)) bola použitá na určenie nukleotidov na tretej pozícii každého kodónu tohto priméru. Na testovanie súborov makrofágovej knižnice s 300 000 klonmi bol použitý tento primér v kombinácii s primárom špecifickým pre buď SPG alebo T7 promótora vú sekvenciu, nachádzajúcu sa po obidvoch stranách klonovacieho miesta vektora pRc/CMV. Každá PCR reakčná zmes bola zložená zo 100 ng tcmplátovej cDNA, 1 pg každého z dvoch primárov, 0,125 mM každého zo štyroch dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM MgCl₂ a 2,5 jednotky Taq peilymerázy. Začiatočný denaturačný krok trvajúci 4 minúty pri 94 °C bol nasledovaný 30 cyklami amplifikácie zloženými z 1 minúty pri 94 °C, 1 minúty pri 60 °C a 2 minút pri 72 °C. Výsledný PCR produkt bol naklonovaný do vektora pBluescript SK- (Stratagene, La Jolla, CA) a jeho nukleotidová sekvencia stanovená pomocou dideoxymetódy. Tento PCR produkt obsahoval sekvenciu odvoditeľnú od novej peptidovej sekvencie a zodpovedajúcu nukleotidom 3 až 301 (SEQ ID NO: 7).

Ďalej sú uvedené PCR primáry, špecifické pre opísaný klonovaný PCR fragment a určené na nájdenie klonu s úplnou dĺžkou.

Srdsr primŕr ťSEÍJ ID NO: 5)

5' TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG 3'

Antisense*' primér C SEČI TD NO: G) ’ CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC 3 '

PCR reakcie s využitím týchto primérov boli uskutočnené, ako to bolo opísané a poslúžili na prvé testovanie súborov cDNA s 300 000 klonmi a potom na testovanie príslušných menších súborov s 3000 klonmi. Tri súbory s 3000 klonmi, ktoré dávali PCR produkt s očakávanou veľkosťou boli použité na transformáciu baktérií.

C. Testovanie knižnice pomocou hybridizácie

DNA z týchto baktérií bola testovaná pomocou hybridizácie s využitím pôvodného naklonovaného PCR fragmentu ako sondy. Kolónie boli prenesené na nitrocelulózu, prehybridizované a hybridizované v 50 % formamide, 0,75M chloride sodnom, 0,075M citráte sodnom, 0,05M fosfáte sodnom, pH 6,5, 1 % polyvinylpyrolidóne, 1 % fikole, 1 % hovädzom sérumalbumíne a 50 ng/ml sonikovanej DNA z lososieho mliečia. Hybridizačná sonda bola značená postupom „random priming“ s hexamérmi. Hybridizácia bola uskutočnená pri 42 °C cez noc, membrány boli intenzívne obmyté 0,03M chloridom sodným, 3mM citrátom sodný, 0,1 % SDS pri 42 °C. Bola stanovená sekvencia nukleotidov v prípade 10 klonov dávajúcich pozitívny signál. Jeden z týchto klonov, sAH 406-3, obsahoval sekvenciu odvoditeľnú na základe pôvodnej peptidovej sekvencie proteínu s PAF-AH aktivitou purifikovaného z ľudskej plazmy. Sekvencie DNA a aminokyselinová sekvencia z nej odvodená sú uvedené v SEQ ID NO: 7 (DNA) a SEQ ID NO: 8 (aminokyseliny).

Kloň sAH 406-3 obsahuje 1,52 kb dlhý inzert s otvoreným čítacím rámcom, ktorý’ kóduje predpokladaný proteín zložený z 441 aminokyselín. Na N-konci sa nachádza relatívne hydrofóbny úsek s dĺžkou 41 amino12

SK 286518 Β6 kyselín pred N-koncovou aminokyselinou stanovenou mikrosekvenáciou proteínu (izoleucín v pozícii 42 v SEQ ID NO: 8). Kódovaný proteín môže mať buď dlhú signálnu sekvenciu alebo signálnu sekvenciu plus ďalší peptid, ktorý je odštiepený pri vzniku zrelého funkčného enzýmu. Prítomnosť signálnej sekvencie je jedným zo znakov sektretovaných proteínov. Okrem toho sa nachádza v proteíne kódovanom klonom sAH 406-3 konsensus motív GxSxG (aminokyseliny 271-275 v SEQ ID NO: 8), o ktorom sa predpokladá, že obsahuje serin aktívneho miesta v prípade všetkých známych cicavčích a mikrobiálnych lipáz a serínproteáz, pozri Chapus et al., Biochimie, 70: 1223 - 1224 (1988) a Brenner, Náture, 334: 528 - 530 (1988).

Tabuľka 2, predkladá porovnanie aminokyselinového zloženia ľudskej plazmatickej PAF-AH, ktorá je predmetom tohto patentu, založeného na sekvencií SEQ ID NO: 8 s aminokyselinovým zložením purifikovaného materiálu opísaným Stafforiniom et al. (1987), pozri skôr.

Tabuľka 2

	Kloň sAH 406-3	Stafforini et al.
Ala	26	24
Asp & Asn	48	37
Cys	5	14
Glu & Gin	36	42
Phe	22	12
Gly	29	58
His	13	24
íle	31	17
Lys	26	50
Leu	40	26
Met	10	7
Pro	15	11
Arg	18	16
Ser	27	36
Thr	20	15
Val	13	14
Trp	7	Nestanovené
Tyr	14	13

Aminokyselinové zloženie zrelej formy ľudskej plazmatickej PAF-AH, ktorá je predmetom tohto patentu, a aminokyselinové zloženie: predtým purifikovančho materiálu, ktorý bol označený ako ľudská plazmatická PAF-AH, je zreteľné odlišné.

Porovnanie nukleotidovej a odvodenej aminokyselinovej sekvencie hovädzej mozgovej cytoplazmatickej PAF-AH (Hattori et al., pozri skôr) s nukleotidovou sekvenciou ľudskej plazmatickej PAF-AH, ktorý je predmetom tohto patentu, neodhalilo žiadnu významnú štruktúrnu podobnosť týchto sekvencií.

Príklad 4

PCR uskutočnená s cDNA z makrofágov a stimulovaných PBMC s využitím primárov hybridizujúcich s 5' neprekladanou oblasťou (nukleotidy 31 až 52 v SEQ ID NO: 7) a oblastí obsahujúcich translačný terminačný kodón na 3'konci PAF-AH cDNA (nukleotidy 1465 až 1487 v SEQ ID NO: 7) našla predpokladaný strihový variant (splice variant) ľudského PAF-AH génu. Výsledkom tejto PCR reakcie boli dva prúžky na géli, jeden z nich zodpovedal očakávanej veľkosti PAF-AH cDNA z príkladu 3 a druhý kratší asi o 100 bp. Väčší prúžok bol identifikovaný na základe sekvencovania s PAF-AH cDNA z príkladu 3, zatiaľ čo kratšiemu prúžku chýbal exón 2 (pozri príklad 5) PAF-AH sekvencie, ktorý kóduje predpokladanú signálnu a propeptidovú sekvenciu plazmatického PAF-AH.

V kratšom klone je prítomná predpokladaná katalytická triáda a všetky cysteínové zvyšky, preto je biochemická aktivita proteínu kódovaného týmto klonom pravdepodobne zhodná s aktivitou plazmatického enzýmu.

Aby sa stanovil biologický význam tohto strihového variantu PAF-AH, o ktorom sa predpokladá, že kóduje cytoplazmatický aktívny enzým, skúmalo sa relatívne množstvo obidvoch foriem v krvných makrofágach odvodených od monocytov pomocou metódy „RNase protection“. Ani jedna z obidvoch mRNA nebola prítomná v čerstvo izolovaných monocytoch, ale obidve mRNA boli nájdené deň 2. počas in vitro diferenciácie monocytov do makrofágov a pretrvávali počas 6 dní kultivácie. Množstvo obdivoch mRNA bolo približne rovnaké počas celého obdobia diferenciácie. Naopak podobná analýza nervového tkaniva detegovala len expresiu mRNA s úplnou dĺžkou kódujúcej extracelulámu úplnú formu PAF-AH.

SK 286518 Β6

Príklad 5

Takisto boli izolované genómové sekvencie ľudskej plazmatickej PAF-AH. Štruktúra PAF-AH génu bola stanovená izoláciou fágových klonov lambda a 1, obsahujúcich ľudskú genómovú DNA, pomocou DNA hybridizácie v podmienkach vysokej stringencie. Fragmenty fágových klonov boli ďalej klonované a sekvenované pomocou primérov prisadajúcich v pravidelných intervaloch k cDNA klonu sAH 406-3. Navyše boli pripravené nové sekvenačné priméry homológne k oblastiam intrónov hraničiacim s exónmi a využité na protismerové sekvencovanie cez hranice exón-intrón s cieľom potvrdenia sekvencie. Hranice exón/intrón boli definované ako body, kde sa genómová sekvencia a cDNA začínajú odlišovať. Táto analýza zistila zloženie ľudského PAF-AH génu z 12 exónov.

Exóny 1, 2, 3, 4, 5, 6 a časť exónu 7 boli izolované z mužskej fetálnej placentámej knižnice konštruovanej v lambda FIX (Stratagene). Fágové plaky boli prenesené na nitrocelulózu, prehybridizované a hybridizované v 50 % formamide, 0,75M chloride sodnom, 75mM citráte sodnom, 50mM fosfáte sodnom (pH 6,5), 1 % polyvinylpyrolidóne, 1 % fikole, 1 % hovädzom serérumalbumíne a 50 ng/ml sonikovanej DNA z lososieho mliečia. Úplný cDNA kloň sAH 406-3 bol použitý ako hybridizačná sonda na identifikáciu fágových klonov obsahujúcich exóny 2-6 a časť exónu 7. Kloň obsahujúci exón 1 bol identifikovaný pomocou fragmentu odvodeného z 5'konca tohto cDNA klonu (nukleotidy 1 až 312 v SEQ ID NO: 7). Obidve sondy boli značené pomocou 32P metódou „random priming“ s hexamérmi. Hybridizácia bola uskutočňovaná pri 42 °C cez noc, membrány boli intenzívne obmyté 30mM chloridom sodným, 3mM citrátom sodným, 0,1 % SDS pri 42 °C. DNA sekvencie exónov 1, 2, 3, 4, 5 a 6 spolu s čiastočnými sekvenciami susediacich intrónov sú uvedené v SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13 a 14.

Zvyšok exónu 7 a exóny 8, 9, 10, 11a 12 boli naklonované z Pl klonu izolovaného z ľudskej Pl genómovej knižnice. Plaky Pl fágov boli prenesené na nitrocelulózu, prehybridizované a hybridizované v 0,75M chloride sodnom, 50mM fosfáte sodnom (pH 7,4), 5mM EDTA, 1 % polyvinylpyrolidóne, 1 % fikole, 1 % hovädzom sérumalbumíne, 0,5 % SDS a 0,1 mg/ml celkovej ľudskej DNA. 2,6 kb

EcoRI fragment genómovej DNA odvodený od 3'konca klonu lambda izolovaného predtým bol použitý ako sonda a označený pomocou 32P metódou „random priming“ s hexamérmi. Tento fragment obsahoval exón 6 a časť exónu 7, prítomného vo fágovom klone. Po hybridizácii cez noc pri 65 °C boli membrány obmyté, ako to bolo opísané. DNA sekvencie exónov 7, 8, 9, 10, 11 a 12 spolu s čiastočnými sekvenciami susediacich intrónov sú uvedené v SEQ ID NO: 15, 16,17, 18,19 a 20.

Príklad 6

Úplné klony cDNA plazmatickej PAF-AH boli izolované z cDNA knižnice z myšacej, psej, hovädzej a slepačej sleziny, neúplný hlodavčí kloň bol izolovaný z cDNA knižnice z potkanieho týmusu. Tieto klony boli identifikované pomocou hybridizácie s nízkou stringenciou s ľudskou cDNA (hybridizačné podmienky boli rovnaké, ako to bolo opísané v prípade exónov 1 až 6 v príklade 5, len namiesto 50 % formamidu bol použitý formamid 20 %). Ako sonda bol použitý 1 kb Hind III fragment ľudského PAF-AH cDNA klonu sAH 406-3 (nukleotidy 309 až 1322 v SEQ ID NO: 7). Okrem toho bol izolovaný neúplný opičí kloň z cDNA z mozgu makaka pomocou PCR a primérov navrhnutých podľa sekvencie nukleotidov 285 až 303 a 851 až 867 zo SEQ ID NO: 7. Nukleotidové a odvodené aminokyselinové sekvencie cDNA klonov z myši, psa, kravy, sliepky, potkana a makaka sú uvedené v tomto poradí v SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25 a 26.

Porovnanie odvodených aminokyselinových sekvencii cDNA klonov s ľudským cDNA klonom poskytlo údaje o podiele identických aminokyselín v percentách, ktoré sú uvedené v tab. 3.

Tabuľka 3

	Človek	Pes	Myš	Krava	Sliepka
Pes	80	100	64	82	50
Myš	66	64	100	64	47
Opica	92	82	69	80	52
Potkan	74	69	82	69	55
Krava	82	82	64	100	50
Sliepka	50	50	47	50	100

Asi 38 % aminokyselinových zvyškov je kompletne konzervovaných vo všetkých sekvenciách. Najpremenlivejšie oblasti sa nachádzajú na N-konci (obsahujú signálnu sekvenciu) a na C-konci a nie sú významné pre enzýmovú aktivitu, ako je ukázané v príklade 10. Motív Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly (SEQ ID NO: 27) nájdený v neutrálnych lipázach a iných esterázach je konzervovaný v hovädzej, psej, myšacej, potkanej a slepačej PAF-AH. Serín, nachádzajúci sa uprostred tohoto motívu, slúži týmto enzýmom ako aktívne nukleofilné miesto. Predpokladané aspartámové a histidínové zložky aktívneho miesta (Príklad 10A) sú takisto konzervované. Ľudská plazmatická PAF-AH, ktorá je predmetom tohto patentu, teda pravdepodobne využíva kata14 lytickú triádu a môže zabrať α/phydrolázovú konformáciu typickú pre neutrálne lipázy, aj keď inak nevykazuje sekvenčnú homológiu s lipázami.

Ľudská plazmatická PAF-AH by mala obsahovať oblasť, ktorá špecificky interaguje s lipoproteínovými časticami (low density a high density) v plazme. N-koncová časť molekuly s obsahom dlhých úsekov vysoko medzidruhovo konzervovaných aminokyselín, ale nie katalytických triád enzýmu, by mohla sprostredkovať tieto interakcie.

Príklad 7

Expresný konštrukt pRC/CMV bol krátkodobo exprimovaný v bunkách COS 7 s cieľom stanovenia PAF-AH aktivity proteínu, kódovaného sAH 406-3 klonom cDNA ľudského plazmatického PAF-AH (Príklad 3). PAF-AH aktivita v médiu z COS buniek bola zisťovaná tri dni po transfekcii týchto buniek pomocou DEAE dextránu.

Bunky boli zaočkované v hustote 300 000 buniek na jednu kultivačnú misku s priemerom 60 mm. Nasledujúci deň boli bunky inkubované 2 hodiny v DMEM obsahujúcom 0,5 mg/ml DEAE extráne, 0,lmM chloroquine a 5 - 1 pg plazmatickej DNA. Potom boli bunky opracované 10 % DMSO v PBS počas 1 minúty, obmyté médiom a inkubované v DMEM obsahujúcom 10 % fetálne teľacie sérum, v ktorom bola predtým inaktivovaná endogénna PAF-AH aktivita pomocou diizopropylfluorofosfátu (DFP). Po troch dňoch inkubácie bola v médiách z transformovaných buniek zisťovaná PAF-AH aktivita. Meranie tejto aktivity boli uskutočňované v prítomnosti a neprítomnosti buď lOmM EDTA alebo lmM DFP, aby sa zistilo, či rekombinantný enzým vyžaduje vápnik a či je inhibovaný DFP, ktorý je inhibítorom serínesteráz, ako to bolo opísané v prípade PAF-AH Stafforiniom et al., (1987), pozri skôr. Negatívne kontroly zahrnovali bunky transformované pRc/CMV bez inzertu alebo s inzertom sAH 406-3 v opačnej orientácii.

PAF-AH aktivita v supematantoch z transformovaných buniek bola zisťovaná metódou Stafforiniho et al., (1990), pozri skôr, s nasledujúcimi modifikáciami. Stručne zhrnuté, PAF-AH aktivita bola stanovená meraním hydrolýzy 3H acetátu z [acetyl-3H] PAF (New England Nuclear, Boston, MA). Voľný 3H acetát vo vodnej fáze bol oddelený od značeného substrátu pomocou chromatografie v reverznej fáze na oktadecylsilikagéle (Baker Research Products, Philipsburg, PA). Stanovenia boli uskutočňované s 10 μΐ supematantu z transformovaných buniek v O,1M Hepes pufri, pH 7,2, v reakčnom objeme 50 μΐ. V jednej reakcii bolo použité celkovo 50 pmol substrátu s pomerom značený : neznačený PAF 1:5. Reakčné zmesi boli inkubované 30 minút pri 37 °C a zastavené pridaním 40 μΐ 10M kyseliny octovej. Roztok bol potom premytý na kolóne s oktadecylsillkagélom, prepláchnutej potom 0,1 M acetátom sodný. Eluát každej vzorky bol odobraný a meraný na scintilačnom počítači počas jednej minúty.

Ako je ukázané na obr. 2, médiá z buniek, transformovaných s sAH 406-3, obsahovali PAF-AH aktivitu s hodnotami štyrikrát vyššími ako pozadie. Táto aktivita nebola ovplyvnená prítomnosťou EDTA, ale bola inhibovaná lmM DFP. Tieto pozorovania dokazujú, že kloň sAH 406-3 kóduje enzým, ktoré aktivita je v súlade s ľudským plazmatickým enzýmom PAF-AH.

Príklad 8

DNA kódujúca ľudskú plazmatickú PAF-AH v úplnej dĺžke, jej rôzne skrátené formy a ďalej chimerickú myšaciu-ľudskú PAF-AH bola pomocou rekombinantných metód exprimovaná v E. coli a kvasinkách a trvalé exprimovaná v cicavčích bunkách.

A. Expresia v E. coli

Pomocou PCR bol vytvorený proteín kódujúci fragment cDNA klonu sAH 406-3 pre ľudskú plazmatickú PAF-AH, vhodný na okamžité ďalšie klonovanie v expresnom vektore v E. coli. Tento segment začína na 5'konci ľudského génu kodónom pre Ue₄₂ (SEQ ID NO: 8), N-koncový aminokyselinový zvyšok enzýmu purifikovanéhe z ľudskej plazmy. V konštrukte bol zahrnutý zvyšok génu vrátane pôvodného terminačného kodónu. Bol použitý nasledujúci 5' „sense“ primér:

SEQ ID NO: 213 ' TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG 3 ', ktorý obsahoval Xbal klonovacie miesto translačný iniciačný kodón (podčiarknutý). Bol použitý nasledujúci 3' „antisense“ primér:

SEQ ID NO: 29 'ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATTCCTG 3'

SK 286518 Β6

Tento primér zahrnoval terminačný kodón sAH 406-3 a obsahoval EcoRV klonovacie miesto. PCR reakcie boli uskutočnené tak, ako to bolo opísané v príklade 3. Výsledný PCR produkt bol štiepený enzýmami Xbal a EcoRN a ďalej klonovaný vo vektore pBR322 obsahujúcom promótor Trp (deBoer et al., PNAS, 80: 21 - 25 (1983)) tesne pred klonovacím miestom. Kmeň E. coli XL-1 Blue bol transformovaný expresným konštruktom a kultivovaný v L pôde obsahujúcej karbenicilín v koncentrácii 100 pg/ml. Transformanty rástli cez noc, boli centrifugované a resuspendované v lytickom pufri zloženom z 50mM Tris-HCl pH 7, 5, 50mM NaCl, lOmM CHAPS, lmM EDTA, 100 pg/ml lyzozómu a 0,05 trypsín inhibujúcich jednotiek (TIU)/ml Aprotmínu. Po jednohodinovej inkubácii na ľade a dvojminútovej sonikácii bola v lyzátoch stanovená aktivita PAF-AH metódou opísanou v príklade 4. E. coli transformovaná expresným konštruktom (označeným trp AH) vytvárala proteín s PAF-AH aktivitou. Pozri tab. 6 v príklade 9.

Boli použité aj konštrukty obsahujúce iné promótory, riadiace expresiu ľudského PAF-AH v E. coli - tac// promótor (deBoer. pozri skôr), arabinózový {ara 8) promótor zo Salmonella typhimurium [Horwitz et al., Gene, 14: 309 - 319 (1981)] a promótor bakteriofága T7. Konštrukty obsahujúce Trp promótor (pUC trp AH), tacll promótor (pUC tac AH) a araB promótor (pUC ara AH) boli zostrojené na základe plazmidu pUC19 (new Engalnd Biolabs, MA), zatiaľ čo konštrukt s T7 promótorom (pET AH) bol utvorený z plazmidu pET15B (Novagen, Madison, WI). Konštrukt s hybridným promótorom (pHAB/PH), tvorený araB pripojeným k ribozómovému väzbovému miestu z T7 promótorovej oblasti, bol takisto vytvorený z plazmidu pET15B. Všetky konštrukty produkovali v E. coli proteíny s PAF-AH aktivitou v rozsahu 20 až 50 U/ml/OD₆₀o- Táto aktivita zodpovedá celkovému množstvu rekombinantného proteínu >1 % všetkých bunkových proteínov.

Bolo takisto zhodnotených niekoľko expresných konštruktov, ktoré produkujú v E. coli PAF-AH s predĺženými N-koncami. N-koniec prírodnej ľudskej PAF-AH bol na základe sekvencovania aminokyselín stanovený ako Ile42 (Príklad 2). Ale sekvencia bezprostredne pred Ι1ο₄₂ nezodpovedá aminokyselinám tvoriacim cieľové miesto na odšiepenie signálneho peptidu [to znamená pravidlo „-3-1“ nie je splnené, keďže v pozícii -1 nie je prítomný lyzín, (pozri von Heijne, Nuc. Acids Res., 14: 4683 - 4690 (1986)]. Je možné, že je sekrečným systámom bunky rozpoznávaná klasickejšia signálna sekvencia (M1-A17 alebo M1-P21) a potom nasleduje ďalšie endoproteolytické štiepenie (Príklad 2). Celá PAF-AH kódujúca sekvencia, začínajúca metionínom (nukleotidy 162 až 1487 zo sekvencie SEQ ID NO: 7) bola upravená na expresiu v E. coli pomocou trp promótora. Tento konštrukt tvoril aktívny PAF-AH, avšak ako je to uvedené v tabuľke 4, jeho expresia dosahovala asi jednu päťdesiatinu úrovne expresie pôvodného konštruktu, začínajúceho Ile₄₂. Tieto výsledky naznačujú, že predĺženie proteínu na jeho N-konci nie je kritické ani nutné pre aktivitu rekombinantného PAF-AH v E. coli.

Tabuľka 4

	Aktivita	PAF-AH (U/ml/OD6oo)
Konštrukt	Lyzát	Médium
pUC trp AH (Ile42 na N-konci)	177.7	0,030
pUC trp AH Met]	3,1	0,003
pUC trp AH Vall0	54,6	0,033

V E. coli môžu byť takisto pripravené skrátené rekombinantné formy ľudskej PAF-AH pomocou plazmidu s malým počtom kópii na bunku a promótora, ktorý je indukovaný pridaním arabinózy do kultivačného média. Jednou z takýchto foriem PAF-A, skrátených na N-konci, je produkt rekombinantnej expresie DNA kódujúci aminokyselinové zvyšky Met42 až Asn441 polypeptidu kódovaného úplnou PAF-AH cDNA (SEQ ID NO:8). Je označený ako rPH,2. Na produkciu rPH,2 v bakteriálnych bunkách bol použitý plazmid pBAR2/PH,2 odvedený od pBR322, ktorý obsahuje (1) nukleotidy 297 až 1487 zo sekvencie SEQ ID NO: 7, ktorá kóduje ľudský PAF-AH začínajúci kodónom pre metionín v pozícii 46, (2) araB-C promótory a araC gén z arabinózového operónu Salmonella typhimurium, (3) transkripčne terminančnú sekvenciu z bakteriofága T7 a (4) replikačný začiatok fága fl.

Konkrétne zahrnuje pBAR/PH.2 nasledujúce úseky DNA: (1) oblasť od zrušeného AatlI miesta v pozícii 1994 k EcoRI miestu v pozícii 6274, to znamená sekvencia vektora s obsahom replikačného začiatku a gény zodpovedané za rezistenciu k apmicilinu alebo tetracyklínu odvodené od bakteriálneho plazmidu pBR322; (2) oblasti od EcoRI miesta v pozícii 6274 k Xbal miestu v pozícii 131, to znamená DNA arabinózového operónu zo Salmonella typhimurium (Genbank Accession number: Ml 1045, Ml 1046, Ml 1047, J01797); (3) oblasť od Xbal miesta v pozícii 131 k Ncol miestu v pozícii 170, to znamená DNA obsahujúcu väzbové miesto pre ribozóm z pET-21b (Novagen, Madison, WI); (4) oblasť od Ncol miesta v pozícii 170 k Xhol miestu v pozícii 1363, to znamená sekvencia ľudskej PAF-AII cDNA a (5) oblasť od Xhol miesta v pozícii 1363 k zrušenému AatlI miestu v pozícii 1993, to znamená DNA fragment z pET-21b (Novagen), s obsahom transkripčne terminačnej sekvencie bakteriofága T7 a raplikačného začiatku bakteriofága fl.

SK 286518 Β6

Iná forma PAF-AH, označená ako rPF.9, je produktom rekombinantnej expresie DNA kódujúcej aminokyselinové zvyšky Met46 až Ilen4₂₆ polypeptidu kódovaného úplnou PAF-AH cDNA (SEQ ID NO: 8). DNA kódujúca rPH.9 bola vložená do toho istého vektora, ktorý bol použitý na produkciu rPH.2 v bakteriálnych bunkách. Tento plazmid bol nazvaný pBAR2/PH.9, je zložený z nasledujúcich úsekov DNA: (1) oblasť od zrušeného AatlI miesta v pozícii 1958 k EcoRI miestu v pozícii 6239, to znamená sekvencia vektora obsahujúca replikačný začiatok a gény zodpovedné za rezistenciu k ampicilinu alebo tetracyklínu odvodené od bakteriálneho plazmidu pBR322; (2) oblasť od EcoRI miesta v pozícii 6239 k Xbal miestu v pozícii 131, to znamená DNA arabinózového operónu zo Salmonella typhimurium (Genbank accession number: Ml 1045, Ml 1046, Ml 1047, J01797); (3) oblasť od Xbal miesta v pozícii 131 kNcol miestu v pozícii 170, to znamená DNA obsahujúcu väzbové miesto pre ribozóm z pET-21b (Novagen, Madison, WI); (4) oblasť od Ncol miesta v pozícii 170 k Xhol miestu v pozícii 1363, to znamená sekvencia ľudskej PAF-AH cDNA a (5) oblasť od Xhol miesta v pozícii 1328 k zrušenému AatlI miestu v pozícii 1958, to znamená DNA fragment z pET-21b (Novagen), s obsahom transkripčne terminačnej sekvencie bakteriofága T7 a replikačného začiatku bakteriofága fl.

Expresia PAF-AH proteínov v pBAR/PH.2 a v pBAR/PH.9 je riadená promótorom araB, ktorý je v prítomnosti glukózy a neprítomnosti arabinózy dokonale reprimovaný, ale funguje ako silný promótor po pridaní L-arabinózy do média s vyčerpanou glukózou. Selekcia buniek s plazmidom je dosiahnutá pridaním ampicilínu (alebo príbuzného antibiotika) alebo tetracyklínu do média. Na expresiu rekombinantného PAF-AH môže byť použitých mnoho kmeňov E. coli vrátane (ale ne výhradne) kmeňov prototrefných v metabolizme arabinózy ako napr. W3110, DH5oc, BL21, C600, JM101 a ich derivátov, kmeňov nesúcich mutácie znižujúce proteolýzu ako napr. CAGG29, KY1429 a kmeňov neschopných rozkladať arabinózu ako napr. SB7219 a MC1061. Výhoda použitia kmeňa, ktorý nedokáže rozkladať arabinózu, spočíva v tom, že induktor (arabinóza) expresie PAF-AH nie je odčerpávaný z média počas indukčnej periódy, čo vedie k vyšším hladinám PAF-AH v porovnaní s hladinami dosiahnutými v prípade kmeňov schopných metabolizovať arabinózu. Aktívne PAF-AH formy sú exprimované v rôznych kmeňoch E. coli v akomkoľvek vhodnom médiu a pri akýchkoľvek vhodných podmienkach. Bohaté médiá LB, EDM295 (minimálne médium M9 doplnené kvasničným extraktom a kyslým hydrolyzátom kazeínu), rovnako ako „definované“ médiá (A675, to znamená minimálne médium A nastavené na pH 6,75, s glycerolom ako zdrojom uhlíka, doplnené stopovými prvkami a vitamínmi) dovoľujú značnú produkciu rPAF-AH foriem. Do médií je pridávaný tetracyklín, ktorý zaisťuje vďaka selekčnému tlaku prítomnosť plazmidu v kultúre.

Kmeň E. coli MC1061 (ATCC 53338), nesúci deléciu arabinózového operónu a teda neschopný metabolizovať arabinózu, bol transformovaný plazmidom pBAR2/PH.2. Kmeň MC1061 je auxotrofný na leucín, bol kultivovaný pri stálom doplňovaní medii obsahujúcimi kazeínový extrakt a komplementujúcimi tak leucínovú mutáciu. Bunky E. coli transformované pBAR/PH.2 boli pestované pri 30 °C v rastových médiách obsahujúcich 2g/L glukózy. Glukóza má dvojitý význam - slúži ako zdroj uhlíka na rast buniek a ako represor arabinózového promótora. Keď poklesla hladina glukózy na <50 mg/L, začala doplňovanie živín pomocou koncentrátu (glukóza v koncentrácii 300g/L). Doplňovanie glukózy sa počas 16 hodín lineárne zvyšovalo rýchlosťou, ktorá obmedzovala tvorbu kyslých vedľajších produktov. V tomto okamihu bolo doplňovanie glukózy nahradené pridávaním glycerolu. Súčasne bola pridávaná L-arabinóza (500g/L) do výslednej koncentrácie 5 g/L. Doplňovanie glycerolu bolo udržiavané na stálej výške počas 22 hodín. Bunky boli zozbierané pomocou filtrácie na dutých vláknach, pritom sa suspenzia buniek asi 10-krát zahustila. Bunkový sediment bol uložený pri -70 °C. Celková bunková hmota dosahovala asi 80g/L (OD₆₀₀ = 50 - 60) s PAF-AH aktivitou 65 - 70 jednotiek/OD/ml, čo predstavuje asi 10 % všetkých bunkových proteínov. Bakteriálna kultúra s konečným objemom asi 75 litrov obsahovala 50 - 60 g PAF-AH.

Vysoká úroveň produkcie rPAF-AH foriem môže byť docielená expresiou pBAR2/PH.2 alebo PH.9 v kmeňoch SB7219 a MC1061. Iné kmene neschopné odbúravať arabinózu sú takisto vhodné na dosiahnutie vysokej hustoty bakteriálnej kultúry. Odporúčajú sa nasledujúce podmienky kultivácie baktérií. Fermentačné tanky obsahujúce kultivačné médiu s 2g/L glukózy sú zaočkované exponenciálne rastúcimi kmeňmi SB7219; pBAR2/PH:2 a SB7219; pBAR2/PH.9. Po spotrebovaní glukózy sú fermentačné tanky zásobované roztokom glycerolu obsahujúcim stopové prvky, vitamíny, horčík a amónne soli tak, aby bol udržaný zdravý exponenciálny rast. Teplota fermentora je udržiavaná na 30 °C, tanky sú prevzdušňované a pretrepávané tak, že je hladina rozpusteného kyslíka nad 15 % saturácie. Keď je hustota bakteriálnej kultúry vyššia ako HOg/L (mokrá váha), sú živiny doplňované konštantnou rýchlosťou, ku kultúre je pridaná L-arabinóza (konečná koncentrácia asi 0,5 %). Tvorba produktu je sledovaná počas 16 - 22 hodín. Výťažok dosahuje zvyčajne hodnoty 40 - 50 g/L (suchá váha buniek). Bunky sú zozbierané centrifugáciou, uložené pri -70 °C a rPAF-AH je vyčistený pre ďalšie analýzy. Špecifické výťažky vyššie ako 150 jednotiek/ml/OD₆₀₀ sú dosahované bežne.

SK 286518 Β6

B. Expresia v kvasinkách

Ľudská rekombinantná PAF-AH bola takisto exprimovaná v Saccharomyces cerevisiae. Na riadenie expresie rPAF-AH bol použitý kvasničný promótor ADH2, produkcie dosiahla hodnoty 7 jednotiek/ml/OD₆₀₀ (Tab.5).

