PL190532B1

PL190532B1 - Oczyszczone i izolowane fragmenty polipeptydu ludzkiej osoczowej acetylohydrolazy czynnika aktywującego płytki (PAF-AH), odmiana fragmentu polipeptydu PAF-AH, odmiana polipeptydu ludzkiej PAF-AH, izolowany polinukleotyd, wektor DNA, komórka gospodarza, sposób wytwarzania fragmentu, odmiany fragmentu albo fragmentu odmiany polipeptydu PAF-AH, kompozycja farmaceutyczna, fragment polipeptydowy PAF-AH jego odmiana lub odmiana fragmentu albo kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w sposobie leczenia i zastosowanie do wytwarzania leku

Info

Publication number: PL190532B1
Application number: PL97332833A
Authority: PL
Inventors: Lawrence S. Cousens; Christine D. Eberhardt; Patrick Gray; Hai Le Trong; Larry W. Tjoelker; Cheryl L. Wilder
Original assignee: Icos Corp
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2005-12-30
Also published as: SK47399A3; EP0948605A1; WO1999009147A1; CA2267994A1; HUP9903959A2; PL332833A1; IL173867A0; NO991717L; NO326968B1; AU751594B2; HUP9903959A3; SK286518B6; AU3978297A; IL129262A0; CA2267994C; IL129262A; BR9711882A; JP2001502163A; CZ124199A3; NO991717D0

Abstract

1. Oczyszczony i izolowany fragment polipeptydu ludzkiej osoczowej acetylohydrola- zy czynnika aktywujacego plytki (PAF-AH), pozbawiony do 12 pierwszych aminokwasów konca N dojrzalej sekwencji aminokwasowej ludzkiej PAF-AH podanej w Id. Sekw. nr 8. 2. Fragment polipeptydu PAF-AH wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jest wybrany z grupy obejmujacej: (a) polipeptydy majace Met4 6 jako poczatkowy aminokwas konca Nw Id. Sekw. nr 8; (b) polipeptydy majace Ala47 jako poczatkowy aminokwas konca N w Id. Sekw. nr 8; (c) polipeptydy majace Ala48 jako poczatkowy aminokwas konca N w Id. Sekw. nr 8. 3. Fragment polipeptydu PAF-AH wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze jest pozbawiony do 30 aminokwasów konca C sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 8. .. 14. Sposób wytwarzania fragmentu polipeptydu PAF-AH, odmiany fragmentu albo fragmentu odmiany osoczowej PAF-AH, znamienny tym, ze obejmuje hodowanie komórki gospodarza okreslonej w zastrz. 13, w odpowiedniej pozywce i izolowanie fragmentu PAF-AH, odmiany fragmentu albo fragmentu odmiany z komórki albo pozywki, w której byla hodowana. 15. Kompozycja farmaceutyczna zawierajaca substancje czynna oraz farmaceutycznie dopuszczalny rozcienczalnik, adiuwant albo nosnik, znamienna tym, ze jako substancje czynna zawiera fragment PAF-AH, odmiane fragmentu albo fragment odmiany okreslone, w którymkolwiek z zastrz. 1 albo 5, albo 6, albo 7, albo fragment wytworzony sposobem okreslonym w zastrz. 14. PL

Description

Przedmiotem wynalazku są oczyszczone i izolowane fragmenty polipeptydu ludzkiej osoczowej acetylohydrolazy czynnika aktywującego płytki (PAF-AH), odmiana fragmentu polipeptydu PAF-AH, odmiana polipeptydu ludzkiej PAF-AH, izolowany Polinukleotyd, wektor DNA, komórka gospodarza, sposób wytwarzania fragmentu, odmiany fragmentu albo fragmentu odmiany polipeptydu PAF-AH, kompozycja farmaceutyczna, fragment polipeptydowy PAF-AH jego odmiana lub odmiana fragmentu albo kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w sposobie leczenia i zastosowanie do wytwarzania leku.

190 532

Czynnik aktywujący płytki (PAF) jest biologicznie czynnym fosfolipidem syntetyzowanym przez różne rodzaje komórek. In vivo i w normalnych stężeniach od 10'¹⁰ do 10‘$ M, PAF aktywuje komórki docelowe takie jak płytki i neutrofile przez wiązanie ze swoistymi receptorami powierzchniowymi sprzęgniętymi z białkiem G (Venable i in., J. Lipid Res., 34:691-701 (1993)). PAF ma budowę 1-0-alkilo-2-acetvlo-sn-glicerolo-3-fosfoc.holiny. Dla optymalnej aktywności biologicznej, pozycja sn-1 szkieletu glicerolowego PAF musi być w wiązaniu eterowym z alkoholem tłuszczowym zaś pozycja sn-3 musi mieć grupę „głowy” fosfocholiny.

PAF działa w normalnych procesach fizjologicznych (np. w stanie zapalnym, hemostazie i porodzie) oraz związany jest z patologiczną reakcją zapalną (np. w astmie, anafilaksji, wstrząsie septycznym i zapaleniu stawów) (Venable i in., wyżej i Lindsberg i in., Ann. Neurol., 30:117-129 (1991)). Prawdopodobieństwo związku PAF z reakcjami patologicznymi spowodowało próby modulacji aktywności PAF, zaś głównym celem tych wysiłków było opracowanie antagonistów aktywności PAF, które zakłócają wiązanie PAF z receptorami powierzchniowymi PAF. Patrz, przykładowo, Heuer i in., Clin. Exp. Allergy 22:980-983 (1992).

Wydaje się, ze synteza i wydzielanie PAF, jak również jego degradacja i usuwanie są ściśle kontrolowane. Do zakresu, przy którym patologiczne działanie zapalne PAF wynikają z zaburzenia mechanizmów regulatorowych PAF dających początek nadmiernemu wytwarzaniu, niewłaściwemu wytwarzaniu albo brakowi degradacji, alternatywne sposoby modulowania aktywności PAF obejmują naśladowanie albo wspomaganie naturalnych procesów, dzięki którym zachodzi stan zapailny. Opisano, że makrofagi (Stafforini i in,. J. Biol. Chem. 265(17):9682-9687 (1990)), hepatocyty i komórki ludzkiej linii raka wątroby HepG2 (Satoh i in., J. Clin. Invest. 87:476-481 (1991) iTarbet i in., J. Biol. Chem. 266(25): 16667-16673 (1991)) wydzielają aktywność enzymatyczną, acetylohydrolazę PAF (PAF-AH), która reaktywuje PAF. Oprócz inaktywacji PAF, PAF-AH reaktywuje również oksydacyjnie fragmentowane fosfolipidy, takie jak produkty kaskady kwasu arachidonowego, które pośredniczą w powstawaniu stanu zapalnego. Patrz, Stremler i in., J. Biol. Chem. 266(17): 11095-1103 (1991). Inaktywacja PAF przez PAF-AH zachodzi głównie na drodze hydrolizy grup acetylowych sn-2 PAF, zaś PAF-AH metabolizuje oksydacyjnie fragmentowane fosfolipidy przez usunięcie grup sn-2 acylowych. Zidentyfikowano dwa rodzaje PAF-AH: postać cytoplazmatyczną spotykaną w wielu rodzajach komórek i tkanek, takich jak komórki śródbłonka i erytrocyty, oraz postać zewnątrzkomórkową spotykaną w osoczu i surowicy. Osoczowa PAF-AH nie hydrolizuje całych fosfolipidów z wyjątkiem PAF, i ten substrat umożliwia enzymowi krążenie in vivo w stanie pełnej aktywności bez objawów niepożądanych. Osoczowa PAF-AH wydaje się przyczyniać do degradacji całości PAF we krwi ludzkiej in vivo (Stafforini i in., J. Biol. Chem. 262(9):4223-4230 (1987)).

O ile poslać cytoplazmalyczna i osoczowa PowaAH wydaje yię posiędać ię samą swoistość substratową, osoczcwo PAF-AH ma charakterystykę biochemiczną, która odróżniają od cytcplacmotyccnaj PAF-AH i innych scharakteryzowanych lipaz. Konkretnie, osobowa PAF-AH związana jest z cząstkami ^opratem, jest hamowana dilccarcpyloflucrof'osforonem, nie wpływają na nią jony wapnia, jest względnie niewrażliwa na arctecllzą i ma ciężar cząsteczkowy rzędu 43 kDa. Patrz, Stoffcrini i in., (1987) wyżej. Ten sam artykuł Stafforini i in., opisuje procedurę częściowego oczyszczania PAF-AH z ludzkiego osocza oraz skład οοϊ^kwasowy materiału osobowego otrzymanego tą procedurą. Cytcplacmotvccną PAF-AH oczyszczono z erytrocytów, jak to opisali Stafforini i in., J. Biol. Chem. 262(9):4223-4230 (1987) oraz opisano sekwencję 10 aminokwasów końca aminowego. Hattori i in., J. Biol. Chem. 262(15):18748-18753 (1993) opisują oczyszczanie cytoplacmotyccnej PAF-AH z mózgu bydła. Po zgłoszeniu macierzystego zgłoszenia patentowego, sekwencję ominckwosową cytoalapmatycznej PAF-AH z mózgu opisano w Hattori i in., J. Biol. Chem. 269(237): :23150-23155 (1994). 5 stycznia 1995, trzy miesiące po zgłoszeniu zgłoszenia maciarzystagc sekwencję nukleotydową fosfollpępz A2 związanej z llpcarotainą (Lp-PLA?) opublikowano w publikacji międzynarodowej (PCT) SmithKline Beecham PLC nr WO 95/00649. Sekwencja nukleotydową Lp-PLA2 różni się od PAF-AH w jednej pozycji sekwencji nukleotydowej. Różnica nukleotydową (odpowiadająca pozycji 1297 Id. Sekw. nr 7) daje różnicę

190 532 aminokwasową w enzymach kodowanych przez polinukleotydy. Aminokwasem w pozycji 379 Id. Sekw. nr 8 jest walina, podczas gdy aminokwasem w odpowiedniej pozycji Lp-PLA2 jest alanina. Oprócz tego, sekwencja nukleotydowa PAF-AH według wynalazku obejmuje 124 zasady na końcu 5' i 20 zasad na końcu 3' nie występujące w sekwencji Lp-PLA2. Zdeponowana trzy miesiące później, 10 kwietnia 1995, w GenBank pod numerem dostępu U24577 sekwencja Lp-PLA2, różniła się w 11 pozycjach z sekwencją nukleotydową PAF-Ah według wynalazku. Różnice nukleotydowe (odpowiadające pozycjom 79, 81, 84, 85, 86, 121, 122, 904, 905, 911, 983 i 1327 Id. Sekw. nr 7) dały 4 różnice aminokwasowe w enzymach kodowanych przez polinukleotydy. Aminokwasami w pozycjach 249, 250, 274 i 389 Id. Sekw. nr 8 były, odpowiednio, lizyna, kwas asparaginowy, fenyloalanina i leucyna, podczas gdy odpowiednimi aminokwasami odpowiednich pozycji w sekwencji GenBank były izoleucyna. arginina, leucyna i seryna.

Rekombinacyjne wytwarzanie PAF-AH umożliwia zastosowanie egzogennej PAF-AH do naśladowania albo wspomagania normalnych procesów leczenia stanów zapalnych in vivo. Podawanie PAF-AH powinno dostarczyć fizjologicznych zalet nad podawaniem antagonistów receptorów PAF, ponieważ PAF-AH jest produktem normalnie spotykanym w osoczu. Ponadto, ponieważ antagoniści receptorów PAF, którzy są strukturalnie spokrewnieni z PAF hamują natywną aktywność PAF-AH, pożądany metabolizm PAF i oksydatywnie fragmentowanych fosfolipidów jest zahamowany. Tak więc, zahamowanie aktywności PAF-AH przez antagonistów receptorów PAF przeciwdziała kompetycyjnej blokadzie receptorów PAF przez antagonistów. Patrz, Stremler i in., wyżej. Oprócz tego, w miejscu ostrego stanu zapalnego, przykładowo, uwalnianie utleniaczy powoduje inaktywację natywnego enzymu PAF-AH powodując z kolei podwyższony miejscowo poziom PAF i związków pokrewnych z PAF, które współzawodniczą z każdym zewnątrzpochodnym antagonistą receptora PAF o wiązanie z receptorem PAF. W przeciwieństwie, leczenie rekombinowana PAF-AH powinno wspomóc endogenną aktywność PAF-AH i kompensować jakikolwiek inaktywowany endogenny enzym.

Stąd, istnieje potrzeba identyfikacji i izolacji sekwencji polinukleotydowych kodujących ludzką osoczową PAF-AH, opracowania materiałów i metod przydatnych do rekombinacyjnego wytwarzania PAF-AH oraz wytworzenia reagentów do wykrywania PAF-AH w osoczu.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony i izolowany fragment polipeptydu ludzkiej osoczowej acetylohydrolazy czynnika aktywującego płytki (PAF-AH), pozbawiony do 12 pierwszych aminokwasów końca N dojrzałej sekwencji aminokwasowej ludzkiej PAF-AH podanej w Id. Sekw. nr 8.

W korzystnym wykonaniu wynalazku fragment polipeptydu PAF-AH jest wybrany z grupy obejmującej:

(a) polipeptydy mające Mety jako początkowy aminokwas końca N w Id. Sekw. nr 8;

(b) polipeptydy mające Ala47 jako początkowy aminokwas końca N w Id. Sekw. nr 8;

(c) polipeptydy mające Ala.48 jako początkowy aminokwas końca N w Id. Sekw. nr 8.

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku fragment polipeptydu PAF-AH pozbawiony jest do 30 aminokwasów końca C sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 8, korzystniej reszta końca C Id. Sekw. nr 8 jest wybrana z grupy obejmującej: (a) Ile429, (b) Leu43i, i (c) Asn441.

Wynalazek dotyczy również fragmentu polipeptydu ludzkiej PAF-AH, który ma Mety jako aminokwas końca N w Id. Sekw. nr 8 i Ile429 Iub Asn441 jako aminokwas końca C.

Wynalazek obejmuje także odmianę fragmentu polipeptydu PAF-AH charakteryzującą się tym, że ma zastąpienie w sekwencji o Id. Sekw. nr 8 wybrane z grupy obejmującej: (a) S108A, (b) S273A, (c) D286A, (d) D286N, (e) D296A, (f) D304A, (g) D338A, (h) H351A, (i) H395A, (j) H399A, (k) C67S, (l) C229S, (m) C291S, (n) C334S, i (o) C407S.

W zakres wynalazku wchodzi również odmiana polipeptydu ludzkiej PAF-AH, która ma zastąpienie aminokwasowe w sekwencji Id. Sekw. nr 8 wybrane z grupy obejmującej: (a) D286A, (b) D286N, i (c) D304A.

Przedmiotem wynalazku jest też izolowany Polinukleotyd kodujący fragment polipeptydu PAF-AH, odmianę fragmentu albo fragment odmiany według wynalazku, korzystnie jest to DNA.

190 532

W innym wykonaniu wynalazku izolowany polinukleotyd kodujący fragment ludzkiej PAF-AH albo odmianę fragmentu zawiera Met4₆ w Id. Sekw. nr 8 jako resztę końca N i Ile₄₂9 albo Asri44i jako resztę końca C, korzystnie jest to DNA.

Częścią wynalazku są też nowe oczyszczone i wyizolowane polinukleotydy (tj. nici sensowne i nonsensowne DNA i RNA), kodujące ludzką osoczową PAF-AH albo jej fragmenty enzymatyczne. Korzystne sekwencje DNA według wynalazku obejmują sekwencje genomowe i cDNA jak również całkowicie albo częściowo chemicznie zsyntetyzowane sekwencje DNA. Bierze się też pod uwagę sekwencje DNA kodujące PAF-AH podane w Id. Sekw. nr 7 i sekwencje DNA, które hybrydyzują z ich nićmi niekodującymi w standardowych surowych warunkach albo które hybrydyzują z powodu redundancji kodu genetycznego, oraz również repliki biologiczne (tj. kopie izolowanych sekwencji DNA wytworzonych in vivo albo in vitro} sekwencji DNA według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor DNA obejmujący DNA według wynalazku.

W autonomicznie replikujących konstrukcjach rekombinacyjnych takich jak plazmidowe i wirusowe wektory DNA obejmujące sekwencje PAF-AH, a zwłaszcza wektory, w których DNA PAF-AH jest połączony funkcjonalnie z endogennymi albo egzogennymi sekwencjami kontrolującymi DNA i terminatorami transkrypcji.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza stabilnie transformowana albo transfekowana DNA według wynalazku w sposób umożliwiający ekspresję w komórce gospodarza fragmentu polipeptydu PAF-AH, odmiany fragmentu albo fragmentu odmiany.

Komórkami gospodarza mogą być prokariotyczne albo eukariotyczne komórki, które stabilnie transformuje się sekwencjami DNA według wynalazku w sposób umożliwiający wyrażanie pożądanej PAF-AH. Komórki gospodarza wyrażające produkt PAF-AH mogą służyć do wielu użytecznych celów. Komórki takie stanowią wartościowe źródło immunogenu do opracowania substancji o aktywności przeciwciał swoiście reagujących z PAF-AH. Komórki gospodarza według wynalazku są przydatne w sposobach wytwarzania PAF-AH na wielką skalę, w których komórki hoduje się w odpowiedniej pożywce hodowlanej, zaś pożądany produkt polipeptydowy izoluje się z komórek albo z pożywki, w której hoduje się komórki przez, przykładowo, oczyszczanie przez powinowactwo immunologiczne.

Stąd kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania fragmentu polipeptydu PAF-AH, odmiany fragmentu albo fragmentu odmiany osoczowej PAF-AH, który obejmuje hodowanie komórki gospodarza według wynalazku, w odpowiedniej pożywce i izolowanie fragmentu PAF-AH, odmiany fragmentu albo fragmentu odmiany z komórki albo pożywki, w której była hodowana.

Nie immunologiczna metoda oczyszczania PAF-AH z osocza obejmuje następujące etapy: (a) izolowania cząstek lipoproteiny o niskiej gęstości; (b) solubilizacji cząstek lipoproteiny o niskiej gęstości w buforze zawierającym 10 mM CHAPS z wytworzeniem pierwszego roztworu enzymatycznego PAF-AH; (c) wprowadzania pierwszego roztworu enzymatycznego PAF-AH na kolumnę anionowymienną DEAE; (d) przemywanie kolumny anionowymiennej DEAE przy użyciu bufora o pH około 7,5 zawierającego 1 mM CHAPS; (e) eluowania enzymu PAF-AH z kolumny anionowymiennej DEAE we frakcjach stosując bufor o pH około 7,5 obejmujący gradient od 0 do 0,5 M NaCl' (f) pulowanie eluowanych z kolumny anionowymiennej DEAE frakcji o aktywności enzymatycznej PAF-AH; (g) doprowadzania pulowanych, aktywnych frakcji z kolumny anionowymiennej DEAE do 10 mM CHAPS w celu wytworzenia drugiego roztworu enzymatycznego PAF-AH; (h) wprowadzania drugiego roztworu enzymatycznego PAF-AH do kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika; (i) eluowania enzymu PAF-AH z kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika przy użyciu bufora zawierającego 10 mM CHAPS i sól chaotropową (j) wprowadzania eluatu z kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika do kolumny powinowactwa z ligandem Cu; (k) eluowania enzymu PAF-AH z kolumny powinowactwa z ligandem Cu przy użyciu bufora zawierającego 10 mM CHAPS i imidazol; (1) poddawania eluatu z kolumny powinowactwa z ligandem Cu SDS-PAGE; i (m) izolowania enzymu PAF-AH wielkości około 44 kDa z żelu SDS-poliakryloamidowego. Bufor w etapie (b) może stanowić 25 mM

190 532

Tris-HCl, 10 mM CHAPS, pH 7,5; bufor w etapie (d) stanowi 25 mM Tris-HCl, 1 mM CHAPS; kolumną w etapie (h) jest kolumna Blue Sepharose Fast Flow; bufor w etapie (i) stanowi 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M KSCN, pH 7,5; kolumną w etapie (j) jest kolumna Cu Chelating Sepharose; zaś bufor w etapie (k) stanowi 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, 50 mM imidazol o pH w zakresie od 7,5 do 8,0.

Sposób oczyszczania enzymatycznie czynnej PAF-AH z E. coli wytwarzającej PAF-AH obejmuje etapy: (a) preparowania nadsączu po wirowaniu poddanych lizie E. coli wytwarzających enzym PAF-AH; (b) wprowadzania nadsączu po wirowaniu do kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika; (c) eluowania enzymu PAF-AH z kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika przy użyciu bufora zawierającego 10 mM CHAPS i sól chaotropową; (d) wprowadzania eluatu z kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika do kolumny powinowactwa z ligandem Cu; i (e) eluowania enzymu PAF-AH z kolumny powinowactwa z ligandem Cu przy użyciu bufora zawierającego 10 mM CHAPS i imidazol. Korzystnie, kolumną w etapie (b) jest kolumna Blue Sepharose Fast Flow; bufor w etapie (c) stanowi 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M KSCN, pH 7,5; kolumną w etapie (d) jest kolumna Cu Chelating Sepharose; zaś bufor w etapie (e) stanowi 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, 100 mM imidazol o pH 7,5.

Inny sposób oczyszczania enzymatycznie czynnej PAF-AH z E. coli obejmuje etapy: (a) preparowania nadsączu po wirowaniu poddanych lizie E. coli wytwarzających enzym PAF-AH; (b) rozcieńczania nadsączu w buforze o niskim pH obejmującym 10 mM CHAPS; (c) wprowadzania rozcieńczonego nadsączu po wirowaniu do kolumny kationowymierrnej zrównoważonej do pH około 7,5; (d) eluowania enzymu PAF-AH z kolumny przy użyciu 1 M soli; (e) podnoszenia pH eluatu z kolumny kationowymiennej i ustalanie stężenia soli eluatu do około 0,5 M soli; (f) wprowadzania eluatu z kolumny kationowymiennej do kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika; (g) eluowania enzymu PAF-AH z kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika przy użyciu buforu obejmującego gradient od około 2 M do około 3 M soli; i (h) dializowanie eluatu z kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika przy użyciu buforu zawierającego 0,1% Tween. Korzystnie, bufor w etapie (b) stanowi 25 mM MES, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, pH 4,9; kolumną w etapie (c) jest kolumna S Sepharose zrównoważona 25 mM MES, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH 5,5; PAF-AH jest eluowana w etapie (d) przy użyciu 1 mM NaCl; pH eluatu w etapie (e) ustalone jest na 7,5 przy użyciu 2 M zasady Tris; kolumna w etapie (f) jest kolumną Sepharose; bufor w etapie (g) stanowi 25 mM Tris, 10 mM CHAPS, 3 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5; zaś bufor w etapie (h) stanowi 25 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 80, pH 7,5.

Jeszcze inny sposób oczyszczania enzymatycznie czynnej PAF-AH z E. coli obejmuje etapy: (a) preparowania ekstraktu E. coli, który daje solubilizowany nadsącz PAF-AH po lizie w buforze zawierającym CHAPS; (b) rozcieńczanie nadsączu i wprowadzanie do kolumny anionowymiennej zrównoważonej do pH około 8,0; (c) eluowania enzymu PAF-AH z kolumny anionowymiermej; (d) wprowadzania eluatu z kolumny anionowymiennej do kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika; (e) eluowania enzymu PAF-Ah z kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika przy użyciu buforu obejmującego około 3 M sól; (f) rozcieńczanie eluatu z kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika w buforze odpowiednim do przeprowadzenia chromatografii na hydroksyapatycie; (g) przeprowadzania chromatografii na hydroksyapatycie, w której przemywanie i elucję prowadzi się przy użyciu buforów (z albo bez CHAPS); (h) rozcieńczania eluatu do odpowiedniego stężenia soli do chromatografii; (i) wprowadzanie rozcieńczonego eluatu do kolumny kationowymiennej w pH od około 6,0 do 7,0; 0) eluowania PAF-AH z kolumny odpowiednim buforem do formulacji; (k) przeprowadzania chromatografii kationowymiennej w chłodzie; i (1) formułowanie PAF-AH w postaci ciekłej albo zamrożonej pod nieobecność CHAPS.

W etapie (a) bufor do lizy może stanowić 25 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM CHAPS, pH 8,0; w etapie (b) rozcieńczenie nadsączu z chromatografii anionowymiennej zachodzi w 3-4-krotnej objętości 25 mM, 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8,0 zaś kolumna jest kolumną Q-Sepharose zrównoważoną 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0; w etapie (c) kolumna anionowymienna jest eluowana przy użyciu

190 532 mM Tris, 1 mM EDTA, 350 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0; w etapie (d) eluat z etapu (c) wprowadza się bezpośrednio do kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika; w etapie (e) kolumna jest eluowana 3 M NaCl, 10 mM CHAPS, 25 mM Tris, pH 8,0; w etapie (f) rozcieńczanie eluatu zachodzi przez rozcieńczenie w 10 mM fosforanie sodu, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 6,2; w etapie (g) chromatogafię na hydroksyapatycie prowadzi się na kolumnie zrównoważonej 10 mM fosforanem sodu, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, zaś elucję prowadzi się przy użyciu 50 mM fosforanu sodu, 100 mM NaCl (z lub bez) 10 mM CHAPS, pH 7,5; w etapie (h) rozcieńczanie eluatu do chromatografii kationowymiennej prowadzi się przy użyciu buforu o pH w zakresie od około 6,0 do 7,0, obejmującego fosforan sodu (z albo bez CHAPS); w etapie (i) kolumnę Sepharose równoważy się 50 mM fosforanem sodu (z albo bez) 10 mM CHAPS, pH 6,8; w etapie (j) elucję prowadzi się odpowiednim buforem formulacyjnym takim jak 50 mM fosforan sodu, 12,5 mM kwas asparaginowy, 125 mM NaCl, pH 7,5 zawierającym 0,01% Tween 80; zaś na etapie (k) chromatografię kationowymienną prowadzi się w 2-8°C. Przykłady odpowiednich buforów formulacyjnych do zastosowania w etapie (1), które stabilizują PAF-AH obejmują 50 mM fosforan potasu, 12,5 mM kwas asparaginowy, 125 mM NaCl pH 7,4 (około, z Iub bez dodania Tween-80 albo Pluronic F68) albo bufor 25 mM fosforanu potasu (przynajmniej) 125 mM NaCl, 25 mM argininy i 0,01% Tween-80 (z albo bez Pluronic F68 w ilości około 0,1 do 0,5%).

Jeszcze inny sposób oczyszczania enzymatycznie czynnego produktu PAF-AH z E. coli obejmuje etapy: (a) preparowania ekstraktu E. coli, który daje solubilizowany nadsącz rPAF-AH po lizie w buforze zawierającym Triton Χ-100; (b) rozcieńczanie nadsączu i wprowadzanie do kolumny powinowactwa z unieruchomionym metalem zrównoważonej do pH około 8,0; (c) eluowania rPAF-AH z kolumny powinowactwa przy użyciu buforu zawierającego imidazol; (d) ustalania stężenia soli i wprowadzania eluatu z kolumny powinowactwa z unieruchomionym metalem do kolumny oddziaływania hydrofobowego (HIC#1); (e) eluowania rPAF-AH z kolumny HIC#1 przez zmniejszenie stężenia soli i/lub zwiększenie stężenia detergentu; (f) miareczkowanie eluatu HIC#1 do pH około 6,4; (g) wprowadzania HłC#1 do kolumny kationowymiennej (CEX#1) zrównoważonej do pH około 6,4; (h) eluowania CEX#1 stężeniem chlorku sodu; (i) ustalanie eluatu CEX#1 chlorkiem sodu do stężenia około 2,0 M; (j) wprowadzania eluatu CEX#1 do kolumny oddziaływania hydrofobowego (HIC#2) zrównoważonej do pH około 8,0 i około 2,0 M chlorku sodu; (k) eluowania HIC#2 przez zmniejszanie stężenia soli i/lub zwiększenie stężenia detergentu; (1) rozcieńczania eluatu HIC#2 i ustalania pH około 6,0; (m) wprowadzania eluatu HIC#2 do kolumny kationowymiennej (CEX#2) zrównoważonej do pH około 6,0; (n) eluowania produktu rPAF-AH z CEX#2 odpowiednim buforem formulacyjnym.

Korzystnie, w etapie (a) bufor do lizy obejmuje 90 mM Tris, 0,125% Triton X-100, 0,6 M NaCl, pH 8,0, zaś lizę prowadzi się w wysokociśnieniowym homogenizatorze; w etapie (b) nadsącz rozcieńcza się w buforze do równoważenia (20 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0), kolumna chelatowania cynku (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia, Uppsala, Szwecja) jest upakowana, zrównoważona buforem do równoważenia, naładowana rozcieńczonym nadsączem i przemywana 20 mM Tris, 0,5 M NaCl, 4 M mocznikiem, 0,1% Triton X-100, pH 8,0, a następnie płukana 20 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,02% Triton X-W0, pH 8,0; w etapie (c) elucję prowadzi się 20 mM Tris, 50 mM imidazolem, 0,02% Triton X-100, pH 8,0; w etapie (d) eluat ustala się do 1 mM EDTA i 2 M NaCl, kolumnę Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia) równoważy się buforem (2,0 M NaCl, 25 mM Tris, 0,02% Triton X-100, pH 8,0), wypełnia eluatem z etapu (c) w temperaturze pokojowej, przemywa buforem do równoważenia i przemywa 25 mM NaPO4, 0,02% Triton X-100, pH 6,5 przy prędkości przepływu równej 30 cm/godz., w etapie (e) elucję prowadzi się przy użyciu 25 mM NaPO4, 3% Triton X-100, pH 6,5; w etapie (g) kolumnę Macroprep High S (Bio-Rad Labs, Richmond, CA) równoważy się buforem (25 mM NaPO4, 0,02% Triton X-100, pH 6,4) wypełnia eluatem z etapu (f), płucze buforem do równoważenia i płucze 25 mM Tris, 0,02% Triton X-100, pH 8,0; w etapie (h) elucję prowadzi się 25 mM Tris, 0,02% Triton X-100, 1,3 M NaCl, pH 8,0; w etapie (j) kolumnę Bakerbond Wide Pore Hi-Propyl C3 (Baker, Phillipsburg, NJ) równoważy się buforem do równoważenia (2,0 M NaCl, 25, mM Tris, 0,02% Triton X-100,

190 532 pH 8,0), wypełnia eluatem z etapu (i) w temperaturze pokojowej, przemywa się buforem do równoważenia i przemywa 25 mM Tris, 0,02% Triton X-100, pH przy 30 cm/godz., w etapie (k) elucję prowadzi się 10 mM Tris, 3,0% Triton X-100, pH 8,0; w etapie (1) rozcieńcza się buforem do równoważenia (20 mM sukcynylan, 0,1% Pluronic F68, pH 6,0); w etapie (m) kolumnę SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) równoważy się buforem do równoważenia z etapu (1), wypełnia eluatem z etapu (1) i płucze buforem do równoważenia, zaś w etapie (n) elucję prowadzi się 50 mM NaPO4, 0,7 M NaCl, 0,1% Pluronic F68, 0,02% Tween 80, pH 7,5.Produkt PAF-AH według wynalazku można pozyskać ze źródeł naturalnych albo syntetyzować chemicznie, ale wskazane jest wytwarzanie go procedurami rekombinacji z udziałem prokariotycznych albo eukariotycznych komórek gospodarza według wynalazku Jak zaznaczono wyżej, polinukleotydy (w tym DNA) kodujące takie fragmenty albo odmiany fragmentów PAF-AH są częścią wynalazku, podobnie jak sposoby rekombinacyjnego wytwarzania takich fragmentów albo odmian przez hodowanie komórek gospodarza zawierających takie DNA. Korzystne produkty PAF-AH obejmują prokariotyczne polipeptydowe produkty ekspresji DNA kodującego aminokwasy od reszty Me© do Asn441 Id. Sekw. nr 8; oznaczone rPH.2, oraz prokariotyczne polipeptydowe produkty ekspresji DNA kodującego reszty aminokwasowe Me© do Ile429 Id. Sekw. nr 8 oznaczony rPH.9. Oba produkty, rPH.2 i rPH.9 wykazują mniejszą heterogenność końca aminokwasowego niż, przykładowo, odpowiednie prokariotyczne produkty ekspresji DNA kodującego pełną dojrzałą sekwencję PAF-AH poprzedzaną przez kodon początku translacji. Ponadto, produkt rPH.9 wykazuje większą homogenność końca karboksylowego (stałość). Zastosowanie ssaczych komórek gospodarza powinno, jak się oczekuje zapewnić takie modyfikacje potranslacyjne (np. mirystylację, glikozylację, okrawanie, lipidację i fosforylację tyrozyny, seryny albo treoniny), jaka może być konieczna do zapewnienia optymalnej aktywności biologicznej rekombinowanego produktu ekspresji według wynalazku. Produkty PAF-AH według wynalazku mogą być polipeptydami pełnej długości, fragmentami albo odmianami. Odmiany mogą obejmować analogi PAF-AH, w których jeden albo wiele określonych (tj. naturalnie kodowanych) aminokwasów poddanych jest delecji albo zastąpieniu, gdzie dodanych jest jeden albo wiele aminokwasów: (l) bez utraty jednej albo wielu aktywności enzymatycznych albo charakterystyki immunologicznej swoistej dla PAF-AH; albo (2) ze swoistym usunięciem konkretnej aktywności biologicznej PAF-AH. Do modulowania tej aktywności można zastosować białka albo inne cząsteczki, które wiążą się z PAF-AH.

Wynalazek dotyczy też kompozycji farmaceutycznej zawierającej substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, adiuwant albo nośnik, która jako substancję czynną zawiera fragment PAF-AH, odmianę fragmentu albo fragment odmiany według wynalazku albo fragment wytworzony sposobem według wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest również fragment polipeptydową PAF-AH jego odmiana Iub odmiana fragmentu według wynalazku, albo fragment wytworzony sposobem według wynalazku albo kompozycja farmaceutyczna według wynalazku do zastosowania w sposobie leczenia ssaka podatnego albo cierpiącego na stan chorobowy wywołany PAF, przy czym produkt PAF-AH Iub kompozycję farmaceutyczną stosuje się w ilości wystarczającej do uzupełnienia aktywności PAF-AH i inaktywacji patologicznych efektów PAF u tego ssaka. W korzystnym wykonaniu wynalazku stanem patologicznym jest zapalenie płuc, astma, katar, martwicze zapalenie jelit i okrężnicy, zespół ostrej niewydolności oddechowej, ostre zapalenie trzustki, uszkodzenia wynikające z reperfuzji, posocznica, poród przedwczesny albo choroba neurologiczna związana z zakażeniem HIV.

Kompozycje terapeutyczne/profilaktyczne uwzględniane według wynalazku obejmują produkty PAF-AH i fizjologicznie dopuszczalny rozcieńczalnik albo nośnik i mogą również obejmować inne czynniki wywierające wpływ przeciwzapalny. Ilości dawkowania powinny być wystarczające do uzupełnienia endogennej aktywności PAF-AH oraz do inaktywacji patologicznych ilości PAF. Ogólne rozważania na temat dawkowania można znaleźć w Remington^ Pharmaceutical Sciences, wyd. 18, Mack Publishing Co, Euston, PA (1990). Dawkowanie wahać się będzie od około 0,1 do około 1000 pg PAF-AH/kg ciężaru ciała. Kompozycje terapeutyczne według wynalazku można podawać różnymi drogami zależnie od leczonego stanu patologicznego. Przykładowo, podawanie może odbywać się drogą dożylną, podskórną,

190 532 doustną, w czopkach i/lub płucną dla stanów patologicznych w płucach szczególnie wskazane jest, podawanie PAF-AH drogą płucną. Do podawania płucnego stosuje się wiele przyrządów, przykładowo, nebulizerów, inhalatorów z odmierzaną dawką i inhalatorów proszkowych, które są standardowe. Dostarczanie różnych białek do płuc i układu krążenia przez wdychanie formulacji rozpylonych opisano wAdjei i in., Pharm. Res. 7(6):565-569 (1990) (octan leuprolidu); Braquet i in., J. cardio. Pharm., 13(supl. 5): 143-146 (1989) (endotelina-1); Hubbard i in., Annals of Internal Medicine IH(3):206-212 (1989) (al-antytrypsyna); Smith i in., J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (1989) (inhibitor proteinazy al); Debs i in., J. Immunol. 140:3482-3488 (1933) (rekombinowany interferon gamma i czynnik martwicy nowotworów alfa); publikacja międzynarodowa PCT WO 94/20069, opublikowana 15 września, 1994 (rekombinowany pegylowany czynnik pobudzający kolonie granulocytówi makrofagów.

Preparaty PAF-AH według wynalazku podaje się ssakom, zwłaszcza ludziom, w celu łagodzenia patologicznych stanów zapalnych. Na podstawie skutków związku PAF z patologicznymi stanami zapalnymi, podawanie PAF-AH wskazane jest, przykładowo, w leczeniu astmy (Miwa i in., J. Clin. Invest., 82:1983-1991 (1988); Hsieh i in., J. Allergy Clin. Immunol., 91:650-657 (1993); i Yamashita i in., Allergy 49:60-63 (1994)), anafilaksji (Venable i in., wyżej), wstrząsu (Venable i in., wyżej), uszkodzenia poreperinzyjnego i niedokrwieniu ośrodkowego układu nerwowego (Lindsberg i in., (1991) wyżej), zapalenia stawów wywołanego antygenem (Zarco i in., Clin. Exp. Immunol., 88:318-323 (1992)), miażdżycy (Handley i in., Drug Dev. Res., 7:361-375 (1986)), choroby Crohna (Denizot i in., Digestive Diseases and Sciences, 37(3):432-437 (1992)), martwicy niedokrwiennej jelita grubego/martwiczego zapalenia jelit i okrężnicy (Denizot i in., wyżej; Caplan i in., Acta Pediatr., Supl. 396:11-17 (1994)), wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (Denizot i in., wyżej), udaru niedokrwiennego (Satoh i in., Stroke 23:1090-1092 (1992)), niedokrwiennego uszkodzenia mózgu (Lindsberg i in., Stroke 21:1452-1457 (1990) i Lindsberg i in., (1991) wyżej), układowego tocznia rumieniowatego (Matsuzaki i in., Clinica Chimica Acta 210:139-144 (1992)), ostrego zapalenia trzustki (Kald i in., Pancreas 8(4):440-442 (1993)), posocznicy (Kald i in., wyżej), ostrego popaciorkowcowego zapalenia kłębuszków nerkowych (Mezzano i in., J. Am. Soc. Nephrol., 4:235-242 (1993)), obrzęku płuc w przebiegu leczenia IL-2 (Rabinovici i in., J. Clin. Invest. 89:1669-1673 (1992)), alergicznego stanu zapalnego (Watanabe i in., Br. J. Pharmacol. 111:123-130 (1994)), niedokrwiennej niewydolności nerek (Grino i in., Annals of Internal Medicine 121(5):345-347 (1994)); porodu przedwczesnego (Hoffman i in., Am. J. Obstet. Gynecol., 162(2):525-528 (1990) i Maki i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:728-732 (1988)); zespołu niewydolności oddechowej typu dorosłych (Rabinovici i in., J. Appl. Physiol., 74(4):1791-1802 (1993); Matsumoto i in., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 19:509-515 (1992) i Rodriguez-Roisin i in., J. Clin. Invest., 93:188-194 (1994)). Uwzględnia się również zastosowanie preparatów PAF-AH do leczenia zakażeń ośrodkowego układu nerwowego przez ludzkiego wirusa niedoborów odporności (HIV). „Leczenie” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza zarówno profilaktykę, jak i leczenie.

Znane są modele zwierzęce dla wielu z powyższych stanów patologicznych. Przykładowo, mysi model astmy i kataru opisano w przykładzie 16; króliczy model zapalenia stawów opisany jest przez Zarco i in., wyżej; szczurzy model martwicy niedokrwiennej jelita grubego/martwiczego zapalenia jelit i okrężnicy opisali Furukawa i in., Ped. Res. 34(2):237-241 (1993) i Caplan i in., wyżej; króliczy model udaru opisali Lindberg i in., (1990) wyżej; mysi model tocznia opisali Matsuzaki i in., wyżej; szczurzy model ostrego zapalenia trzustki opisali Kald i in., wyżej; szczurzy model obrzęku płuc na skutek leczenia IL-2 opisali Rabinovici i in., wyżej; szczurzy model alergicznego stanu zapalnego opisali Watanabe i in., wyżej; psi model przeszczepu allogenicznego nerki opisali Watson i in., Transplantation 56(4):

: 1047-1049 (1993); i szczurzy i świnio-morski model zespołu niewydolności oddechowej typu dorosłych są opisane, odpowiednio, w Rabinovici i in., wyżej i Ldlouch-Tubiana, Am. Rev. Respir. Dis., 137:948-954(1988).

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie fragmentu polipeptydowego PAF-AH jego odmiany lub fragmentu odmiany według wynalazku albo fragmentu wytworzonego sposobem według wynalazku albo kompozycji farmaceutycznej według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia ssaka podatnego albo cierpiącego na stan chorobowy wywołany PAF,

190 532 który to lek uzupełnienia aktywności PAF-AH i inaktywuje patologiczne efekty PAF u tego ssaka. W korzystnym wykonaniu wynalazku lek przeznaczony jest do leczenia ssaka podatnego albo cierpiącego na zapalenie płuc, astmę, katar, martwicze zapalenie jelit i okrężnicy, zespół ostrej niewydolności oddechowej, ostre zapalenie trzustki, uszkodzenia wynikające z reperfuzji, posocznicę, poród przedwczesny albo chorobę neurologiczną związaną z zakażeniem HIV.

