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TWI504611B - Hyaluronic acid and / or a salt thereof - Google Patents

Hyaluronic acid and / or a salt thereof Download PDF

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Publication number
TWI504611B
TWI504611B TW100109189A TW100109189A TWI504611B TW I504611 B TWI504611 B TW I504611B TW 100109189 A TW100109189 A TW 100109189A TW 100109189 A TW100109189 A TW 100109189A TW I504611 B TWI504611 B TW I504611B
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TW
Taiwan
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hyaluronic acid
molecular weight
ultrafiltration membrane
salt
value
Prior art date
Application number
TW100109189A
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English (en)
Other versions
TW201139463A (en
Inventor
Masanobu Kohsaka
Katsumi Ishige
Hiromitsu Hoshika
Haruko Sakai
Original Assignee
Denki Kagaku Kogyo Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Denki Kagaku Kogyo Kk filed Critical Denki Kagaku Kogyo Kk
Publication of TW201139463A publication Critical patent/TW201139463A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI504611B publication Critical patent/TWI504611B/zh

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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Description

玻尿酸及/或其鹽之純化方法
本發明係關於一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法。
玻尿酸除作為化妝品之保濕劑以外，亦於眼科、整形外科、皮膚科等中作為醫藥品而使用。雖然玻尿酸可藉由來自動物組織，例如雞之雞冠、牛眼之玻璃體等之萃取物而製造，但由於混入作為夾雜物之硫酸軟骨素等、或因組織內所含之玻尿酸酶等而易低分子量化，故而亦進行培養具有玻尿酸生產能力之微生物而由培養液中製造玻尿酸之方法(醱酵法)(非專利文獻1及專利文獻1)。
於藉由萃取法或醱酵法製造之玻尿酸中，由於蛋白質或發熱性物質等以雜質形式存在，故正研究有將該等分離去除以獲得高純度之製品之方法。尤其是製造之初始階段之雜質的去除能減輕以後之純化步驟之負荷，作為獲得亦可作為醫藥品使用之高純度之製品的方法而期待得到開發。作為高純度地純化玻尿酸之方法，已知：為去除例如蛋白質、核酸等副生物、及來自培養基之無機鹽類而於使包含玻尿酸及其鹽與雜質之玻尿酸溶液通過帶正電之過濾器後添加水溶性有機溶劑，而使玻尿酸鈉析出、沈澱並萃取上清液，藉此進行純化之方法(非專利文獻2)。
[非專利文獻1]Journal of General Microbiology，85,372-375,1976
[專利文獻1]日本專利特公平4-12960號公報
[專利文獻2]日本專利特開平9-324001公報
然而，於以工業規模獲得可作為醫藥品使用之高純度之玻尿酸類時，於上述方法中亦存在玻尿酸之回收率低等問題。
本發明係有鑒於上述情況而完成者，其目的在於提供一種簡便、高產率地以工業規模純化高純度之玻尿酸類之方法。