Tabuľka 5

Konštrukt	Promótor	Kmeň	Aktivita enzýmu (U/ml/OD)
pUC tac AH	tac	E. coli	W3110	30
PUC trp AH	trp	E. coli	W3110	40
pOC ara AH	araB	E. coli	W3110	20
pET AH	T7	E. coli	BL2K	(DE3) 50
		(Novagen)
pHAB/PB	ar«B/T7	E. coli	XL-1	34
PBAR2/PH.2	araB	MC1061	90
pYcp ADH2 AH	ADH2	Yeast BJ2.28	7

C. Expresia PAF-AH v cicavčích bunkách

1. Expresia ľudského PAF-AH cDNA konštruktu

Plazmidy konštruované na expresiu PAF-AH využívajú s výnimkou pSNF/PAFAH.l silný vírusový promótor pôvodom z cytomagalovírusu, polyadenylačné miesto z génu pre kravský rastový hormón a replikačný začiatok vírusu SV4O na zaistenie vysokého počtu kópií plazmidu v COS bunkách. Plazmidy boli vnesené do buniek pomocou clcktroporácie. Najprv bola pripravená súprava plazmidov, v ktorých boli buď 5'hraničná sekvencia (pDCl/PAFAH.l), alebo tak 5', ako aj 3'hraničná sekvencia ľudskej PAF-AH cDNA (PDC1/PAFAH.2), nahradené hraničnými oblasťami iných génov, ktoré sa vyznačujú vysokou úrovňou expresie v cicavčích bunkách. Transfekcia týchto plazmidov do COS, CHO či 293 buniek viedla k produkcii PAF-AH v rovnakej výške (0,01 jednotiek/ml teda 2 - 4-krát vyššie ako úroveň pozadia), aká bola dosiahnutá s klonom sAH406 po transientnej expresii COS buniek (Príklad 7). Bol konštruovaný ďalší plazmid obsahujúci promótor Friendovho slezinného vírusu namiesto promótora cytomegalovírusu. cDNA pre ľudskú PAF-AH bola vložená do plazmidu pmH-neo (Hahn et al., Gene 127·. 267 (1993)) pod kontrolou promótora Friendovho slezinného vírusu. Po transfekcii buniek myelómovej línie NSO plazmidom pSFN/PAFAH.l a otestovaní niekoľkých sto klonov boli zistené dve transfektanty (4B11 a ICH), ktoré dávali 0,15 - 0,5 jednotiek/'ml aktivity PAF-AH. Produktivita týchto dvoch NSO transfektantov zodpovedá asi 0,1 mg/liter, ak predpokladáme špecifickú aktivitu asi 5000 jednotí ek/mg

2. Expresia PAF-AH chimerických konštruktov tvorených myšacím a ľudským génom

Konštrukt pRC/MS9 obsahujúci cDNA pre myšaciu PAF-AH v cicavčom expresnom vektore oRc/CMV viedol po transfekcii do COS buniek k produkcii sekretovanej formy PAF-AH vo výške 5 - 10 jednotiek/ml (1000-krát vyššie nad úrovňou pozadia). Ak predpokladáme, že je špecifická aktivita myšacej PAF-AH približne rovnaká ako v prípade ľudského enzýmu, je myšacia cDNA exprimovaná asi 500-krát až 1000-krát viac ako ľudská cDNA pre PAF-AH.

Aby mohol byť preskúmaný rozdiel medzi úrovňou expresie ľudskej a myšacej PAF-AH v COS bunkách, boli zostrojené dva chimerické ľudské-myšacie gény a sledované z hľadiska expresie v COS bunkách. Prvý konštrukt, pRc/PH.HMCl, obsahuje kódujúcu sekvenciu pre 97 N-koncových aminokyselín myšacieho PAF-AH polypeptidu (SEQ ID NO: 21) pripojených k 343 C-koncovým aminokyselinám ľudskej PAF-AH v expresnom vektore pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA). Druhý chimerický gén pRc/PH.MHC2 obsahuje kódujúcu sekvenciu pre 40 N-koncových aminokyselín myšacieho PAF-AH polypeptidu pripojených k 400 C-koncovým zvyškom ľudskej PAF-AH v pRc/CMV. Po transfekcii COS buniek plazmidom pRc/PH.MHCl došlo k akumulácii 1 - 2 jednotiek/ml PAF-AH aktivity v médiu. V kondiciovaných médiách z bunkovej kultúry transformovanej plazmidom pRc/PH.MCH2 bola zistená len 0,01 jednotky/ml PAF-AH aktivity. Z týchto pokusov vyplýva, že rozdiel v úrovni expresie myšacieho a ľudského PAF-AH génu je aspoň čiastočne spôsobený vlastnosťami polypeptidového segmentu vymedzeného aminokyselinovými zvyškami 40 až 97, alebo príslušným úsekom RNA či DNA, kódujúcim túto oblasť PA-AH proteínu.

3. Prekódovanie prvých 290 bp sekvencie PAF-AH

Jedna z hypotéz vysvetľujúcich nízku úroveň syntézy ľudskej PAF-AH v transformovaných cicavčích bunkách predpokladá, že použitie kodónov v prirodzenom géne nie je optimálne na účinnú expresiu. Nezdá sa však pravdepodobné, že by typ použitých kodónov mohol byť zodpovedný za 500 - 1000-násobný rozdiel v úrovni expresie medzi ľudským a myšacím génom, pretože optimalizácia kodónov vedie len k 10-násobnému zvýšeniu expresie. Druhá hypotéza vysvetľuje rozdielnu úroveň expresie myšacieho a ľudského PAF-AH génu v prítomnosti sekundárnej štruktúry v 5' kódujúcej oblasti ľudskej PAF-AH mRNA, ktorá vedie k relatívne rýchlej degradácii mRNA, alebo spôsobuje neúčinnú iniciáciu či elongáciu translácie.

S cieľom overenia týchto hypotéz bol zostrojený syntetický fragment kódujúci pôvodný ľudský PAF-AH proteín od N-konca až k aminokyselinovému zvyšku 96, v ktorom bola väčšina kodónov nahradená („prekódovaná“) kodónmi pre tú istú aminokyselinu, ale majúcimi odlišnú sekvenciu. Zmena z GTA v druhom kodóne viedla k vytvoreniu Asp718 miesta, ktoré je na jednom konci syntetického fragmentu a ktoré je takisto prítomné v myšacej cDNA. Druhý koniec fragmentu obsahoval BamHI miesto vyskytujúce sa v kodóne 97 ľudského génu. Asp718/BamHI fragment dlhý asi 290 bp bol odvodený od PCR fragmentu pripraveného pomocou duálnej asymetrickej PCR; postupu na konštrukciu syntetických génov opísaného v Sandhu et al., Biotechnique, 12: 14 - 16 (1992). Syntetický Asp718/BamHI fragment bol ligovaný s DNA fragmentmi, kódujúcimi zvyšok molekuly ľudskej PAF-AH, začínajúcimi nukleotidom 453 zo SEQ ID NO: 7. Potom bola sekvencia kódujúca pôvodný ľudský PAF-AH enzým vložená do cicavčieho expresného vektora pRc/CMV (Invitrogen, San Diego), čím bol vytvorený plazmid pRc/HPH.4. Úplná sekvencia prekódovaného génu je uvedená v SEQ ID NO: 30. Oblasť v pRc/HPH.4 priliehajúca k 5' koncu sekvencie kódujúcej ľudskú PAF-AH pochádza z myšacej cDNA pre PAF-AH v pRc/MC9 (nukleotidy 1 až 116 zo SEQ ID NO: 21).

COS bunky boli tranzientne transformované plazmidmi pRc/HPH.4 (prekódovaný ľudský gén), pRc/MS9 (myšací PAF-AH) a pRc/PH.MHCl (hybridná sekvencia myš-človek č. 1) s cieľom stanovenia expresie ľudskej PAF-AH z pRc/HPH.4. V kondiciovaných médiách z transformovaných bunkových kultúr bola zisťovaná PAF-AH aktivita, ktorá nadobúdala hodnoty 5,7 jednotky/ml (myšací gén), 0,9 jednotky/ml (hybridná sekvencia myš-človek č. 1) a 2,6 jednotky/ml (prekódovaný ľudský gén). Prekódavanie prvých 290 bp kódujúcej sekvencie pre ľudskú PAF-AH sa ukázalo byť ako úspešná stratégia a zdvihlo hladinu expresie ľudskej PAF-AH z niekoľkých nanogramov/ml na asi 0,5 mikrogramu/ml počas tranzientnej transformácie COS buniek. Prekódovaný gén pre PAF-AH z plazmidu pRc/HPH.4 bude vložený do cicavčieho expresného vektora obsahujúceho gén pre dihydrofolátreduktázu (DHFR) a týmto vektorom bude transformovaná DHFR negatívna bunková línia ovária čínskeho chrčka. Transformované bunky budú podrobené selekcii metotrexátom, tak budú získané klony, ktoré tvoria veľké množstvo ľudskej PAF-AH vďaka génovej ampliftkácii.

Príklad 9

Ľudská rekombinantná plazmatická PAF-AH (začínajúca Ile₄₂) exprimovaná v E. coli, bola prečistená na úroveň Coomassie modrou ofarbeného prúžku na SDS-PAGE pomocou rôznych metód. Takisto boli stanovované aktivity vykazované natívnym enzýmom PAF-AH.

A. Purifikácia rekombinantnej PAF-AH

Prvý použitý purifikačný postup je podobný tomu, ktorý bol opísaný v príklade 1 pre natívnu PAF-AH. Nasledujúce kroky boli uskutočňované pri 4 °C. Peleta z 50 ml kultúry E. coli, ktoré produkujú PAF-AH (transformované expresným konštruktom trp AH), bol lyzovaný tak, ako je to opísané v príklade 8. Pevné čiastočky boli odstránené centrifugáciou pri 10 000 g počas 20 minút. Supematant bol nanesený rýchlosťou 0,8 ml/min. na kolónu Blue sepharose Fast Flow (2,5 cm x 4 cm; objem náplne 20 ml)), ktorá bola ekvilibrovaná pufrom D (25 mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl, pH 7,5). Kolóna bola premytá 100 ml pufra D a eluovaná rýchlosťou 3,2 ml/min. 100 ml pufra A obsahujúceho 0,5M KSCN. 15 ml aktívnej frakcie bolo nanesených na 1 ml kolónu Cu chelating Sepharose, ekvilibrovanú pufrom D. Táto kolóna bola premytá 5 ml pufra D, ďalej nasledovala elúcia 5 ml pufra D obsahujúceho 100 mM imidazol gravitačným tokom. Frakcie s PAF-AH aktivitou boli analyzované pomocou SDS-PAGE.

Výsledky purifikácie sú znázornené v tab. 6, v ktorej sa jednotka rovná hydrolýze μηιοί PAF za hodinu. Produkt purifikácie získaný pri 4 °C sa objavil na SDS-PAGE ako jediný intenzívne zafarbený prúžok pod polohou markera 43 kDa, s náznakom difúzneho zafarbenia tesne pod sebou a nad sebou. Rekombinantný materiál je výrazne čistejší a vykazuje vyššiu špecifickú aktivitu v porovnaní s PAF-AH preparátom z plazmy, opísaným v príklade 1.

SK 286518 Β6

Tabuľka 6

Vzorka	Objem (ml)	Aktivita (jedno tka/ml)	Celková aktivita (jednotka/103)	Kone, proteínov (mg/ ml)	Špecifická aktivita (jednotka/mg	% návratnosti aktivity	Násobok načistenia
						krok	celk.	krok	celk.
Lyzát	4,5	989	4451	15,6	63	100	100	1	1
Blue	15	64	960	0,07	914	22	22	14,4	14,4
Cu	1	2128	2128	0,55	3869	220	48	4,2	61

Keď bola totožná purifikačná procedúra uskutočnená pri laboratórnej teplote, objavila sa okrem prúžku pod markerom 43 kDa skupina prúžkov migrujúcich pod polohou markera 29 kDa, ktorá kolerovala s PAF-AH aktivitou zmeranou v plátkoch gélu. Tieto prúžky s nižšou molekulovou hmotnosťou môžu byť proteolytické fragmenty PAF-AH, ktoré si uchovali enzymatickú aktivitu.

Pri laboratórnej teplote bol použitý tiež ďalší purifikačný postup. Paleta (100 g) E. coli produkujúcich PAF-AH (transformovaných expresným konštruktom pUC trp AH), bol resuspendovaný v 200 ml lyzovacieho pufra (25mM Tris, 20mm CHAPS, 50mM NaCl, lmM EDTA, 50 pg/ml benzamidu, pH 7,5) a lyzovaný trojnásobným pretlačením cez mikrofluidizér pri 15000 psi. Pevné častice boli odstránené centrifugáciou pri 14300 x g počas jednej hodiny. Supematant bol lOx zriedený v zrieďovacom pufri (25mM MES (kyselina 2[N-morfolinoletánsulfónová), lOmM CHAPS, lmM EDTA, pH 4,9) a nanesený rýchlosťou 25ml za minútu na kolónu S Sepharosy Fast Flow (200 ml) (katión-ionexovú kolóna), ktorá je ekvilibrovaná v pufri E (25mM MES, lOmM CHAPS, lmM EDTA, 50mM NaCl, pH 5,5). Kolóna bola premytá jedným litrom pufra E a eluovaná IM NaCl. Eluát bol zozbieraný do 50ml frakcie a pH bolo upravené na 7,5 pomocou 0,5ml 2M Tris-u (bázy). Frakcie obsahujúce aktivitu PAF-AH boli spojené a upravené tak, aby obsahovali 0.5M NaCl. Takto spojené frakcie boli nanesené rýchlosťou 1 ml/min. na kolónu Blue Sepharose Fast Flow (2,5 cm x 4 cm; 20 ml) ekvilibrovanú v pufri F (25mM Tris, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl, lmM EDTA, pH 7,5). Kolóna bola premytá 100 ml pufra F a eluovaná pufrom F obsahujúcim 3M NaCl rýchlosťou 4 ml/min. Tento Blue Sepharosový Fast Flow chromatografická krok bol opakovaný s cieľom zníženia hladiny endotoxínov vo vzorke. Frakcie obsahujúce aktivitu PAF-AH boli spojené a dialyzované proti pufru G (25mM Tris, pH 7,5, 0,5M NaCl, 0,1 % Tween 80, lmM EDTA).

Výsledky purifikácie sú ukázané v tabuľke 7, v ktorej sa jednota rovná μ mol hydrolýzy PAF za hodinu.

Tabulka 7

Vzorka	Objem (ml)	Aktivita (jednotka/ml)	Celková aktivita (jednotka/10)	Kone, proteínov (mg/ml)	Špecifická aktivita (jednôt ka/mg)	% návrat nosti aktivity krok	celk.	Násobok načistenia
krok	celk
Lyzát	200	5640	1128	57,46	98	100	100	1	1
S	111	5742	637	3,69	1557	57	56	16	16
Blue	100	3944	394	0,84	4676	35	62	3	48

Získaný produkt purifikácie vyzeral na SDS-PAGE ako jediný intenzívny prúžok pod značkou 43 kDa s trochou difúzneho zafarbenia priamo pod prúžkom a nad prúžkom. Rekombinantný materiál je podstatne čistejší a vykazuje väčšiu špecifickú aktivitu v porovnaní s prípravou PAF-AH z plazmy, ako je opísaná v príklade 1.

V tomto predkladanom vynáleze sa uvažuje ešte o jednom purifikačnom protokole. Ten zahrnuje lýzu buniek, prečistenie a prvý kolónový krok. Bunky boli zriedené 1 : 1 v lyzovacom pufri (25m Tris pH 7,5, 150mM NaCl, 1 % Tween 80, 2mM EDTA). Lýza bola uskutočnená v chladenom mikrofluidizéri pri 15000 - 20000 psi. Bolo použité trojnásobné pretlačenie materiálu cez mikrofluidizér s cieľom dosiahnuť >99 % rozbitie buniek. Lyzát bol zriedený 1 : 20 v riediacom pufri (25mM Tris, pH 8,5, lmM EDTA) a aplikovaný na kolónu naplnenú chromatografickým médiom Q-Sepharosa Big Bead (Pharmacia). Kolóna bola ekvilibrovaná v roztoku 25mm Tris pH 8,5, lmM EDTA, 0,015 % Tween 80. Eluát bol zriedený 1 : 10 v 25mM MES pH 5,5, 1,2M síran amónny, lmM EDTA a nanesený na chromatografické médium Butyl Sepharose (Pharmacia) ekvilibrovaná rovnakým pufrom. Aktivita PAF-AH bola eluovaná roztokom 25mM MES pH 5,5, 0,1 % Tween 80, lmM EDTA.

V tomto predkladanom vynáleze sa uvažuje ešte o ďalšej metóde purifikácie enzymaticky aktívneho PAF-AII. Táto metóda zahrnuje nasledujúce kroky: a) príprava extraktu E. coli, ktorá vedie po lýze v pufri

SK 286518 Β6 obsahujúcom CHAPS k supernatantu obsahujúcemu solubilizovaný PAF-AH; b) riedenie uvedeného supernatantu a jeho aplikácia na anión-ionexovú kolónu ekvilibrovanú na pH približne 8,0; c) elúcia enzýmu PAF-AH z uvedenej anión-ionexovej kolóny; d) nanesenie uvedeného adjustovaného eluátu z uvedenej anión-ionexovej kolóny na afinitnú kolónu obsahujúcu „blue dye ligand“; e) elúciu uvedenej kolóny obsahujúcej „blue dye ligand“ pufrom obsahujúcim 3,0M soľ; f) zriedenie eluátu z kolóny obsahujúcej „blue dye ligand“ do pufra vhodného na realizáciu hydroxylapatitovej chromatografie; g) uskutočnenie hydroxylapatitovej chromatografie, kde je premytie a elúcia uskutočnené pomocou pufrov (s obsahom či bez obsahu CHAPS); h) nariedenie uvedeného hydroxylapatitového eluátu na koncentráciu solí vhodnú pre katión-ionexovú kolónu; i) nanesenie uvedeného neriedeného hydroxylapatitového eluátu na katión-ionexovú kolónu pri pH pohybujúcom sa v rozmedzí približne 6,0 až 7,0; j) elúcia PAF-AH z uvedenej katión-ionexovej kolóny vhodným pufrom s vhodným zložením; k) uskutočnenie katión-ionexovej chromatografie pri chlade; a 1) zloženie kvapalnej alebo zmrazenej formy PAF-AH v neprítomnosti CHAPS.

Najlepšie je v uvedenom kroku použiť toto: v kroku a) lyzovací pufer má zloženie: 25mM Tris, lOOmM EDTA, 20mM CHAPS, pH 8,0; v kroku b) riedenie supematantu pre anión-ionexovú chromatografiu je 3 - 4 krát od 25mM Tris, lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 8,0 a kolóna je Q-Sepharosová kolóna ekvilibrovaná 25mM Tris, lmM EDTA, 50mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku c) je anión-ionexová kolóna vymývaná použitím 25mM Tris, lmM EDTA, 350mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku d) je eluát z kroku

e) aplikovaný priamo na afinitnú kolónu s „blue dye ligandom“; v kroku e) je kolóna eluovaná pufrom obsahujúcim 3M NaCl, lOmM CHAPS, 25mM Tris, pH 8,0; v kroku f) je eluát z Blue dye zriedený na hydroxylapatitovú chromatografiu. Eluát je zriedený lOmM fosforečnanom sodným, lOOmM NaCl, lOmM CHAPS, pH 6,2; v kroku g) je hydroxylapatitová chromatografia sprevádzaná použitím hydroxylapatitovej kolóny ekvilibrovanej lOmM fosforečnanom sodným, lOOmM NaCl, lOmM CHAPS. Elúcia je uskutočňovaná použitím 50mM fosforečnanu sodného, lOOmM NaCl (s či bez lOmM CHAPS), pH 7,5; v kroku h) je uskutočňované nariedenie uvedeného hydroxylapatitového eluátu pre katión-ionexovú chromatografiu pomocou pufra s pH v rozmedzí približne 6,0 až 7,0 a obsahujúcom fosforečnan sodný (s či bez CHAPS); v kroku i) je kolóna s S-Sepharosou ekvilibrovaná 50mM fosforečnanom sodným (s či bez lOmM CHAPS), pH 6,8; v kroku j) je elúcia uskutočnená pufrom s vhodným zložením, ako napríklad 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. asparágová, 125mM NaCl, pH 7,5 a obsahujúcim 0,01 % Tween 80; v kroku k) je uskutočnená katiónionexová chromatografia pri 2 - 8 °C. Príkladom na vhodné zloženie pufra použiteľného v kroku 1), ktorý stabilizuje PAF-AH je 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. asparágová, 125mM NaCl, pH približne 7,4 (s či bez prídavku Tween 80 a/alebo Plurinicu F68) alebo 25mM fosfátový (K+) pufer obsahujúci (prinajmenšom) 125mM NaCl, 25mM arginín a 0,01 % Tween 80 (s či bez Plurinicku F68 v koncentrácii približne 0,1 až 0,5 %).

Aktivita rekombinantného PAF-AH

Najvýraznejšou vlastnosťou PAF acetylhydrolázy je výrazná špecificita pre substráty s krátkymi zvyškami na sn-2 pozícii substrátu. Táto prísna špecificita odlišuje PAF acetylhydrolázu od ostatných foriem PĽA2. Aby sa zistilo, či rekombinantný PAF-AH degraduje fosfolipidy s dlhým reťazcom mastných kyselín na sn-2 pozícii, bola teda testovaná hydrolýza l-palmltoyl-2-arachidonyl-í«-glycerol-3-fosfocholínu (arachidonylPC). Táto látka je totiž uprednostňovaným substrátom dobre charakterizovanej formy PLA₂. Ako predpovedali už predchádzajúce štúdie s natívnym PAF-AH, tento fosfolipid nebol v prípade, že bol inkubovaný s rekombinantným PAF-AH hydrolyzovaný. V ďalších experimentoch bol do roztoku štandardného hydrolyzačného testu pridaný arachidonylPC v koncentrácii 0 až 125μΜ. Cieľom tohto bolo zistenie, či toto pridanie inhibuje hydrolýzu PAF rekombinantným PAF-AH. Dokonca ani pri najvyššej koncentrácii PAF-AH (čo bola koncentrácia 5x vyššia ako koncentrácia PAF) nebola zistená inhibícia hydrolýzy PAF. Rekombinantný PAF-AH teda vykazuje rovnakú substrátovú špecificitu ako natívny enzým - substráty s dlhými reťazcami nie sú rozpoznávané. Okrem toho rekombinantný enzým PAF-AH rýchlo degraduje oxidovaný fosfolipid (gluraroylPC), ktorý prešiel oxidatívnym štiepením sn-2 mastných kyselín. Natívna plazmová PAF-AH má niekoľko ďalších vlastností, ktoré ju odlišujú od ostatných fosfolipáz vrátane od vápenatých iónov nezávislých fosfolipáz a fosfolipáz odolných proti látkam, ktoré modifikujú SH skupiny alebo štiepia disulfidy.

Natívne a rekombinantné plazmové enzýmy PAF-AH sú senzitívne proti DFP, čo naznačuje, že serín tvorí časť ich aktívneho séra. Neobvyklou vlastnosťou natívnej plazmovej PAF acetylhydrolázy je jej tesná asociácia s lipoproteinmi v krvnom obehu a skutočnosť, že jej katalytická efektivita je ovplyvnená lipoproteínovým prostredím. Ak je rekombinantná PAF-AH, ako je opísaná vo vynáleze, inkubovaná s ľudskou plazmou (a predtým ošetrená DFP s cieľom odstránenia endogénnej enzymatickej aktivity), asociuje sa s nízko a vysokohustotnými lipoproteinmi rovnakým spôsobom ako natívna aktivita. Tento výsledok je dôležitý, pretože existujú solídne dôkazy o tom, že modifikácia nízkohustotných lipoproteínov je nevyhnutná na ukladanie cholesterolu pozorovanému pri ateróme a že oxidácia lipidov je iniciačným faktorom v tomto procese. PAF-AH chráni nízkohustotné lipoproteíny pred modifikáciou pri oxidačných podmienkach in vitro a môžu hrať túto úlohu aj in vivo. Podávanie PAF-AH je preto doporučované pre zníženie oxidácie lipoproteínov v prípa21

SK 286518 Β6 de aterosklerotických plakov a rovnako tak aj pri liečbe zápalov. Všetky tieto výsledky potvrdzujú, že kloň cDNA sAH 406-3 kóduje proteín s aktivitami ľudskej plazmovej PAF acetylhydrolázy.

Príklad 10

V E. coli boli exprimované aj ďalšie rekombinantné PAF-AH produkty. Tieto produkty zahrnovali analógy PAF-AH majúce mutáciu v jednej aminokyseline a fragmenty PAF-AH.

A. PAF-AH produkty vzniknuté substitúciou aminokyselín

PAF-AH je lipáza, pretože hydrolyzuje fosfolipid PAF. Aj keď neexistuje žiadna všeobecná podobnosť medzi PAF-AH a ostatnými charakterizovanými lipázami, v porovnaní so štruktúrne charakterizovanými lipázami boli nájdené konzervované zvyšky. V aktívnom centre bol identifikovaný serín. Serín spoločne so zvyškom aspartámu a histidínu tvorí katalytickú trojicu, ktorá reprezentuje aktívne miesto lipáz. Tieto tri zvyšky spolu nesusedia v primárnej aminokyselinovej sekvencii, ale zo štruktúrnych štúdií vieme, že spolu tieto tri susedia v trojrozmernom priestore. Z porovnávaní štruktúr cicavčích lipáz vieme, že aspartámový zvyšok je obvykle 24 aminokyselinovým zvyškom od C konca, smerom k aktívnemu miestu so serínom.

Pomocou miestne cielenej mutagenézy a PCR boli modifikované jednotlivé kodóny ľudskej PAF-AH, ktoré kódovali sekvencie pre alanínový zvyšok. Tieto mutanty boli exprimované v E. coli. Tak, ako je ukázané v tabuľke 8, kde napríklad skratka „S108A“ znamená, že serínový zvyšok v pozícii 108 bol zamenený za alanín, bodové mutácie Ser273, Asp₂₉₆ alebo His351 kompletne zničili PAF-AH aktivitu. Vzdialenosti medzi jednotlivými aminokyselinovými zvyškami v aktívnom centre sú pre PAF-AH a ostatne lipázy podobné (od Ser k Asp je to 23 aminokyselín; od Ser k His je to 78 aminokyselín). Tieto pokusy tiež ukázali, že Ser₂₇₃, ASP296 alebo Hls351 sú zvyšky kľúčové pre aktivitu a preto tiež sú kandidátmi pre triádu katalytických zvyškov. Cysteínové zvyšky sú svojou vlastnosťou možnosti tvorby disulfidových mostíkov veľmi často kritické na zachovanie funkčnej integrity proteínu. Plazmatický PAF-AH enzým obsahuje päť cysteínových zvyškov. Na určenie, ktorý z cysteínových zvyškov je kritický na udržanie enzýmovej aktivity, boli cysteíny jednotlivo nahradené mutáciou za serín a výsledné mutanty sa exprimovali v E. coli. Predbežné výsledky merania aktivity s čiastočne načistenými preparátmi týchto rekombinantných mutantných foriem enzýmu sú ukázané v druhom stĺpci tabuľky číslo 8, zatiaľ čo výsledky získané s viacerými načistenými enzýmovými preparátmi sú zhrnuté v treťom stĺpci tabuľky 8. Dáta ukazujú, že všetky mutantné formy mali skoro rovnaké aktivity, z toho usudzujeme, že pre aktivitu PAH-AH nie je nutný žiadny cystcínový zvyšok. Ďalšie mutanty mali tiež malý alebo žiadny vplyv na katalytickú aktivitu PAF-AH. V tabuľke 8, ++++ reprezentujú aktivitu prirodzene sa vyskytujúceho typu PAF-AH rovnajúcu sa 40 až 60 U/ml/OD₆o₀, +++ reprezentujú aktivitu okolo 20 až 40 U/mlOD_60fl, ++ 10 až 20 U/ml/OD₆₀o, + 1 až 10 U/ml/OD₆₀₀ a znamienko indikuje aktivitu menšiu ako 1 U/ml/OD₆₀₀.

Tabuľka 8

Mutácia	Aktivita PAF-AH	Špecifická akt. purifikátov PAF-AH
Divoký (prirodzene sa vyskytujúci) typ	++++	6,9 mmol/mg/bod
S1O8A	++++
S273A	-
D286A	-
D286a	++
D296A	-
D3O4A	++++
D338A	++++
H351A	-
H395A, H399A	++++
CG7S	+++	5,7 mmol/mg/bod
C229S	-1-	6,5 mmol/mg/bod
C291S	-U	5,9 mmol/mg/hod
C334S	++++	6,8 mmol/mg/hod
C4O7S	+++	6,4 mmol/mg/hod
C67S, C334S, C4075S		6,8 mmol/mg/hod

B. Fragmentálne PAF-AH produkty

Pomocou štiepenia exonuklázou III na 3' konci PAF-AH kódujúcej sekvencie rôzne dlhý čas boli pripravené delécie na C konci. Tieto skrátené kódujúce sekvencie boli potom ligované do plazmidovej DNA kódujúcej stop kodóny vo všetkých troch častiach rámca. Pomocou DNA sekvenčnej analýzy, expresie proteínu a merania aktivity PAF-AH bolo charakterizovaných desať DNA delečných konštruktov. Odstránenie 21 až 30

SK 286518 Β6 aminokyselinových zvyškov z C konca silne redukovalo katalytickú aktivitu a odstránenie 52 aminokyselinových zvyškové viedlo ku kompletnému zničeniu aktivity. To je znázornené na obrázku 3.

Podobné delécie boli uskutočnené na aminokonci PAF-AH. V E. coli boli pripravené fuzne proteíny PAF-AH s tioredoxínom na N-konci. Tým sa docielila konzistentná vysoká hladina expresie aktivity PAF-AH (LaVallie a ďalší, Biotochnoloy, 11, str. 187 až 193, 1993). Odstránenie devätnástich aminokyselinových zvyškov z prirodzene sa vyskytujúceho N-konca proteínu (Ile42) redukovalo aktivitu až o 99 %. Zatiaľ čo odstránenie 26 aminokyselinových zvyškov kompletne zničilo enzymatickú aktivitu fúzneho proteínu (pozri obrázok 3). Delécia 12 aminokyselinových zvyškov zvýšila enzýmovú aktivitu štyri razy.

V nasledujúcich purifikačných procesoch pre PAF-AH vychádzajúcich z čerstvej ľudskej plazmy pomocou metód podobných tým, ktoré boli opísané v príklade 1 (na skoncentrovanie eluátu z Blue Sepharosy bol použitý namiesto Cu stĺpca filter Microcon 30 firmy Amicon), boli identifikované ďalšie dve N-koncové aminokyseliny popri Ile₄₂ a to Ser35 a Lys55. Heterogenita môže mať prirodzený pôvod v stave enzýmu v plazme, či môže byť výsledkom purifikačného postupu.

Purifikovaný materiál opísaný skôr bol tiež podrobený analýze na glykozylácii. Purifikovaný natívny PAF-AH sa inkuboval v prítomnosti alebo neprítomnosti N-glykanázy, čo je enzým odstraňujúci karbohydráty viazané na N-koniec glykoproteínov. Takto ošetrené vzorky PAF-AH boli potom podrobené elektroforéze v 12 % SDS polyarkylamidovom géli a potom označené pomocou králičieho polyklonálneho antiséra vo Westem blotte. Bielkovina, ktorá nebola inkubovaná s N-glykanázou, putovala v géli ako difúzny prúžok s molekulovou hmotnosťou 45 až 50 kDa, zatiaľ čo proteín ošetrený glykanázou putoval ako ostro ohraničený pruh zodpovedajúci molekulovej hmotnosti 44 kDa. Tým je demonštrovaná skutočnosť, že natívny PAF-AH je glykozylovaný.

Heterogenita na N-konci bola tiež pozorovaná v purifikovaných preparátoch rekombinantného PAF-AH (Ile₄₂ N-koniec). Tieto enzýmové preparáty boli zmesou polypeptidu s N-koncami začínajúci Ala47, Ue42, alebo umelým iniciačným zvyškom Met-1 susediacim s Ile42.

1. Predbežné porovnanie fragmentov PAF-AH s PAF-AH

Z dôvodu pozorovanej heterogenity rekombinantne pripravených PAF-AH boli pripravené ďalšie rekombinantné produkty, ktoré boli tiež testované na pozorovanú heterogenitu po expresii a následnej purifikácii. Zloženie rekombinantných exprimovaných produktov PBAR2/PH.2 a pBAR2/PH.2 v kmeni MC1061 E. coli bolo analyzované v rôznych časových intervaloch počas produkčnej fázy bunkového cyklu. Čiastočne načistené vzorky rekombinantného PH.2 a PH.9 odohrané v rôznych časových intervaloch medzi 5 až 22 hodinami po indukcii expresie proteínu boli analyzované pomocou laserovej desorpčnej ionizačnej hmotnostnej spektrometrie (MALDI-MS).

Ak bol použitý PH.2 expresný vektor, boli pozorované dva piky v spektre čiastočne purifikovaného proteínu, ktoré zodpovedali hmotnostnej hodnote predpokladanej pre rPAF-AH proteín. Tieto dva piky boli pozorované vo všetkých časových intervaloch, väčšia heterogenita bola pozorovaná len v časovom intervale zodpovedajúcom stresovému pôsobeniu spôsobenému nahromadením acetátu alebo vyčerpaním kyslíka v médiu počas fermentácie buniek. Presnosť merania MALDI-MS techniky leží približne v rozsahu ± 0,3 % hmotnosti jednej aminokyseliny. Pozorovaný produkt s vyššou hmotnosťou zodpovedá svojím hmotnostným zložením očakávanému celému produktu translácie vektora PH.2 mínus hmotnosť metionínu, ako iniciátora translácie, o ktorom sa predpokladá, že bol posttrans lačne odstránený. Pík s nižšou hmotnosťou mal približne o 1200 atómových hmotnostných jednotiek menej.

Ak bol použitý expresný vektor PH.9, bol získaný v spektre čiastočne purifikovaného proteínu prednostne proteín, ktorý zodpovedal svojou očakávanou hmotnosťou proteínu rPAF-AH. Tento jediný pík bol pozorovaný vo všetkých časových okamihoch, v čase sa nezvyšovala ani heterogenita proteínu. Pozorovaná hmotnosť tohto proteínu bola v súlade s prítomnosťou očakávaného translačného produktu pre vektor PH.9 s plnou dĺžkou, opäť mínus iniciačný metionín.

