SK286327B6 - Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid - Google Patents
Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid Download PDFInfo
- Publication number
- SK286327B6 SK286327B6 SK1063-2001A SK10632001A SK286327B6 SK 286327 B6 SK286327 B6 SK 286327B6 SK 10632001 A SK10632001 A SK 10632001A SK 286327 B6 SK286327 B6 SK 286327B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- molecular weight
- high molecular
- aqueous solution
- diafiltration
- Prior art date
Links
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 title claims abstract description 113
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 title claims abstract description 113
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 title claims abstract description 113
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 claims abstract description 37
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 45
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 30
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 21
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 19
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 18
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 16
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 5
- 241000194048 Streptococcus equi Species 0.000 claims description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 241000120569 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus Species 0.000 claims description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229920002385 Sodium hyaluronate Polymers 0.000 description 9
- 229940010747 sodium hyaluronate Drugs 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 8
- YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N sodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2-[(2s,3s,4r,5r,6r)-6-[(2r,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2- Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 YWIVKILSMZOHHF-QJZPQSOGSA-N 0.000 description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 5
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 5
- WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-3-[(2s,3r,5s,6r)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WCDDVEOXEIYWFB-VXORFPGASA-N 0.000 description 4
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N alpha-D-glucuronic acid Chemical group O[C@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-WAXACMCWSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 3
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 3
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Chemical group CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000008952 bacterial invasion Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000001520 comb Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000002374 sebum Anatomy 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Polyethers (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka spôsobu čistenia kyseliny hyalurónovej s vysokou molekulovou hmotnosťou alebo jej solí.
Doterajší stav techniky
Kyselina hyalurónová je mukopolysacharid biologického pôvodu, v prírode dosť rozšírený. Je napríklad známe, že kyselina hyalurónová je obsiahnutá v živočíšnych tkanivách ako v pupočnej šnúre, synovialnej tekutine, v sklovci, v kohúťom hrebeni a rôznych spojovacích tkanivách ako v koži a v chrupavke.
Chemicky patri kyselina hyalurónová medzi glykózaminoglykány a obsahuje striedajúce sa a opakujúce sa jednotky D-glukurónovej kyseliny a N-acetyl-D-glukózamínu tvoriacich lineárny reťazec s molekulovou hmotnosťou až do 13 x 106 Daltonov.
Výraz „kyselina hyalurónová s vysokou molekulovou hmotnosťou“ používaný v prihláške tohto vynálezu znamená kyselinu hyalurónovú s molekulovou hmotnosťou, ktorej hodnota nie je menšia ako asi 0,5 x 106 Daltonov.
Výraz „kyselina hyalurónová“ uvádzaný v opise vynálezu aj v patentových nárokoch môže znamenať bez rozlišovania tak kyselinu hyalurónovú vo svojej kyslej forme, ako aj znamenať jej soľ, napríklad nátriumhyaluronát, kálium-hyaluronát, magnézium-hyaluronát, kalcium-hyaluronát alebo ďalšie.
Kyselina hyalurónová s vysokou molekulovou hmotnosťou je viskózna a je schopná si zachovávať gélovitý stav, má lubrikačné účinky a zabraňuje invázii baktérii a zadržuje vodu.
Vďaka týmto vlastnostiam kyselina hyalurónová umožňuje zachovávať tonicitu a elasticitu kože.
V literatúre existujú obsiahle údaje o farmaceutickom použití kyseliny hyalurónovej alebo jej soli.
Pretože kyselina hyalurónová je neimunogénna zlúčenina a má viskózno-elastické a hydrofilné vlastnosti, používa sa už niekoľko rokov ako náhrada sklovca alebo kĺbového mazu, alebo ako nosné médium v očnej chirurgii, ako je opísané napríklad v US-A-4 141 973, Balasz.
V kĺbových mazoch pôsobí roztok kyseliny hyalurónovej ako klzný prostriedok poskytujúci bunkám ochranné prostredie, a preto sa používa na liečbu zápalu kolenných kĺbov.
V EP-A-0 781 547, Chemedica S. A, je opísaný oftalmický prípravok obsahujúci nátrium-hyaluronát na použitie v očnej chirurgii.
V EP-A-0 719 559, Chemedica S. A. sú opísané viskózne roztoky nátrium-hyaluronátu vhodné ako maskovacie tekutiny pri terapeutickej fotokeratektómii pomocou „excimer-lasera“.
V EP-A-0 875 248, Chemedica S. A. je opísané použitie kyseliny hyalurónovej alebo niektorej z jej farmaceutický prijateľných solí na prípravu vodných roztokov vhodných ako tekutiny na intraartikuláme výplachy.
V EP-A-0 698 388, Chemedica S. A. je opísaný oftalmický prípravok slúžiaci ako náhrada sĺz, ktorý obsahuje hyaluronát ako prostriedok na zvýšenie viskozity.
Vďaka vysokej hydrofilnosti je možné kyselinu hyalurónovú použiť tiež v kozmetických produktoch ako v pleťových vodách a krémoch.
Na farmaceutické použitie kyseliny hyalurónovej alebo jej soli sa vyžaduje, aby uvedené zložky boli vo vysoko čistej forme.
Kyselinu hyalurónovú možno extrahovať a získať prečistením napríklad z pupočnej šnúry, z kohútích hrebienkov alebo zo streptokokov skupiny A a C, ako je opísané napríklad v US-A-4 141 973, Balasz a v US-A-5 559 104, Romeo a kol.
Prípravu kyseliny hyalurónovej s použitím streptokokov po prvýkrát opísali Forres a kol., v roku 1937 (J. Biol. Chem., 118,61 (1937)) a neskôr bolo preukázané, že kyselina hyalurónová získaná zo zvieracích zdrojov je totožná s kyselinou hyalurónovou získanou z mikrobiologických zdrojov.
Spôsoby prípravy kyseliny hyalurónovej z mikrobiologických zdrojov sú založené na vlastnostiach streptokokov, že ich bunková stena obsahuje ako hlavnú zložku kyselinu hyalurónovú.
Uvedené mikroorganizmy sú schopné transformovať glukózu obsiahnutú v ich životnom prostredí na D-glukurónovú kyselinu a N-acetyl-G-glukózamín a ako sekundárny metabolit produkovať kyselinu hyalurónovú na tvorbu svojej ochrannej steny.