本發明者等人為達成上述目的，對將雜質自包含玻尿酸及其鹽與雜質之玻尿酸溶液中高效地分離去除而簡便且高效地純化高純度之玻尿酸類的方法進行了各種研究，結果發現藉由於將玻尿酸類溶液調整至偏酸性之pH值後、利用超濾膜進行透析處理，可有效去除核酸、發熱性物質、蛋白質、乳酸、無機鹽類等，從而完成了本發明。
即，根據本發明，提供一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括於將包含玻尿酸及其鹽與雜質之玻尿酸溶液調整至偏酸性之pH值後、利用超濾膜進行透析處理之步驟。根據該製造方法，可高效地去除雜質。
 [術語之說明]
本說明書中之「玻尿酸及/或其鹽」與「玻尿酸類」同義，可交換使用，係指游離之玻尿酸、及於無損本發明之目的之範圍內可使用的任意之玻尿酸鹽(並不限定於此，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鋰鹽等金屬鹽，或鹽酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽等酸加成物等)或水合物、該等之混合物。此處，玻尿酸係指N-乙醯基-D-葡萄糖胺與D-葡糖醛酸鍵結之2糖單元重複連鏈而成之高分子量多糖類，各種鹽主要係指葡糖醛酸部分成為鹽之形態者。玻尿酸因可摺疊之鏈部分與D-葡糖醛酸部分之羧基之負電荷的相互作用而易於空間中展開，藉此可與大量水結合而形成凝膠。另外，即便為低濃度，但分子間力亦較強，因此具有相對較高之黏性。由於此種作用，例如具有濕潤關節之作用、柔軟皮膚之作用等，於生理上亦發揮該等作用。
已知於玻尿酸類中，分子量約200萬Da之玻尿酸鈉與分子量約80萬Da者相比，作為醫藥品，對治療變形性膝關節炎、肩關節周圍炎、慢性類風濕性關節炎等發揮出優異之效果(藥理與治療、Vol. 22、No. 9、289(1994)；藥理與治療、Vol. 22、No. 9、319(1994))。另外，除此以外還已知作為外科手術後之防止黏連用之效果、進而亦於皮膚科領域、眼科領域中作為醫藥品之效果，一部分通常於臨床上使用。於作為醫藥品使用之情形時，較理想為使用平均分子量為100萬以上之玻尿酸類。若考慮獲取或處理之容易性，則作為醫藥品更理想為平均分子量為100萬~500萬Da之玻尿酸類，尤其理想為平均分子量為150萬~400萬Da之玻尿酸類。另外，此種高分子量玻尿酸類於作為化妝品用途使用時，亦因其較高之保濕力而發揮優異之效果。
關於本說明書中之「平均分子量」，只要無特別說明，則於表示玻尿酸類之平均分子量時，係指黏度平均分子量者。黏度平均分子量可藉由業者通常使用之方法而求出。較佳為可藉由各國之藥典等中通常所使用之測定方法而求出，更佳為可藉由日本藥典中所使用之測定方法而求出。作為一例，例如於期望玻尿酸鈉具有與本申請案發明接近之平均分子量(150萬~390萬)之情形時，其平均分子量可使用極限黏度[η]並藉由下式而求出，但並不限定於此。
[式1]
溶解玻尿酸類作為醫藥品之注射用溶解液可適當使用通常所使用之注射用溶解液(例如，各國藥典中所確認者)，該注射用溶解液係於注射用水、生理鹽水等中加入含有酸、鹼、磷酸鹽之類之緩衝劑的pH值調整劑等者。
該等玻尿酸類可為藉由自動物組織中萃取之萃取法而製造者，亦可為藉由使用玻尿酸生產微生物菌株使其醱酵而獲得之醱酵法而製造者。然而，於自動物組織所萃取者中，其他黏多糖等雜質相對較多，且玻尿酸類之分子量亦較小，故而較理想為使用藉由醱酵法而獲得者。於適於本發明之醱酵法之一例中，例如可使用鏈球菌屬之微生物並藉由已知之方法獲得玻尿酸類。
於將藉由醱酵法而獲得之醱酵液用於本發明之方法等中之情形時，較理想為使用藉由已知之方法、例如離心分離或過濾處理等殺菌之溶液者。視情況，亦可使用添加乙醇等水溶性有機溶劑而將玻尿酸析出純化者。另外，亦可使用經氧化鋁等處理者。
本說明書中之「鏈球菌」包括：可生產玻尿酸之鏈球菌(Streptococcus)屬之任意細菌‧其變異株。尤其較理想為使用如專利文獻2中所記載之馬鏈球菌(Streptococcus equi)FM-100(微工研菌寄第9027號)、日本專利特開平2-234689號公報中所記載之馬鏈球菌FM-300(微工研菌寄第2319號)之高產率且穩定地生產玻尿酸之變異株。作為適合生產玻尿酸之鏈球菌屬細菌之例，其他例如可列舉：馬鏈球菌(Streptococcus equi)、流行性鏈球菌(Streptococcus zooepidemicus)、類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)、壞乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)及該等之變異株等，但並不限定於此。