2. Purifikácia fragmentov PAF-AH

Rekombinantne exprimované produkty rPH.2 (expresný produkt DNA kódujúci Met46 až Asn441) a rPH.9 (expresný produkt DNA kódujúci Met46 až Ue₄₂9) boli purifikovane pre ďalšie porovnávacie štúdie s produktom rPAF-AH (expresný produkt DNA kódujúci Ile₄₂ až Asn441). RPH.9 bol produkovaný pomocou kmeňa E. coli SB7219 a purifikovaný väčšinou pomocou chelátového purifikačného procesu využívajúceho Zn tak; ako to bolo opísané, rPH.2 bol produkovaný v kmeni MC1061 v E. coli tak, ako to bolo opísané v predchádzajúcom texte a bol purifikovaný tak, ako je to opísané ďalej. Transformované bunky boli lyzované nariedením buniek lyzačným pufrom (lOOmM sukcinát, lOOmm NaCl, 20mM CHAPS, pH 6,00. Vzniknutá hmota sa mixovala a lyžovala sa popraskaním buniek vysokým tlakom. Lyzované bunky sa stočili a supematant obsahujúci rPH.2 sa ponechal na ďalšie spracovanie. Vyčerený supematant sa nariedil 5-krát 25mM fosfátovým pufrom obsahujúcim lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 7,0. Nariedený supematant sa potom aplikoval na stĺpec Sepharosy Q. Stĺpec sa premyl najprv trojnásobkom objemu stĺpca 25mM Na-fosfátovým puf23

SK 286518 Β6 rom obsahujúcim lmM EDTA, 50mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 7,0 (Premytie 1), potom nasledovalo premytie desaťnásobným objemom stĺpca 25mM Tris pufrom obsahujúcim lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 8,0 (Premytie 2) a následne desiatimi objemami stĺpca 25mM Tris pufrom obsahujúcim lmM EDTA, lOOmM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0 (Premytie 3). Elúcia bola zakončená pomocou 25mM Tris pufra obsahujúceho lmM EDTA, 350mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0. Eluát zo stĺpca Q Sepharosy sa potom nariedil trojnásobkom svojho objemu 25mM Tris, obsahujúcim lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 8,0 a bol navrstvený na stĺpec Blue Sepharosy. Stĺpec bol premytý najprv desiatimi objemami stĺpca 25mM Trisom, obsahujúcim lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 8,0. Potom nasledovalo premytie troma objemami stĺpca 25mM Tisom obsahujúcim 0,5M NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0. Elúcia bola zakončená pomocou premytia 25mM Trisom obsahujúcim 3,0M NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0. Eluát zo stĺpca Blue Sepharosy bol nariedený päťnásobkom lOmM Na fosfátového pufra obsahujúceho lOmM CHAPS, pH 6,2 a bol potom aplikovaný na chromatografický stĺpec. Stĺpec bol premytý desaťnásobkom objemu stĺpca lOmM Na-fosfátovým pufrom obsahujúcim lOOmM NaCl, 0,1 % Pluronic FG8, pH 6.2. rPH.2 sa eluoval zo stĺpca 120 mM Na-fosfátovým pufrom obsahujúcim lOOmM NaCl a 0,1 % Pluronie: F-68m, pH 7,5. V prípade nariedeného eluátu zo stĺpca hydroxylapatitu bolo upravené pH na pH 6,8 pomocou 0,5 N-sukcinylovej kyseliny. Potom nasledovala chromatografía na stĺpci Sepharosy SP. Stĺpec SP Sepharosy bol premytý desaťnásobkom svojho objemu 50mM fosfátom sodným obsahujúcim 125mM NaCl, 0,1 % Pluronic F68, pH 6,8. Elúcia sa uskutočňovala 50mM fosfátom sodným so 125mM NaCl a 0,1 % Pluronic F68, pH 7,5. Eluovaný rPH.2 sa napokon upravil riedením na konečnú koncentráciu 4 mg/ml pomocou 50mM fosfátu sodného obsahujúceho 125M NaCl, 0,15 % Pluronic F68, pH 7,5. Ďalej bol pridaný Tween 80 do konečnej koncentrácie 0,02 %. Vytvorený produkt sa prefiltroval cez 0,2 pm membránu a uschoval na ďalšie využitie.

3. Porovnanie PAF-AH fragmentov s PAF-AH pomocou sekvenácie

Purifikované preparáty rPH.2 a rPH,9 boli porovnané s purifikovanými zlúčeniami rPAF-AH pomocou N.terminálneho sekvencovania použitím sekvenátora Applied Blosystems Model 473 Proteín Sequencer (Applied Blosystems, Foster City, CA) a pomocou C koncového sekvencovania uskutočneného pomocou prístroja Hewlett-Packard Model G1009A C-terminal Proteín Sequencer. Pripravený rPH.2 vykazoval v porovnaní s rPAF-AH menšiu heterogenitu N-konca. N-koncová analýza pripraveného rPH.9 bola veľmi podobná tiež analýze v prípade rPH.2, ale v porovnaní s rPH.2 bola pozorovaná v prípade rPH.9 nižšia heterogenita na C-konci.

Purifíkovaný proteín rPH.2 mal väčšinu sekvencií obsahujúcich N-koncový Ala47 (približne 86 až 89 %) a menší podiel sekvencií majúcich na N-konci Ala48 (približne 11 až 14 %). Tento pomer bol celkom stabilný aj pri rôznych podmienkach fermentácie buniek. Purifíkovaný proteín rPH.9 tiež obsahoval vo väčšine sekvencií N koncový Ala47 (medzi 83 až 90 %) a menší podiel s N-koncovou aminokyselinou Ala48 (približne 10 až 17 %). Oproti tomu, snahy o prípravu polypeptidu v baktériách začínajúceho Ile₄₂ (rPAF-AH) vyústili v zmes rôznych polypeptidov s N-koncovými aminokyselinami začínajúcimi Ala47 (20 až 53 %), Ile₄₂ (8 až 10 %) a umelo dodaným iniciátorom metionínom Met-1 (37 až 72 %) v susedstve Ilc42. V prípade rPH.2 a rPH.9 bol iniciačný metionín účinne odstránený pomocou aminoterminal peptidázy po bakteriálnej syntéze peptidu, keď zostal Ala v pozícii 47 (alebo alanín v pozícii 48) ako koncový zvyšok.

Sekvencovanie C-konca sa uskutočňovalo veľmi často na rPH.2, kde na C-konci bola objavená ako hlavná vyskytujúca sa sekvencia HOOC-Asn-tyr (približne 80 %), čo je v dobrej zhode s predpokladanou sekvenciou C-konca translačného produktu, ktorá je HOOC-ASn₄₄|-Tyr₄₄₀, zatiaľ čo sekvencia HOOC-Leu sa objavila len v 20 %. Po frakcionizácii rPH.2 na SDS-PAGE sa uskutočnilo ďalšie sekvencovanie primárneho a sekundárneho prúžku. Sekvencovanie určilo ako C-terminálnu sekvenciu HOOC-Leu-Met z nižšieho sekundárneho prúžku (AHL opísané ďalej k sekcii B.5), ktorý zodpovedá translačnému produktu skrátenému o 10 aminokyselinových zvyškov. Tento produkt vykazuje tiež nízku hladinu HOOC-His. Ďalšie mapovanie peptidov ukázalo, že v prípade niektorých produktov rPH.2 sa vyskytujú ešte ďalšie C-koncové sekvencie. Priamym sekvencovanim bol C-koniec v prípade rPH.9 primáme určený ako HOOC-Ile-His (približne 78 až 91 %, čo záleží od šarže). Tento výsledok je v dobrej zhode s predpokladaným C koncom translačného produktu HOOC-Ile₄₂9-His₄₂8. Zdá sa však, že táto technika má určité pozadie (šum), čim by neboli podchytené nízke hladiny koncentrácií iných sekvencií.

4. Porovnanie PAF-AH fragmentov s PAF-AH metódou MALDI-MS

MALDI-MS metóda bola aplikovaná na purifikovaná produkty rPH.2 a rPH.9. Spektrum namerané pre rPH.2 vykázalo dva piky, ktoré svojou hmotnosťou zodpovedali hodnote očakávanej pre rPH.AH produkty (pozri obrázok 4). Toto spektrum je podobné spektru získanému do čiastočne purifikovaného proteínu opísanému v sekcii B.l v texte. Druhý pík, zodpovedajúci nižšej molekulovej hmotnosti, bol vo väčšine meraní prítomný asi v 20 až 30 % zastúpení. Spektrum rPH.9 ukázalo, že dominantný pík zodpovedá predpokladanej hmotnosti pre úplný translačný produkt vektora PH.9, od ktorého sa odčíta hmotnosť iniciačného metionínu (pozri obrázok 5). V prípade rPH.9 bol tiež pozorovaný vedľajší pík zodpovedajúci nižšej molekulovej hmotnosti. Bol zastúpený asi v prípade 5 % celkového množstva vzoriek.

5. Porovnanie PAF-AH fragmentov s PAF-AH pomocou SDS-PAGE

Elektroforéza v polyalkrylamidovom géli v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) bola aplikovaná na purifikované šarže rPAF-AH, rPH.2 a rPH.9. V prípade rPH.2 bol získaný na elektroforeograme veľmi zložitý obraz prúžkov, rozmiestených okolo miesta zodpovedajúceho migračnému rozsahu očakávanému pre rPAF-AH produkt. Toto miesto bolo určené pomocou zodpovedajúcich molekulových štandardov. Na jednom, či niekoľkých, géli boli pozorované dva dominantné prúžky, ktoré mali v tesnom susedstve každý svoje dva sekundárne prúžky, ktoré boli umiestené nad primárnym prúžkom a pod ním. Tieto horné sekundárne prúžky, stredné primáme a spodné sekundárne prúžky boli označené ako AHU, AHM a AHL. Všetky tieto prúžky reagovali s monoklonálnou protilátkou pripravenou proti rPAF-AH vo Westem blote a tak boli identifikované ako produkty príbuzné rPAF-AH. Vrchný sekundárny prúžok AHU zvyšoval svoju intenzitu v závislosti od doby skladovania proteínu a pravdepodobne reprezentoval modifikovanú formu produktu rPAF-AH. Výsledky získané z SDS-PAGE pre rPAF-AH produkty sú podobné výsledkom získaným tou istou metódou pre rPH.2. Sú tu dva väčšie pruhy, ktoré migrujú v blízkosti predpokladanej molekulovej hmotnosti pre rPAF-AH, ďalej dva minoritné pruhy nad a tieň pod majoritnými pruhmi. Na rozdiel od týchto, rPH.9 poskytuje na SDS-PAGE jeden dominantný pruh bez zjavného štiepenia. Ďalej boli tiež pozorované slabo poznateľné prúžky zodpovedajúce nižšej molekulovej hmotnosti a ďalší prúžok v pozícii zodpovedajúcej hmotnosti diméru. Nebol zrejmý však žiadny prúžok zodpovedajúci AHU pozícii.

Zloženie purifikovaných preparátov rPH.2 a rPH.9 bolo ďalej analyzované pomocou 20 gélov a izoelektrickej fokusácie (IEF) v močovine, ktorá nasledovala za SDS-PAGE v druhom rozmere. Pre rPH.9 je na dvojrozmernej elektroforéze päť hlavných škvŕn rozdelených v smere IEF. Heterogenita v počte nábojov sa v rámci jednotlivých šarží rPH.9 javila ako konzistentná. Na rozdiel od uvedených výsledkov 2D gél pre rPH.2 sa javil ďaleko komplikovanejší, pretože obsahoval asi 15 škvŕn rozdelených v IEF a SDS-PAGE.

6. Porovnanie aktivity PAF-AH s aktivitou fragmentov PAF-AH

Purifikované produkty rPH.2 a rPH.9 vykazovali obidva enzymatickú aktivitu, ktorá bola rovnaká ako v prípade endogénneho PAF-AH purifikovaného zo séra, obidva produkty tiež viažu lipoproteín rovnakým spôsobom ako purifikovaný endogénny PAF-AH.

Príklad 11

Predbežná analýza expresie ľudských plazmatických mRNA pre PAF-AH bola vo vzorcoch ľudských pletív stanovovaná pomocou hybridizácie v Northem blote.

RNA boli pripravené zo vzoriek ľudskej mozgovej kôry, srdca, obličiek, placenty, týmusu a mandlí pomocou RNA Stat 60 (tel-Test „B“, Friendswood, TX). Ďalej bola RNA pripravená tiež z buniek podobných prekurzorom ľudských hematopoetických buniek línie THP-1 (ATCC TIB 202), v prípade ktorej bola vyvolaná difereciácia do fenotypu podobného makrofágu, a to použitím phorbolesteru phorbolmyristylacetátu (PMA). RNA získaná z pletív a RNA pripravená z premylocytickej bunkovej línie THF-1 pred a jeden až tri dni po indukcii, boli rozdelené pomocou elektroforézy v 1,2 % agarózovom formaldehydovom géli a potom prenesené na nitrocelulózovú membránu. Kloň s úplnou dĺžkou PAF-AH cDNA, sAH406-3, pripravený z ľudskej plazmy, bol označený metódou náhodného párovania primárov (random priming) a bol hybridizovaný na membránu, pri podmienkach identických podmienkam opísaným v príklade 3 pre prehliadanie knižnice. Získané výsledky indikovali, že sonda PAF-AH hybridizuje s pruhom zodpovedajúcim 1,8 kb vo vzorcoch z týmusu, mandlí a v malom rozsahu tiež s placentámou RNA.

PAF sa syntetizuje v mozgu tak pri normálnych, ako aj patofyziologických podmienkach. Vzhľadom na známe, zápal vyvolávajúce a potenciálne neurotoxické vlastnosti tejto molekuly, sa predpokladá ako kritický na udržanie zdravia nervového pletiva mechanizmus lokalizácie PAF syntézy alebo jeho rýchly katabolizmus. Prítomnosť PAF acetylhydrolázy v nervových tkanivách ukazuje na jej ochrannú úlohu v týchto pletivách. Je zaujímavé, že obidva PAF-AH, to znamená bovinná (hovädzia) heterotriméma intraceluláma PAF-AH (jej klonovanie je opísané v práci Hattori a ďalší. J. Biol. Chem., 269(37): strana 23150 až 23155 (1994) aj PAF-AH podľa predkladaného vynálezu, boli nájdené v mozgu.

S cieľom určenia, či obidva enzýmy exprimované v rovnakých alebo iných častiach mozgu, bol naklonovaný ľudský homológ bovinnej cDNA pre intracelulámu PAF-AH a pomocou Northern blotu boli porovnané vzorky tejto v mozgu exprimovanej mRNA s exprimovanou mRNA pre PAF-AH podľa vynálezu rovnakou metódou, ako bola opísaná v predchádzajúcich paragrafoch. V mozgu boli metódou Northem blotu preskúmané nasledujúce oblasti: malý mozog, dreň, miecha, bazálne jadro mozgu, amygdala, podvesok mozgový, talamus a tylový pól, čelný lalok a spánkový lalok mozgovej kôry. Stopa prítomnosti obidvoch enzýmov bola detegovaná v každom z uvedených pletív. Vo vyššom množstve bola však skôr detegovaná heterotriméma intraceluláma forma enzýmu, než forma sekretovaná. Analýza uskutočnená pomocou Northem blotu potvrdi25

SK 286518 Β6 la aj pre ďalšie pletivá a bunky, že heterotriméma forma intracelulámeho enzýmu sa vyskytovala v týchto pletivách veľmi hojne. Pletivá, kde bol enzým delegovaný sú nasledujúce: týmus, prostata, semenníky, vaječníky, tenké črevo, tračník, periférne krvný leukocyty, makrofágy, mozog, pečeň, kostrové svaly, obličky, slinivka a žľazy nadobličiek. Táto všadeprítomná expresia tejto formy enzýmu napovedá, že heterotriméma intraceluláma PAF-AH má v bunkách všeobecnú udržiavaciu funkciu.

Ďalej bola v kultúre skúmaná expresia RNA pre PAF-AH v monocytoch izolovaných z ľudskej krvi a počas ich spontánnej diferenciácie na makrofágy. V čerstvých monocytoch bolo detegované len malé alebo vôbec žiadne množstvo RNA, ale expresia bola in-dukovaná a zosilnila sa počas diferenciácie na makrofágy. Sprievodným javom bolo aj zvýšenie aktivity PAF-AH v médiu kultúry diferencujúcich sa buniek . Expresia transkriptu ľudskej plazmatickej RNA pre PAF-AH bola tiež pozorovaná v bunkách THP-1, a to prvý deň, ale už nie tretí deň nasledujúci po indukcii. Bunky THP-1 v bazálnom štádiu neexprimovali mRNA pre PAF-AH.

Príklad 12

Expresia PAF-AH v ľudských a myšacích pletivách bola skúmaná pomocou hybridizácie in situ.

Ľudské pletivá boli získané National Disease Research Interchange and Cooperative Human Tissue Network. Normálny myšací mozog a miecha, ďalej EAE miecha boli získané z S/JLJ myší. Normálnejšie myšacie embryá boli získané od jedenástich do osemnástich dní po oplodnení.

Časti pletív boli umiestené do Tissue Tek II kryoformy (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL) s malým možstvom OCT zlúčeniny (Miles, Inc. Elkhart, IN). Vo forme boli vzorky vycentrované, forma naplnená OCT zlúčeninou, potom umiestená do nádoby s 2-metylbutánom (C2H5CH(CH3)2. ALdrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI) a nádobka bola umiestená do kvapalného dusíka. Hneď ako pletivo a OCT zlúčenina v kryoforme zmrznú, sú uchovávané v -80 °C až do rozrezania bločka. Bločky s pletivami boli rozdelené na rezy s hrúbkou 6 pm a pripevnené k Vectabondom (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) potiahnutým sklíčkam a skladované pri -70 °C a potom umiestené do teploty 50 °C na čas približne 5 minút s cieľom odstránenia kondenzácie a potom sú vzorky fixované v 4 % paraformaldehyde počas 20 minút pri 4 °C, dehydrované (70 %, 95 %, 100 % etanol) počas jednej minúty pre každý stupeň, napokon sú ponechané na vzduchu schnúť počas 30 minút pri izbovej teplote. Pletivá sú hybridizované in situ s rádioaktívne značenou jednovláknovou mRNA generovanou z DNA odvodenej z interného 1 Kb Hindlll fragmentu génu pre PAF-AH (nukleotidy 308 až 1323 zo Sekvencie ID číslo: 7) pomocou in vitro RNA transkripcie inkorporáciou 35S-UTP (Amersham) alebo z DNA odvodenej od heterotrimérnej intracelulárnej cDNA pre PAF-AH identifikovanej Hattorim a ďalšími. Sondy sa používali v rôznych dĺžkach od 250 do 500 bp. Hybridizácia sa uskutočňovala cez noc (12 až 16 hodín) pri 50 °C; 35S- značená sonda (6x105 cpm/rez), tRNA (0,5 pg/rez), ďalej bola pridaná dietylpyrokarbonátom ošetrená voda (depe) do hybridizačného pufra, čím sa upravili koncentrácie jeho zložiek na 50 % formamidu, 0,3M NaCl, 20mM Tris ph, 7, 5, 10 % síranom dextránu, lx Denhardtov roztok, lOOmM ditiotreitol (BTT) a 5mM EDTA. Po hybridizácii sa rezy premývali 1 hodinu pri izbovej teplote v 4x SSC/lOmM DTT, potom 40 minút pri 60 °C v 50 % formamide/lxSSC/lOmM DTT, 30 minút pri izbovej teplote v 2 x SSC, 30 minút pri izbovej teplote v 0,1 x SSC. Rezy sa potom dehydrovali, sušili 2 hodiny na vzduchu a potom boli vyvolané (po skladovaní pri 4 °C v úplnej tme) a ofarbené kontrastným farbivom hematoxylin/eozín.

A. Mozog Mozoček

Tak v ľudskom, ako aj myšacom mozgu bol pozorovaný silný signál vo vrstve Purkyňových buniek malého mozgu, ďalej v košíčkových bunkách a v stredných častiach jednotlivých neurónov v nucleus dentate (jedno zo štyroch jadier v malom mozgu). V týchto bunkách bola ďalej pozorovaná aj herterotriméma forma PAF-AH. Ďalej bol nájdený signál aj pre plazmatickú PAF-AH v granulámych a molekulových vrstvách sivej mozgovej hmoty.

Hippocapmus

Silný signál bol zaznamenaný v hippocampe, hlavne v jednertllvých bunkách, ktoré sa javia ako bunky neurónové. Tieto bunky boli identifikované ako polymorfné časti strednej časti neurónov a granulámych buniek. Tiež v hippocampe bol nájdený signál pre heterotrimérnu intracelulámu formu PAF-AH.

Mozgový kmeň

Tak v ľudskom, ako aj myšacom mozgovom kmeni bol v jednotlivých bunkách sivej hmoty zaznamenaný silný signál.

Kôra

V častiach ľudskej mozgovej kôry, ktorá bola získaná z hlavnej mozgovej, tylovej spánkovej kôry a tiež v celých častiach myšacích mozgov bol pozorovaný v prípade jednotlivých buniek silný signál. Tieto bunky boli identifikované ako pyramidálne, hviezdicovité a polymorfhé bunky. Neboli pozorované žiadne rozdiely vo výsledkoch získaných z rôznych vrstiev kôry. Výsledky získané metódou hybridizácie in situ sa líšili od výsledkov získaných skúmaním mozgovej kôry metódou Northem blotu. Rozdiely pravdepodobnosti vyplývajú z vyššej citlivosti metódy hybridizácie in situ v porovnaní s metódou Northem blotu. Tak v malom mozgu, ako aj v hipokampe boli získané podobné výsledky potvrdzujúce expresiu heterotrimémej formy intracelulámeho PAF-AH.

Hypofýza

O niečo slabší signál bol zaznamenaný na jednotlivých roztrúsených bunkách distálnej časti týchto ľudských pletív.

B. Ľudský tračník

Tak v prípade normálnych, ako aj v prípade tračnikov pacientov s Crohnovou chorobou, sa objavil signál u lymfatických agregátov prítomných v časti sliznice, signál bol slabo vyšší u pacientov s Crohnovou chorobou. Vzorky z tračníka pacientov s Crohnovou chorobou vykazovali tiež silný signál v lamina propria. Podobne, vyššia hladina signálu bola pozorovaná vo vzorkách z chorého slepého čreva, aj keď zdravé črevo vykazovalo nízky, ale stále ešte detegovateľný signál. Vzorky od pacientov trpiacich ulceróznou kolitídou nevykazovali žiadny signál, a to ani v lymfatických agregátoch, ani v črevnej sliznici.

C. Ľudské mandle a týmus

Bol zaznamenaný signál signál v prípade roztrúsených buniek v zárodočných centrách mandlí a týmusu.

D. Ľudské lymfatické uzliny

V prípade vzoriek pochádzajúcich z lymfatických uzlín normálneho darcu bol pozorovaný silný signál, zatiaľ čo vo vzorkách odohraných z lymfatických uzlín pacienta v septickom šoku bol zaznamenaný signál veľmi slabý.

E. Ľudské tenké črevo

Tak vzorky tenkého čreva od zdravého darcu, ako aj vzorky čreva od pacientov trpiacich Crohnovou chorobou poskytovali len slabý signál v Peyerových plakoch a črevnej sliznici. Signál bol bo vzorkách chorých darcov trocha vyšší.

F. Ľudská slezina a pľúca

Tak vo vzorkách pochádzajúcich zo zdravej sleziny a pľúc, ako aj vo vzorkách zo slezín pacientov trpiacich abscesom sleziny a pľúc pacientov s rozdutím pľúc nebol nájdený žiadny signál.

G. Myšacia miecha

V prípade obidvoch typov miechy, to znamená normálne a AEE štádium 3 miechy, bol zaznamenaný silný signál v sivej hmote miechy. Expresia bola v mieche v EAE štádiu 3 slabo vyššia. V prípade miechy pochádzajúcej z EAE štádia 3 boli bunky v bielej hmote mozgovej a v perivaskulámom spojive pravdepodobne infiltrované makrofágmi alebo leukocytmi a vykazovali signál, ktorý nebol zrejmý v normálnej mieche.

H. Myšacie embryá

V jedenásťdennom embryu je signál zreteľný v centrálnom nerovom systéme v štvrtej srdcovej komore, ktorá zastáva konštantná počas vývoja malého mozgu a mozgového kmeňa embrya. Počas dozrievania embrya sa signál stáva zreteľným v centrálnom nervovom systéme v mieche (12 deň), primárnej kôry a Gasseriho uzline (14 deň) a v hypofýze 16 deň). V periférnom nervovom systéme sa signál stáva zreteľným (začínajúc dňom 14 a 15) v nervoch odbočujúcich z miechy a 17 deň sa objavuje silný signál v okolí základov čuchových orgánov embrya. Expresia je tiež zrejmá od 14 dňa a pečeni a pľúcach, v čreve od 15 a v posteriálnej časti úst/hrdla odo dňa 16. Od 18 dňa je možné signál určiť diferencovane ako signál v kôre, zadnom mozgu (malom mozgu a mozgovom kmeni), v nervoch odbočujúcich z bedrovej oblasti miechy, ako signál v zadnej časti úst/hrdla, pečeni, obličkách, ďalej ako možný slabý signál v pľúcach a čreve.

Súhrn

Expresia mRNA pre PAF-AH v mandliach, týmuse, lymfatických uzlinách, Peyerových pľúcach, slepom čreve a v lymfatických agregátoch tračníka je v dobrom súlade so závermi, že pravdepodobný prevládajúci

SK 286518 Β6 zdroj PAF-AH in vivo je v makrofágu, pretože vo všetkých týchto uvedených pletivách sú makrofágy silne zastúpené, slúžia tu ako fagocytózne a antigén prezentujúce bunky.

Expresia PAF-AH v zápalových pletivách sa dá vysvetliť hypotézou, že hlavnú úlohu v zápalových procesoch hrajú monocyty odvodené od makrofágov. Predpokladá sa, že PAF-AH inaktivuje PAF a fosfolipidy podporujúce zápal a tým reguluje smerom dole kaskádu zápalových procesov iniciovaných pomocou týchto mediátorov.

PAF je u potkanov delegovaný vo všetkých tkanivách a je sekretovaný v kultúre granulárnych buniek malého mozgu. In vitro a in vivo pokusy ukázali, že sa PAF viaže na špecifické receptory v nervových tkanivách a indukuje funkčne a fenotypické zmeny, ako je mobilizácia kalcia, regulácia transkripcie, ktorá aktivuje gény a diferenciácia nerových bunkových línií prekurzora, PC12. Tieto pozorovania objasňujú úlohu PAF v mozgu a v súlade s tým sa uskutočnili pokusy využívajúce kultúry tkanív hyppocampu a analógov PAF a jeho antagonistov, ktoré využívajú PAF ako dôležitý spätný mesendžer pre dlhotrvajúce hypokampálne zosilnenie. Preto okrem patologickej úlohy PAF v zápalových procesoch sa zdá, že sa PAF zúčastňuje aj na rutinnom nervovom signálnom procese. Expresia extracelulámej PAF-AH v mozgu môže teda slúžiť na reguláciu trvania a veľkosti signalizácie sprostredkovanej PAF.

Príklad 13

Pri použití PAF-AH ako antigénu produkovaného v E. coli boli pripravené monoklonálne protilátky špecifické pre ľudský špecifický plazmatický PAF-AH.

Myš línie 1342 bola imunlzovaná 0,19 a 40 deň rekombinantným PAF-AH. Ako dávka tesne pred fúziou použitá na imunizáciu myši dávka imunogénu v PBS. O štyri dni ďalej bola myš usmrtená a sterilné vybraná jej slezina. Tá bola potom vložená do misky s 10 ml bezsérového média RPM1 1640. Suspenzia buniek bola pripravená trením slezín medzi dvoma koncami zmrazených mikroskopických sklíčok ponorených do bezsérového média RPMI 1640 s dodaným 2mM L-glutamínom, lmM pyruvátom sodným. 100 jednotiek/ml penicilínu a 100pg/ml streptomycínu (RPMI) (GIBCO, Canada). Suspenzia buniek bola filtrovaná cez sterilný bunkový filter (70-mesh Nitex) (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) a potom boli bunky dvakrát premyté centrifugáciou pri 200 g počas piatich minút a pelety boli opäť resuspendované v 20 ml bezsérového média RPMI. Slezinné bunky z troch natívnych Balb/c myší boli pripravené podobným spôsobom. NS-1 myelómové bunky boli udržiavané v logaritmickej fáze: v RPMI s 11 % fetálneho bovinného séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) počas troch dní pred fúziou, boli centrifugované pri 200 g počas 5 minút a peleta bola dvakrát premytá rovnakým spôsobom, ako je to opísané.

Jedenkrát 10⁸ slezinných buniek bolo kombinovaných s 2,0 x 10⁷ NS-1 buniek, centrifugovaných a supematant bol odsatý. Sediment v kyvete bol poklepkávaním dva kyvety rozdelený a potom bol pridávaný počas jednej minúty 1 ml 37 °C teplého PEG-u 1500 (50 % v 75mM Hepes, pH 8,0) (Boehringer Manheim) pri stálom miešaní, nasledovalo pridanie 7 ml bezsérového média počas 7 minút. Nasledovalo pridanie 8 ml RPMI a bunky sa centrifugovali pri 200 g počas 10 minút. Po odstránení supematantu bola peleta resuspendovaná v 200 ml RPMI obsahujúcom 15 % FBS. 100μΜ hypoxantínu sodného, 0,4μΜ aminopterínu, 16μΜ tymidínu (HAT) (Gibco), 25 jednotiek/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10⁶ tymocytov/ml a bunky boli vysiate na desať dosiek Coming s plochým dnom s 96 jamkami (Coming, Corning New York).

Druhý, štvrtý a šiesty deň nasledujúci po fúzii bolo vymenených 100 μΐ v jamke za čerstvé. Ôsmy deň bola fúzia testovaná pomocou ELISA, testovala sa na prítomnosť myšacieho IgG viažuceho rekombinantný PAF-AH. Mikrotitračné dosky Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA) boli potiahnuté rekombinantným PAF-AH v koncentrácii lOOng/dosku nariedeným v 25mM TRIS, pH 7,5. Inkubácia sa konala pri 37 °C počas dvoch hodín. Potom bol poťahovací roztok odsatý a do jamiek bolo nakvapkaných 200 μΐ blokovacieho roztoku (0,5 % želatíny z rybacej kože (Sigma) zriedenej pomocou CMF-PBS) a tento blokovací roztok sa inkuboval 30 minút pri 37 °C. Potom boli dosky trikrát premyté PBS obsahujúcim 0,05 % Tween 20 (PBST) a do každej jamky bolo pridaných 50 μΐ supematantu z kultúry. Po ďalšej 30-minútovej inkubácii pri 37 °C a následnom trojnásobnom premytí bol do jamiek na doske pridaný konjugát kozích antimyšacích IgG (fc) s chrenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pensylvania) nariedený v PBS 1: 3500. Dosky sa inkubovali rovnakým spôsobom, ako to bolo opísané, štyrikrát boli premyté PBST a potom nasledovala inkubácia so substrátom na peroxidázu (100 μΐ/jamka) rozpusteným v substrátovom pufri. Roztok mal toto zloženie: lmg/'ml o-fenyléndiamín (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30 % H₂O₂ v lOOmM citrátu pH 4,5. Po piatich minútach bola farebná reakcia zastavená pridaním 50 μΐ 15 % H₂SO₄. Na fotometri odčítajúcom hodnoty absorbancie v roztoku (Dynatech reader) sa odčítala absorbancia pri vlnovej dĺžke 490 nm - A490.

Vybrané jamky z fúzie boli dvakrát preklonované metódou limitného riedenia do 96-jamkovej doštičky. Po piatich dňoch inkubácie sa vizuálne hodnotil počet kolónií v jamke. Hybridómy, ktoré sa klonovali, boli nasledujúce: 90D1E, 90Ľ3A, 90E6C, 90G1 ID (ATCC HB 11724) a 90F2D (ATCC HB 11725).

Izotypy monoklonálnych protilátok, produkovaných hybridómami, boli určené pomocou systému Isostrip (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Výsledky ukázali, že monoklonálne protilátky produkované hybridómami fúzie 90 boli typu IgGl.

SK 286518 Β6

Všetky monoklonálne protilátky produkované hybridómami z fúzie 90 bolo možné použiť v ELISA testoch, ale neviazali sa na PAF-AH vo Westem blotoch. Na prípravu protilátok, ktoré by mohli rozpoznávať PAF-AH vo Westem blote, sa myši imunizovali rekombinantným enzýmom. Hybridómy boli pripravené metódou opísanou na fúziu 90, ale testovanie prebiehalo pomocou Westem blotu a nie pomocou ELISA. Tak boli vybrané klony, ktoré bolo možné použiť na detekciu pomocou tejto metódy.

Pre Westem analýzy sa rekombinantný PAF-AH miešal s rovnakým objemom vzorkového pufra obsahujúceho 125mM Tris, pH 6,8, 4 % SDS, lOOmM ditiotreitol a 0,05 % brofenolovú modrú. Pred nanesením na elektroforézu sa vzorka varila počas 5 minút. Bol používaný 12 % SDS polyakrylamidový gél (Novex). Elektroforéza sa uskutočňovala pri 40mA, potom nasledoval elektrotransfer bielkoviny na polyvinylidénfluoridovú membránu (Pierce). Transfer trval 1 hodinu pri 124 V v roztoku 192mM glycínu, 25mM Tris bázy, 20 % metanolu a 0,01 % SDS. Membrána sa nechal inkubovať cez noc v roztoku 20mM Tris, lOOmM NaCl (IBS) obsahujúcom 5 % hovädzie sérum albumín (BSA, Sigma). Blot sa ďalej inkuboval 1 hodinu pri izbovej teplote s králičím polyklonálnym antisérom neriedeným 1 : 8000 pomocou TBS pufra obsahujúceho 5 % BSA, potom nasledovalo premytie v TBS a inkubácia s konjugátom kozích anti myšacích IgG konjugovaných s alkalickou fosfatázou rozpusteným v TBS obsahujúcom 5 % BSA počas 1 hodiny pri izbovej teplote. Blot bol opäť premytý TBS a nasledovala inkubácia so substrátom na alkalickú fosfatázu, to znamená 5-bróm-4-chlór-3-indolyl fosfátom v koncentrácii 0,02 % a 0,03 % tetrazoliovou modrou v Tris-HCl, pH 9,5, lOOmM NaCl a 5mM MgCl₂. Reakcia bola zastavená pomocou opakovaného premývania vodou.

Vybrané jamky fúzie, ktorých supematanty boli pozitívne vo Westemovej analýze, boli spracovaná tak, ako to bolo opísané. Hybridom 143A reagujúci s PAF-AH vo Westem blotoch, bol klonovaný (ATCC HB 11900).