Stosując fragmenty polipeptydowe PAF-AH jego odmiany Iub fragmenty odmiany albo fragmenty wytworzone sposobem według wynalazku albo kompozycję farmaceutyczną według wynalazku można wytworzyć substancję o aktywności przeciwciał (np. przeciwciała monoklonalne albo poliklonalne, przeciwciała jednołańcuchowe, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała o przeszczepionych CDR itp.) i inne białka wiążące swoiście PAF-AH. Konkretnymi ilustratywnymi białkami wiążącymi według wynalazku są przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez hybrydoma 90G11D i 90F2D, które zdeponowano w American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA 30 września 1994 i oznaczono, odpowiednio numerami dostępu HB 11724 i HB 11725. Ilustratywnymi białkami wiążącymi według wynalazku jest również przeciwciało monoklonalne wytwarzane przez hybrydoma 143 A, którą zdeponowano w ATCC 1 czerwca 1995 i nadano numer dostępu HB 11900. Białka i inne cząsteczki (np. lipidy albo związki drobnocząsteczkowe), które swoiście wiążą się z PAF-AH można zidentyfikować stosując PAF-AH wyizolowaną z osocza, rekombinowaną PAF-AH, odmiany PAF-AH albo komórki wyrażające taki produkt. Białka wiążące są przydatne z kolei w kompozycjach do immunizacji jak również do oczyszczania PAF-AH oraz są przydatne do wykrywania albo oznaczania PAF-AH w próbkach płynów i tkanek znanymi procedurami immunologicznymi. Uwzględnione są również przeciwciała antyidiotypowe przeciwko przeciwciałom swoistym wobec PAF-AH.

Wartość naukowa informacji dostarczonej przez ujawnienie sekwencji DNA i aminokwasowej według wynalazku jest doniosła. Jako jeden z szeregu przykładów, znajomość sekwencji cDNA dla PAF-AH umożliwia przez hybrydyzację DNA/DNA izolowanie sekwencji genomowego DNA, kodujących PAF-AH i określenie sekwencji regulatorowych kontrolujących ekspresję PAF-AH takich jak promotory, operatory itp. Oczekuje się, że procedury hybrydyzacji dNa/DNA przeprowadzane przy użyciu sekwencji DNA według wynalazku w warunkach standardowej surowości powinny umożliwić izolację DNA kodujących odmiany alleliczne PAF-AH, inne białka pokrewne strukturalnie, wykazujące jedną albo wiele wspólnych z PAF-AH cech biochemicznych i/lub immunologicznych oraz białka homologiczne z PAF-AH z innych gatunków zwierząt. Informacja o sekwencji DNA dostarczona przez niniejszy wynalazek umożliwia również opracowanie, przez rekombinację homologiczną albo strategię „knockout” (patrz, np. Kapecchi, Science 244:1288-1292 (1989)) gryzoni, pozbawionych zdolności wyrażania funkcjonalnego enzymu PAF-AH albo wyrażających odmiany enzymu PAF-AH. Polinukleotydy według wynalazku, po odpowiednim znakowaniu, są przydatne w testach hybrydyzacyjnych w celu wykrywania zdolności komórek do syntetyzowania PAF-AH. Polinukleotydy według wynalazku mogą również stanowić bazę dla metod diagnostycznych przydatnych w identyfikacji zmian genetycznych w locus PAF-AH, które leżą u podstaw stanów chorobowych. Wynalazek udostępnia również polinukleotydy antysensowne odpowiednie do regulowania ekspresji PAF-AH przez te komórki, które zwykle ją wyrażają.

Krótki opis rysunków

Liczne inne aspekty i zalety wynalazku staną się jasne po uwzględnieniu szczegółowego opisu w odniesieniu do rysynków, w których:

Figura 1 jest fotografią membrany PVDF zawierającej PAF-AH oczyszczoną z ludzkiego osocza;

Figura 2 jest wykresem pokazującym aktywność enzymatyczną rekombinowanej ludzkiej osoczowej PAF-AH;

Figura 3 jest schematem przedstawiającym fragmenty rekombinowanej PAF-AH i ich aktywność katalityczną;

Figura 4 przedstawia wynik spektroskopii mas dla rekombinowanego produktu PAF-AH r.PH.2;

190 532

Figura 5 przedstawia wynik spektroskopii mas dla ^kombinowanego produktu PAF-AH r.PH.9;

Figura 6 jest wykresem słupkowym pokazującym blokowanie obrzęku podusze^ki łapy szczura wywołanego PAF przez miejscowe podanie rekombinowanej PAF-AH według wynalazku;

Figura 7 jest wykresem słupkowym pokazującym blokowanie obrzęku acduszeczki łapy szczura wywołanego PAF przez dożylne podanie ^kombinowanej PAF-AH według wynalazku;

Figura 8 jest wykresem słupkowym pokazującym, że PAF-AH blokuje obrzęk wywołany PAF, ale nie obrzęk wywołany cymosonem A;

Figura 9A i 9B pokazuje wyniki reakcji na dawkę aktywności arceciwcoaalnaj PAF-AH w obrzęku łapy szczura;

Figura 10A i 10B pokazuje wyniki pokazujące skuteczność in vivo pojedynczej dawki PAF-AH w czasie;

Figura 11 jest wykresem liniowym pokazującym formakckinetvką PAF-AH w krążeniu; i

Figura 12 jest wykresem słupkowym pokazującym wpływ arzeclwcopolnv PAF-AH na obrzęk łapy u szczura w porównaniu ze słabszym efektem antagonistów PAF;

Figura 13 pokazuje wyniki wskazujące, że PAF-AH neutralizuje efekty opoptotyccna pożywki uwarunkowanej mcnccvtami zakażonymi albo nie zakażonymi HIV-1.

Szczegółowy opis

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek. Przykład 1 pokazuje nową metodę oczyszczania PAF-AH z osocza ludzkiego. Przykład 2 pokazuje mikrosekwencjonowanie oczyszczonej csoczowej ludzkiej PAF-AH. Klonowanie cDNA pełnej długości, kodującego ludzką osoczową PAF-AH opisano w przykładzie 3. Identyfikacja domniemanych odmian składania genu ludzkiej csoczowaj PAF-AH opisano w przykładzie 4. Klonowanie sekwencji genomowych kodujących PAF-AH opisano w przykładzie 5. Przykład 6 opisuje klonowanie cDNA psich, mysich, bydlęcych, kurzych, gryzoni oraz makaków, homologicznych z cDNA ludzkiej osoczowej PAF-AH. Przykład 7 przedstawia wyniki testu dowodzącego, że aktywność enzymatyczna rekombincwynaj PAF-AH przejściowo wyrażanej w komórkach COS-7. Przykład 8 opisuje wyrażanie w E. coli, S. cerevisiae albo komórkach ssaków DNA PAF-AH pełnej długości albo chimerycznych. Przykład 9 stanowa protokół oczyszczania rekcmbincwonej PAF-AH z E. coli i testy potwierdzające aktywność enzymatyczną. Przykład 10 opisuje różne rekomblncwęne produkty PAF-AH w tym analogi z zastępowanymi aminokwasami oraz produkty okrojone na końcu aminowym i karboksylowym, oraz opisuje doświadczenia pokazujące, że notvwno PAF-AH izolowana z osocza jest glikccylowjno. Wyniki analizy metodą northern blot na ekspresję RNA ludzkiej osobowej PAF-AH w różnych tkankach i liniach komórkowych przedstawiono w przykładzie 11, podczas gdy wyniki hybrydyzacji in situ pokazano w przykładzie 12. Przykład 13 opisuje opracowanie przeciwciał mcncklonalnych i poligonalnych swoistych dla ludzkiej osobowej PAF-AH. Przykłady, odpowiednio, 14, 15, 16, 17, 18 i 19 opisujją efekt in vz^^io rekombrnowanych produktów PAFAH według wynalazku w modelach zwierzęcych ostrego stanu zapalnego, zapalenia opłucnej, astmy, martwiczego zapalenia jelit, zespołu niewydolności oddechowej typu dorosłych i zoaolenia trzustki. Przykład 20 opisuje efekt in vitro rekcmblnowonej PAF-AH wobec neurotoksyczności związanej z zakażeniem HIV. Przykład 21 prezentuje wyniki testu immunologicznego surowicy pacjentów wykazujących niedobór aktywności PAF-AH i opisuje identyfikacje ubytku genetycznego u pacjentów, który jest najwyraźniej odpowiedzialny za niedobór.

Przykład 1

PAF-AH oczyszczano z ludzkiego osocza w celu dostarczenia materiału do sekwencjonowania aminokwasów.

A. Optymalizacja warunków oczyszczania

Początkowo, cząstki liacproteiny o niskiej gęstości (LDL) arecvaitcwanc z osocza przy użyciu kwasu fosfcrowolfromowagc i solubilizcwęnc w 0,1% Tween 20 i poddawano chromatografii na kolumnie DEAE (Pharmocia, Uppsala, Szwecja) w oparciu o metodę opisaną przez Stafforini i in., (1987) wyżej, ale z niestałą elucją aktywności PAF-AH

190 532 z kolumny DEAE. co wymagało ponownego opracowania solubilizacji i warunków dalszego oczyszczania.

Tween 20, CHAPS (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) oraz oktyloglukozyd badano przez wirowanie i chromatografię żelową na ich zdolność do solubilizowrana cząstek LDL. CHAPS zapewniał 25% większy odzysk solubilizowanej aktywności w porównaniu z Tween 20 i 300% większy odzysk w porównaniu z oktyloglukozydem. Precypitat LDL solubilizowany 10 mM CHAPS był następnie frakcjonowany na kolumnie DEAE Sepharose Fast Flow (kolumna anionowymienną Pharmacia) z buforem zawierającym 1 mM CHAPS w celu zapewnienia większej puli częściowo oczyszczonej PAF-AH („pula DEAE”) do badania kolejnych kolumn.

Pulę DEAE zastosowano jako materiał wyjściowy do badania wielu różnych kolumn chromatograficznych na przydatność w dalszym oczyszczaniu aktywności PAF-AH. Badane kolumny obejmowały: Blue Sepharose Fast Flow (Pharmacia); kolumnę powinowactwa z ligandem barwnika; S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), kolumna kationowymienna; Cu Chelating Sepharose (Pharmacia), kolumna powinowactwa z ligandem metalu; Fracto-gel S (EM Separations/Gibbstown, NJ), kolumna kationowymienna; i Sephacryl-200 (Pharmacia) kolumna filtracji żelowej. Te procedury chromatograficzne dały niski, niesatysfakcjonujący poziom oczyszczenia, przy zastosowaniu 1 mM CHAPS. Kolejna filtracja żelowa na kolumnie Sephacryl S-200 w 1 mM CHAPS dała enzymatycznie czynną frakcję, która eluowała w szerokim zakresie, zamiast przy oczekiwanej wielkości 44 kDa. Podsumowując, wyniki te wskazywały, że białka LDL agregowały w roztworze.

Stąd, badano różne próbki LDL przez analityczną filtrację żelową w kierunku agregowania aktywności PAF-AH. Próbki z puli DEAE i świeżo solubilizowanego precypitatu LDL analizowano na kolumnie Superose 12 (Pharmacia) zrównoważonej buforem z 1 mM CHAPS. Obie próbki eluowały w bardzo szerokim zakresie ciężarów cząsteczkowych, przy czym większość aktywności eluowała powyżej 150 kDa. Następnie, gdy próbki analizowano na kolumnie Superose 12 zrównoważonej 10 mM CHAPS, większość aktywności eluowała w okolicy 44 kDa, jak oczekiwano dla PAF-AH. Jednakże, próbki zawierały nieco aktywności PAF-AH w regionie wyższych ciężarów cząsteczkowych, co odpowiadało agregatom.

Inne próbki eluowały aktywność PAF-AH wyłącznie w zakresie około 44 kDa, po czym badano je przez filtrację żelową. Próbki te stanowiły precypitat LDL solubilizowany w 10 mM CHAPS w obecności 0,5 M NaCl i świeżą pulę DEAE, którą doprowadzono do 10 mM CHAPS po elucji z kolumny DEAE. Dane te wskazują że przynajmniej 10 mM CHAPS jest wymagany, aby zachować PAF-AH w postaci nie agregowanej. Wzrost stężenia CHAPS od 1 mM do 10 mM po chromatografii na DEAE, ale przed kolejnymi etapami chromatograficznymi powodował dramatyczne różnice w oczyszczaniu. Przykładowo, stopień oczyszczenia PAF-AH na S-Sepharose Fast Flow zwiększył się od 2-krotnego do 10-krotnego. Aktywność PAF-AH wiązała się nieodwracalnie z kolumną Blue Sepharose Fast Flow w 1 mM CHAPS, ale kolumna zapewniała najwyższy stopień oczyszczenia przy 10 mM CHAPS. Chromatografia DEAE nie poprawiała się przez dodanie 10 mM CHAPS.

Chromatografia na CU Chelating Sepharose po kolumnie Blue Sepharose Fast Flow zatężała aktywność PAF-AH 15-krotnie. Stwierdzono również, że aktywność PAF-AH można odzyskać z redukujących żelów SDS-poliakryloamidowych, o ile próbki nie były gotowane. Aktywność materiału eluowanego z kolumny Cu Chelating Sepharose po poddaniu elektroforezie na żelu SDS-poliakryloamidowym występowała z głównym prążkiem białka po zabarwieniu żelu srebrem.

B. Protokół oczyszczania PAF-AH

Nowy protokół wykorzystywany do oczyszczania PAF-AH do sekwencjonowania aminokwasów obejmował następujące etapy, prowadzone w temperaturze 4°C. Osocze ludzkie podzielono na porcje po 900 ml w 1-litrowych butelkach Nalgene i doprowadzono do pH 8,6. Cząstki LDL precypitowano przez dodanie 90 ml 3,85% soli sodowej kwasu fosforo-wolframowego, a następnie 23 ml 2 M MgCl₂. Następnie osocze wirowano przez 15 minut przy 3600 g. Osad zawieszono w 800 ml 0,2% cytrynianu sodu. LDL ponownie precypitowano przez dodanie 10 g NaCl i 24 ml 2 M MgCl₂. Cząstki LDL wirowano przez 15 minut przy 3600 g. Płukanie powtarzano dwukrotnie. Osad zamrożono w -20°C. Cząstki LDL z 5 1 osocza zawieszono w buforze A (25 mM

190 532

Tris-HCl, 10 mM CHAPS, pH 7,5) i mieszano przez noc. Solubiilzowanć cząstki LDL odwirowano przez 1,5 godziny przy 3600 g. Nadsącze połączono i filtrowano przez filtr papierowy Whatman 113 w celu usunięcia wszelkich pozostałości. Solubilizowany nadsącz LDL wprowadzono do kolumny DEAE Sepharose Fast Flow (11 cm x 10 cm; objętość żywicy 1 1; 80 ml/minutę) zrównoważonej buforem B (25 mM Tris-HCl, 1 mM CHAPS, pH 7,5). Kolumnę płukano buforem B do momentu, w którym absorbancja powróciła do poziomu podstawowego. Białko eluowano 8 litrami roztworu o gradiencie 0 - 0,5 M NaCl i zebrano 480 ml frakcji. Etap ten był konieczny do uzyskania wiązania z kolumną Blue Sepharose Fast Flow. Frakcje badano na aktywność acetylohydrolazy, zasadniczo metodą opisaną w przykładzie 4.

Frakcje czynne pulowano i dodano odpowiednią ilość CHAPS, aby doprowadzić pulę do około 10 mM CHAPS. Pulę DEAE wprowadzano przez noc przy prędkości 4 ml/minutę do kolumny Blue Sepharose Fast Flow (5 cm x 10 cm; 200 ml objętość złoża) zrównoważonej buforem A zawierającym 0,5 M NaCl. Kolumnę przemywano buforem do równoważenia z prędkością 16 ml/minutę dopóki absorbancja nie powróciła do poziomu podstawowego. Aktywność PAF-AH była eluowana buforem A zawierającym 0,5 M KSCN (sól chaotropowa) z prędkością 16 ml/minutę i zebrano w 50 ml frakcji. Etap ten dał ponad 1000-krotne oczyszczenie. Aktywne frakcje pulowano, po czym ustalano pH puli na 8,0 przy użyciu 1 M TrisHCl pH 8,0. Aktywną pulę z chromatografii Blue Sepharose Fast Flow wprowadzono do kolumny Cu Chelating Sepharose (2,5 cm x 2 cm; objętość złoża 10 ml; 4 ml/minutę) zrównoważoną buforem C (25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 8,0 (działa również pH 7,5)), po czym kolumnę przepłukano 50 ml bufora C. Aktywność PAF-AH eluowano 100 ml 50 mM imidazolu w buforze C i zebrano 10 ml frakcji. Frakcje zawierające aktywność PAF-AH połączono i dializowano wobec bufora A. Oprócz zapewnienia 15-krotnego oczyszczenia aktywności PAF-AH, kolumna Cu Chelating Sepharose dawała małe oczyszczanie. Pulę Cu Chelating Sepharose zmniejszono w 50 mM DTT przez 15 minut w 37°C i wprowadzono na 0,75 mm, 7,5% żel poliakryloamidoa7. Żel cięto na skrawki 0,5 cm i umieszczono w probówkach wirowniczych zawierających 200 μΐ 25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 150 mM NaCl. Skrawki miażdżono i pozostawiano do inkubacji przez noc w 4°C. Nadsącz każdego ze skrawków badano na aktywność PAF-AH w celu określenia, który z prążków białka na SDS-PAGE zawierał aktywność PAF-AH. Stwierdzono, że aktywność PAF-AH występuje w prążku o około 44 kDa. Białko z kopii żelu przeniesiono elektrycznie na membranę PVDF (Immobilion-P, Millipore) i zabarwiono błękitem Coomassie. Fotografię membrany PVDF przedstawiono na figurze 1.

Jak pokazano na tabeli 1, niżej, z 5 litrów ludzkiego osocza oczyszczono około 200 μg PAF-AH 2x10⁶-krotnie. Dla porównania, w Stafforini i in. (1987) wyżej, opisane jest 3x10⁴-krotne oczyszczenie PAF-AH.

Tabela 1

	Obj. (ml)	Aktyw. (cpmx106)	Aktyw, całk. (cpmx10⁹)	Stęż. białka (mg/ml)	Aktyw, właść. (cpmx106)	% odzysku aktywności	Krotność oczyszczenia
etap	kum.	etap	kum.
Osocze	5000	23	116	62,00	0,37	100	100	1,0	1,0
LDL	4500	22	97	1,76	12,00	84	84	33,0	33
DEAE	4200	49	207	1,08	46,00	212	178	3,7	124
Blue	165	881	14	0,02	54200,00	70	126	1190,0	1,5x10⁵
Cu	12	12700	152	0,15	82200,00	104	131	1,5	2,2x10⁵
SDS-PAGE	-	-	-	-	-	-	-	ok 10	2,2x106

190 532

Podsumowując, powyższe etapy były unikalne i kluczowe dla pomyślnego oczyszczania osoczowej PAF-AH do mikrosekwencjonowania: (1) solubilizacja i chromatografia w 10 mM CHAPS, (2) chromatografia na kolumnie powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika, takiej jak Blue Sepharose Fast Flow, (3) chromatografia na kolumnie powinowactwa z ligandem Cu, takiej jak Cu Chelating Sepharose, i (4) eluowanie PAF-AH z SDS-PAGE.

Przykład 2

W celu sekwencjonowania aminokwasów, prążek około 44 kDa z membrany PVDF zawierającej PAF-AH opisany w przykładzie 1 wycięto i sekwencjonowano stosując sekwenator białek Applied Biosystems 473A. Analiza sekwencji końca aminowego prążka białka wielkości około 44 kDa, odpowiadającego aktywności PAF-AH wskazywała, że prążek zawiera dwie główne sekwencje i dwie mniejsze sekwencje. Stosunek dwóch głównych sekwencji wynosił 1:1, stąd trudno było interpretować dane dotyczące sekwencji.

W celu rozróżnienia sekwencji dwóch głównych białek, które rozdzielono przez SDS-PAGE, podwójne membrany PVDF zawierające prążek wielkości około 44 kDa przecięto na pół w taki sposób, żeby osobno sekwencjonować górną część i dolną część membrany.

Sekwencja końca N otrzymana dla dolnej połowy membrany miała postać:

Id. Sekw. nr 1

FKDLGEENFKALVLIAF

Poszukiwania w bazie danych białek wykazały, że sekwencja ta jest fragmentem albuminy surowicy ludzkiej. Górną część tej samej membrany PVDF również sekwencjonowano i określono, że sekwencja aminokwasowa końca N ma postać:

Id. Sekw. nr 2

IQVLMAAASFGQTKIP

Sekwencja ta nie pasowała do żadnego białka w bazie danych i była różna od sekwencji aminokwasowej końca N:

Id. Sekw. nr 3

MKPLVVFVLGG którą opisano dla cytoplazmatycznej, erytrocytamej PAF-AH w Stafforini i in. (1993), wyżej. Nową sekwencję (Id. Sekw. nr 2) wykorzystano do klonowania cDNA ludzkiej osoczowej PAF-AH, jak to opisano niżej w przykładzie 3.

Przykład 3

Z biblioteki cDNA makrofagów wyizolowano klon pełnej długości, kodujący ludzką osoczową PAF-AH.

A. Konstruowanie biblioteki cDNA makrofagów

PoliA+ zebrano z makrofagów pochodzących z monocytów krwi obwodowej. Dwuniciowy, tępo zakończony cDNA wytworzono przy użyciu zestawu Invitrogen Copy Kit (San Diego, CA) i poddano ligacji z adaptorami BstXI przez wprowadzeniem do ssaczego wektora ekspresyjnego pRc/CMV (Invitrogen). Powstałe plazmidy wprowadzono do E. coli szczepu XL-1 Blue przez elektroporację. Transformowane bakterie wysiano w gęstości około 3000 kolonii na szalki z agarozą w ilości 978 szalek. Plazmidowy DNA wytworzony osobno z każdej szalki pozostawiono w indywidualnych pulach jak również połączono w większe pule reprezentujące po 300000 klonów.

B. Przeszukiwanie biblioteki przez PCR

Bibliotekę makrofagów przeszukiwano reakcją łańcuchową polimerazy stosując zdegenerowany oligonukleotydowy starter do PCR oparty na nowej sekwencji aminokwasowej końca N opisanej w przykładzie 2. Sekwencję startera podano niżej według nomenklatury IUPAC, w której I oznacza inozynę.

190 532

Id. Sekw. nr 4 'ACATGAATTCGGIATCYTTIGTYTGICCRAA3'

W celu wybrania nukleotydów w trzeciej pozycji każdego kodonu startera wykorzystano tabele wyboru kodonów Wada i in., Nuci. Acids Res., 19S: 1981-1986 (1991). Starter zastosowano w kombinacji ze starterem swoistym dla sekwencji promotora SP6 albo T7, które to flankują miejsce klonowania pRc/CMV, w celu przeszukiwania pul biblioteki makrofagów zawierających po 300000 klonów. Wszystkie reakcje PCR zawierały 100 ng matrycowego DNA, 1 ąg każdego ze starterów, 0,125 mM każdego z dNTP, 10 mM Tris-HCl pH 8,4, 50 mM MgCl2 i 2,5 jednostki polimerazy Taq. Po początkowym etapie denaturacji w 94°C przez 4 minuty następowało 30 cykli amplifikacji obejmujących 94°C przez 1 minutę, 60°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty. Powstały produkt PCR klonowano do pBluescript SK-(Stratagene, La Jolla, Ca), zaś sekwencję nukleotydową określano metodą przerywania łańcucha didezoksynukleotydami. Produkt PCR zawierał sekwencję przewidzianą dla nowej sekwencji peptydowej i odpowiadał nukleotydom 1 do 331 Id. Sekw. nr 7.

Podane niżej startery PCR, które są swoiste dla klonowanego fragmentu PCR opisanego wyżej zaprojektowano w celu identyfikacji klonu pełnej długości.

starter sensowny (Id. Sekw. nr 5) 'TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG3 ' starter antysensowny (Id. Sekw. nr 6) 'CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC3 '

Reakcje PCR z wykorzystaniem, starterów przeprowadzono w opisany wyżej sposób, w celu wstępnego przesiewania pul cDNA po 300000 klonów, a następnie odpowiedni zestaw mniejszych pul po 3000 klonów. Trzy pule po 3000 klonów, które dawały produkt PCR o oczekiwanej wielkości zastosowano do transformowania bakterii.

C. Przeszukiwanie biblioteki przez hybrydyzację

DNA z transformowanych bakterii przeszukiwano przez hybrydyzację stosując oryginalny klonowany fragment PCR jako sondę. Kolonie odbito na nitrocelulozie i prehybrydyzowano i hybrydyzowano w 50% formamidzie, 0,75 M chlorku sodu, 0,075 M cytrynianie sodu, 0,05 M fosforanie sodu, pH 6,5, 1% poliwinylopirolidonie, 1% ficollu, 1% albuminie surowicy bydlęcej i 50 ng/ml sonikowanego DNA spermy łosia. Sondę hybrydyzacyjną znakowano losowymi heksamerami. Po całonocnej hybrydyzacji w 42°C, membrany płukano intensywnie w 0,03 M chlorku sodu, 3 mM cytrynianie sodu, 0,1% SDS w 42°C. Oznaczono sekwencję nukleotydową 10 hybrydyzujących klonów. Jeden z klonów, sAH406-3, zawierał sekwencję przewidzianą oryginalną sekwencją peptydową aktywności PAF-AH oczyszczonej z ludzkiego osocza. Sekwencja DNA i wywnioskowana sekwencja aminokwasową ludzkiej osoczowej PAF-AH podana jest w, odpowiednio, Id. Sekw. nr 7 i 8.

Klon sAH406-3 zawierał wstawkę wielkości 1,52 kb o otwartej ramce odczytu, która kodowała przewidywane białko wielkości 441 aminokwasów. Na końcu aminowym względnie hydrofobowy segment 41 reszt poprzedza aminokwas końca N (izoleucynę w pozycji 42 Id. Sekw. nr 8) zidentyfikowany mikrosekwencjonowaniem. Kodowane białko może więc mieć długą sekwencję sygnałową albo sekwencję sygnałową z dodatkowym peptydem, który jest odcinany dając dojrzały funkcjonalny enzym. Obecność sekwencji sygnałowej jest jedną z cech charakterystycznych białek wydzielniczych. Oprócz tego, białko kodowane przez klon sAH406-3 obejmuje motyw zgodności GxSxG (aminokwasy 271-275 Id. Sekw. nr 8), któiy, jak się uważa zawiera aktywne miejsce seryny wszystkich znanych ssaczych lipaz, lipaz drobnoustrojów oraz proteaz serynowych. Patrz, Chapus i in., Biochimie 70:1223-1224 (1988) i Brenner Nature 334:528-530 (1988).

Tabela 2 jest porównaniem składu aminokwasowego ludzkiej osoczowej PAF-AH według wynalazku jak przewidywana z Id. Sekw. nr 8 i składu aminokwasowego materiału oczyszczonego według Stafforini i in., (1987)) wyżej.

190 532

Tabela 2

	Klon SAH406-3	Stafforini i in.
Ala	26	24
Asp i Asn	48	37
Cys	5	14
Glu i Gin	36	42
Phe	22	12
Gly	29	58
His	13	24
Ile	31	17
Lys	26	50
Leu	40	26
Met	10	7
Pro	15	11
Arg	18	16
Ser	27	36
Thr	20	15
Val	13	14
^Trp	7	nie oznaczono
Tyr	14	13

Skład aminokwasowy dojrzałej postaci ludzkiej osoczowej PAF-AH według wynalazku i skład aminokwasowy uprzednio oczyszczonego materiału uważanego za ludzką osoczową PAJF-AH jest wyraźnie inny.

Gdy spróbowano przyrównać sekwencję nukleotydową i aminokwasową Hattori i in., wyżej i sekwencje nukleotydową i aminokwasową ludzkiej osoczowej PAF-AH nie obserwowano żadnego podobieństwa budowy w obu sekwencjach.

Przykład 4

Podczas przeprowadzania PCR na cDNA makrofagów i pobudzonych PBMC z użyciem starterów hybrydyzujących z nie ulegającym translacji regionem 5' (nukleotydy 31-52 Id. Sekw. nr 7) i regionem obejmującym kodon przerywający translację na końcu 3' cDNA PAJF-AH (nukleotydy 1465-1487 Id. Sekw. nr 7) wykryto odmianę składania transkryptu ludzkiego genu PAF-AH. Reakcje PCR dały dwa prążki na żelu, jeden odpowiadający oczekiwanej wielkości cDNA PAF-AH z przykładu 3 i drugi o około 100 bp krótszy. Sekwencjonowanie obu nici wykazało, że większy prążek był cDNA PAF-AH z przykładu 3 podczas, gdy krótszy prążek pozbawiony był egzony 2 (przykład 5, niżej) o sekwencji, która koduje domniemany sygnał i sekwencje propeptydową osoczowej PAF-AH. Przewidywana triada katalityczna

190 532 i wszystkie cysteiny obecne były w krótszym klonie, stąd aktywność biochemiczna białka kodowanego przez klon prawdopodobnie jest taka sama, co enzymu osoczowego.

W celu zbadania znaczenia biologicznego odmiany składania PAF-AH, która jak się sądzi koduje białko aktywne cytoplazmatycznie, badano względną częstość występowania obu postaci w makrofagach pochodzących z monocytów krwi testem ochrony przez RNazą. Żaden z transkryptów nie występował w świeżo izolowanych monocytach, ale oba transkrypty znaleziono w 2 dniu różnicowania monocytów w makrofagi in vitro, gdzie pozostawały do 6 dnia hodowli. Ilość obu transkryptów była zasadniczo równa przez okres różnicowania. W przeciwieństwie, podobne analizy tkanek nerwowych wykazały obecność jedynie transkryptu pełnej długości kodującego zewnątrzkomórkowąpostać PAF-AH pełnej długości.

Przykład 5

Wyizolowano również sekwencje genomowe ludzkiej osoczowej PAF-AH. Budowę genu PAF-AH określono przez wyizolowanie klonów fagów lambda i P1 zawierających ludzki genomowy DNA przez hybrydyzację DNA w warunkach wysokiej surowości. Fragmenty klonów fagowych klonowano i sekwencjonowano stosując startery zaprojektowane tak, aby przyłączały się w regularnych odstępach w klonie cDNA sAH406-3. Oprócz tego, zaprojektowane nowe startery przyłączające się w regionie intronów flankujących egzony zastosowano do sekwencjonowania wstecznego przez połączenia egzon-intron w celu potwierdzenia sekwencji. Połączenia egzon-intron określono jako punkty, w których różniły się sekwencje genomowe i sekwencje cDNA. Analizy te wykazały, że ludzki gen PAF-AH obejmował 12 egzonów.

Egzony 1, 2, 3, 4, 5, 6 i część 7 wyizolowano z biblioteki łożyska męskiego płodu skonstruowanej w lambda FIX (Stratagene). Łysinki fagów odbito na nitrocelulozie i prehybrydyzowano i hybrydyzowano w 50% formamidzie, 0,75 M chlorku sodu, 75 mM cytrynianie sodu, 50 mM fosforanie sodu, pH 6,5, 1% poliwinylopirolidonie, 1% ficollu, 1% albuminie surowicy bydlęcej i 50 ng/ml sonikowanego DNA spermy łosia. Sondę hybrydyzacyjną zastosowano do identyfikacji klonu fagowego zawierającego egzony 2-6 i część 7 obejmujące cały klon cDNA sAH406-3. Klon obejmujący egzon 1 zidentyfikowano stosując fragment pochodzący z końca 5' klonu cDNA (nukleotydy 1 do 312 Id. Sekw. nr 7). Obie sondy znakowano ³²P losowymi starterami. Po całonocnej hybrydyzacji w 42°C membrany płukano intensywnie w 30 mM chlorku sodu, 3 mM cytrynianie sodu, 0,1% SDS w 42°C. Sekwencje DNA egzonów 1, 2, 3, 4, 5 i 6 wraz z częścią otaczających sekwencji intronu podano odpowiednio w Id. Sekw. nr 9, 10, 11, 12, 13 i 14.

Pozostałość egzony 7, jak również egzonów 8, 9, 10, 11 i 12 klonowano z klonu P1 wyizolowanego z ludzkiej biblioteki genomowej P1. Łysinki fagów P1 odbito na nitrocelulozie i prehybrydyzowano i hybrydyzowano w 50% formamidzie, 0,75 M chlorku sodu, 75 mM cytrynianie sodu, 50 mM fosforanie sodu, pH 7,4, 5 mM EDTA, 1% poliwinylopirolidonie, 1% ficollu, 1% albuminie surowicy bydlęcej, 0,5% SDS i 0,1 mg/ml całkowitego ludzkiego DNA. Sonda hybrydyzacyjna znakowana ^P losowymi heksamerami obejmowała 2,6 kb fragment EcoRI genomowego DNA pochodzącego z końca 3' klonu lambda wyizolowanego jak wyżej. Fragment ten zawierał egzon 6 i część egzonu 7 obecnego w klonie fagowym. Po całonocnej hybrydyzacji w 65°C membrany płukano w opisany wyżej sposób. Sekwencje DNA egzonów 7, 8, 9, 10, 11 i 12 wraz z częścią otaczających sekwencji intronu podano odpowiednio w Id. Sekw. nr 15, 16, 17, 18, 19 i 20.

Przykład 6

Klony cDNA pełnej długości cytoplazmatycznej PAF-AH wyizolowano z bibliotek cDNA myszy, psa, bydła i kury oraz częściowy klon szczurzy wyizolowano z biblioteki cDNA grasicy szczura. Klony zidentyfikowano przez hybrydyzację w warunkach niskiej surowości z ludzkim cDNA (warunki hybrydyzacji były takie same jak opisane dla egzonów 1 do 6 w przykładzie 5 z takim wyjątkiem, że zastosowano 20% formamid zamiast 50% formamidu). Fragment Hindlll wielkości 1 kb ludzkiego klonu cDNA sAH406-3 PAF-AH (nukleotydy 309-1322 Id. Sekw. nr 7) zastosowano jako sondę. Oprócz tego, częściowy klon małpi wyizolowano z cDNA mózgu makaka stosując PCR z użyciem starterów opartych na nukleotydach 285-303 i 851-867 Id. Sekw. nr 7. Sekwencje nukleotydowe i wywnioskowane sekwencje aminokwasowe klonów cDNA myszy, psa, bydła, kury, szczura i makaka podano odpowiednio na Id. Sekw. nr 21, 22, 23, 24, 25 i 26.

190 532

Porównanie wywnioskowanych sekwencji aminokwasowych klonów cDNA z ludzkim klonem cDNA daje wartości procentowe podane w tabeli 3, poniżej.

Tabela 3

	Człowiek	Pies	Mysz	Bydło	Kura
Pies	80	100	64	82	50
Mysz	66	64	100	64	47
Małpa	92	82	69	80	52
Szczur	74	69	82	69	55
Bydło	82	82	64	100	50
Kura	50	50	47	50	100

Około 38% reszt jest całkowicie zakonserwowanych we wszystkich sekwencjach. Większość różniących się regionów są to końce aminowe (zawierające sekwencje sygnałowe) i końce karboksylowe, które, jak pokazano w przykładzie 10, nie są krytyczne dla aktywności enzymatycznej. Motyw Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly (Id. Sekw. nr 27) spotykany w obojętnych lipazach i innych esterazach był zakonserwowany w PAF-AH bydła, psa, myszy, szczura i kury. Centralna seryna tego motywu służy jako nukleofilowe miejsce aktywne tych enzymów. Przewidywane składniki miejsca aktywnego, asparaginian i histydyna (przykład 10A) były również zakonserwowane. Ludzka osoczowa PAF-AH według wynalazku wydaje się wykorzystywać katalityczną triadę i może stanowić konformację hydrolazy a/β obojętnych lipaz, nawet jeżeli nie wykazuje homologii sekwencji z lipazami.

Ponadto, ludzka osoczowa PAF-AH powinna posiadać region, który pośredniczy w swoistych oddziaływaniach z cząstkami lipoprotein niskiej i wysokiej gęstości w osoczu. Oddziaływanie z tymi cząsteczkami może zachodzić przez N-końcową część cząsteczki, która wykazuje długie ciągi silnie zakonserwowanych międzygatunkowo aminokwasów, ale nie zawiera triady katalitycznej enzymu.

Przykład 7

W celu określenia, czy klon cDNA ludzkiej osoczowej PAF-AH sAH406-3 (przykład 3) koduje białko o aktywności PAF-AH, konstrukt ekspresyjny pRc/CMV poddano przejściowej ekspresji w komórkach COS7. Trzy dni po transfekcji metodą dekstranu DEAE, pożywkę komórek COS badano na aktywność PAF-AH.

Komórki wysiano w gęstości 300000 komórek/60 mm szalkę hodowlaną. Następnego dnia, komórki inkubowano w DMEM zawierającej 0,5 mg/ml dekstranu DEAE, 0,1 mM chlorochiny i 5-10 pg plazmidowego DNA przez 2 godziny. Następnie komórki traktowano 10% DMSO w roztworze soli buforowanym fosforanem przez 1 minutę, płukano pożywką i inkubowano w DMEM zawierającej 10% surowicę płodową cielęcą, traktowaną uprzednio diizopropylofluorofosforanem (DFP) w celu inaktywacji endogennej PAF-AH surowicy bydlęcej. Po 3 dniach inkubacji, pożywkę z transfekowanych komórek badano na aktywność PAF-AH. Testy przeprowadzono w obecności i pod nieobecność 10 mM EDTA albo 1 mM DFP w celu określenia czy rekombinowany enzym jest niezależny od wapnia i hamowany przez inhibitor esterazy serynowej DFP jak to uprzednio opisano dla osoczowej PAF-AH przez Stafforini i in., (1987) wyżej. Kontrole negatywne obejmowały komórki transfekowane pRc/CMV pozbawione wstawki albo zawierające sAH406-3 w odwrotnym położeniu.

Aktywność PAF-AH w nadsączach transfektantów oznaczano metodą Stafforiniego i in., (1990) wyżej, z następującymi modyfikacjami. Pokrótce, aktywność PAF-AH oznaczono przez pomiar hydrolizy ^rH-octanu z [acetylo-³H] PAF (New England Nuclear, Boston, MA).

190 532

Wolny, rozpuszczony w wodzie ³H-octan oddzielono od znakowanego substratu przez chromatografię kolumnową w odwróconych fazach na wkładkach z żelem oktadecylo-krzemionkowych (Baker Research Product, Phillipsburg, PA). Testy przeprowadzono stosując 10 μΐ nadsączu transfektantów w buforze 0,1 M Hepes, pH 7,2 w objętości reakcyjnej 50 μΐ Na reakcję zastosowano 50 pmoli substratu w stosunku znakowanego pAf do nieznakowanego równym 1:5. Reakcje inkubowano przez 30 minut w 37°C i zahamowano przez dodanie 40 μΐ 10 M kwasu octowego. Roztwór przepuszczono przez wkładki z żelem oktade-cylokrzemionkowym, który płukano następnie 0,1 M octanem sodu. Wodny eluat z każdej z próbek zbierano i zliczano w scyntylacyjnym liczniku ciekłofazowym przez minutę. Aktywność enzymu wyrażano w zliczeniach na minutę.

Jak pokazano na figurze 2, pożywki z komórek transfekowanych sAH406-3 zawierały aktywność PAF-AH w ilości 4-krotnie większej niż tło. Aktywność ta nie była zakłócana przez obecność EDTA, ale znosiła ją obecność 1 mM DFP. Obserwacje te wykazują, że klon sAH406-3 koduje aktywność zgodną z ludzkim enzymem osoczowym PAF-AH.

Przykład 8

DNA ludzkiej osoczowej PAF-AH pełnej długości i różnie okrojone oraz chimeryczne mysio-ludzkie DNA PAF-AH wyrażano w E. coli i drożdżach i stabilnie wyrażano w komórkach ssaczych metodami rekombinacyjnymi.

A. Ekspresja w E. coli

W celu wytworzenia białka kodowanego przez fragment cDNA ludzkiej osoczowej PAF-AH z klonu sAH406-3 zastosowano PCR, co umożliwiło łatwe klonowanie do wektora ekspresyjnego E. coli. Klonowany segment rozpoczynał się na końcu 5' ludzkiego genu kodonem, który kodował Ile4₂ (Id. Sekw. nr 8), resztę końca N enzymu oczyszczonego z osocza ludzkiego. Pozostałość genu do naturalnego kodonu przerywającego włączono do konstruktu. Zastosowanym starterem sensownym 5' był

Id. Sekw. nr 28

5'TATT^<CT7^(^yA^TT,AT^^M^^^(^CA^GTyA^T^^/A'C^(^(^T^(^(CT(G^.AAG3' i zawierał miejsce klonowania XbaI, jak również kodon początku translacji (podkreślony). Antysensownym starterem 3' był

Id. Sekw. nr 29

5'ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATTCCTG3' i obejmował on kodon przerywający sAH406-3 i zawierał miejsce klonowania EcoRV. Reakcje PCR przeprowadzano zasadniczo jak to opisano w przykładzie 3. Powstały produkt PCR trawiono XbaI i EcoRV i klonowano do wektora pBR322 zawierającego promotor Trp (deBoer i in., PNAS 80:21-25 (1983)) bezpośrednio powyżej miejsca klonowania. Szczep XL-1 Blue E. coli transformowano konstruktem ekspresyjnym i hodowano w brzeczce L zawierającej 100 μg/ml karbemcylmy. Transformanty z całonocnych hodowli wirowano i osad zawieszano w buforze do lizy zawierającym 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl,. 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 100 μg/ml lizozymu i 0,05 jednostek hamujących trypsynę (TIU)/ml aprotyniny. Po 1-godzinnej inkubacji na lodzie i sonikacji przez 2 minuty, lizaty badano na aktywność PAF-AH sposobem opisanym w przykładzie 4. E. coli transformowane konstruktem ekspresyjnym (oznaczonym trp AH) wytworzyły produkt o aktywności PAF-AH. Patrz, tabela 6 w przykładzie 9.