Biosyntéza kyseliny hyalurónovej je opísaná napríklad v US-A-4 897 349, Swann a kol.
Na získavanie kyseliny hyalurónovej alebo jej sodnej soli z mikrobiologických zdrojov vo farmaceutickej čistote je známych viac spôsobov.
Napríklad v US-A-4 780 414, Nimrod a kol., US-A-4 517 295, Bracke a kol. a v US-A-5 563 051, Ellwood a kol., sú uvedené spôsoby získavania kyseliny hyalurónovej kontinuálnou fermentáciou baktérií rodu Streptococcus s nadväzným prečistením až na farmaceutickú čistotu.
Predsa len vo všetkých uvedených procesoch spôsoby čistenia kyseliny hyalurónovej zahrnujú vyzrážanie kyseliny hyalurónovej z mikrobiologického prostredia s použitím veľkého množstva organických rozpúšťadiel, ako je etanol, acetón, izopropanol atď.
Sú tiež známe niektoré spôsoby čistenia kyseliny hyalurónovej z mikrobiologických zdrojov s použitím kvartémych amóniových solí (US-A-4 517 295, Bracke a kol.) alebo s použitím aniónových alebo katiónových povrchovo aktívnych prostriedkov (US-A-5 316 926, Brown a kol.)
Opísané spôsoby sú v celosti zložité, čo vedie k vysokej cene produktov.
Sú tiež známe spôsoby čistenia, kde roztok kyseliny hyalurónovej sa spracuje diafiltráciou s použitím filtra s nominálnou hodnotou separácie molekulovej hmotnosti 10 000, 20 000 alebo 30 000 Daltonov, opísané napríklad v US-A-5 563 051, Ellwood a kol., a v US-A-4 517 295, Bracke a kol.
Vzhľadom na nízku hodnotu separačného limitu molekulovej hmotnosti možno skôr uvedené diafiltračné spôsoby použiť iba na odstránenie veľmi malých molekúl a diafiltrovaný roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú musí byť ďalej spracovaný spôsobmi zahrnujúcimi rôzne spôsoby zrážania, čo vedie k tomu, že uvedené spôsoby zostávajú i naďalej zložité.
Cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob získavania kyseliny hyalurónovej alebo jej soli vysokej molekulovej hmotnosti majúcej farmaceutický prijateľnú čistotu z biologických zdrojov, obzvlášť z mikrobiologických zdrojov vo vysokom výťažku, pri pomerne nízkych nákladoch a výhodne bez použitia organických rozpúšťadiel alebo bez pridania ďalších prostriedkov.
Podstata vynálezu
Uvedený cieľ sa dá podľa vynálezu docieliť spôsobom čistenia kyseliny hyalurónovej s vysokou molekulovou hmotnosťou z biologického zdroja charakterizovaného tým, že zahŕňa nasledujúce stupne:
a) úprava pH vodného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou pochádzajúcou z biologického zdroja na pH v rozmedzí 1,7 až 3,3 s nadväznou diafiltráciou uvedeného roztoku pri rovnakej hodnote pH s použitím filtra s veľkosťou pórov s nominálnym separačným limitom molekulovej hmotnosti od 100 000 Daltonov do 0,45 pm;
b) odstránenie buniek z vodného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou pochádzajúcou z biologického zdroja, kde uvedený stupeň sa vykoná pred stupňom (a) alebo po stupni (a);
c) sterilizácia.
Uvedeným spôsobom, zahrnujúcim stupeň diafiltrácie pri pH v rozmedzí od 1,7 do 3,3 a stupeň odstránenia buniek, sa tak dá výhodne prečistiť kyselina hyalurónová s vysokou molekulovou hmotnosťou z biologického zdroja a najmä z mikrobiologického zdroja a získať tak kyselina hyalurónová s vysokou molekulovou hmotnosťou alebo jej soľ vo farmaceutický prijateľnej čistote a s vysokým výťažkom.
V stupni (a) spôsobu podľa vynálezu sa kyselina hyalurónová spracuje diafiltráciou s použitím filtra nominálneho limitu separácie molekulovej hmotnosti alebo veľkosti pórov umožňujúceho recirkuláciu kyseliny hyalurónovej a priechod všetkých ostatných zložiek obsiahnutých v roztoku alebo v živnej pôde filtrom.
Spôsob podľa vynálezu možno vykonať s použitím akéhokoľvek biologického zdroja kyseliny hyalurónovej.
Spôsobom podľa vynálezu možno kyselinu hyalurónovú vo farmaceutický prijateľnej čistote výhodne pripraviť bez sprievodných stopových množstiev organických rozpúšťadiel alebo ďalších pridávaných zložiek, pretože spôsob čistenia podľa vynálezu nezahŕňa zrážanie organickými rozpúšťadlami alebo ďalšími prostriedkami, ale kyselina hyalurónová zostáva v celom priebehu uvedeného spôsobu v roztoku.
Ďalšie ciele, vlastnosti a výhody vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho podrobného opisu.
Spôsobom podľa vynálezu je možné prečistiť kyselinu hyalurónovú z akéhokoľvek biologického zdroja až na farmaceutický prijateľnú čistotu.
Napríklad vodný roztok kyseliny hyalurónovej obsahujúci kyselinu hyalurónovú s veľkou molekulovou hmotnosťou určený na prvotné spracovanie buď v stupni (a) podľa vynálezu, alebo v stupni (b) podľa vynálezu môže byť vodný roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú získaný extrakciou pupočnej šnúry, kohútích hrebienkov alebo iných zdrojov.
Predsa len vo výhodnom vyhotovení podľa vynálezu je vodný roztok kyseliny hyalurónovej z mikrobiologického zdroja obsahujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou určený najprv na spracovanie buď v stupni (a) podľa vynálezu, alebo v stupni (b) podľa vynálezu vodnej živnej pôdy, ktorá obsahuje kyselinu hyalurónovú z mikrobiologického zdroja.
Mikrobiologický zdroj je výhodný mikroorganizmus rodu Streptococcus produkujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou a ešte výhodnejšie sa mikrobiologický zdroj zvolí zo skupiny zahrnujúcej Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus equi a Streptococcus pyogenes.