Polyklonálne antiséra špecifické pre ľudský plazmatický PAF-AH boli pripravené počas trojmesačnej imunizácie králikov 100 pg purifikovaného rekombinantného enzýmu vo Freundovom adjuvans.

Príklad 14

Na hodnotenie in vivo terapeutického vplyvom rekombinantného PAF-AH pripraveného podľa vynálezu boli uskutočnené experimentálne štúdie na modeli akútneho zápalu v prípade opuchu potkanieho chodidla (Henriues a ďalší, Br. J. Pharmacol., 106: 579 - 589 (1992). Výsledky týchto štúdií ukázali, že rPAF-AH blokuje vznik PAF-indukovaného edému. Ďalej boli uskutočnené paralelné štúdie slúžiace na porovnanie účinnosti PAF-AH s dvoma komerčne dostupnými PAF antagonistmi.

A. Príprava PAF-AH

E. coli transformované PAF-AH expresným vektorom puc trp AH boli lýzované v mikrofluidizéri, pevné časti boli centrifugované a bunkové supematanty boli nanesené na stĺpec S-Sepharosy (Pharmacia). Stĺpec bol extenzívne premývaný pufrom obsahujúcim 50mM NaCl, ÍOmM CHAPS, 25mM MES a lmM EDTA. pH 5,5. PAF-AH bol vymytý stúpajúcou koncentráciou NaCl, až do hodnoty IM. Ako ďalší krok purifikačného procesu bola použitá afinitná chromatografia na stĺpci Blue Sepharosy (Pharmacia). Pred nanesením PAF-AH na stĺpec Blue Sepharosy bola vzorka nariedená 1 : 2, tým došlo k zníženiu koncentrácie soli na 0,5M a upravilo sa pH na 7,5. Po extenzívnom premývaní stĺpca Blue Sepharosy pufrom obsahujúcim 0,5M NaCl, 25mM Tris, ÍOmM CHAPS a lmM EDTA, pH 7,5. PAF-AH bol zo stĺpca vymývaný zvyšujúcou sa koncentráciou NaCl až na 3,0M.

Čistota týmto spôsobom izolovaného PAF-AH bola obvykle 95 %, tak, ako to bolo určené pomocou SDS-PAGE s aktivitou v rozsahu 5000 až 1000 U/ml. Ďalšie kvantitatívne kontroly uskutočnené s PAF-AH preparátmi zahrnovali určenie hladiny endotoxínu a hemolytickej aktivity s čerstvo pripravenými potkaními erytrocytmi. Ako pufer slúžiaci súčasne na uchovanie aj ako nosič pre administráciu preparátu bol použitý pufer obsahujúci 25mM Tris, ÍOmM CHAPS, 0,5M NaCl, pH 7,5. Dávkovanie použité v pokusoch bolo založené na určení enzýmovej aktivity v testoch priamo predchádzajúcich pokusom.

B. Indukcia opuchu (edému)

Vo všetkých pokusoch boli použité potkanie samice Long Evans (Charles River, Wilmington, MA) staré medzi 6 až 8 týždňami, ktoré vážili medzi 180 až 200 g. Pred uskutočnením pokusu boli zvieratá podrobené anestézii zmesou anestetických prípravkov Ketaset (Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, IA), Rompun (Miles, Shawnee Mission, KS) a AcePromazin (Aveco, Fort Dodge, IA). Všetky anestetiká boli podané podkožné v dávkach približne 2,5 mg Ktasetu, 1,6 mg Rompunu, 0,2 mg AcePromazinu na jednu dávku podanú jednému zvieraťu. Opuchy boli indukované v chodidlách podaním buď PAF alebo zymozanu tak, ako je opísané ďalej. PAF (Sigma -1402) bol čerstvo pripravený na realizáciu každého pokusu zo zásobného roztoku 19,lmM uchovávaného v zmesi chlóroform/metanol (9 : 1) pri -20 °C. Požadované objemy boli vysušené pod dusíkovou atmosférou, nariedené 1 : 1000 v pufri obsahujúcom 150mM NaCl, ÍOmM Tris, pH 7,5 a 0,25 % BSA a sonikované počas piatich minút. Zvieratám bolo aplikovaných podkožné medzi brušká na zadnom chodidle 50 μΐ PAF (konečná dávka 0,96 nmol). Opuch sa objavil za hodinu, v niektorých prípadoch

SK 286518 Β6 po dvoch hodinách. Zymozan A (Sigma A-8800) sa pripravoval čerstvý pre každý pokus, a to ako suspenzia 10 mg/ml v PS. Zvieratám bolo aplikovaných podkožné medzi brušká na zadnom chodidle 50 μΐ zymozanu (konečná dávka 500 μg) a opuch sa objavil po dvoch hodinách.

Opuch sa kvantifikoval pomocou merania objemu chodidla bezprostredne pred administráciou PAF alebo zymozanu a potom v uvedenom čase po podaní PAF a zymozanu. Opuch sa kvantifikoval zvýšením objemu chodidla v mililitroch. Meranie objemu bolo uskutočňované na plethysmometri (UGO Basile, model 7150), ktorým sa dá zmerať objem vody vytlačenej ponoreným chodidlom. Z dôvodu, aby bola porovnateľná veľkosť ponorenej časti chodidla v obdivoch vymedzených časových intervaloch, zadná časť nohy bola označená nezmývateľným atramentom v mieste, kde končí osrstenie na päte. Opakované merania rovnakého chodidla použitím tejto techniky indikovali presnosť merania s chybou do 5 %.

C. Spôsoby podávania a dávkovania PAF-AH

PAF-AH bol podávaný injekčné lokálne medzi brušká na chodidle, alebo systémovo pomocou intravenóznej injekcie do chvostovej žily. Pri lokálnom podávaní dostali potkany 100 μΐ PAF-AH (4000-6000 U/ml) podkožné medzi brušká pravej zadnej nody. Ľavá noha slúžila ako kontrola, bola do nej injikovaná dávka 100 μΐ nosiča (pufrovaný fyziologický roztok). Pri systémovom podávaní PAF-AH bolo potkanom podávané uvedené množstvo jednotiek PAF-AH v 300 μΐ nosiča injekciou do chvostovej žily. Kontrolné zvieratá dostali intravenózne do chvostovej žily rovnaký objem nosiča.

D. Lokálne podávanie PAF-AH

Potkanom (N=4) bola podaná subkutánne medzi brušká na pravom chodidle injekčná dávka 100 μΐ PAF-AH (4000 - 6000 U/ml). Do ľavého chodidla bol injekčné vpravený len nosič (100 μΐ pufŕovaného fyziologického roztoku). Štyrom ďalším potkanom bola podaná len dávka nosiča. Všetky potkany boli ihneď podrobené podaniu PAF cestou subkutánnych injekcií a jednu hodinu po podaní bol meraný objem. Obrázok 6, kde je veľkosť opuchu vyjadrená zvýšením objemu chodidla (ml) ±SEM pre každú sledovanú skupinu, ukazuje, že vznik opuchu indukovaného pomocou PAF je blokovaný lokálnym podaním PAF-AH. V prípade skupiny zvierat, ktorým bol podaný PAF-AH pred podaním PAF, sa prejavili v porovnaní s kontrolnou skupinou zvierat zmenšenie opuchu. V skupine myší ošetrených PAF-AH bolo pozorované zvýšenie objemu chodidla len o 0,08 ml ± 0,008 (SEM). Zvýšenie objemu chodidla bolo spôsobené injekciou PAF do chodidla. Toto zvýšenie objemu nebolo pozorované v chodidlách, do ktorých bol injekčné aplikovaný len nosič.

E. Intravenózne podávanie PAF-AH

Potkany (N=4 v skupine) boli ošetrené intravenóznou injekciou PAF-AH (2000 U v 300 μΐ nosiča) 15 minút pred podaním PAF. Opuch sa objavil 1 až 2 hodiny po podaní PAF. Obrázok 7, na ktorom je veľkosť opuchu vyjadrená nárastom objemu v (ml)±SEM pre každú skúmanú skupinu, ukazuje, že intravenózna aplikácia PAF-AH blokuje vznik opuchu zapríčinený podaním PAF, a to jednu až dve hodiny po jeho podaní. Skupina, ktorá bola ošetrená 2000U PAF-AH itnravenóznou cestou, vykázala počas dvoch hodín zníženie zápalu. Priemerné zvýšenie hodnoty objemu kvapaliny liečenej PAF-AH bolo 0,10±0,08 (SEM), oproti zvýšeniu 0,56 ml±0,l 1 nameranému v prípade kontrolnej skupiny ošetrenej len nosičom.

F. Porovnanie účinku PAF-AH v zabránení vzniku opuchu indukovaného PAF alebo Zymozanom

Potkany (N=4 v skupine) boli ošetrené intravenóznou injekciou PAF-AH (2000U v 300 μΐ nosiča) alebo nosičom samotným. 15 minút pred touto injekciou dostali zvieratá PAF alebo zymozan A a po jednej alebo dvoch hodinách bol zmeraný objem chodidiel. Na obrázku 8 je znázornená veľkosť opuchu ako priemerné zvýšenie objemu v (ml)±SEM, a to pre všetky sledované skupiny. Z obrázku je zrejmé, že podanie PAF-AH (2000 U) bolo účinné v redukcii opuchu chodidla vyvolaného PAF, ale je neúčinne v blokovaní vzniku opuchu v prípade podávania zymozanu. Priemerné zvýšenie hodnoty objemu v prípade skupiny PAF-AH bolo 0,08±0,02 (SEM), oproti zvýšeniu 0,49±0,03 nameranému v prípade kontrolnej skupiny.

G. Podávanie účinnej dávky určené titráciou PAF-AH, ktorá vyvoláva ochranu

V dvoch samostatných pokusoch bol potkanom (N=3 až 4 v skupine) podávaný intravenózne PAF-AH v sérii riedení alebo len nosič v 300 μΐ objemoch, a to 15 minút pred podaním dávky PAF. Obidve chodidlá zvierat boli ošetrené PAF rovnakým spôsobom, ako je opísaný, opuch sa hodnotil po jednej hodine. Na obrázku 9 je znázornená veľkosť opuchu ako priemerné zvýšenie objemu v (ml)±SEM, a to pre všetky sledované skupiny. Z obrázku je zrejmé, že podávanie stúpajúcich dávok PAF-AH zabraňuje tiež so stúpajúcou tendenciou tvorbe opuchu vyvolaného injekciou PAF potkanom. V pokuse bola zistená ID50, pre PAF-AH podávaný injekčnou cestou medzi 40 až 80 U na potkana.

SK 286518 Β6

H. Účinnosť PAF-AH in vivo ako funkcia času po podaní

V dvoch samostatných pokusoch bol potkanom (N=3 až 4 v skupine) podávaný intravenózne PAF-AH (200 0 v 300 μΐ nosiča) alebo len nosič. Po podaní PAF-AH dostali potkany dávku PAF, a to v časových intervaloch začínajúcich 15 minút po podaní PAF-AH až po 47 hodín po podaní PAF-AH. Opuch bol potom hodnotený jednu hodinu po podaní PAF. Na obrázku 10 je znázornená veľkosť opuchu ako priemerné zvýšenie objemu v (ml)±SEM, a to pre všetky sledované skupiny. Z obrázku je zrejmé, že podanie 200U PAF-Ah ochráni potkany pred vznikom opuchu indukovaného PAF počas najmenej 24 hodín.

I. Farmakokinetiká PAF-AH

Štyri potkany dostali dávku 2000 PAF-AH intravenóznou injekciou v 300 μΐ objeme. V rôznych časových bodoch bola odohraná plazma a uchovaná pri 4 °C. Koncentrácia PAF-AH v plazme sa určovala pomocou ELISA, používal sa typ testu využívajúci dvojité väzby pomcou mAb. V skratke sa dá tento postup opísať takto: monoklonálna protilátka 90G11D (Príklad 13) sa nariedi v 50mM uhličitanovom pufri pH 9,0 na koncentráciu 100 ng/ml a nechá sa naviazať na mikrotitračnú dosku Immulon 4 cez noc pri +4 °C. Po extenzívnom premytí pomocou PBS obsahujúceho 0,05 % Tween 20, sa dosky blokovali 1 hodinu pri izbovej teplote 0,5 % rybacou kožnou želatínou (Sigma) riedenou v PBS. Vzorky séra riedené v PBS obsahujúceho 15mM CHAPS boli na premytú dosku nanesené v duplikátoch a inkubovali sa počas 1 hodiny v izbovej teplote. Po premytí bol pridaný do každej jamky konjugát monoklonálnej protilátky 90F2D s biotínom (Príklad 13) v koncentrácii 5 pg/ml nariedený v PBS. Konjugát sa nechal inkubovať jednu hodinu pri izbovej teplote. Po premytí sa pridalo do každej jamky 50 μΐ Extra avidínu (Sigma) v riedení 1 : 1000. Avidín sa inkuboval jednu hodinu pri izbovej teplote. Po premytí sa pridal substrát OPD a nechalo sa vyvinúť zafarbenie, ktoré sa zmeralo na fotometri. Z kalibračnej krivky sa potom podľa nameraných hodnôt odčítala aktivita enzýmu. Z obrázku 11, kde body reprezentujú priemer±SEM, je zrejmé, že v plazme odohranej hodinu pred podaním hladiny koncentrácie PAF-AH dosahujú predpokladanú koncentráciu vo vzorkách s objemom plazmy 5 až 6 ml u potkanov vážiacich 180 až 200 gramov, priemerne 374 U/ml±58,2. Po jednej hodine hladiny koncentrácie stabilne klesajú, až dosiahnu po 24 hodinách priemernú hodnotu 19,3 U/ml±3,4, ktorá je však stále znateľne vyššia ako koncentrácia endogénnej PAF-AH, ktorá dosahovala v enzymatických testoch približné hodnoty okolo 4 U/ml.

J. Účinnosť PAF-AH v porovnaní s antagonistmi PAF

Potkany (N=4 v skupine) boli ošetrené jedným z troch potenciálnych prípravkov zamedzujúcich zápal antagonistom PAF CV3988 (Biomol L-103) podávaný IP (2mg v 200 μΐ EtOH), antagonistom PAF Alpazolom (Sigma A - 8800) podávaným IP (2 mg v 200 μΐ EtOH) alebo PAF-AH (2000 U) podávaným IV. Kontrolná skupina potkanov dostala 300 μΐ nosiča IV. Antagonisty PAF boli administrované IP, pretože sú rozpustné v etanole. Potkanom ošetreným buď CV3988 alebo Alprazolom bol podaný PAF po 30 minútach po podaní týchto antagonistov, to preto, aby sa antagonisty PAF dostali do obehu, zatiaľ čo PAF-AH a potkanom ošetreným nosičom bolo podávanie uskutočnené po 15 minútach po administrácii enzýmu. Potkany ošetrené PAF-AH vykazovali redukciu v opuchoch indukovaných PAF, až za nimi sa umiestili ďalší antagonisty CV3988 a Aprazolam. To je znázornené na obrázku 12, kde je znázornená veľkosť opuchu ako priemerné zvýšenie objemu v (ml)±SEM, a to pre všetky skúmané skupiny.

Ak zhrnieme dosiahnuté výsledky, je zrejmé, že rPAF-AH účinne blokuje opuchy vyvolané in vivo PAF. Podávanie produktov PAF-AH sa môže diať buď lokálne alebo systémovo pomocou IV injekcií. V štúdiách dávkovania sa pohybovali dávky IV injekcií v rozsahu 160 - 2000 U/potkana. Tieto dávky dramaticky znížili zápal vyvolaný PAF, zatiaľ čo dávka DI50 sa pohybovala v rozmedzí 40 až 80 U/potkana. Výpočty založené na objeme plazmy pre potkana vážiaceho 180 až 200 gramov dávajú dobrý predpoklad pre to, že koncentrácie v plazme rovnajúce sa 25 až 40 U/ml účinne bránia vzniku opuchu vyvolanému PAF. Tieto predpoklady boli podporené predbežnými farmakokinetickýml štúdiami. Zistilo sa, že dávka 2000U PAF-AH je účinná pri blokovaní edému vyvolaného PAF počas najmenej 24 hodín. Po 24 hodinách po podávaní boli v plazme zistené koncentrácie PAF-AH približne 25 U/ml. PAF-AH blokoval vznik opuchu vyvolaného PAF oveľa účinnejšie ako obidva testované uvedené ďalšie antagonisty PAF. Súhrnne je možné povedať, že tieto výsledky potvrdzujú, že PAF-AH účinne blokuje zápaly indukované PAF a mohol by mať terapeuticky význam pri liečení chorôb, kde je PAF primárny mediátor.

Príklad 15

Rekombinantý PAF-AH podľa vynálezu bol testovaný in vivo na druhom modeli, zápale pohrudnice (pleuritíde) vyvolanom PAF. Ako bolo ukázané už predtým, ak je aplikovaný do pohrudničného priestoru, indukuje vaskuláme presakovanie. (Hebriques a ďalší, pozri skôr). Samice potkanov (Charles River, 180 - 200 g) boli injikované do chvostovej žily 200 μΐ 1 % Evansovou modrou rozpustenou v 300 μΐ rekombinantného PAF-AH (1500 μΐ/ml/hodina, pripraveného tak, ako je to opísané v príklade 14) alebo len rovnakým objemom kontrolného pufra. Po pätnástich minútach dostali potkany 100 μΐ injekciu PAF (2nmol) do

SK 286518 Β6 pohrudničného priestoru. Po jednej hodine pôsobenia PAF boli potkany zabité a odsatá kvapalina, ktorá vznikla premývaním pohrudničnej dutiny 3 ml heparinizovaného PBS. Presakovanie ciev bolo merané množstvom Evansovej modrej v pohrudničnom priestore premeraním absorbancie pri 620 nm. V prípade potkanov, ktorým bol najprv podaný PAF-AH, bolo presakovanie ciev oveľa menšie, ako v prípade kontrolnej skupiny zvierat (reprezentovalo to viac ako 80 % redukciu zápalu).

Predchádzajúce výsledky podporujú možnosť využitia rekombinantného PAF-AH podľa vynálezu ako lieku pri zápale pohrudnice.

Príklad 16

Účinnosť rekombinantného enzýmu PAF-AH podľa vynálezu bola tiež testovaná na modeli antigénom indukovanej tvorby eozinofilov. Akumulácia eozinofilov v dýchacích cestách je charakteristickou vlastnosťou neskorej fázy imunitnej odpovede, ktorá sa vyskytuje pri astme, rinitíde a ekzémoch. Myši BALB/c (Charles River) boli zcitlivené dvoma intraperitoneálnymi injekciami obsahujúcimi 1 pg ovalbumínu (OVA) v 4 mg hydroxidu hlinitého (Imject alum, Pierce Laboratories, Rockford, IL) podanými v dvojtýždennom intervale. Štrnásty deň nasledujúci druhou imunizáciou boli zcitlivené myši podrobené imunologickému testu s aerosolizovaným OVA alebo fyziologickým roztokom ako kontrolou.

Pred samotným testom boli myši náhodne rozdelené do štyroch skupín po štyroch myšiach. Myši v skupine 1 a 3 boli ošetrené 140 μΐ kontrolného pufra obsahujúceho 25mM Tris, 0,5M NaCl, lmM EDTA a 0,1 % Tween 80 podaného intravenóznou injekciou. Myši v skupine 2 a 4 boli ošetrené 750 jednotkami PAF-AH (aktivita 55000/ml podanými v 140 μΐ PAF-AH pufra). Tridsať minút po podaní PAF-AH alebo pufra boli myši v skupine 1 a 2 vystavené aerosolizovanému PBS, ako je to opísané ďalej, zatiaľ, čo myši v skupine 3 a 4 boli vystavené aerosolizovanému OVA, 24 hodín potom boli myši opäť ošetrené druhý raz buď 140 μΐ pufra (skupina 1 a 3) alebo 750 jednotkami PAF-AH v 140 μΐ pufra (skupina 2 a 4). Látky boli podané intravenózne injekciou.

Eozifilová infiltrácia trachei bola indukovaná u zcitlivených myší vystavením zvierat aerolizovanému OVA. Zcitlivené myši boli umiestené do 50 ml kónických centrifugačných skúmaviek (Cormimg) a nútené dýchať aerolizovaný OVA (50 mg/ml) rozpustený v 0,9 % fyziologickom roztoku počas 20 minút s použitím rozprašovača (Model 646, DeVilbiss Corp., Somerset, PA). Kontrolné myši boli ošetrené rovnakým spôsobom s tou výnimkou, že bol v rozprašovači použitý len 0,9 % fyziologický roztok. 48 hodín po expozícii aerolizovaným OVA alebo fyziologickým roztokom boli myši usmrtené a trachey boli vybrané. Trachey z každej skupiny boli pevne zachytené v OCT a skladované pri -70 °C do času narezania preparátov.

Na vyhodnotenie eozinofílovej infiltrácie trachey boli tkanivové rezy zo štyroch skupín myší ofarbené buď roztokom Luna a hematoxylín-eozínovým roztokom alebo peroxidázou. Dvanásť šesťmikrometrových rezov bolo narezaných z každej skupiny a podľa toho očíslovaných. Rezy očíslované nepárnymi číslami boli ofarbené farbou Luna podľa nasledujúceho postupu. Rezy boli fixované 5 minút pri laboratórnej teplote, opláchnuté tečúcou vodou trikrát počas 2 minút pri laboratórnej teplote a potom opláchnuté v dvoch výmenách destilovanej vody (dH₂O) počas jednej minúty pri laboratórnej teplote. Tkanivové rezy boli farbené farbou Luna 5 minút pri laboratórnej teplote (farba Luna je zložená z 90 ml Weigertovho železného hematoxylínu (Welgerťs Iron hematoxylin) a 10 ml 1 % Bierbrich Scarlet). Ofarbené rezy boli ponorené do 1 % kyslého alkoholu 6x, opláchnuté v tečúcej vode počas 1 minúty pri laboratórnej teplote, ponorené do 0,5 % roztoku uhličitanu lítneho, päťkrát opláchnuté tečúcou vodou počas 2 min. pri izbovej teplote. Rezy boli dehydrované etanolom s koncentráciami 70 % - 35 % - 100 %, v každej koncentrácii boli ponechané 1 minútu pri izbovej teplote, ďalej boli prečistené dvakrát xylénom počas 1 minúty pri izbovej teplote a pripevnené do Cytoseal 60.

Pre farbenie peroxidáz boli segmenty fixované acetónom s teplotou 4 °C počas 10 minút a usušené na vzduchu. Ku každej časti bolo pridaných 200 μΐ roztoku DAB a ponechaných 5 min. pri izbovej teplote. Rezy boli 5 min. oplachované vodovodnou vodou pri izbovej teplote a ďalej boli na každý segment aplikovaný 2 kvapky 1 % kyseliny osmičelej počas 3 - 5 s. Rezy boli opláchnuté vodovodnou vodou počas 5 min. pri izbovej teplote a kontrastne ofarbené Mayerovým hematoxylínom pri 25 ^CC pri izbovej teplote. Potom boli rezy 5 min. oplachované tečúcou vodou a dehydrované etanolovým radom 70 % - 95 % - 100 %, 1 minútu v každej koncentrácii, pri izbovej teplote. Rezy boli ďalej prečistené dvakrát xylénom počas 1 minúty pri izbovej teplote a upevnené v Cytosealu 60.

Bol hodnotený počet eozinofilov v submukozálnom tracheálnom tkanive. Trachea myšacej prvej a druhej skupiny obsahovala veľmi málo samotných eozinofilov v submukozálnom tkanive. Podľa predpokladu boli trachey myší tretej skupiny, ktoré boli dopredu ošetrené pufrom a vystavené poprašku OVA, veľký počet eozinofilov v submukozálnom tkanive. Oproti tomu trachey myší štvrtej skupiny, ktoré boli predbežne ošetrené PAF-AH a vystavené poprášenie OVA, obsahovali len niekoľko eozinofilov v submukozálnom tkanive v porovnaní s kontrolnou skupinou a skupinami 1 a 2.

Terapeutické ošetrenie PAF-AH preto môže byť indikované v prípadoch neskorej imunitnej odpovede, pri ktorej dochádza k akumulácii eozinofilov tak, ako je to v prípade astmy a rinitídy.

Príklad 17

PAF-AH produkt, ktorý je predmetom patentu, bol testovaný pre dva odlišné potkanie modely pri ošetrení nekrotických enterokolitíd (NEC), akútnych hemoragických nekróz čreva, ku ktorým dochádza pri plodoch s nízkou pôrodnou váhou a spôsobuje významnú chorobnosť a mortalitu. V predchádzajúcich experimentoch sa ukázalo, že ošetrenie glukokortikoldmi znížilo výskyt NEC u zvierat a nedonosených detí a predpokladá sa, že k aktivite glukokortikoidov dochádza prostredníctvom zvýšenej teploty PAF-AH v plazme.

A. Aktivita u potkanov s NOEC indukovaným pôsobením PAF

1. Prevencia

Rekombinantný PAF-AH produkt, rPH.2 (25,000 jednotiek v 0,3 ml, skupiny 2 a 4) alebo samotný pufer (25mM Tris, 0,5M NaCl, lmM EDTA a 0,1 % Tween 80) (skupiny 1 a 3), boli podané do chvostovej žily samičích potkanov Wistar (n=3) s hmotnosťou 180 - 200 g. 15 minút po aplikácii rPH.2 alebo samotného pufra bol zvieratám injikovaný tak, ako to opísal Furukawa, et al. (J. Pediatr. Res. 34: 237 - 241 (1993)), do abdominálnej aorty na úrovni superiomej mezenterickej artérie buď samotný BSA (0,25 %) - fyziologický roztok (skupiny 1 a 2) alebo PAF (0,2 gg/100 mg) suspendovaný vo fyziologickom roztoku obsahujúcom BSA (skupina 3 a 4). Tenké črevo bolo po dvoch hodinách odstránené od slepého čreva prerušením Trietzovho väzu, dôkladne opláchnuté chladným fyziologickým roztokom a hodnotené. Pre mikroskopické pozorovanie boli získané vzorky z hornej, strednej a dolnej časti tenkého čreva. Tkanivá boli fixované v pufrovanom formalíne a vzorky pripravené na mikroskopické hodnotenie ofarbením hematoxilínom a eozínom. Experiment bol trikrát opakovaný.

Pri zbežnej prehliadke čriev bol zistený normálny nález v skupinách ošetrených BSA vo fyziologickom roztoku. Podobne tiež injikovaný rPH.2 v neprítomnosti PAF nemal žiadny efekt na nález v črevách (gross findings). Naopak, injekcia PAF do descendujúcej aorty mala za následok rýchle a ťažké diskolorácie a hemoragiu serózneho povrchu čriev. Podobná hemoragia bola zaznamenaná, ak boli segmenty tenkého čreva sledované na strane sliznice a tenké črevo bolo úplne nekrotické. Ak bol rPH.2 injikovaný do chvostovej žily 15 min. pred podaním PAF do aorty, bol nález na črevách normálny.

Pri mikroskopickom pozorovaní čriev v skupinách 1, 2 a 4 bola zistená normálna vilózna architektúra a normálna populácia buniek v lamina propria. Naopak, v prípade skupiny ošetrenej samotným PAF boli zistené silné nekrózy a hemoragie v celej sliznici. Aktivity PAF-AH v plazme boli stanovené v prípade rovnakých potkanov ako v predchádzajúcom experimente. Aktivita PAF-AH bola stanovená tak, ako je to opísané neskôr. Pred injekciou do chvostovej žily boli najprv odohrané vzorky krvi. Ďalej boli vzorky odobrané z vena cava bezprostredne pred injekciou PAF a v dobe usmrtenia. Krv bola zozbieraná v množstve asi 50 ,ul do heparinizovaných kapilárnych trubičiek. Plazma bola získaná centrifugáciou (980x g počas 5 minút). Enzým bol stanovený podľa Yasuda a Johnston, Endocrinology, 130: 708 - 716 (1992).

Aktivita PAF-AH v plazme bola v prípade všetkých potkanov pred injekciou 75 ± 2,5 jednotky (1 jednotka sa rovná 1 nmol x min.¹ x ml-1 plazmy). Aktivity PAF-AH namerané v plazme boli po 15 minútach po injekcii samotného pufra 75,2 ± 2,6 jednotky v skupine 1 a 76,7 ± 3,5 jednotiek v skupine 3. Po 15 minútach bola zistená aktivita PAF-AH v plazme zvierat, ktorým bolo injikovaných 25 000 jednotiek rPH.2, 2249 ± ± 341 jednotiek v skupine 2 a 2494 ± 623 jednotiek v skupine 4. Aktivita v skupinách 2 a 4 zostala zvýšená (1855 ± 257 jednotiek) až do doby usmrtenia (2 1/4 hodiny po injekcii rPH.2) (skupina 2 = 1771 ± 308; skupina 4 = 1939 ± 478). Z týchto výsledkov vyplýva, že aktivita PAF-Ah v plazme potkanov, ktorým bola injikovaná samotná prenosná látka (skupiny 1 a 3), sa nemenila počas experimentu. V prípade zvierat, ktorým bol injikovaný PAF, sa vyvinul NEC, zatiaľ čo všetky potkany, ktorým bol podaný rPH.2 a potom injekcia PAF, boli úplne ochránené.

2. Závislosť prevencie NEC od dávkovania

Aby bolo možné zistiť u potkanov závislosť ochrannej aktivity proti NEC od dávkovania, boli zvieratá ošetrené zvyšujúcimi sa dávkami rPH.2 15 min. pred podaním PAF. Dávky rPH.2 sa pohybovali v rozmedzí 25,5 až 25,500 jednotiek, ktoré boli podané do chvostovej žily potkanov. Potom bol injikovaný PAF (0,4 pg v 0,2 fyziologického roztoku s BSA) 15 min. po podaní rPH.2 do abdominálnej aorty, 2 hodiny po podaní PAF bolo tenké črevo odstránené a bol hodnotený vznik NEC. Aktivita PAF-AH v plazme bola stanovená pred exogénnym podaním enzýmu a 15 minút a 2 1/4 hodiny po podaní rPH.2. Výsledky sú priemernou hodnotou z 2 - 5 zvierat v každej skupine. V prípade všetkých potkanov, ktoré dostávali menej ako 2 000 jednotiek enzýmu, sa rozvinul NEC. Aktivita PAF-AH v plazme zvierat, ktorým boli podávané najnižšie ochranné dávky enzýmu (2040 jednotiek), dosahovala po 15 minútach 363 jednotiek na ml plazmy, čo predstavovalo päťnásobné zvýšenie oproti východiskovej hodnote. Ak bol rPH.2 podaný v dávke nižšej ako 1 020 celkových jednotiek, bola priemerná aktivita enzýmu v plazme okolo 160 a nižšia a v prípade všetkých zvierat zistený vznik NEC.

SK 286518 Β6

3. Trvanie ochrany proti NEC

S cieľom stanovenia dĺžky exogénneho pôsobenia produktu PAF-AH potrebného na ochranu proti vzniku NEC, bolo potkanom do chvostovej žily jednorazovo injikované fixné množstvo enzýmu a následne aplikovaný PAF v rôznych časových intervaloch. rPH.2 (8 500 jednotiek v 0,3 ml) alebo samotný roztok bez účinnej látky bol potkanom podaný od chvostovej žily a PAF (0,36 pg v 0,2 ml BSA vo fyziologickom roztoku) injikovaný do abdominálnej aorty v rôznych časových intervaloch po podaní enzýmu. Tenké črevá boli vybrané 2 hodiny po injekcii PAF a podrobené vyšetreniu a histologickému pozorovaniu vzniku NEC. Aktivita PAF-AH v plazme bola stanovená v rôznych intervaloch po podaní enzýmu a dve hodiny po aplikácii PAF. V každej skupine boli stanovené priemiemé hodnoty enzymatickej aktivity ± štandardná odchýlka.

Z výsledkov vyplýva, že u žiadneho potkana nedošlo k vzniku NEC počas prvých 8 hodín po injekcii rPH.2, zatiaľ, čo v prípade 100 % zvierat, ktorým bol následne aplikovaný PAF 24 a 48 hodín po injekcii enzýmu, došlo k rozvoji NEC.

4. Zvrat NEC

Aby bolo možné stanovil, či môže podávanie PAF-AH zvrátiť rozvoj NEC vyvolaný injekciou PAF, bolo zvieratám injikovaných 25 000 jednotiek enzýmu do vena cava dve minúty po podaní PAF (0,4 pg). V prípade žiadneho zvieraťa sa NEC nevytvoril. Ale ak bol rPH.2 podaný týmto spôsobom 15 minút po injekcii PAF, v prípade všetkých zvierat sa NEC vytvoril, čo zodpovedá rýchlemu priebehu počas rozvoja NEC indukovanému podaním PAF, ako už bolo opísané predtým Furukavom et al. (pozri skôr). Zo súhrnu týchto výsledkov vyplýva, že relatívne malé zvýšenie aktivity (päťnásobné) PAF-AH v plazme je schopné zabrániť vzniku NEC. Tieto pozorovania spolu s predchádzajúcimi správami o tom, že aktivita PAF-AH v plazme králičích plodov [Maki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 728 - 732 (1988)] a neošetrených detí [Caplan et al., J. Pediatr. 116: 908 - 964 (1990)] bola relatívne nízka, svedčí o tom, že profylaktické podanie prípravkov obsahujúcich ľudský rekombinantný PAF-AH produkt deťom s nízkou pôrodnou váhou môže byť použité pri ošetrení NEC.

B. Aktivita v neonatálnom modeli NEC

Účinnosť produktu PAF-AH, rPH.2, bola hodnotená v prípade NEC modelu pre novonarodené stresované potkany ďalej opísaným postupom, a to podaním kŕmnej zmesi a asfyxiou, čo sú dva rizikové faktory pre vznik choroby u ľudí. V tomto modelovom systéme došlo v prípade 70 - 80 % zvierat do tretieho dňa života k zjavnému a mikroskopickému poškodeniu čreva podobne ako v prípade neonatálneho NEC. Potkaní novorodenci boli získaní z brezivých potkanov Sprague-Dawley (Harlan Sprague-Dawley, indlanapolis, IN), pri anestézii CO₂ a porodené abdominálnou incíziou. Novorodené zvieratá bola zhromaždené, osušené a celú dobu experimentu umiestené v inkubátori pre novorodencov.