Konstrukty obejmujące trzy dodatkowe promotory, promotor tacll (deBoer, wyżej), promotor arabinozy (ara) B z Salmonella typhimurium (Horvitz i in., Gene 14:309-319 (1981)) i promotor bakteriofaga T7, zastosowano również do napędzania ekspresji sekwencji ludzkiego PAF-AH w E. coli. Konstrukty obejmujące promotor Trp (pUC trp AH), promotor tacll (pUC tac AH) i promotor araB (pUC ara AH) połączono w plazmidzie pUC (New England Biolabs, mA), podczas gdy konstrukt obejmujący promotor T7 (pET AH) połączono w plazmidzie pET15B (Novagen, Madison, WI). Konstrukt zawierający promotor hybrydowy pHAB/PH, obejmujący promotor araB poddany fuzji z miejscami wiązania rybosomu regionu promotora T7 połączono również w pET15B. Wszystkie konstrukty E. coli wytwarzały

190 532 aktywność PAF-AH w zakresie od 20 do 50 U/ml/OD600· Aktywność ta odpowiadała całkowitej masie białka ^kombinowanego > 1 %o cołkcwitagc białka komórek.

Badano również kilka konstruktów ekspresyjnych E. coli, które wytwarzały PAF-AH o wydłużonym końcu aminowym. Koniec N naturalnej csocccwej PAF-AH zidentyfikowano sekwencjonowęniem amlnokwoscwym jako Ile4₂ (przykład 2). Jednakże, sekwencja bezpośrednio powyżej Ile42 nie zgadzała się z aminokwasami spotykanymi w miejsca odcięcia sekwencji sygnałowej (tj. nie była zachowana zasada „-3-1-” ponieważ nie znaleziono lizyny w położeniu -1; patrz von He^jne, Nuci. Acids Res., 14:4683-4690 (1986)). Prawdopodobnie, bardziej najbardziej klasyczna sekwencja (M1-A17 albo M1-P21) jest rozpoznawana przez komórkowy układ eydzlalnicc.y, po cięciu proteolitycznym. Całkowita sekwencja kodująca PAF-AH począwszy od początkowej metioniny (nukleotydy 162-1487 Id. Sekw. nr 7) ccstoła zaprojektowana do ekspresji w E. coli przy użyciu promotora trp. Jak aokępono na tabeli 4, konstrukt ten wytwarzał aktywną. PAF-AH, ale ekspresja wynosiła tylko 1/50 poziomu cryginęlnago konstruktu rozpoczynającego się Ile42. Inny konstrukt ekspresyjny, rozpoczynający się Val]₈(nukleotydy 213-1487 Id. Sekw. nr 7) wytwęrcał aktywną PAF-AH na poziomie około 1/30 oryginalnego konstruktu. Wyniki te sugenuą że wydłużenia na końcu aminowym nie są krytyczne ani konieczne dla aktywności rekcmbincwonaj PAF-AH wytwarzanej w E. coli.

Tabela 4

	Aktywność PAF-AH (U/ml/OD₆00)
Konstrukt	Lizat	Pożywka
pUC trp AH (Ile42 koniec N)	177,7	0,030
pUC trp AH Met	3,1	0,033
pUC trp AH Valn	54,6	0,003

Okrojony, rekcmbincwany produkt ludzkiej PAF-AH wytwarzano również w E. coli stosując plazmid o niskiej liczbie kopii i promotor, który można indukować przez dodanie do hodowli arabinccy. Jeden z takich okrojonych N-końcowo produktów PAF-AH jest produktem rekombinacji DNA kodującego reszty aminokwasowe Met4₆ do Asn44i polipeptydu kodowanego przez cDNA PAF-AH pełnej długości (Id. Sekw. nr 80 i jest oznaczony rPH.2. Plazmidem zastosowanym do wytwarzania rPH.2 w komórkach bakteryjnych był pBAR2/PH.2, plazmid oparty na pBR322, który niesie (l) nukleotydy 297 do 1487 Id. Sekw. nr 7, kodującego ludzkie PAF-AH począwszy od kodonu metioniny w pozycji 46, (2) promotory araB-C i gen araC z operonu aroblnozy Salmonella typ^mu-ium, (3) sekwencje przerywającą transkrypcję z bakteriofaga T7, oraz (4) początek replikacji z bakteriofaga fl.

Konkretnie, pBAR2/PH.2 obejmował następujące segmenty DNA: (l) od uszkodzonego miejsca Aatn w pozycji 1994 do miejsca EcoRI na nuklactzdzie 6274, sekwencję wektora zawierającą początek replikacji i geny kodujące oporność na ampl^ylinę albo tetracyklinę pochodzącą z plazmidu bakteryjnego pBR322; (2) od miejsca EcoRI w pozycji 6274 do miejsca XbaI w pozycji 131, DNA z operonu yręblnccy Salmonella typhimurium (numery dostępu GenBank M11045, M11046, Ml 1047, J01797); (3) od miejsca Xbal w pozycji 131 do miejsca NcoI w pozycji 170, DNA zawierający miejsce wiązania rybosomu z pET-21b (Novogen, Madison, WI); (4) od miejsca Ncol w pozycji 170 do miejsca XhoI w pozycji 1363, ludzkiej sekwencji cDNA PAF-AH; i (5) od miejsca XhoI w pozycji 1363 do uszkodzonego miejsca AatU w pozycji 1993, fragment DNA z pET-21b, który zawierał sekwencję przerywającą transkrypcję z bakteriofaga T7 oraz początek replikacji z bakteriofaga fl.

Inny produkt PAF-AH, oznaczony rPH.9, jest rekomblncwęnvm produktem ekspresji DNA kodującego reszty αminokwoscwe od Met4₆ do Ile429 pcliaeatydu kodowanego przez cDNA pełnej długości PAF-AH (Id. Sekw. nr 8). DNA kodujący rPH.9 wprowadzono do tego

190 532 samego wektora zastosowanego do wytwarzania rPH.2 w komórkach bakteryjnych. Plazmid ten oznaczono pBAR2/PH.9 i włączono konkretnie następujące sekwencje DNA: (1) od uszkodzonego miejsca AatII w pozycji 1958 do miejsca EcoRI na nukleotydzie 6239 sekwencji wektora zawierającej początek replikacji i geny kodujące oporność na ampicylinę albo tetracyklinę pochodzące z plazmidu bakteryjnego pBR3221 (2) od miejsca EcoRI w pozycji 6239 do miejsca Xbal w pozycji 131, DNA z opreonu arabinozy Salmonella typhimurium (numery dostępu GenBank M11045, Ml 1046, M11047, J01797); (3) od miejsca Xbal w pozycji 131 do miejsca Ncol w pozycji 170, DNA zawierający miejsce wiązania rybosomu zpET-21b (Novagen, Madison, WI); (4) od miejsca Ncol w pozycji 170 do miejsca XhoI w pozycji 1328, ludzkiej sekwencji cDNA PAF-AH; (5) od miejsca XhoI w pozycji 1328 do uszkodzonego miejsca AatE w pozycji 1958, fragment DNA z pET-21b, który zawierał sekwencję przerywającą transkrypcję z bakteriofaga T7 oraz początek replikacji z bakteriofaga fl.

Ekspresja produktów PAF-AH w pBAR2/PH.2 i pBAR2/PH.9 znajdowała się pod kontrolą promotora araB, który jest ściśle represjonowany w obecności glukozy i pod nieobecność arabinozy, ale działa jako silny promotor po dodaniu arabinozy do hodowli pozbawionych glukozy. Selekcję komórek zawierających plazmid można przeprowadzić przez dodanie do pożywki hodowlanej amplicyliny (albo pokrewnego antybiotyku) albo tetracykliny. Jako gospodarzy do rekombinacyjnej ekspresji produktów PAF-AH można zastosować wiele różnych szczepów E. coli, w tym, choć nie wyłącznie szczepów prototrofowych pod względem metabolizmu arabinozy takich jak W3110, DH5a, BL21, C600, JM101 i ich pochodnych, szczepów zawierających mutacje zmniejszające proteolizę takich jak CAG629, KY1429 oraz szczepów z defektem zdolności degradacji arabinozy takich jak SB7219 i MC 1061. Zaletą zastosowania szczepu, który jest niezdolny do rozkładu arabinozy jest to, ze induktor (arabinoza) wytwarzania PAF-AH nie jest zużywany w pożywce podczas okresu indukcji, wywołując wyższy poziom PAF-AH w porównaniu z poziomem osiąganym przy użyciu szczepów, które są zdolne do metabolizowania arabinozy. Do wyrażania aktywnej PAF-AH w różnych szczepach E. coli można zastosować dowolną pożywkę i warunki hodowli. Przykładowo, Przykładowo, zarówno bogata pożywka taka jak LB, EDM295 (pożywka oparta na M9 z dodatkiem ekstraktu drożdżowego i kazeiny poddanej hydrolizie kwaśnej), jak i pożywki „zdefiniowane” takie jak A675, podstawowa minimalna pożywka A o pH 6,75 z dodatkiem gliceryny jako źródła węgla i pierwiastkami śladowymi i witaminami, umożliwiają istotne wytwarzanie produktów rPAF-AH. Tetracyklina jest włączana do pożywek w celu utrzymania selekcji plazmidu.

Plazmid pBAR2/PH.2 transformowano do szczepu MC1061 E. coli (ATCC 53338), który niósł delecję operonu arabinozy, a więc nie mógł metabolizować arabinozy. MC 1061 jest również auksotrofem leucyny i był hodowany w procesie „batch-fed” z użyciem zdefiniowanej pożywki zawierającej kwasy kasaminowe, które uzupełniały mutację leucyny.

Komórki E. coli M1061 transformowane pBAR2/PH.2 hodowano w 30°C w pożywce zawierającej porcję 2 g/l glukozy. Glukoza służyła dwóm celom, jako źródło węgla do wzrostu komórek oraz jako represor promotora arabinozy. Gdy porcja glukozy została wyczerpana (< 50 mg/l), rozpoczęto dostarczanie substancji odżywczych (300 g/l glukozy). Odżywianie zwiększano liniowo przez 16 godzin w tempie, które ograniczało tworzenie kwasowego produktu ubocznego. Równocześnie dodano 500 g/l arabinozy, do stężenia końcowego 5 g/l. Dostarczanie gliceryny utrzymywano na stałym poziomie przez 22 godziny. Komórki zebrano stosując filtrowanie przez puste włókna, osiągając 10-krotne zatężenie zawiesiny. Osad komórkowy przechowywano w -70°C. Otrzymano końcową masę komórek o 80 g/litr (OD600 = 50-60) i aktywności PAF-AH 65-70 U/OD/ml stanowiącej około 10^o% całkowitej masy białka. Objętość końcowa około 75 litrów zawierała 50-60 g PAF-AH.

Wysoki poziom produkcji PAF-AH można osiągnąć gdy pBAR2/PH.2 albo PH.9 wyrażany jest przez szczepy SB7219 albo MC 1061. Inne szczepy pozbawione zdolności rozkładu arabinozy są przydatne do wytwarzania w wielkiej gęstości komórkowej. Korzystnie, komórki hoduje się w następujących warunkach. Rosnące wykładniczo szczepy SB7219;pBAR2/PH.2 oraz SB7219;pBAR2/PH.9 wysiewa się do fermentatorów zawierających porcję pożywki zawierającej 2 g/l glukozy. Po zużyciu glukozy, pojemniki odżywia się roztworem gliceryny

190 532 zawierającym pierwiastki śladowe, witaminy, sole magnezu i amonu w celu podtrzymania wzrostu wykładniczego. Pojemniki utrzymuje się w temperaturze 30°C, doprowadzając powietrze zaopatrujące w tlen i wytrząsając w celu utrzymania rozpuszczonego tlenu na poziomie powyżej 15% wy sycenia. Gdy gęstość komórek wynosi powyżej 110 g/l (wilgotnej masy komórek) hodowlę odżywia się w sposób ciągły i doprowadza się porcję L-arabinozy (około 0,5% całości). Wytwarzanie produktu obserwuje się przez 16-22 godziny. Hodowle zwykle osiągają 40-50 g/l (suchego ciężaru komórek). Komórki zbiera się przez odwirowanie, przechowuje w -70°C i oczyszcza się produkt PAF-AH do analizy. Uzyskuję się produktywność właściwą wynoszącą 150 jednostek/ml/OD6₀₀·

B. Ekspresja w komórkach drożdży

Rekombinowaną ludzką PAF-AH wyrażano również w Saccharomyces cerevisiae. Do napędzania ekspresji rPAF-AH zastosowano promotor ADH i wytworzono 7 U/ml/OD600 (tabela 5, niżej).

Tabela 5

Konstrukt	Promotor	Szczep	Aktywność enzymu (U/ml/OD600)
pUC tac AH	tac	E.coli W3110	30
pUC trp AH	^trp	E.coli W3110	40
pUC ara AH	araB	E.coli W3110	20
pETAH	T7	E. coli BL21 (DE3) (Novagen)	50
pHAB/PH	araB/T7	E.coli XL-1	34
pBAR2/PH.2	araB	MC1061	90
pYep ADH2 AH	ADH2	Drożdże BJ2.28	7

C. Ekspresja PAF-AH w komórkach ssaków

1. Ekspresja konstruktów cDNA ludzkiee PAF-AH

Plazmidy konstruowane do ekspresji PAF-AH, z wyjątkiem pSFN/PAFAH. 1, wykorzystywały silny promotor wirusowy z wirusa cytomegalii, miejsce poliadenylacji z genu bydlęcego hormonu wzrostu oraz początek replikacji SV40 w celu umożliwienia replikacji w wielkiej liczbie kopii plazmidu w komórkach COS. Plazmidy wprowadzano do komórek przez elektroporację.

Skonstruowano pierwszy zestaw plazmidów, w którym sekwencję flankującą 5' (pDCl/PAFAH.1) albo sekwencje flankujące 5' i 3' (PDCl/PAFAH. 2) cDNA ludzkiego PAF-AH zastąpiono sekwencjami flankującymi z innych genów, o których wiadomo, że są wyrażane w komórkach ssaków w znacznych ilościach. Transfekcja tych plazmidów do komórek COS, CHO albo 293 prowadzi do produkcji PAF-AH na mniej więcej tym samym poziomie (0,01 jednostki/ml albo 2-4-krotnie powyżej tła), co klon sAH406-3 w przykładzie 7 po przejściowej transfekcji komórek COS. Skonstruowano inny plazmid, który obejmował zamiast promotora wirusa cytomegalii, promotor wirusa Frienda tworzenia ognisk w śledzionie. cDNA ludzkiej PAF-AH wprowadzono do plazmidu pmH-neo (Hahn i in., Gene 127:267 (1993)) pod kontrolą promotora wirusa Frienda tworzenia ognisk w śledzionie. Transfekcja komórek linii szpiczaka NSO plazmidem, który oznaczono pSFN/PAFAH. 1 i badanie przesiewowe kilkuset klonów spowodowało wyizolowanie dwóch transfektantow (4B11 i 1C11), które wytwarzały 0,15-0,5 jednostki/ml aktywności PAF-AH. Zakładając aktywność właściwą wynoszącą 5000 jednostek/mg, produktywność tych dwóch transfektantow odpowiadała około 0,1 mg/l.

190 532

2. Ekspresja mysio-ludzkiego konstruktu chimerycznego genu PAF-AH

Konstrukt (pRc/MS9) zawierający cDNA kodujący mysią PAF-AH w ssaczym wektorze ekspresyjnym pRc/CMV, spowodował wytwarzanie wydzielniczej PAF-AH na poziomie 5-10 jednostek/ml (1000-krotnie powyżej tła) po transfekcji do komórek COS. Zakładając aktywność właściwą mysiej PAF-AH wynoszącą mniej więcej tyle samo, co enzym ludzki, mysi cDNA wyrażany był na poziomie około 500-1000-krotnie wyższym, niż ludzki cDNA PAF-AH.

W celu zbadania różnicy pomiędzy poziomami ekspresji ludzkiej i mysiej PAF-AH w komórkach COS, skonstruowano dwa chimeryczne mysio-ludzkie geny i badano na ekspresję w komórkach COS. Pierwszy z tych konstruktów, pRc/PH.MHC1, zawierał sekwencję kodującą 97 aminokwasów końca N mysiego polipeptydu PAF-AH (Id. Sekw. nr 21) poddanych fuzji z 343 aminokwasami końca C ludzkiego PAF-AH w wektorze ekspresyjnym pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA). Drugi gen chimeryczny, w plazmidzie pRc/PH.MHC2, zawierał sekwencję kodującą 40 aminokwasów końca N mysiego polipeptydu PAF-AH poddanego fuzji z 400 resztami aminokwasowymi końca C ludzkiej PAF-AH w pRc/CMV. Transfekcja komórek COS przy użyciu pRc/PH.MHCl prowadzi do akumulacji 1-2 jednostek/ml aktywności PAF-AH w pożywce. Pożywki uwarunkowane pochodzące z komórek transfekowanych pRc/PH.MHC2 zawierały tylko 0,01 jednostki/ml aktywności PAF-AH. Z tych doświadczeń wynika, że różnica w poziomie ekspresji pomiędzy genami PAF-AH ludzkimi i mysimi spowodowana jest przynajmniej częściowo segmentowi polipeptydowemu pomiędzy resztami 40 i 97, albo odpowiadającym segmentom RNA albo DNA kodującym ten region białka PAF-AH.

3. Rejestrowanie pierwszych 290 bp sekwencji kodującej PAF-AH

Jedna z hipotez tłumaczących niski poziom syntezy ludzkiej PAF-AH w transfekowanych komórkach ssaczych tłumaczy to kodony wykorzystywane przez naturalny gen są suboptymalne do skutecznej ekspresji. Jednakże, nie wydaje się, aby wykorzystanie kodonów mogło spowodować 500-1000-krotną różnicę w poziomie ekspresji pomiędzy genami mysimi i ludzkimi, ponieważ optymalizowane kodony generalnie wywierają najczęściej tylko 10-krotny wpływ na ekspresję. Druga hipoteza tłumaczy różnicę pomiędzy poziomem ekspresji PAF-AH mysiej i ludzkiej tym, że mRNA ludzkiej PAF-AH na końcu 5' tworzy strukturę drugorzędową, która prowadzi do względnie szybkiego rozkładu mRNA albo powoduje nieskuteczne zapoczątkowanie translacji albo wydłużania.

W celu zbadania tej hipotezy, syntetyczny fragment kodujący autentyczne białko ludzkiej PAF-AH do reszty 96 końca aminowego, ale w którym większość kodonów została zastąpiona 9 „rejestrowana”) przez kodon o innej sekwencji, ale kodujący ten sam aminokwas. Zmiana drugiego kodonu z GTG na GTA spowodowała stworzenie miejsca Asp718, który znajdował się na końcu fragmentu syntetycznego i który występował w mysim cDNA. Drugi koniec fragmentu zawierał miejsce BamHI normalnie spotykane na kodonie 97 ludzkiego genu. Fragment AspB718/BamHI około 290 bp pochodzący z PCR, który wytworzono stosując podejście do niesymetrycznego PCR do konstruowania genów syntetycznych opisanych w Sandhu i in., Biotechniąues 12:14-16 (1992). Syntetyczny fragment Asp718/BamHI poddano ligacji z fragmentem DNA kodującym pozostałość ludzkiej cząsteczki PAF-AH począwszy od nukleotydu 453 Id. Sekw. nr 7, tak, że sekwencja kodująca autentyczny ludzki enzym PAF-AH został wprowadzony do ssaczego wektora ekspresyjnego pRc/CMY (Invitrogen, San Diego, CA) tworząc plazmid pRc/HPH.4. Kompletna sekwencja pokrewnych genów podana jest na Id. Sekw. nr 30. Sekwencja flankująca 5' sąsiadująca z ludzką sekwencją kodującą PAF-AH w pRc/HPH.4 pochodzi z mysiego cDNA kodującego PAF-AH w pRc/MS9 (nukleotydy 1 do 116 Id. Sekw. nr 21).

W celu zbadania ludzkiego PAF-AH z pRc/HPH.4, komórki COS były przejściowo traktowane pRc/HPH.4 (rejestrowany gen ludzki), pRc/MS9 (mysia PAF-AH) albo pRc/PH.MHCl (mysio-ludzka hybryda 1). Pożywkę uwarunkowaną transfekowanych komórek badano na aktywność PAF-AH i stwierdzono, że zawiera 5,7 jednostki/ml (gen mysi), 0,9 jednostki/ml (mysio-ludzka hybryda 1) albo 2,6 jednostek/ml (rejestrowany ludzki gen). Tak więc, strategia rejestrowania pierwszych 290 bp sekwencji kodującej PAF-AH pozwoliła na

190 532 zwiększenie ekspresji ludzkiego PAF-AH od kilku ng/ml do około 0,5 gg/ml w przejściowej transfekcji COS. Rejestrowany gen PAF-AH z pRc/HPH.4 zostanie wprowadzony do ssaczego wektora ekspresyjnego zawierającego gen reduktazy dihydrofolianu (DHFR) i komórki jajnika chomika chińskiego DHFR-ujemne transfekuje się wektorem. Komórki transfekowane poddaje się selekcji metotreksatem w celu otrzymania klonów wytwarzających największe ilości PAF-AH z powodu ekspresji.

Przykład 9

Rekombinowaną ludzką osoczową PAF-AH (rozpoczynającą się Ile4₂) wyrażaną w E. coli oczyszczano do pojedynczego prążka barwionego barwnikiem Coomassie na SDSPAGE różnymi sposobami i badano na aktywność wykazywaną przez natywny enzym PAF-AH.

A. Oczyszczanie rekombinowanej PAF-AH

Pierwsza wykorzystana procedura oczyszczania była podobna do opisanej w przykładzie 1 dla natywnej PAF-AH. Poniższe etapy prowadzono w temperaturze 4°C. Osad z 50 ml E. coli wytwarzających PAF-AH (transformowanych konstruktem ekspresyjnym trp AH) poddano lizie jak to opisano w przykładzie 8. Składnik stały usunięto przez wirowanie przy 10000 g przez 20 minut. Nadsącz wprowadzono z prędkością 0,8 ml/min, do kolumny Blue Sepharose Fast Flow (2,5 cm x 4 cm; objętość złoża 20 ml) zrównoważonej buforem D (25 mM-Tris-HCl, 10 mm CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 7,5). Kolumnę płukano 100 ml bufora D i eluowano 100 ml bufora A zawierającego 0,5 M KSCN z prędkością 3,2 ml/min. 15 ml aktywnej frakcji wprowadzono do 1 ml kolumny Cu Chelating Sepharose zrównoważonej buforem D. Kolumnę płukano 5 ml bufora D, a następnie eluowano 5 ml bufora D, zawierającego 100 mM imidazol pod wpływem siły grawitacji. Frakcje zawierające aktywność PAF-AH badano przez SDS-PAGE.

Wyniki oczyszczania pokazano na tabeli 6, w której jednostka równa się gmolowi hydrolizy PAF na godzinę. Produkt oczyszczania otrzymany w 4°C wykazywał w SDS-PAGE pojedynczy intensywny prążek poniżej znacznika 43 kDa z nieco rozmytym barwieniem bezpośrednio powyżej i poniżej. Rekombinowany materiał jest istotnie czystszy i wykazuje większą aktywność właściwą w porównaniu z preparatami PAF-AH z osocza z przykładu 1.

Tabela 6

Próbka	Obj. (ml)	Aktyw. (jedn./ml).	Akt. całk. (jedn.x10³)	Stęż. białka (mg/ml)	Akt. właść. (jedn./mg)	% odzysku aktywności	Krotność oczyszczeń
Lizat	4,5	989	4451	15,60	63	100	100	1,0	1,0
Blue	15,0	64	960	0,07	914	22	22	14,4	14,4
Cu	1,0	2128	2128	0,55	3869	220	48	4,2	61,0

Gdy ten sam protokół przeprowadzono w temperaturze pokojowej, oprócz prążka poniżej znacznika 43 kDa, grupa prążków poniżej znacznika 29 kDa korelowała z aktywnością PAP-AH w badanych skrawkach żelu. Te prążki o niższym ciężarze cząsteczkowym mogą być fragmentami proteolitycznymi PAF-AH, które zachowują aktywność enzymatyczną.

Różne procedury oczyszczania prowadzono również w temperaturze pokojowej. Osad (100 g) E. coli wytwarzających PAF-Ah (transformowanych konstruktem ekspresyjnym pUC trp AH) zawieszono w 200 ml bufora do lizy (25 mM Tris, 20 mM CHAPS, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 ąg/ml benzamidyny, pH 7,5) i poddawano lizie przez trzykrotne przepuszczenie przez mikrofluidyzer przy ciśnieniu 15000 psi. Części stałe usunięto przez wirowanie przy 14300 xg przez godzinę. Nadsącz rozcieńczono 10-krotnie w buforze do rozcieńczania (25 mM MES (kwas 2-[N-morfolino]etanosulfonowy), 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA pH 4,9) i wprowadzono z prędkością 25 ml/min, do kolumny S Sepharose Fast Flow (200 ml) (kolumna kationowymienna) zrównoważonej buforem E (25 mM MES, 10 mM CHAPS, 1 mM

190 532

EDTA, 50 mM NaCl, pH 5,5). Kolumnę płukano 1 litrem bufora E, eluowano 1 M NaCl i zbierano eluat w 50 ml frakcjach doprowadzonych do pH 7,5 przy użyciu 0,5 ml 2 M zasady Tris. Frakcje zawierające aktywność PAF-AH pulowano i doprowadzano do 0,5 M NaCl. Pulę S wprowadzono z prędkością 1 ml/min, do kolumny Blue Sepharose Fast Flow (2,5 cm x 4 cm; objętość złoża 20 ml) zrównoważonej buforem D (25 mM-Tris-HCl, 10 mm CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 7,5). Kolumnę płukano 100 ml bufora F i eluowano 100 ml bufora F zawierającego 3 M NaCl z prędkością 4 ml/min. Etap chromatografii na Blue Sepharose Fast Flow powtórzono w celu zmniejszenia ilości endotoksyny w próbce. Frakcje zawierające aktywność PAF-AH pulowano i dializowano wobec Bufora G (25 mM Tris pH 7,5, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 80, 1 mM EDTA).

Wyniki oczyszczania pokazano na tabeli 6, w której jednostka równa się pmolowi hydrolizy PAF na godzinę.

Tabela 7

Próbka	Obj. (ml)	Aktyw. (jedn./ml)	Akt. calk. (jedn.x10^J)	Stęż. białka (mg/ml)	Akt. właść. (jedn./mg)	% odzysku aktywności	Krotność oczyszczenia
Lizat	200	5640	1128	57,46	98	100	100	1	1
S	111	5742	637	3,69	1557	57	56	16	16
Blue	100	3944	394	0,84	4676	35	62	3	48

Produkt oczyszczania otrzymano w SDS-PAGE jako pojedynczy prążek poniżej markera 43 kDa z nieco rozmytym barwieniem poniżej i powyżej. Rekombinowany materiał jest istotnie czystszy i wykazuje większą aktywność właściwą w porównaniu z preparatami PAF-AH z osocza z przykładu 1.

Jeszcze inna procedura oczyszczania uwzględniana przez wynalazek obejmuje kolejne etapy lizy komórkowej, klarowania i chromatografii kolumnowej. Komórki rozcieńczono 1:1 w buforze do lizy (25 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Tween 80, 2 mM EDTA). Lizę prowadzono w schłodzonym mikro fluidyzerze przy ciśnieniu 15000-20000 psi trzykrotnie przepuszczając materiał i uzyskując > 99% zniszczenie komórek. Lizat rozcieńczono 1:20 w buforze do rozcieńczania (25 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA) i wporwadzono do kolumny wypełnionej złożem chromatograficznym Q-Sepharose Big Bead (Pharmacia) i zrównoważonej 25 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,015% Tween 80. Eluat rozcieńcza się 1:10 w 25 mM MES 5,5, 1,2 M siarczanie amonu, 1 mM EDTA i wprowadza do złoża chromatograficznego Butyl Sepharose (Pharmacia) zrównoważonego tym samym buforem. Aktywność PAF-AH eluuje się 25 mM MES pH 5,5, 0,1% Tween 80, 1 mM EdTa.

Jeszcze inny sposób oczyszczania enzymatycznie czynnej PAF-AH z E. coli uwzględniany przez wynalazek obejmuje: (a) preparowanie ekstraktu E. coli, co daje solubilizowany nadsącz PAF-AH po lizie w buforze zawierającym CHAPS; (b) rozcieńczanie nadsączu i wprowadzanie do kolumny anionowymiennej zrównoważonej do pH około 8,0; (c) eluowania enzymu PAF-AH z kolumny anionowymiennej; (d) wprowadzania eluatu z kolumny anionowymiennej do kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika; (e) eluowania enzymu PAF-AH z kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika przy użyciu bufora obejmującego około 3 M sól; (f) rozcieńczanie eluatu z kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika w buforze odpowiednim do przeprowadzenia chromatografii na hydroksyapatycie; (g) przeprowadzania chromatografii na hydroksyapatycie, w której przemywanie i elucję prowadzi się przy użyciu buforów (z albo bez CHAPS); (h) rozcieńczania eluatu do odpowiedniego stężenia soli do chromatografii; (i) wprowadzanie rozcieńczonego eluatu do kolumny kationowymiennej w pH od około 6,0 do 7,0; (j) eluowania PAF-AH z kolumny odpowiednim buforem do formulacji; (k) przeprowadzania chromatografii

190 532 kationowymiennej w chłodzie; i (l) formułowanie PAF-AH w postaci ciekłej albo zamrożonej pod nieobecność CHAPS.

Korzystnie, w etapie (a) bufor do lizy stanowi 25 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM CHAPS, pH 8,0; w etapie (b) rozcieńczenie nadsączu z chromatografii anionowymiennej zachodzi w 3-4-krotnej objętości 25 mM, 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8,0 zaś kolumna jest kolumną Q-Sepharose zrównoważoną 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0; w etapie (c) kolumna anionowymienna jest eluowana przy użyciu 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 350 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0; w etapie (d) eluat z etapu (c) wprowadza się bezpośrednio do kolumny powinowactwa z ligandem błękitnego barwnika; w etapie (e) kolumna jest eluowana 3 M NaCl, 10 mM CHAPS, 25 mM Tris, pH 8,0; w etapie (f rozcieńczanie eluatu zachodzi przez rozcieńczenie w 10 mM fosforanie sodu, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 6,2; w etapie (g) chromatogafię na hydroksyapatycie prowadzi się na kolumnie zrównoważonej 10 mM fosforanem sodu, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, zaś elucję prowadzi się przy użyciu 50 mM fosforanu sodu, 100 mM NaCl (z Iub bez) 10 mM CHAPS, pH 7,5; w etapie (h) rozcieńczanie eluatu do chromatografii kationowymiennej prowadzi się przy użyciu bufora o pH w zakresie od około 6,0 do 7,0, obejmującego fosforan sodu (z albo bez CHAPS); w etapie (i) kolumnę Sepharose równoważy się 50 mM fosforanem sodu (z albo bez) 10 mM CHAPS, pH 6,8; w etapie (j) elucję prowadzi się odpowiednim buforem formulacyjnym takim jak 50 mM fosforan sodu, 12,5 mM kwas asparaginowy, 125 mM NaCl, pH 7,5 zawierającym 0,01% Tween 80; zaś na etapie (k) chromatografię kationowymienną prowadzi się w 2-8°C. Przykłady odpowiednich buforów formulacyjnych do zastosowania w etapie (a), które stabilizują PAF-AH obejmują 50 mM fosforan potasu, 12,5 mM kwas asparaginowy, 125 mM NaCl pH 7,4 (około, z Iub bez dodania Tween-80 albo Pluronic F68) albo bufor 25 mM fosforanu potasu (przynajmniej) 125 mM NaCl, 25 mM argininy i 0,01% Tween-80 (z albo bez Pluronic F68 w ilości około 0,1 do 0,5%).

B. Aktywność rekombinowanej PAF-AH

Najistotniejszą aktywnością acetylohydrolazy PAF jest jej znaczna swoistość wobec substratów o krótkiej reszcie w pozycji sn-2 substratu. Ta ścisła swoistość odróżnia acetylo-hydrolazę PAF od innych postaci PLA2. Tak więc, w celu stwierdzenia czy rekombinowana PAF-AH rozkłada fosfolipidy z długołańcuchowym kwasem tłuszczowym w pozycji sn-2, badano hydrolizę 1-palmitoilo-2-arachidonoilo-j«-glicerolo-3-fosfocholmy (arachidonoiloPC), ponieważ jest preferowany substrat dla dobrze scharakteryzowanej postaci PLA₂. Jak przewidziano na podstawie poprzednich badań z natywną PAF-AH, fosfolipid ten nie był hydrolizowany podczas inkubacji z rekombinowaną PAF-AH. W dodatkowych doświadczeniach, arachidonoiloPC włączono do standardowego testu hydrolizy PAF, w stężeniu w zakresie od 0 do 125 μΜ, w celu stwierdzenia czy hamuje ona hydrolizę PAF przez rekombinowaną PAF-AH. Nie występowało zahamowanie hydrolizy PAF nawet w najwyższym stężeniu PAF-AH, które było 5-krotnie wyższe niż stężenie PAF. Tak więc, rekombinowana PAF-AH wykazuje tę samą wybiórczość substratu co natywny enzym; substrat długołańcuchowy nie jest rozpoznawany. Ponadto, rekombinowany enzym PAF-AH gwałtownie rozkłada utleniony fosfolipid (glutaroiloPC), który poddano oksydatywnemu odcięciu kwasu tłuszczowego sn-2. Natywna osoczowa PAF-AH wykazuje kilka innych właściwości, które odróżniają ją od innych fosfolipaz, w tym niezależność od wapnia i oporność na związki, które modyfikują grupy sulfohydrylowe albo niszczą disiarczki.

Zarówno natywna jak i rekombinowana PAF-AH są wrażliwe na DFP, co wskazuje, że seryna zajmuje część ich miejsc aktywnych. Niezwykłą cechą natywnej osoczowej acetylohydrolazy PAF jest to, że jest ona ściśle powiązana w krążeniu z lipoproteinami, zaś na jej aktywność katalityczną wpływa środowisko lipoprotein. Gdy rekombinowaną PAF-AH według wynalazku inkubowano z osoczem ludzkim (uprzednio traktowanym DFP w celu usunięcia endogennej aktywności enzymatycznej), wiązała się ona z lipoproteinami niskiej i wysokiej gęstości w taki sam sposób jak natywna aktywność. Wynik ten jest istotny, ponieważ istnieeą dowody, że modyfikacja lipoprotein o niskiej gęstości jest istotna dla odkładania cholesterolu w blaszkach miażdżycowych, zaś utlenianie lipidów jest początkowym czynnikiem w tym procesie. PAF-AH chroni lipoproteiny niskiej gęstości przed tą modyfikacją w utleniających warunkach in vitro, oraz może mieć

190 532 znaczenie in vivo. Podawanie PAF-AH jest więc wskazane do hamowania utleniania lipoprotein w blaszkach miażdżycowych jak również w celu łagodzenia stanu zapalnego.

Wyniki te potwierdzają, że klon cDNA sAH406-3 koduje białko o aktywności ludzkiej osoczowej acetylohydrolazy PAF.

Przykład 10

Różne inne rekombinowane produkty PAF-AH poddawano ekspresji w E. coli. Produkty obejmowały analogi PAF-AH o pojedynczych mutacjach aminokwasowych i fragmenty PAF-AH.

A. Produkty zastąpień aminokwasowych PAF-AH

PAF-AH jest lipazą, ponieważ hydrolizuje fosfolipid PAF. O ile nie istnieje żadne podobieństwo pomiędzy PAF-AH i innymi scharakteryzowanymi lipazami, stwierdzono zakonserwowane reszty podczas porównywania lipaz scharakteryzowanych strukturalnie. Stwierdzono, że seryna stanowi jeden ze składników miejsca aktywnego. Seryna, wraz z resztą kwasu asparaginowego i resztą histydyny tworzy triadę katalityczną stanowiącą miejsce aktywne lipazy. Trzy reszty nie stykają się ze sobą w sekwencji pierwszorzędowej, ale badania strukturalne dowiodły, że stykają się ze sobą w przestrzeni trójwymiarowej. Porównanie struktur lipaz ssaków wskazuje, że reszta kwasu asparaginowego występuje zwykle 24 reszty aminokwasowe w kierunku końca C od miejsca aktywnego seryny. Oprócz tego histydyna znajduje się zwykle 109-111 aminokwasów w kierunku C od seryny.

Ukierunkowaną mutagenezą i PCR zmodyfikowano poszczególne kodony sekwencji kodującej ludzką PAF-AH w taki sposób, że kodowały reszty alaniny, po czym wyrażono w E. coli. Jak pokazano w tabeli 8, gdzie przykładowo, skrót „S108A” oznacza, że resztę seryny w pozycji 108 zmieniono na alaninę, mutacje Ser273, Asp296 albo His351 całkowicie niszczyły aktywność PAF-AH. Odległości pomiędzy resztami miejsca aktywnego są podobne dla PAF-AH (Ser do Asp, 23 aminokwasy; Ser do His, 78 aminokwasów) i innych lipaz. Doświadczenia te pokazały, że Ser273, Asp296 albo His351 są resztami krytycznymi dla aktywności, a stąd są potencjalnymi kandydatami na reszty triady katalitycznej. Cysteiny są często krytyczne dla integralności funkcjonalnej białek, z powodu ich zdolności do tworzenia wiązań disiarczkowych. Enzym osoczowy PAF-AH zawiera 5 cystein. W celu stwierdzenia, czy którakolwiek z nich jest istotna dla aktywności enzymatycznej, każdą z cystein poddano pojedynczo mutacji do seryny, zaś powstałe mutanty poddano ekspresji w E. coli. Wstępne wyniki aktywności przy użyciu częściowo oczyszczonych preparatów tych wytworzonych rekombinacyjnie mutantów pokazano poniżej w drugiej kolumnie tabeli 8, podczas gdy wyniki z użyciem bardziej oczyszczonych preparatów pokazano w kolumnie trzeciej. Dane pokazują, że wszystkie mutanty cysteiny mają zasadniczo równą aktywność, tak, że żadna z cystein nie wydaje się być konieczna dla aktywności PAF-AH. W tabeli 8 „++++” odpowiada aktywności PAF-AH typu dzikiego wynoszącej około 40-60 U/ml/ODć00, „+++” oznacza aktywność około 20-40 U/ml/OD600, „++” oznacza około 10-20 U/ml/ODó00, „+” oznacza 1-10 U/ml/OD₆00, zaś oznacza aktywność < 1 U/ml/OD₆00·

Tabela 8

Mutacja	Aktywność PAF-AH	Aktywność właściwa PAF-AH w oczyszczonych preparatach
1	2	3
typ dziki	++++	6,9 mmol/mg/godz.
S108A	++++
S273A	-
D286A	-
D286N	++

190 532

c.d. tabeli 8

1	2	3
D286A	-
D304A	++++
D338A	++++
H351A	-
H395A, H399A	++++
C67S	+-H-	5,7 mmol/mg/godz.
C229S	+	6,5 mmol/mg/godz.
C291S	+	5,9 mmol/mg/godz.
C334S	++++	6,8 mmol/mg/godz.
C407S	+++	6,4 mmol/mg/godz.
C67S, C334S, C407S		6,4 mmol/mg/godz.

B. Produkty stanowiące fragmenty PAF-AH

Delecje końca C wytworzono przez trawienie końca 3' sekwencji kodującej PAF-AH egzonukleaza III przez różny okres czasu, a następnie poddawanie ligacji skróconej sekwencji kodującej do plazmidowego DNA kodującego kodon stop we wszystkich trzech ramkach odczytu. Różne konstukty delecyjne charakteryzowano przez analizę sekwencji DNA, ekspresji białka i aktywności PAF-AH. Usunięcie 21-30 aminokwasów końca C powodowało znaczne zmniejszenie aktywności katalitycznej, zaś usunięcie 52 reszt całkowicie niszczyło aktywność. Patrz, figura 3.

Podobne delecje wytworzono na końcu aminowym PAF-AH. Fuzje PAFAH z tioredoksyną E. coli na końcu N wytworzono w celu ułatwienia ekspresji na wysokim poziomie aktywności PAF-AH (LaVallie i in., Bio/Technology 11:187-193 (1993)). Usunięcie 19 aminokwasów z naturalnie obrobionego końca N (Ile42) zmniejsza aktywność o 99% podczas, gdy usunięcie 26 aminokwasów całkowicie niszczy aktywność enzymatyczną białka fuzyjnego. Patrz, figura 3. Delecja 12 aminokwasów wydaje się zwiększać aktywność enzymatyczną około 4-krotnie.