Vodné živné pôdy obsahujúce kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou možno pripraviť ktorýmikoľvek spôsobmi v odbore dobre známymi, zahrnujúcimi fermentáciu kultúry Streptococcus vo vhodnom vodnom médiu a za vhodných podmienok za tvorby kyseliny hyalurónovej s vysokou molekulovou hmotnosťou. Uvedené spôsoby sú opísané napríklad v US-A-4 780 414, Nimrod a kol., US-A-5 563 051 Ellwood a kol. alebo v US-A-5 316 916, Brown a kol.
Spôsob prípravy vodnej živnej pôdy obsahujúcej kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou sa podľa vynálezu dá vykonať napríklad nasledovne:
Na konci obvykle používaného fermentačného spôsobu sa vodná živná pôda s pH asi 7,4 obsahujúca kyselinu hyalurónovú prevedie do nádrže so systémom na automatickú reguláciu teploty.
Teplota sa potom udržuje na hodnote v rozmedzí od 15 °C do 25 °C, výhodne na 20 °C.
Vodný roztok kyseliny hyalurónovej alebo živná pôda obsahujúca kyselinu hyalurónovú sa potom spracuje spôsobom čistenia podľa vynálezu.
Odstránenie všetkých proteínov a ďalších rozpustných zložiek obsiahnutých vo vodnom roztoku sa potom vykoná v stupni (a) diafiltráciou roztoku získaného z biologického zdroja s pH v rozmedzí od 1,7 do 3,3 s použitím filtra s veľkosťou pórov v rozmedzí od separačného limitu nominálnej molekulovej hmotnosti 100 000 Daltonov do 0,45 pm.
Predpokladá sa, že keď sa pH roztoku kyseliny hyalurónovej upraví na hodnotu v rozmedzí od 1,7 do 3,3, dôjde k vzniku určitého typu zasieťovania, kde molekuly kyseliny hyalurónovej vytvoria sieť, ktorá sa za podmienok iných hodnôt pH rozpadne.
V rozmedzí hodnôt pH od 1,7 do 3,3 táto sieť neprechádza filtrom s veľkosťou pórov v rozmedzí od separačného limitu nominálnej molekulovej hmotnosti 100 000 Daltonov do 0,45 μιη, zatiaľ čo ostatné zložky prechádzajú filtrom, čo umožňuje separáciu kyseliny hyalurónovej od všetkých rozpustených zložiek obsiahnutých v roztoku.
V stupni (a) sa pH vodného roztoku výhodne upraví na hodnotu v rozmedzí od 2,0 do 2,7 a potom sa vykoná diafiltrácia pri uvedenej hodnote pH.
Ešte výhodnejšie sa v stupni (a) pH vodného roztoku upraví na hodnotu v rozmedzí od 2,3 do 2,7 a potom sa vykoná diafiltrácia pri uvedenej hodnote pH.
V stupni (a) sa pH výhodne upraví vodným roztokom HC1.
V prvom výhodnom prevedení podľa vynálezu sa stupeň (b) zahrnujúci odstránenie buniek vykoná až po stupni (a) zahrnujúcom diafiltráciu, kde pH vodného roztoku alebo živnej pôdy obsahujúcej kyselinu hyalurónovú z biologického zdroja sa najprv upraví na hodnotu v rozmedzí od 1,7 do 3,3, výhodne na hodnotu v rozmedzí od 2,5 do 2,6, výhodne vodným roztokom kyseliny chlorovodíkovej.
Pri uvedených hodnotách pH sa vodný roztok alebo živná pôda obsahujúca kyselinu hyalurónovú prevedie na viskózne-elastický vodný roztok alebo živnú pôdu obsahujúcu kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou v zasieťovanom stave.
Takto pripravený vodný roztok alebo živná pôda obsahujúca kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou sa potom podrobí diafiltrácii, výhodne diafiltrácii s priečnym tokom za udržovania hodnoty pH na konštantnej hodnote počas celého diafiltračného stupňa.
Zvlášť výhodné je, keď filter použitý v stupni (a) rafinačného spôsobu podľa prvého výhodného prevedenia vynálezu má veľkosť pórov 0,2 pm.
V uvedenom stupni (a) zahrnujúcom diafiltráciu sa viskózne-elastický vodný roztok alebo živná pôda obsahujúca kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou čerpá do filtračnej komory s priečnym tokom s vhodným počtom filtračných vložiek s veľkosťou pórov v rozmedzí od separačného limitu nominálnej molekulovej hmotnosti 100 000 Daltonov do 0,45 pm výhodne s veľkosťou pórov 0,2 μιη za prívodu apyrogénnej destilovanej vody do zásobníka obsahujúceho viskózne-elastický roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou rovnakou rýchlosťou ako sa odvádza filtrát, aby bol zachovaný konštantný objem.
V stupni (a) rafinačného procesu podľa prvého výhodného prevedenia vynálezu sa viskózne-elastický roztok alebo živná pôda obsahujúca kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou výhodne diafiltruje tak dlho, pokiaľ odstraňovaný filtrát nemá absorbanciu (optickú hustotu, OD) pri vlnovej dĺžke 280 nm rovnakú alebo nižšiu ako 0,02. V tomto prípade by absorbancia filtrátu pri uvedenej vlnovej dĺžke mala byť sledovaná počas celého diafiltračného procesu.
Podľa uvedeného prvého výhodného prevedenia vynálezu, po stupni (a), zahrnujúcom diafiltráciu, nasleduje stupeň (b), zahrnujúci odstránenie buniek, výhodne stupeň (b), ktorý zahrnuje odstreďovanie na odstránenie všetkých buniek alebo proteínov obsiahnutých v diafiltrovanom roztoku alebo živnej pôde.
V prípade mikrobiologického zdroja môže stupeň odstreďovania zahŕňať napríklad úpravu pH diafiltrovanej živnej pôdy na pH na rozmedzí od 3,5 do 5,0, výhodne na 4,0 a potom odstredenie diafiltrovanej vodnej živnej pôdy za získania supematantu obsahujúceho kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou.
Výhodne sa hodnota pH diafiltrovanej živnej pôdy upraví vodným roztokom NaOH. Predsa len je možné použiť aj iné alkalické roztoky.
Podľa uvedeného prvého výhodného prevedenia po stupni (b) zahrnujúcom odstránenie buniek sa vykoná sterilizačný stupeň (c).