Najprv boli v jednotlivých skupinách stanovené dávkovanie a absorpčné charakteristiky rPH.2. Normálnym novorodeným potkaním mláďatám bola v čase 0. podaná enterálne alebo intraperitoneálne jedna z troch dávok rPH.2 (31ambda, 151ambda alebo 751ambda) a potom bola odohraná krv pre stanovenie aktivity PAF-AH v plazme po lh, 6h a 24h. Aktivita PAF-AH bola meraná metódou inkubácie so substrátom [Gray et al., Náture, 374: 549 (1995)] a ELISA použitím anti-ľudských rPAF-AH monoklonálnych protilátok pre každú vzorku (90F2D a 90G1 ID, ako je to opísané v príklade 13). Imunohistologický rozbor bol uskutočnený štandardnými technikami pomocou protilátok 1 : 100 a inkubovaných cez noc.

V prípade normálne narodených mláďat potkanov nebola po aplikácii rPH.2 do čriev zistená zvýšená aktivita PAF-AH v plazme žiadnu dobu experimentu, tak pomocou metódy inkubácie so substrátom, ako aj metódy ELISA. Pri intraperltoneálnej aplikácii rPH.2 bola do jednej hodiny po aplikácii merateľná cirkulujúca aktivita PAF-AH obidvoma metódami a táto aktivita vrcholila 6h po podaní látky. Vyššie dávky rPH.2 (od 3 do 751ambda, 10 až 250 U) vyvolali vyššiu aktivitu PAF-AH v plazme. Po enterálnom podaní bola pri ímunohistochemickej analýze zistená prítomnosť rPAF-AH produktu v epitelových bunkách črevnej sliznice. Aktivita bola sústredená prevažne v črevných viloch s minimálnu prítomnosťou farbiva v kryptických bunkách. Intenzívnejšie bolo ofarbene ileum ako jejunum a určité množstvo rPAF-AH produktu bolo imunochemicky detegované v častiach tračníka. Žiadne pozorovateľné farbenie nebolo zistené v prípade kontrolných vzoriek a vzoriek získaných zo zvierat, ktorým bola látka podaná intraperitoneálne. Enterálna aplikácia produktu rPAF-AH mala teda za následok lokálnu akumuláciu v epiteli sliznice, zatiaľ čo intraperitoneálne podanie produktu rPAF-AH zvýšila hladinu cirkulujúceho enzýmu, ale nie jeho lokálnu akumuláciu v sliznici.

V prípade NEC modelu bol u novorodených potkanov indukovaný NEC podľa Caplan et al., Pediatr. Pathol., 14: 1017 - 1028 (1994). Pri tomto postupe boli zvieratá každé tri hodiny kŕmené trubičkou rozpustnou kŕmnou zmesou pre mláďatá (Esbiliac, Borden Inc.). Začiatočná kŕmna dávka 0,1 ml/kŕmenie bola neskôr podľa tolerancie zvýšená na 0,4 ml/kŕmenie až do štvrtého dňa. V prípade všetkých zvierat bola dvakrát denne vyvolaná asfyxia vdychovaním 100 % dusíka počas 50 sekúnd v uzatvorenej plastikovej komore a zvieratá potom boli vystavené chladu (4 °C) počas 10 min. Funkcia čriev a močového mechúra bola stimulovaná jemnou manipuláciou po každom kŕmení. Zvieratá boli vyživované počas 96 hodín alebo dokiaľ nevy34 kazovali znaky úzkosti. Chorobné zvieratá mali abdominálnu distenziu, krvavú stolicu, dýchacie ťažkosti, cyanozu, letariu a boli usmrtené dekapitáciou. Po usmrtení boli črevá všetkých potkanov hodnotené na prítomnosť nekróz a fixované vo formalme pre neskoršiu histologickú analýzu. Vzorky boli prichytené v parafíne, narezané mikrotómom, ofarbené hematoxylínom a eozínom a hodnotené dvoma nezávislými pozorovateľmi. Poškodenie čriev bolo označené ako 1+ pri odchlipnutých alebo oddelených epitelových bunkách, 2pri odlupujúcich sa epitelových bunkách do strednej vilóznej vrstvy, 3+ pre nekrózu celého vilusu a 4+ pre transmurálnu nekrózu.

S cieľom stanovenia účinnosti rPH.2 bola trom skupinám potkanov podaná látka enterálne, intraperitoneálne alebo obidvoma spôsobmi. Preparát rPH.2 obsahoval 0,8 mg/ml proteínu a približne 4000 jednotiek/mg PAF-AH s pomerom endotoxín/proteín <0,5 EU/mg. Pri enterálnom použití rPH.2 bolo zvieratám podaných 251ambda (80U) látky zriedenej v kŕmnej dávke orogastrickou trubicou (každé tri hodiny). Pri intraperitoneálnom použití bolo zvieratám podaných 751ambda intraperitoneálnou injekciou dvakrát denne. Kontrolným zvieratám bol aplikovaný zodpovedajúci objem pufra (20mM NaPO₄, pH 7,4) bez rPH.2 a boli sledované súčasne s každou experimentálnou skupinou. Mortalita a príznaky NEC v každej skupine ošetrenia a rozdiely boli analyzované pomocou Flscherovho exaktného testu. Za významné boli považované hodnoty pri p <0,05. Výsledky sú uvedené v tabuľke 9.

Tabuľka 9

	NEC	mŕtve
kontrola (i.p. podanie)	7/10	8/10
rPH.2 (240 U i.p., dvakrát denne)	6/11	8/11
kontrola (enterálne podanie)	19/26	21/26
rPH.2 (80 U enterálne, po 3h)	6/26	7/26
kontrola (i. p. + enterálne podanie:)	10/17	12/17
rPH.2 (240 U i.p. dvakrát denne a 80 U enterálne po 3h)	3/14	7/14

Údaje reprezentujú súhrnné výsledky štyroch nezávislých experimentov pri i.p, aplikácii, štyroch experimentov pri enterálnom podaní a troch experimentov pri i.p. + enterálnom podaní.

Enterálna aplikácia rPH.2 v porovnaní s kontrolou významne znižovala tak výskyt NEC, ako aj úhyn zvierat. Výsledky štyroch rôznych experimentov ukázali, že predchádzajúce ošetrenie zvierat rPH.2 znížilo NEC z 19/26 (kontrola) na 6/26 (p<0,001).

Intestinálne poškodenie ošetrených a kontrolných zvierat bolo rôzne, ale vo väčšine prípadov šlo o midvillous nekrózy v prípade niekoľkých segmentov, úplné nekrózy vilusu v iných častiach, prípadne tie isté miesta s transmutálnymi nekrózami, zvyšné časti mali normálny histologický nález. Najťažší stupeň NEC v prípade ošetrených aj kontrolných zvierat s intestlnálnym poškodením bol podobný (stredná hodnota 2,8 v prípade kontrol a 2,4 v prípade dopredu ošetrených rPH.2. p>0,05).

Intraperitoneálne podanie rPH.2 nemalo, v tomto modelovom systéme, na tvorbu NEC a úhyn zvierat významný vplyv. Nástup symptómov v tejto skupine a kontroly bol podobný (40 ± 5 hodín v prípade kontroly, 36 ± 7 hodín v skupine potkanov ošetrených rPH.2) a stupeň NEC bol v obidvoch skupinách tiež podobný (stredná hodnota 2,6 v prípade kontroly a 2,5 v skupine potkanov ošetrených rPH.2).

Boli uskutočnené ďalšie experimenty, pri ktorých bol potkanom podaný rPH.2 tak enterálne, ako aj intraperitoneálne a to v rovnakých dávkach ako pri aplikácii jedným z týchto spôsobov (25 lambda rPH.2 pri každom kŕmení po troch hodinách a 751ambda intraperitoneálnou injekciou dvakrát denne). Výsledky ukazuje tabuľka 9. Napriek tomu, že nebol medzi ošetrenou a kontrolnou skupinou zistený významný rozdiel v počte uhynutých zvierat, ošetrenie rPH.2 významne znižovalo výskyt NEC (10/17 v prípade kontroly a 3/14 v prípade potkanov ošetrených rPH.2, p = 0,04). V prípade šiestich zo siedmich uhynutých zvierat zo skupiny ošetrenej rPH.2 bol zistený pozitívny nález E. coli v krvi tesne pred smrťou.

Tieto výsledky potvrdzujú úlohu PAF-AH produktov v neonatálnom modeli NEC, ktorý nie je indukovaný PAF. Enterálne ošetrenie rPAF-AH produktom bránilo vzniku NEC, zatiaľ čo intraperitoneálne ošetrenie v týchto dávkach nemalo žiadny zrejmý účinok. Tieto výsledky svedčia o tom, že PAF-AH produkt doplnený do zmesi pre umelú výživu novorodencov ohrozených vznikom NEC by mohol znížiť výskyt tejto choroby.

Príklad 18

Účinnosť PAF-AH produktu pri syndróme akútnej respiračnej nedostatočnosti (ARDS - acute respiratoty distress syndróme) bola sledovaná u morčiat.

Intravenózne injikovaný PAF vyvolal u morčiat ťažký zápal pľúc pripomínajúci začiatočný ARDS u ľudí. Počas niekoľkých minút po intravenóznej aplikácii PAF bol parenchým pľúc zaplnený zúženými bronchami a bronchiolami (Lellouch-Tubiana et al., pozri skôr). Krvné doštičky a polymorfonukleárne neutrofily začali marginalizovať a bunkové agregáty boli ľahko detegovateľné pozdĺž pľúcnych arteriol [Lellouch-Tubiana Br.

SK 286518 Β6

J. Exp Path., 66: 345 - 355 (1985)]. Infúzie PAF tiež poškodzovali bronchiálne epitelové bunky, ktoré sa odlučovali zo stien a akumulovali v dýchacích cestách. Takéto poškodenie epitelových buniek v dýchacích dráhach je v zhode s tvorbou hyalinových membrán, ku ktorému dochádza u ľudí počas ARDS. Marginalizácia neutrofilov a doštičiek je rýchlo nasledovaná diapedézou týchto buniek do alveolárnych sept a alveolárnych priestorov pľúc. Bunkové infiltráty vyvolané PAF sú sprevádzané významným vaskulámym presakovaním a vznikom edému v dýchacích cestách [Kirsch, Exp. Lung Res., 18: 447 - 459 (1992)]. Vznik edému bol tiež potvrdený pri in vitro štúdiách, keď PAF indukoval extravazáciu fibrinogénu značeného 1251 v závislosti od podanej dávky (10 - 1000 ng/ml) v prípade premytých pľúc morčiat [Basran. Br. J. Pharmacol., 77: 437 (1982)].

Na základe uvedených pozorovaní bol vytvorený ARDS model u morčiat. Kanyla je pod anestéziou umiestená do krčnej žily morčiat Hartly samčieho pohlavia (približne 300 - 400 g) a PAF zriedený v transportnej látke, ktorou bolo 500 pg PBS s 0,25 % hovädzieho sérumalbumínu (PBS-BSA), aplikovaný infúziou počas 15 minút v celkovej dávke 100 - 400 ng/kg. V rôznych intervaloch po infúzii PAF boli zvieratá usmrtené a bolo im odohrané pľúcne tkanivo. V prípade morčiat, ktorým bo infúziou podaný PAF, bolo už počas 15 minút jasne zrejmé časovo závislé poškodenie pľúc a zápal, ktorý trval až 60 minút. V alveolárnych priestoroch morčiat, ktorým bol podaný PAF, sú prítomné neutrofily a červené krvinky, zatiaľ čo v prípade kontrolných zvierat ich prítomnosť nebola zistená. Bolo tiež dokázané poškodenie epitelových buniek pripomínajúce tvorbu hyalinových membrán u ľudských pacientov s ARDS. Vo vzorkách bronchoalveolámej laváže (BAL) odohraných z morčiat, ktorým bol infúzne podaný PAF, bola zistená silná akumulácia proteínov v zapálených pľúcach a dokázané vaskuláme presakovanie.

V tomto modelovom systéme ARDS u morčiat bolo zistené, že rPH.2 úplne zabránil poškodeniu pľúc vyvolanému PAF. Skupiny morčiat boh dopredu ošetrené buď rPH.2 (2000 jednotiek v 500 μΐ) alebo len samotným PAF-AH pufrom (500 μΐ). Po 15 minútach bol morčatám podaný infúzne PAF (400 ng/kg v 500 μΐ) a aplikovaný počas 15 minút. Kontrolnej skupine morčiat bolo infúzne podaných 500 μΐ PBS-BSA. Po ukončení infúzie PAF boli zvieratá usmrtené a odohraná im BAL tekutina lavážou pľúc X s 10 ml fyziologického roztoku obsahujúceho 2 μ/ml heparínu, aby sa predišlo zrážaniu. S cieľom stanovenia obsahu proteínov v BAL boli vzorky zriedené 1:10 fyziologických roztokom a bola stanovená OD 280. V BAL tekutine morčiat, ktorým bol aplikovaný samotný pufer, bola zistená koncentrácia proteínov 2,10 ± 1,3 mg/ml. Oproti tomu BAL tekutina zo zvierat, ktorým bol infúzne podaný PAF, obsahovala 12,55 ± 1,65 mg/ml proteínov. V prípade morčiat dopredu ošetrených rPH.2 bol v BAL tekutine zistený obsah proteínov 1,13 ± 0,25 mg/ml, čo je porovnateľné s kontrolou a dokazuje to, že PAF-AH produkt úplne bráni vzniku pľúcneho edému indukovaného PAF.

Príklad 19

Účinnosť produktu PAF-AH, rPH.2, bola hodnotená pre dva modelové systémy akútnej pankreatitídy.

A. Aktivita v prípade modelu pankreatitídy u potkanov

Samce potkana Wistar (200 - 250 g) boli zakúpené od Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Potkany boli chované v miestnosti s riadenou klímou 23 ± 2 °C, 12 hodinovým cyklom svetlo/tma a kŕmené štandardným laboratórnym krmivom a vodou ad libitum. Zvieratá boli náhodne rozdelené do kontrolnej a experimentálnej skupiny. Potkany boli anestetizované 50 mg/kg pentobarbitalom sodným aplikovaným intraperltoneálne a potom im bol zavedený polyvinylový katéter (veľkosť V3, Biolab products, Lake Havasu, AZ) do krčnej žily. Katéter bol tiahnutý subkutánne a ústil v dorzálnej cervikálnej oblasti. Zvieratá boli ponechané, aby sa prebrali s anestézie. Potkany mali voľný prístup k vode, ale boli cez noc ponechané bez potravy. Experimenty boli uskutočnené nasledujúci deň na zvieratách, ktoré boli už pri vedomí. Do začatia experimentu bol katéter plnený konštantnou infúziou fyziologického roztoku (0,2 ml/h). Ten deň, keď sa uskutočnil experiment, bol zvieratám intravenózne injikovaný rPH.2 alebo samotná prenosná kontrolná látka a následne podaná infúzia buď (1) 5 pg/kg caeruleínu po hodine počas 3,5 hodiny, alebo (2) 10 pg/kg caeruleínu po hodine počas 5 hodín, (Research Plus, Bayonne, NJ). Hneď po ukončení infúzie boli zvieratá anestetizované pentobarbitalom sodný, boli im otvorené brušné dutiny a bolo im odsatých 5 ml krvi z vnútornej veny cavy pre ďalšie stanovenie. Zvieratá boli potom usmrtené vykrvácaním. Boli merané sérum amyláza sérum lipáza a sérum bilirubín a odobraný pankreas. Časti pankreasu boli buď fixované v 4 % roztoku fosfátového formaldehydového purfa pre histologické aktivity alebo ihneď zmrazené na -80 °C pre merania myeloperoxidázovej aktivity. Ďalšie časti pankreasu boli použité na stanovenie obsahu vody v pankrease, pankreasovej amylázy a trypsínu, ako je opísané. Myeloperoxidasová aktivita, ktorá ukazuje mieru zafarbenia neutrofilov bola stanovená v pankrease a pľúcach, ako je ďalej opísané. Dáta boli štatisticky hodnotené pomocou nepárového Študentovho t-testu. Uvedené hodnoty predstavujú priemer + S.E.M. prinajmenšom troch rôznych experimentov. Za významné sú považované výsledky pri p < 0,05.

1. Obsah vody v pankrease

Segmenty pankreasu boli osušené a zvážené (čerstvá váha) a potom sušené 34 hodín pri 120 °C a opäť zvážené (suchá váha).

Voda pankreasu bola vypočítaná ako rozdiel medzi čerstvou a suchou váhou a vyjadrená ako percento čerstvej váhy. Zvýšený obsah vody v pankrease indikoval vznik edému.

2. Sérum a pankreatická amyláza

Aktivita amylázy v sére bola meraná pomocou substrátu 4,6-ethylin (G7)-p-nitrofenyl (Gl)-alD-maltoplastid (ET-G7PNP) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) podľa Pierre et al., Clin. Chem., 22:1219 (1976). Aktivita amylázy v tkanivách pankreasu bola meraná rovnakou metódou po homogenizácií tkanív v 10 mM fosfátového pufru, pH 7.4.

3. Pankreatický trypsín

Aktivita trypsínu bola meraná fluorimetricky pomocou substrátu Boc-Gin-Ala-Arg-MCA. V kyvete bolo zmiešané 200 μΐ vzorku a 2,7 ml 50mM Tris pufru (pH 8,0) obsahujúceho 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂ a 0,1 % hovädzie sérum albumín. K vzorke bolo pridané 100 μΐ substrátu a po 20 sekundách preinkubácie bola začatá reakcia. Fluorescencia bola meraná pri excitácii 380 nm a emisii 440 nm a vyjadrená smernicou priamky. Aby bolo možné vyhodnotiť spoločne rôzne experimenty, bola aktivita trypsínu vo frakciách vyjadrená ako percento celkovej aktivity trypsínu.

4. Histológa a morfometria

Pre svetelnú mikroskopiu boli náhodne vybrané rezy z prednej, strednej a zadnej časti pankreasu a fixované v 10 % neutrálnom fosfátovom formalínovom pufri. V parafíne prichytené segmenty s veľkosťou 5 pm boli ofarbené hematoxylínom-eozínom (H & E) a hodnotené skúšaným morfológom. Poškodenie alebo nekrózy acinámych buniek boli stanovené buď ako (a) prítomnosť neostrosti v prípade acinámych buniek alebo (b) vakuolizácia a opuch acinámych buniek a deštrukcia histo-architektúry celého acínu alebo len časti, obidva javy museli súvisieť so zápalovou reakciou. Množstvo poranených alebo nekrotických buniek a celková plocha tvorená acinámymi bunkami bolo kvantifikované morfometricky pomocou videa a počítačovej planimetrickej analýzy obrazu (model CCD-72. Dage-MTl, Michigan city, IN) vybaveným softvérom na analýzu obrazu NIH-1200. Pre každú vzorku bolo hodnotených desať náhodne zvolených polí mikroskopu. Rozsah poškodených alebo nekrotických buniek bol stanovený ako percento celkovej plochy acinámych buniek s oblasťami spĺňajúcimi kritériá pre poškodenie alebo nekrózu.

5. Meranie myeloperoxidázovej aktivity (MPO) v pankrease a pľúcach

Zafarbenie neutrofílov v pankrease a pľúcach bolo stanovené na základe myeloperoxidázovej aktivity v tkanivách. Vzorky boli odohrané v dobe usmrtenia uložené pri -70 °C až do doby analýzy. Vzorky (50 mg) boli rozmrazené a homogenizované v 1 ml 20mM fosfátového pufra (pH 7,4) a centrifugované (10.000 x g, 10 min., 4 °C). Získaná peleta bola resuspendovaná v 50mM fosfátovom pufri (pH 6,0) obsahujúcom 0,5 % hexadecyltrimetylamóniumbromid (Sigma, St. Louis, MO) a štyrikrát za sebou zmrazená a rozmrazená. Suspenzie boli potom rozrušené sonikáciou počas 40 sekúnd a centrifugované (10.000 x g, 5 min., 4 °C). Reakčná zmes obsahujúca extrahovaný enzým, l,6mM tetrametylbenzidin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 80mM fosfátový pufer (pH 5,4) a 0,3mM peroxid vodíka, bola inkubovaná pri 37 °C 110 sekúnd a meraná absorbancia pri 655 nm automatickým analyzátorom CobasBio. Táto absorbancia potom bola prepočítaná podľa obsahu sušiny vo vzorke tkaniva.

6. Meranie pulmonálnej vaskulámej permeability

Upchanie spoločného biliopankreatického kanála má obvykle za následok ťažkú pankreatitídu súvisiacu s poškodením pľúc, ktoré je možné kvantifíkovať podľa vaskulámej permeability pľúc a histologickým hodnotením.

Zvieratám bolo dve hodiny pred usmrtením intravenózne aplikovaných 5 mg/kg fluoresceín izotiokyanát albumínu (FITC-albumín, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Pulmonálna mikrovaskuláma permeabilita bola hodnotená na základe presakovania FITC-albumínu z vaskulámych kompartmentov do bronchoalveolámych priestorov. Stručný opis metódy: hneď po usmrtení bol pravý bronchus blokovaný svorkou a trachea otvorená. Potom boli pravé pľúca vybrané pomocou kanyly vložené do trachey. Tri laváže fyziologickým roztokom (60 ml na laváž) boli spojené a bola merané fluorescencia FITC v sére a laváži pri excitácii 494 nm a emisii 520 nm. Vypočítaný pomer fluorescencie laváže ku krvi potom vyjadroval mieru mikrovaskulámej permeability pľúc. Pľúca boli tiež ofarbené pomocou H & E a histologický hodnotené.

SK 286518 Β6

7. Účinok podania Caeruleínu a rPH.2

Infúzia samotného caeruleínu 5 pg/kg-'h počas 3,5 hodiny vyvolala u potkanov typickú miernu indukovanú pankreatitidu, charakterizovanú hyperamyláziou, pankreatickým edémom meraným podľa obsahu vody v pankrease a histologickými zmenami zahrnujúcimi výraznú vakuolizáciou a pankreatický edém. Infúzia fyziologického roztoku nevyvolávala u kontrolných zvierat žiadne z týchto biochemických ani histologických zmien. Intravenózne podanie: rPH.2 v dávkach 5, 10 alebo 20 mg/kg 30 min. pred začatím infúzie caeruleínu neovplyvnila významne závažnosť zmien pankreatického edému (obsah vody) a histologický nález indukovaný infúziou samotného caeruleínu. Podanie rPH.2 neovplyvnilo tiež caeruleínom indukovanú aktiváciu pankreatického trypsinogénu alebo obsah amylázy.

Infúzia vyšších dávok caeruleínu, 10 pg/kg/h počas 5 hodín, vyvolala u potkanov ťažšiu pankreatitidu a charakteristickým výrazným zvýšením amylázovej aktivity v sére, vznikom pankreatického edému, silným zvýšením pankreatickej aktivity MPO a významným zvýšením aktivácie trypsinogénu a amylázovej aktivity pankreasu. Histológia pankreasu odhalila nielen edém pankreasu a vakuolizáciu alcinámych buniek, ale tiež niekoľko nekrotických škvŕn a niekoľko infiltrovaných buniek.

Podanie rPH.2 (5 alebo 10 mg/kg intravenózne) 30 min. pred začiatkom infúzie caeruleínu (10 pg/kg/h) zlepšilo väčšinu pankreatických zmien, ktoré vyvolala samotná infúzia caeruleínu. Výsledky prezentuje tabuľka 10, pozri ďalej. Ošetrenie rPH.2 v dávke 5 mg/kg malo za následok pokles aktivity sérumamylázy (z 1098 ± 1412 na 6763 ± 1256). Vyššie dávky 10 mg/kg rPH.2 už nevyvolali zlepšenie hyperamylázie. Ošetrenie rPH.2 v dávke 5 alebo 10 mg/kg malo tiež za následok zníženie výskytu pankreatického edému indukovaného caeruleínom meraného podľa obsahu vody (90,61 ± 0,27 pri samotnom caeruleínu a 88,21 ± 0,61 pre caeruleín s 5 mg/kg rPH.2). rPH.2 v dávke 5 mg/kg vyvolal silné zlepšenie pankreatickej aktivity NPO (2,92 + 0,32-krát pri samotnom caeruleíne a 1,19 + 0,21 pri caeruleínu spolu s rPH.2, p < 0,05). Vyššie dávky rPH.2 nevyvolávali už ďalšie zlepšenie MPO aktivity. Dávka rPH.2 tiež nemenila výhnamne rozsah aktivácie trypsinogénu alebo obsah amylázy v pankrease. Po predbežnom ošetrení rPH.2 bolo pri histologickej analýze zistené zlepšenie v prípade mikroskopických nekróz pankreasu a infiltrácie.

Poškodenie pľúc súvisiace s pankreatitídou bolo pozorované tak klinicky, ako aj v prípade niekoľkých modelov pankraetitídy. Infúzia caeruleínu v dávke 5 pg/kg/h počas 3,5 h, ktorá vyvoláva miernu formu pankreatitidy, nemala za následok významné zasiahnutie pľúc. Avšak infúzia caeruleínu v dávke 10 pg/kg/h počas 5 h, ktorá vyvolávala ťažšiu pankreatitidu, spôsobila poškodenie pľúc kvantifikovateľné zvýšenou vaskulámou permeabilitou pľúc (0,31 ± 0,04 až 0,79 ± 0,09), aktivitou MPO v pľúcach (zodpovedajúcou zafarbeniu neutrofilov) a infiltráciou neutreifilov.

Podanie rPH.2 v dávke 5 mg/kg 30 min. pred infúziou caeruleínu významne zlepšovala rast MPO aktivity v pľúcach, indukovaný infúziou samotného caeruleínu (3,55 ± 0,93 v prípade samotného caeruleínu a 1,51 ± ± 0,26 v prípade caeruleínu s rPH.2). Ošetrenie rPH.2 významne znížilo závažnosť mikroskopických zmien pozorovaných v pľúcnom tkanive po infúzii caeruleínu. Zvýšená vaskuláma permeabilita vyvolaná infúziou caeruleínu bola podaním rPH.2 znížená, ale rozdiel nebol štatisticky významný. Vyššia dávka rPH.2 (10 mg/kg) neznižovala viac poškodenie pľúc vyvolaná caeruleínom než nižšie dávky.

Tabuľka 10

	Kontrola (žiadny CER)	Caeruleín (CER) 10 ug/kg/h	CER + 5 mg/kg rPH.2	CER± 10 mg/kg rPH.2
sérum amyláza (U/I)	961±174	10984±1412	6763± 1256	8576±1024
obsah vody v pankrease (% vlhkej váhy)	72,71 ±0,64	90,61 ±0,27	88,21 ±0,61	89,00 ± 0,94
pankreatický MPO (násobky kontroly)	1,0	2.92 = 0,32	1,19 ± 0,21	1,42 ± 0,19
aktivita pankreatického trypsínu (lOOOxsklon/pg DNA)	0,12 ±0,06	9,70 = 2,50	8,33 ± 1,75	9,15 ± 1,28
obsah pankreatickej amylázy (tl/ug DNA)	0,28 ± 0,06	0,42 ± 0,07	0,45 + 0,04	0,46 ± 0,044
vaskuláma permeabilita pľúc (laváž/ sérum %)	0,31 ±0,04	0,79 = 0,09	0,70 ± 0,09	0,70 ±0,07
MPO pľúc (násobky kontroly)	1,0	3,55 ±0,93	1,51 ±0,26	1,64 ± 0,22

B. Aktivita v prípade modelu pankreatitídy u vačice

Zdravé, náhodne odchytené americké vačice (Didelphis virginiana) obidvoch pohlaví (2,0 kg až 4,0 kg) boli získané zo Scott-Haas a chované v miestnostiach s riadenou atmosférou 23 ± 2 °C, 12 hodinovým cyklom svetlo/'tma a kŕmené štandardným laboratórnym krmivom a vodou ad libitum. Po nočnom pôste boli zvieratá anestetizované 50 mg/kg fenobarbitalu sodného i.p. (Veterlnary Laboratories Inc., Lenexa, KS). Celiotómia bola uskutočňovaná prostredníctvom stredovej incízie pri sterilných podmienkach a kanál spoločný pre žlč a pankreas bol podviazaný s cieľom vyvolania nekrotickej pankreatitídy. Navyše bol cystický kanál podviazaný tak, aby žlčník nemohol fungovať ako zásobáreň žlče. Zvieratá boli náhodne rozdelené do kon38

SK 286518 Β6 trolných a experimentálnych skupín. Začínajúc druhým dňom po podviazaní pankreatického kanálu, bolo experimentálnej skupine podané rPH.2 v dávke 5 mg/kg telesnej hmotnosti a deň (aplikované 4 mg.'ml roztoku) intravenózne do chvostovej žily, zatiaľ čo kontrolnej skupine bolo intravenózne podané placebo v rovnakom objeme. Po 1 a 2 dňoch ošetrenia (3. a 4. deň po ligácii pankreatického kanálu) boli zvieratá usmrtené predávkovaním fenobarbitalu sodného. Boli odohrané vzorky krvi zo srdca na stanovenie obsahu sérum amylázy, sérum lipázy a sérum bilirubinu a bol odohraný pankreas. Časti pankreasu boli jednak fixované v 4 % fosfátovom formaldehydovom pufri na histologické pozorovania alebo okamžite zmrazené na -80 °C na stanovenie myeloperoxidázovei aktivity. Ďalšie časti pankreasu slúžili na stanovenie obsahu vody a obsahu pankreatickej amylázy tak, ako to bolo opísané v sekcii A tohoto príkladu. Myeloperoxidázová aktivita, mierka zafarbenia neutrofilov, bola stanovená v pankrease tak, ako to je opísané. Pulmonálna vaskuláma permeabilita bola tiež stanovená uvedenou metódou.

Uvedené výsledky predstavujú priemer ± stredná chyba priemeru (SEM) získaný z troch a viacerých experimentov. Významnosť zmien bola hodnotená Študentovým t-testom, pokiaľ išlo o dáta usporiadané v dvoch skupinách a analýzou variancie (ANOVA), ak boli porovnávané tri skupiny a viac. Ak ANOVA indikovala významný rozdiel, boli dáta analyzované metódou Turkey ako post hoc test rozdielov medzi skupinami. Rozdiel bol považovaný za významný, ak hodnota p<0,05.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 11. Upchanie spoločného biliopankreatického kanálika malo za následok tažkú nekrotickú pankreatitidu, charakterizovanú hyperamyláziou, hyperlipázémiami a rozsiahlymi nekrozami pankreasu. Navyše malo upchanie spoločného blolopankratického kanálika za následok silné zvýšenie hodnôt bilirubinu v sére. Intravenózne podanie rPH.2 (5 mg/kg/deň) začínajúc druhým dňom po ligácii pankreatického kanálika, zlepšilo väčšinu pankreatických zmien indukovaných upchaním kanálika a v porovnaní so zvieratami, ktorým bolo podané placebo. Jednodenné ošetrenie rPH.2 znížilo hladinu sérumamylázy v porovnaní s kontrolnými zvieratami, napriek tomu, že rozdiel nebol štatisticky významný a dvojdenná aplikácia rPH.2 (4. deň po ligácii pankreatického kanálika) významne znížil hladiny amylázy v porovnaní s placeboskupinou. Jednodenné a dvojdenné ošetrenie rPH.2 znížilo hladinu sérumlipázy na úroveň kontroly, ale rozdiel nebol štatisticky významný. Dvojdenná aplikácia rPH.2 znížila obsah pankreatickej amylázy na úroveň kontrol, ale pri jednodennej aplikácii došlo k zvýšeniu pankreatickej amylázy. Ošetrenie rPH.2 neovplyvnilo hladinu bilirubinu v sére, pankreatickú myeloperoxidázovú aktivitu ani obsah vody v pankrease.

K hlavným charakteristickým zmenám indukovaným obštrukciou biliopankreatického kanálika patrili nekrózy, infiltrácia zapálených buniek, vakuolizácia acinámych buniek a výrazná roztiahnutie acinámych luménov. Morfometrické sledovanie poškodených acinámych buniek pankreasu ukázalo silný ochranný účinok rPH.2 pri ošetrení deň alebo dva dopredu. Pri ošetrení rPH.2 deň dopredu bolo poškodenie acinámych buniek znížené na 23 % celkového acinámeho tkaniva, v porovnaní so 48 % poškodeného tkaniva zvierat, ktorým bolo podané placebo. Tento pokles poranených buniek bol ešte viac zrejmý po dvojdennej aplikácii rPH.2, keď došlo k zníženiu poškodených buniek na 35 % v porovnaní so 60 % u zvierat, ktorým bolo podané placebo.

Vaskuláma permeabilita pľúc, kvantifikovaná injekciou FITC, v skupine, ktorej bol aplikovaný rPH.2, sa výrazne odlišovala od placebo skupiny pri jednodennej a dvojdennej aplikácii. Histologické pozorovania ukázali ťažké poškodenie pľúc vo všetkých skupinách ošetrených placebom. Poškodenie pľúc bolo charakterizované rozsiahlou zápalovou reakciou s intersticiálnou a intraalveolámou infiltráciou predovšetkým makrofágmi, lymfocytmi a neutrofilmi a nepravidelným ale výrazným intersticiálnym edémom a zosilnením alveolárnych membrán. Podanie rPH.2 výrazne znížilo infiltráciu zapálených buniek a zmenšilo intersticiálny edém pri obidvoch dĺžkach aplikácie.

Súhrn týchto výsledkov jasne ukazuje, že intravenózne podanie rPH.2 v dávke 5 mg/kg/deň začínajúc 48 hodín po ligácii pankreatického kanálika malo za následok významné zníženie zvýšených hladín amylázy a lipázy a poškodenie acinámych buniek kvantifikované morfometrickou analýzou sekcií ofarbených H & E n a došlo k významnému poklesu závažnosti pankreatitídou indukovanému poškodeniu pľúc. Na tomto, z klinického hľadiska vhodnom modeli pankreatitídy, ukázal rPAF-AH produkt prínosný vplyv na zníženie závažnosti pankreatitídy.