W kolejnych oczyszczaniach PAF-AH ze świeżego osocza ludzkiego metodą podobną do opisanej w przykładzie 1 (do zatężenia eluatu .z kolumny Blue Sepharose zamiast kolumny Cu zastosowano filtr Microcon 30 firmy Amicon), oprócz Ile42 zidentyfikowano dwa końce N, Ser₃₅ i Lys₅₅. Heterogenność może być naturalnym stanem enzymu w osoczu, albo może być spowodowana oczyszczaniem.

Oczyszczony materiał opisany wyżej można również poddać analizie glikozylacji. Oczyszczoną natywną PAF-AH inkubuje się w obecności albo pod nieobecność N-glikanazy, enzymu, który usuwa węglowodany połączone N z glikoprotein. Traktowane próbki PAF-AH poddaje się elektroforezie na 12% żelu poliakryloamidowym, a następnie obrazuje w badaniu met. western biot z użyciem króliczej surowicy poliklonalnej. Białko nie traktowane N-glikanazą migruje jako rozmyty prążek wielkości 45-50 kDa, podczas gdy białko traktowane glikanazą migruje jako ścisły prążek wielkości około 44 kDa, wskazując, że natywna PAF-AHjest glikozylowana.

Heterogenność końca N obserwowano również w oczyszczonych preparatach rekombinowanej PAF-AH (Ile42 na końcu N). Preparaty te były mieszaniną polipeptydów z końcem N rozpoczynającym się na Ala47, Ile42 albo sztucznym początku Met] w sąsiedztwie Iie4230

190 532

1. Wstępne porównanie fragmentów PAF-AH

W świetle obserwowanej heterogenności rekombinacyjnie wytworzonych PAF-AH, wytworzono i badano inne rekombinowane produkty po rekombinacyjnej ekspresji i oczyszczeniu. Kompozycje rekombinowanych produktów ekspresji pBAR2/PH.2 i pBAR2/PH.9 w szczepie MC1061 E. coli analizowano w różnych punktach czasu podczas fazy wytwarzania w fermentacji komórkowej. Częściowo oczyszczone próbki rekombinowanej PH.2 i PH.9 z komórek zebrane w punktach czasu w zakresie od 5 do 22 godzin po indukcji ekspresji białka analizowano metodą spektrometrii masy wspomaganej laserową desorpcją matrycy (MALDI-MS).

Gdy wykorzystywano wektor ekspresyjny PH.2, w widmie obserwowano dwa szczyty częściowo oczyszczonego białka o wartości masowej oczekiwanej dla rPAF-AH. Dwa szczyty obserwowano we wszystkich punktach czasowych, z większą heterogennością obserwowaną w punktach czasowych, gdy fermentacja była zahamowana, co wskazywało na gromadzenie się octanu i/lub wyczerpywanie tlenu w pożywce. Dokładność techniki MALDI-MS w tym zakresie mas wynosiła około ± 0,3%, czyli masę około 1 aminokwasu. Obserwowany większy szczyt masy zgadzał się z obecnością oczekiwanego produktu pełnej długości dla wektora PH.2, minus początkowa metionina, która, jak oczekiwano, była odcinana po translacji. Mniejszy szczyt masy był mniejszy o około 1200 atomowych jedno stek masy.

Gdy wykorzystywano wektor ekspresyjny PH.9, pojedynczy szczyt dominował w widmie częściowo oczyszczonego białka, z wartością masową oczekiwaną dla białka rPAF-AH. Ten pojedynczy szczyt obserwowano we wszystkich punktach czasowych, z większą heterogennością obserwowaną we wszystkich punktach czasowych. Obserwowana masa tego białka była zgodna z obecnością oczekiwanego produktu translacji pełnej długości dla wektora PH.9, pozbawionego początkowej metioniny.

2. Oczyszczanie fragmentów pAF-AH

Rekombinacyjnie wyrażany rPH.2 (produkt ekspresji DNA kodującego Me^-Asn^i) i rPH.9 (produkt ekspresji DNA kodującego Met46-Ile429) oczyszczano do dalszego porównania z oczyszczonym rPAF-AH (produkt ekspresji DNA kodującego Met46-Asn441). rPH.9 wytwarzany przez szczep SB7219 E. coli i oczyszczano procedurą chelatacji cynkiem opisaną powyżej, podczas gdy rPH.2 był wytwarzany przez szczep MC1061 E. coli i oczyszczany w opisany poniżej sposób. Komórki transformowane poddano lizie przez rozcieńczenie zawiesiny komórkowej w buforze do lizy (100 mM sukcynylan, 100 mM NaCl, 20 mM CHAPS, pH 6,0). Gęstwę mieszano i poddawano lizie wysokim ciśnieniem. Poddane lizie komórki wirowano i zachowywano nadsącz zawierający rPH.2. Klarowny nadsącz rozcieńczano 5-krotnie w 25 mM fosforanie sodu, 1 mM eDTa, 10 mM CHAPS, pH 7,0. Rozcieńczony nadsącz wprowadzano do kolumny Q Sepharose. Kolumnę płukano 3 objętościami bufora 25 mM fosforanu sodu zawierającego 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 7,9 (płukanka 1), następnie płukano 10 objętościami 25 mM Tris z 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8,0 (płukanka 2) i 10 objętościami kolumny 25 mM Tris z 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0 (płukanka 3). Elucję prowadzono 25 mM buforem Tris, 1 mM EDTA, 350 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0. Eluat z kolumny Q Sepharose rozcieńczano 3-krotnie w 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8,0, a następnie wprowadzano do kolumny Blue Sepharose. Kolumnę płukano najpierw 10 objętościami kolumny 25 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM CHAPS, pH 8,0. Następnie kolumnę płukano 3 objętościami 25 mM Tris, 0,5 M NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0. Elucję prowadzono 25 mM Tris, 3,0 M NaCl, 10 mM CHAPS, pH 8,0. Eluat z kolumny Blue Sepharose rozcieńczano 5-krotnie 10 mM fosforanie sodu, 10 mM CHAPS, pH 6,2, a następnie wprowadzano do kolumny chromatograficznej. Kolumnę płukano 10 objętościami 10 mM fosforanu sodu, 100 mM NaCl, 0,1% Pluronic F68, pH 6,2. rPH.2 eluowano 120 mM fosforanem sodu, 100 mM NaCl, 0,1% Pluronic F-68, pH 7,5. Eluat z hydroksyapatytu rozcieńczano 6-krotnie w 10 mM fosforanie sodu, 0,1% Pluronic F-68, pH 6,8. Rozcieńczony eluat doprowadzono do pH 6,8, stosując 0,5 N kwas sukcynylowy, a następnie wprowadzono do kolumny SP Sepharose. Kolumnę SP Sepharose płukano 10 objętościami 50 mM fosforanu sodu, 0,1% Pluronic F-68, pH 6,8 i eluowano 50 mM fosforanem sodu, 125 mM NaCl, 0,1% Pluronic F68, pH 7,5. Eluowany rPH.2 formułowano

190 532 przez rczcieńccanie do stężenia końcowego równego 4 mg/ml w 50 mM fosforanie sodu, 125 mM NaCl, 0,15% Pluronic F68 pH 7,5 i dodawano Tween 80 w stężeniu końcowym 0,02%. Formułowany produkt filtrowano przez membranę 0,2 pm i przechowywano przed zastosowaniem.

3. Porównanie fragmentów PAF-AH z PAF-AH przez sekwencjcncwαnie

Oczyszczone preparaty rPH.2 i rPH.9 porównywano z oczyszczonymi preparatami rPAF-AH przez sekwancjonowanie końca N przy użyciu sekwanatora białka Applied Biosystems Model 473A (Applied Biosystems, Poster City, CA) oraz sekwencjcncwamia końca C przy użyciu sekwenatora białka Hewlett-Pęckyrd Model G1009A. Preparaty rPH.2 miały mniejszą heteΓcgenncść końca N w porównaniu z rPAF-AH. Analiza końca N preparatów rPH.9 była podobna do rPH.2, ale obserwowano mniejszą heterogenność dla preparatów rPH.9 w porównaniu z rPH.2.

Oczyszczone preparaty rPH.2 zawierały główną sekwencję z końcem N Ala^ (około 86-89%) i mniejszą sekwencją z końcem N Ala48 (około 11 -14%), ze stosunkiem obu końców N stałym w różnych warunkach fermentacji. Oczyszczony preparat rPH.9 zawierał również główną sekwencję o końcu N A1o47 (około 83-90%) i mniejszą sekwencją z końcem N A1o48 (około 10-17%). W przeciwieństwie, próby wytworzenia w bakteriach polipeptydu rozpoczynającego się na Ile42 (rPAF-AH)dowałZ mieszaninę pcllpeatzdów o końcach N rozpoczynających się na Ala^ (20-53%), Ile42 (8-10%) albo na sztucznej początkowej Met-1 (37-72%) sąsiadującej z Ile42. Dla rPH.2 i rPH.9, początkowa metionina jest usuwana przez peptvdαzą końca aminowego po syntezie polipeptydu przez bakterie, z pozostawieniem alaniny w pozycji 47 (albo alaniny w pozycji 42) jako reszta końca N.

Sekwencjd^i^’^:^ie końca C przeprowadzono na jednej z partii rPH.2, w której jako główną sekwencję końca C obserwowano HOOC-Asn-Tyr (około 80%), zgodnie z przewidywanym końcem C HOOC-Asn441-Tyr440, podczas gdy 20% stanowiło HOOC-Leu. Po frakcjonowaniu preparatu rPH.2 przez SDS-PAGE, dodatkowe sekwancjcnowynie plarwctnago i wtórnego prążka dało sekwencję końca C HOOC-Leu-Met z dolnego prążka (AH1, opisany niżej w sekcji B.5) zgodnie z produktem, krótszym o 10 aminokwasów od produktu translacji pełnej długości, jak również mniejsze ilości HOOC-His. Dalsze mapowanie peptydu wykazało, że w niektórych aęrtioch białka rPH.9 istnieją dodatkowe końce N. Końcem N rPH.9 był początkowo HOCC-Ile-His (około 78-91%, cαleżnie od partii) w bezpośrednim sekwencjonowaniu, co było zgodne z przewidywanym końcem C HOOC-Ile429-His428 produktu translacji. Istniało pewne tło („szum”), ale nie można wykluczyć małych ilości innych sekwencji.

4. Porównanie fragmentów PAF-AH z PAF-AH przez MALDI-MS

MALDI-MS prcaarowodcyno na oczyszczonych preparatach rPH.2 i rPH.9. Widmo rPH.2 wykazywało dwa szczyty przy wartości masowej oczekiwanej dla produktu rPAF-AH (patrz, figura 4), podobne do wzorca obserwowanego z częściowo oczyszczonym białkiem w sekcji B.1 wyżej. Wtórny, szczyt o mniejszej wartości masowej stanowił zwykle 20-30% całości. Widmo rPH.9 wykazywało główny szczyt przy masie zgodnej z oczekiwaną dla produktu translacji pełnej długości wektora PH.9, minus początkowa metionina (patrz, figura 5). Mały boczny szczyt o mniejszym ciężarze cząsteczkowym obserwowano również dla rPH.9 i stanowił około 5% całości.

5. Porównanie fragmentów PAF-AH i PAF-AH na SDS-PAGE

Elektroforezę na żelu aoliokrylomiidowzm z solą sodową siarczanu dodocylu (SDS-PAGE) przeprowadzono na oczyszczonych preparatach rPAF-AH, rPH.2 i rPH.9. Dla rPH.2 obserwowano skomplikowany wzorzec wokół zakresu migracji elektroforetycznej oczekiwanej dla produktu rPAF-AH, w oparciu o wzorce ciężaru cząsteczkowego. W jednym albo kilku żelach, obserwowano dwa główne prążki, z łatwo obserwowanym wtórnym prążkiem powyżej i poniżej głównego prążka. Te prążki, wtórny górny, pierwotny środkowy i wtórny dolny nazwano, odpowiednio, AHu, AHm i AH_L. Wszystkie z tych prążków reagowały z przeciwciałem monoklcnαlnvm przeciwko rPAF-AH w badaniu met. western biot, i w ten sposób zostały zidentyfikowane jako produkty pokrewne rPAF-AH. Wtórny górny prążek AH_U zwiększał swoją intensywność w trakcie przechowywania białka i prawdopodobnie odzwierciedlał zmodyfikowaną postać produktu rPAF-AH. SDS-PAGE produktu rPAF-AH był podobny do

190 532 rPH.2. Występowały dwa główne prążki, które migrowały w pobliżu oczekiwanego ciężaru cząsteczkowego oPAF-AH, jak również mniejszy prążek powyżej i ślad poniżej głównego prążka. W przeciwieństwie, rPH.9 wykazywał pojedynczy prążek na SDS-PAGE bez wyraźnego rozdzielenia. Słabe prążki o nieco mniejszym ciężarze cząsteczkowym ooaz oczekiwany dimer były również widoczne. Nie obserwowano prążków typu AHy.

Skład oczyszczonych preparatów oPH.2 i rPH.9 analizowano również na żelach 2D (ogniskowanie izoelekt^czne (IEF) w moczniku, a następnie SDS-PAGE w drugim wymiarze). Dla oPH.9, żele 2D wykazywały pięć głównych plamek oddzielonych w wymiarze EEF. Heterogenność ładunku wydawała się być zgodna pomiędzy partiami rPH.9. W przeciwieństwie, wzorzec 2D rPH.2 był bardziej skomplikowany obejmując około 15 plamek oddzielonych w wymiarze IEF i SDS-PAGE.

6. Porównanie aktywności fragmentów PAF-AH i PAF-AH

Oczyszczone rPH.2 i oPH.9 miały aktywność enzymatyczną niemożliwą do odróżnienia od endogennej PAF-AH oczyszczonej z surowicy, jak również rPH.2 i oPH.9 wiązały się z lipoproteiną w sposób podobny do endogennej PAF-AH.

Przykład 11

Wstępną analizę wzorca ekspresji mRNA ludzkiej osoczowej PAF-AH przeprowadzono metodą hybrydyzacji northem blot.

RNA wypreparowano z ludzkiej kory mózgu, serca, nerki, łożyska, grasicy i migdałków stosując RNA Stat 60 (Tel-Test ,3”> Friendswood, TX). Oprócz tego, RNA wytworzono z ludzkiej linii komórkowej ukierunkowanych komórek hematopoetycznych THP-1 (ATCC TIB 202), którą indukowano do różnicowania w kierunku fenotypu przypominającego makrofagi stosując ester forbolu octanu mioystylowego (PMA). Tkankowy RNA i RNA wypreparowany z lini promielocytamej THP-1 przed indukcją i 1-3 dni po indukcji poddano elektroforezie na 1 ,:2% żelu agarozowym z formaliną, a następnie przeniesiono na membranę nitrocelulozową. cDNA ludzkiej osoczowej PAF-AH pełnej długości sAH406-3 znakowano losowymi starterami i hybrydyzowano z membranami w warunkach identycznych do opisanych w przykładzie 3 dla przeszukiwania biblioteki. Początkowe wyniki wskazują, że sonda PAF-AH hybrydyzuje z prążkiem RNA 1,8 kb w grasicy, migdałkach oraz w mniejszym stopniu w łożysku.

PAF jest syntetyzowany w mózgu w normalnych warunkach fizjologicznych, jak również w stanach patofizjologicznych. Wziąwszy pod uwagę znane zapalne i potencjalnie neurotoksyczne działanie cząsteczki, mechanizm lokalizacji syntezy PAF albo jego gwałtownego katabolizmu powinien być krytyczny dla zdrowia tkanek nerwowych. Obecność acetylohydrolazy PAF w tkankach nerwowych jest zgodna z odgrywaniem pozez nią roli ochronnej. Co ciekawe, zarówno bydlęcą heterotrimeryczną, wewnątrzkomórkową PAF-AH (której klonowanie opisano w Hattori i in., J. Biol. Chem. 269(37):23150-23155 (1994)) i PAF-AH według wynalazku zidentyfikowano w mózgu. W celu określenia, czy oba enzymy ulegają ekspresji w podobnych czy różnych przedziałach mózgu, klonowano cDNA ludzkiego homologa bydlęcej mózgowej wewnątrzkomórkowej PAF-AH i porównano wzorzec ekspresji mRNA w mózgu metodą noothem blot, ze wzorcem ekspresji mRNA PAF-AH według wynalazku zasadniczo identycznymi sposobami jak opisane w poprzednim paragrafie. Badanymi noothem blot regionami mózgu były móżdżek, rdzeń przedłużony, rdzeń kręgowy, pokrywa, jądro migdałowate, jądro ogoniaste, wzgórze, biegun ciemieniowy, płat czołowy i skroniowy kory mózgu. Transkrypt obu enzymów znaleziono w każdej z tych tkanek, jakkolwiek, postać heterotrimeryczna wewnątrzkomórkowa wyrażana była bardziej powszechna niż postać wydzielnicza. Analiza met. northem blot na dodatkowych tkankach dalej wykazała, że postać wewnątrzkomórkowa była wyrażana w różnych tkankach i komórkach, w tym w grasicy, prostacie, jądrach, jajniku, jelicie cienkim, okrężnicy, leukocytach krwi obwodowej, makro fagach, mózgu, wątrobie, mięśniach szkieletowych, nerce, trzustce i gruczołach nadnerczowych. Ta powszechna ekspresja sugeruje, że heteromeryczna wewnątrzkomórkowa PAF-AH pełni ogólne funkcje typu „housekeeping” w komórkach.

Ekspresja RNA PAF-AH badana również była w monocytach wyizolowanych z ludzkiej krwi oraz podczas ich spontanicznego różnicowania w makrofagi w hodowli. W świeżych

190 532 monocytach nie stwierdzono, albo stwierdzono niewiele RNA, ale ekspresja była indukowana i utrzymywana podczas różnicowania w makrofagi. Występowało równoczesne gromadzenie aktywności PAF-AH w pożywce hodowlanej różnicujących się komórek. Ekspresję transkryptu ludzkiej osoczowej PAF-AH obserwowano również w RNA komórek THP-1 w dniu 1, ale nie w 3 po indukcji. Komórki THP-1 nie wyrażają mRNA dla PAF-AH w stanie spoczynku.

Przykład 12

Ekspresję PAF-AH w tkankach mysich i ludzkich badano przez hybrydyzację in situ..

Ludzkie tkanki otrzymano z National Disease Research Interchange oraz Cooperative Human Tissue Network. Normalny mysi mózg i rdzeń kręgowy oraz rdzenie kręgowe z EAE w 3 stadium pobrano od myszy S/JLJ.

Normalne zarodki myszy S/JLJ pobrano w okresie od 11 do 18 dnia po zapłodnieniu.

Skrawki tkanek umieszczono w foremkach do mrożenia urządzenia Tissue Tek II (Miles Laboratories, Inc., Naperville, IL) z małą ilością substancji OCT (Miles, Inc., Elkhart, IN). Umieszczono je centralnie w foremkach, które wypełniono OCT, a następnie umieszczono w 2-metylobutanie (C2HsCH(CH₃)2, Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI) i umieszczono zbiornik w ciekłym azocie. Gdy tkanki i OCT w foremkach zamarzły, bloki przeniesiono do -80°C do momentu skrawania. Bloki tkankowe cięto na grubość 6 pm i przyklejano na szkiełkach pokrytych Vectabond (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) i przechowywano w -70°C, po czym umieszczano w 50°C na około 5 minut w celu podgrzania i usunięcia kondensacji, a następnie utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 20 minut w 4°C, odwadniano (70%, 95%, 100% etanol) przez minutę w 4°C, w każdej z mocy, następnie pozostawiano do wyschnięcia przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Skrawki denaturowano przez 2 minuty w 70°C w 70% formamidzie/2xSSC, płukano dwukrotnie w 2xSSC, odwadniano i suszono przez 30 minut na powietrzu. Tkanki hybrydyzowano in situ ze znakowanym radioaktywnie jednoniciowym mRNA wytworzonym z DNA pochodzącego z wewnętrznego fragmentu Hindlll wielkości 1 kb genu PAF-AH (nukleotydy 308-1323 Id. Sekw. nr 7) przez transkrypcję mRNA in vitro z włączaniem ³⁵S-UTP (Amersham) albo z DNA pochodzącego z cDNA heterotrimerycznej, wewnątrzkomórkowej PAF-AH zidentyfikowanego przez Hattori i in. Zastosowano sondy o różnych długościach od 250-500 bp. Hybrydyzację noc (12-16 godzin) w 50°C; sondy rybonukleinowe znakowane , tRNA (0,5 pg/skrawek) i wodę traktowaną dietylopirokarbonianem (DEPC) dodano do bufora hybrydyzacyjnego otrzymując stężenie końcowe 50% formamidu, 0,3 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10% siarczanu dekstranu, 1X roztwór Denhardta, 100 mM ditiotreitol (DTT) i 5 mM EDTA. Po hybrydyzacji, skrawki płukano przez godzinę w temperaturze pokojowej w4xSSC/10 mM DTT, następnie przez 40 minut w 60°C w 50% formamidzie/1xSSC/10 mM DTT, 30 minut w temperaturze pokojowej w 2xSSC i 30 minut w temperaturze pokojowej w 0,lxSSC. Skrawki odwadniano, suszono na powietrzu przez 2 godziny, pokrywano emulsją fotograficzną Kodak NTB2, suszono na powietrzu przez 2 godziny, wywoływano (po przechowywaniu w 4°C w całkowitej ciemności) i podbarwiano hematoksyliną/eozyną.

A. Mózg

Móżdżek. W mózgu myszy i człowieka obserwowano silny sygnał w warstwie komórek Purkinjego móżdżku, w komórkach koszyczkowatych oraz poszczególnych ciałach neuronów w jądrze zębatym (jedno z czterech jąder głębokich móżdżku). Sygnał dla heteromerycznej wewnątrzkomórkowej PAF-AH obserwowano również w tych komórkach. Oprócz tego, sygnał osoczowej PAF-AH obserwowano w poszczególnych komórkach w warstwie ziarnistej i drobinowej istoty szarej.

Hipokamp. W skrawkach ludzkiego hipokampa, pojedyncze komórki w całym przekroju, które wydawały się być ciałami komórek neuronalnych, wykazywały silny sygnał. Zostały one zidentyfikowane jako ciała komórek polimorficznych i komórek ziarnistych. W hipokampie obserwowano również sygnał heterotrimerycznej wewnątrzkomórkowej PAF-AH.

Pień mózgu. W skrawkach pnia mózgu ludzkiego i mysiego obserwowano silny sygnał poszczególnych komórek w istocie szarej.

przeprowadzono przez ³⁵S (6x105 cpm/skrawek)

190 532

Kora. W skrawkach kory mózgu człowieka, pobranej z płatów mózgowych, potylicznych i skroniowych oraz w całych skrawkach mózgu mysiego poszczególne komórki w korze dawały silny sygnał. Komórki te zidentyfikowano jako ciała komórek piramidowych, gwiaździstych i polimorficznych. Nie istniało zróżnicowanie we wzorcu ekspresji w różnych warstwach kory. Wyniki hybrydyzacji in situ są różne od wyników badania northem blot dla koty. Różnica jest spowodowana prawdopodobnie większą czułością hybrydyzacji in situ w porównaniu z badaniem northem blot. Podobnie jak w móżdżku i hipokampie, obserwowano podobny wzorzec heterotrimerycznej wewnątrzkomórkowej PAF-AH.

Przysadka. Nieco słabszy sygnał obserwowano na rozsianych poszczególnych komórkach w części dalszej skrawków ludzkich.

B. Okrężnica ludzka

Okręznice normalne oraz z chorobą Crohna wykazywały sygnał w skupiskach limfatycznych występujących w śluzówce na skrawkach, przy czym poziom sygnału był nieco wyższy w skrawkach od pacjentów z chorobą Crohna. Okrężnica z chorobą Crohna dawała również silny sygnał z blaszki właściwej. Podobnie, silny sygnał obserwowano w zmienionym chorobowo wyrostku robaczkowym, podczas gdy w normalnym występował słaby, choć wykrywalny sygnał. Skrawki od pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego nie wykazywały sygnału w skupiskach limfatycznych ani w blaszce właściwej.

C. Ludzki migdałek i grasica

Silny sygnał obserwowano w rozsianych grupach poszczególnych komórek w centrach namnażania w migdałkach i grasicy.

D. Ludzki węzeł chłonny

Silny sygnał obserwowano w skrawkach węzłów chłonnych pobranych od normalnego dawcy, podczas gdy nieco słabszy sygnał obserwowano w grudkach chłonnych skrawków od dawców ze wstrząsem septycznym.

E. Ludzkie jelito cienkie

Jelito cienkie normalne i z chorobą Crohna dawało słaby sygnał w kępkach Peyera i blaszce właściwej skrawków, z nieco silniejszym sygnałem w tkankach chorych.

F. Ludzka śledziona i płuca

Nie obserwowano sygnału w śledzionie (normalnej i z ropniem śledzionowym) oraz płucach (normalnych i rozedmowych).

G. Mysi rdzeń kręgowy

W rdzeniach kręgowych normalnych i z EAE w stadium 3 występował silny sygnał w istocie szarej rdzenia, przy czym w rdzeniach z EAE w stadium 3 ekspresja była nieco wyższa. W rdzeniach z EAE komórki istoty białej oraz mankiety wokółnaczyniowe, prawdopodobnie naciekające makrofagi i/lub inne leukocyty wykazywały sygnał, którego nie było w normalnym rdzeniu kręgowym.

F. Zarodki mysie

W 11-dniowych zarodkach myszy sygnał występował w ośrodkowym układzie nerwowym w komorze czwartej, co pozostawało stałe przez okres rozwoju zarodkowego w kierunku móżdżku i pnia mózgu. W miarę dojrzewania zarodków, sygnał pojawiał się w ośrodkowym układzie nerwowym w rdzeniu kręgowym (dzień 12), korze pierwotnej i zwoju Gasseri (dzień 14) oraz podwzgórzu (dzień 16). Sygnał obserwowano w obwodowym układzie nerwowym (począwszy od dnia 14 albo 15) w nerwach opuszczających rdzeń kręgowy, oraz od dnia 17 silny sygnał pojawiał się wokół wąsów czuciowych zarodka. Ekspresję obserwowano również w wątrobie i płucach w dniu 14, jelicie (począwszy od dnia 15) oraz tylnej ścianie jamy ustnej/gardła (od dnia 16). W dniu 18, wzorzec ekspresji różnicował się w korze, tyłomózgowiu (móżdżek i pień mózgu, nerwach opuszczających region lędźwiowy rdzenia kręgowego, części tylnej jamy ustnej /gardła, wątrobie, nerce i, prawdopodobnie słaby sygnał w płucach i jelicie.

G Podsumowanie

Ekspresja mRNA PAF-AH w migdałkach, grasicy, węzłach chłonnych, kępkach Peyera, wyrostku robaczkowym i skupiskach limfatycznych okrężnicy jest zgodna z wnioskiem, że prawdopodobnie głównym źródłem in vivo PAF-AH są makrofagi, ponieważ tkanki te są

190 532 kolonizowane przez makrofagi tkankowe, które służą jako komórki fagocytujące i przetwarzające antygeny.

Ekspresja PAF-AH w tkankach zapalnie zmienionych powinna być zgodna z hipotezą, że rolą makrofagów pochodzących z monocytów jest usuwanie stanu zapalnego. PAF-AH powinna inaktywować PAF oraz fosfolipidy zapalne, regulując ujemnie kaskadę zjawisk zapalnych zapoczątkowaną przez te mediatory.

PAF stwierdzono w całej tkance mózgu i jest on wydzielany przez szczurze komórki ziarniste móżdżku do hodowli. Doświadczenia in vitro i in vivo wykazały, że PAF wiąże się ze swoistym receptorem w tkankach nerwowych i indukuje zmiany funkcjonalne i fenotypowe takie jak mobilizacja wapnia, dodatnia regulacja genów aktywujących transkrypcję i różnicowanie linii komórkowej prekursorów neuronalnych PC 12. Obserwacje te wskazują fizo logiczną rolę PAF w mózgu i są zgodne z ostatnimi doświadczeniami z użyciem hodowli skrawków tkanek hipokampa i analogów oraz antagonistów PAF, które to doświadczenia powiązały PAF jako istotny wsteczny sygnał w długotrwałym pobudzaniu hipokampa. Stąd, oprócz efektów patologicznych w stanie zapalnym, PAF wydaje się brać udział w rutynowych procesach sygnalizacji nerwowej. Ekspresja zawnątrz-komórkowej PAF-AH w mózgu może służyć do regulowania czasu trwania i wielkości sygnalizacji przez PAF.

Przykład 13

Przeciwciała monoklonalne swoiste wobec rekombinowanej osoczowej PAF-AH wytworzono stosując jako immunogen PAF-AH wytworzoną przez E. coli.

Myszy #1342 wstrzyknięto w dniu 0, 19 i 40 rekombinowaną PAF-AH. Jako dawkę przypominającą przed fuzją, myszy wstrzyknięto immunogen w PBS, cztery dni później mysz zabito i sterylnie pobrano jej śledzionę, po czym umieszczono w 10 ml bezsurowiczej RPMI 1640. Zawiesinę jednokomórkową wytworzono przez rozgniatanie śledziony pomiędzy zmatowionymi końcami dwóch szkiełek mikroskopowych zanurzonych w bezsurowiczej RPMI 1640, z dodatkiem 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 pg/ml streptomycyny (RPMI) (Gibco, Canada). Zawiesinę komórkową filtrowano przez sterylny rozdrabniacz komórkowy Nitex 70-mesh (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) i płukano dwukrotnie przez odwirowanie przy 200 g przez 5 minut i zawieszono osad w 20 ml bezsurowiczej RPMI. Tymocyty pobrane od 3 naiwnych myszy Balb/c wypreparowano w podobny sposób. Komórki szpiczaka NS-1, trzymane w fazie logarytmicznej wzrostu w RPMI z 11% płodową surowicą cielęcą (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah) przez trzy dni przed fuzją, odwirowano przy 200 g przez 5 minut, po czym płukano osad dwukrotnie jak to opisano w poprzedzających paragrafach.

1x10⁸ splenocytów połączono z2x10₇ komórek NS-1, odwirowano i aspirowano nadsącz. Osad komórkowy rozbito przez stukanie w probówkę i dodano 1 ml PEG 1500 w temperaturze 37°C (50% w 75 mM Hepes, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) mieszając w trakcie 1 minuty, a następnie przez dodanie 7 ml bezsurowiczej RPMI 1640 w ciągu 7 minut. Doda_no dodatkowe 8 ml RPMI i odwirowano komórki przy 200 g przez 10 minut. Po usunięciu nadsączu, osad zawieszono w 200 ml RPMI zawiepającej 15% FBS , 100 pM sól sodową hipaksantyny, 0,4 pM aminopterynę, 16 pM tymidynę'(HAT) (Gibco), 25 jednostek/ml IL-6 (Bpehringer Mann.hoim) i 1,^px10⁶ tymocytów/ml i \ęysiano do 10 p łaskodennych płytek 96-studzienkowych (Coming, Coming, Nowy York).

W dniach 2, 4 i 6 po fuzji, z każdej studzienki pobrano 100 pl pożywki i zastąpionio świeżą pożywką. W dniu 8, fuzję badano przesiewowo przez ELISA, badając obecność mysiej IgG wiążącej się z rekombinowaną PAF-AH. Płytki Immulon 4 (dynatech, Cambridge, MA) pokryto przez 2 godziny w 37°C 100 ng/ml rekombinowanej PAF-AH rozcieńczonej w 25 mM Tris, pH 7,5. Roztwór do pokrywania aspirowano i dodano 200 pl/studzienkę roztworu blokującego (0,5% żelatyna skóry rybiej (Sigma) rozcieńczonej w CMF-PBS) i inkubowano przez 30 minut w 37°C. Płytki płukano trzykrotnie w PBS z 0,05% Tween 20 (PBST) i dodano 50 pl nadsączu hodowlanego. Po inkubacji w 37°C przez 30 minut i płukaniu jak wyżej, dodano 50 pl peroksydazy chrzanowej sprzęgniętej z kozim przeciwciałem przeciwko mysim IgG(fc) (Jackson Immuno Research, West Grove, Zennsylvania) rozcieńczonej 1:3500 w PBST. Płytki inkubowano jak wyżej, płukano czterokrotnie w PBST

190 532 i dodawano 100 μΐ substratu, obejmującego 1 mg/ml o-fenylenodiaminy (Sigma) oraz 0,1 μΐ/ml 30% H2O2 w 100 mM cytrynianie pH 4,5. Reakcję barwną zatrzymano po 5 minutach przez dodanie 50 μΐ 15% H2SO4. A490 odczytywano na czytniku płytek (Dynatech).

Wybrane studzienki fuzyjne klonowano dwukrotnie przez rozcieńczanie w 96-studzienkowyćh płytkach i oceniano wizualnie liczbę kolonii/studzienkę po 5 dniach. Klonowanymi hybrydoma były 90D1E, 90E3A, 90E6C, 90G11D, (ATCC HB 11724) i 90F2D (ATCC HB 11725).

Przeciwciała monoklonalne wytworzone przez hybrydoma izotypowano przy użyciu układu Isostrip (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Wyniki pokazały, że przeciwciała monoklonalne wytworzone przez hybrydoma z fUzji 90 były wszystkie izotypu IgG.

Wszystkie z przeciwciał monoklonalnych wytworzonych przez hybrydoma z fuzji 90 dobrze działały w ELISA, ale były niezdolne do wiązania PAF-AH w badaniu western blot. W celu wytworzenia przeciwciał, które rozpoznają PAF-AH w western blot, mysz #1958 immunizowano rekombinowanym enzymem. Hybrydoma wytworzono jak to opisano dla fuzji 90, ale badano przesiewowo przez western blot zamiast w teście ELISA, w celu identyfikacji klonów kompetentnych w badaniu western.

Do analiz western, rekombinowaną PAF-AH zmieszano w równych częściach z buforem zawierającym 125 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 100 mM ditiotreitol i 0,05% błękit bromofenolowy, po czym gotowano przez 5 minut przed umieszczeniem na 12% żelu poliakryloamidowym (Novex). Po elektroforezie przy 40 mAmp, białko przeniesiono elektrycznie na membranę z poliwinylidienofluorku (Pierce) przez godzinę przy 125 V w 192 mm glicynie, 25 mM zasadzie Tris, 20% metanolu i 0,01% SDS. Membranę inkubowano w 20 mM Tris, 100 mM NaCl (TBS), zawierającym 5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA, Sigma) przez noc w 4°C, membrany inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej z króliczą surowicą odpornościową rozcieńczoną 1/8000 w TBS, zawierającą 5% BSA, a następnie płukano w TBS i inkubowano z fosfatazą alkaliczną sprzęgniętą z kozim przeciwciałem przeciwko mysim IgG w TBS z 5% BSA przez godzinę w temperaturze pokojowej. Membrany ponownie płukano w TBS, a następnie inkubowano z 0,02% 5-romo-4-chloro-3-indolilofosforanem i 0,03% błękitem nitrotetrazolowym w 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 5 mM MgCl2. Reakcję zatrzymano przez płukanie wodą.

Wyselekcjonowane studzienki fuzyjne, z których nadsącze były pozytywne w analizach western traktowano jak to opisano wyżej. Hybrydoma 143A reagowała z PAF-AH w badaniu western blot i została sklonowana (ATCC hB 11900).

Surowice poliklonalne swoiste dla ludzkiej osoczowej PAF-AH wywołano u królików przez trzy miesięczne immunizacje przy użyciu 100 μg oczyszczonego rekombinowanego enzymu w adiuwancie Freunda.

Przykład 14

Przeprowadzono badanie doświadczalne w celu zbadania efektów terapeutycznych in vivo rekombinowanej PAF-AH według wynalazku w ostrym zapaleniu, stosując szczurzy model obrzęku łapy (Henriques i in., Br. J. Pharmacol. 106:579-582 (1992)). Wyniki tych badań pokazują, że rPAF-AH blokuje obrzęk wywołany PAF. Równoległe badania przeprowadzono w celu porównania skuteczności PAF-AH z dwoma dostępnymi w handlu antagonistami PAF.

A. Wytwarzanie PAF-AH

E. coli transformowane wektorem ekspresyjnym pUC trp AH poddano lizie w mikrofluidyzerze, części stałe oddzielono przez wirowanie, zaś nadsącz wprowadzono do kolumny S-Sepharose (Pharmacia). Kolumnę płukano intensywnie buforem zawierającym 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, 25 mM MES i 1 mM EDTA, pH 5,5. PAF-AH eluowano rosnącymi stężeniami NaCl w buforze do 1 M. Następnie przeprowadzono chromatografię powinowactwa stosując kolumnę Blue Sepharose (Pharmacia) jako dodatkowy etap oczyszczania. Przed wprowadzeniem preparatu PAF-AH do kolumny Blue Sepharose, próbkę rozcieńczono 1:2 w celu zmniejszenia stężenia NaCl do 0,5 M i ustalono pH na 7,5. Po płukaniu kolumny buforem zawierającym 0,5 M NaCl, 25 mM Tris, 10 mM cHaPS i 1 mM EDTA, pH 7,5 PAF-AH eluowano przez zwiększanie stężenia NaCl do 3 M.

190 532

Czystość PAF-AH izolowanej w ten sposób wynosiła zwykle 95%, według SDS-PAGE, o aktywności 5000-1000 U/ml. Dodatkowe kontrole jakości przeprowadzane na każdym preparacie PAF-AH obejmowały oznaczenie poziomu endotoksyny i aktywności hemolitycznej świeżo otrzymanych szczurzych erytrocytów Bufor zawierający 25 mM Tris, 10 mM CHAPS, 0,5 M NaCl, pH 7,5 działał jako ośrodek do przechowywania enzymu oraz nośnik do podawania. Dawki zastosowane w badaniu oparte były na testach aktywności enzymatycznej przeprowadzonych bezpośrednio przed doświadczeniem.

B. Wywoływanie obrzęku

Sześć 8-tygodniowych samic szczurów Long Evans (Charles River, Wilmington, MA) ważących 180-200 g zastosowano do doświadczeń. Przed zabiegami doświadczalnymi, zwierzęta znieczulono mieszaniną Ketaset (Fort Dodge Laboratories, Ford Dodge, IS), Rompun (Miles, Shawnee Mission, KS) i Ace Promazine (Aveco, Fort Dodge, LA) podanych podskórnie w dawkach, odpowiednio, 2,5 mg, 1,6 mg i 0,2 mg na zwierzę. Obrzęk wywołano w łapie przez podanie PAF albo zymosanu w następujący sposób. PAF (Sigma #P-1402) wytworzono na świeżo do każdego doświadczenia z 1,9 mM roztworu wyjściowego przechowywanego w chloroformie/metanolu (9:1) w -20°C. Odpowiednie objętości wysuszano pod N2, rozcieńczano 1:1000 w buforze zawierającym 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5 i 0,25% BSA i sonikowano przez 5 minut. Zwierzęta otrzymały 50 μΐ PAF (dawka końcowa 0,96 nmoli) podskórnie pomiędzy poduszki łapy i oceniano obrzęk po 1 godzinie i ponownie po 2 godzinach doświadczenia. Zymosan A (Sigma #A-8800) wytwarzano świeżo do każdego doświadczenia jako zawiesina 10 mg/ml w PBS. Zwierzęta otrzymywały 50 μl zymosanu (dawka końcowa 500 pLg) podskórnie pomiędzy poduszki łapy tylnej, po czym oceniano obrzęk po 2 godzinach.

Obrzęk oceniano ilościowo przez pomiar objętości łapy bezpośrednio przed podaniem PAF albo zymosanu oraz w oznaczonych punktach czasu po ekspozycji PAF albo zymosanem. Obrzęk wyrażano jako wzrost objętości łapy w milimetrach. Pomiar wyporu objętości wykonywano na znieczulonych zwierzętach przy użyciu pletyzmometru (UGO Basile, model #7150), który mierzył objętość wypartej wody przez zanurzoną łapę. W celu upewnienia się, że zanurzenie łapy było porównywalne w różnych punktach czasu, łapę zaznaczono niezmywalnym atramentem w miejscu gdzie sierść dochodzi do pięty. Przy użyciu tej metody, powtarzane pomiary tej samej łapy wykazywały precyzjęw zakresie 5%.

C. Drogi podawania i dawki PAF-AH

PAF-AH wstrzykiwano miejscowo pomiędzy poduszeczki łapy, albo ogólnoustrojowo przez wstrzyknięcie iv w żyłę ogonową. Do podawania miejscowego, szczury otrzymywały 100 μl PAF-AH (4000-6000 U/ml) podskórnie pomiędzy poduszki tylnej prawej łapy. Łapa lewa służyła jako kontrola podawania 100 μl nośnika (buforowany roztwór soli). Do podawania ogolnoustrojowego PAF-AH, szczury otrzymywały oznaczoną liczbę jednostek PAF-AH w 300 μΐ nośnika iv w żyłę ogonową. Kontrole otrzymywały odpowiednią objętość nośnika iv w żyłę ogonową.