所謂本說明書中之「超濾膜」，係指孔徑為0.001~0.01 μm之過濾膜及/或截留分子量為1000~300000左右之過濾膜。超濾膜之材質大致分為無機膜與有機膜，進而分為疏水性與親水性。作為疏水性有機膜，可列舉聚碸、聚醚碸、聚醚、聚偏二氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯等，但並不限定於此。作為親水性有機膜，可列舉聚丙烯腈、聚醯胺、聚醯亞胺、醋酸纖維素等，但並不限定於此。其過濾介質之形狀包括平板膜、管狀膜、捲式膜、中空纖維(Hollow fiber)膜等所有模組形式。
過濾方式包括端點過濾方式與掃流方式。端點過濾方式係指將供給於膜之全部水過濾之方式。相對於此，掃流方式係指藉由相對於膜面平行流動而一面抑制供給於膜之水中所含之懸浮物或膠體堆積於膜面之現象一面進行過濾的方式。於掃流方式中，包括單程方式(One-pass method)、反沖方式(Backlash method)及反向方式(Reverse method)，但並不限定於此。所謂單程方式，係指如圖1之A所示不循環利用來自超濾膜之透過液而進行過濾之方式。所謂反沖方式，係指如圖1之B所示包括將來自超濾膜之透過液儲存於透過液槽中、自透過液槽轉移至超濾膜上、沖洗附著於過濾膜表面之玻尿酸類之步驟的過濾方式。所謂反向方式，係指如圖1之C所示包括藉由關閉透過液閥門使來自超濾膜之透過液逆流而沖洗附著於過濾膜表面之玻尿酸類之步驟的過濾方式。
本說明書中之「雜質」係指玻尿酸類、水以外之溶劑成分、無機鹽以外之物質，尤其係指於使用作為最終產品之玻尿酸類時可帶來不利之物質(發熱性物質等)。作為主要雜質源，可列舉：於玻尿酸類之生產階段中源自組織、微生物或培養液(培養基)者、或者於其後之純化階段等中混入者。作為本說明書中之雜質之例，可列舉組織或菌體、蛋白質、核酸、多糖類、低分子化合物、或內毒素等，但並不限定於此。作為雜質之組織或菌體分別包括：源自於萃取法中所使用之作為萃取原料之組織的組織片等，或於醱酵法中所使用之微生物之菌體或菌體片等，但並不限定於此。作為雜質之蛋白質包括：源自上述組織、菌之蛋白質及於生產後之步驟中混入之蛋白質等，但並不限定於此。作為雜質之內毒素包括源自上述菌之脂多糖類等，但並不限定於此。
所謂本說明書中之「低分子化合物」，係指與玻尿酸類相比分子量相對較小之化合物，例如分子量為2000 Da以下、或分子量為1000 Da或分子量為500 Da以下之化合物，但並不限定於此。此種低分子化合物包括各種胺基酸、有機酸(例如乳酸)、糖(例如葡萄糖)等。
本說明書中之「去除」除包括完全去除對象物質以外，亦包括部分去除(減少該物質之量)。本說明書中之「純化」包括去除任意或特定之雜質。
關於本說明書中之各個數值範圍，分別包含由「~」表示之上限值及下限值。
[實施形態]
本發明例如係關於以下之實施態樣，但並不限定於此。
實施態樣1.
一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括藉由於將包含玻尿酸及/或其鹽與雜質之玻尿酸溶液調整至偏酸性之pH值後、利用超濾膜進行透析處理而去除雜質之步驟。
實施態樣2.
如實施態樣1之方法，其中於超濾膜之截留分子量與利用超濾膜進行透析處理時之pH值滿足下式之條件下，利用超濾膜進行透析處理：pH值≦-5×10-5 ×(截留分子量)+4.4978。
實施態樣3.
如實施態樣1或2之方法，其中超濾膜之截留分子量為25000~35000，透析處理時之pH值為3.3以下。
實施態樣4.
如實施態樣1或2之方法，其中上述超濾膜之截留分子量為12000~14000，透析處理時之pH值為3.9以下。
實施態樣5.
如實施態樣1或2之方法，其中上述超濾膜之截留分子量為9000~11000，透析處理時之pH值為4.1以下。
實施態樣6.
如實施態樣1或2之方法，其中上述超濾膜之截留分子量為6000~8000，透析處理時之pH值為4.2以下。
實施態樣7.
如實施態樣1或2之方法，其中上述超濾膜之截留分子量為4000~5000，透析處理時之pH值為4.3以下。
實施態樣8.
如實施態樣1至7中任一項之方法，其中上述超濾膜為疏水性有機膜。
實施態樣9.
如實施態樣1至8中任一項之方法，其中上述處理之過濾方式為反向方式。
實施態樣10.
如實施態樣1至9中任一項之方法，其中上述處理時之透過流速為20~50 L/m2 ‧hr。
實施態樣11.
如實施態樣1至10中任一項之方法，其中上述雜質包括菌體、蛋白質、核酸、低分子化合物或內毒素。
實施態樣12.