Podľa druhého výhodného prevedenia spôsobu podľa vynálezu sa stupeň (b) zahrnujúci odstránenie buniek vykoná pred stupňom diafiltrácie (a).
V druhom výhodnom prevedení sa stupeň (b) odstránenie buniek výhodne vykoná v diafiltračnom stupni s priečnym tokom.
V diafiltračnom stupni odstraňovania buniek (b) sa pH vodného roztoku kyseliny hyalurónovej alebo živnej pôdy získanej z biologického zdroja najprv upraví na ph 3,5 výhodne vodným roztokom HC1, a potom sa získaný vodný roztok alebo živná pôda diafiltruje pri uvedenom pH s použitím filtra s veľkosťou 0,2 pm.
V diafiltračnom stupni (b) odstraňovania buniek sa vodný roztok alebo živná pôda obsahujúca kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou čerpá do filtračnej komory s priečnym tokom, ktorá má vhodný počet filtračných vložiek s veľkosťou pórov 0,2 pm za prívodu sterilnej apyrogénnej destilovanej vody do zásobníka obsahujúceho vodný roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou, rovnakou rýchlosťou akou sa odvádza filtrát, aby bol zachovaný konštantný objem.
Pri uvedenej hodnote pH umožňuje filter s veľkosťou pórov 0,2 pm recirkuláciu buniek a prechod kyseliny hyalurónovej filtrom.
V stupni (b) rafinačného spôsobu podľa druhého výhodného prevedenia sa vodný roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú výhodne s vysokou molekulovou hmotnosťou diafiltruje až do dosiahnutia prídavku 10 ekvivalentných objemov apyrogénnej destilovanej vody.
V stupni (a) uvedeného druhého výhodného prevedenia sa pH vodného roztoku kyseliny hyalurónovej v podstate bez buniek získanej v stupni (b) najprv upraví na 1,7 až 3,3, výhodne na 2,4, výhodne pomocou vodného roztoku HC1.
Pri uvedenej hodnote pH sa vodný roztok kyseliny hyalurónovej prevedie na veľmi viskózne-elastický roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú v zasietenom usporiadaní.
Takto získaný vodný roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou sa potom diafiltruje, výhodne v procese s priečnym tokom, pričom hodnota pH sa udržuje na konštantné vyššie uvedenej hodnote počas celého priebehu diafiltrácie.
V stupni (a) uvedeného rafinačného spôsobu podľa vynálezu podľa druhého výhodného prevedenia sa použije filter so separačným limitom nominálnej molekulovej hmotnosti 300 000 Daltonov.
V uvedenom diafiltračnom stupni (a) sa viskózne-elastický vodný roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou čerpá do filtračnej komory s vhodným počtom filtračných vložiek s veľkosťou pórov v rozmedzí od separačného limitu nominálnej molekulovej hmotnosti 100 000 Daltonov do 0,45 /im, výhodne s nominálnym separačným limitom molekulovej hmotnosti 300 000 Daltonov, za zahustenia a prívodu apyrogénnej sterilnej destilovanej vody do zásobníka obsahujúceho viskózne-elastický roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou rovnakou rýchlosťou ako sa odvádza filtrát, aby bol zachovaný konštantný objem.
V stupni (a) rafinačného spôsobu podľa druhého výhodného prevedenia vynálezu sa viskózne-elastický vodný roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou výhodne diafiltruje až do dosiahnutia prídavku 15 ekvivalentných objemov apyrogénnej sterilnej destilovanej vody. Filtrát sa potom odstráni.
Pri použití druhého výhodného prevedenia vynálezu je výhodné, že je vynechané odstreďovanie.
Podľa uvedeného druhého prevedenia za stupňom (a) zahrnujúcom diafiltráciu nasleduje stupeň (c) zahrnujúci sterilizáciu.
Sterilizačný stupeň v spôsobe podľa vynálezu sa výhodne vykoná filtračnou sterilizáciou.
Podľa vynálezu je možné filtračnú sterilizáciu vykonať jej štandardným spôsobom.
Podľa uvedeného prvého prevedenia sa stupeň sterilizácie filtráciou vykoná úpravou pH supematantu získaného v stupni (b) odstredením na hodnotu 7,0 a nasledujúcou filtráciou supematantu cez filter s veľkosťou pórov 0,2 pm.
Podľa uvedeného druhého prevedenia sa stupeň sterilizácie filtráciou vykoná úpravou pH diafiltrovaného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovú získaného v stupni (a) na hodnotu 7,0 a následnou filtráciou supematantu cez filter s veľkosťou pórov 0,2 μηα.
V uvedených dvoch výhodných prevedeniach sa pH výhodne upraví pomocou vodného roztoku NaOH. Je možné použiť aj iné vodné alkalické roztoky.
Potom je možné sterilný roztok zahustiť s použitím filtra so separačným limitom nominálnej molekulovej hmotnosti 5 000 až 10 000 Daltonov.
Po zahustení je možné sterilizovaný roztok vysušiť vymrazením, pričom sa získa kyselina hyalurónová alebo jej soli vo forme suchého prášku.
Kyselina hyalurónová alebo jej soľ pripravená spôsobom čistenia podľa vynálezu má farmaceutický prijateľnú čistotu a jej výťažok v uvedenom procese je asi 70 - 90 % hmotnostných vzhľadom na obsah kyseliny hyalurónovej v roztoku suroviny.
Kyselina hyalurónová alebo jej soľ, pripravená spôsobom čistenia podľa vynálezu, je pozoruhodná neprítomnosťou pyrogénnych zložiek a tým, že nemá zápalové účinky.
Kyselina hyalurónová alebo jej soľ, pripravená spôsobom čistenia podľa vynálezu, obsahuje od 90 % do 95 % hmotnostných kyseliny hyalurónovej obsahujúcej D-glukurónovú kyselinu a N-acetyl-D-glukózamín v pomere 1 : 1, od asi 3 % do 5 % hmotnostných vody, menej ako 0,2 % hmotnostných proteínov, menej ako 0,3 % hmotnostných nukleových kyselín a menej ako 0,3 % hmotnostných neutrálneho cukru.