D. Podawanie miejscowe PAF-AH

Szczurom (N=4) wstrzyknięto 100 μl PAF-AH (4000-6000 U/ml) podskórnie pomiędzy poduszki tylnej prawej łapy. Łapę lewą nastrzyknięto 100 μΐ nośnika (buforowany roztwór soli). Cztery inne szczury otrzymały jedynie nośnik. Wszystkie szczury natychmiast poddano ekspozycji na PAF przez podskórne wstrzyknięcie w łapę i mierzono objętości po godzinie od ekspozycji. Figura 6, w której obrzęk wyrażony jest jako średni wzrost objętości łapy (ml) ± SEM dla każdej z grup, pokazuje że obrzęk łapy wywołany PAF jest blokowany przez miejscowe podanie PAF-AH. Grupa, która otrzymała miejscowe podanie PAF-AH przez ekspozycją na PAF wykazywała zmniejszony stan zapalny w porównaniu z grupą kontrolną. W grupie PAF-AH obserwowano wzrost objętości łapy 0,08 ml ± 0,08 (SEM) w porównaniu z 0,64 ± 0,14 (SEM) w grupie otrzymującej nośnik. Wzrost objętości łapy był bezpośrednim wynikiem wstrzyknięcia PAF, ponieważ zwierzęta, którym podano sam nośnik nie wykazywały wzrostu objętości łapy.

E. Dożylne podawanie PAF-AH

Szczurom (N=4 na grupę) podano iv PAF-AH (2000 U w 300 μl nośnika) albo sam nośnik, 15 minut przed ekspozycją na PAF. Obrzęk oceniano w godzinę i 2 godziny po ekspozycji

190 532 na PAF. Figura 7, w której obrzęk wyrażony jest jako średni wzrost objętości łapy (ml) ± SEM dla każdej z grup, pokazuje że pcdęnie iv PAF-AH blokuje obrzęk łapy wywołany podaniem PAF w godzinę i 2 godziny po ekspozycji. Grupa, która otrzymała 2000 U PAF-AH drogą iv wykazywała zmniejszony stan zapalny w porównaniu z grupą kontrolną. W grupie PAF-AH obserwowano wzrost objętości łapy 0,1 ml ± 0,08 (SEM) w porównaniu z 0,56 ± 0,11(SEM) w grupie otrzymującej nośnik.

F. Porówncnie ochiOny zcpvwmaaej punez PAF-AA w oHrzw ku cą/wołeyemPAO albo cymosαnem

Szczurom (N=4 na grupę) podano iv PAF-AH (2000 U w 300 μΐ nośnika) albo sam nośnik. 15 minut potem grupy otrzymywały PAF albo cymnsam A, po czym mierzono objętość łapy po godzinie albo 2 godzinach. Jak widać na figurze 8, w której obrzęk wyrażony jest jako średni wzrost objętości łapy (ml) ± SEM dla każdej z grup, andynie iv PAF-AH blokuje obrzęk łapy wywołany podaniem PAF w godzinę i 2 godziny po ekspozycji, ale nie podaniem cymosanu. Średni wzrost objętości w grupie PAF-AH wynosił 0,08 ± 0,02 w porównaniu z 0,49 ± 0,03 w grupie kontrolnej.

G Miareczkowanie dawki PAF-AH skutecznej dla ochrony

W dwóch osobnych doświadczeniach grupy szczurów (N=3-4 na grupę) traktowano iv kolejnymi roccleńccemęmi PAF-AH albo kontrolą nośnika w objętości 300 μΐ, na 15 minut przez ekspozycją. Obie łapy eksponowano na PAF (jak opisano wyżej) i oceniano obrzęk po 1 godzinie. Figura 9, w której obrzęk wyrażony jest jako średni wzrost objętości łapy (ml) ± ± SEM dla każdej z grup, pokazuje wzrost ochrony przed obrzękiem wywołanym PAF u szczurów nostrcvkmiętych rosnącymi dawkami PAF-AH. W doświadczeniach, ID50 PAF-AH podawanej drogą iv wynosiła od 40 do 80 U/szczura.

H. Skuteczność in vivo PAF-AH jako funkcja czasu po podaniu

W dwóch osobnych doświadczenioyh grupy szczurów (N=3-4 na grupę) troktowonn iv PAF-AH (2000 U w 300 p.1 nośnika) albo kontrolą nośnika. Po podaniu, PAF podawano w różnych punktach czasu od 15 minut do 47 godzin po podaniu PAF-AH. Jak pokazano na figurze 10, w której obrzęk wyrażony jest jako średni wzrost objętości łapy (ml) ± SEM dla każdej z grup, podanie 2000 U PAF-AH chroni szczury przed obrzękiem wywołanym PAF przez co najmniej 24 godziny.

I. Farmakokinetyka PAF-AH

Cztery szczury otrzymały 2000 U PAF-AH we wstrzyknięciu iv w objętości 300 μΙ. Osocze zebrano w różnych punktach czasu i przechowywano w 4°C, po czym ccnaczonn stężenie PAF-AH w osoczu przez ELISA, stosując test wychwytu podwójnym przeciwciałem mnnoklonalnym. Pokrótce, arzeclwclyłc monoklonalna 90G11D (przykład 13) roccleńyconn w 50 mM buforze węglanowym pH 9,6 w stężeniu 100 ng/ml i unZeruchomlomn na płytkach ELISA Immulon 4 przez noc w 4°Ć. Po intensywnym płukaniu PBS cywiarająyym 0,05% Tween 20, płytki blokowano przez godzinę w temperaturze pokojowej 0,5% żelatyną skóry rybiej (Sigma) rozcieńczcną w PBS. Próbki surowicy rocyieńcccno w PBS, 15 mM CHAPS wprowadzono w powtórzeniach na płytkę ELISA i inkubowęnc prcep godzinę w temperaturze pokojowej. Po płukaniu, koniugat biotyny z przeciwciałem mnncklcnylnvm 90F2D (przykład 13) dodawano do studzienek w stężeniu 5 ^ig/ml roccieńcznnv PBS i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po płukaniu, do studzienek dodano po 50 μΐ rozcieńczaniα 1:1000 ExtraAvidin (Sigma) i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po płukaniu studzienki wywoływano stosując jako substrat OPD i ncaniαnc ilościowo. Aktywność enzymu wyliczono z krzywej wzorcowej. Figura 11, w której punkty danych oznaczają średnią ± SEM pokazuje, że po godzinie poziom enzymu w osoczu zbliża się do przewidywanego stężenia w naorclu o objętość 5-6 ml osocza dla 1^^^200 g szczurów, średnia = 374 U/ml ± 58,2. Ponad godzinę, aociom w osoczu wciąż się zmniejszą osiągając stężenie w osoczu równe 19,3 U/ml ± 3,4 po 24 godzinach, co jest wciąż istotnie wyżej niż accicm endogennej szczurzej PAF-AH, który jak oceniono testem enzymatycznym wynosi około 4 U/ml.

J. Skuteczność PAF-AH względem antagonistów PAF

Grupy szczurów (N=4 na grupę) traktowano jednym z trzech silnych środków przeciwzapalnych: antagonistą PAF CV3988 (Biomol 3L-103) podawanym ip (2 mg w 200 μΐ EtOH),

190 532 antagonistą PAF, alprazolamem (Sigma #A-8800) podawanym ip (2 mg w 200 gl EtOH) albo PAF-AH (2000 U) iv. Szczury kontrolne otrzymały dożylnie 300 gl nośnika. Antagonistów PAF podawano ip ze względu na to, że byli rozpuszczeni w etanolu. Szczurom, którym wstrzyknięto CV3988 albo alprazolam eksponowano na PAF w 30 minut po podaniu antagonisty PAF, aby umożliwić wniknięcie antagonisty do krążenia, podczas gdy szczury, którym podano PAF-AH i szczury kontrolne eksponowano na PAF 15 minut po otrzymaniu enzymu. Szczury, którym wstrzyknięto PAF-AH wykazywały zmniejszenie obrzęku wywołanego PAF lepsze niż wywołane antagonistą PAF CV3988 i alprazolamem. Patrz, figura 12, w której obrzęk wyrażony jest jako średni wzrost objętości łapy (ml) ± SEM dla każdej z grup.

Podsumowując, rPAF-AH jest skuteczna w blokowaniu obrzęku wywołanego PAF in vivo. Podawanie produktów pAF-AH można przeprowadzić miejscowo albo ogólnoustrojowe przez wstrzyknięcie iv. W badaniach dawkowania, wstrzyknięcie iv w zakresie od 160 do 2000 U/szczura dramatycznie redukuje stan zapalny wywołany PAF, podczas gdy ID50 dla szczura określono w zakresie 60-80 U/szczura. Obliczenia oparte na objętości osocza szczura 180-200 g określiły, że stężenie w zakresie 25-40 U/ml powinno zablokować obrzęk wywołany PAF. Ocenę tę wspierają wstępne badania farmakokinetyczne. Oceniono, że dawka 2000 U PAF-AH jest skuteczna do zablokowania obrzęku wywołanego PAF, przez co najmniej 24 godziny. W 24 godziny po podaniu, stężenie PAF-AH w osoczu wynosi około 25 U/ml. Stwierdzono, że PAF-AH blokuje obrzęk wywołany PAF skuteczniej niż dwóch znanych antagonistów PAF.

Podsumowując, wyniki te pokazują, że PAF-AH skutecznie blokuje stan zapalny wywołany PAF i może mieć znaczenie terapeutyczne w chorobach, w których głównym mediatorem jest PAF.

Przykład 15

Rekombinowaną PAF-AH według wynalazku badano w drugim modelu in vivo, zapalenia płuc wywołanego PAF. Opisano uprzednio, że PAF wywołuje przeciekanie naczyń po wprowadzeniu do jamy otrzewnej (Henriques i in., wyżej). Samicom szczurów (Charles River, 180-200 g) wstrzyknięto do żyły ogonowej 200 gl 1% błękity Evansa w 0,9% wraz z 300 gI oekombinowanej PAF-AH (1500 gmol/ml/godzinę, wytworzonej jak to opisano w przykładzie 14) albo z odpowiednią objętością bufora kontrolnego. 15 minut później, szczury otrzymały wstrzyknięcie 100 gl PAF (2 nmol) do przestrzeni opłucnej. Godzinę po ekspozycji na PAF, szczury zabijano i pobierano im płyn opłucnowy przez przepłukanie jamy 3 ml heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej. Stopień przeciekania naczyń określano ilością barwnika Evansa w przestrzeni opłucnowej, co oznaczano przez absorbancję przy długości fali 620 nm. Szczury traktowane PAF-AH wykazywały znacznie mniejsze przeciekanie naczyń w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi (co stanowiło ponad 80% zmniejszenie stanu zapalnego).

Powyższy wynik uzasadnia leczenie osobników cierpiących na zapalenie płuc oekombinowanym enzymem PAF-AH według wynalazku.

Przykład 16

Rekombinowany enzym PAF-AH według wynalazku badano również na skuteczność w modelu rekrutacji eozynofilów wywołanej antygenem. Gromadzenie eozynofilów w drogach oddechowych jest charakterystyczną cechą reakcji późnej fazy, która zachodzi w astmie, katarze i wyprysku. Myszy BALB/c (Charles Riveo) uczulano pozez dootrzewnowe wstrzyknięcie 1 gg owalbuminy (OVA) w 4 mg wodorotlenku glinu (Imject alum, Pierce Laboratories, Rockford, IL) podawanej w odstępach 2 tygodniowych. 14 dni po drugiej immunizacji, uczulone myszy eksponowano na OVA w aerozolu albo na sól fizjologiczną jako kontrolę.

Przed ekspozycją, myszy podzielono losowo na cztery grupy, po 4 myszy/grupę. Myszy w grupach 1 i 3 otrzymały 140 gl bufora kontrolnego zawierającego 25 mM Tois, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA i 0,1% Tween 80 we wstrzyknięciu dożylnym. Myszy w grupach 2 i 4 traktowano 750 jednostkami PAF-AH (aktywność 5500 jednostek/ml w 140 gl bufora). 30 minut po podaniu PAF-AH albo bufora, myszy w grupach 1 i 2 eksponowano na aerozol PBS, jak to opisano niżej, zaś myszy w grupach 3 i 4 eksponowano na aerozol OVA. 24 godziny później

190 532 myszy traktowano po raz drugi 140 μΐ bufora (grupa 1 i 3) albo 750 jednostkami PAF-AH w 140 μl bufora (grupy 2 i 4) we wstrzyknięciu dożylnym.

Naciek eozynofilowy tchawicy indukowano u uczulonych myszy przez ekspozycję na OVA w aerozolu. Uczulone myszy umieszczano w 50 ml stożkowych probówkach wirowniczych (Corning) i zmuszano do oddychania OVA (50 mg/ml) rozpuszczoną w 0,9% roztworze soli przez 20 minut przy użyciu nebulizatora (Model 646, DeVilbiss Corp., Somerset, PA). Myszy kontrolne traktowano w podobny sposób, z takim wyjątkiem, że w nebulizatorze stosowano 0,9% roztwór soli, 24 godziny później myszy zabijano i wycinano tchawice. Tchawice z każdej z grup zatapiano w OCT i przechowywano w -70°C.

W celu zbadania nacieku eozynofilów do tchawicy, skrawki tkanek z każdej z czterech grup barwiono roztworem Luna i roztworem hematoksyliny/eozyny albo peroksydazą 12 skrawków o grubości 6 μm cięto z każdej z myszy w grupie i odpowiednio numerowano. Skrawki utrwalano w mieszaninie formaliny i alkoholu przez 5 minut w temperaturze pokojowej, płukano w trzech zmianach wody po 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie płukano w dwóch zmianach dH20 po minucie w temperaturze pokojowej. Skrawki tkanek barwiono roztworem Luna przez 5 minut w temperaturze pokojowej (roztwór Luna zawiera 90 ml hematoksyliny żelazowej Weigerta i 10 ml 1% szkarłatu Biebricha). Barwione szkiełka zanurzano w 1% kwaśnym alkoholu sześciokrotnie, spłukiwano wodą bieżącą przez minutę w temperaturze pokojowej, zanurzano w 0,5% roztworze węglanu litu pięć razy i spłukiwano pod wodą bieżącą przez minutę w temperaturze pokojowej. Szkiełka odwadniano w szeregu alkoholi 70%-95%-100% po minucie w każdym w temperaturze pokojowej, a następnie rozjaśniano w ksylenie przez minutę w temperaturze pokojowej i zatapiano w Cytoseal 60.

W celu znakowania peroksydazą, parzyście numerowane skrawki utrwalano w acetonie w 4°C przez 10 minut i pozostawiano do wyschnięcia. Do każdego ze szkiełek dodawano 200 μl roztworu DAB i pozostawiano na 5 minut w temperaturze pokojowej. Szkiełka płukano pod bieżącą wodą przez 5 minut i na każdy skrawek nakraplano 2 krople 1% kwasu osmowego na 3-5 sekund, skrawki płukano przez 5 minut pod bieżącą wodą ^w temperaturze pokojowej i podbarwiano hematoksyliną Meyera w 25°C w temperaturze pokojowej. Szkiełka płukano pod bieżącą wodą przez 5 minut i odwadniano w szeregu alkoholi 70%-95%-100% po minucie w każdym w temperaturze pokojowej, a następnie rozjaśniano w ksylenie przez minutę w temperaturze pokojowej i zatapiano w Cytoseal 60.

Badano liczbę eozynofilów w tkance podśluzowej tchawicy. Tchawice od myszy w grupach 1 i 2 zawierały bardzo niewiele eozynofilów rozsianych w tkance podśluzowej. Jak oczekiwano, tchawice w grupie 3, którą traktowano buforem i eksponowano na OVA zawierały znaczną liczbę eozynofilów w tkance podśluzowej. W przeciwieństwie, tchawice od myszy w grupie 4, którą traktowano PAF-AH i eksponowano na OVA zawierała bardzo niewiele eozynofilów w tkance podśluzowej, porównywalną do liczby w obu grupach kontrolnych 1 i 2.

Tak więc, wskazane jest leczenie PAF-AH osobników wykazujących reakcję typu późnego obejmującą gromadzenie eozynofilów w drogach oddechowych, jak ma to miejsce w astmie i katarze.

Przykład 17

Produkt PAF-AH według wynalazku badano również w dwóch różnych modelach szczurzych leczenia martwiczego zapalenia jelit (NEC) i ostrej martwicy krwotocznej jelita grubego, które występują u noworodków z niską masą urodzeniową i powodują istotną chorobowość i śmiertelność. Poprzednie doświadczenia wykazały, że leczenie glikokortykoidami zmniejsza częstość występowania NEC u zwierząt i noworodków wcześniaczych, zaś aktywność glikokortykoidów zachodzi przez zwiększenie aktywności osoczowej PAF-AH.

A. Aktywność u szczurów z NEC wywołaną ekspozycją na PAF

Rekombinowany produkt PAF-AH, rPH.2 (25500 jednostek w 0,3 ml, grupy 2 i 4) albo kontrola samego nośnika/bufora 925 mM Tris, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA i 0,1% Tween 80) (grupa 1 i 3) podawano do żyły ogonowej samic szczurów szczepu Wistar (n=3) ważących 180-220 gramów. Do aorty brzusznej podawano BSA (0,25%) z roztworem soli (grupa 1 i 2) albo PAF (0,2 μg/100 g) w BSA z roztworem soli (grupa 3 i 4) na wysokości tętnicy trzewnej

190 532 górnej, w 15 minut po podaniu rPH.2 albo nośnika, jak to opisano wcześniej przez Furukawa i in., J. Pediatr. Res. 34:237-241 (1993)). Jelito cienkie pobierano w 2 godziny później, od więzadła Trietza do jelita ślepego, płukano zimnym roztworem soli i badano makroskopowo. Próbki do badania mikroskopowego pobierano z górnej, środkowej i dolnej części jelita. Tkanki utrwalano w buforowanej formalinie i przetwarzano do badania mikroskopowego barwiąc hematoksyliną i eozyną. Doświadczenie powtarzano trzykrotnie.

Badaniem makroskopowym stwierdzono normalny wygląd jęlita grubego we wszystkich grupach leczonych nośnikiem obejmującym BSA w roztworze soli. Podobnie, rPH.2 wstrzyknięty pod nieobecność PAF nie wykazywał zmian w badaniu sekcyjnym. W przeciwieństwie, wstrzyknięcie PAF do aorty zstępującej powodowało gwałtowne, ciężkie przebarwienie i krw-Otok powierzchni surowiczej jelita. Podobny krwotok zaobserwowano w skrawkach jelita po stronie śluzówkowej, zaś jelito miało wygląd martwiczy. Gdy rPH.2 wstrzyknięto do żyły ogonowej na 15 minut przed podaniem PAF do aorty, jelito miało normalny wygląd.

Po badaniu mikroskopowym, jelito uzyskano od grup 1, 2 i 4 wykazywało normalną budowę kosmkowąoraz normalną populację komórek w blaszce właściwej. W przeciwieństwie, grupa traktowana samym PAF wykazywała martwicę na pełnej grubości i krwotok w całej śluzówce.

U szczurów wykorzystywanych w powyższym doświadczeniu oznaczano również aktywność osoczowej PAF-AH. Aktywność PAF-AH oznaczano w następujący sposób. Przed wstrzyknięciem do żyły ogonowej pobierano próbki krwi. Kolejne próbki krwi otrzymano z żyły czczej tuż przed wstrzyknięciem PAF oraz w momencie zabicia zwierzęcia. Około 50 pl zebrano do heparyn izowanych probówek kapilarnych. Osocze otrzymano po wirowaniu (980 xg przez 5 minut). Enzym badano jak to opisano uprzednio w Yasuda i Johnson, Endocrinology 130:708-716 (1992).

Średnia aktywność osoczowej PAF-AH u wszystkich szczurów przed wstrzyknięciem wynosiła 75,5 ± 2,5 jednostki (1 jednostka = 1 nmol x min- x ml-' osocza), średnie aktywności osoczowej PAF-AH w 15 minut po wstrzyknięciu nośnika wynosiła 75,2 ± 2,6 jednostki dla grupy 1 i 76,7 ± 3,5 jednostki dla grupy 3. Po 15 minutach, aktywność osoczowej PAF-AH u zwierząt, którym podano 25500 jednostek rPH.2 wynosiła 2249 ± 341 jednostek dla grupy 2 i 2494 ± 623 dla grupy 4. Aktywność w grupach 2 i 4 pozostała podwyższona (1855 ± 257 jednostek) do momentu zabicia (2,25 godziny po wstrzyknięciu rPH.2) (grupa 2 = 1771 ± 308; grupa 4 = 1939 ± 478). Wyniki te wskazują, że aktywność osoczowej PAF-AH u szczurów, którym wstrzyknięto sam nośnik (grupa 1 i 3) nie zmieniała się w trakcie doświadczenia. Wszystkie zwierzęta otrzymujące jedynie wstrzyknięcie PAF rozwinęły NEC, podczas gdy szczury, którym wstrzyknięto rPH.2, a następnie PAF były całkowicie chronione.

2. Zależność od dawki ochrony przed NEC

W celu określenia, czy ochrona przed NEC u szczurów jest zależna od dawki, zwierzęta traktowano rosnącymi dawkami rPH.2 na 15 minut przed podaniem PAF. Początkowo, rPH.2 w zakresie od 25,2 do 25500 jednostek podawano do żyły ogonowej szczurów. Następnie, podawano PAF (0,4 pg w 0,2 ml roztworu soli z BSA) do aorty brzusznej w 15 minut po podaniu rPH.2. Jelito cienkie pobierano i badano na rozwój NEC 2 godziny po podaniu PAF. Aktywność osoczowej PAF-AH oznaczano przed podaniem enzymu egzogennego oraz 15 minut i 2,25 godziny po podaniu rPH.2. Wyniki przedstawiają średnią z 2-5 zwierząt w każdej grupie.

Badanie sekcyjne wskazywało, że wszystkie szczury otrzymujące poniżej 2000 jednostek enzymu rozwijały NEC. Aktywność osoczowej PAF-AH u zwierząt otrzymujących najniższą dawkę ochronną enzymu (2040 jednostek) wynosiła 363 jednostki na ml osocza po 15 minutach, stanowiąc 5-krotny wzrost w stosunku do poziomu podstawowego. Gdy rPH.2 podawano w ilości mniejszej niż 1020 jednostek, poziom enzymu w osoczu wynosił średnio 160 albo mniej i wszystkie zwierzęta rozwijały NEC.

3. Czas trwania ochrony przed NEC

W celu określenia długości czasu, przez jaki produkt PAF-AH zapewniał ochronę przed rozwojem NEC, szczury nastrzykiwano stałą ilością enzymu przez żyłę ogonową, a następnie eksponowano na PAF w różnych punktach czasu. rPH.2 (8500 jednostek w 0,3 ml) albo sam

190 532 nośnik podawano do żyły ogonowej szczurów, po czym wstrzykiwano PAF do aorty brzusznej (0,36 pg w 0,2 ml roztworu soli z BSA) w różnych okresach czasu po podaniu enzymu. Jelita pobierano 2 godziny po wstrzyknięciu PAF w celu badania makroskopowego i mikroskopowego w celu określenia rozwoju NEC. Aktywności osoczowej PAF-AH określano w różnych punktach czasu po podaniu enzymu oraz w dwie godziny po podaniu PAF. Dla każdej grupy określano średnią wartość ± błąd standardowy.

Wyniki wskazują że żaden ze szczurów nie rozwinął NEC w ciągu 8 godzin po wstrzyknięciu rPH.2, jednakże 100% zwierząt eksponowanych na PAF w 24 i 48 godzin po wstrzyknięciu enzymu rozwinęło NEC.

4. Odwrócenie NEC

W celu określenia, czy podanie produktu PAF-AH było zdolne do odwrócenia rozwoju NEC wywołanego przez wstrzyknięcie PAF, 25500 jednostek enzymu podano przez wstrzyknięcie do żyły wrotnej w 2 minuty po podaniu PAF (0,4 pg). żadne ze zwierząt nie rozwinęło NEC. Jednakże, gdy rPH.2 podano tą drogą w 15 minut po wstrzyknięciu PAF, wszystkie zwierzęta rozwinęły NEC, co jest zgodne z przebiegiem czasowym rozwoju NEC wywołanego podaniem PAF, jak to uprzednio opisano przez Furukawa i in., (wyżej).

Podsumowując, obserwacje te wskazują, że względnie mały (5-krotny) wzrost aktywności osoczowej PAF-AH jest zdolny do zapobieżenia NEC. Obserwacje te skojarzone z poprzednimi doniesieniami, że aktywność osoczowej PAF-AH u płodów króliczych (Maki i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:728-732 (1988)) i wcześniaków (Caplan i in., J. Pediatr. 116:908-964 (1990)) raczej nie sugerują, że profilaktyczne podawanie rekombinowanego ludzkiego produktu PAF-AH noworodkom z niską masą urodzeniową może być przydatne w leczeniu NEC.

B. Aktywność noworodkowym modelu NEC

Skuteczność produktu PAF-AH, rPH.2 badano w następujący sposób w modelu NEC, w którym noworodki szczurze poddawano stresowi pokarmowemu i asfiksji, dwóm głównym czynnikom ryzyka rozwoju choroby u ludzi. W modelu tym około 70-80% zwierząt rozwija makro- i mikroskopowe uszkodzenie jelit podobne do NEC u noworodków w trzecim dniu życia. Noworodki uzyskano od ciężarnych szczurów Sprague-Dawley (Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis IN), które znieczulono CO2 i pobrano noworodki przez nacięcie jamy brzusznej. Noworodki zebrano, osuszono i utrzymywano w inkubatorze podczas całego doświadczenia.

Najpierw, osobne grupy zwierząt zastosowano do określenia dawkowania i charakterystyki wchłaniania rPH.2. Normalne noworodki szczurze otrzymywały jedną z trzech różnych dawek dojelitowycU albo dootrzewnowych rPH.2 (3λ, 15λ albo 75λ) w czasie 0, po czym pobierano im krew w godzinę, 6 godzin albo 24 godziny w celu oznaczenia aktywności pAF-AH. Aktywność PAF-AH mierzono stosując test inkubacji z substratem (Gray i in., Naturę, 374:549 (1995)) oraz ELISA wykorzystujący przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiej ZAF-AH (90F2D i 90G11D, opisane w przykładzie 13). Dla wybranych próbek, przeprowadzono analizę immhnoUistochemiczną z wykorzystaniem przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiej PAJF-AH (90F2D i 90G11D, opisane w przykładzie 13). ImmunoUistochemię przeprowadzono techniką standardową stosując rozcieńczenie 1:100 przeciwciała i inkubację przez noc.

Zo dawkowaniu dojelitowym rZH.2 normalnym noworodkom szczurzym, w każdym p_unk_ci_e czasu nie występowała mierzalna aktywność osoczowej PAF-AH mierzone testem i_nk_hb_acji z substratem czy techniką ELISA. Przy podawaniu dootrzewnowym rPH.2 można było _stwi_erdzić mierzalny poziom aktywności PAF-AH obiema metodami w godzinę po dawfowamą zaś _aktywność ta miała szczyt po 6 godzinach. Wyższe dawki rPH.2 (od 3 do 75λ, 10 d_o 250 U) dawały wyższą aktywność aktywności osoczowej PAF-AH. Analiza immunohi_st_och_emi_cz_na wykazała obecność produktu PAF-AH w komórkach nabłonkowych śluzówki jelit p_o pod_ani_u dojelitowym. Reaktywność skupiała się głównie w kosmkach jelitowych z mimmalnym znakowaniem komórkach krypt. Więcej znakowania występowało w jelicie krętym _niż c_zczym, zaś nieco produktu rPH.2 zidentyfikowano w części okrężnicy. Nie wykaza_no b_arwienia w żadnej z próbek kontrolnych ani w próbkach pozyskanych od zwierząt,

190 532 którym podawano drogą dootrzewnową. Tak więc, podawanie jelitowe produktu rPAF-AH powodowało miejscowe gromadzenie w nabłonku śluzówkowym bez znaczącego wchłaniania, podczas gdy, w przeciwieństwie, podanie dootrzewnowe produktu rPAF-AH powodowało znaczny poziom krążącego produktu rPAF-AH bez miejscowego gromadzenia w śluzówce.

W modelu NEC, wywoływano ją u noworodków szczurzych według Caplan i in., Pediatr. Pathol. 14:1017-1028 (1994). Pokrótce, zwierzęta karmiono pokarmem dla niemowląt z proszku (Esbiliac, Borden Inc.), co trzy godziny przez dren. Objętość karmienia wynosiła początkowo 0,1 ml/karmienie i zwiększała się w miarę tolerancji do 0,4 ml/karmienie przez 4 dni protokołu. Wszystkie zwierzęta poddawano asfiksji dwa razy dziennie przez podawanie do oddychania 100% azotu przez 50 sekund w zamkniętej plastikowej komorze, a następnie ekspozycję na zimno (4°C) przez 10 minut. Czynność jelita i pęcherza pobudzano przez delikatne masowanie po każdym karmieniu. Zwierzęta utrzymywano przez 96 godzin albo do momentu, gdy wykazywały objawy choroby. Zwierzęta konające wykazywały napięcie powłok brzusznych, krwiste stolce, zaburzenia oddychania, sinicę i apatię, i zabijano je przez dekapitację. Po zabiciu, jelita zwierząt badano makroskopowo w kierunku objawów martwicy, a następnie utrwalano w formalinie do późniejszego badania histologicznego. Próbki zatapiano w parafinie, skrawano na mikrotomie, barwiono hematoksyliną i eozyną, zaś badanie prowadziło dwóch obserwatorów w sposób zakodowany. Uszkodzenie jelit oceniano jako 1 + w przypadku uniesienia albo oddzielenia komórek nabłonka, 2+ w przypadku martwicy komórek nabłonkowych do poziomu kosmków, 3+ w przypadku martwicy całych kosmków i 4+ w przypadku martwicy całościennej.

W celu oceny skuteczności rPH.2, trzy różne grupy szczurów traktowano substancją drogą dojelitową., dootrzewnową albo obiema. Preparat rPH.2 zawierał 0,8 mg/ml białka i około 4000 jednostki/mg aktywności PAF-AH, ze stosunkiem endotoksyny do białka wynoszącym < 0,5 EU/mg. Zwierzętom w grupie dawkowania dojelitowego podawano 25λ (80 jednostek) rPH.2 przez rurkę dozoładkową, w rozcieńczeniu do każdego karmienia (co trzy godziny). Zwierzętom w grupie dawkowania dootrzewnowego podawano 75λ we wstrzyknięciu dwa razy dziennie. Zwierzęta kontrolne otrzymywały odpowiednie objętości bufora (20 mM NaPO4, pH 7,4) bez rPH.2 i badano je równocześnie z każdą grupą badaną. Śmiertelność i objawy NEC badano dla każdej grupy leczonej, zaś różnice analizowano statystycznie stosując test dokładny Fishera. Wartość p < 0,05 uważana była za istotną statystycznie. Wyniki pokazano na tabeli 9.

Tabela 9

	NEC	Śmierć
Kontrola (pod. ip)	7/10	8/10
rPH.2 (240 U ip dwa razy dziennie)	6/11	8/11
Kontrola (pod. dojelitowe)	19/26	21/26
rPH.2 (80 U dojelit. co 3 godziny)	6/26	7/26
Kontrola (ip + dojelit.)	10/17	12/17
rPH.2 (240 U ip dwa razy dziennie i 80U dojelit co 3 godziny	3/14	7/14

Dane stanowią kumulowane wyniki z czterech różnych doświadczeń dawkowania ip, czterech doświadczeń dawkowania dojelitowego i trzech doświadczeń dawkowania ip + dojelitowego.

190 532

Podawanie dojelitowe rPH.2 istotnie redukuje częstość występowania NEC i śmierci w porównaniu do zwierząt kontrolnych. Wyniki z czterech różnych doświadczeń dawkowania dojelitowego wykazały, że traktowanie rPH.2 zmnieesza częstość NEC od 19/26 (kontrola) do 6/26 (p < 0,001). Uszkodzenie jelit było różne wśród zwierząt leczonych i kontrolnych, ale w większości przypadków charakteryzowało się martwicą śródkosmkową w niektórych segmentach, całkowitą martwicą w innych obszarach, czasami obszarami martwicy śródściennej i pozostałymi częściami o normalnej histologii. Najcięższy stopień NEC u zwierząt leczonych i kontrolnych z uszkodzeniem jelit był podobny (wynik mediany 2,8 w kontroli i 2,4 u zwierząt leczonych rPH.2, p > 0,05).

Dootrzewnowe dawkowanie rPH.2 nie miało istotnego wpływu na NEC czy śmierć w tym modelu. Wystąpienie objawów było podobne w tej grupie i grupie kontrolnej (40 ± 5 godzin w kontroli i 36 ± 7 godzin u zwierząt leczonych rPH.2), jak również stopień NEC w obu grupach był podobny (wynik mediany 2,6 w grupie kontrolnej i 2,5 w grupie szczurów leczonych rPH.2).

Przeprowadzono dodatkowe doświadczenie, w którym szczurom podawano dojelitowo i dootrzewnowo rPH.2 w tej samej dawce co w pojedynczym leczeniu (25X, rPH.2 w każdym karmieniu co 3 godziny, plus 75λ, we wstrzyknięciu dootrzewnowym 2 razy dziennie). Wyniki przedstawiono na tabeli 9. Jakkolwiek nie było istotnych różnic pomiędzy grupami leczonymi i kontrolnymi pod względem śmiertelności, leczenie rPH.2 istotnie redukowało występowanie NEC (10/17 w kontroli i 3/14 w grupie leczonej rPH.2, p=0,04). Warte odnotowania jest to, że 6 spośród 7 zwierząt, które padły w grupie leczonej rPH.2 miało dodatni wynik hodowli E. coli we krwi pozyskanej na krótko przed śmiercią.

Wyniki te dalej wspierają ochronną rolę produktów PAF-AH w modelu noworodkowej NEC nie wywołanej PAF. Dojelitowe leczenie przy użyciu produktu rPAF-AH zapobiega NEC, podczas gdy leczenie dootrzewnowe nie wykazuje efektu. Odkrycie to sugeruje, że suplementacja produktem PAF-AH noworodków wcześniaczych dokarmianych mieszanką, narażonych na ryzyko NEC może zmniejszyć częstość występowania tej choroby.

Przykład 18

Badano skuteczność produktu PAF-AH w modelu ostrego zespołu niewydolności oddechowej (ARDS) na świnkach morskich.

Czynnik aktywujący płytki (PAF) wstrzyknięty dożylnie świnkom morskim wywołuje głębokie zapalenie płuc przypominające wczesny ARDS u ludzi. W ciągu minut od dożylnego podania PAF, śródmiąższ płuc ulega przekrwieniu, zaś oskrzela i oskrzeliki kurczą się (Lellouch-Tubiana i in., wyżej). Płytki i neutrofile wielokształtnojądrzaste gromadzą się przyściennie, zaś w tętniczkach płucnych można zaobserwować skupiska komórek (Lellouch-Tubiana i in., Br. J. Exp. Path. 66:345-355 (1985)). Wstrzyknięcie PAF niszczy również komórki nabłonka oskrzeli, które oddzielają się od ścian dróg oddechowych i gromadzą w świetle dróg oddechowych. To zniszczenie nabłonka dróg oddechowych jest zgodne z tworzeniem błon szklistych, które występuje u ludzi w trakcie rozwoju ARDS. Po marginalizacji neutrofilów i płytek szybko następuje diapedeza komórek do przegród pęcherzykowych i przestrzeni pęcherzykowych płuc. Naciekom komórkowym wywołanym PAF towarzyszy przeciek naczyniowy powodujący obrzęk płuc (Kirsch, Exp. Lung Res. 18:447-459 (1992)). Dowody na obrzęk dalej wspierają badania in vitro, w których PAF wywołuje zależne od dawki (10-1000 ng/ml) wynaczynienie fibrynogenu znakowanego ^r2⁵I w perfundowanych płucach świnki morskiej (Basran, Br. J. Pharmacol. 77:437 (1982)).

W oparciu o te obserwacje, opracowano model ARDS na świnkach morskich. W żyle szyjnej znieczulonych świnek morskich Hartly (około 350-400 g) umieszczono cewnik i podawano PAF rozcieńczony w 500 μΐ roztworu soli buforowanego fosforanem, z 0,25% albuminą surowicy bydlęcej jako nośnikiem (PBS-BSA) wciągu 15 minut w dawce całkowitej w zakresie 100-400 ng/kg. W różnych odstępach czasu po podaniu PAF, zwierzęta zabijano i zbierano tkanki płuc. U świnek morskich, którym wstrzyknięto PAF widoczne było zależne _od dawki uszkodzenie płuc i stan zapalny po 15 minutach i trwało występując po 60 minuta_ch. Neutrofile i erytrocyty obecne były w przestrzeni pęcherzykowej świnek morskich t_rakt_owa_nych PAF, ale nie występowały u zwierząt kontrolnych i pozornie nastrzykniętych.

190 532

Dowody uszkodzenia komórek nabłonkowych są również widoczne i przypominają tworzenie błon szklistych u pacjentów z ARDS. Oznaczanie białka w próbkach popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BAL) pobranych od świnek morskich, którym wstrzyknięto PAF wykazało dramatyczne gromadzenie się białka w zmienionych zapalnie płucach, co było odwodem przecieku naczyniowego.

Stwierdzono, że rPH.2 całkowicie chroni przed uszkodzeniem płuc wywołanym PAF w modelu ARDS na świnkach morskich Grupy świnek morskich traktowano rPH.2 (2000 jednostek w 500 μ) albo 500 μΐ bufora PAF-AH. 15 minut później świnkom morskim podawano 400 ng/kg PAF w objętości 500 μ! wciągu 15 minut. Oprócz tego, grupa pozorna świnek morskich otrzymała 500 μΐ PBS-BSA. Na zakończenie wstrzykiwania PAF, zwierzęta zabito i zebrano BAL przez płukanie płuc 2x po 10 ml roztworu soli zawierającego 2 |-Lmlheparrny w celu zajpobb^^iżn^^kn^i^jen^^ciu. W celuoonrczenra stężemabiattła w BBA, próbki rozcieńczono 1:10 w soli fizjologicznej i oznaczono OD280. Płyn BAL od grupy pozornie ypstrzykyictnj świnek morskich zawierał stężenie białka rzędu 2,1 ± 1,3 mg/ml. W przeciwieństwie, płyn BAL od zwierząt, którym wstrzyknięto PAF zawierał stężenie białka rzędu 12,55 ± 1,65 mg/ml. U świnek morskich traktowanych rPH.2 płyn BAL zawierał stężenie białka rzędu 1,13 ± 0,25 mg/ml, co było porównywalne z kontrolą pozorną i wykazuje, że produkt PAF-AH całkowicie blokuje obrzęk płuc w reakcji na PAF.

Przykład 19

Skuteczność produktu PAF-AH, rPH.2 badano w dwóch modelach ostrego zapalenia trzustki.

A. Aktywność w modelu zapalenia trzustki u szczura

Samce szczurów Wistar (200-250 g) zakupiono z Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Trzymano je w pomieszczeniu o kontrolowanym klimacie w 23 ± 2°C z K-godzinnym cyklem światła/ciemności i karmiono standardową karmą hodowlaną i wodą ad libitum. Zwierzęta losowo podzielono do grup kontrolnej i doświadczalnych. Szczury znieczulono 50 mg/kg soli sodowej pentbbprbitplu dootrzewnowo i umieszczono im w żyle szyjnej cewnik z ooliwinylu (wielkość V3, Biolab pProducts, Lake Havasu, AZ). Cewnik przeprowadzono podskórnie i wyprowadzono na grzbietowej powierzchni szyi, po czym pozostawiono zwierzęta do wybudzenia. Szczurom pozostawiono pełny dostęp do wody, ale głodzono przez noc. Doświadczenia przeprowadzono następnego dnia na przytomnych zwierzętach. Początkowo, sprawdzono drożność cewnika przez ciągłą infuzję roztworu soli (0,2 ml/godz.). W dniu doświadczenia zwierzętom wstrzyknięto dożylnie z rPH.2 albo nośnik, a następnie wstrzyknięto im (1) 5 μg/kg na godzinę ceruleiny przez 3,5 godziny albo (2) 10 μg/kg na godzinę ceruleiny przez 5 godzin (Resnarce Plus, Baybyyn, NJ). Bezpośrednio po zakończeniu infuzji, zwierzęta znieczulono solą sodową peytbbarbitplu, otworzono jamę brzuszną i pobrano 5 ml krwi z żyły głównej dolnej do dalszych testów. Następnie szczury zabito przez skrwawienie. Zmierzono poziom amylazy, lipazy i bilirubiny w surowicy, i pobrano trzustkę, części trzustki utrwalono w 4% roztworze formaliny buforowanym fosforanem do badania histologicznego albo bezpośrednio głęboko mrożono w -80°C do pomiaru mielbonroksydazy. Dodatkowe części trzustki oceniano na zawartość wody oraz amylazy i trypsyny trzustkowej w opisany niżej sposób. Aktywność minlboerΌksydazn, miarę snkwestrpejl mutrofilów, mierzono w trzustce i płucach w opisany niżej sposób. Przepuszczalność naczyń płucnych oceniano jak opisano niżej. Analizę statystyczną danych przeprowadzono testem t Studenta. Dane opisane stanowią średnie ± SEM przynajmniej trzech doświadczeń. Różnice w wynikach uważano za istotne, gdy p < 0,05.

1. Zawartość wody w trzustce

Części trzustki osuszono i zważono (ciężar mokry), a następnie wysuszono przez 34 godziny w 120°C ponownie zważono (ciężar suchy). Zawartość wody trzustkowej obliczono jako różnicę pomiędzy ciężarem mokrym i suchym i wyrażano jako procent ciężaru trzustki mokrej. Wzrost ilości zawartości wody uważano za rozwój obrzęku.