如實施態樣1至11中任一項之方法，其中純化後之上述玻尿酸及/或其鹽之平均分子量為350萬~700萬Da。
實施態樣13.
如實施態樣1至12中任一項之方法，其中上述玻尿酸類溶液中之玻尿酸及/或其鹽之濃度為1~5 g/L。
以下對本發明之態樣進行說明。
本發明之態樣(例如實施態樣1)係一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括藉由於將包含玻尿酸及/或其鹽與雜質之玻尿酸類溶液調整至偏酸性之pH值後、利用超濾膜進行透析處理而去除雜質之步驟。根據該純化方法，可藉由調整至偏酸性之pH值而減少利用超濾膜進行過濾時之玻尿酸類之損失，而高效地去除雜質。
藉由於超濾膜之截留分子量與利用超濾膜進行透析處理時之pH值滿足下式之條件下利用超濾膜進行透析處理，可於實質上不損失玻尿酸類之情況下進行純化：pH值≦-5×10-5 ×(截留分子量)+4.4978。作為滿足上述之式的超濾膜之截留分子量與利用超濾膜進行透析處理時之pH值，例如可列舉：超濾膜之截留分子量為35000，pH值為2.7；超濾膜之截留分子量為30000，pH值為3.0；超濾膜之截留分子量為25000，pH值為3.3；超濾膜之截留分子量為20000，pH值為3.5；超濾膜之截留分子量為14000，pH值為3.8；超濾膜之截留分子量為13000，pH值為3.9；超濾膜之截留分子量為12000，pH值為3.9；超濾膜之截留分子量為11000，pH值為4.0；超濾膜之截留分子量為10000，pH值為4.0；超濾膜之截留分子量為9000，pH值為4.1；超濾膜之截留分子量為8000，pH值為4.1；超濾膜之截留分子量為7000，pH值為4.2；超濾膜之截留分子量為6000，pH值為4.2；超濾膜之截留分子量為5000，pH值為4.3；超濾膜之截留分子量為4000，pH值為4.3。
此處，所謂「實質上不損失玻尿酸類」，係指玻尿酸類之損失率成為7%以下(回收率成為93%以上)、6%以下(回收率成為94%以上)、5%以下(回收率成為95%以上)、4%以下(回收率成為96%以上)或3%以下(回收率成為97%以上)。
若使用截留分子量較高之膜，則玻尿酸類透過超濾膜而產生損失之風險增高，另一方面若使用截留分子量較低之膜，則蛋白質等相對高分子之雜質之去除效率下降。根據上述實施態樣之方法，使用截留分子量較高之膜、與使用截留分子量較低之膜均可藉由調整至與膜之截留分子量對應之pH值而於不損失玻尿酸類之情況下去除雜質，因此於上述態樣之方法中使用之超濾膜的截留分子量並無特別限定。例如，於使用具有25000~35000之截留分子量之超濾膜之情形時，可藉由將pH值調整至3.3以下而於不損失玻尿酸類之情況下進行純化。於使用具有12000~14000之截留分子量之超濾膜之情形時，可藉由將pH值調整至3.9以下而於不損失玻尿酸類之情況下進行純化。於使用具有9000~11000之截留分子量之超濾膜之情形時，可藉由將pH值調整至4.1以下而於不損失玻尿酸類之情況下進行純化。於使用具有6000~8000之截留分子量之超濾膜之情形時，可藉由將pH值調整至4.2以下而於不損失玻尿酸類之情況下進行純化。於使用具有4000~5000之截留分子量之超濾膜之情形時，可藉由將pH值調整至4.3以下而於不損失玻尿酸類之情況下進行純化。
此處，超濾膜之截留分子量可藉由使用如表1所示之目標物質進行過濾並調查各自之阻塞率相當於90%之分子量而確定。
於上述態樣之方法中使用之超濾膜之材質並無特別限定，就雜質之去除之觀點而言較理想為疏水性有機膜，更理想為聚碸、聚醚碸、聚醚、聚偏二氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯。
作為於上述態樣之方法中使用之超濾膜，例如可使用：PM-10、PM-50、PM-100(Koch公司製造)，NTU-3050(日東電工公司製造)，IRIS3065(羅納‧普朗克公司製造)，FS-10(旭化成公司製造)，MU-6303(可樂麗公司製造)、DUSO400(泰金化學工業公司製造)，SLP-3053(旭化成化學公司製造)等，但並不限定於該等。
上述態樣之方法中之過濾方式並無特別限定，但由於水透過膜之流速易穩定化、過濾膜之壽命延長等，故而較理想為掃流方式，其中尤其理想為反向方式。