Tabuľka 11

	Po jednom ošetrení (usmrtenie 3. deň)	Po dvojdennom ošetrení (usmrtenie 4. deň)
	placebo	rPH.2 5 mg/kg	placebo	rPH.2 5 mg/kg
sérum bilirubín (mg/dl)	5,49 ± 0,96	7,10 ±0,60	6,54 ± 0,55	4,91 ± 0,79
sérum amyláza (U/l)	5618 ±899	4288 ± 675	6538±1355	3106 ±467*
sérum lipáza (U/l)	2226 ±554	1241 ±263	1424 ± 257	1023 ± 295
obsah vody v pankrease (%)	81,10 ± 0,56	i 81,52 ±0,79	80,05 ± 1,07	79,32 ± 0,49
pankreatický MPO	1345 ±286	1142 ±83	1149 ±232	1033±130

SK 286518 Β6

	Po jednom ošetrení (usmrtenie 3. deň)	Po dvojdennom ošetrení (usmrtenie 4. deň)
	placebo	rPH.2 5 mg/kg	placebo	rPH.2 5 mg/kg
(OD/frakcia sušina)
panreaktická amyláza (U/pg DNA)	706 ± 92	1101± 105	950 ± 85	712 ±131
vaskuláma permeabilita pľúc (FITC laváž/sérum %)	0,76 ± 0,09	0,21 ±0,04**	0,57 ±0,13	0,23 ± 0,04*
poškodené acináme bunky (% z celkového acinámeho tkaniva)	48	23	60	35

* p - 0,02 versus placebo ** p < 0,001 versus placebo

Príklad 20

Bola uskutočnená štúdia hodnotiaca účinok PAF-AH produktu, rPH.2, na neurotoxicitu spojenú s infekciou HIV. Infekcia centrálneho nervového systému HIV-1 (human immunodeficienecy irus, typ 1) spôsobuje neuronálne straty apoptózou. Ak sú monocyty infikované HIV-1 aktivované rôznymi antigénnymi stimulmi vrátane kontaktu s nervovými bunkami, vylučujú vysoké hladiny neurotoxických cytokínov vrátane PAF, vyvolávajúcich zápal.

Bol študovaný vplyv rPH.2 na neurotoxicitu upraveného média z memocytov infikovaných HIV.

Monocyty boli infikované HIV a aktivované tak, ako je to opísané ďalej. Monocyty boli získané z periférnych buniek kostnej drene (peripheral bone marrow cells - PBMC) HIV a hepatitis B seronegatívnych darcov po leukoforéze a purifikované (>98 %) centrifugačným vyčistením (Countercurrent centrifugal eluriation) tak, ako to opísali Genis et al., J. Exp. Med., 176: 1703 - 1718 (1992). Bunky boli kultivované (1 x 10⁴ buniek/ml v kultivačných fľašiach T-75) v DMEM/Sigma. St. Louis, MO) s ľudským rekombinantným faktorom stimulujúcim kolónie makrofágov (MSCF - rekombinant human macropbage colony stimulátory factor) (Genetic Inštitúte, Inc. Cambridge, MA). Pri týchto podmienkach sa monocyty diferencovali na makrofágy. Po 7 -10 dňoch kultivácie boli makrofágy vystavené HIV-1ADA (pod číslom M60472) v prebytku infekčného agens (multipliezity of infection - MOI) 0,01 infekčných viriónov/cieľovú bunku. Pri týchto podmienkach bolo 20 - 50 % monocytov infikovaných 7 dní po inokulácii HIV-1, čo bolo potvrdené imunofluorescenčnými metódami a hybridizáciou in situ [Kalter et al., J. Immunol., 146, 298 - 306 (1991)]. Kultúram bolo doplňované čerstvé živné médium každý 2 až 3 deň. Päť až sedem dní po infekcii HIV, v čase kulminácie aktivity reverznej transkriptázy (10⁷ cpm/ml) stanovenej podľa Kalter et al., pozri skôr, boli kultúry monocytov, a to tak infikovaných HIV-1, ako aj paralelné kultúry neinfikovaných monocytov, stimulované LPS (10 ng/ml) alebo samotnou prenosovou látkou počas 30 min., pri 37 °C a potom rýchlo zmrazené na -80 °C a uchované až do doby testovania neurotoxicity.

Kultúry ľudských cerebrálnych kortikálnych neurónových buniek boli odvodené podľa nasledujúceho postupu. Ľudské fetálne mozgové tkanivo bolo získané z telencefalónu v druhom trimestri (13 - 16 týždňov tehotenstva) modifikovaným postupom podľa Bankera a Cowana, Brain Res., 136: 397 - 425 (1977). Stručný opis metódy: mozgové tkanivo bolo odobrané, obmyté 30 ml chladného Hankovho média BSS (obsahujúceho Ca²⁺ a Mg²⁺ + 25mM HEPES a 5X gentamicínu), separované od adherent meninges a krvi a narezané na kúsky s veľkosťou 2 mm’. Tkanivo bolo pretlačené cez 230μΜ vrecko Nitex a 10 - 15-krát jemne pretiahnuté cez Pasteurovu pipetu opálenú nad plameňom. Ďalej bolo tkanivo centrifugované pri 550 rpm, 5 min., 4 °C a peleta bola resuspendovaná v 5 - 10 ml MEM-hipp (D-glukóza, 5 g/1; L-glutamín, 2mM; HEPES, lOmM; AN pyruvát, lmM; KC1, 20mM) s obsahom Nl komponent (inzulín, 5 mg/ml; transferín, 5 mg/ml; selenit, 5 pg/l, progesterón, 20nM; putrescln, 100μΜ), rovnako ako 10 % fetálne sérum (FCS), PSN zmes antibiotík (penicilín, 50 mg/1; streptomycín 50 mg/1; neomycín 100 mg/1) a fungizon (2,5 g/1). Počet buniek a ich životnosť boli určené pomocou nariedenia Hanksovým BSS obsahujúcim 0,4 % tryptofánovú modrú (1 : 1 v/v) a bunky boli počítané pomocou hemocytometra. Bunky boli päťkrát premyté 10 ml pipetou a vysiate v riedení zodpovedajúcom hustote 105 buniek/12 mm krycie sklíčko, ktorá bola dopredu potiahnutá poly-L-lyzínom (70K-150K MW, Sigma, St. louis, MO) a po nanesení buniek umiestená do 24-jamkových kultivačných dosiek. Do každej kultivačnej jamky bol potom pridaný 1 ml média. Bunky sa inkubovali a kultivovali počas 10 až 28 dní pri 370 °C v inkubátore s vlhkou atmosférou zloženou z 5 % CO₂/95 % vzduchu. Médium sa menilo každé tri dni. Pri týchto podmienkach boli kultúry > z 60 - 70 % homogénne pre neuróny, ďalej kultúra obsahovala 20 - 30 % hviezdicových buniek, < 1 % mikroglií a približne 10 % makrofágov a farbitelných mikroglií. Po 14 až 28 dňoch kultivácie kultúra neurónov exprimovala dostatočné množstvo N-metyl-D-aspartátu (NMDA) alebo non-NMDA receptory boli usmrtené po podaní excitotoxických dávok NMDA alebo alfaamino-3-hydroxy-5-metyl-4-izoxazol propiónovej kyseliny (AMPA).

Test na neurotoxicitu bol uskutočňovaný nasledujúcim spôsobom. Testované vzorky, medzi ktoré patrili (a) kondiciované médiá z LPS-stimulovaných H1V-1 infikovaných monocytov, (b) kontrolné médiá, (c) kondiciované médium s pridaným rPH.2 v koncentrácii 51 pg/ml alebo (d) kondiciované médium s pridaným nosičom pre rPH.2, boli aplikované na bunky kultúry neurónov v koncentrácii 1 : 10 v/v na dobu 24 hodín. Neurotoxicita sa merala pomocou identifikácie apoptických jadier in situ na neurónoch rastúcich na krycích sklíčkach, ktoré boli fixované 4 % formaldehydom. Na tento test bol používaný komerčný kit (Apop Tag; ONCOR, Gaithersburg, MO), ktorý používal terminálnu deoxynukleotidyltransferázu (TdT) pre väzbu digoxigenin-dUPT k 3'-OH konci novoštiepenej DNA (TUNEL farbenia). Digitálne spracovanie obrazov neurónov farbených TUNEL technikou vo viac ako 15 náhodne vybraných mikroskopických poliach sa analyzovala na počet technikou TUNEL farbených j adier/celkovému počtu neurónov zistených na 50 mikroskopických poliach pomocou počítačovej morfometrie (MCID, Imaging Research, St. Catherine, Ontario, Kanada).

Dáta boli vyjadrené v % jadier neurónov pozitívnych vo farbení TUNEL + SEM a sú ukázané na obrázku 13. Testy štatistickej dôkaznosti medzi kontrolou a experimentálnym liečením boli uskutočnené metódou ANOVA alebo párovými t-testmi, s dôkaznosťou p<0,05. Kvantifikácia týchto kultúr potvrdila, že kondiciované médium z HlV-infikovaných a aktivovaných monocytov indukovala smrť buniek neurónov v rozsahu 25 % z celkovej populácie cerebrálnych kôrových neurónnov. rPH.2 bol schopný redukovať túto toxicitu na menej ako 5 % z celkového počtu neurónov. rPH.2 sám osebe nebol neurotoxický, pretože v koncentrácii 50 pg/ml rPH.2 nemal v porovnaní s kultúrou ošetrenou pomocou kontrolného média žiadny vplyv na smrť neurónových buniek. Tieto výsledky jasne dokázali, že hlavnou zložkou vyvolávajúcou neurotoxicitu pri aplikácii kondiciovaného média z buniek HIV-1 infikovaných aktivovaných monocytov, musí byť PAF, pretože neurotoxicita môže byť takmer úplne potlačená spoločnou inkubáciou s produktom PAF-AH, čo je enzým zodpovedný za metabolizmus PAF v centrálnom nervovom systéme. Tieto zistenia načítajú možné terapeutické použitie pri liečení neurologických chorôb CNS, ktoré sú spojené s infekciou HIV-1.

Príklad 21

Takmer 4 percentá japonskej populácie má nízku či až nedetegovateľnú hladinu aktivity PAF-AH v plazme. Táto deficiencia je v korelácii s ťažkými respiračnými symptómami u detí trpiacich astmou. Miwa a ďalší (J. Clin. Invest., 82: 1983 - 1991 (1988)), poukázali na to, že tieto stavy môžu byť spôsobené deficienciou dedenou autozomálnym recesívnym spôsobom.

Na určenie skutočnosti, či táto deficiencia pochádza z inaktívneho, ale prítomného enzýmu, či je spôsobená nemožnosťou syntézy PAF-AH, bola zhromažďovaná plazma od mnohých pacientov deficientných na aktivitu PAF-AH (pomocou metódy opísanej v príklade 10 pre transfektanty) a ďalej bola testovaná prítomnosť PAF-AH pomocou monoklonálnych protilátok 90G11D (Príklad 13) pomocou ELISA metódy opísanej ďalej: Mikrotitračné dosky Immunolon 4 s plochým dnom (Dynatech, Chantilly, VA) boli potiahnuté monoklonálnou protilátkou 90G1 ID v koncentrácii 100 ng/jamku a ponechané inkubovať sa do rána. Potom boli jamky blokované 1 hodinu pri izbovej teplote 0,5 % želatínou z rybacej kože (Sigma) nariedenej v CMF-PBS. Ďalej boli jamky štyrikrát premyté. Plazma získaná od pacientov bola nariedená v PBS obsahujúcom 15mM CHAPS a bola pridaná do každej jamky na doštičke (50 pVjamka). Doštičky sa inkubovali 1 hodinu pri izbovej teplote a potom boli štyri razy premyté. Nasledovalo pridanie 5 μΐ monoklonálnej protilátky 90F2D v koncentrácii 5 μg/ml, ktorá bola blotinylovaná štandardnou metódou a nariedená v PBST do každej jamky. Doska sa inkubovala 1 hodinu pri izbovej teplote a potom bola trikrát premytá. Nasledovalo pridanie 50 μΐ Extra Avidínu (Sigma) nariedeného 1 : 1000 v CMT-PBST do každej jamky a doska sa opäť nechala inkubovať 1 hodinu pri izbovej teplote. Potom nasledovalo vyvolanie aktivity.

Boli nájdené priame korelácie medzi PAF-AH aktivitou a koncentráciou enzýmu. Ak nebola v sére pacienta nameraná aktivita, bolo to vždy sprevádzané nemožnosťou delegovať prítomnosť enzýmu. Podobne, vzorky plazmy vykazujúce polovičnú hodnotu normálnej aktivity, obsahovali polovicu normálnej hladiny PAF-AH. Tieto zistenia potvrdzujú, že deficiencia aktivity PAF-AH je spôsobená nemožnosťou syntetizovať enzým alebo je spôsobená tým, že monoklonálne protilátky nerozpoznávajú inaktívnu formu enzýmu.

Boli navrhnuté ďalšie pokusy, ktoré mali umožniť rozhodnutie, či deficiencia je spôsobená genetickou poruchou v géne pre ľudský plazmatický PAF-AH. Bola izolovaná genómová DNA z PAF-AH deficientných jedincov a použitá ako templát pre PCR reakcie s primérmi špecifickými pre PAF-AH gén. Každá z kódujúcich sekvencii exónov bola najprv amplifikovaná a sekvencovaná z jedného jedinca. V exóne 9 bola zistená zámena jedného nukleotiu (a to G za T v pozícii 996 podľa Sekvencie id. č.: 7). Nukleotidová zámena vyústila do aminokyselinovej substitúcie fenylalanínu za valín v pozícii 279 sekvencie PAF-AH (V279F). Exón 9 bol amplifikovaný z genómovej DNA ešte ďalších 11 PAF-AH deficientných pacientov, u ktorých bola zistená rovnaká bodová mutácia.

Na určenie, či táto mutácia pozmení enzým, bol v E. coli exprimovaný konštrukt s touto mutáciou nevykazujúci žiadnu PAF-AH aktivitu, zatiaľ čo kontrolný konštrukt, ktorý neobsahoval mutáciu, bol plne aktívny. Zámena tejto aminokyseliny vedie pravdepodobne k štrukturálnej modifikácií, ktorá spôsobuje pozorova nú deficienciu aktivity a tiež neschopnosť imunoreaktivity s PAF-AH protilátkami generovanými podľa vynálezu.

PAF-AH špecifické protilátky podľa vynálezu tak môžu byť použité v diagnostických metódach na detekciu abnormálnych hladín PAF-AH v sére (normálne koncentrácie sú medzi 1 až 5 U/ml) a na sledovanie patologických podmienok spojených s PAF-AH. Čo viac, určenie genetického poškodenia v PAF-AH génu umožňuje genetický výskum zaoberajúci sa deficienciou PAF-AH u japonských pacientov. Mutácia spôsobuje zisk reštrikčného endonukleázového miesta (MAFII) a tak umožňuje aplikácie jednoduché metódy, analýzy Restrition Fragment Lenght Polymorphism (RFLP), ktorá je schopná rozlíšiť medzi normálnymi a mutantnými alelami. (informáciu o tejto aplikácii možno získať : Lewin, strana 136 až 141 v Genes V, Oxford University Press, New York (1994)).

Pomocou metódy štiepenia DNA enzýmomMae II, bol uskutočnený výskum genómovej DNA od 12 pacientov deficientných v PAF-AH, nasledoval Southem blot a hybridizácia so sondou komplementárnou s exónom 9 (nukleotidy 1 až 396, podľa Sekvencie id. č.: 17). O všetkých pacientov bolo zistené, že majú RFLP zhodné s mutantnými alelami.

Aj keď je vynález opísaný pomocou termínov špecifických pre danú realizáciu, samozrejme sa však rozumie, že sa môžu vyskytnúť rôzne varianty a modifikácie, ktoré sú jasné odborníkom v danom odbore. Preto teda, na vynález môžu byť pokladané len také obmedzenia, ktoré sa objavujú v pripojených patentových nárokoch.

Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:

(i) Žiadateľ: ICOS CORPORATION (ii) Názov vynálezu: Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase (iii) Počet sekvencií: 30 (iv) Korešpondenčná adresa:

(A) Adresa: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) Ulica: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) Mesto: Chicago (D) Štát: Illinois (E) Krajina: Onited States of America (F) PSČ (ZIP): 60606-6402 (v) Forma vhodná pre počítačové spracovanie:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) Súčasné údaje o žiadosti:

(A) Číslo žiadosti:

(B) Dátum registrácie:

(C) Klasifikácia, (viii) Informácie o právnom zástupcovi/agentovi:

(A) Meno: Rin-Laures, Li-Hsien (B) Registračné číslo: 33,547 (C) Referencie/počet súdnych prípadov: 27866/34026 (ix) Telekomunikačné informácie:

(A) Telefón: (312) 474-6300 (B) Fax: (312) 474-0448 (C) Telefax: 25-3658 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:

Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu íle Ala 15 10 15

Phe (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 16 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEO ID NO, 2, íle Gin Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly Gin Thr Lys íle Pro 15 10 15 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 11 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 3:

Met Lys Pro Leu Val Val Phe Val Leu Gly Gly 15 10 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: Upravené-miesto (B) UMIESTENIE: skupina (13, 21, 27) (C) ĎALŠIE INFORMÁCIE: /poznámka = „Nukleotid na každej z týchto pozícii je inozín“ (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 4:

ACATGAATTC GGNATCYTTG NGTYTGNCCR AA 32 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 5:

TATTTCTAGA AGTGTGGTGG AACTCGCTGG 30 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 6:

CGATGAATTC AGCTTGCAGC AGCCATCAGT AC ³²

SK 286518 Β6 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1520 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 162..1484 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 7:

GCTGGTCGGA GGCTCGCAGT GCTGTCGGCG AGAAGCAGTC GGGTTTGGAG CGCTTGGGTC	60
GCGTTGGTGC GCGGTGGAAC GCGCCCAGGG ACCCCAGTTC CCGCGAGCAG CTCCGCGCCG	120
CGCCTGAGAG ACTAAGCTGA AACTGCTGCT CAGCTCCCAA G ATG GTG CCA CCC	173

Met Val Pro Pro

AAA TTG

CAT His

GTG CTT Val Leu

TTC TGC Phe Cys 10

CTC TGC GGC TGC CTG GCT GTG GTT TAT

221

Lys 5

Leu

Leu Cys

Gly

Cys 15

Leu Ala

Val Val Tyr ' 20

CCT

TTT

GAC

TGG

CAA

TAC

ATA

AAT

CCT

GTT

GCC

CAT

ATG

AAA

TCA

TCA

269

Pro

Phe

Asp

Trp

Gin

Tyr

íle

Asn

Pro

Val

Ala

His

Met

Lys

Ser

Ser

25

30

35

GCA

TGG

GTC

AAC

AAA

ATA

CAA

GTA

CTG

ATG

GCT

GCT

GCA

AGC

TTT

GGC

317

Ala

Trp

Val

Asn.

Lys

íle

Gin

Val

Leu

Met

Ala

Ala

Ala

Ser

Phe

Gly

40

45

50

CAÄ

ÄCT

AAA

ATC

CCC

CGG

GGA

AAT

GGG

CCT

TAT

TCC

GTT

GGT

TGT

ACA

365

Gin

Thr

Lys

íle

Pro

Arg

Gly

Asn

Gly

Pro

Tyr

Ser

Val

Gly

Cys

Thr

55

60

65

GAC TTA

ATG Met

TTT GAT CAC ACT AAT

AAG GGC ACC TTC TTG CGT

TTA Leu

TAT Tyr

413

Asp

Leu 70

Phe

Asp

His

Thr 75

Asn

Lys

Gly

Thr

Phe SO

Leu

Arg

TAT

CCA

TCC

CAA

GAT

AAT

GAT

CGC

CTT

GAC

ACC

CTT

TGG

ATC

CCA

AAT

461

Tyr

Pro

Ser

Gin

Asp

Asn

Asp

Arg

Leu

Asp

Thr

Leu

Trp

íle

Pro

Asn

85

90

95

100

AAA

GAA

TAT

TTT

TGG

GGT

CTT

AGC

AAA

TTT

CTT

GGA

ACA

CAC

TGG

CTT

509

Lys

Glu

Tyr

Phe

Trp

Gly

Leu

Ser

Lys

Phe

Leu

Gly

Thr

His

Trp

Leu

105

110

115

ATG

GGC

AAC

ATT

TTG

AGG

TTA

CTC

TTT

GGT

TCA

ATG

ACA

ACT

CCT

GCA

557

Met

Gly

Asn

íle

Leu

Arg

Leu

Leu

Phe

Gly

Ser

Met

Thr

Thr

Pro

Ala

120

125

130

AAC

TGG

AAT

TCC

CCT

CTG

AGG

CCT

GGT

GAA

AAA

TAT

CCA

CTT

GTT

GTT

605

Asn

Trp

Asn

Ser

Pro

Leu

Arg

Pro

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pro

Leu

Val

Val

135

140

145

TTT

TCT

CAT

GGT

CTT

GGG

GCA

TTC

AGG

ACA

CTT

TAT

TCT

GCT

ATT

GGC

653

Phe

Ser

His

Gly

Leu

Gly

Ala

Phe

Arg

Thr

Leu

Tyr

Ser

Ala

íle

Gly

150

155

160

ATT

GAC

CTG

GCA

TCT

CAT

GGG

TTT

ATA

GTT

GCT

GCT

GTA

GAA

CAC

AGA

701

íle

Asp

Leu

Ala

Ser

His

Gly

Phe

íle

Val

Ala

Ala

Val

Glu

His

Arg

165

170

175

160

GAT AGA TCT GCA TCT

GCA ACT

TAC Tyr

TAT Tyr

TTC AAG GAC CAA TCT GCT

GCA Ala

749

Asp

Arg

Ser Ala

Ser 185

Ala

Thr

Phe 190

Lys

Asp

Gin

Ser

Ala 195

GAA

ATA

GGG

GAC

AAG

TCT

TGG

CTC

TAC

CTT

AGA

ACC

CTG

AAA

CAA

GAG

797

Glu

íle

Gly

Asp

Lys

Ser

Trp

Leu

Tyr

Leu

Arg

Thr

Leu

Lys

Gin

Glu

200

205

210

GAG

GAG

ACA

CAT

ATA

CGA

AAT

GAG

CAG

GTA

CGG

CAA

AGA

GCA

AAA

GAA

845

Glu

Glu

Thr

His

íle

Arg

Asn

Glu

Gin

Val

Arg

Gin

Arg

Ala

Lys

Glu

215

220

225

TGT

TCC

CAA

GCT

CTC

AGT

CTG

ATT

CTT

GAC

ATT

GAT

CAT

GGA

AAG

CCA

893

Cys

Ser

Gin

Ala

Leu

Ser

Leu

íle

Leu

Asp

íle

Asp

His

Gly

Lys

Pro

230

235

240

GTG

AAG

AAT

GCA

TTA

GAT

TTA

AAG

TTT

GAT

ATG

GAA

CAA

CTG

AAG

GAC

941

Val

Lys

Asn

Ala

Leu

Asp

Leu

Lys

Phe

Asp

Met

Glu

Gin

Leu

Lys

Asp

245

250

255

260

TCT

ATT

GAT

AGG

GAA

AAA

ATA

GCA

GTA

ATT

GGA

CAT

TCT

TTT

GGT

GGA

989

Ser

íle

Asp

Arg

Glu

Lys

íle

Ala

Val

íle

Gly

His

Ser

Phe

Gly

Gly

265

270

275

GCA

ACG

GTT

ATT

CAG

ACT

CTT

AGT

GAA

GAT

CAG

AGA

TTC

AGA

TGT

GGT

1037

Ala Thr Val íle Gin Thr Leu Ser Glu Asp Gin Arg Phe Arg Cys Gly

280 285 290

ATT GCC CTG GAT GCA

TGG ATG

TTT Phe 300

CCA CTG

GGT GAT GAA GTA

TAT Tyr

TCC Ser

1085

íle

Ala

Leu 295

Asp

Ala

Trp

Met

Pro

Leu

Gly Asp

Glu 305

Val

AGA

ATT

CCT

CAG

CCC

CTC

TTT

TTT

ATC

AAC

TCT

GAA

TAT

TTC

CAA

TAT

1133

Arg

íle

Pro

Gin

Pro

Leu

Phe

Phe

íle

Asn

Ser

Glu

Tyr

Phe

Gin

Tyr

310

315

320

CCT

GCT

AAT

ATC

ATA

AAA

ATG

AAA

AAA

TGC

TAC

TCA

CCT

GAT

AAA

GAA

1181

Pro

Ala

Asn

íle

íle

Lys

Met

Lys

Lys

Cys

Tyr

Ser

Pro

Asp

Lys

Glu

325

330

335

340

AGA

AAG

ATG

ATT

ACA

ATC

AGG

GGT

TCA

GTC

CAC

CAG

AAT

TTT

GCT

GAC

1229

Arg

Lys

Met

íle

Thr

íle

Arg

Gly

Ser

Val

His

Gin

Asn

Phe

Ala'

Asp

345

350

355

TTC

ACT

TTT

GCA

ACT

GGC

AAA

ATA

ATT

GGA

CAC

ATG

CTC

AAA

TTA

AAG

1277

Phe

Thr

Phe

Ala

Thr

Gly

Lys

íle

íle

Gly

His

Met

Leu

Lys

Leu

Lys

360

365

370

GGA

GAC

ATA

GAT

TCA

AAT

GTA

GCT

ATT

GAT

CTT

AGC

AAC

AAA

GCT

TCA

1325

Gly

Asp

íle

Asp

Ser

Asn

Val

Ala

íle

Asp

Leu

Ser

Asn

Lys

Ala

Ser

375

380

385

TTA

GCA

TTC

TTA

CAA

AAG

CAT

TTA

GGA

CTT

CAT

AAA

GAT

TTT

GAT

CAG

1373

Leu

Ala

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

Leu

His

Lys

Asp

Phe

Asp

Gin

390

395

400

TGG

GAC

TGC

TTG

ATT

GAA

GGA

GAT

GAT

GAG

AAT

CTT

ATT

CCA

GGG

ACC

1421

Trp

Asp

Cys

Leu

íle

Glu

Gly

Asp

Asp

Glu

Asn

Leu

íle

Pro

Gly

Thr

405

410

415

420

AAC

ATT

AAC

ACA

ACC

AAT

CAA

CAC

ATC

ATG

TTA

CAG

AAC

TCT

TCA

GGA

1469

Asn

íle

Asn

Thr

Thr

Asn

Gin

His

íle

Met

Leu

Gin

Asn

Ser

Ser

Gly

425

430

435

ATA GAG AAA TAC AAT TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAAAAAA ΑΑΑΑΆΑ íle Glu Lys Tyr Asn

440

1520

SK 286518 Β6 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA.: 441 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 8:

Met Val Pro Pro Lys

Leu

His

Val

Leu Phe Cys Leu Cys Gly Cys Leu

1

5

10

15

Ala

Val

Val

Tyr

Pro

Phe

Asp

Trp

Gin

Tyr

íle

Asn

Pro

Val

Ala

His

20

25

30

Met

Lys

Ser

Ser

Ala

Trp

Val

Asn

Lys

íle

Gin

Val

Leu

Met

Ala

Ala

35

40

45

Ala

Ser

Phe

Gly

Gin

Thr

Lys

íle

Pro

Arg

Gly

Asn

Gly

Pro

Tyr

Ser

50

55

60

Val

Gly

Cys

Thr

Asp

Leu

Met

Phe

Asp

His

Thr

Asn

Lys

Gly

Thr

Phe

65

70

75

80

Leu Arg Leu Tyr Tyr

Pro

Ser

Gin Asp Asn Asp Arg 90

Leu

Asp Thr 95

Leu

85

Trp

íle

Pro

Asn

Lys

Glu

Tyr

Phe

Trp

Gly

Leu

Ser

Lys

Phe

Leu

Gly

100

105

110

Thr

His

Trp

Leu

Met

Gly

Asn

íle

Leu

Arg

Leu

Leu

Phe

Gly

Ser

Met

115

120

125

Thr

Thr

Pro

Ala

Asn

Trp

Asn

Ser

Pro

Leu

Arg

Pro

Gly

Glu

Lys

Tyr

130

135

140

Pro

Leu

Val

Val

Phe

Ser

His

Gly

Leu

Gly

Ala

Phe

Arg

Thr

Leu

Tyr

145

150

155

160

Ser

Ala

íle

Gly

íle

Asp

Leu

Ala

Ser

His

Gly

Phe

íle

Val

Ala

Ala

165

170

17 5

Val

Glu

His

Arg

Asp

Arg

Ser

Ala

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Asp

180

185

190

Gin

Ser

Ala

Ala

Glu

íle

Gly

Asp

Lys

Ser

Trp

Leu

Tyr

Leu

Arg

Thr

195

200

205

Leu

Lys

Gin

Glu

Glu

Glu

Thr

His

íle

Arg

Asn

Glu

Gin

Val

Arg

Gin

210

215

220

Arg

Ala

Lys

Glu

Cys

Ser

Gin

Ala

Leu

Ser

Leu

íle

Leu

Asp

íle

Asp

225

230

235

240

His

Gly

Lys

Pro

Val

Lys

Asn

Ala

Leu

Asp

Leu

Lys

Phe

Asp

Met

Glu

245

250

255

Gin

Leu

Lys

Asp

Ser

íle

Asp

Arg

Glu

Lys

íle

Ala

Val

íle

Gly

His

260

265

270

Ser Phe Gly 275

Gly

Ala Thr Val

íle Gin Thr Leu Ser Glu

Asp

Gin

Arg

280

285

Phe

Arg

Cys

Gly

íle

Ala

Leu

Asp

Ala

Trp

Met

Phe

Pro

Leu

Gly Asp

290

295

300

Glu

Val

Tyr

Ser

Arg

íle

Pro

Gin

Pro

Leu

Phe

Phe

íle

Asn

Sér

Glu

305

310

315

320

Tyr

Phe

Gin

Tyr

Pro

Ala

Asn

íle

íle

Lys

Met

Lys

Lys

Cys

Tyr

Ser

325

330

335

Pro

Asp

Lys

Glu

Arg

Lys

Met

íle

Thr

íle

Arg

Gly

Ser

Val

His

Gin

340

345

350

Asn

Phe

Ala

Asp

Phe

Thr

Phe

Ala

Thr

Gly

Lys

íle

íle

Gly

His

Met

355

360

365

Leu

Lys

Leu

Lys

Gly

Asp

íle

Asp

Ser

Asn

Val

Ala

íle

Asp

Leu

Ser

370

375

380

Asn

Lys

Ala

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

Leu

His

Lys

385

390

395

400

Asp

Phe

Asp

Gin

Trp Asp

Cys

Leu

íle

Glu

Gly Asp Asp Glu

Asn

Leu

405

410

415

íle

Pro

Gly

Thr

Asn

íle

Asn

Thr

Thr

Asn

Gin His íle Met

Leu

Gin

420

425

430

Asn

Ser

Ser

Gly

íle

Glu

Lys

Tyr

Asn

435

440

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1123 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: exón (B) UMIESTENIE: Nestanovená (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 9:

AAATATAAAT	TTTAATAACA	CCACACATAA	ATTTCAAACT	ACTTTCCCTA	AGTTTCTAGC	60
TGAAGTTTTA	ÄATGAGTGTG	TTTTTAATTT	ATTAGAAAGT	GGATTGAAGA	GAAAACATTG	120
GAAGATGAAG	GAAGGCGTTT	CAGTTAAACC	CCAAATAACT	CTGTGTTACA	CTGAGCTATG	180
AAACGGCTCC	TTCTAGCTCC	ATTTCTCCTC	AGACCTAAGT	GCTATTCCTG	ATTGTCCTTC	240
ATTGTCATTT	CCAGGGAGAA	ATGACACCAG	CACAGTGGCA	GGCCTTCCAA	TCTGGAGCAC	300
GGTCCACACA	ACTTCCGAAT	TGGTGTTCAG	TGTAAAGTGT	ATCGGAGTGC	GGAAAATGCG	360
CAGGGCATTG	CCAACTATAG	ATGCTCGGAG	TAATTCAGTG	TATTCAGAGA	ACACGGTGAA	420

ACAAGGAAAA	CCGGCCTGAC	TGGGGGGTGA	ATTCAGCAGG	GAGTAAATCT	GATCGGCATC	480
AGGTCTGCGG	AAAGGAGCTG	GTGAGCACGA	CACCACCAGG	CATTGCCTGG	CTCTCTCCGC	540
GGCGGGCTAA	GTTAACCTCG	GGTCCAGGTG	CGGGCCATGG	TCTTGGGGAG	GGTGCTGGGT	600
GCGCTCGAGC	AGGCTACGTC	GGGAGCCGCC	GCTGCTAGTG	AGAGCCGGGC	CACACACGCT.	660
CCTCCCCGGT	ACCTCCTCCA	GCATCACCAG	GGGAGGAGAG	GGTCGGGCAC	AAGGCGCGCT	720
AGGCGGACCC	AGACACAGCC	GCGCGCAGCC	CACCCGCCCG	CCGCCTGCCA	GAGCTGCTCG	780
GCCCGCAGCC	AGGGGGACAG	CGGCTGGTCG	GAGGCTCGCA	GTGCTGTCGG	CGAGAAGCAG	840
TCGGGTTTGG	AGCGCTTGGG	TCGCGTTGGT	GCGCGGTGGA	ACCCCCCAGG	GACCCCAGTT	900
CCCGCGAGCA	GCTCCGCGCC	GCGCCTGAGT	GAGGAGGGGC	CCCGGGGGCG	AGGCGGGAGT	960
GGGAGGAAGG	GCACGGTCGC	CGCGCTGGAG	GTCGGGACCC	CGGAGCGGCG	ACCGGCCGGG	1020
GTGGGCTCGC	TGAGTCGCAC	CCGCTCTGCT	GGCCGGTCCT	GGGCTCACAG	TCCCTGCAGC	1080
CCTCGGAAAC	AGCGCTAGGA	TCCTTCGGGA	GAGGAGAGAT	GAC		1123

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 417 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: exón (B) UMIESTENIE: 145..287 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10:

GTACCAATCT	AAAACCCAGC	ACAGAAAAAT	ACATGTTTTA	TTTTTTCCAA	GTGTTACTAG	60
TACCTCAGCC	TTTCTTGATT	TGTCAGCTTA	TTTAAGGCCT	CTTCATTGCA	TACTTCTTTT	120
TTCTTTTAAT	CATCTGCTTC	GAAGGAGACT	AAGCTGAAAC	TGCTGCTCAG	CTCCCAAGAT	180
GGTGCCACCC	AAATTGCATG	TGCTTTTCTG	CCTCTGCGGC	TGCCTGGCTG	TGGTTTATCC	240
TTTTGACTGG	CAATACATAA	ATCCTGTTGC	CCATATGAAA	TCATCAGGTA	AGAGGTGTAT	300
TTGTTCAAGG	TCTTGAGCAA	CTGATCTGTC	GCCATACTTC	AAGTGGGCCC	CAAGAAGTTG	360
CACATCTGCA	CATCTAAACA	AGTCCTATTT	AAAGGCTTAT	GGAGATCCTG	TATTCTC	417

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 498 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KLÚČ: exón (B) UMIESTENIE: 251..372 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11:

CATTAGGAGG TAACAGTCCA AGGCAGCTGA GAGAAAGGCT ATGTCTACTT TCATCTCTTT60

ACCCTCCAAA ACCCCTACAC AGTGTTTCAA ACAGAGAGAC CCTCAATAAT TGCATATCTT120

ACTTGTTAGG TTGAGAAAGA AAGAAGGCCA GAAACTATGG GAAGTAACTT GATTCCGTTG180

GAATTCTTTT GCATAATAAA ATCTGATATG TAATGGATGA CAAATGAGAT AATATTTACC240

TGTTTTTCAG CATGGGTCAA CAAAATACAA GTACTGATGG CTGCTGCAAC GTTTGGCCAA300

ACTAAAATCC CCCGGGGAAA TGGGCCTTAT TCCGTTGGTT GTACAGACTT AATGTTTGAT360

CACACTAATA AGGTAATGCT TTGATTTATA CAACTTATCC TGATACTCTA ATATTGTCTG420

TCGCTATGGA CCACTAGAAG GTGTTCAAAT GTGACCTTGC CCTCACCTGA GAATGACTCA480

TTTTCGAATT TGTATTGT498 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 433 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: exón (B) UMIESTENIE: 130..274 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 12:

CAGCAGCCTA	AAGTCTTAGA	CTTTGTGAAC	ACAGAGGTAT	TGAGTCCCAC	ΤΆΆΤΤΑΑΤΑΤ	60
CGAAAATAGC	TGCTGGAATA	TGTTTGAGAC	ACAACTTCTC	TAAAAGTGCA	TTAATTTCTT	120
TCTTAACAGG	GCACCTTCTT	GCGTTTATAT	TATCCATCCC	AAGATAATGA	TCACCTTGAC	180
ACCCTTTGGA	TCCCAAATAA	AGAATATTTT	TGGGGTCTTA	GCAAATTTCT	TGGAACACAC	240
TGGCTTATGG	GCAACATTTT	GAGGTTACTC	TTTGGTAAGA	TTTCTGTTGA	TCCTTCTTTG	300
TAGGCTCTTG	CATGTATGAA	AACCTTGAAA	ACAACAAGAA	CTTCAAGTAG	TTAAGACCAA	360
AGTAGATTTT	TCTTCAGTCC	AAATAGCTCC	TAAAATGATA	AGGAAAGTAT	TTCTTTAAAG	420
CCCAGGCAAC	TAC					433

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 486 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KLÚČ: exón (B) UMIESTENIE: 164..257 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 13:

TTGGTGGGTA TCTAGTAGCA GTCTTTTTAA TGAATCTACT ATTCATCCAT AAAAAAGTAG

ATATAAATCA GATGGGTCTG CATTTTATGC TAATGAGATA TGAATTAAAT TCACTAGCAA

120

SK 286518 Β6

CACTCAGAGA AAACCTTAAC TATAACCTTC CATTGTTGTC TAGGTTCAAT GACAACTCCT 18 0 GCAAACTGGA ATTCCCCTCT GAGGCCTGGT GAAAAATATC CACTTGTTGT TTTTTCTCAT 240 GGTCTTGGGG CATTCAGGTA ATGTTTGAGA GGTTGAACAA TTTTGGCTTC CAGGAATAAA 300 TGACAATTTT TTTATTCAAG AAAGAAATAG CAGAGTTTGG AATGTCATGC AGGCCCTTGT 360 CTGGAGGAGT TGGGGTTCCT CAATAATTGG CTGTGGGTCT ATTGATCAGT CCTAGACCTG 420 TCTGGTCAAG TAGTTTTTTC CCTACTATCA GCTCATTGGG ATTAGCCTCA CAGCAGAGAA 480 GAAAGG 4 86 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 363 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) 10 (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: exón (B) UMIESTENIE: 113..181 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 14:

CCCCAGGCTC TACTACAGGG TGTAATGGCC TCCATGTTCC CAGTTTTATT AGTGACTCAG 60 CCTTGTAATT CATGACTGGT AGTTGTAATT CTTCCCTCTT TTTGTTTTGA AGGACACTTT 120 ATTCTGCTAT TGGCATTGAC CTGGCATCTC ATGGGTTTAT AGTTGCTGCT GTAGAACACA 180 GGTATGTTAC CTGATATAAT TGGGCTCTTT GGCCAACTAC AGGGAATGTC AATGCTCATA 240 ACTATGTTTC TAATTTTCAT AAAAGTTTAT TTAAAATGTT GATGGAACTT TCAAGTATGG 300 TAACATCATG AGCAAAAAAG GAGATTGAGT TTTATCGACT TAAAAGACTT AAAAGCACCT 360 AAC 363 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 441 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: exón (B) UMIESTENIE: 68..191 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 15:

GAACTGAGAA ACATGGTCAG ATGAGGAAGG GAAGGAGCAT

GCATAAATAA TTTTGCTTGT

ATTATAGAGA TAGATCTGCA TCTGCAACTT ACTATTTCAA GGACCAATCT

GCTGCAGAAA

120

TAGGGGACAA GTCTTGGCTC TACCTTAGAA

CCCTGAAACA AGAGGAGGAG ACACATATAC

180

GAAATGAGCA GGTACATTGC AGTGAAAGGA

GAGGTGGTTG GTGACCTAAA AGCATGTACA

240

AAAGGATGAC	ATTTGTTAAT	TTAATTTTAC	ACCTGGCAAG	TTATGCTCCT	AGCTCTCCTA	300
TTTCCCATTC	CCAAAAGATC	TGTCAATAGA	TTCCTGGAGC	AGTAAAATTC	CCTTAATGGA	360
ATATCTAGTT	CATAGTAAAA	ACAAAGGCAA	ATACAAAAAT	TTGGGAGATG	ACAGTGAATA	420
TTCAGAATTC	CTCGAGCCGG	G				441

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 577 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI: _ (A) MENO/KĽÚČ: exón (B) UMIESTENIE: 245..358 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 16:

GGTTAAGTAA	ATCGTCTGAA	GTCACATAGT	AGGTAAGGCA	AAACAGAGCC	AGGATTTGGA	60
CTAAGGCTAT	ACCTATGTGC	AÄAGCTGGGG	CCTGTGTCAT	TATGGTAGCA	AGTAATAGTC	120
ACTAATCAGA	TTTCCAGTTT	ATAACTGACC	AACGATTTTT	CCCAAATACA	GCTTCTACCT	180
AAACTTTAAA	ATAAGTGTTA	TAACTTTTTA	CTTTGTCATT	TCCTTCTTCT	AATAATTATA	240
TTAGGTACGG	CAAAGAGCAA	AAGAATGTTC	CCAAGCTCTC	AGTCTGATTC	TTGACATTGA	300
TCATGGAAAG	CCAGTGAAGA	ATGCATTAGA	TTTAAAGTTT	gatatggaac	AACTGAAGGT	360
AAGCTATAAA	AAGTAATTTT	TCTCTTGTCC	TACAGTTCTT	TATTGTTTTT	TGTCATTTAA	420
TTTTCTGCCT	ATATTGCAAG	GTACAATATG	ATAAAGGGCT	GCAACCAGCC	CCTCCCCAAT	480
gcgcacacac	AGACACACAA	AGCAGTACAG	GTAAAGTATT	GCAGCAATGA	AGAATGCATT	540
ATCTTGGACT	AGATATGAAT	GCAAAGTTAG	TCAGTTT			577

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 396 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: exón (B) UMIESTENIE, 108..199 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 17:

ATCAATGTAT	TTACCATCCC	CATGAAATGA	ACAATTATAT	GATTGACAAA	TCATTTCTTC	60
TAACACCACG	AAATAGCTAT	AAATTTATAT	CATGCTTTTT	CAAATAGGAC	TCTATTGATA	120
GGGAAAAAAT	AGCAGTAATT	GGACATTCTT	TTGGTGGAGC	AACGGTTATT	CAGACTCTTA	1B0
GTGAAGATCA	GAGATTCAGG	TAAGAAAATA	AGATAGTAAA	GCAAGAGAAT	AGTAÄATTAT	240
TGGAAGAAAT	TATATTGTGA	GATATAATTT	TTATTCAAAT	TCTTAGTGAA	GGAAGGGGAT	300

SK 286518 Β6

CTCTTGGAGT TTATAAGGCT ATTCTTTTGC CCCCATAAAA TACTCTATAT ACATTTTCCT

AGGCTAAAAC ATCTCCTCTC CTGCTATTAA AATCTC

360

396 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 519 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: exón (B) UMIESTENIE: 181..351 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 18:

CTTACAAAGT	TAATCATATC	CCTTTCCCAC	ATTGAAGTAT	GATACCTCTT	TATTCCAATC	60
AGATAACCCA	TAATAAACTG	GTATGGTGCG	TGTCCACCAA	TCCTAGCATT	ATTAGGATGT	120
CCTCAATGTT	GGCTAGTATG	TAACCAGTTT	aatttcatca	TTGTCAACAA	ATATCTACAG	180
ATGTGGTATT	GCCCTGGATG	CATGGATGTT	TCCACTGGGT	GATGAAGTAT	ATTCCAGAAT	240
TCCTCAGCCC	CTCTTTTTTA	TCAACTCTGA	ATATTTCCÄA	TATCCTGCTA	ATATCATAAA	300
AATGAÄÄAAA	TGCTACTCAC	CTGATAÄAGA	AAGAAAGATG	ATTACÄATCA	GGTAAGTATT	360
AGTGACTTAT	TTCATTATGT	GAAACAAACT	TGAAGCTTGG	GTAAATATCA	ATCGATATCA	420
TTTGGTAACT	ATTAAAGAAT	TGCTGAATTG	GTTGTTTAGA	CTTTCAATAA	GGAGAGAATT	480
AGATAATCTC	AGTTTCTAAG	TACATTTAGT	CTACTCTTT			519

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 19.

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 569 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KLÚČ: exón (B) UMIESTENIE: 156..304 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 19:

TGAAACACAT	CTAAGTAGAT	CAAATTACAA	GTTTTATTTC	TTCTTTGGTT	TTCAGTAAAC	60
AGACCAACAA	GACCAGTACC	TTTCCTTACA	CTCTAACTÄA	ΆΆΑΑΑΤΑΑΤΆ	ATTTTATCAA	120
ACAATGTGAC	TTTTAAATGT	CTTGTTCTCT	TTTAGGGGTT	CAGTCCACCA	GAATTTTGCT	180
GACTTCACTT	TTGCAACTGG	CAAAATAATT	GGACACATGC	TCAAATTAAA	GGGAGACÄTA	240
GATTCAAATG	TAGCTATTGA	TCTTAGCAAC	AAAGCTTCAT	TAGCATTCTT	ACAAAAGCAT	300
TTAGGTAAGA	AACTATTTTT	TTCATGACCT	AAACCGAGAT	GAATCTCGAG	GACAAAGCTG	360
TCTATCTTAA	TACAGCTTTA	GTACTATTTA	AACTATTTCC	AGTTGGTTTA	CAATGGAACA	420

SK 286518 Β6

AAGCAGTATA	TCAATTTGAA	AACAGAAATT	TGAGAAAGTC	AATTTTGCTG	CTTTACATCT	480
CTATATCATA	GAAAGCAAAT	CAACTGTTAA	AGGTAATATT	CTTTGTATGA	GCTAGAGTGA	540
CTCATGTGAG	GATATCGAAC	GACGGTGCT				569

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO, 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 469 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genómová) (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: exón (B) UMIESTENIE: 137..253 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 20:

GATACAGAGG CACATCGTCT

CTACCATCCT AACGGAACTT GTGTAATTTG TAAATCTTTA

TTGCCACCTA GGGGCATCCA AACTGTTTAA TGCTCTCAAA AGTTTAATAT

GTTGATTAAC

120

ACTTTATATT

TTATAGGACT TCATAAAGAT TTTGATCAGT GGGACTGCTT GATTGAAGGA

180

GATGATGAGA ATCTTATTCC AGGGACCAAC ATTAACACAA CCAATCAACA

CATCATGTTA

240

CAGAACTCTT CAGGAATAGA GAAATACAAT GTTTCAAAAC TGTCTAAAAT TATGTGTGTG AGAGAGAGAG AGAGAGAATT TTAATGTATT GCTATACTGT AATCGTGATT GAAGCTTGGA

TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAGTCTT300

TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG AGAGAGAGAG360

TTCCCAAAGG ACTCATATTT TAAAATGTAG420

CTAAGAATTT TTTCCCTTT469 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1494 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 117..1436 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 21:

GGCACGAGCT AGGATCTGAC TCGCTCTGGT GGCATTGCTG CGCTCAGGGT TCTGGGTATC

CGGGAGTCAG TGCAGTGACC AGAACATCAA ACTGAAGCCA CTGCTCAGCT CCTAAG

116

ATG GTA

CCA CTC

AAA CTG

CAG GCG Gin Ala

CTT TTC TGC

CTC Leu

CTC TGC

TGC Cys 15

CTC Leu

164

Met 1

Val

Pro

Leu

Lys 5

Leu

Leu

Phe 10

Cys

Leu

Cys

CCA

TGG

GTC

CAT

CCT

TTT

CAC

TGG

CAA

GAC

ACA

TCT

TCT

TTT

GAC

TTC

212

Pro

Trp

Val

His

Pro

Phe

His

Trp

Gin

Asp

Thr

Ser

Ser

Phe

Asp

Phe

20

25

30

AGG

CCG

TCA

GTA

ATG

TTT

CAC

AAG

CTC

CAA

TCG

GTG

ATG

TCT

GCT

GCC

260

Arg

Pro

Ser

Val

Met

Phe

His

Lys

Leu

Gin

Ser

Val

Met

Ser

Ala

Ala

35

40

45

GGC TCT

GGC Gly

CAT AGT AAA

ATC CCC AAA

GGA AAT

GGA TCG TAC CCC

GTC Val

308

Gly

Ser 50

His

Ser Lys

íle 55

Pro

Lys

Gly

Asn

Gly 60

Ser Tyr

Pro

GGT

TGT

ACA

GAT

CTG

ATG

TTC

GGT

TAT

GGG

AAT

GAG

AGC

GTC

TTC

GTG

356

Gly

Cys

Thr

Asp

Leu

Met

Phe

Gly

Tyr

Gly

Asn

Glu

Ser

Val

Phe

Val

65

70

75

80

CGT

TTG

TAC

TAC

CCA

GCT

CAA

GAT

CAA

GGT

CGC

CTC

GAC

ACT

GTT

TGG

404

Arg

Leu

Tyr

Tyr

Pro

Ala

Gin

Asp

Gin

Gly Arg

Leu

Asp

Thr

Val

Trp

85

90

95

ATC

CCA

AAC

AAA

GAA

TAT

TTT

TTG

GGT

CTT

AGT

ATA

TTT

CTT

GGA ACA

452

íle

Pro

Asn

Lys

Glu

Tyr

Phe

Leu

Gly

Leu

Ser

íle

Phe

Leu

Gly

Thr

100

105

110

CCC

AGT

ATT

GTA

GGC

AAT

ATT

TTA

CAC

CTC

TTA

TAT

GGT

TCT

CTG

ACA

500

Pro

Ser

íle

Val

Gly

Asn

íle

Leu

His

Leu

Leu

Tyr

Gly

Ser

Leu

Thr

115

120

125

ACT Thr

CCT GCA AGC

TGG Trp

AAT Asn

TCT CCT TTA AGG ACT GGA GAA

AAA TAC

CCG Pro

548

Pro 130

Ala

Ser

Ser 135

Pro

Leu

Arg

Thr

Gly 140

Glu

Lys

Tyr

CTC

ATT

GTC

TTT

TCT

CAT

GGT

CTC

GGA

GCC

TTC

AGG

ACG

ATT

TAT

TCT

596

Leu

íle

Val

Phe

Ser

His

Gly

Leu

Gly

Ala

Phe

Arg

Thr

íle

Tyr

Ser

145

150

155

160

GCT

ATT

GGC

ATT

GGC

TTG

GCA

TCT

AAT

GGG

TTT

ATA

GTG

GCC

ACT

GTC

644

Ala

íle

Gly

íle

Gly

Leu

Ala

Ser

Asn

Gly

Phe

íle

Val

Ala

Thr

Val

165

170

175

GAA

CAC

AGA

GAC

AGA

TCT

GCA

TCG

GCA

ACT

TAC

TTT

TTT

GAA

GAC

CAG

692

Glu

His

Arg

Asp

Arg

Ser

Ala

Ser

Ala

Thr

Tyr

Phe

Phe

Glu

Asp

Gin

180

185

190

GTG

GCT

GCA

AAA

GTG

GAA

AAC

AGG

TCT

TGG

CTT

TAC

CTG

AGA

AAA

GTA

740

Val

Ala

Ala

Lys

Val

Glu

Asn

Arg

Ser

Trp

Leu

Tyr

Leu

Arg

Lys

Val

195

200

205

AAA

C?A

GAG

GAG

TCG

GAA

AGT

GTC

CGG

AAA

GAA

CAG

GTT

CAG

CAA

AGA

788

Lys

Gin

Glu

Glu

Ser

Glu

Ser

Val

Arg

Lys

Glu

Gin

Val

Gin

Gin

Arg

210

215

220

GCA

ATA

GAA

TGT

TCC

CGG

GCT

CTC

AGT

GCG

ATT

CTT

GAC

ATT

GAA

CAT

836

Ala

íle

Glu

Cys

Ser

Arg

Ala

Leu

Ser

Ala

íle

Leu

Asp

íle

Glu

His

225

230

235

240

GGA

GAC

CCA

AAA

GAG

AAT

GTA

CTA

GGT

TCA

GCT

TTT

GAC

ATG

AAA

CAG

884

Gly

Asp

Pro

Lys

Glu

Asn

Val

Leu

Gly

Ser

Ala

Phe

Asp

Met

Lys

Gin

245

250

255

CTG

AAG

GAT

GCT

ATT

GAT

GAG

ACT

AAA

ATA

GCT

TTG

ATG

GGA

CAT

TCT

932

Leu

Lys

Asp

Ala

íle

Asp

Glu

Thr

Lys

íle

Ala

Leu

Met

Gly

His

Ser

260

265

270

TTT

GGA

GGA

GCA

ACA

GTT

CTT

CAA

GCC

CTT

AGT

GAG

GAC

CAG

AGA

TTC

980

Phe

Gly

Gly

Ala

Thr

Val

Leu

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Asp

Gin

Arg

Phe

275

280

285

AGA

TGT

GGA

GTT

GCT

CTT

GAT

CCA

TGG

ATG

TAT

CCG

GTG

AAC

GAA

GAG

1028

Arg

Cys

Gly

Val

Ala

Leu

Asp

Pro

Trp

Met

Tyr

Pro

Val

Asn

Glu

Glu

290

295

300

SK 286518 Β6

CTG TAC TCC AGA ACC CTC CAG CCT

CTC Leu

CTC TTT ATC AAC TCT GCC AAA

1076

Leu Tyr Ser Arg Thr Leu Gin

Pro

Leu

Phe 315

íle Asn

Ser Ala Lys 320

305

310

TTC

CAG

ACT

CCA

AAG

GAC

ATC

GCA

AAA

ATG

AAA

AAG

TTC

TAC

CAG

CCT

1124

Phe

Gin

Thr

Pro

Lys

Asp

íle

Ala

Lys

Met

Lys

Lys

Phe

Tyr

Gin

Pro

325

330

335

GAC

AAG

GAA

AGG

AAA

AAT

GAT

TAC

AAT

CAA

GGG

CTC

AGG

CAC

CAG

AAC

1172

Asp

Lys

Glu

Arg

Lys

Asn

Asp

Tyr

Asn

Gin

Gly

Leu

Arg

His

Gin

Asn

340

345

350

TTT

GAC

GAC

TTT

ACT

TTT

GTA

ACT

GGC

AAA ATA

ATT

GGA

AAC

AAG

CTG

1220

Phe

Asp

Asp

Phe

Thr

Phe

Val

Thr

Gly

Lys

íle

íle

Gly

Asn

Lys

Leu

355

360

365

ACA

CTG

AAA

GGA

GAA

ATC

GAT

TCC

AGA

GTA

GCC

ATC

GAC

CTC

ACC

AAC

1268

Thr

Leu

Lys

Gly

Glu

íle

Asp

Ser

Arg

Val

Ala

íle

Asp

Leu

Thr

Asn

370

375

380

AAA

GCT

TCG

ATG

GCT

TTC

TTA

CAA

AAG

CAT

TTA

GGG

CTT

CAG

AAA

GAC

1316

Lys

Ala

Ser

Met

Ala

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

Leu

Gin

Lys

Asp

385

390

395

400

TTT

GAT

CAG

TGG

GAC

CCT

CTG

GTG

GAA

GGA

GAT

GAT

GAG

AAC

CTG

ATT

1364

Phe

Asp

Gin

Trp

Asp

Pro

Leu

Val

Glu

Gly Asp

Asp

Glu

Asn

Leu

íle

405

410

415

CCT

GGG

TCA

CCC

TTT

GAC

GCA

GTC

ACC

CAG

GCC

CCG

GCT

CAG

CAA

CAC

1412

Pro

Gly

Ser

Pro

Phe

Asp

Ala

Val

Thr

Gin

Ala

Pro

Ala

Gin

Gin

His

420

425

430

TCT

CCA

GGA

TCA

CAG

ACC

CAG

AAT

TAGAAGAACT '

TGCTTGTTAC ACAGTTGCCT

1466

Ser

Pro

Gly

Ser

Gin

Thr

Gin

Asn

435 440

TTTAAAAGTA GAGTGACATG AGAGAGAG (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 2191 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 92..1423 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 22:

CCGCGCGCTC CGGCCGGGGG ACCCTGGTTC CGGCGAGCGG CTCAGCGCGG CGCCCGGAAG

1494

TTTAAGCTGA AACCACTGCT CAGCTTCCAA G ATG TTG CCA CCC AAA CTG CAT 112

Met Leu Pro Pro Lys Leu His

5

GCG CTT TTC TGC

CTC TGC

AGC TGC Ser Cys 15

CTC ACA CTG GTT CAT

CCT ATT GAC

160

Ala

Leu

Phe 10

Cys

Leu

Cys

Leu Thr

Leu Val

His 20

Pro íle

Asp

TGG

CAA

GAC

CTA

AAT

CCT

GTT

GCC

CAT

ATT

AGA

TCA

TCA

GCA

TGG

GCC

208

Trp

Gin

Asp

Leu

Asn

Pro

Val

Ala

His

íle

Arg

Ser

Ser

Ala

Trp

Ala

30 35

SK 286518 Β6

AAT AAA ATA

CAA Gin

GCT Ala

CTG Leu 45

ATG Met

GCT Ala

GCT Ala

GCA Ala

AGT ATT AGG

CAA Gin

AGT AGA Ser Arg 55

Asn 40

Lys

íle

Ser 50

íle

Arg

ATT

CCC

AAA

GGA

AAT

GGA

TCT

TAT

TCT

GTC

GGT

TGT

ACA

GAT

TTG

ATG

íle

Pro

Lys

Gly

Asn

Gly

Ser

Tyr

Ser

Val

Gly

Cys

Thr

Asp

Leu

Met

65 70

TTT GAT TAT ACT AAT

AAG GGC ACC TTT

TTG CGT TTG TAT TAT

CCA Pro

TCG Ser

352

Phe

Asp

Tyr Thr Asn 75

Lys

Gly

Thr

Phe 80

Leu Arg

Leu

Tyr

Tyr 85

CAA

GAG

GAT

GAC

CAC

TCT

GAC

ACG

CTT

TGG

ATC

CCA

AAC

AAA

GAA

TAT

400

Gin

Glu

Asp

Asp

His

Ser

Asp

Thr

Leu

Trp

íle

Pro

Asn

Lys

Glu

Tyr

90

95

100

TTT

TTT

GGT

CTT

AGT

AAA

TAT

CTT

GGA

ACA

CCC

TGG

CTT

ATG

GGC

AAA

448

Phe

Phe

Gly

Leu

Ser

Lys

Tyr

Leu

Gly

Thr

Pro

Trp

Leu

Met

Gly

Lys

105

110

115

ATA

TTG

AGC

TTC

TTT

TTT

GGT

TCA

GTG

ACA

ACT

CCT

GCG

AAC

TGG

AAT

496

íle

Leu

Ser

Phe

Phe

Phe

Gly

Ser

Val

Thr

Thr

Pro

Ala

Asn

Trp

Asn

120

125

130

135

TCC

CCT

CTG

AGG

ACT

GGT

GAA

AAA

TAT

CCA

CTG

ATT

GTT

TTT

TCT

CAT

544

Ser

Pro

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pro

Leu

íle

Val

Phe

Ser

His

140

145

150

GGT

CTT

GGA

GCA

TTC

CGG

ACA

ATT

TAT

TCT

GCT

ATT

GGC

ATT

GAT

CTA

592

Gly

Leu

Gly

Ala

Phe

Arg

Thr

íle

Tyr

Ser

Ala

íle

Gly

íle

Asp

Leu

155

160

165

GCA Ala

TCA Ser

CAT His 170

GGG TTC ATC GTT GCT GCT ATA GAA CAC AGA GAT

GGA Gly

TCC Ser

640

Gly

Phe

íle Val Ala 175

Ala

íle

Glu His

Arg 180

Asp

GCC

TCT

GCG

ACT

TAC

TAT

TTC

AAG

GAC

CAG

TCT

GCT

GCA

GAA

ATA

GGG

688

Ala

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Asp

Gin

Ser

Ala

Ala

Glu

íle

Gly

185

190

195

AAC

AAA

TCT

TGG

TCT

TAT

CTT

CAA

GAA

CTA

AAA

CCA

GGG

GAT

GAG

GAG

736

Asn

Lys

Ser

Trp

Ser

Tyr

Leu

Gin

Glu

Leu

Lys

Pro

Gly

Asp

Glu

Glu

200

205

210

215

ATA

CAT

GTT

CGA

AAT

GAG

CAG

GTA

CAG

AAA

AGG

GCA

AAG

GAG

TGC

TCC

784

íle

His

Val

Arg

Asn

Glu

Gin

Val

Gin

Lys

Arg

Ala

Lys

Glu

Cys

Ser

220

225

230

CAA

GCT

CTC

AAC

TTG

ATT

CTG

GAC

ATT

GAT

CAT

GGA

AGG

CCA

ATT

AAG

832

Gin

Ala

Leu

Asn

Leu

íle

Leu

Asp

íle

Asp

His

Gly

Arg

Pro

íle

Lys

235

240

245

AAT

GTA

CTA

GAC

TTA

GAG

TTT

GAT

GTG

GAA

CAA

CTG

AAG

GAC

TCT

ATT

880

Asn

Val

Leu

Asp

Leu

Glu

Phe

Asp

Val

Glu

Gin

Leu

Lys

Asp

Ser

íle

250

255

260

GAC

AGG

GAT

AAA

ATA

GCA

GTA

ATT

GGA

CAT

TCT

TTT

GGT

GGA

GCC

ACA

928

Asp

Arg

Asp

Lys

íle

Ala

Val

íle

Gly

His

Ser

Phe

Gly

Gly

Ala

Thr

265

27 0

275

GTT

CTT

CAG

GCT

CTT

AGT

GAA

GAC

CAG

AGA

TTT

AGG

TGC

GGG

ATT

GCC

976

Val

Leu

Gin

Ala

Leu

Ser

Glu

Asp

Gin

Arg

Phe

Arg

Cys

Gly

íle

Ala

280

285

290

295

TTG

GAT

GCA

TGG

ATG

CTT

CCA

CTG

GAT

GAT

GCA

ATA

TAT

TCC

AGA

ATC

1024

Leu

Asp

Ala

Trp

Met

Leu

Pro

Leu

Asp

Asp

Ala

íle

Tyr

Ser

Arg

íle

300

305

310

CCT Pro

CAG CCC

CTC TTT TTT ATT

AAC TCG GAA CGG TTC CAA TTT

CCT Pro

GAG Glu

1072

Gin

Pro

Leu Phe 315

Phe íle

Asn

Ser Glu 320

Arg

Phe

Gin

Phe 325

AAT

ATC

AAA

AAA

ATG

AAA

AAA

TGC

TAC

TCA

CCT

GAC

AAA

GAA

AGA

AAA

1120

Asn

íle

Lys

Lys

Met

Lys

Lys

Cys

Tyr

Ser

Pro

Asp

Lys

Glu

Arg

Lys

330

335

340

ATG

ATT

ACA

ATC

AGG

GGT

TCA

GTC

CAT

CAG

AAC

TTT

GCT

GAT

TTC

ACT

1168

Met

íle

Thr

íle

Arg

Gly

Ser

Val

His

Gin

Asn

Phe

Ala

Asp

Phe

Thr

345

350

355

TTT

ACA

ACT

GGC

AAA

ATA

GTT

GGA

TAC

ATA

TTC

ACA

TTA

AAA

GGA

GAT

1216

Phe

Thr

Thr

Gly

Lys

íle

Val

Gly

Tyr

íle

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asp

360

365

370

375

ATA

GAT

TCA

AAT

GTA

GCA

ATT

GAT

CTT

TGC

AAC

AAA

GCT

TCA

TTG

GCA

1264

íle

Asp

Ser

Asn

Val

Ala

íle

Asp

Leu

Cys

Asn

Lys

Ala

Ser

Leu

Ala

380

385

390

TTT

TTA

CAA

AAG

CAT

TTA

GGA

CTG

CGG

AAA

GAT

TTT

GAT

CAG

TGG

GAT

1312

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

Leu

Arg

Lys

Asp

Phe

Asp

Gin

Trp

Asp

395

400

405

TCT

TTG

ATT

GAA

GGA

AAA

GAC

GAA

AAT

CTT

ATG

CCA

GGG

ACC

AAC

ATT

1360

Ser

Leu

íle

Glu

Gly

Lys

Asp

Glu

Asn

Leu

Met

Pro

Gly

Thr

Asn

íle

410

415

420

AAC

ATC

ACC

AAC

GAA

CAT

GAC

ACT

CTA

CAG

AAC

TCT

CCA

GAA

GCA

GAG

1408

Asn

íle

Thr

Asn

Glu

His

Asp

Thr

Leu

Gin

Asn

Ser

Pro

Glu

Ala

Glu

425

430

435

AAA TCG AAT TTA GAT TAAAAGCACT TTTTTAAAGA TCTTGTTTAA AAACTGTCAA 1463

Lys Ser Asn Leu Asp

440

AAAATGTGTG	TATGACTTTT	AATATATTTT	CTCAAATAAC	TCATATTGGA	AAATGTAGGC	1523
TATCCCATAA	AAGTGATTGA	AGCTTGGACT	AGGAGGTTTT	TTTCTTTAAA	GAAAGATTGG	1583
TGTCTATCGA	AATCATGCCA	GCCTAAATTT	TAATTTTACT	AAAATGATGC	TGTGTCAAAA	1643
TTAATAACTA	CTTTTACATT	CTTTAATGGA	CAAGTATAAC	AGGCACAAGG	CTAATGAAAA	1703
CGTGTTGCAA	TGACATAACA	ATCCCTAAAA	ATACAGATGT	TCTTGCCTCT	TTTTTCTATT	1763
ATAATTGAGT	TTTAGCAACA	TGTTATGCTA	GGTAGAATTT	GGAAGCACTT	CCCTTTGACT	1823
TTTGGTCATG	ATAAGAAAAA	TTAGATCAAG	CAAATGATAA	AAGCAGTGTT	TTACCAAGGA	1883
TTAGGGATAC	TGAACAATTT	CACTATGGTA	ACTGAATGGG	GAGTGACCAA	GGGTAAAAAT	1943
ATTAAAGCCA	AGGCAAAGGC	AGCAGATTAG	AATGGATTAA	AGAGAGTTTA	TAATTTGTTT	2003
GCATTTACTT	GATGGTTTAT	CTCATGGATT	CATGAGTCAA	GAAAGGTGCG	TAGGACAGGC	2063
CAGGGATTCC	AGTTATAACA	CATTATTCAC	CCAAAGGGTT	CTTTAATTCT	GTATGAGTAT	2123
TGGGAGTGGA	TTAGCACAAT	AGAGGCATAT	GTTGCTTTAA	ΑΑΑΑΆΑΑΑΆΑ	ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ	2183
AAAAAAAA						2191

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1533 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina

SK 286518 Β6 (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (n) TYP MOLEKULY: proteín (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 62..1394 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 23:

CCGCGAGCAG TTCACCGCGG CGTCCGGAAG GTTAAGCTGA AACGGCAGCT CAGCTTCGGA

G ATG TTA CCG TCC AAA TTG CAT GCG CTT TTC TGC CTC TGC ACC TGC

Met Leu Pro Ser Lys Leu His Ala Leu Phe Cys Leu Cys Thr Cys 15 10 15

106

CTT GCA CTG

GTT TAT

CCT Pro

TTT GAC TGG CAA GAC CTG

AAT Asn

CCA Pro

GTT Val 30

GCC Ala

154

Leu

Ala

Leu

Val

Tyr 20

Phe

Asp

Trp Gin 25

Asp

Leu

TAT

ATT

GAA

TCA

CCA

GCA

TGG

GTC

AGT

AAG

ATA

CAA

GCT

CTG

ATG

GCT

202

Tyr

íle

Glu

Ser

Pro

Ala

Trp

Val

Ser

Lys

íle

Gin

Ala

Leu

Met

Ala

35

40

45

GCT

GCA

AAC

ATT

GGT

CAA

TCT

AAA

ATC

CCC

AGA

GGA

AAT

GGA

TCT

TAT

250

Ala

Ala

Asn

íle

Gly

Gin

Ser

Lys

íle

Pro

Arg

Gly

Asn

Gly

Ser

Tyr

50

55

60

TCC

GTC

GGT

TGT

ACA

GAC

TTG

ATG

TTT

GAT

TAC

ACT

AAT

AAG

GGC

ACC

29B

Ser

Val

Gly

Cys

Thr

Asp

Leu

Met

Phe

Asp

Tyr

Thr

Asn

Lys

Gly

Thr

65

70

75

TTC

TTG

CGT

TTG

TAT

TAT

CCA

TCT

CAA

GAT

GAT

GAT

CAC

TCC

GAC

ACC

346

Phe

Leu

Arg

Leu

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Gin

Asp

Asp

Asp

His

Ser

Asp

Thr

80

85

90

95

CTT

TGG

ATC

CCA

AAC

AAA

GAA

TAT

TTT

TTG

GGT

CTT

AGT

AAA

TTT

CTT

394

Leu

Trp

íle

Pro

Asn

Lys

Glu

Tyr

Phe

Leu

Gly

Leu

Ser

Lys

Phe

Leu

100

105

110

GGA

ACA

CAC

TGG

CTT

GTG

GGC

AAA

ATT

ATG

GGC

TTA

TTC

TTC

GGT

TCA

442

Gly

Thr

His

Trp

Leu

Val

Gly

Lys

íle

Met

Gly

Leu

Phe

Phe

Gly

Ser

115

120

125

ATG

ACA

ACT

CCT

GCA

GCC

TGG

AAT

GCA

CAT

CTG

AGG

ACT

GGG

GAA

AAA

490

Met

Thr

Thr

Pro

Ala

Ala

Trp

Asn

Ala

His

Leu

Arg

Thr

Gly

Glu

Lys

130

135

140

TAC

CCA

CTA

ATT

ATT

TTT

TCT

CAT

GGT

CTT

GGA

GCA

TTC

AGG

ACG

ATT

538

Tyr

Pro

Leu

íle

íle

Phe

Ser

His

Gly

Leu

Gly

Ala

Phe

Arg

Thr

íle

145

150

155

TAT

TCT

GCT

ATT

GGC

ATT

GAT

CTG

GCA

TCC

CAC

GGG

TTT

ATA

GTT

GCT

Tyr

Ser

Ala

íle

Gly

íle

Asp

Leu

Ala

Ser

His

Gly

Phe

íle

Val

Ala

160

165

170

175

GCT

GTA

GAA

CAC

AGG

GAT

GGC

TCT

GCA

TCC

TCG

ACA

TAC

TAT

TTC

AAG

Ala

Val

Glu

His

Arg

Asp

Gly

Ser

Ala

Ser

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Phe

Lys

180

185

190.