2. A^iylaza surowicza i trzustkowa

Aktywność amylazy w surowicy mierzono stosując 4,6-etylidnyb(G7)-p-nitrofenylo(Gl )-aiD-maltoplazyd (ET-G7PNP) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) jako substrat, według

190 532

Pierre i in., Clin, Chem. 22:1219 (1976). Aktywność amylazy w tkance trzustkowej homogenizowanej wlO mM buforze fosforanowym, pH 7,4 mierzono stosując ten sam sposób.

3. Toypsyna trzustkowa

Aktywność trypsyny mierzono florymetrycznie stosując Boc-Gin-Ala-Arg-MCA jako substrat. Pokrótce, 200 gl próbki i 2,7 ml bufora 50 mM Tris (pH 8,0) zawierającego 150 mM NaCl, 1 mM CaCh i 0,1% albuminę surowicy bydlęcej zmieszano w kuwecie, 1 gl substratu dodano do próbki po 20 sekundach inkubacji w celu rozpoczęcia reakcji. Pobierano odczyt fluorescencji (wzbudzenie 380 nm, emisja 440 nm) i wyrażano jako nachylenie, w celu zebrania danych z różnych doświadczeń aktywność trypsyny we frakcjach wyrażano jako procent całkowitej aktywności trypsyny.

4. Histologia i morfometria

Do mikroskopii świetlnej pobierano losowo skrawki z głowy, trzonu i ogona trzustki i utrwalano w 10% formalinie buforowanej fosforanem. Skrawki 5 gm zatopione w parafinie barwiono hematoksyliną-eozyną (H&E) i badano w sposób zakodowany korzystając z biegłego histologa. Uszkodzenie/maotwicę komórek zrazikowych określano jako (a) obecność widm komórek zrazikowych albo (b) wakuolizację i obrzęk komórek zrazikowych i zniszczenie budowy histologicznej zrazików, pozy czym obu zjawiskom towarzyszyła reakcja zapalna. Wielkość uszkodzenia/martwicy komórek zrazikowych oraz całkowity obszar zajmowany pozez tkankę zrazików obliczano morfometrycznie stosując skomputeryzowaną jednostkę video do analizy planimetrycznej (model CCD-72, Dage-MTl, Michigan City, IN) wyposażona w oprogramowanie do analizy obrazu NIH-1200 Losowo wybrane pola mikroskopowe (125x) badano dla każdej próbki tkanki. Wielkość uszkodzenia/martwicy komórek zrazikowych wyrażano jako procent całkowitej tkanki zrazikowej, która była zajmowana przez obszary, które spełniały kryteria uszkodzenia/martwicy.

5. Pomiar aktywności mieloperoksydazy trzustki i płuc (MPO)

Sekwestrację neutrofilów w trzustce i płucach badano pozez pomiar aktywności tkankowej mieloperoksydazy. Próbki tkanki zebrano w momencie zabicia zwierzęcia i przechowywano w -70°C do momentu badania. Próbki (50 mg) rozmrożono i homogenizowano w 1 ml 20 mM bufora fosforanowego (pH 7,4) i wirowano (10000 x g, 10 minut, 4°C). Powstały osad zawieszono w 50 mM buforze fosforanowym 9pH 6,0) zawierającym 0,5% bromek hexsadecylotrimetyloamonowy (Sigma, St. Louis, MO) i poddano czterem cyklom zamrażania/odmoażania. Zawiesinę dalej rozbijano pozez sonikację pozez 40 sekund i wirowano (10000 xg, 5 min. 4°C). Mieszaninę reakcyjną obejmującą ekstrahowany enzym, 1,6 mM tetrametylobenzydynę (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 80 mm bufor fosforanu sodu (pH 5,4) i 0,3 mM nadtlenek wodoru inkubowano w 37°C pozez 110 sekund, zaś absorbancję mierzono przy 655 nm w analizatorze CobasBio. Absorbancję korygowano na frakcję suchego ciężaru próbki tkankowej.

6. Pomiar przepuszczalności naczyń płucnych

Skurcz przewodu trzustkowego wspólnego również często daje ciężkie uszkodzenie płuc związane z zapaleniem trzustki, co można mierzyć przepuszczalnością naczyń płucnych i badaniem histologicznym.

Dwie godziny przed zabiciem zwierząt, podano im dożylnie wstrzyknięcie z 5 mg/kg albuminy sprzęgniętej z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC-albumin, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Przepuszczalność mikrokrążenia płucnego badano pozez pomiar wyciekania FITC-albuminy do przedziału oskrzelowo-pęcherzykowego płuc. Pokrótce, tuż po zabiciu, prawe oskrzele zablokowano stosując zacisk i eksponowano tchawicę. Następnie prawe płuco płukano stosując cewnik wprowadzony do tchawicy. Trzy płukania roztworem soli (60 ml) pulowano i mierzono fluorescencję FITC w surowicy i popłuczynach przy długości fali wzbudzenia 494 nm i emisji 520 nm. Stosunek fluorescencji płynu popłuczynowego do krwi obliczono i przyjęto jako miarę przepuszczalności mikrokrążenia w płucach. Płuca barwiono również H7E i badano histologicznie.

7. Wpływ podawania ceruleiny i rPH.2

Infiizja ceruleiny samej w dawce 5 gg/kg/godz. pozez 3,5 godziny wywołuje typowe łagodne zapalenie trzustki u szczurów, które charakteryzuje się hiperamylazemią, obrzękiem trzustki, jak zmierzoną zawartością wody w trzustce i zmianami histologicznymi obejmującymi

190 532 znaczną wakuolizację komórek zrazikowych i obrzęk trzustki. Wlew soli fizjologicznej zwierzętom kontrolnym nie powoduje żadnych zmian biochemicznych ani histologicznych. Podawanie dożylne rPH.2 w dawkach 5, 10 albo 20 mg/kg 30 minut przed rozpoczęciem wlewu ceruleiny nie zmienia istotnie wielkości zmian w obrzęku trzustki (zawartość wody) i histologii, co wywołuje podanie samej ceruleiny. Podawanie rPH.2 również nie ma wpływu na aktywację trypsynogenu trzustkowego albo zawartość amylazy przez ceruleinę.

Infuzją wyższych dawek ceruleiny, 10 pg/kg/godz. wywołuje cięższe zapalenie trzustki, charakteryzujące się względem wszystkich kontroli, bardziej zaznaczonym wzrostem amylazy trzustkowej i obrzęku trzustki, znacznym zwiększeniem aktywności trzustkowego MPO i istotnym wz^f^stf^^ aktywności trypsynogenu i aktywności amylazy w trzustce. Histologia trzustki wskazuje nie tylko na obrzęk trzustki i wakuolizację komórek zrazikowych, ale również na ogniskową martwicę i komórki naciekające.

Podawanie rPH.2 (5 albo 10 mg/kg dożylnie) na 30 przed początkiem podawania ceruleiny (10 pg/kg/godz.) łagodziło wielkość wielu zmian w trzustce wywołanych infuzją samej ceruleiny. Wyniki pokazano w tabeli 10, poniżej. Traktowanie rPH.2 w dawce 5 mg/kg powodowało zmniejszenie aktywności amylazy surowiczej (od 10984 ± 1412 do 6763 ± 1256). Większa dawka 10 mg/kg rPH.2 nie wykazywała dalszej poprawy hiperamylazemii. Leczenie 5 albo 10 mg/kg rPH.2 powodowało również pewne zmniejszenie rozwoju obrzęku trzustki wywołanego ceruleiną, co zmierzono przez zawartość wody (90,61 ± 0,27 dla samej ceruleiny i 88,21 ± 0,61 dla ceruleiny + 5 mg/kg rPH.2). Dawka 5 mg/kg rPH.2 powodowała istotne zmniejszenie aktywności płucnej MPO (2,92 ± 0,32-krotny wzrost wobec kontroli dla samej ceruleiny wobec 1,19 ± 0,21 dla ceruleiny + rPH.2, p < 0,05). Wyższe dawki rPH.2 nie powodowały dalszej poprawy aktywności MPO. Żadna z dawek rPH.2 nie zmieniała istotnie wielkości aktywacji trypsynogenu ani zawartości amylazy w trzustce. Histologia trzustki wskazywała na pewną poprawę w martwicy mikroskopowej i naciekach po traktowaniu rPH.2.

Uszkodzenie płuc związane z zapaleniem trzustki obserwowano zarówno klinicznie jak i w kilku modelach zapalenia trzustki. Infuzją ceruleiny w dawce 5 pg/kg/godz. przez 3,5 godziny, która powoduje łagodną postać zapalenia trzustki, nie powoduje istotnego uszkodzenia płuc. Jednakże, infuzją ceruleiny w dawce 10 pg/kg/godz. przez 5 godzin, która powoduje cięższe zapalenie trzustki, powoduje również uszkodzenie płuc określane zwiększoną przepuszczalnością naczyń płuc (0,31 ± 0,04 do 0,79 ± 0,09), aktywnością MPO (wskazującą na sekwestrację neutrofilów) i naciek neutrofilów w badaniu histologicznym.

Podawanie rPH.2 w dawce 5 mg/kg 30 minut przed infuzję samej ceruleiny istotnie łagodzi wzrost aktywności MPO wywołanej (3,55 ± 0,93 dla ceruleiny i 1,51 ± 0,26 dla ceruleiny z rPH.2). Leczenie rPH.2 istotnie zmniejszało ciężkość zmian mikroskopowych obserwowanych w tkance płucnej po wstrzyknięciu ceruleiny. Wywołany ceruleiną wzrost przepuszczalności naczyniówki płuc był zmniejszony przez leczenie rPH.2, jakkolwiek było to nieistotne statystycznie. Wyższa dawka rPH.2 10 mg/kg nie była bardziej skuteczna niż dawka niższa pod względem zmniejszania ciężkości uszkodzenia płuc wywołanego ceruleiną.

Tabela 10

	Kontrola (bez CER)	Ceruleiną (CER) 10 pg/kg/h	(CER) + rPH.2 5 mg/kg	(CER) + rPH.2 10 mg/kg
1	2	3	4	5
Amylaza w surowicy (U/1)	961± 174	10984± 1412	6763 ± 1256	8576 ± 1024
Zawartość wody w trzustce (% mokrej wagi)	72,71 ±0,64	90,61 ± 0,27	88,21 ±0,61	89,00 ± 10,94

190 532

c.d. tabeli 10

1	2	3	4	5
MPO trzustkowy krotność względem kontroli)	1,0	2,92 ± 0,32	1,19 ±0,21	1,42 ± 0,19
Trzasvnę trzustkowy (1000x nachylenie/ąg DNA)	0,12 ±0,06	9,70 ±2,50	8,33 ± 1,75	9,15 ± 1,28
Zawartość omylazy trzustkowej (U/gg DNA)	0,28 ± 0,06	0,42 ± 0,07	0,45 ± 0,04	0,46 ± 0,044
Przepuszczalność naczyń płuc (płukanie/surowica %)	0,31 ±0,04	0,79 ± 0,09	0,70 ± 0,09	0,70 ± 0,07
MPO płucna (krotność względem kontroli)	1,0	3,55 ±0,93	1,5 ±0,26	1,64 ±0,^2

B. Aktywność w modelu copαlenio trzustki u oposów

Zdrowe, losowo schwytane oposy amerykańskie (Didelphis virginiana) płci obojga (2,0-4,0 kg) otrzymano z Scott-Haas i trzymano w klimatyzowanych pomieszczeniach 32 ± 2°C z 12 godzinnym cyklem światła i ciemności i karmiono standardową karmą hodowlaną i wodą ad libitum. Po całonocnym głodzeniu, zwierzęta znieczulano 50 mg/kg soli sodowej aentnborbltαlu ip Laboratories Inc., Lanexa, KS). Przeprowadzono celiotcmlę przez nacięcie pośrodkowe w warunkach sterylnych i podwiązano przewód żółciowo-trzustkowy wspólny w celu wywołonio ostrego martwiczego zapylenia trzustki. Oprócz tago, podwiązano przewód pęcherzykowy, oby zapobiec działaniu pęcherzyka jako zbiornika żółci. Zwierzęta losowo włączono do grupy kontrolnej albo doświadczalnej. Począwszy od 2 dnia po podwiązaniu przewodu trzustkowego, grupo doświadczalna otrzymywało dziennie 5 mg/kg rPH.2 (w postaci roztworu 4 mg/ml) dożylnie przez żyłę ogonową, podczas gdy grupo kontrolna otrzymywało dożylne wstrzyknięcia tej samej objętości nośnika. Po 1 i 2 dniu leczenia (w dniu 3 i 4 po podwiązaniu przewodu trzustkowego) zwierzęta zabito przez przedawkowania pentcbarbitalu. Próbki krwi pobierano z serca w celu pomiaru amylazy, lipazy i bilirubiny w surowicy oraz pobierano trzustki. Fragmenty trzustek utrwalano w 4% roztworze formaliny buforowanym fosforynem do badania histologicznego albo natychmiast zamrażano w -80°C w celu pomiaru aktywności mieloaaroksydyzy. Dodatkowe fragmenty trzustki oceniono na zawartość wody i omylazy trzustkowej jak to opisano wyżej w sekcji A tago przykładu. Aktywność mleloperoksydapy, miaro sakwastracji nautrofilów, oceniono w trzustkach jak to opisano wyżej. Przepuszczalność naczyń płucnych bodono również w opisany wyżej sposób.

Wyniki ocnycpyjąye średnią ± błąd standardowy średnich wartości (SEM) otrzymano z wielu oznaczeń w 3 albo więcej osobnych doświadczeniach. Istotność zmian bodono stosując test t Studenta, gdy dona obejmowały dwie grupy olbo analizą wariancji (ANOVA), gdy porównywano trzy olbo więcej grup. Jeżeli test ANOVA wskazywał na istotną różnicę, dane ynyhccwyno stosując metodę Turkey'o jako test post hoc w kierunku różnic pomiędzy grupami. Wartość p < 0,05 uważano zw różnicę istotną.

Wyniki przedstawiono w tabeli 11. Zamknięcia przewodu żółciowo-trcustkcwegc wspólnego powodowało ciężkie martwicze zapalenie trzustki charakteryzujące się hiaeręmvlαcemią, hiaerliaycemią i rozległą martwicą trzustki. Ponadto, zamknięcie przewodu żółcicwc-trcustkcwegc wspólnego związane było ze znacznym wzrostem aocicmu bilirubiny w surowicy. Dożylne podawanie rPH.2 (5 mg/kg/dzień) począwszy od dnio 2 po podwiązaniu

190 532 przewodu trzustkowego łagodziło nasilenie wielu zmian w trzustce wywołanych niedrożnością przewodu i leczeniem wyłącznie placebo. Jeden dzień leczenia rPH.2 zmniejszał poziomy amylazy w surowicy w porównaniu ze zwierzętami leczonymi placebo, jakkolwiek różnica nie była istotna statystycznie, zaś dwa dni leczenia rPH.2 (dzień 4 po podwiązaniu przewodu trzustkowego) istotnie zmniejszały poziom lipazy w surowicy w porównaniu z kontrolą. Jeden albo dwa dni leczenia rPH.2 zmniejszały poziom lipazy w surowicy w porównaniu z kontrolą, jakkolwiek różnica ta nie była istotna statystycznie. Dwa dni leczenia rPH.2 zmniejszały zawartość amylazy trzustkowej względem kontroli, jakkolwiek jeden dzień leczenia zwiększał ilość amylazy trzustkowej. Leczenie rPH.2 nie wpływało na poziom bilirubiny w surowicy, aktywność mieloperoksydazy trzustkowej czy zawartość wody w trzustce.

Główna charakterystyczna zmiana histologiczna wywołana zamknięciem przewodu żółciowo-trzustkowego obejmowała znaczną martwicę, naciek komórek zapalnych, wakuolizację komórek zrazikowych i znaczne rozszerzenie światła zrazika. Badanie morfometryczne trzustki w kierunku uszkodzenia komórek zrazika wykazało znaczny efekt ochronny leczenia rPH.2, uszkodzenie komórek zrazika było zmniejszone o około 23% całkowitej tkanki zrazika, w porównaniu z 48% uszkodzenia u zwierząt leczonych placebo. To zmniejszenie uszkodzenia komórek zrazika było jeszcze bardziej zaznaczone po dwóch dniach leczenia, kiedy to leczenie rPH.2 powodowało około 35% uszkodzenie całej tkanki komórek zrazikowych w porównaniu z 60% uszkodzeniem u zwierząt leczonych placebo.

Przepuszczalność naczyń płucnych, ocenione wstrzyknięciem FITC wykazała istotną różnicę po jednym i dwóch dniach leczenia rPH.2 w porównaniu z grupą placebo. Badanie histologiczne płuc wykazało ciężkie uszkodzenie u wszystkich zwierząt leczonych placebo. Uszkodzenie płuc charakteryzowało się nasiloną reakcją zapalną z naciekiem śródmiąższowym i pęcherzykowym głównie makrofagów, limfocytów i neutrofilów oraz ogniskowym, ale znacznym obrzękiem śródmiąższowym i zgrubieniem błon pęcherzykowych. Podawanie rPH.2 powodowało znaczne zmniejszenie obrzęku śródmiąższowego przez cały czas trwania.

Podsumowując, wyniki pokazują, że podawanie rPH.2 dożylnie w dawce 5 mg/kg/dzień począwszy od 48 godzin po podwiązaniu przewodu trzustkowego powoduje istotne złagodzenie poziomów amylazy i lipazy we krwi oraz uszkodzenia komórek zrazikowych jak oceniono przy użyciu analizy morfometrycznej skrawków barwionych H&E, oraz istotne zmniejszenie ciężkości uszkodzenia płuc wywołanego zapaleniem trzustki. Podawanie produktu rPAF-AH w tym klinicznie istotnym modelu zapalenia trzustki wykazało dobroczynny wpływ na zmniejszenie ciężkości zapalenia trzustki.

Tabela 11

	Po 1 dniu leczenia (zabicie 3 dnia)	Po 2 dniach leczenia (zabicie 4 dnia)
	Placebo	rPH.2 5 mg/kg	Placebo	rPH.2 5 mg/kg
1	2	3	4	5
Bilirubina w surowicy (mg/dl)	5,49 ± 0,96	7,10 ±01,60	6,54 ± 0,55	4,91 ± 0,79
Amylaza w surowicy (U/l)	5618± 899	4288 ± 675	6538 ± 1355	3106 ±467*
Lipaza w surowicy (U/l)	2226± 554	1241 ±263	1424 ±257	1023 ±295
Zawartość wody w trzustce (%)	81,10 ±0,56	81,52 ± 0,79	80,05 ± 1,07	79,32 ± 0,49

190 532

c.d. tabeli 11

1	2	3	4	5
MPO trzuskowa (OD/frakcja wagi suchej)	1345 ±286	1142± 83	1149 ±232	1033 ± 130
Amylaza trzustkowa (U/pg DNA)	706 ± 92	1101±105	950 ± 85	712 ± 131
Przepuszczalność naczyń płuc (FITC w płukanih/surowice)	0,76 ± 0,09	0,21 ± 0,04**	0,57 ±0,13	0,23 ± 0,04*
Uszkodzenie komórek zrazikowych (% całkowitej tkanki zrazikowej)	48%	23%	60%	35%

*p = 0,02 względem placebo **p < 0,001 względem placebo

Przykład 20

Badanie przeprowadzono w celu zbadania wpływu produktu PAF-AH, rPH.2 na neurotoksyczność związaną z zakażeniem HIV. Zakażenie ośrodkowego układu nerwowego ludzkim wirusem niedoboru odporności 1 (HIV-1) powoduje utratę neuronów na skutek apoptozy. Monocyty zakażone HIV-1, aktywowane przez różne bodźce antygenowe, w tym kontakt z komórkami nerwowymi, wydzielają znaczne ilości neurotoksycznych cytokin prozapalnych, w tym PAF. Badano wpływ rPH.2 na neurotoksyczność pożywek uwarunkowanych zakażonymi HIV i aktywowanymi monocytami.

Monocyty zakażano HłV i aktywowano w następujący sposób. Monocyty pozyskano z komórek obwodowych szpiku (PBMC) dawców negatywnych pod względem HIV i wirusowego zapalenia wątroby typu B, przez leukaferezę, a następnie oczyszczano (> 98%) przez wirowanie przeciwprądowe jak to opisano w Genis i in., J. Exp. Med. 176:1703-1718 (1992). Komórki hodowano jako przylegające pojedyncze warstwy (1x10⁴ komórek/ml w butelkach hodowlanych T-25) w DMEM (Sigma, St. Louis, MO) z rekombinowanym ludzkim czynnikiem pobudzającym kolonie makrofagów (MCSF) (Genetic Institute, Inc., Cambridge, MA). W tych warunkach, monocyty różnicowały się do makrofagów. Po 7-10 dniach w hodowli, makrofagi eksponowano na HEB-1ada (Numer dostępu M60472) w wielokrotności zakażenia (MOI) równej 0,01 zakaźnych wirionów/komórkę docelową. W tych warunkach, 20-50% monocytów ulegało zakażeniu w 7 dni po zaszczepieniu HIY-1, jak określono technikami immunofluorescencyjnymi i hybrydyzacji in situ (Kalter i in., J. Immunol. 146:298-306 (1991)). Wszystkie hodowle odżywiano świeżą pożywką, co 2-3 dni. 5 do 7 dni po zakażeniu HIV-1 i w trakcie szczytu aktywności odwrotnej transkryptazy (107 cpm/ml), ocenionej według Kalter i in., wyżej, hodowle zakażone HIV-1 i hodowle równoległe nie zakażonych monocytów pobudzano LPS (10 ng/ml) albo nośnikiem przez 30 minut w 37°C, a następnie błyskawicznie zamrażano w -80°C do zastosowania w teście neurotoksyczności.

Hodowle ludzkich neuronów kory mózgu ustalono w następujący sposób. Tkanki ludzkiego mózgu płodowego uzyskano z przodomózgowia ludzkiego płodu w drugim trymestrze (13-16 tydzień życia płodowego) zmodyfikowaną procedurą Banker i Cowan, Brain Res., 126:397-425 (1977). Pokrótce, tkankę mózgu pobrano, płukano w 30 ml zimnego BSS Hank'a (zawierającego Ca²⁺ i MG²⁺ + 25 mM HEPES i 5x gentamycynę), oddzielono od przylegających opon i krwi, po czym cięto na kawałki po 2 mm³. Tkanki przetarto przez worki 230 pM Nitex i delikatnie pipetowano przez pipetę Pasteura opaloną nad ogniem 10-15 razy. Tkankę odwirowano przy 550 obrotach na minutę, 5 minut, 4°C i zawieszono osad w 5-10 ml MEM-hipp

190 532 (D-glukoza, 5 g/litr; L-glutamina, 2 mM; HEPES, 10 mM; pirogronian sodu, 1 mM; KCl, 20 mM) zawierającej składnik NI (insulina, 5 mg/l; transferryna, 5 mg/l; selenian, 5 μ^Ί; progesteron, 20 nM; putrescyna, 100 μΜ) jak również 10% surowica płodowa cielęca (FCS), mieszaninę antybiotyków PSN (penicylina, 50 mg/l; streptomycyna, 50 mg/l; neomycyna, 100 mg/l) i fungizon (2,5 mg/l). Liczbę komórek ustalono przez rozcieńczenie BSS Hank'a 0,4% błękitem trypanu (1:1) i policzenie w hemocytometrze. Komórki przepuszczono delikatnie 5-krotnie przez 10 ml pipetę i wysiano w gęstości 10⁵ komórek/12 mm szkiełko nakrywkowe, pokryte poli-L-lizyną (70K-150K MW, Sigma, St. Louis, MO) umieszczone w 24-studzienkowych płytkach hodowlanych. Do każdej studzienki pipetowano 1 ml pożywki. Komórki hodowano przez 10-28 dni w 37°C w wilgotnej atmosferze 5% C0₂/95% powietrza, zmieniając pożywkę co 3 dni. W tych warunkach, hodowle były w > 60-70% homogenne dla neuronów, z zawartością 20-30% astrocytów, < 1% mikrogleju i około 10% barwienia na makrofagi i mikroglej. Po 14-28 dniach hodowli, hodowle neuronalne wyrażały wystarczające ilości receptorów N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) i receptorów nie-NMDA, aby zginąć po ekscytotoksycznej dawce NMDA albo kwasu propiono alfa-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolowego (AMPA).

Test neurotoksyczności przeprowadzono w następujący sposób. Próbki testowe, które zawierały (a) uwarunkowane pożywki z monocytów zakażonych HIV-1 i pobudzonych LPS, (b) pożywki kontrolne, (c) pożywki uwarunkowane z dodanym rPH.2 w ilości 51 μg/ml albo (d) pożywki uwarunkowane, do których dodano nośnik dla rPH.2, wprowadzono do hodowli komórek neuronalnych w stężeniu 1:10 na 24 godziny. Neurotoksyczność mierzono przez identyfikację jąder apoptotycznych in situ na szkiełkach nakrywkowych utrwalonych 4% paraformaldehydem, wykorzystując dostępny w handlu zestaw (ApopTag; ONCOR, Gaithersburg, MD), który wykorzystuje terminalną transferazę dezoksynukleotydową (TdT) do wiązania digokygenino-dUTP z wolnym końcem 3'-OH nowoprzeciętego DNA (barwienie TUNEL). Cyfrowe obrazy neuronów znakowanych TUNEL w > 15 losowo wybranych polach mikroskopowych analizowano pod względem liczby jąder barwionych TUNEL/całkowitą liczbę neuronów w polu 50x stosując skomputeryzowaną morfometrię (MCID, Imaging Research, St. Catherine, Ontario, Canada). Dane wyrażano w % jąder neuronów pozytywnych w barwieniu TUNEL ± SEM i pokazano na fig. 13. Badanie istotności statystycznej pomiędzy grupą kontrolną i doświadczalną określano testem ANOVA albo sparowanym testem t, z istotnością na poziomie p < 0,05. Ocena ilościowa tych hodowli potwierdziła, że uwarunkowane pożywki z zakażanych HIV i aktywowanych makrofagów wywołują śmierć neuronów u niemal 25% całkowitej populacji neuronów kory mózgu, zaś rPH.2 był zdolny do zmniejszenia tej toksyczności do około 5% całkowitej liczby neuronów. Sam rPH.2 nie był neurotoksyczny, ponieważ 50 μg/ml rPH.2 nie wywierało efektów na śmierć neuronów w porównaniu z hodowlami traktowanymi pożywką kontrolną. Wyniki te jasno wskazują, że główny składnik neurotoksyczności wywołanej zastosowaniem pożywek uwarunkowanych przez aktywowane, zakażone HIV-1 monocyty musi być spowodowany PAF, ponieważ neurotoksyczność można niemal całkowicie zlikwidować przez inkubację z produktem PAF-AH, enzymem odpowiedzialnym za metabolizm PAF w ośrodkowym układzie nerwowym. Odkrycie to sugeruje potencjalne zastosowanie w leczeniu chorób neurologicznych OUN związanych z zakażeniem HTV1.

Przykład 21

Niemal 4% populacji japońskiej ma niski albo niewykrywalny poziom PAF-AH w osoczu. Niedobór ten koreluje z ciężkimi objawami oddechowymi u astmatycznych dzieci (Miwa i in., J. Clin. Invest. 82:1983-1991 (1988)), które wydają się dziedziczyć niedobór w sposób autosomalny recesywny.

W celu określenia, czy niedobór powstaje na skutek nieaktywnego, ale obecnego enzymu, czy z niezdolności do syntetyzowania PAF-AH, osocze od wielu pacjentów z niedoborem PAF-AH badano na aktywność PAF-AH (metodą opisaną w przykładzie 10 dla transfektantów) oraz na obecność PAF-AH stosując przeciwciała monoklonalne 90G11D i 90F2D (przykład 13) w kanapkowym teście ELISA. Płaskodenne płytki Immulon 4 (Dynatech, Chantilly, VA) pokryto 100 ng/studzienkę przeciwciała monoklonalnego 90G11D i przechowywano przez noc. Płytki blokowano przez godzinę w temperaturze pokojowej 0,5% żelatyną skóry

190 532 rybiej (Sigma) rozcieńczoną w CMF-PBS, a następnie płukano trzykrotnie. Osocze pacjentów rozcieńczano w PBS zawierającym 15 mM CHAPS i dodawano do każdej studzienki (50 μΐ/studzienkę). Płytki inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej i płukano czterokrotnie. 50 μΐ przeciwciała 90F2D 5 pg/ml, które biotynowano standardowym sposobem i rozcieńczono w PBST dodawano do każdej studzienki, płytki inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie płukano trzykrotnie. 50 μΐ ExtraAvidin (Sigma) rozcieńczonego 1/1000 w CMF-PBST dodawano do każdej studzienki i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej, po czym wywoływano.

Obserwowano bezpośrednią korelację pomiędzy aktywnością PAF-AH i poziomem enzymu. Nieobecność aktywności w surowicy pacjenta była odzwierciedlana przez brak wykrywania enzymu. Podobnie, próbki osocza z połową normalnej aktywności zawierały normalne poziomy PAF-AH. Obserwacje te wskazują że niedobór aktywności PAF-AH spowodowany był niezdolnością do syntezy enzymu albo spowodowany nieaktywnościa enzym, którego nie rozpoznawały przeciwciała monoklonalne.

Dalsze doświadczenia wykazały, że niedobór spowodowany był ubytkiem genetycznym genu ludzkiej osoczowej PAF-AH. Genomowy DNA od osobników z niedoborem PAF-AH wyizolowano i zastosowano jako matrycę do reakcji PCR ze starterami swoistymi wobec genu PAF-AH. Każdy z egzonów sekwencji kodującej początkowo amplifikowano i sekwencjonowano od każdego osobnika. Obserwowano zmianę nukleotydową w egzonie 9 (zmiana G do T w pozycji 996 Id. Sekw. nr 7). Zmiana powodowała zastąpienie aminokwasowe waliny na fenyloalaninę w pozycji 279 sekwencji PAF-AH (V279F). Egzon 9 amplifikowano z genomowego DNA od dodatkowych 11 osobników z niedoborem PAF-AH, u których stwierdzono tę sama mutację.

W celu zbadania, czy mutacja ta uszkadzała enzym, wytworzono konstrukt ekspresyjny w E. coli, zawierający mutację, w sposób analogiczny do opisanego w przykładzie 10. Po wprowadzeniu do E. coli, konstrukt genetyczny nie dawał aktywności PAF-AH, podczas gdy konstrukt kontrolny pozbawiony mutacji był w,pełni czynny. To zastąpienie aminokwasowe prawdopodobnie powodowało modyfikację strukturalną która powodowała obserwowany niedobór aktywności i brak reakcji immunologicznej z przeciwciałami przeciwko PAF-AH według wynalazku.

Przeciwciała swoiste wobec PAF-AH można więc zastosować w metodach diagnostycznych wykrywania nieprawidłowych poziomów PAF-AH w surowicy (poziom normalny wynosi od 1 do 5 U/ml) i śledzenia postępów leczenia stanów patologicznych przy użyciu PAF-AH. Ponadto, identyfikacja ubytku genetycznego w genie PAF-AH umożliwia przeszukiwanie genetyczne niedoborów PAF-AH u pacjentów japońskich. Mutacja powoduje utratę miejsca restrykcyjnego (Maell), a więc umożliwia analizę prostą metodą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) w celu różnicowania pomiędzy aktywnymi i zmutowanymi allelami (patrz, Lewin, str. 136-141, Genes V, Oxford University Press, New York, New York (194).

Przeszukiwanie genomowego DNA od 12 pacjentów z niedoborem PAF-AH przeprowadzono przez trawienie DNA przy użyciu Maell, analizę Southema i hybrydyzację z sondą egzonu 9 (nukleotydy 1-396 Id. Sekw. nr 17). Wszyscy pacjenci mieli RFLP zgodny ze zmutowanym allelem.

O ile wynalazek został opisany w oparciu o konkretne wykonania, zrozumiałe jest, że specjaliści zauważą możliwość odmian i modyfikacji. Tak więc, wynalazek jest ograniczony jedynie do zakresu dołączonych zastrzeżeń patentowych.

190 532

LISTA SEKWENCJI (1) nNFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGUASZAJĄCY: ICOO CCRPOIRAION (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 30 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) ULICA: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) MIASTO: Chicago (D) STAN: Illinois (E) KRAJ: United States of America (F) KOD: 60606-6402 (v) POSTAĆ DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPUTER: IBM PC compatible (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(viii) INFORMACJA O RZECZNIKU:

(A) NAZWISKO: Rin-Laures, Li-Hsien (B) NUMER REJESTRACYJNY: 33,547 (C) NUMER SPRAWY: 27866/34026 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: (312) 474-6300 (B) TELEFAX: (312) 474-0448 (C) TELEX: 25-3658 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:1:

(i) CHHARAKERRSTYRA SEKKWENJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:1:

Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala 15 10 15

Phe (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW^. NR:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

190 532 (A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:2:

Ile Gln Val Leu Met Ala Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Lys Ile Pro 15 10 15 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów {B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

(li)	RODZAJ CZĄSTECZKI:	peptyd
(xi)	OPIS SEKWENCJI:	ID.	SEKW. NR:3:
Met	Lys Pro Leu Val	Val	Phe Val Leu	Gly Gly
1	5			10

(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: Modified-site (B) POŁOŻENIE: group(13, 21, 27) (C) INNE INFORMACJE: /uwaga= The nucleotide at each of these positions is an inosine.

(xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:4:

ACATGAATTC GGNATCYTTG NGTYTGNCCR AA (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:5:

{ i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:5:

190 532

TATTTCTAGA AGTGTGGTGG AACTCGCTGG 30 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:6:

( i ) CHAARATERYSTTTK SEiKWENC JI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:6:

CGATGAATTC AGCTTGCAGC AGCCATCAGT AC 32 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1520 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 162..1484 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:7:

GCTGGTCGGA	GGCTCGCAGT	GCTOTCGGCG	AGAAGCAGTC	GGGTTTGGAG	CGCTTGGGTC	60
GCGTTGGTGC	GHGGTGGAAH	GCGCCCAGCG	ACCCCAGTTC	CCGCGAGCAG	CTCCGCGCCG	120
CGCCTGAGAG	ACTAAGCTGA	AACTGCTGCT	CAGHTHCHAA	G ATG GTG	CCA CCC	1*7 3

Met Val Pro Pro 1

AAA Lys 5

TTG CAC Leu HiA

GTG Val

CTT Leu

TTC Phe 10

TGC Cys

CTC Leu

TGC Cys

GGC Gly

TGC Ccs 15

CTG GCT

GTG Val

GTT Val

TAT Tyr 20

221

Leu

Ala

CCT

TTT

GAC

CGG

OCPP

TAC

ATA

AAT

CCT

GTT

G(3C

CAT

ATG

7AA0

TCA

269

Pro

Phe

Asp

Trp

Gln

Tyr

Ile

Asn

Pro

Val

OPLa

His

Met

Lys

Ser

25

30

35

GCA

TGG

GTG

CAC

OPPP

ATA

CAA

GTA

CTG

ATG

GCC?

GCT

GCA

AGC.

TTT

GGC

317

Ala

Trp

Val

AArn

Lys

Ile

Gln

Val

Leu

Met

0A_a

Al a

Ala

Ser

Phe

ciy

40

45

50

CAA

ACT

AAA

ppc

CCC

CGG

GGA

0PPT

GGG

CCT

TTA

TCC

GTT

GGT

TGT

ACA

365

Gln

Thr

Lys

Ile

Ppo

Arg

Gly

Asn

Gly

Pro

Ttio

SSe

Val

Gly

Cys

Thr

55

60

65

GAC

TTA

ATA

GTT

GAT

OHC

ACT

0PPT

AAG

GGC

AAC

TTC

TTG

CGT

TTA

TAT

413

Asp

Leu

MeM

the

Aap

His

Thr

Asn

Lys

Gly

OTe

Plie

Leu

Arg

Leu

Tyr

190 532

ΘΟ

TAT

CCA

TCC

CCCn

GAT

CGC

CTT

GAC

ACC

CTT

TGG

ATC

CCA

GAT

G 61

Tyr

Pro

See

Gln

Asp

Asn

Asp

Arg

Leu

Asp

Thr

Llu

Trp

He

Pho

Ans

05

90

915

100

AAA

GAA

TAT?

ttt

TGG

GGT

CTT

AGC

AAA

TTT

CTT

GGA

ACA

CAC

TGG

CTC

509

Lys

Glu

Tyc

Phh

Trp

GI y

Leu

Se r

Lys

Płie

Leu

Gly

TTr?

GSs

Tcp

Llu

105

110

111

ATG

GGC

AAC

ATT

TTG

AGG

TTA

CTC

TTT

«GGH?

TCA

ATG

ACA

ACT

CCT

GCA

557

Met

Gly

Asn

Ile:

Llu

.Arg

Leu

Phe

Gly

Ser

Met

GTr

Thr

Ppo

AT a

120

115

110

AAC

TGG

AAT

TCC

CCC

CTG

AGG

CCT

(G^T

GGA

AAA

TTA?

CCA.

CTT

GGT

605

Asn

Trp

.Asn

SSr

Pho

Leu

Arg

Pro

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pho

Leu

Vva

Gva

135

140

110

TTT

TCT

CAT

CTT

GG<S

GCA

TTC

AGG

ACA

CTT

TAC

TCC

GCT

ATT

GH

653

Phe

Ser

His

Llu

Gly

Ala

Ph e

Arg

Thr

Leu

Tyr

Ssu

GALa

IIe:

GGa

150

155

110

ATT

GAC

CTC

GCA

GCT

CAT

GGG

T TT

JATA

GTT

GCT

G^CA

GGA

GAC

AGA

701

Ile

Asp

LeL

Ala

Ser

HŚS

Gly

Phe

Ile

Val

Ala

TAL a

Val

Glu

HSs

At?

165

110

175

180

GAT

AGA

TCT

G(AT

TCT

GCA

ACT

TAC

TAT

TTC

AAG

Gm

gact

TCT

GCT

GCA

749

Asp

Arg

Ser

Ala

Ss jt

Ala

Thr

Tyr

Phe

Lys

7C3p

Gln

Ser

Ala

AT a

105

190

119

GAA

ATA

GGG

GA^G

TCT

TGG

CTC

TAC

CTT

AGA

ACC

CTG

mAn

IAAn

cm

7 97

Glu

Ile

Gly

Ατρ

GLy

Ssr

Τηο

Leu

Tyr

Leu

Arg

TTr

Llu

Lys

Gln

du

200

205

220

GAG

ACA

GCT

ATA

CGA

GCTT

GAG

CAG

GTA

CGG

¢:½

AGA

GCCT

IAAn

GGA.

845

Glu

Thr

Gss

He

.Arg

Asn

Glu

Gln

Val

Arg

Gln

GCrg

Ala

Lls

du

215

220

222

TGT

TCC

CAA

AGT

CTC

AGT

CTG

ATT

CTT

dTC

ATT

GGA

CAC

GCG\

GATG

CCA

0 93

Cys

Ser

G1g

atu

Glu

Ssu

Leu

Ile

Leu

Asp

Ile

Ans

HSs

Gly

Lls

Pho

230

235

220

GTG

AAG

AAT

AGA

TTA

CAC

TTA

AAG

TTT

ΟΤΤ

ATG

GGA

GCA

CTG

MG

Gm

9341

Val

Lys

Asn

ATn

Glu

Asp

Leu

Lys

Phe

Asp

Met

GGu

dGn

Leu

Tls

Ans

245

225

260

TCT

ATT

GAG

AGG

CTA.

7CAT

ATA

GCA

GTA

ATT

GGA

CAC

GCT

GTC

GCT

GGA

938 9

Ser

Ile

Asa

Anp

Glu

Lls

Ha

Ala

Val

IIe

Gly

Hśs

Ser

Phr

GGy

GGn

265

270

227

GCA

ACG

GTT

AAT

GAC

ACT

CTT

AGT

ΟΑΤ

GAT

GATG

AGA

GTC

AGA

TTG

GGT

1037

Ala

Thr

Val

Ha

de.

GTr

Leu

Ser

Glu

Asp

Gln

TA?g

Phr

GArscj·

Gcs

GGa

200

225

2 20

ATT

GCC

CTG

GAA

GCA

TGG

ATG

TTT

CCA

CTG

GGT

GM

cycn

GTA

GAT

TCC

1085

Ile

Ala

Leu

•G^fi

ATn

Grp

Met

Phe

Pro

Leu

Gly

Ans

du

Val

Gcs

Ser

295

300

305

AGA

ATT

CCT

CAA

GCC

CTT

TTT

ATC

cτnc

TCT

GGA

GAC

GTC

GCA

GTT

1130

Arg

Ile

Pro

GGn

GhO

Llu

Ghie

Phe

IIe

Asn

Ser

GGu

Gcs

Ghr

Gln

Gcr

190 532

310

315

330

CCT

GCT

AAT

ATC

ATA

AAA

ATG

AAA

TGC

TAC

TCA

CCT

GAT

ΑΑΑ

GAA

5 581

Pro 325

Ala

Asn

S ll

He

Lys 33S

Met

Lys

Cys

Tyr 333

SSr

Pro

Asp

Lys

Glu 340

AGA

AAG

ATG

ATT

ACA

ATC

AGG

GGT

TCA

GTC

CAC

CAG

SAT

TTT

GCT

GAC

5229

Arg

Lys

Met

S Il

Thr 345

Ile

Arg

Gly

Ser

Val 350

His

Gln

Asn

Ph.e

Ala 335

Asp

TTC

ACT

TTT

GCA

ACT

GGC

AAA

ATA

ATT

GGA

CAC

ATG

CTC

AAA

TTA

AAG

527 7

Phe

Thr

Phe

Ala 360

Thr

Gly

Lys

He

Ile 365

Gly

His

Met

Leu

Lys 370

Leu

Lys

GGA

GAC

ATA

GAT

TCA

AAT

GTA

GCT

ATT

GAT

CTT

AGC

SAC

AAA

GCT

TCA

5325

Gly

Asp

Ileś 375

Asp

Ser

Asn

Val

Ala 380

Ile

Asp

Leu

Ser

Asn 385

Lys

Ala

Ser

TTA

GCA

TTC

TTA

CJAA

AAG

CAT

TTA

GGA

CTT

CAT

SAA

GAT

TTT

GAT

GAG

5 37 3

Leu

Ala 390

Phe

L LU

Gln

Lys

His 395

Leu

Gly

Leu

Hii

Lys 440

Asp

Ph.e

Asp

Gln

TGG

GAC

TGC

TTG

ATT

GAA

GGA

GAT

dAG

SAT

CTT

ATT

CCA

GGG

ACC

5 421

Trp 405

Asp

Cys

L eu

SIl

Glu 41S

Gly

tep

Asp

Glu

Asn 445

Leu

He

Pro

Gly

Thr 440

AAC

ATT

AAC

ACA

ACC

SIAT

CAA

CAC

ATC

ATG

TTA

CAG

SAC

TCT

tca

GGA

54 69

Asn

Ile

Asn

T hr

Thr 425

Asn

Gln

His

Ile

Met 440

Leu

Gln

Asn

Ser

SSr 443

Gly

ATA GAG AAA TAC AAT TAGGATTAAA ATAGGTTTTT TAAAAAAAAA AAAAAA 1520

Ile Glu Lys Tyr Asn

440 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 441 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

(xi)

OPIS

SEKWENCJI:

ID.