於上述態樣之方法中，玻尿酸類溶液於超濾膜處理時之透過流速根據玻尿酸類溶液之性狀或超濾膜之種類而不同，不能一概而論。例如，於以工業規模純化玻尿酸類時，較理想為20 L/m2 ‧hr以上，更理想為25 L/m2 ‧hr以上，尤其理想為30 L/m2 ‧hr以上。因存在剪切玻尿酸類而引起分子量降低之可能性，故玻尿酸類溶液於過濾時之透過流速較佳為100 L/m2 ‧hr以下，進而較佳為50 L/m2 ‧hr以下。
於上述態樣之方法中，用以輸送液體之壓力並無限定，通常較佳為於加壓下通過過濾膜。尤佳為利用泵等加壓而輸送之方法。當於輸送液體時利用泵施加壓力時，只要不損壞或堵塞過濾膜而使性能劣化，則無特別限定。施加於過濾膜上之壓力較佳為0.01 MPa以上0.30 MPa以下、更佳為0.03 MPa以上0.20 MPa以下、尤佳為0.05 MPa以上0.10 MPa以下。
進而，根據上述態樣之方法，可減少純化時玻尿酸類之分子量之下降，尤其是於高分子量(例如，純化後之平均分子量為350萬~700萬Da)玻尿酸類之純化中，發揮優異之效果。另外，即便對先前難以處理之相對高濃度(例如0.1~20 g/L、0.5~15 g/L、1~10 g/L)之玻尿酸類溶液，亦可高效地處理。
另外，根據上述態樣之方法，雖然玻尿酸類之消失受到較低的抑制，但作為雜質，不僅通常可利用超濾膜去除之低分子化合物(例如胺基酸、糖、有機酸)而且高分子化合物(例如核酸、內毒素、蛋白質)亦可高效地分離‧去除。另外，上述態樣之方法於核酸、內毒素及或蛋白質之去除中亦發揮優異之效果。
使用上述態樣之方法時之玻尿酸類溶液之玻尿酸類濃度就由溶液黏度之高低引起之處理之難易度及玻尿酸類之溶解度之觀點而言，較理想為0.1~20 g/L，最理想為1~10 g/L，但並不限定於此。
另外，於上述態樣之方法中，為降低玻尿酸類溶液之黏度，亦可於玻尿酸類溶液中共存氯化鈉等鹽類。於此情形時，較理想為避免高濃度鹽之共存使得純化效果不受損壞。作為此種鹽之共存之具體例，可列舉於玻尿酸類溶液中添加0.1~5重量%之氯化鈉。
使用上述態樣之方法時之玻尿酸類溶液之溫度較理想為0~80℃，但並不限定於此。若溫度為80℃以下，則可較強地抑制處理時之玻尿酸類之分解及分子量之降低。
另外，於進行超濾透析處理時，作為膜前處理，較理想為藉由利用2%以下之鹼(例如氫氧化鈉水溶液)、過氧化物(例如次氯酸鈉水溶液)、界面活性劑、檸檬酸、檸檬酸銨‧酵素清潔劑等藥劑對膜進行清洗處理之化學方法，或藉由沖洗、海綿球、空氣注入法等物理方法進行。
本發明之進一步之態樣，於上述第一態樣中，除上述步驟以外，亦可進而包含使玻尿酸類溶液與無機吸附劑、有機吸附劑及/或活性碳接觸之步驟。
另外，若考慮其後所必須之分離‧純化步驟等，則較理想為避免需要追加之純化步驟之成分的混入。即，為避免混入新雜質之本發明之其他態樣，係於上述第一態樣中不包括於玻尿酸類溶液之超濾後，使其與無機吸附劑或有機吸附劑接觸之步驟的純化方法。關於本發明之進一步之態樣，於上述第一態樣中不包括使玻尿酸類溶液與無機吸附劑或有機吸附劑接觸之步驟。於本發明中，即便為超濾亦可發揮充分之純化效果，故而於重視避免新雜質之混入之情形時，較理想為單獨利用超濾進行處理。當然，於此情形時，除超濾以外亦可進行其他純化處理等步驟。
另外，關於本發明之進一步之態樣，係於上述態樣中藉由馬鏈球菌FM-100(微工研條寄第9027號)或馬鏈球菌FM-300(微工研條寄第2319號)生產玻尿酸類。藉由使用由該等微生物生產之玻尿酸類作為純化對象，可獲得雜質更少且高分子量之玻尿酸類純化物，尤其是於作為醫藥使用時發揮優異之效果。
藉由使用上述態樣之純化方法可減輕玻尿酸類之分離‧純化步驟之負荷，因此有關上述態樣之純化方法於製造之工業製程的較初始階段中使用尤為有效。
再者，藉由上述實施態樣、態樣而說明之純化方法等並非限定本發明者，而旨在舉例說明而揭示者。本發明之技術範圍係由申請專利範圍所規定，業者可於申請專利範圍所揭示之發明之技術範圍內進行各種設計變更。
例如，上述純化方法亦可為進一步包括其他步驟、或者繼上述純化方法之後進一步實施其他之步驟‧方法，而製造玻尿酸類等之方法。作為此種步驟‧方法，例如可列舉：培養玻尿酸生產微生物菌株之步驟；由玻尿酸產生微生物菌株培養液製造培養濾液之步驟；離心分離純化對象液之步驟；中和對象液之步驟；微濾純化對象液之步驟；透析處理對象液之步驟；於純化對象液中添加芳香族系吸附樹脂並攪拌及超濾之步驟；藉由層析法純化對象液之步驟；將活性碳自對象液中分離之步驟；將活性碳自對象液中去除之步驟；添加有機溶劑使玻尿酸類沈澱之步驟；將玻尿酸類結晶化之步驟；使玻尿酸類乾燥之步驟等。