Spôsob podľa vynálezu je veľmi jednoduchý a je veľmi výhodný z ekonomického a z ekologického hľadiska, pretože nezahŕňa použitie iných prostriedkov ako HC1 alebo NaOH.
Pri použití spôsobu čistenia podľa vynálezu získaná kyselina hyalurónová alebo jej soľ neobsahuje žiadne stopy organických rozpúšťadiel.
Nasledujúce príklady prevedenia spôsobu prípravy kyseliny hyalurónovej s vysokou molekulovou hmotnosťou alebo jej soli s farmaceutický prijateľnou čistotou podľa vynálezu sú uvedené len na znázornenie vynálezu a žiadnym spôsobom neobmedzujú rozsah vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príprava vodnej živnej pôdy obsahujúcej kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou z mikrobiologického zdroja.
Bunky Streptococcus equi sa kultivujú pri teplote 37 °C vo vhodnom médiu nasledujúceho zloženia:
glukóza60 g,
Soytone15 g, extrakt z kvasníc5 g, dihydrogenťosforečnan draselný.................................................2,5 g, síran horečnatý heptahydrát........................................................1,2 g, prečistená apyrogénna voda........................................................ 1 000 ml.
Desať litrov média sa vysterilizuje a inokuluje s 1 - 2 % kultúry Streptococcus equi s optickou hustotou (OD) asi 7 stanovenej pri vlnovej dĺžke 650 nm.
Počas fermentácie sa pH vodnej živnej pôdy automaticky udržuje na hodnote 7,4 (prídavky NaOH 5 mol/1). Vykonáva sa vzduchovanie v dávke 1 objemu vzduchu na jeden objem média za minútu, a počas celej fermentácie sa živná pôda premiešava rýchlosťou 250 ot./min.
Za 20 hodín sa živná pôda upokojí a prevedie sa do vhodnej nádrže majúcej objemovú kapacitu 50 litrov.
Spôsob čistenia podľa prvého výhodného prevedenia vynálezu
Hodnota pH živnej pôdy pripravenej opísaným spôsobom sa za kontinuálneho miešania upraví na 2,5 pomocou HC1 (6 mol/1) a získa sa tak veľmi viskózna vodná živná pôda, ktorá má vzhľad hustej kvapkovitej tekutiny.
Táto vodná živná pôda sa potom čerpá do filtračnej komory s priečnym tokom, ktorá má tri filtračné vložky 0,2 pm umiestnené na sebe. Použijú sa filtračné vložky SARTOCON cassette, Mod. No. 302 186 07 06 W-SG vyrábané firmou SARTORIUS s veľkosťou pórov 0,2 pm.
Na počiatku zavedenia vodnej živnej pôdy do filtračného systému sa ventil na odvod filtrátu uzavrie, aby vodná živná pôda mohla niekoľko minút recirkulovať a docielila sa stabilita systému a systém sa zbavil bublín obsiahnutých v systéme s recirkulujúcou tekutinou.
Potom sa ventil na odvod filtrátu otvorí a do nádrže obsahujúcej vodnú živnú pôdu sa začne zavádzať rovnakou rýchlosťou, ako sa odvádza filtrát sterilnej apyrogénnej destilovanej vody, aby sa zachoval konštantný objem vodnej živnej pôdy. Vstupný tlak sa udržuje na hodnote v rozmedzí 0,1 MPa až 0,3 MPa (1 až 3 bar) výhodne 0,2 MPa (2 bar).
Diafiltrácia sa ukončí, keď absorbancia filtrátu pri vlnovej dĺžke 280 nm dosiahne hodnotu 0,012 (OD). Filtrát sa odstraňuje.
Hodnota pH diafiltrovanej živnej pôdy sa potom upraví na 4 pomocou roztoku NaOH (5 mol/1) a potom sa živná pôda odstreďuje pri 9 000 ot./min. a 15 °C v odstredivke s chladením.
Potom sa hodnota pH supematantu upraví na 7,0 roztokom NaOH (5 mol/1) a roztok sa sfiltruje cez filter s veľkosťou pórov 0,2 pm na sterilizáciu roztoku štandardným spôsobom.
Sterilný roztok sa potom lyofilizuje štandardným lyofilizačným spôsobom a získa sa tak hyaluronát sodný vo forme suchého prášku.
Výťažok kyseliny hyalurónovej podľa tohto príkladu je asi 85 - 87 % vzhľadom na obsah kyseliny hyalurónovej v roztoku obsahujúcom vstupnú surovinu. Pripravený produkt má nasledujúce parametre:
- obsah nátrium-hyaluronátu.......................................................96,5 %
- vnútorná viskozita (25 °C) = 2 100 ml/g (zodpovedajúcej molekulovej hmotnosti 1,7 x 106 Daltonov),
- obsah vody................................................................................3,1 %,
- obsah proteínov.........................................................................0,08 %,
- obsah kyseliny nukleovej..........................................................0,01 %,
- obsah neutrálneho cukru...........................................................0,01 %.
Nátrium-hyaluronát s vysokou molekulovou hmotnosťou pripravený uvedeným spôsobom je vhodný na prípravu farmaceutických kompozícií.
Spôsob čistenia podľa druhého výhodného prevedenia vynálezu
Hodnota pH vodnej živnej pôdy objemu 5 litrov obsahujúcej kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou pripravenej opísaným spôsobom z mikrobiologického zdroja sa za kontinuálneho miešania upraví na 3,5 pomocou HC1 (6 mol/1) a na tejto hodnote pH sa udržuje v celom priebehu diafiltračného stupňa s priečnym tokom na odstránenie buniek.
Tento vodný roztok (5 litrov) sa potom čerpá do filtračnej komory s priečnym tokom vybavenej tromi filtračnými vložkami 0,2 μπι umiestnenými na sebe. Použijú sa filtračné vložky SARTOCON cassette, Mod. No. 302 186 07 06 W-SG vyrábaných firmou SARTORIUS s veľkosťou pórov 0,2 μπι.
Na počiatku zavádzania vodnej živnej pôdy do filtračného systému sa ventil na odvod filtrátu uzavrie, aby vodná živná pôda mohla niekoľko minút recirkulovať a docielila sa stabilita systému a systém sa zbavil bublín obsiahnutých v systéme s recirkulujúcou tekutinou.