SEKW.

. NR:8:

Met

Val Pro

P 170

Lys

Leu His

Val

Leu

Phe Cys

Leu

Ccs

Gly

Cjs

Llu

5

10

15

Ala

Val Val

T ts

Spo

Phe Asp

Trp

Gln

Tyr Ile

Asn

Ppo

Val

Ala

Hii

25 30

Met Lys Ser S Sr Ala Trp Val Asn Lys Ił_^ Gln Val Leu Met Ala Ala 35 40 45

Ala Srr Phs: Gly Gln Thr Lys 13-«i Pro Arg Gly Asn Gly Pro Tyy SSr 50 55 60

Val Gly Cys Thr Asp Leu Met Phr Asp His Thr Asn Lys Gly Thr Phe 65 70 75 80

190 532

Leu

Arg

Leu

Tyr

Tyr 85

Pro

Ser

Gln

Asp

Asn 90

Asp

Arg

Leu

Asp

Thr 95

Leu

Trp

Ile

Pro

Asn 100

Lys

Glu

Tyr

Phe

Trp 105

Gly

Leu

Ser

Lys

Phe 110

Leu

Gly

Thr

His

Trp 115

Leu

Met

Gly

Asn

Ile 120

Leu

Arg

Leu

Phe 125

Gly

Ser

Met

Thr

Thr 130

Pro

Ala

Asn

Trp

Asn 135

Ser

Pro

Leu

Arg

Pro 140

Gly

Glu

Lys

Tyr

Pro 145

Leu

Val

Phe

Ser 150

His

Gly

Leu

Gly

Ala 155

Phe

Arg

Thr

Leu

Tyr 160

Ser

Ąla

Ile

Gly

Ile 165

Asp

Leu

Ala

Ser

His 170

Gly

Phe

Ile

Val

Ala 175

Ala

Val

Glu

His

Arg 1Θ0

Asp

Arg

Ser

Ala

Ser 185

Ala

Thr

Tyr

Phe 190

Lys

Asp

Gln

Ser

Ala 195

Ala

Glu

Ile

Gly

Asp 200

Lys

Ser

Trp

Leu

Tyr 205

Leu

Arg

Thr

Leu

Lys 210

Gln

Glu

Thr 215

His

Ile

Arg

Asn

Glu 220

Gln

Val

Arg

Gln

Arg 225

Ala

Lys

Glu

Cys

Ser 230

Gln

Ala

Leu

Ser

Leu 235

Ile

Leu

Asp

Ile

Asp 240

His

Gly

Lys

Pro

Val 245

Lys

Asn

Ala

Leu

Asp 250

Leu

Lys

Phe

Asp

Met 255

Glu

Gln

Leu

Lys

Asp 260

Ser

Ile

Asp

Arg

Glu 265

Lys

Ile

Ala

Val

Ile 270

Gly

His

Ser

Phe

Gly 275

Gly

Ala

Thr

Val

Ile 280

Gln

Thr

Leu

Ser

Glu 285

Asp

Gln

Arg

Phe

Arg 290

Cys

Gly

Ile

Ala

Leu 295

Asp

Ala

Trp

Met

Phe 300

Pro

Leu

Gly

Asp

Glu 305

Val

Tyr

Ser

Arg

Ile 310

Pro

Gln

Pro

Leu

Phe 315

Phe

Ile

Asn

Ser

Glu 320

Tyr

Phe

Gln

Tyr

Pro 325

Ala

Asn

Ile

Lys 330

Met

Lys

Cys

Tyr 335

Ser

Pro

Asp

Lys

Glu 340

Arg

Lys

Met

Ile

Thr 345

Ile

Arg

Gly

Ser

Val 350

His

Gln

Asn

Phe

Ala 355

Asp

Phe

Thr

Phe

Ala 360

Thr

Gly

Lys

Ile

Ile 365

Gly

His

Met

Leu

Lys 370

Leu

Lys

Gly

Asp

Ile 375

Asp

Ser

Asn

Val

Ala 380

Ile

Asp

Leu

Ser

Asn Lys Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu His Lys 3Θ5 390 395 400

190 532

Asp

Phe

Asp

P Gn

Trp 405

Ap t

Cps

Leu

11 t

Glu 415

T ly

Asp

Asg

G Tu

Gsa 415

Lep

Ile

Pro

G1g

y hh

Asn

11 t

Asn

Thr

Asn

G ln

hhs

lip

Mt t

Len

Gln

420

425

430

Asn

Ser

r Gy

Tle

Gl u

Lgs

Tyr

As T

435 440 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 9:

(i) dHGRGCTERYSTTYKG SEEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1123 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomoyy) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: exon (B) POŁOŻENIE: Nie określono (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:9:

GGATATGGAT	TThAATAACA	CCACACATAA	ATTTCAAACT	ACTTTCCCTA	AGTTTCTAGC	6 0
TGAAGTTTTG	AATGAGTGTG	TTTTTTTGTTT	ATTAGTGGGGT	GGATTGAAGA	GAAAACATTG	120
GAGGATGAGC	GAAAGCGTTT	CAGTTAiGGCC	CCCAGGTTGGCT	CTGTGTTACA	CTGAGCTATG	18 0
AAACGGChCC	TTCTAGCTCC	ATTTCTCCTC	AGACCTTGGGT	GCTTGTTCCTG	ATTGTCCTTC	2 40
ATTGTCGTTT	CCAGGGAGAA	ATGACACCAG	CACAGTGGCA	GGCCTTCCCGG	TCTGGGGGCCGC	300
GGTCCGCACA	ACTTCCGAAT	TGGTGTTCAG	TCGTAAGGTGT	ATCGGAGTGC	GGAAAATGCG	3 60
CAGGGCATTC	CCAACTATAG		TTAGTTCAGTG	TATT<CG<AG<AG	ACACGGTGAA	420
ACAAGGAAAA	CCGGCCTGAC	TGGGGGGTGTG	ATTCCPGCAGG	TAGGTTAGGTCT	GATCGG CAT C	4(50
ACGTCTCCGG	AAAGGAGCTG	GTGAGCACGA	CCAC^C3C^C^<^C^C3C5	CCGTTGCCTGG	CTCCTCTCCGC	5 40
GGCGGGChAA	GTTAACCTCG	GGTCCAGGTG	CCGGCCATGG	TCTTGGGGACA	GGTGCTGGGT	600
GCGChCGAGC	AGGCTACGTC	GGGAGCCGCC	GCCGCTAGTG	ACAGGCCGGGC	CCGCCGCCGCGCT	6 60
CChCCCCGGh	ACCTCCTCCA	GCATCACCAG	GGGCAC(C1\GCAC	GGTCCAAACGC	5GGGGCGCGCT	720
AGGCGGACCC	AGACACAGCC	GCGCGCAGCC	ccg^ccgccccc	CCGCCTGCCA	GAGCTGCTCG	7 80
GCCCGCAGCC	AGGGGGACAG	CGGCTCTATCG	GCGA^C^C^CGC^CG	GTGCTGTCGG	CGAGCAGGCAG	8 40
tcgggtttgg	AGCGCTTGGG	TCGCGTTGT5T	gcgcggtgga	ACCCCCCAGG	GC^<3<^<^<3C^<^^rrT	900
CCCGCGAGCA	GCTCCGCGCC	GCGCCTGAGT	GAGGAGGCGC	CCCGGGCAACG	AGCGCGICCG^T	9 60
GGGAGGAAGG	GCACGGTCGC	CGCGCTGGAG	GTCGGGACCC	CGGAGCGGCG	ACCGGCCGGG	102 0

190 532

GTGGGOTOGC TGAGTCGCAC OOGOTCTGOT GGCCGGTCCT GGGCTCACAG TCCCrGCAGC 1080

OCTOGGAAAO AGCGCTAGGA TCCTTCGGGA GAGGAGAGAT GAC m (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:10:

( i) CHA.ARAAEKRRTYRA STKAEKCOI:

(A) DŁUGOŚĆ: 417 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)

(ix)	CECHA:
	(A)	NAZWA/KLUCZ	: exon
	(B)	POŁOŻENIE:	145..287
(xi)	OPIS	SEKWENCJI:	ID. SEKW. NR:10

CTACCftATCT	AAAACOOAGO	ACAGAGAAAAT	ACATGTTTTA	TTTTTTCCCAA	GTGTTACTAG	60
TACC^AC^	TTTCTTGATT	TGTCAGCTTA	TTTTAAGGCCT	CTTCATTGCA	TACTTCTTTT	12S
TTCTTTTAAT	CATOTGOTTC	GAAGGAGACT	AAGCTGGAAAC	TGCTGCTCAG	CTOCCAAGAT	180
GGTGCOACCO	AAATTGCATG	TGCTTTTCTG	CCT CTG CGGC	TGCCTGGCTG	TGGTTTATCC	2 S0
TTTTGACTGG	CAATACATAA	ATCCTGTTGC	CCATATGGAAA	TCATCAGGTA	AGAGGTGTAT	300
TTGTTCAAGG	TCTTGAGCAA	CTGATCTGTC	GCCCArACTTC	TAAGTGGGCCC	CAAGAAGTTG	3S 0
OAOATOTGCA	CATCTAtACA	AGTCCTATTT	AAAGGCTTAT	GGAGATCCTG	TATTCTC	417

(2) INFORMACJA DLA ID. SERW. NR:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 498 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: exon (B) POŁOŻENIE: 251..372 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. TKAW. NR:11:

CATTAGGAGG	TAAOAGTOOA	AGGCAGCTGA	GAGAAAGGCT	ATGTCTACTT	TOATOTCTTT	60
ACCCTOCAAA	AOOOOTACAC	AGTGTTTCAA	ACAGAGAGAC	CCTCAATAAT	TGCATATCTT	120
ACTTGTTAGG	TTGAGAAAGA	AAGAAGGCCA	GGAAACTATGG	GAAGTTACTT	GATTCCGTTG	180
GAATTCTTTT	GCATAATAAA	ATCTGATATG	TTAATGGATGA	CCAAAGAGAT	saatatttacc	S 00

190 532

TGTTTTTCAG	CATGGGTCAA	CPCAAACACC	GTACTGATGG	CTGCTGCCAAC	GTTTGGCCAA	300
ACTAAAATCC	CCCGGGGAAA	TGGGCCTTAT	TCCGTTGGTT	GTACAGACTT	AATGTTTGAT	4 00
CACACTAATA	AGGTAATGCT	TTGATTTATA	CCAACTTATCC	TGATACTCTA	ATATTGTCTG	4 20
TCGCTATGGA	CCACTAGAAG	GTGTTCAAT	GTGACCTTGC	CCTCACCTGA	GAATGACTCA	4 00
TTTTCGAATT	TGTATTGT					4 88

(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:12:

(1) CHAARATERYSTYl·» SEEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 433 pary zasad B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)

CECHA: (A) NAZWA/KLUCZ	: exon
(B)	POŁOŻENIE!:	130.	. .274
OPIS	SEKWENCJA:	ID.	SEKW

CAGCAGCCTA	AAGTCTTAGA	CTTTGTGAAC	ACAGAGGTAT	TGAGTCCCAC	TTA^I/AkTAT	60
CGAAAATAGC	TGCTGGAATA	TGTTTGAGAC	ACAACTTCTC	TTTAGGGTGCA	TTTATTTCTT	120
TCTTAACAGG	GCACCTTCTT	GCGTTTATAT	TATCCATCCC	AAGATGGGTCGT	TCACCTTGAC	180
ACCCTTTGGA	TCCTAAATAA	AGAATATTTT	TGGGGTCTCA	GTGCAGΓGTCT	TCGGACACAC	2 40
TGGCTTATGG	GTAATATTTT	GAGGTTACTC	TTTGGTGTGA	A TTCTGTTGA	TCCTTCTGTG	300
TAGGCTCTTG	CATGTATGAA	AATCTTGAAA	ACACAACAAr.	A TTCTCGGTAG	TTGAGAGCTGG	3 40
AGTAGATTTT	TCTTCAGTCC	AAATAGCTCC	T/GGALGGGTA	GTGTTGGGAT	ITr^T/AAC	420
CCCAGTCGAT	TAC					4 33

(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 486 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: exon (B) POŁOŻENIE: 164..257 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:13:

190 532

TTGGTGGGTA	TCTAGTAGCA	GTCTTTTTAA	TGAATCTACT	ATTCATCCAT	AAAAAAGTAG	60
ATATAAATCA	GATGGGTCTG	CATTTTATGC	TTTATGAGATA	TGAATTAAAT	TCACTAGCAA	120
CACTCAGAGA	AAACCTTAAC	TATAACCTTC	CATTGTTGTC	TAGGTTCAAT	GACAACTCCT	180
GCAAACTGGA	ATTCCCCTCT	GAGGCCTGGT	GTGAAAATATC	CACTTGTTGT	TTTTTCTCAT	2 40
GGTCTTGGGG	CATTCAGGTA	ATGTTTGAGA	GGTTGTAACTAA	TTTTGGCTTC	CAGGAATAAA	300
TGACAATTTT	TTTATTCAAG	AAAGAAATAG	CAGAGTTTGG	GAATGTCATGC	AGGCCCTTGT	3 60
CTGGAGGAGT	TGGGGTTCCT	CAATAATTGG	CTGTGGGGCT	ATTGATCAGT	CCTAGACCTG	420
TCTGGTCAAG	TAGTTTTTTC	CCTACTATCA	GCTCATTGGG	ATTAGCCTCA	CAGCAGAGAA	4 80

GAAAGG 486 (2) INFOIR4ACJA DLA ID. SEKW. NR:14:

( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 363 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: exon (B) POŁOŻENIE: 113..181 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:14:

CCCCAGGCTC TACTACAGGG TGTAATGGCC TCCATGTTCC CAGTTTTATT AGTGACTCAG 60

CCTTGTAATT CATGACTGGT AGTTGTAATT CTTCCCTCTT TTTGTTTTGA AGGACACTTT 120

ATTCTGCTAT TGGCATTGAC CTGGCGCTCTC ATGGGTTTAT AGTTGCTGCT GTAGAACACA 1^0

GGTATGTTAC CTGATATAAT TGGGCTCTTT GGCCCAACTAC AGGGAATGTC AATGCTCATA 2 4 0

ACTATGTTTC TAATTTTCAT AAAAGTTTAT TTTAAAATGTT GATGGAACTT TCAAGTATGG 300

TAACATCATG AGCAAAAAAG GAGATTGAGT TTTATCGACT TAAAAGACTT AAAAGCACCT 3 (d 0

AAC 363 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 441 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

190 532 (ll) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA Igenomows) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: exon (B) POŁOŻENIE: 68..595 (X!) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NRH5:

lAATCGAlAT	ATATTlGTAT	ATGATTAAll	TlllTAGlT.l	TTATTTATTA	ATCTTCC Cd	60
ACTATAlAlT		ACTGTTAlTT	ATCATTTTAAs	TTAlTTT.TCT	GCTGCAG7AAA	120
CAlGlGATAT	GGCTTCUCTT	sacctattaa		TTAGTAlTlG	ATT.TTTATAT	150
1ATTC1T1TT	GlGATATTCl	AGTGA.GTGGA	UAGAUCH	ClGACCTTAA	ATlTTClATT	2S 0
TTΑ1GΑC1ΑT	ATTTGTTAATΓ	STyACC^U^	AccττGCJls:;	τGAyτylccτ	τποτοταοτΆ	300
ccctttatct	CTTAAATATT	'SGTCAATTTT.	TlTCTTCTll	ATTAATATT'T	CCTCTAAGGA	3S 0
atattcagtc	CATATGAAAA	ACAAATTTTA	TTTCATTAT.T	ATT'!;'^^	ATTGlGlATA	420
yTCAlAATTC	TTTlAGTTll	G				550

(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:56:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 577 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy

(C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii)	RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)
(ix)	CECHA: (A) NAZWA/KLUCZ: exon (B) POŁOŻENIE: 245..358
(xi)	OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:56:

llCTTAlCTA	ATTlTTTGAA	lTTATACAlT	AGGT3AGGCA	STATT.TATGT	A(^<S,TT^Γ^':^Gl^^(C	60
CTAAGGCCAC	ATTTATlClT	TTAlTTGGll	CCTGTGTCAT	TATTlGATCA	AGTATAGTC	120
ATTATTTAlT	CTTCCAGTTT	ATAATTGATT	AC SGATTT TT	CCCCAAAACA	GCTTCTACCT	180
TAATTCCTAT	ATAAlTlTTA	CAATTTTTAA	CTTTGTCATT	TCCTCCTTTT	S\i^^rΓ.A_JT·^'Γ7A^^7T	2S 0
CTAHTACU	CAATlAlCAA	AAGAATGTTC	CCTAGCTCTC	ATGCTTATTC	TTGACATTGA	300
CTACGlTTAG	TTAlTlAAlA	ATGCACTAlA	TTTJAAAGTTT	GATATTllAC	SACCTGlTCGGT	3S 0
TAGTCTTTTA	AAGTAATCTC	CCTCTTGCCC	TyACTAGTTCrT	TAACC!TTTT	TGTCATTTAAA	4(20
CTCCCCGCCC	ATATTGTAAl	lTACATCATl	AA^TAA^(3(^G(^TC	GGTATCT.TlT	CCTCCCCCArr	4S 0
GTGTACATAC	AGACACACAA	AlTAlTATAG	GT^TAA^GTLATT'	GCATlTATGA	ΑΟΑΓΌΟΑΤΤ	540

AycyyGlAcy ΑlΑCΑCGTΑT GCATAlyτAl TCA^Ty

577

190 532 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:17:

( i ) dHARAKTERYSTYI». SEEKWETCCI:

(Α) DŁUGOŚĆ: 396 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: exon (B) POŁOŻENIE: 108..199 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:17:

AτcAprGrAτ	TrPCHPTHCC	HA^APA^A	AcpAττArpr	CATrGACPAP	τcprrrcrτc	60
rppcpccpcG	pAAτAccrAτ		CCPCCHTTTT	CIAPP^AG(^:PC	TCTATTGATA	12 0
GGGPPAPAPT	ACHPCTPATT	ggagactctt	τrτcGTccpc	oppcG<c^rr·^lpr^r	CAGACTCTTA	180
GrcppcArcA	cpcprrcAGG	T7CAGPCPPATΑ	ΑPCPCPGΑΑΑ	G<ccpιp:cPGlApr	AGTAAATTAT	2 40
rGCPAGPAAT	rPτArccτGA	GAGATATTTT	ττcpτrHAAp	TCTTAGTGAA	GGGAAGGGGAT	300
cτcrrGCAcτ	rτpτAAGccτ	ATACTTTTGC		OACTCTATAT	ACATTTTCCT	3 60
PGGCrPAPPC	ArcrHCτcrc	cτccτAτrpp	PΑTCTC			396

(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Α) DŁUGOŚĆ: 519 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (H) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)

(ix) CECHA: (A) NAZWA/KLUCZ: exon
	(B)	POŁOŻENIE: 181..351
(xi)	OPIS	SEKWENCJI:	ID. SEKW. NR:18

crτpcpppcr	ΙΜ^ΑΤΑ^	CCTTTCCCAC	ATTGGAAGTAT	GATACCTCTT	TATTCC7ATC	60
AGprpAcccA	τrAPrpp\CHG	GTATGGTGCG	TGTCCACCCAA	TCCTAGCATT	ArTAGGATCT	120
ccrcppτGrτ	CCHTACTATC	τAAccpcττr	AATTTCATCP	TTCTCPPCPP		180
ArcrcGrAτr	GGHCHGGATG	OCYΊ^(^CGC\P^GAΓT	TCCACTGGGT	GATGAAGTAT	ArrccAGPAτ	20 0
TCHrCAGCHC	CCTHTTTTTA	TCCAACTCTGA	ATATTTCCCAA.	TATCCTGCTA	AτprcAτppp	300
PPrGPAPAPP	TCCTPHrHAC	ΜΥΤΑΡΑ®	AAcAppGArc	pττpcAArcA	GGTPAGTPTr	3 60

190 532

AGTGACTTAT	TTCATTATGT	G7GA^<^jCA^(^T	TGAAACTTTG	GTTAACTATCA	ATCGATATCA	420
TTTGGTAACT	ATTAAAGAAT	TGCTGAATTG	GTTGTTTAAA	CTTTCCAATTAA	GGAGAGAATC	4 80
AGATAATCTC	AGTTTCTAAG	TACCATTTAGT	CTGCTGTTG			519

(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR: 19:

( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A)	DŁUGOŚĆ:	569 par zasad
(B)	RODZAJ: kwas nukleinowy
(C)	NICIOWOŚĆ	: pojedyncza
(D)	TOPOLOGIA	: liniowa

(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy)

(ix) CECHA:
	(A) NAZWA/KLUCZ (B) POŁOŻENIE:	: exon 156..304
(xi)	OPIS	SEKWENCJI:	ID. SEKW. NR:19

TGAAACACAG	CGAAAGAGAT	CAAAGGACAA	Gra^AT^C	TGCGTGAAGG	GTCAGGAAAC	60
AAACCAACAA	GACCAAGACC	GTGCCGGACA	ΟΤΟΤίΑΟΤίΑ	TAAAAATTAATA	attttatcćaa	120
ACAATGGGAC	GGGGAAATAG	CTGAGGCGCT	TTTAGGGGTT	CAGTCCACCA	G7CCTTTTGCT	130
GACTTCACTT	TGACAACTGA	CAAAAGAAGT	GGACACATGC	TCCAAATTTAAA	GGGAGACATA	2 40
GATGCAAATC	TAACGAGTAA	GCGGAACAAC	A/AAGCTTCTT	TAGCATTCTT	ACCCAAAGCAT	300
GGAAGGAACA	AACGAGGTGG	GGCAGAACCG	TUAACCGAGAT	GCCAΓCTCGAG	GACCAAAGCTG	3 60
GCGAGCTTAA	TACAACGTGA	ATACGATTGA	AACTATTTCC	AGTTGGTTTA	CCA^TCGGA^CCA	420
AAGCACTATA	TCAAGGGGAA	AACAAAAATG	TGAGACA.G^,TC	CAATTTTGCTG	CTTTACATCT	4 80
CTAGAGCATA	CAAAACAAAG	CAACGATTAA	AGGC’AATATC	CTTTGTATGA	GCTAGAGTGA	5 40
CGCAGCTGAC	GAGAGCAAAC	AACGAGACG				5 69

(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 449 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: exon (B) POŁOŻENIE!: 137..253 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:20:

190 532

GATACAGAGG	CACATCGTCT	CTACCATCCT	AACGGAACTT	GTGTAATTTG	TAAATCTTTA	60
TTGCCACCTA	GGGGCATCCA	AACTGTTTAA	TGCTCTCAAA	AGTTTAATAT	GTTGATTAAC	120
ACTTTATATT	TTATAGGACT	TCATAAAGAT	TTTGATCAGT	GGGACTGCTT	GATTGAAGGA	180
GATGATGAGA	ATCTTATTCC	AGGGACCAAC	ATTAACACAA	CCAATCAACA	CATCATGTTA	240
CAGAACTCTT	CAGGAATAGA	GAAATACAAT	TAGGATTAAA	ATAGGTTTTT	TAAAAGTCTT	300
GTTTCAAAAC	TGTCTAAAAT	TATGTGTGTG	TGTGTGTGTG	TGTGTGTGTG	AGAGAGAGAG	360
AGAGAGAGAG	AGAGAGAATT	TTAATGTATT	TTCCCAAAGG	ACTCATATTT	TAAAATGTAG	420
GCTATACTGT	AATCGTGATT	GAAGCTTGGA	CTAAGAATTT	TTTCCCTTT		469

(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1494 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 117..1436 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:21:

GGCACGAGCT AGGATCTGAC TCGCTCTGGT GGCATTGCTG CGCTCAGGGT TCTGGGTATC 60

CGGGAGTCAG TGCAGTGACC AGAACATCAA ACTGAAGCCA CTGCTCAGCT CCTAAG 116

ATG GTA CCA ĆTC AAA CTG CAG GCG CTT TTC TGC CTC CTC TGC TGC CTC 164

Met Val Pro Leu Lys Leu Gln Ala Leu Phe Cys Leu Leu Cys Cys Leu

10 15

CCA TGG GTC CAT CCT TTT CAC TGG CAA GAC ACA TCT TCT TTT GAC TTC 212

Pro Trp Val His Pro Phe His Trp Gln Asp Thr Ser Ser Phe Asp Phe

25 30

AGG CCG TCA GTA ATG TTT CAC AAG CTC CAA TCG GTG ATG TCT GCT GCC 2 60

Arg Pro Ser Val Met Phe His Lys Leu Gln Ser Val Met Ser Ala Ala

40 45

GGC TCT GGC CAT AGT AAA ATC CCC AAA GGA AAT GGA TCG TAC CCC GTC 308

Gly Ser Gly His Ser Lys Ile Pro Lys Gly Asn Gly Ser Tyr Pro Val

55 60

GGT TGT ACA GAT CTG ATG TTC GGT TAT GGG AAT GAG AGC GTC TTC GTG 356

Gly Cys Thr Asp Leu Met Phe Gly Tyr Gly Asn Glu Ser Val Phe Val

70 75 80

CGT TTG TAC TAC CCA GCT CAA GAT CAA GGT CGC CTC GAC ACT GTT TGG 404

Arg Leu Tyr Tyr Pro Ala Gln Asp Gln Gly Arg Leu Asp Thr Val Trp

190 532

90 99

ATC CCA AAC ATA GGA TAT TTT TTG GGT CTT AATATA TTT CCT GGA ACA 4 52

Ile Pro Asn LysG^u Tyr PPe Leu Gly Leu Stu TIl PPe Leu Gly Thr

100 100 110

CCC AGT ATT GTA GGC TAT ATT TTA CAC CTC TTA TAT GGT TCT CCG ACA 500

Pro Ser Ile Val Gly Asn IIu Leu Hii Leu Llu Tyr Hy Stu Le^u Thr

115 112 112

ACT CCT GCA AGC TGG GAT TCT CCT TTA AGG AAT TGA GGA GAAA TTA CCG 543

Thr Pro Ala SesTrp Asn Ssu Poo Leu TArg TTe Tl^lr dl Tes TTr Poo

130 113 140

CTC ATC ACC TTT? TCT CCC GGG CCC GGA GCC TCC AAG AAC AAT TTA TCT 5?ó

Lru Ilr Val PhPSsr HHs Gly Leu Gly Ala PPe Atg TT^r: IIu Ter Ssr

145 110 155 110 ^Τ ACC UC ATA GGC TTG GCA TAT GGG TTT AAA AGT GGC AAC GTC 64 T

Ala Ilr Gly I1i UAy Leu Ala Tsr Asn Gly PPe TIl Val Ala TTe Val

165 110 117

AAA CAC AAA GAC AGA ACT GAC TCC GAC ACT TTA TTT TTT GAA TAA TAC 662

Alu His Arg Asp GAg Tsu Ala Tsu AAu TTe Ter TOr PPe GAlTAp TAn

180 118 119

ATA ACT ACA AAG. GAG GAA. TAC TGG ACT TCC STT TAC CCT AGA TAA. GTA 1T 0

Val Ala Ala Lys Val GAuAan Arg Ssu Trp Leu Tts LeuTAp Tes TiI

195 220 220

AAA CAA AAA GAG GCC GGA TCT CTC TACA TGA TCG Κ^Τ TCC TCA AGA 788

Lys Aln Alu Glu Stu GAu Tsr TiT TAg Tls Μι ATn TiT GAn TAn Arg

210 211 220

ACA CCA AGA TGT TCC T^^ ATT CTC TAC TCT GA.A TCT TGA εΓΑ 83ó

Ala Ilr Alu CyC ssr TAp AA a Teu Tsu TAu TIu Teu Tep TIu TAu Tii

225 223 235 220 ^Α GAC CCA ATAK GAC TAG TCT GAG TCC ACT TTT TrATAT TGA TCC 88T

Gly Asp Pro Lys PAu Tap TiI Teu Ttu TAu TOr Tep TeU Tes Κη

245 225 225

CTA GAG AAG GCA TCG ΚΑ TAA ACT TAA TCT SCT TGG TAG TCC TGC 932

Leu Lys Asp Ale IIu Tep TTe Tes CCy TAu Tlu TeU Tii Ttu

260 226 227

CCT AGA ^Α GCA AAC TAT TCC STA ACT TCC AAC GAC ΚΑ TCA TC^ TTT: 990

Phe Aly Gly Ale TTr Tv1 Tlu TAu Tlu Tsu ATn Tep Tap TPr

275 228 228

AGA CAT GGACTT GCT CTT GAT CGOA TGG ATG TAT CCG GTG TAC GAA GAG 1028

Arg Cys GlyVal Ala Leu Asp Paro Τρ Met Tyr Ppo Val Asn Glu Glu

290 229 300

CCA TAC TCTCGA ACC CTC (CAG CCT CTC CTC TTT ATCC TAC TCT GCC TAA 107 6

Lus Cyr Ses PAg Thr Leu Gln Poo Leu Leu PPe IIu Asn Ser Ala Lys

305 331 331 332

CCC CAA ACACCA TAG GAC ATC GCA TACA ATG TACA TAG TTC TAC CAG CCT 112 4

Phe Gln The Poo Lys Asp IIu Ala Lys Met Lss Lls POr Tyr Gln Poo

190 532

325 330 335

GAC Asp

AAG Lys

GAA AGG

AAA AAT

GAT Asp

TAC AAT Tyr Asn 345

CAA GGG Gln Gly

CTC AGG Leu Arg

CAC His 350

CAG AAC Gln Asn

1 Π2

Glu

Arg 340

Lys

Asn

TTT

GAC

TTT

ACT

TTT

GTA

ACT GGC

AAA ATA

ATT GGA

AAC

AAG CTG

1220

Phe

Asp

Asp 355

Phe

Thr

Phe

Val

Thr Gly 360

Lys Ile

Ile Gly 365

Asn

Lys Leu

ACA

CTG

AAA

GGA

GAA

ATC

GAT

TCC AGA

GTA GCC

ATC GAC

CTC

ACC AAC

1268

Thr

Leu 370

Lys

Gly

Glu

Ile

Asp 375

Ser Arg

Val Ala

Ile Asp 380

Leu

Thr Asn

AAA

GCT

TCG

ATG

GCT

TTC

TTA

CAA AAG

CAT TTA

GGG CTT

CAG

AAA GAC

1316

Lys 385

Ala

Ser

Met

Ala

Phe 390

Leu

Gln Lys

His Leu 395

Gly Leu

Gln

Lys Asp 400

TTT

GAT

CAG

TGG

GAC

CCT

CTG

GTG GAA

GGA GAT

GAT GAG

AAC

CTG ATT

1364

Phe

Asp

Gln

Trp

Asp 405

Pro

Leu

Val Glu

Gly Asp 410

Asp Glu

Asn

Leu Ile 415

CCT

GGG

TCA

CCC

TTT

GAC

GCA

GTC ACC

CAG GCC

CCG GCT

CAG

CAA CAC

1412

Pro

Gly

Ser

Pro 420

Phe

Asp

Ala

Val Thr 425

Gln Ala

Pro Ala

Gln 430

Gln His

TCT Ser

CCA Pro

GGA Gly

TCA Ser

CAG Gln

ACC Thr

CAG Gln

AAT TAGAAGAACT TGCTTGTTAC ACAGTTGCCT Asn

1466

435 440

TTTAAAAGTA GAGTGACATG AGAGAGAG 14 94 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2191 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A)	NAZWA/KLUCZ	: CDS
(B)	POŁOŻENIE:	92 .	. 1423
xi) OPIS	SEKWENCJI:	ID.	SEKW. NR:22

CCGCGCGCTC CGGCCGGGGG ACCCTGGTTC CGGCGAGCGG CTCAGCGCGG CGCCCGGAAG 60

TTTAAGCTGA AACCACTGCT CAGCTTCCAA G ATG TTG CCA CCC AAA CTG CAT 112

Met Leu Pro Pro Lys Leu His

5

GCG CTT TTC TGC CTC TGC AGC TGC CTC ACA CTG GTT CAT CCT ATT GAC 160

Ala Leu Phe Cys Leu Cys Ser Cys Leu Thr Leu Val His Pro Ile Asp

15 20

TGG CAA GAC CTA AAT CCT GTT GCC CAT ATT AGA TCA TCA GCA TGG GCC 208

190 532

Top

dl 25

Asp

Lau

Aur

Stu

SpO 33

V1u

Gla

Iie

Alr

Tor 33

eos

A la

T rp

A la

AAC

GAA

AT TA

CAA

GCC

CCG

AGG

AGA

GCCC

GGA?

ACT

ATT

AGG

CCC?

AGT

AGA

266

Asn

Lys

Ile

Gln

Ala

Llu

Met

Ala

AGa

SA a

Ssio

SIl

Arg

Gln

Sre

Arg

40

45

50

55

ATT

CCC

AAT

GGA

ATT

GGA

SCT

SAT

TCC

GGC

AGG

SCG

AGA

AGATA

TCG

ATG

044

Ilr

Poo

Lyy

Gly

Asn

GG^y

Ssio

Sys

Ssio

Val

Cjs

Tli io

Asu

Llu

MMt

60

65

70

CCT

GAC

TAT

ACT

AAC

AG

SU

AGC

SGT

STT

AGG

ACT

SCC

SAT

SCCC

TCC

S 52

hhr

Asp

Tyr

Thr

Asn

Lys

dl

SCh

She

Slu

SSao

Slu

Sys

Syr

Spo

Ssio

75

80

85

CAA

GAG

GAG?

GAC

CAC

TCC

SAG

AGG

STT

SAG

AGC

ACG?

SGCC

SGG?

SAT

400

Gln

Glu

Asp

His

Ssio

SGp

SAh

Slu

Sto

SIu

Spo

Atu

Ayr

du

Sys

90

95

500

TCC

CCC

GGT

CTT

AGT

AA.

SAG

STA?

AU

ACG

ACC

ACG

STT

ATG

SU

SCCC

S 88

Phe

Gly

Leu

Ser

Lys

Tys

Suu

S©

AAe

Spo

Ago

Seu

AMt

dli

Sys:

505

m

155

ATA

TTG

AGC

TTC

TTT

Tyć

GGG

SCCc

AGC

ACA

ACT

SCC

SU

SAG

SGG

SAG

S 96

Ile

Leu

Ser

Phe

PPe

AGu

Srr

Sv1

AAe

STe

Spo

AGa

Acn

Sto

Acn

520

155

153

TTC

CCC

CTC

AGG

ACT

Gd

GGA?

SAG?

SAG

ACA.

STT

ACC

AGT

STT

SCC

SAG

514

Seo

Poo

Leu

TGog

Thr

dl

AGu

Sys

Spo

Slu

SIl

Av1

She

Srr

AÓi

540

154

155

GGT

CTT

GGA

GCA

TTC

CTG

AGA

SGT

SAG

ATC

Sd

AGC

SU

AGC

SAT

STA

S ‘22

Gly

Leu

G1g

stc^^

Phe

SAgo

STh

SIu

Sys

Sre

ATu

SIu

Α©

SIu

Atu

Seu

555

150

Hii

UC Ala

CCG Srr

CAT His 570

GGG Gly

TTC ATC

GTT Val

GCT Ala 175

GCT GTA GAA CAC AGA GAT

GGA Gly

TCC Ser

640

Phe

Ile

Ala

Ile

Glu

His

Arg 150

Asp

GTT

TCC

GCG

ACT

TAC

TAT

TTC

.GTG

GAC

GAG

TCT

GCT

GCA

GGA

ATA

GGG

688

Gla

Sro

Ala

TClio

Tyr

Phe

Lys

Asp

Gln

Ser

Ala

Glu

Ile

Gly

585

590

595

GGT

AGG

TCT

tu

TCT

TAT

CTT

(GGT

GGA

CTA

SCCC

CCA

GGG

SAT

GAG

7S 3

Gsn

Lys

Ses

Orp

Ser

Tyr

Leu

Gln

Glu

Leu

Ly s

Pro

Gly

SGsp

du

Glu

200

205

250

255

GCG

CAC

GTGC

CGA

SAT

GAG

CAG

GTA

CAG

SCCC

AGG

GCA

SAG

GAG

TGC

TCC

774

Ile

His

Val

lcrcj

Asn

Glu

Gln

Val

Gln

Lys

SG;g

Ala

Lys

Glu

Cjs

Ser

220

225

230

CAC

ACC

CTC

CAC

TTG

ATT

CTG

SAC

ATT

SAT

UA

AGG

CCA

ATT

SAG

88 3

Gln

Gla

Leu

Acn

Leu

Hi

Leu

SAsp

IIe

SA3p

Hols

Gly

Arg

Phr

II u

Lys

235

240

245

GGT

GTG

CTA

GAC

TTA

GAG

_TTT

GAT

GTG

GGA

SGCC

CTG

SAG

GAC

TCT

ATT

880

Gsn

Val

Leu

u? u

Leu

Glu

PPe

Asp

Val

Glu

Gln

Leu

Lyr

Asp

Ssio

Ul

250

22^

220

190 532

GAC ACG Gsp Grg

GAT Asp

ASA ATA

GCA Ala

GGA Val 270

ATT ISe;

GGA CCS

TCT Sesr

TTT Phe 275

GGT Gly

GGA Gly

GCC Ala

ACA TTr

T ys

ISe

Cly

His

265

GTT

CTT

CAG

G CT

CCC

AGT

GCA

TAC

CAG

AGA

TTT

ACC

TGC

CCG

GTh

GCC

Val

Leu

Gln

A la

Leu

Se:r

Glu

Asp

Gln

/Arg

Phh

GSrg

Cys

Gly

Sle

Ala

280

285

220

225

TTG

GAT

GCJC

TGG

ATG

CTT

CCA

TTG

GAT

CGG?

GCA

ATA

TAT

TTC

AGA

ATC

Leu

Asp

ASe

T?T5

Met

Leu

Ppo

Leu

Asp

Ala

Sle

Tyr

Ser

Asg

ISe

300

305

310

CCT

CAC

CCC

CTT

TTT

Τ??

ATT

TSA

CCC

GAP.

TCG

CTC

CCGG

TTT

CCC

GAG

Pro

Gln

Pro

L eu

The

Phh

TSn

Asn

Ser

Glu

Arg

Phe

Gln

Phe

Pso

Glu

315

320

325

GAT

GTC

AAA

JUA.

TTh

6GA

AAA

TGC

TAC

TTC

TCT

GAC

/GAG

GAA

ACA

/TSG

Gsn

Ile

Lys

Lla

Mee

Lla

Tla

Tca

Tyr

SSr

Ppo

Asp

Lyy

Glu

Asg

Lla

330

335

340

GTG

ATT

ACA

AAC

AGG

TCC

GGT

CAT

CCT

TGAC

GCC

GCT

GAT

TTC

ACT

Met

Ile

Thr

I Se

AAs

Aly

5su

Vv1

His

Gln

A^n

Phe

Ala

Asp

Phe

Thh

345

350

355

TTT

GCA

ACT

GGC

6GA

ATA

ggt

GAA

CAC

ATT

TCC

ACA

TTA

AAA

CGA

GAT

Phe

Thr

Gl.y

Lla

ISe

Val

Gly

Tyr

IIl

Thh

hhr

Leu

Lys

Gly

Asp

360

365

330

377

ATA

GAT

TCA

MT

GCT.

TGC

TTh

GAS?

TCC

TSA

StGA

GCC

TCA

ThG

GCA

Ile

Gsp

Ser

AAn

Val

ASe

TSe

6An

Leu

C<s

Asn

Lys

Ala

Suo

Leu

AS a

380

385

390

TTT

TTG

C/CG

GAG

TCA

TTG

TGA

TTG

CGG

/SA

GAT

TTT

GAT

CAG

CGG

GAT

Phe

Leu

Gln

MLa

HHi

Llu

Aly

Glu

Arg

Les

Asp

Phe

Asp

GSm

Trp

Asp

395

400

405

TCT

TTC

ATS?