[實施例]
以下，藉由實施例更具體地說明本發明，但本發明並不限定於該等。
實施例1
利用純水將使用馬鏈菌球FM-100(微工研寄第9027號)培養之培養液45 L稀釋為80 L(玻尿酸鈉濃度2.0 g/L)並藉由離心分離去除菌體。將所得之粗製玻尿酸調整至pH 2.9後，利用截留分子量為30000且材質為聚碸之超濾膜(Koch公司製造‧PM-100)2 m2 ，以30 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之稀釋操作，並以透析次數10次、反向方式進行處理。將食鹽2.4 kg溶解於80 L所得之溶液中，調整至pH 7後以乙醇240 L使其析出並以乙醇8 L進行清洗，於40℃下進行真空乾燥，而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸回收率示於表2。
實施例2
將實施例1中所使用之粗製玻尿酸調整至pH 2.9後，利用截留分子量為30000且材質為聚醚碸之超濾膜(旭化成公司製造‧FS-10)5 m2 ，以30 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之純水稀釋，並以透析次數11次、反向方式進行處理。所得之溶液係以與實施例1相同之方式進行處理而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸回收率示於表2。
實施例3
將實施例1中所使用之粗製玻尿酸調整至pH 3.3後，以利用截留分子量20000材質聚碸之超濾膜(日東電工公司製造‧NTU-3050)3 m2 ，以30 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之純水稀釋，並以透析次數8次、反向方式進行處理。所得之溶液係以與實施例1相同之方式進行處理而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸鈉之回收率示於表2。
實施例4
將實施例1中所使用之粗製玻尿酸調整至pH 2.9後，利用截留分子量為30000且材質為聚偏二氟乙烯之超濾膜(羅納‧普朗克公司製造‧IRIS3065)5 m2 ，以30 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之純水稀釋，並以透析次數9次、反向方式進行處理。所得之溶液係以與實施例1相同之方式進行處理而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸鈉之回收率示於表2。
實施例5
將實施例1中所使用之粗製玻尿酸調整至pH 2.7後，利用截留分子量為40000且材質為聚醚碸之超濾膜(泰金化學工業公司製造‧DUSO400)5 m2 ，以30 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之純水稀釋，並以透析次數11次、反向方式進行處理。所得之液係以與實施例1相同之方式進行處理而獲得150 g之玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸鈉之回收率示於表2。
實施例6
將實施例1中所使用之粗製玻尿酸調整至pH 3.7後，利用截留分子量為13000且材質為聚碸之超濾膜(可樂麗公司製造‧MU-6303)5 m2 ，以30 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之純水稀釋，並以透析次數11次、反向方式進行處理。所得之溶液係以與實施例1相同之方式進行處理而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸鈉之回收率示於表2。
實施例7
將實施例1中所使用之粗製玻尿酸調整至pH 3.7後，利用截留分子量為10000且材質為聚碸之超濾膜(旭化成化學公司製造‧SLP-3053)4.5 m2 ，以30 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之純水稀釋，並以透析次數11次、反向方式進行處理。所得之溶液係以與實施例1相同之方式進行處理而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸鈉之回收率示於表2。