Potom sa ventil na odvod filtrátu otvorí a do nádrže obsahujúcej vodnú živnú pôdu sa zavádza rovnakou rýchlosťou ako sa odvádza filtrát, sterilná apyrogénna destilovaná voda s celkovým objemom zodpovedajúcim 10 ekvivalentným objemom, aby sa zachoval konštantný objem vodnej živnej pôdy. Vstupný tlak sa udržuje na hodnote v rozmedzí 0,1 MPa až 0,3 MPa (1 až 3 bar) výhodne 0,2 MPa (2 bar).
Retenčná tekutina sa odstráni a filtrát (50 litrov) obsahujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou zbavený buniek sa spracuje ďalej uvedeným spôsobom.
Hodnota pH získaného diafiltrovaného roztoku (50 litrov) obsahujúceho kyselinu hyalurónovú sa potom upraví na 2,4 za tvorby veľmi viskózneho roztoku a hodnota pH sa udržuje na skôr uvedenej hodnote počas celého diafiltračného procesu s priečnym tokom.
Táto vodná živná pôda (50 litrov) sa potom čerpá do filtračnej komory s priečnym tokom s tromi filtračnými vložkami 300 000 Daltonov umiestnenými na sebe. Použijú sa filtračné vložky SARTOCON cassette, Mod. No. 302 146 790 07 7E-SG vyrábané firmou SARTORIUS s veľkosťou pórov zodpovedajúcich 300 000 Daltonom.
Na počiatku zavádzania vodnej živnej pôdy do filtračného systému sa ventil na odvod filtrátu uzavrie, aby vodná živná pôda mohla niekoľko minút recirkulovať a docielila sa stabilita systému a systém sa zbavil bublín obsiahnutých v systéme s recirkulujúcou tekutinou.
Potom sa ventil na odvod filtrátu otvorí a vodná živná pôda sa zahustí na objem 7,5 litrov. Filtrát (42,5 litrov) sa odstráni.
Potom sa do nádrže obsahujúcej vodnú živnú pôdu zavedie rovnakou rýchlosťou ako sa odvedie filtrát, sterilná apyrogénna destilovaná voda s celkovým objemom rovnajúceho sa pätnástim ekvivalentným objemom, aby sa zachoval konštantný objem vodnej živnej pôdy. Vstupný tlak sa udržuje na hodnote v rozmedzí od 0,1 MPa do 0,3 MPa (1 až 3 bar,) výhodne 0,2 MPa (2 bar). Filtrát (116 litrov) sa odstráni.
Potom sa napájanie vodou ukonči a vodná živná pôda sa zahustí.
Hodnota pH zahusteného diafiltrovaného roztoku (4 litre) sa potom upraví na 7,0 pomocou NaOH (5 mol/1) a roztok sa sfiltruje cez statický filter s veľkosťou pórov 0,2 μπι na sterilizáciu roztoku štandardným spôsobom sterilizácie filtráciou.
Sterilný roztok sa potom suší lyofilizáciou štandardným lyofilizačným spôsobom a vo forme suchého prášku sa tak získa hyaluronát sodný.
Výťažok v prevedení podľa uvedeného príkladu je asi 83 -85 % vztiahnutých na obsah kyseliny hyalurónovej v roztoku suroviny a produkt má nasledujúce parametre:
- obsah nátrium-hyaluronátu.......................................................97,0 %
- vnútorná viskozita (25 °C) = 2100 mVg (zodpovedajúca molekulovej hmotnosti 1,7 x 106 Daltonov),
- obsah vody...............................................................................2,9 %,
- obsah proteínu...........................................................................0,08 %,
- obsah kyseliny nukleovej..........................................................0,01 %,
- obsah neutrálneho cukru...........................................................0,01 %.
Nátrium-hyaluronát s vysokou molekulovou hmotnosťou pripravený uvedeným spôsobom je vhodný na prípravu farmaceutických kompozícií.
Claims (28)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Spôsob čistenia kyseliny hyalurónovej s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktorej hodnota nie je menšia ako 0,5 x 106 Daltonov pochádzajúcej z biologického zdroja vedúceho na získanie kyseliny hyalurónovej alebo jej soli s vysokou molekulovou hmotnosťou s čistotou prijateľnou na farmaceutické použitie, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa: a) stupeň úpravy pH vodného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou pochádzajúcu z biologického zdroja na pH v rozmedzí 1,7 až 3,3 s nasledujúcou diafiltráciou tohto roztoku pri rovnakej hodnote pH s použitím filtra s veľkosťou pórov zodpovedajúcich separačnému limitu nominálnej molekulovej hmotností od 100 000 Daltonov do 0,45 gm; b) stupeň odstránenia buniek z vodného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou pochádzajúcu z biologického zdroja, kde uvedený stupeň sa vykoná buď pred stupňom (a), alebo po stupňu (a); c) stupeň sterilizácie,
- 2. Spôsob čistenia podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že vodný roztok obsahujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou pochádzajúci z biologického zdroja, ktorý sa najprv spracuje buď v stupni (a), alebo v stupni (b) je vodná živná pôda obsahujúca kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou pochádzajúcou z mikrobiologického zdroja.
- 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedeným mikrobiologickým zdrojom je mikroorganizmus rodu Streptococcus produkujúci kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou.
- 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že uvedený mikroorganizmus rodu Streptococcus sa zvolí zo skupiny zahrnujúcej Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus equi a Streptococcus pyogenes.
- 5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že v stupni (a) sa hodnota pH vodného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou upraví na hodnotu v rozmedzí od 2,0 do 2,7 a potom sa roztok spracuje diafiltráciou pri uvedenej hodnote pH.
- 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že v stupni (a) sa hodnota pH vodného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou upraví na hodnotu v rozmedzí od 2,3 do 2,7 a potom sa roztok spracuje diafiltráciou pri uvedenej hodnote pH.
- 7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že v stupni (a) sa hodnota pH vodného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou upraví vodným roztokom HC1.
- 8. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že v stupni sterilizácie (c) sa sterilizácia vykoná filtračnou sterilizáciou.
- 9. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že po stupni sterilizácie (c) nasleduje stupeň lyofilizácie (d), v ktorom sa lyofilizáciou sterilizovaného roztoku získa kyselina hyalurónová alebo jej soľ vo forme suchého prášku.