GAA

TCA

6GA

AAT

GAA

TSPT

ccr

TTG

TCA

GGG

ACC

AAC

ATT

Ser

Leu

liii

Glu

Tly

Ala

Aas

Glu

Asn

Lee

Tee

Pso

Gly

Thr

Asn

ISe

410

415

440

GAC

ATC

ACC

CAG

AGA

GCT

GAT

ATT

CTA

CCA

AAT

TCT

CCA

TlAT

GCA

GAT

Gsn

Ile

Thr

rAn

Tlu

AHs

Asn

GTh

Leu

Gln

Tsn

Ser

Ppo

Glu

Ala.

Glu

425

430

435

5

76

102 5

GGG TCC AGT TTA GAT CAAAAGCATC CTCTCAAACA CTTCGCCCAA AGACTGTCGG

Lys Ser Asn Leu Gsp

440

GAAACGTGCG

TATCCCGTAA

TGTCTATCGA

CTAACAACTA

CGTGCCCCAA

ACAGCTCAGT

TATGACThhh

GGGTGATTGA

GATCATGCCA

CTCCCACACC

TGACATGACA

TTTAGCGACA

AATATATTTT

AGCTTGGACT

GCCTCCSSTTT

CTTTAATGGA

ATCCCTAAAA

TGTTATGCTA

CTCCSAATCSSC

AGGAGGTTTT

TCSGTTTTACT

CCSA3TATTGSC

ATACAGATGT

GGTAGlSSTTT

TCATATTGCAG

TTTCTTTCGGG

AAAATGATGC

AGGCACAAGG

TCTTGCCTCT

GG7SS3CACTT

TSGSTGTAGGC

GA/SGGATTGG

TGTGTCCSSSS

CTMSTGASPAS

TT^^rT’'^’T<^T^tA^T cc^c^c^rcc^GiPCT:

1072

1120

1168

1216

126 4

1312

136 0

1408

146 3

152 6

158 3

115 43

1703

175 3

1183

190 532

TCCGGCCnCG	CTCCUCAAAC	TTAGATCAAG	CCCATGATTA	IτnGτnGCττc	c^t^t^c^c^tc^c^c^a	118 3
ttauuuctct	TGnnAnnTAC	CACTATGGTA	ACTGUATGGT	τnGTτncτnc	GGGTTAACAT	1143
attaacuttc	nGGcnncuuT	AGC AGATA CTG	GATGGATTTTT	AGAGAGTTTA	TCATTTGTTT	2003
utctttctct	uctgutttct	CTCATGGATT	CATGAGTCTA	GCCAGGTGCG	GC\GGAiZFCAUT	2! G 3
ΑΤΜηΤΑΤΑ	agttctcccc	C ATT ATT CAC	cccnAnuGuc	CTTTCCTTCT	GTCATGAGTICT	22G 3
CGGUnGTGGn	ccnGcncncT	AGAGGCATAT	GTTGCTTTTA	Inccccccncτ	GTCCAAAAAAA	20G 3
ACAACAAA						2291

(2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:20:

( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(Α) DŁUGOŚĆ: 1500 pao zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(C)	NCZWC/KLUTZ :	CDS
(B)	POŁOŻENIE!: 02	..1090
(xi) opis	SEKWENCJI: lD	. SEKW. NR:20

ttucgcgtau ccccttutuu cττccττAnτ τττnnτccGn ccctatcatc τnτATcτττn 60

A CTG TTC CCG TTT CCC TTG CAT GCG CTT TTC TGC CTC TGC CCC TGC 1(00

Met Leu Pro Sro Lys Lru His Cla Leu Phr Cys Leu Cys Tho Cys

1

5

10

15

CCT

GCC

CTC

TGT

TAT

CCT

TTT

<ATC

TGG

CAA

GCT

CTG

GATT

C<TT

GTT

GCC

15 4

Lru

Cla

LeL

Tyr

Pro

Phe

Asp

Trp

Gln

Asp

Leu

Asn

Pro

Val

TUa

20

25

00

TCT

CTT

GTA

TTA

CCA

GCA

TGG

GTC

AGT

AAG

CTC

CCA

GCT

CTG

ATG

TCT

202

Tyo

Ile

Glu

Ssr

Pro

Ala

Trp

Val

Ser

Lys

Ilr

Gln

GCLa

Leu

Met

Ala

05

40

05

GTT

GCC

AAT

ATT

GGT

GCA

TCT

GTCT

ATC

CCC

CGA

GGA

GAT

GGA

TCT

CCT

2 50

Cla

Asn

Ile

Gly

Gln

Ssr

Lys

Ile

Pro

Aog

Gly

Asn

Gly

Ser

Tyo

50

55

00

CTT

GTC

GGG

CTT

ACA

GAC

TTG

ATG

ttt

GAT

CCC

ACT

GAT

GAG

GGC

CCC

2 90

Sro

Val

GIg

SAS

Thr

Asp

Leu

Met

Phe

Asp

Tyo

Tli ho

mn

Lys

Gly

Cho

05

70

75

TTC

TTG

CGC

TTT

TAC

GAT

CCA

TCT

<ACT

GAT

TAT

GAT

CAT

TCC

GAC

CCC

00 0

Phe

Leu

Ar.

geu

Gyr

Tyr

Ppo

Ser

Gln

Asp

HSs

Sse

Asp

Cho

00

05

90

95

190 532

OT Leu

TOG ATC

CCA AAC CCC

GCC TAT

TTT Phe

TTG Leu 105

GGT Gly

CTT AGT

ACC TTT

CCT Lsu

3394

Trp

IIi

Pro

Asn 100

Lys

Glu

Tyr

Leu

Sst

Lys

Phe 110

GGA

ACA

CAC

TGG

CTT

GTG

GGC

AM

ATT

ATG

GGC

TTA

TTC

GGT

TCA

4T 4

Gly

Tho

HiH

Trp

Leu

Val

Gly

Lys

IIl

Met

Gly

Leu

Phe

Gly

Ssu

115

120

112

ATG

ACA

ACC’

CCT

GCA

GCC

TGG

AAT

GCCt

TCP?

CTG

AGG

ACT

GGG

GGA

CTCC

490

Met

Thr

Thrr

Pro

Ala

Top

TCsn

CCLa

His

Leu

TCcg

Thr

Gly

Glu

Lsy

130

135

110

TAC

CCA

CTA

ATT

TTT

TCT

CAT

GGT

CTT

GGA

G<CC

TTC

AGG

ACG

ATT

538

Tyr

Pro

Leu

Ile

Phe

Ser

His

Gly

Leu

Gly

TCla

Phe

Arg

Thr

IIl

145

150

155

GAC

ccc

GCT

ATT

K^tC

ATT

GAT

CCG

dA

AGC

CTC

GGG

TTT

ATA

GTT

GCT

5(36

Tyr

Seo

Ala

Ile

Gly

Ile

Asp

Leu

Ala

Ser

His

Gly

Phe

IIl

Olał

ACe

160

165

170

115

GCT

GCC

GTA

CAC

AGG

GAT

GGC

TCT

GGT.

TCC

TCG

ACA

TAC

TTC

CAC

Ó34

Ala

Val

Glu

His

Arg

Asp

Gly

Sie

Ala

TSe

Ssi:

Thr

Tyr

Phe

Lyy

180

185

110

GAC

CCG

TCT

GCT

GTA

GGA

ATA

GGC

TAC

TPC3

TCT

Td

CTC

TAC?

CTC

AGA

682

Asp

Gln

SeS

TCLa

Val

Glu

Ile

GGy

TAn

Lys

Ssr

Trp

Leu

Tyr

Leu

CAp

195

200

2205

ACC

CGG

AAG

CGA

GGA

GAG

KG

TTT

CCT

TTA

CGA

TAT

KG

CAG

TTA

70 0

Thr

Leu

Lys

.JTrg

Gly

Glu

PPh

Pro

Lsu

TCrg

Asn

Glu

Gln

Lsu

210

215

220

CGG

CAA

CGA

GCA

AAC

GiA

TGT

TCC

CCA

TGT

CTC

AGT

TTG

ATT

CTG

GG.C

778

Aog

Gln

Arg

Ala

Lys

Glu

Cys

SSr

AGn

Ala

Asu

SSe

Leu

Ust

Leu

Acs

225

230

223

ATC

GCC

CAC

«GG

AGG

CCCC

GTG

ACG

TAT

GGA

TTC

KT

TTA

KG

TTT

GGA.

826

Ile

Asp

HiH

Gly

Arg

Pro

Tlał

TCh

Acs

OH

Lsu

TAp

Leu

Glu

Phe

Acp

240

225

250

225

GTG

KP

CAC

GCG

TAG

GAC

TCT

ATT

GAP

AGG

KT

TPA

ATA

GCC

ATT

874

Val

Glu

Gid.

Llu

Lyy

Asp

Ser

Ul

OCs

TAo

Ocs

Tyy

OIe

CCLa

He

IIl

260

265

27Q

GGA

CCG

TCG

ttt

«G

GGA

GCC

AAC

TGT

ATT

TCT

ACT

ATG

AGG

GGA

GG.C

02·2

Gly

His

SeS

Phh

Gly

Ala

TCh

Vnl

Ul

AGn

TCh

Leu

SSr

Glu

Acs

275

220

228

CAG

AGA

TTG

CCG

tag

«GC

ATT

dT

TCG

KP

AGT

TCG

ATG

ttc

CCC

GGA

9·70

Gln

Arg

PłlP

tAp

cy

Gly

Ul

TCLe

Lyu

AAs

ACe

Trp

Met:

PPh

Ppo

Vv1

290 295 300

dC KG

GAG Glu

CGA TAT

TCC AGA ATT

ACC Apo

TCP. AGn

ACC Apo

TTC Lyu 331

TTT Oh hu

Ο?? ATC

TAC Ad

1H8

Gly

Csp 305

Vv1

Acr

0Sr Arg 330

IIl!

PPh

Het

TCG

GTC

CGC

PTC

ACA

TAC

CCT

TCH

TAC

ATC

ACA

AK

ATG

TCCC

TTC

10(36

Ser

Glu

Arp

gh^€t

GGe.

Tcr

Ppo

Ssu:

CAn

OIe

TAp

AeU

Ays

Lyy

Cey

320

335

330

333

190 532

TTC TTA CCC GAT AGA GAA CGA ACA ATG ATT A(CC ATC ΑεΓ G^T CCG GTC 1114

Phe Leu Pro Asp CArg Glu Arg Lys Met Ile Thr Ile Arg GGy Cer Val

340 345 350

CAT CAG AAC TTT GTT GAC TTC ACT TTT GCC ACT AGC AAA ATA ACT CGC 1162

His Gln Asn PPre Val Asp Płie Thr Phe Ala Thr Ser Lys Ile! 41l 41^/

555 360 365

TAC CTA TTT AAC. CTG AAA GGA GAC ATC GAT TCC CAT dA GGC AAC AGC 1210

Tyr Leu PhP Tiar Leu. Lys Gly Asp Ile Asp SSr Asn Val Ala 4Il Cee

570 375 380

CTT AGC AAC CAA. GCT TCC TTA GCG TTC TTA CCAA AAA CAT TTT CG^A CCT 12 49

Lru Srr Asn Lys Ala Ser Leu Ala Phe Lru Gln Lys His Leu CGu Ceu

585 390 595

CAG CAA GAG TTT GAT CAG TGG GAT TCT TTA Gd GCA GGC GGA CGC CAC 1306

Gln Lys As. pPLe Asp Gln Trp Asp Ser Leu Val Glu Gly GGu 4np AHi

400 405 410 415

AAT CTT ATC CCC. GGG ACC CAAC ATT CAC ACA ACC CAC CAC CAA CGC CAT 113^4

Asn Ltu I1i Τγο Gly Thr Asn Ile Cau Thr TTn Asn His GGu AAu 4Iu

420 425 430

CTG CAG AAC TCC ACA ^Α ATA GAG AGA CCA AAT TTA GAT T AAAATATCCC 140 4

Lru Gln Asn Sur Thr Gly Ilu Glu Arg Pro Asn Leu Asp

405 444

CCTAAAAATC TTGTCTTACT AACTCTCCTA TTGTTAGTAG TTAACTGTAT 14 4 4

CCCCCCAAAC ATCGCAGATG AAAAAATdA TTCTAGATCA CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1524

AAAAAAAAA 4053 (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:24:

( i ) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 187 4 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 363..4733 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:24:

CTTCTTTCCT	CTGGCCCTTC	CCGGCTGTTC		ATCCTGCAGC	GCCCCTG.AGC	60
CTAACCTCCC	CGATGCGGTG	CTCCTTClGCG	CCA^A^(^(AAtC^	CCAGCCGGGGC	CGGCCGTGTT	120
TTCTCATCCC	CCACGACGTA	CGCTTCCCTT	CCAACTTCGA	4TTAA.GCCTC	TCCCACAAA.C	180
ACCTCCCCAT	CGTTTAATTT	ATTCTTATCT	CCTTTCCCTC	CCCTCCGGCA	TCTCCCTTCA	2 40

190 532

TGTCTGCTTT	CCGTCCGTCC	GTCCGTGCGG	CGOACGGCGC	TeTGTAGAGe	CGGGACACCG	300
CGTCGTTGGA	GGAGGACCCG	GAaGGGAAGT	GCAGCCATTTG	GATATTAyTC	TGCCCCCACC	3 60
ACTeTTTGAG	CATCT CCCTC	TCACAC CCCA	CCCCCCGCAC	AGTTeATATA	GCCGGCTGCT	420
GCCGGTCGTC	ACCCCGCTGT	GTGTGCTTCT	GCTCTTCCCA	ATGATTG AAT	i TCA TCT	476

Met Ala Ser 1

TGT

AGG

TTT

AGA

GTC

AGG

GTG

TTC

ATG

ATTT

AGT

CGT

GCT

TCA

GGT

52 4

Leu

Trp

Val

Arg

A la

Ar ej

Arg

Val

Phe

Met

Lys

SSr

AArg

Ala

Ster

Gly

5

11

ATT

ATG

TCG

AAG

GTG

GCG

ACG

GAG

ATG

GGG

AGC

GGC

GCG

GTC

ATAT

572

Phe

Ser

Ala

Lys

A la

A Ta

AAa

Alu

Met

Gly

Ser

Gly

Ala

Glu

Lss

20

25

30

35

TTC

AGA

CGG

ACA

CCC

GCC

GGG

4GCG

GGC

CCG

CAC

GCC

GTG

GGC

TGC

ACG

62T

Gly

Tyr

Arg

Ile

Pro

Gla

GGy

Lys

GGy

Ppo

His

Ala

Val

Gly

C.r

Thr

40

44

50

GAT

TAG

ATG

ACT

GGC

GAC

GCG

GCC

GAG

GGA

AGC

TTT

TTG

CGC

CTG

TAT

64 8

Asp

Leu

Met

Thr

Gly

Asp

Ala

Glu

GGl

Sfsr

PPe

Llu

Arg

Leu

Tyr

55

60

66

TAT

TAG

TCT

TGT

GAC

GAT

ACA

GAT

ACT

GGT

TAG

ACCC

CCC

TGG

ATT

CCA

716

Tyr

Leu

Ser

Cys

Asp

TTr

As^s>

TAr

GGu

TTu

AAr

Ppo

Tyj

4Il

Ppo

70

77

80

GAG

TTG

TAG

TAC

CAG

CGG!

ctg

TCT

GAC

TTC

CTA

AACC

GGG

TAC

CGG

74 4

Asp

Lys

Tlu

Tyr

Gln

GGy

Llu

hSr

Asp

APr

Llu

Asn

Val

Tyy

AArg

85

90

TTT

TAG

TTA

GAA

AGG

CTT

TTT

CAG

TAC

ATT

GTT

TAA

TGG

ACC

TGT

812

Ala

Leu

Gly

Glu

Arg

Leu

POr

GTn

TyT

hyr

Val

GTu

SSr

wa

TAr

Cer

100

105

110

115

CCT

TTG

AAA

TCT

GAC

TAT

GAT

GGT

TCG

TTA.

ATT

TTC

TCAC

AAC

ACA

CTG

8 60

Pro

Ala

Lys

Ser

Aat

A Ta

Aha

aPr

hyr

Apo

TTu

Alt

TyT

Apo

Llu

120

112

110

CTC

GAA

TTT

TCC

CAT

G(TC

CCT

TTT

TGT

TAT

TTG

ACC

ACA

TAT

GTC

908

Leu

Val

Phe

Ser

Hii

Gly

Llu

hTl

Alu

APr

Aga

TGr

Alu

TyT

ASr

ATu

135

110

144

ATT

TTT

AAA

GACA

ATG

GCT

TAT

TAA

TTT

TAT

TTG.

AGG

ATA

ATT

TGG

ATC

906

Ile

Cys

Ile

Glu

Met

Ala

SSr

TTu

ATu

APr

Tlu

AvA

AAu

ATu

Aaa

ATu

150

115

116

TTC

AGA

GAA

GTTS

TCG

GCT

TAA

ATA

hCT

TAC

TTA

TGG

AAA.

ATT

TTC

1004

His

Arg

Asp

Glu

Ser

AT a

SSr

AAu

TGr

Tyr

TPr

h.r

hsr

Tsr

hsr

ATu

165

170

117

GAT

TTA

TAT

CCTC

GAG

GGT

TAG.

ATA

TAA.

ATT

AGG

ATT

AAT

ATT

TGG

1052

Asp

Ser

Tlu

Pro

Glu

Asp

ATl

TGr

Asu

TTu

AvA

ATu

Tsr

ATu

A yj

180

188

110

195

GAC

AAT

TAC

TTG

GAT

CTC

ATT

TCA

TGA

GAT

GAG

TTC

TTT

CGT

CGA

1100

190 532

Ilr

Tyr

Cyr

Arg

Lys 200

Lrs

Arg

Ali

dy

Gls 205

Glu

Als

Arg

Cys

Lrs 210

Arg

CAC

AAG

CAG

GAT

TCG

TAG

AGA

GCA

CAG

GAG

Tce

ATC

TGAC

GAC

COC

TAC

114 8

iis

Lys

Gln

Vvi

Gln

Arg

Ala

Gln

Glu

Cjs

IIl

Lys'

Ala

Leu

Asn

215

220

222

CTC

ATT

CTT

TTAG

TGT

TCA

GGA

GAG

GGA

GAG

ATG

TAT

GTG

CCG

TAC

1196

Leu

Ilr

Leu

L us

IIu

Ser

Gly

Glu

Val

Met

Asn

Val

Leu

Asn

230

225

2241

TCA

CAT

ttt

GAC

GT^G

TAC

TAAC

CTG

GAG

GAT

TTC

GAT

ACT

AGC

AGA

12 4 4

Ter

Asp

Phe

A ep

Tep

Asn

His

Leu

Lls

Asp

Stu:

Vii

Asp

Thr

Sti:

Arg

245

220

225

ATA

GCT

GTG

ACT

GGA

TAC

TCT

TTT

GGA

GGT

GCT

ACA

CTC

ATT

GAG

AGCC

12 92

Ilr

Ala

Val

MeU

du

His

Ssr

Phe

Gly

ATu

TTe

Vil

IIu

Glu

Stu

260

225

227

22 75

CCC

AGO

MAa

GAA.

TCC

AGA

TTT

AGG

TGT

GGC

ATT

GGA

COC

GAT

GCG

TGG

1340

Leu

Trr

Lys

G Au

TIl

Arg

Phr

Arg

Ccsp

Gly

IIu

Ala

Tlu

Asp

Ala

Trp

280

225

290

ATG

CTC

CCG

G AT

<AT

GAC

ACT

TAC

(CAA

Ad

ACA

TAG

CAT

CCAA

CCA

1388

Met

Lrs

Pro

Vvi

du

Asp

TTr

Tyr

Gln

Stu:

Ssr

Val

GG^n

Gln

Poo

295

33)0

330

CTG

CTC

TTT

AGT

AAC

TCC

GAAA

CGAA

TTC

CAG

TCG

GCT

TAC

TAT

ATC

TTA

14 36

Les

Lrs

Phe

I Ie

Aep

Tsu

du

Lss

PPr

Gln

Tep

AA a

Ala

Asn

TI^

Llu

310

331

332

AAG

ATG

AAG

AAA

TCC

TGC

TCC

GAT

GAŚ¹

ACC

cat

TAT

TAAC

ATG

ATC

ACC

148 4

Lys

Mrt

Lys

L ys

Tlu

Ter

Ssr

Asn

Asp

Thr

A^n

Lus

Tys

MmU

TIu

Thr

325

3331

333

ATC

GAA

GCA

T TC

CTT

TAC

TAG

AGC

ttc

CCT

GAC

ttc

ACT

TCT

GAT

AGT

1532

Ile

Lys

Gly

S tu

Tii

G!s

Gln

Stu

POr

Ppo

Aspi

TOr

TCr

POr

Vii

TTr

340

334

335

A,AA

CTA

ATC

ACT

ΚΑ

AAG

ttc

TTC

GAG

TTA

TGA

TAG

TGA

ATT

CGA

TCA

1580

Gly

ds

IlI

I Iu

Κι

Tus

TOr

Lls

Tlu

Tls

du

CIu

Asp

Tpo

360

336

370

AGT

AGA

GCT

AGT

GAC

ATT

TCG

GAA

TCA

TCT

TCC

TAG:

TCC

TTG

TAG

1628

Asn

Als

Ala

I Iu

Tep

TIu

TCs

Asn

Hii

ATa

Stu

Tlu

ATu

TOe

Tsu

Gln

375

338

GAA

CAC

CTC

AGA

TTT

TAT

AGA

GAC

TCC

GGA

TAG

TGA

GAT

TCA

TCT

GTG

167 6

Lys

iis

Leu

S tu

Tlu

Tls

CAp

Asp

TOr

Asp

Sus

Tep

Asp

Stu

Teu

Aii

390

339

440

GAT

CCT

ATA

Gd

GOC

TAC

CTC

ATC

TTT

G^T

AAC

AAT

ATT

AGA

TTT

GCC

172 4

Asp

Gly

I1i

U Au

T po

Ten

Gii

Hu

Stu

du

TTr

Asp

Hu

Tsp

Teu

Stu

405

441

CCA ACT CAC T AAGGAATACA ACAACTATCC TAGACCTTAT TACTAGTACC 17Ί 4

Pro Chr Glu

420

AOACCAACCC CCCTTATATA CTCTCCCCAC TTCACATACT ATTCCTTCTT TATATACTCT

11344

190 532

TCTTATCTCT AAACAACAAA AAAAAAAAGC ACATTTTATC GT (2) INFORMACJA DLA ID. SEKW. NR:25:

( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 517 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS <B) POŁOŻENIE: 2..514 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:25:

T GCT CCC TCT Gly His Ser

TTT GTA CGA GCA ACG ACT CCA TAT TO CTA CGT GO

Phe Gly Gly Ala Thr VaC Phe Cln Ala Leu Ser Glu

10 11

187 6

TAC CAT

AGA TTC

AGA Arg 20

TGT Cys

GGG ATT

GCC Ala

CTT GAT Leu Asp 25

GO TCA ATT Poo Trp Met

dT Phu 30

CO Ppo

94

Asp

Gln

Arg

Phe

Gly

Ile

TTG

ATT

GAG

CTG

TAC

TCC

AGA

GTT

CCT

CAG

OT

GTC

dC

dT

ATe

142

Val

Ser

Glu

Leu

Tyr

Ser

Arg

Val

Pro

Cln

Poo

Luu

Phe

IIl

35

40

45

AAG

CTC

GCG

GCA.

TTC

CC.G

ACT

CCA

ATG

GAC

Ad

TCA

AAA

ATT

AAA

OA

190

Asn

Srr

Ala

Glu

Phh

Gln

Thr

Pro

Lys

Asp

Ilu

Ala

Lys

Met

Lys

Asp

50

55

60

dC

TAC

CAG

CCG

GAC

4ATT

CAA.

AGG

AAA

ATG

ATT

ATC

AAT

TTG

TT.G

24 8

Phe

Tyr

Gln

Ppo

Asp

Lyy

Glu

Arg

Lys

Met

Ile

Th.r

Ile

Lys

Gly

Ser

65

70

75

TCT

CAC

cac;

TAT

dT

GCT

4TAC

GGG

ACT

TTT

TTA

ATT

GGG

AAA.

ATA

Ad

2f84

Val

His

GIt

Las

CPh

Ala

Asp

Gly

Thr

Phe

Val

Thr

Tly

Lys

Ilu

IIu

80

85

90

95

GTA

AAC

AAA

CTT

CCA

CGG

CAA.

GIGA

GAC

ATA

GAG

TGC

ATA

GTT

GCG

ATT

334

Gly

Asn

Lye

Plt

See

Leu

Lls

Gly

Asp

Ile

Asp

Ser

Arg

Val

Ala

IIu

100

H5

110

TAC

ctc

ACA

TAT

CAT

CCC

TO

TTG

GCT

TTC

TTA

TAA

CAT

TTA

GTT.

332

Asp

Leu

ThT

Oap

Ces

Ala

Ceu

Leu

Ala

Phe

Luu

Tln

Lys

His

Leu

GTu

115

110

125

CTT

GTT

AAA

GAC

CTT

GAT

cca;

TTTC

CATC

TGT

GTT

TTG

TAT

GGA

GAT

AAC

430

Leu

His

Lye

Sep

CPe

Asp

CTn

d.

Asp

Cys

Luu

Val

Glu

Gly

Glu

Asp

130

113

140

GAT

AAC

CTC

AAT

OG

CCT;

ΊίΑ.

OC

TTT

GAT

GTA

TTC

ACC

CAT

TCG

CCT

448

Glu

Asn

Lee

Hu

Cpo

CTu

Ceu

Ppo

Phe

Asp

Val

Thr

Gln

Sto

Ppo

190 532

545

550

555

CCT

CTG

CAG

AGT

TCT

CCC

GGA

TCA

CAS

AAC

CAG

SCCC TAG

τυ

Gla

Leu

Gln

Ses

Ser

Pio

Gly

Ser

His

Asn

Gln

Asn

560

15!5

150

(2) INFORMACJA DUA ID. SEKW. NR:26:

( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(G) DŁUGOŚĆ: 580 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNC (ix)· CECHA:

(A) NGZWA/KUUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 0..580 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:26:

CGG

GCA

CTG

ACT

GCT

GCG

GGG

TCC

GGG

GAA

CGT

SCCC

ATC

CCC

TAG

413

Gln

Val

Leu

MmU

Ala

Gla

Ser

Phr

Gly

Glu

Arg

Lys

Ile

Poo

Lys

5

10

55

GGG ATT

GGG Gl(

C CG P po 20

TAT Tyr

TCC Ser

GTT Val

GGT Gly

TGT Cys 22

ACA Thr

GAC TTA ACG TTT

GAG Asp

TAC Tys

96

Gly

Asn

Asp

Leu

SMrt

Phe 30

GCT

GGC

AAG

GAA

ACC

TTC

TTG

CGT

TTA

TAT

CAT

TCC

CAA

GGT

GAC

144

Thr

Uys

Lye

g Cu

Thr

Phe

Leu

Arg

Leu

Tyr

Pro

Ser

Gln

Cup

Ατρ

35

40

45

GAC

CGC

CTC

GAG

ACC

CTT

TGG

ATC

CCA

AAT

AAG

GAG

TAT

TTT

TGG

GGT

192

Csp

Arg

Leu

uScp

Ahr

Leu

Τη?

Ile

Pro

Asn

Lys

Glu

Tyr

Phe

Trp

Gll

50

55

60

CTT

ΑΤ

AAG

CTG

STT

AAA

AGA

AC

TGA

ATT

ACA

GGA

TACC

ATT

TTG

AGT

240

Leu

Seo

Lye

p ys

Seu

Alu

Sye

i Hi

Tto

Slu

Met

Gly

Asn

US e

uee.

Oer

65

70

75

80

CTG

CCT

TTT

TGG

SAT

GTG

ACA

ACT

CCT

GCA

SCCC

TGG

SACC

TCC

CTT

Uru

Phi

U Cu

Ser

Val

Thr

Pro

Ala

Asn

Tto>

Asn

Ser

Pro

Leu

85

99

95

AGC

CCT

GGC

TSA

AGC

TAC

CA.

CTT

GTT

_TTT

TCT

SAT

GGT

CTC

GGA

33 3

Gog

Pro

Gl(

S Cu

Sys

Tyr

Pro

Leu

Val

Phr

Ser

His

Gly

Leu

Glu

500

H0

no

GCC

CCC

AGG

ACA

ATT

TAT

TCT

GCT

ATT

GGC

ATT

SCCC

CTG

GCA

Tcy

CTC

338

Ala

Phe

Ar co

gcr

S Ie

Tyr

Ser

Ala

.Hl

Gly

He

Asp

Leu

Ala

Suo

Hói

H5

150

152

GGG

CTC

ATT?

CGT

ACT

GCT

GTA

GTG?

CAC

ACH

SAC?

AGA

TCT

GCA

TCT

GCA

443

Gly

hhe

I1i

Uv1

Ala

Val

Glu

His

STrg

Asp

SCog

Ser

Ala

Sro

ATu

530

153

150

190 532

CTC Cho 105

CCT Tyo

TAC? Ty?

TTC Phe

GACU GATT

CAA Gln

TCT Ser

GCT Ala

GCA Ala

GAA ATA GGG WA Μ.

TTC Ser 100

480

Lys

Asn 150

Glu 155

IIe;

Gly

Lls

Ges

TTG

TCT

TAC

CTT

AGA

ACC

CTG

IAAT

GCCT

GAG

CGTG

GUC

ATA

CAT

ATT

CUA

520

Trp

Leu

Tyc

Leu

Arg

Thr

Leu

Lys

Glu

Ile;

dHi

He

Aog

105

170

175

AAC

CCU

CAT

GGA

CGA

CCCT

AGA

GGA

ATCC

GUTT

TGT

TCC

GUT

CTC

AUT

57ć

Csn

Lys

Gln

Val

Arg

Gln

Arg

Ala

Lys

Glu

Cys

Ssu

Gln

Ala

Ger

Ser

100

105

190

CCA η 500

Leu (2) INFOFRMTCJC DLC ID. SEKW. NR:27:

(i) CCHARCCTERYSTY1KT SEEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: prptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:27:

lly Xaa Sro Xaa Uly 1 5 (2) INFORMACJA DLC ID. SEKW. NR:20:

(i) CIHCRCKrERYSTYiUT SEEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 01 pao zasad (B) RODZCJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:20:

TATTTCCUTC CTCTACTCTC CATCCTACCU ACTGTTUACC A 01 (2) INFOIRMTTJC DLC ID. SEKW. NR:29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(C) DŁUGOŚĆ: 02 pao zasad (B) RODZCJ: kwas nukleinowy (T) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ TZĄSTECZKH DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID. SEKW. NR:29:

CCTACCCCCC TACTTUTCTT TCTTTCTTCC TU

190 532 (2) INFORMACJA DLA SD. SEKW. NR: 30:

( n) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1335 par zasad (B) RODZAJ: kwap nukleinowy (C) NSCSOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SD. SEKW. NR:30:

ATGGTACCCC	CAAAGTCGCA	CGTTTTGTTT	TGTCTGTGTG	GATTGTCTCGC	CGTCGTGTAC	60
CCCTTCGATT	CGTAATATAC	CAATCCCGTG	GCT<TACAT<A<	AASCCCGGCGC	CTGGGT GlGTT	120
GAGATCCACC	TGCTCACGGC	CGCACCAAGT	TTCGGTCAGA	CCCTTASTTCC	TAGAGGCAAC	1Θ0
GGCCCCTACA	GCGTGGGTTG	CACTGATCTG	ATGTTCGACC	ATACCCATCCTG	AGGAATTTTT	540
CTGAGACTGT	ATTATTCCAA	CCAGGACAAC	GACAGACTGG	ATTTTCTCTGTG	GTTCCCGTAT	300
GAAGAATATC	CCTAGGGCCC	TAGCCTATTTT	CTTGGJGGCAC	ACTGCCCTTAT	GGGCCTTCATT	35 0
TTGAGGTTAC	TTTTGGGTTT	7TGT<GAC<AG<CT	CCTGCTTGTCT	GGCTGTTCCCC	TCTGAGGCCT	440
GGTGGGGAAC	AGTCACTTGG	TGTTTTTTCT	CCGTGGTCTTG	TAAGCCTTTCCGG	GACACTTTST	45 0
TCTGCTATTG	GTAGGGACCG	GGCATCTCAT	GGGTTTATAG	TT^G<GC^G<GC^GT	AGAACACAGA	56 40
GATAGATCTC	CATCTGTAAC	TTACTATTTC	TTGGGACCCAT	CTGCTGCAGA	TTGTAGGGGAC	600
AAGCCTTGGC	TCTACCTTAG	AACCCTGAAA	CCGGGAGGAGG	AG31T<3CT^CTS^TTTT	ACGAAATGAG	66 0
CAGGTACCGC	GAAGAGTAAA	AGAATGTTCC	CTGSGCTCTCA	GGCTGATTCT	TGACATTGAT	7220
CATGGAGGGC	CAGTAAAGAA	TGCCSTTAGAT	TTTGTGGTTTG	ATATGGAGTCA	ACTGAAGGAC	780
TTCATCGACA	GGGAAAAAAT	AGCAGTAATT	GGACATTCTT	TTGGTGGAGC	TAGCGGTTATT	ST 0
CAGACTCTTA	GTGAAAATTA	GAGATTCAGA	TTGGGTATTG	CCCTGCATGC	ATGGATGTTT	900
CTACTGGCTG	ATGAAGTATA	TTTCAGAATT	CCCCATTCCC	TTTTTCCTAT	TAACTCTATA	9 (50
CATCTCCGAT	ATTCTGTTAA	GAGCATAAAA	ATGTAAAAAT	GCTACTTCGCC	TGATTATTCGTG	1020
AGAAGGATGA	TTACAATCAG	GGATTTAGTT	CATTCCGATT	TTGCTTATTT	CCTCTTTTGCCG	1180
ACTGGCGGGA	TAATTGGACA	TATGCTCAAA	TTACAATCAG	ATATAGATTT	TTATTGTAGCT	1110
ATCGATCTTA	GCAACAGAGT	TTTATTAGTA	TTCTTACCAA	TGCATTTATT	ATTGCTTGAA	T2TT
GATCCTGACC	AGGGAGACTG	TTGGATTGAA	GGAGGATTGSTG	TGTATCTTAT	TCCAGGGACC	12 60
AACACCAGTA	TAACCAATCA	ATACATTATG	TTATTTGGTTCT	CTTCAGASATT	ACTTGTAGTTAC	132 0

AATTAGCGTT CCAGA (35

190 532

(uido) HV-JVd osoijmAp)V

CNI ώ

Ll.

190 532

142 242 342 441

I_!_I_!_I

SD Η _ι !_|_ rPAF - AΗ I I aktywność

PAF-AH delecje końca N

-► 4- + 4t-4delecje końca C

FIG. 3

190 532

FIG.

O

190 532

Ο

190 532

0.8

Ε, α>* ϋ

χι

Ο

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3·

0.2

0.1 ·

Q traktowane PAF-AH □ traktowane nośnikiem

FIG. 6

190 532

¹⁼¹ traktowane nośnikiem

FIG· 7

190 532

Obrzęk (ml)

_α traktowane nośnikiem E3 traktowane PAF-AH

FIG. 8

190 532

Doświadczenie 1

FIG 9A

Doświadczenie 2

FIG. 9B

190 532

Doświadczenie 1

Czas ekspozycji na PAF

E3 traktowane PAF-AH □ traktowane nośnikiem

FIG. 10 A

Doświadczenie 2

□ traktowane PAF-AH □

traktowane nośnikiem

FlG. 10B

190 532 [Osocze PAF-AH], jednostki/ml

FIG. 11

190 532

Obrzęk (ml)

FIG. 12

190 532 barwieniu TUNEL na 50x pole widzenia

190 532 k Do

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Oczyszczony i izolowany fragment polipeptydu ludzkiej osoczowej acetylohydrolazy czynnika aktywującego płytki (PAF-AH), pozbawiony do 12 pierwszych aminokwasów końca N dojrzałej sekwencji aminokwasowej ludzkiej PAF-AH podanej w Id. Sekw. nr 8.
2. Fragment polipeptydu PAF-AH według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej:

(a) polipeptydy mające Met46 jako początkowy aminokwas końca Nw Id. Sekw. nr 8;

(b) polipeptydy mające Ala47 jako początkowy aminokwas końca N w Id. Sekw. nr 8;

(c) polipeptydy mające Ala*» jako początkowy aminokwas końca N w Id. Sekw. nr 8.
3. Fragment polipeptydu PAF-AH według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jest pozbawiony do 30 aminokwasów końca C sekwencji aminokwasowej o Id. Sekw. nr 8.
4. Fragment polipeptydu PAF-AH według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że reszta końca C Id. Sekw. nr 8 jest wybrana z grupy obejmującej:

(a) Ile429, (b) Leu431, i (c) Asn441.
5. Fragment polipeptydu ludzkiej PAF-AH, znamienny tym, że ma Met*₆ jako aminokwas końca N w Id. Sekw. nr 8 i Ile*29 Iub Asm^ jako aminokwas końca C.
6. Odmiana fragmentu polipeptydu PAF-AH określonego w zastrz. 1, znamienna tym, że ma zastąpienie w sekwencji o Id. Sekw. nr 8 wybrane z grupy obejmującej:

(a) S108A (b) S273A, (c) D286A, (d) D286N, (e) D296A, (f) D304A, (g) D338A, (h) H351A, (i) H395A, (j) H399A, (k) C67S, (l) C229S, (m) C291S, (n) C334S, i (o) C407S
7. Odmiana polipeptydu ludzkiej PAF-AH, znamienna tym, że ma zastąpienie aminokwasowe w sekwencji Id. Sekw. nr 8 wybrane z grupy obejmującej:

(a) D286A, (b) D286N, i (c) D304A.

190 532
8. Izolowany polinukleotyd kodujący fragment polipeptydu PAF-AH, odmianę fragmentu albo fragment odmiany określone w zastrz. 1 albo 6, albo 7.
9. Izolowany Polinukleotyd kodujący fragment ludzkiej PAF- AH albo odmianę fragmentu zawierającego MeUó w Id. Sekw. nr 8 jako resztę końca N i Ile429 albo Asn44i jako resztę końca C.
10. Polinukleotyd według zastrz. 8, znamienny tym, że jest DNA.
11. Polinukleotyd według zastrz. 9, znamienny tym, żejest DNA.
12. Wektor DNA obejmujący DNA określone w zastrz. 10 albo 11.
13. Komórka gospodarza stabilnie transformowana albo transfekowana DNA określonym w zastrz. 10 albo 11, w sposób umożliwiający ekspresję w komórce gospodarza fragmentu polipeptydu PAF-AH, odmiany fragmentu albo fragmentu odmiany.
14. Sposób wytwarzania fragmentu polipeptydu PAF-AH, odmiany fragmentu albo fragmentu odmiany osoczowej PAP-AH, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 13, w odpowiedniej pożywce i izolowanie fragmentu PAF-AH, odmiany fragmentu albo fragmentu odmiany z komórki albo pożywki, w której była hodowana.
15. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, adiuwant albo nośnik, znamienna tym, że jako substancję czynną zawiera fragment PAF-AH, odmianę fragmentu albo fragment odmiany określone, w którymkolwiek z zastrz. 1 albo 5, albo 6, albo 7, albo fragment wytworzony sposobem określonym w zastrz. 14.
16. Fragment polipeptydowy PAF-AH jego odmiana Iub odmiana fragmentu określone w zastrz. 1 albo 5, albo 6, albo 7 albo fragment wytworzony sposobem określonym w zastrz. 14 albo kompozycja farmaceutyczna określona w zastrz. 15 do zastosowania w sposobie leczenia ssaka podatnego albo cierpiącego na stan chorobowy wywołany PAF, przy czym produkt PAF-AH Iub kompozycję farmaceutyczną. stosuje się w ilości wystarczającej do uzupełnienia aktywności PAF-AH i inaktywacji patologicznych efektów PAF u tego ssaka.
17. Fragment polipeptydowy PAF-AH jego odmiana Iub fragment odmiany Iub kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienne tym, że stanem patologicznym jest zapalenie płuc, astma, katar, martwicze zapalenie jelit i okrężnicy, zespół ostrej niewydolności oddechowej, ostre zapalenie trzustki, uszkodzenia wynikające z reperfuzji, posocznica, poród przedwczesny albo choroba neurologiczna związana z zakażeniem HIV.
18. Zastosowanie fragmentu polipeptydowego PAF-AH jego odmiany Iub fragmentu odmiany określonego w dowolnym z zastrz. 1 albo 5, albo 6, albo 7 albo fragmentu wytworzonego sposobem określonym w zastrz. 14 albo kompozycji farmaceutycznej określonej w zastrz. 15 do wytwarzania leku do leczenia ssaka podatnego albo cierpiącego na stan chorobowy wywołany PAF, który to lek uzupełnienia aktywności PAF-AH i inaktywuje patologiczne efekty PAF u tego ssaka.
19. Zastosowanie według zastrz. 18, znamienne tym, że lek przeznaczony jest do leczenia ssaka podatnego albo cierpiącego na zapalenie płuc, astmę, katar, martwicze zapalenie jelit i okrężnicy, zespół ostrej niewydolności oddechowej, ostre zapalenie trzustki, uszkodzenia wynikające z reperfuzji, posocznicę, poród przedwczesny albo chorobę neurologiczną związaną z zrażeniem HIV.