GAC

CAG

TCT

GCT

GTA

GAA

ATA

GGC

AAC

AAG

TCT

TGG

CTC

TAT

CTC

AGA

Asp

Gin

Ser

Ala

Val

Glu

íle

Gly

Asn

Lys

Ser

Trp

Leu

Tyr

Leu

Arg

195

200

205

586

634

682

ACC CTG AAG CGA GGA GAG

GAG GAG TTT CCT TTA CGA AAT

GAG CAG TTA

730

Thr

Leu Lys Arg Gly 210

Glu

Glu

Glu 215

Phe Pro

Leu

Arg

Asn 220

Glu

Gin

Leu

CGG

CAA

CGA

GCA

AAG

GAA

TGT

TCT

CAA

GCT

CTC

AGT

TTG

ATT

CTG

GAC

778

Arg

Gin

Arg

Ala

Lys

Glu

Cys

Ser

Gin

Ala

Leu

Ser

Leu

íle

Leu

Asp

225

230

235

ATT

GAT

CAC

GGG

AGG

CCA

GTG

ACG

AAT

GTA

CTA

GAT

TTA

GAG

TTT

GAT

826

íle

Asp

His

Gly Arg

Pro

Val

Thr

Asn

Val

Leu

Asp

Leu

Glu

Phe

Asp

240

245

250

255

GTG

GAA

CAG

CTG

AAG

GAC

TCT

ATT

GAT

AGG

GAT

AAA

ATA

GCC

ATT

ATT

Θ74

Val

Glu

Gin

Leu

Lys

Asp

Ser

íle

Asp

Arg

Asp

Lys

íle

Ala

íle

íle

260

265

270

GGA

CAT

TCT

TTT

GGT

GGA

GCC

ACA

GTT

ATT

CAG

ACT

CTT

AGT

GAA

GAC

922

Gly

His

Ser

Phe

Gly

Gly

Ala

Thr

Val

íle

Gin

Thr

Leu

Ser

Glu

Asp

275

2Θ0

285

CAG

AGA

TTC

AGG

TGT

GGC

ATT

GCT

CTG

GAT

GCA

TGG

ATG

TTT

CCC

GTG

970

Gin

Arg

Phe

Arg

Cys

Gly

íle

Ala

Leu

Asp

Ala

Trp

Met

Phe

Pro

Val

290

295

300

GGT

GAT

GAA

GTA

TAT

TCC

AGA

ATT

CCT

CAA

CCC

CTC

TTT

TTT

ATC

AAC

1018

Gly Asp

Glu

Val

Tyr

Ser

Arg

íle

Pro

Gin

Pro

Leu

Phe

Phe

íle

Asn

305

310

315

TCG

GAA

CGA

TTC

CAA

TAC

CCT

TCT

AAT

ATC

ATA

AGA

ATG

AAA

AAA

TGC

1066

Ser

Glu

Arg

Phe

Gin

Tyr

Pro

Ser

Asn

íle

íle

Arg

Met

Lys

Lys

Cys

320

325

330

335

TTC

TTA

CCT

GAT

AGA

GAA

CGA

AAA

ATG

ATT

ACA

ATC

AGG

GGT

TCG

GTC

1114

Phe

Leu

Pro

Asp

Arg

Glu

Arg

Lys

Met

íle

Thr

íle

Arg

Gly

Ser

Val

340

345

350

CAT

CAG

AAT

TTT

GTT

GAC

TTC

ACT

TTT

GCC

ACT

AGC

AAA

ATA

ATT

GGC

1162

His

Gin

Asn

Phe

Val

Asp

Phe

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Lys

íle

íle

Gly

355

360

365

TAC

CTA

TTC

ACA

CTG

AAA

GGA

GAC

ATC

GAT

TCC

AAT

GTA

GCC

ATC

AGC

1210

Tyr

Leu

Phe

Thr

Leu

Lys

Gly

Asp

íle

Asp

Ser

Asn

Val

Ala

íle

Ser

370

375

380

CTT

AGC

AAC

AAA

GCT

TCC

TTA

GCG

TTC

TTA

CAA

AAA

CAT

TTA

GGA

CTT

1258

Leu

Ser

Asn

Lys

Ala

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

Leu

385

390

395

CAG

AAA

GAT

TTT

GAT

CAG

TGG

GAT

TCT

TTA

GTT

GAA

GGC

GAA

GAT

CAC

1306

Gin

Lys

Asp

Phe

Asp

Gin

Trp

Asp

Ser

Leu

Val

Glu

Gly

Glu

Asp

His

400

405

410

415

AAT

CTT

ATT

CCA

GGG

ACC

AAC

ATT

AAC

ACA

ACC

AAC

CAC

CAA

GCC

ATT

1354

Asn

Leu

íle

Pro

Gly

Thr

Asn

íle

Asn

Thr

Thr

Asn

His

Gin

Ala

íle

420

425

430

CTG

CAG

AAC

TCC

ACA

GGA

ATA

GAG

AGA

CCA

AAT

TTA

GAT

T AAAAGAGCTT

1404

Leu

Gin

Asn

Ser

Thr

Gly

íle

Glu

Arg

Pro

Asn

Leu

Asp

435

440

TTTAAAAAGT TTTGTTTACG AACTTGTCTA AAAGTGTGTG TGTGTATGAT TTAAATGTAT 14 64

TTTCTCAAAT AGCTCATATT AAAAAATGTA GGCTATAGCA CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1524 AAAAAAAAA 1533

SK 286518 Β6 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1876 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 468..1734 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 24:

CGGCGGGCTG CTGGCCCTTC CCGGCTGTTC GTAGAGCCGG ATCCTGCAGC GCCCCTGAGA60

CGAACCGCCC CGATGCGGTG CTCCTCAGCG CCACGGGACG CAGCCGGGGC CGGCCGTGTT120

GGCGCAGCTC CCACGACGTA CGCTTCCTTT CCAGGCTCGA GGAAAGCCTC TCCCACAAAC180

ACCGTCCCAG CTGGGAAGTG AGGCGGAGTT TTGGTCCCTC CCCTCCGGCA GCGCCCGGCA240

TTCCGTCCGT CCGTCCGTCC GTCCGTGCGG CGCACGGCGC CCTGCAGAGC CGGGACACCG300

CAGCAGGGTA GGAGGACCCG GAGGTGGTGT GCAGCCACAG GTTTCCATCC TGCCCCCACC360

TCCCGGGGAG CAGCCCTGTG CTATACCCAA CCCCCCGCAC AGAGCACTGA GCCGGCTGCT420

GCCTGCCTGC ACCCCGCCGT GGGACCTTCT GCTCTTCCCA ACAAGTG ATG GCA TCG476

Met Ala Ser

CTG TGG GTG AGA GCC AGG AGG GTG TTC ATG AAA AGT CGT GCT TCA GGT524

Leu Trp Val Arg Ala Arg Arg Val Phe Met Lys Ser Arg Ala SerGly

1015

TTC TCG GCG AAG GCG GCG ACG GAG ATG GGG AGC GGC GGC GCG GAG AAG572

Phe Ser Ala Lys Ala Ala Thr Glu Met Gly Ser Gly Gly Ala GluLys

25 3035

GGC TAT CGG ATC CCC GCC GGG AAG GGC CCG CAC GCC GTG GGC TGC ACG620

Gly Tyr Arg íle Pro Ala Gly Lys Gly Pro His Ala Val Gly CysThr

4550

GAT CTG ATG ACC GGC GAC GCG GCC GAG GGA AGC TTT TTG CGC CTG TAT668

Asp Leu Met Thr Gly Asp Ala Ala Glu Gly Ser Phe Leu Arg LeuTyr

6065

TAC CTA TCG TGT GAC GAC ACA GAT ACT GAA GAG ACA CCC TGG ATT CCA716

Tyr Leu Ser Cys Asp Asp Thr Asp Thr Glu Glu Thr Pro Trp ílePro

7580

GAT AAA GAG TAC TAC CAG GGG CTG TCT GAC TTC CTC AAC GTG TAC CGG764

Asp Lys Glu Tyr Tyr Gin Gly Leu Ser Asp Phe Leu Asn Val TyrArg

9095

GCC CTG GGA GAA AGG CTT TTC CAG TAC TAC GTT GGC TCA GTG ACC TGT812

Ala Leu Gly Glu Arg Leu Phe Gin Tyr Tyr Val Gly Ser Val ThrCys

100 105 110115

CCT GCA AAA TCA AAC GCT GCT TTT AAG CCA GGA GAG AAA TAC CCA CTG8 60

Pro Ala Lys Ser Asn Ala Ala Phe Lys Pro Gly Glu Lys Tyr ProLeu

120 125130

CTC GTT TTT TCC CAT GGA CTT

GGA GCT TTT CGG ACC ATC TAT TCT GCT

908

Leu Val

Phe

Ser 135

His

Gly

Leu

Gly Ala 140

Phe

Arg

Thr

íle Tyr 145

Ser Ala

ATC

TGC

ATA

GAG

ATG

GCT

TCT

CAA

GGC

TTT

CTA

GTG

GCA

GCT

GTG

GAG

956

íle

Cys

íle

Glu

Met

Ala

Ser

Gin

Gly

Phe

Leu

Val

Ala

Ala

Val

Glu

150

155

160

CAC

AGA

GAT

GAA

TCG

GCT

TCA

GCA

ACG

TAT

TTC

TGT

AAA

AAG

AAG

GCT

1004

His

Arg

Asp

Glu

Ser

Ala

Ser

Ala

Thr

Tyr

Phe

Cys

Lys

Lys

Lys

Ala

165

170

175

GAT

TCT

GAG

CCA

GAG

GAG

GAT

CAA

ACA

TCA

GGC

GTG

GAG

AAG

GAG

TGG

1052

Asp

Ser

Glu

Pro

Glu

Glu

Asp

Gin

Thr

Ser

Gly

Val

Glu

Lys

Glu

Trp

180

185

190

195

ATC

TAC

TAC

AGG

AAG

CTC

AGA

GCA

GGA

GAG

GAG

GAG

CGC

TGT

CTG

CGT

1100

íle

Tyr

Tyr

Arg

Lys

Leu

Arg

Ala

Gly

Glu

Glu

Glu

Arg

Cys

Leu

Arg

200

205

210

CAC

AAG

CAG

GTA

CAG

CAG

AGA

GCA

CAG

GAG

TGC

ATC

AAA

GCG

CTC

AAC

1148

His

Lys

Gin

Val

Gin

Gin

Arg

Ala

Gin

Glu

Cys

íle

Lys

Ala

Leu

Asn

215

220

225

CTC

ATT

CTT

AAG

ATC

AGT

TCA

GGA

GAG

GAA

GTG

ATG

AAT

GTG

CTG

AAC

1196

Leu

íle

Leu

Lys

íle

Ser

Ser

Gly

Glu

Glu

Val

Met

Asn

Val

Leu

Asn

230

235

240

TCA

GAC

TTT

GAC

TGG

AAC

CAC

CTG

AAG

GAT

TCT

GTT

GAT

ACT

AGC

AGA

1244

Ser

Asp

Phe

Asp

Trp

Asn

His

Leu

Lys

Asp

Ser

Val

Asp

Thr

Ser

Arg

245

250

255

ATA

GCT

GTG

ATG

GGA

CAC

TCT

TTT

GGT

GGT

GCT

ACA

. GTT

ATT

1 GAG

AGC

1292

íle

Ala

Val

Met

Gly

His

Ser

Phe

Gly

Gly

Ala

Thr

Val

íle

: Glu

Ser

260

265

270

275

CTC

AGC

AAA

GAA

ATT

AGA

TTT

AGG

TGT

GGC .

ATT

GCC

CTT

GAT ‘

GCG TGG

1340

Leu

Ser

Lys

Glu

íle

Arg

Phe

Arg

Cys

Gly

íle .

Ala

Leu .

Asp Ala Trp

280

285

290

ATG

CTC

CCG

GTA

GGC

GAT

GAC

ACT

TAC

CAA

AGC

AGT

GTG

CAG ’

CAA CCA

1388

Met

Leu

Pro

Val

Gly Asp

Asp

Thr

Tyr

Gin

Ser

Ser

Val

Gin

Gin Pro

295

300

305

CTG

CTC

TTT

ATT

AAT

TCC

GAA

AAA

TTC

CAG

TGG

GCT

GCC

AAT .

ATC TTA

1436

Leu

Leu

Phe

íle

Asn

Ser

Glu

Lys

Phe

Gin

Trp

Ala

Ala

Asn

íle Leu

310

315

320

AAG

ATG

AAG

AAG

CTT

AGC

TCC

AAT

GAT

ACC

AAC

AAG

AAA

ATG

ATC ACC

1484

Lys

Met

Lys

Lys

Leu

Ser

Ser

Asn

Asp

Thr

Asn

Lys

Lys

Met

íle Thr

325

330

335

ATC

AAA

GGA

TCG

GTA

CAT

CAG

AGC

TTT

CCT

GAT

TTT

ACT

TTT

GTG AGT

1532

íle

Lys

Gly

Ser

Val

His

Gin

Ser

Phe

Pro

Asp

Phe

Thr

Phe

Val Ser

340

345

350

355

GGA

GAA

ATC

ATT

GGA

AAG

TTT

TTC

AAG

TTA

AAA

GGA

GAA

ATA

GAC CCA

1580

Gly

Glu

íle

íle

Gly

Lys

Phe

Phe

Lys

Leu

Lys

Gly

Glu

íle

Asp Pro

360

365

370

AAT

GAA

GCT

ATT

GAT

ATA

TGC

AAC

CAC

GCT

TCA

TTG

GCC

TTC

CTG CAG

1628

Asn

Glu

Ala

íle

Asp

íle

Cys

Asn

His

Ala

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu Gin

375 380 385

SK 286518 Β6

AAA Lys

CAT CTG AGT

CTT AAG AGA GAT TTT

GAT AAG

TGG GAT TCA CTC

GTG Val

1676

His

Leu 390

Ser

Leu

Lys

Arg

Asp 395

Phe

Asp

Lys

Trp Asp 400

Ser

Leu

GAT

GGC

ATA

GGA

CCC

AAT

GTT

ATT

TCT

GGT

ACC

AAT

ATC

GAC

TTA

TCT

1724

Asp

Gly

íle

Gly

Pro

Asn

Val

íle

Ser

Gly

Thr

Asn

íle

Asp

Leu

Ser

405

410

415

CCA ACT GAG T AAGGAGTACA AGAAGTACTG CAAAGGCCAC CAGCAGCAGG 1774

Pro Thr Glu

420

ACACCAACGT TGGCCACACA TTGCTTGGAG CTGAGATAGC ACTGGCCTCC CACACAGCTT 1Θ34

TTGGAGTGTG AAACAACAAA AAAAAAAATC ACAGGGGAGC CG (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 517 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 2..514 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 25:

G GGG CAT TCT TTT GGA GGA GCA ACA GTT TTT CAA GCC CTA AGT GAA

Gly His Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Phe Gin Ala Leu Ser Glu 15 10 15

1876

GAC CAG AGA TTC AGA

TGT Cys

GGG ATT GCC CTT GAT CCG

TGG Trp

ATG Met

TTT· Phe 30

CCC Pro

Asp

Gin

Arg

Phe

Arg 20

Gly

íle

Ala

Leu Asp 25

Pro

GTG

AGT

GAG

GAG

CTG

TAC

TCC

AGA

GTT

CCT

CAG

CCT

CTC

TTC

TTT

ATC

Val

Ser

Glu

Glu

Leu

Tyr

Ser

Arg

Val

Pro

Gin

Pro

Leu

Phe

Phe

íle

35

40

45

AAC

TCT

GCC

GAA

TTC

CAG

ACT

CCA

AAG

GAC

ATT

GCA

AAA

ATG

AAA

AAC

Asn

Ser

Ala

Glu

Phe

Gin

Thr

Pro

Lys

Asp

íle

Ala

Lys

Met

Lys

Asn

50

55

60

TTC

TAC

CAG

CCT

GAC

AAG

GAA

AGG

AAA

ATG

ATT

ACG

ATC

AAG

GGC

TCA

Phe

Tyr

Gin

Pro

Asp

Lys

Glu

Arg

Lys

Met

íle

Thr

íle

Lys

Gly

Ser

65

70

75

GTG

CAC

CAG

AAT

TTT

GCT

GAC

GGG

ACT

TTT

GTA

ACT

GGC

AAA

ATA

ATT

Val

His

Gin

Asn

Phe

Ala

Asp

Gly

Thr

Phe

Val

Thr

Gly

Lys

íle

íle

80

85

90

95

GGA

AAC

AAG

CTG

TCA

CTG

AAA

GGA

GAC

ATA

GAC

TCC

AGA

GTT

GCC

ATA

Gly

Asn

Lys

Leu

Ser

Leu

Lys

Gly

Asp

íle

Asp

Ser

Arg

Val

Ala

íle

100

105

110

GAC

CTC

ACC

AAC

AAG

GCT

TCC

TTG

GCT

TTC

TTA

CAA

AAA

CAT

TTA

GGA

Asp

Leu

Thr

Asn

Lys

Ala

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Gin

Lys

His

Leu

Gly

115

120

125

CTT

CAT

AAA

GAC

TTT

GAT

CAG

TGG

GAC

TGT

CTG

GTG

GAG

GGA

GAG

AAC

Leu

His

Lys

Asp

Phe

Asp

Gin

Trp

Asp

Cys

Leu

Val

Glu

Gly

Glu

Asn

130

135

140

142

190

238

286

334

382

430

SK 286518 Β6

GAG AAC CTC ATC

CCG GGG TCA CCC TTT GAT GTA GTC ACC CAG TCC CCG

478

Glu Asn Leu 145

íle

Pro Gly

Ser Pro 150

Phe Asp

Val Val 155

Thr

Gin

Ser

Pro

GCT

CTG

CAG

AGT

TCT

CCC

GGA

TCA

CAC

AAC

CAG

AAT

TAG

517

Ala

Leu

Gin

Ser

Ser

Pro

Gly

Ser

His

Asn

Gin

Asn

160

165

170

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 580 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTENIE: 1..580 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 26:

CAA

GTA

CTG

ATG

GCT

GCT

GCA

AGC

TTT

GGC

GAA

CGT

AAA

ATC

CCT

AAG

48

Gin

Val

Leu

Met

Ala

Ala

Ala

Ser

Phe

Gly

Glu

Arg

Lys

íle

Pro

Lys

1

5

10

15

GGA Gly

AAT GGG

CCT TAT Pro Tyr 20

TCC GTT

GGT TGT ACA GAC

TTA ATG TTT GAT

TAC Tyr

96

Asn

Gly

Ser

Val

Gly Cys 25

Thr

Asp

Leu

Met Phe 30

Asp

ACT

AAA

AAG

GGC

ACC

TTC

TTG

CGT

TTA

TAT

TAT

CCA

TCC

CAA

GAT

GAT

144

Thr

Lys

Lys

Gly

Thr

Phe

Leu

Arg

Leu

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Gin

Asp Asp

35

40

45

GAT

CGC

CTT

GAC

ACC

CTT

TGG

ATC

CCA

AAT

AAG

GAG

TAT

TTT

TGG

GGT

192

Asp

Arg

Leu

Asp

Thr

Leu

Trp

íle

Pro

Asn

Lys

Glu

Tyr

Phe

Trp

Gly

50

55

60

CTT

AGC

AAG

TAT

CTT

GGA

AAA

CAC

TGG

CTT

ATG

GGC

AAC

ATT

TTG

AGT

240

Leu

Ser

Lys

Tyr

Leu

Gly

Lys

His

Trp

Leu

Met

Gly

Asn

íle

Leu

Ser

65

70

75

80

TTA

CTC

TTT

GGT

TCA

GTG

ACA

ACT

CCT

GCA

AAC

TGG

AAT

TCC

CCT

CTG

288

Leu

Leu

Phe

Gly

Ser

Val

Thr

Thr

Pro

Ala

Asn

Trp

Asn

Ser

Pro

Leu

85

90

95

AGG

CCT

GGT

GAA

AAA

TAC

CCA

CTT

GTT

GTT

TTT

TCT

CAT

GGT

CTT

GGA

336

Arg

Pro

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pro

Leu

Val

Val

Phe

Ser

His

Gly

Leu

Gly

100

105

110

GCA

TTC

AGG

ACA

ATT

TAT

TCT

GCT

ATT

GGC

ATT

GAC

CTG

GCA

TCT

CAT

384

Ala

Phe

Arg

Thr

íle

Tyr

Ser

Ala

íle

Gly

íle

Asp

Leu

Ala

Ser

His

115

120

125

GGG

TTT

ATA

GTT

GCT

GCT

GTA

GAA

CAC

AGA

GAT

AGA

TCT

GCA

TCT

GCA

432

Gly

Phe

íle

Val

Ala

Ala

Val

Glu

His

Arg

Asp

Arg

Ser

Ala

Ser

Ala

130

135

140

ACT

TAC

TAT

TTC

AAG

AAC

CAA

TCT

GCT

GCA

GAA

ATA

GGG

AAA

AAG

TCT

480

Thr

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Asn

Gin

Ser

Ala

Ala

Glu

íle

Gly

Lys

Lys

Ser

145 150 155 160

TGG CTC TAC CTT AGA ACC CTG AAA GAA GAG GAG GAG

ATA CAT ATA CGA

528

Trp

Leu

Tyr Leu

Arg Thr 165

Leu

Lys

Glu

Glu 170

Glu Glu

íle

His

íle 175

Arg

AAT

AAG

CAG

GTA

CGA

CAA

AGA

GCA

AAA

GAA

TGT

TCC

CAA

GCT

CTC

AGT

576

Asn

Lys

Gin

Val

Arg

Gin

Arg

Ala

Lys

Glu

Cys

Ser

Gin

Ala

Leu

Ser

180

185

190

CTG A

580

Leu (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 5 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 27:

Gly Xaa Ser Xaa Gly

5 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 28:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 41 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ň) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 28:

TATTCTAGAA TTATGATACA AGTATTAATG GCTGCTGCAA G ⁴¹ (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 29:

ATTGATATCC TAATTGTATT TCTCTATTCC TG 32 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1335 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 30:

ATGGTACCCC CAAAGCTGCA CGTCCTGTTT TGTCTGTGTG GATGTCTCGC CGTCGTGTAC

CCCTTCGATT GGCAGTATAT CAACCCCGTG GCTCACATGA AGAGCAGCGC

CTGGGTGAAT

120

AAGATCCAGG TGCTCATGGC CGCACCAAGC TTCGGTCAGA CCAAGATTCC

TAGAGGCAAC

180

CACCGATCTG ATGTTCGACC ATACCAACAA AGGAACTTTT

GGCCCCTACA GCGTGGGCTG

240

CTGAGACTGT	ACTACCCCAG	CCAGGACAAC	GACAGACTGG	ATACTCTGTG	GATCCCAAAT	300
AAAGAATATT	TTTGGGGTCT	TAGCAAATTT	CTTGGAACAC	ACTGGCTTAT	GGGCAACATT	360
TTGAGGTTAC	TCTTTGGTTC	AATGACAACT	CCTGCAAACT	GGAATTCCCC	TCTGAGGCCT	420
GGTGAAAAAT	ATCCACTTGT	TGTTTTTTCT	CATGGTCTTG	GGGCATTCAG	GACACTTTAT	480
TCTGCTATTG	GCATTGACCT	GGCATCTCAT	GGGTTTATAG	TTGCTGCTGT	AGAACACAGA	540
GATAGATCTG	CATCTGCAAC	TTACTATTTC	AAGGACCAAT	CTGCTGCAGA	AATAGGGGAC	600
AAGTCTTGGC	TCTACCTTAG	AACCCTGAAA	CAAGAGGAGG	AGACACATAT	ACGAAATGAG	660
CAGGTACGGC	AAAGAGCAAA	AGAATGTTCC	CAAGCTCTCA	GTCTGATTCT	TGACATTGAT	720
CATGGAAAGC	CAGTGAAGAA	TGCATTAGAT	TTAAAGTTTG	ATATGGAACA	ACTGAAGGAC	780
TCTATTGATA	GGGAAAAAAT	AGCAGTAATT	GGACATTCTT	TTGGTGGAGC	AACGGTTATT	840
CAGACTCTTA	GTGAAGATCA	GAGATTCAGA	TGTGGTATTG	CCCTGGATGC	ATGGATGTTT	900
CCACTGGGTG	ATGAAGTATA	TTCCAGAATT	CCTCAGCCCC	TCTTTTTTAT	CAACTCTGAA	960
TATTTCCAAT	ATCCTGCTAA	TATCATAAAA	ATGAAAAAAT	GCTACTCACC	TGATAAAGAA	1020
AGAAAGATGA	TTACAATCAG	GGGTTCAGTC	CACCAGAATT	TTGCTGACTT	CACTTTTGCA	1080
ACTGGCAAAA	TAATTGGACA	CATGCTCAAA	TTAAAGGGAG	ACATAGATTC	AAATGTAGCT	1140
ATTGATCTTA	GCAACAAAGC	TTCATTAGCA	TTCTTACAAA	AGCATTTAGG	ACTTCATAAA	1200
GATTTTGATC	AGTGGGACTG	CTTGATTGAA	GGAGATGATG	AGAATCTTAT	TCCAGGGACC	1260
AACATTAACA	CAACCAATCA	ACACATCATG	TTACAGAACT	CTTCAGGAAT	AGAGAAATAC	1320
AATTAGGATT	CTAGA					1335

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (19)

1. Purifikovaný a izolovaný polypeptidový fragment ľudskej plazmovej acetylhydrolázy doštičkyaktivujúceho faktora (PAF-AH), ktorému chýba až prvých dvanásť N-koncových aminokyselín zrelej ľudskej PAF-AH aminokyselinovej sekvencie uvedenej v SEQ ID NO:8.

10

2. Polypeptidový fragment PAF-AH podľa nároku 1, vybraný zo skupiny skladajúcej sa z

a) polypeptidu, ktorý má Mct_4;, SEQ ID NO: 8 ako počiatočnú N-koncovú aminokyselinu,

b) polypeptidu, ktorý má Ala₄₇ SEQ 1D NO: 8 ako počiatočnú N-koncovú aminokyselinu,

c) polypeptidu, ktorý má Ala₄₈ SEQ ID NO; 8 ako počiatočnú N-koncovú aminokyselinu.

3. Polypeptidový fragment PAF-AH podľa nároku 1 alebo 2, ktorému chýba až 30 C-koncových amino15 kyselín aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO:8.

4. Polypeptidový fragment PAF-AH podľa nároku 1 alebo 2, ktorý má ako svoj C-koncový zvyšok, zvyšok SEQ ID NO:8 vybraný zo skupiny skladajúcej sa z:

a) Ile₄₂₉

b) Ľeu_43] a

c) Asumi.

5. Ľudský polypeptidový fragment PAF-AH obsahujúci Met₄₆ SEQ ID NO: 8 ako N-koncový zvyšok a Ile₄₂₉ alebo Asuhi ako C-koncový zvyšok.

6. Variantný polypeptidový fragment PAF-AH podľa nároku 1, ktorý vykazuje v sekvencií SEQ ID NO: 8 náhradu aminokyseliny, vybranú zo skupiny skladajúcej sa z

a) S 108 A

b) S 273 A

c) D 286 A

d) D 286 N

e) D 296 A

f) D 304 A

g) D 338 A

h) H 351 A

i) H 395 A

j) H 399 A

k) C 67 S

l) C 229 S

m) C 291 S

n) C 334 S a

o) C 407 S.

7. Variantný ľudský polypeptid PAF-AH, ktorý vykazuje v sekvencií SEQ ID NO: 8 náhradu aminokyseliny, vybranú zo skupiny skladajúcej sa z

a) D 286 A

b) D 286 N a

c) D 304 A.

8. Izolovaný polynukleotid kódujúci polypeptidový fragment PAF-AH, jeho variant alebo variantný fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, 6 alebo 7.

9. Izolovaný polynukleotid kódujúci ľudský fragment PAF-AH alebo variantný fragment vykazujúci Met46 v SEQ ID NO: 8, ako N-koncový zvyšok, a Ile429 alebo Asn441, ako C-koncový zvyšok.

10. Polynukleotid podľa nároku 8 alebo 9, ktorým je DNA.

11. DNA vektor obsahujúci DNA podľa nároku 10.

12. Hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekované DNA podľa nároku 10 spôsobom, ktorý' umožní v tejto hostiteľskej bunke expresiu PAF-AH polypeptidového fragmentu, jeho variantu alebo variantného fragmentu.

13. Spôsob produkcie polypeptidového fragmentu PAF-AH, jeho variantu alebo variantného fragmentu plazmového PAF-AH podľa niektorého z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že sa pestuje hostiteľská bunka podľa nároku 12 vo vhodnom živnom médiu a izoluje sa PAF-AH fragment, jeho variant alebo variantný fragment z buniek alebo ich rastového média.

14. Polypeptidový fragment PAF-AH, jeho variant alebo variantný fragment produkovaný spôsobom podľa nároku 13.

15. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje fragment PAF-AH, jeho variant alebo variantný fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7 alebo 14 a farmaceutický prijateľné riedidlo, adjuvans alebo nosič.

16. Polypeptidový fragment PAF-AH, jeho variant alebo variantný fragment podľa niektorého z nárokov 1 až 7 alebo 14 a farmaceutická kompozícia podľa nároku 15 na použitie pri liečení cicavca susceptibilného k PAF-mediovanému patologickému stavu alebo postihnutého týmto stavom, pričom množstvo PAF-AH produktu alebo farmaceutickej kompozície postačuje na doplnenie PAF-AH aktivity a inaktiváciu patologických účinkov PAF pri cicavcovi.

17. Polypeptidový fragment PAF-AH, jeho variant alebo variantný fragment alebo farmaceutická kompozícia podľa nároku 16, kde patologickým stavom je pleurísia, astma, rinitída, nekrotizačná enterokolitida, syndróm akútneho respiračného distresu, akútna pankreatitida, reperfuzne poškodenie, septikémia, predčasný pôrod alebo neurologická choroba spojená s infekciou HIV.

18. Použitie polypeptidového fragmentu PAF-AH, jeho variantu alebo variantného fragmentu podľa niektorého z nárokov 1 až 7 alebo 14 alebo farmaceutickej kompozície podľa nároku 15 na výrobu liečiva na liečenie cicavca susceptibilného k PAF-mediovanému patologickému stavu alebo postihnutého týmto stavom, pričom množstvo liečiva postačuje na doplnenie PAF-AH aktivity a inaktiváciu patologických účinkov PAF pri cicavcovi.

SK 286518 Β6

19. Použitie podľa nároku 18, kde liečivo je určené na liečenie cicavca susceptibilného k pleurisii, astme, rinitíde, nekrotizačnej enterokolitide, syndrómu akútneho respiračného distresu, akútnej pankreatitlde, reperfuznemu poškodeniu, septikémii, predčasnému pôrodu alebo neurologickej chorobe spojenej s infekciou Hl V alebo postihnutého niektorým z týchto stavov.