- 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sterilizovaný roztok sa pred lyofilizáciou zahustí.
- 11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že stupeň odstránenia buniek (b) sa vykoná po stupni diafiltrácie (a).
- 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že v stupni (a) sa hodnota pH vodného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou upraví na hodnotu v rozmedzí od 2,5 do 2,6 a potom sa roztok spracuje diafiltráciou pri uvedenej hodnote pH.
- 13. Spôsob podľa nároku 11 alebo 12, vyznačujúci sa tým, že filter použitý v diafiltrácii v stupni (a) má veľkosť pórov 0,2 pm.
- 14. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 12, vyznačujúci sa tým, že roztok kyseliny hyalurónovej sa v stupni (a) diafiltruje tak dlho, pokiaľ odstraňovaný fíltrát nemá hodnotu absorbancie (OD) pri vlnovej dĺžke 280 nm rovnakú alebo nižšiu 0,02.
- 15. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 14, vyznačujúci sa tým, že stupeň (b) odstránenia buniek sa vykoná v stupni odstreďovania.
- 16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že stupeň odstreďovania zahŕňa úpravu pH diafiltrovaného vodného roztoku získaného v stupni (a) na hodnotu pH v rozmedzí od 3,5 do 5,0 a odstredenie diafiltrovaného vodného roztoku za získania supematantu obsahujúceho kyselinu hyalurónovú.
- 17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že hodnota pH diafiltrovaného vodného roztoku získaného v stupni (a) sa upraví na 4,0.
- 18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že uvedená úprava hodnoty pH sa vykoná vodným roztokom NaOH.
- 19. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 18, vyznačujúci sa tým, že sterilizačný stupeň (c) je stupeň sterilizácie filtráciou zahrnujúci úpravu pH supematantu získaného v stupni odstreďovania (b) na hodnotu 7 a filtráciou supematantu filtrom s veľkosťou pórov 0,2 μπι.
- 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že uvedená úprava pH sa vykoná vodným roztokom NaOH.
- 21. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, vyznačujúci sa tým, že stupeň (b) odstránenie buniek sa vykoná pred stupňom (a).
- 22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že stupeň (b) odstránenie buniek je diafiltračný stupeň odstránenia buniek.
- 23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že diafiltračný stupeň (b) odstránenie buniek zahŕňa úpravu pH vodného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovú s vysokou molekulovou hmotnosťou pochádzajúcu z biologického zdroja na hodnotu pH 3,5 a následnou diafiltráciou roztoku pri rovnakej hodnote pH s použitím filtra s veľkosťou pórov 0,2 pm.
- 24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že uvedená hodnota pH sa upraví vodným roztokom HC1.
- 25. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 24, vyznačujúci sa tým, že filter použitý v diafiltračnom stupni (a) má veľkosť pórov zodpovedajúcich separačnému limitu nominálnej molekulovej hmotnosti 300 000 Daltonov.
- 26. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 25, vyznačujúci sa tým, že v stupni (a) sa pH vodného roztoku obsahujúceho kyselinu hyalurónovu s vysokou molekulovou hmotnosťou upraví na 2,4 a potom sa roztok diafiltruje pri rovnakej hodnote pH.
- 27. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 21 až 26, vyznačujúci sa tým, že sterilizačný stupeň (c) je stupeň sterilizácie filtráciou zahrnujúci úpravu hodnoty pH vodného roztoku získaného v stupni (a) diafiltráciou na hodnotu 7 a filtráciou tohto vodného roztoku filtrom s veľkosťou pórov 0,2 pm.
- 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že uvedená úprava pH sa vykoná vodným roztokom NaOH.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH00154/99A CH692919A5 (fr) | 1999-01-28 | 1999-01-28 | Procédé de purification de l'acide hyaluronique à poids moléculaire élevé. |
| PCT/IB2000/000082 WO2000044925A1 (en) | 1999-01-28 | 2000-01-27 | Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK10632001A3 SK10632001A3 (sk) | 2002-04-04 |
| SK286327B6 true SK286327B6 (en) | 2008-07-07 |
Family
ID=4180486
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1063-2001A SK286327B6 (en) | 1999-01-28 | 2000-01-27 | Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6489467B1 (sk) |
| EP (1) | EP1144668B1 (sk) |
| AT (1) | ATE242816T1 (sk) |
| AU (1) | AU3070400A (sk) |
| BR (1) | BR0007782B1 (sk) |
| CA (1) | CA2360343C (sk) |
| CH (1) | CH692919A5 (sk) |
| CZ (1) | CZ301306B6 (sk) |
| DE (1) | DE60003282T2 (sk) |
| ES (1) | ES2200812T3 (sk) |
| PL (1) | PL200677B1 (sk) |
| SK (1) | SK286327B6 (sk) |
| WO (1) | WO2000044925A1 (sk) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH692919A5 (fr) * | 1999-01-28 | 2002-12-13 | Trb Chemedica S A | Procédé de purification de l'acide hyaluronique à poids moléculaire élevé. |
| ES2192960B1 (es) * | 2001-11-16 | 2005-03-01 | Consejo Sup. Investig. Cientificas | Nuevo procedimiento de obtencion de acido hialuronico. |
| HRP20041230B1 (hr) * | 2002-08-07 | 2013-02-28 | Laboratoire Medidom S.A. | Postupak pripreme sterilnog pripravka hijaluronske kiseline visoke molekularne težine |
| US7002007B2 (en) * | 2004-05-28 | 2006-02-21 | Calcigen Corporation | Production of high molecular weight hyaluronates |
| KR100577075B1 (ko) * | 2004-06-16 | 2006-05-08 | 주식회사 티앤라이프시스템 | 칼슘염 및 인산염, 또는 인산칼슘염을 이용한 히아루론산정제방법 |
| GB0502096D0 (en) * | 2005-02-01 | 2005-03-09 | Chiron Srl | Purification of streptococcal capsular polysaccharide |
| EP2216412B1 (en) * | 2006-07-06 | 2012-10-03 | Reliance Life Sciences Pvt., Ltd. | Process for purification of high molecular weight hyaluronic acid |
| CN100478360C (zh) * | 2006-10-31 | 2009-04-15 | 山东福瑞达生物化工有限公司 | 将浓缩用于透明质酸或其盐的生产的方法 |
| EP2209814B1 (en) * | 2007-11-13 | 2017-01-25 | Bio-Technology General (Israel) Ltd. | Dilute filtration sterilization process for viscoelastic biopolymers |
| DE102009021372A1 (de) * | 2009-05-14 | 2010-11-18 | Ursapharm Arzneimittel Gmbh | Phosphatfreie pharmazeutische Zusammensetzung zur Glaukombehandlung |
| US8283463B2 (en) | 2010-02-09 | 2012-10-09 | Bausch & Lomb Incorporated | Sterile hyaluronic acid solutions |
| JP5713995B2 (ja) * | 2010-03-17 | 2015-05-07 | 電気化学工業株式会社 | ヒアルロン酸及び／又はその塩の精製方法 |
| CN102504047A (zh) * | 2011-11-30 | 2012-06-20 | 上海景峰制药有限公司 | 一种玻璃酸钠发酵液的超滤方法 |
| WO2013116819A1 (en) | 2012-02-03 | 2013-08-08 | University Of Rochester | Compositions and methods for recombinant synthesis of high molecular weight hyaluronic acid |
| CN105237656A (zh) * | 2015-10-30 | 2016-01-13 | 深圳市阳光之路生物材料科技有限公司 | 一种提纯透明质酸钠的方法 |
| GB201703850D0 (en) * | 2017-03-10 | 2017-04-26 | Givaudan Sa | Improvements in or relating to organic compounds |
| IT201900019724A1 (it) | 2019-10-24 | 2021-04-24 | Bmg Pharma S P A | “procedimento in solvente organico per la purificazione dell’acido ialuronico sale sodico” |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4517295A (en) | 1983-02-18 | 1985-05-14 | Diagnostic, Inc. | Hyaluronic acid from bacterial culture |
| JPH072117B2 (ja) | 1986-10-09 | 1995-01-18 | 三菱レイヨン株式会社 | ヒアルロン酸の製造法 |
| IT1271001B (it) | 1994-07-26 | 1997-05-26 | Poli Ind Chimica Spa | Procedimento di preparazione di acido ialuronico mediante fermentazione con streptococcus |
| CH692919A5 (fr) * | 1999-01-28 | 2002-12-13 | Trb Chemedica S A | Procédé de purification de l'acide hyaluronique à poids moléculaire élevé. |
-
1999
- 1999-01-28 CH CH00154/99A patent/CH692919A5/fr not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-01-27 US US09/868,529 patent/US6489467B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-27 DE DE60003282T patent/DE60003282T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-27 AT AT00900777T patent/ATE242816T1/de active
- 2000-01-27 EP EP00900777A patent/EP1144668B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-27 SK SK1063-2001A patent/SK286327B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-01-27 AU AU30704/00A patent/AU3070400A/en not_active Abandoned
- 2000-01-27 WO PCT/IB2000/000082 patent/WO2000044925A1/en not_active Ceased
- 2000-01-27 CA CA2360343A patent/CA2360343C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-01-27 PL PL350135A patent/PL200677B1/pl unknown
- 2000-01-27 CZ CZ20012694A patent/CZ301306B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-01-27 BR BRPI0007782-8B1A patent/BR0007782B1/pt active IP Right Grant
- 2000-01-27 ES ES00900777T patent/ES2200812T3/es not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6489467B1 (en) | 2002-12-03 |
| SK10632001A3 (sk) | 2002-04-04 |
| ATE242816T1 (de) | 2003-06-15 |
| DE60003282T2 (de) | 2004-05-06 |
| AU3070400A (en) | 2000-08-18 |
| CA2360343C (en) | 2010-02-23 |
| CZ20012694A3 (cs) | 2002-02-13 |
| CA2360343A1 (en) | 2000-08-03 |
| DE60003282D1 (de) | 2003-07-17 |
| CZ301306B6 (cs) | 2010-01-06 |
| EP1144668A1 (en) | 2001-10-17 |
| ES2200812T3 (es) | 2004-03-16 |
| CH692919A5 (fr) | 2002-12-13 |
| BR0007782B1 (pt) | 2013-08-27 |
| EP1144668B1 (en) | 2003-06-11 |
| BR0007782A (pt) | 2002-09-10 |
| PL200677B1 (pl) | 2009-01-30 |
| WO2000044925A1 (en) | 2000-08-03 |
| PL350135A1 (en) | 2002-11-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK286327B6 (en) | Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid | |
| FI79346C (fi) | Framstaellning av hyaluronsyra medelst bakteriekultur. | |
| CN102617754B (zh) | 用于纯化高分子量透明质酸的有效方法 | |
| EP0716688B1 (en) | Culture medium and process for the preparation of high molecular weight hyaluronic acid | |
| EP2870255B1 (en) | Preparation of sodium hyaluronate using a mutant of streptococcus zooepidemicus | |
| EP0694616A2 (en) | Process for the preparation of hyaluronic acid by fermentation with streptococcus | |
| EP0266578B1 (en) | Method of producing hyaluronic acid | |
| EP1366082B1 (en) | Highly sulfated derivatives of k5 polysaccharide and their preparation | |
| US6660853B2 (en) | Method for purifying high molecular weight hyaluronic acid | |
| TWI504611B (zh) | Hyaluronic acid and / or a salt thereof | |
| JP2893451B2 (ja) | 高分子量のヒアルロン酸を製造する方法 | |
| ES2280749T3 (es) | Floculacion con sal bivalente. | |
| MXPA01007523A (en) | Process for purifying high molecular weight hyaluronic acid | |
| JP2938880B2 (ja) | ヒアルロン酸の精製法 | |
| KR101627014B1 (ko) | 히알루론산의 정제 방법 | |
| JPS61239898A (ja) | ヒアルロン酸の製造法 | |
| KR100312638B1 (ko) | 고순도히알우론산의제조방법 | |
| JPH1156384A (ja) | 多糖類の精製方法 | |
| JPH0753117B2 (ja) | ヒアルロン酸の製造法 | |
| JPH0630604B2 (ja) | ヒアルロン酸の製造法 | |
| PL235053B1 (pl) | Sposób wytwarzania kwasu hialuronowego | |
| HK1206788B (en) | Preparation of sodium hyaluronate using a mutant of streptococcus zooepidemicus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Expiry date: 20200127 |