比較例1
將實施例1中所使用之粗製玻尿酸調整至pH 5.5後，利用截留分子量為10000且材質為聚碸之疏水性超濾膜(Koch公司製造‧PM-10)2 m2 ，以30 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之稀釋操作，並以透析次數15次、反向方式進行處理。所得之溶液係以與實施例1相同之方式進行處理而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸回收率示於表2。
比較例2
將實施例1中所使用之粗製玻尿酸調整至pH 3.6後，利用截留分子量為20000且材質為乙酸纖維素之親水性超濾膜(DDS公司製造‧CA600PP)4.5 m2 ，以30 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之純水稀釋，並以透析次數10次、反向方式進行處理。所得之溶液係以與實施例1相同之方式進行處理而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸回收率示於表2。
比較例3
將實施例1中所得之粗製玻尿酸調整至pH 3.3後，利用截留分子量為20000且材質為乙酸聚醯亞胺之親水性超濾膜(日東電工公司製造‧NTU-4220)5 m2 ，以30 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之純水稀釋，並以透析次數9次、反向方式進行處理。所得之溶液係以與實施例1相同之方式進行處理而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸回收率示於表2。
比較例4
將實施例1中所得之粗製玻尿酸調整至pH 3.7後，利用截留分子量為13000且材質為乙酸聚碸之疏水性超濾膜(可樂麗公司製造‧MU-6303)5 m2 ，以5 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之純水稀釋，並以透析次數11次、單程方式進行處理。將所得之溶液以與實施例1相同之方式進行處理而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸回收率示於表2。
比較例5
將實施例1中所使用之粗製玻尿酸調整至pH 3.7後，利用截留分子量為13000且材質為乙酸聚碸之疏水性超濾膜(可樂麗公司製造‧MU-6303)5 m2 ，以15 L/m2 ‧hr之透過流速反覆進行容積比為2倍之濃縮、等倍之純水稀釋，並以透析次數11次、反沖方式進行處理。所得之溶液係以與實施例1相同之方式進行處理而獲得玻尿酸鈉。將分析結果及玻尿酸回收率示於表2。
測定方法
(1)核酸含量：對0.1%之玻尿酸鈉於260 nm下之吸光度進行測定。
(2)蛋白質含量：將玻尿酸鈉溶解於0.1 N之氫氧化鈉中，以洛利法進行測定。
(3)乳酸：以0.1%之濃度溶解玻尿酸鈉，以L-LDH(L-Lactate Dehydrogenase，L-乳酸脫氫酶)法進行測定。
(4)金屬：將玻尿酸鈉以0.05之濃度溶解於8 N之硝酸中，進行ICP(Inductively Coupled Plasma，電感耦合等離子體)發射光譜分析。
(5)極限黏度：將玻尿酸鈉以0.02%之濃度溶解於0.2 M之氯化鈉中，對30℃下之極限黏度進行測定。
實施例8
使用具有各種截留分子量之聚碸之疏水性超濾膜、於以下條件下將實施例1所使用之粗製玻尿酸純化，調查超濾時之pH值與玻尿酸之回收率的關係。
HA溶液條件
HA濃度：2 g/L
分子量：440萬(極限黏度：55 dL/g)
過濾條件
線速：1 m/s
透過流速：30 L/(m2 ‧hr)
濃縮：2倍濃縮
溫度：25℃
於圖2中表示超濾時之pH值與玻尿酸回收率之關係之圖表。另外，關於各截留分子量之膜，獲得表示超濾時之pH值與玻尿酸損失率之關係的式1~5。使用下述式1~5算出實質上不引起各截留分子量之超濾膜中之玻尿酸類之損失的pH值，於該pH值之範圍內(最適pH值)利用超濾膜進行純化，藉此可於不損失玻尿酸類之情況下進行純化。
於使用截留分子量為30,000之超濾膜之情形時
(式1)玻尿酸類之損失率(%)=44.86×(超濾時之pH值)-131.79
(最適pH值≦2.9)
於使用截留分子量為13,000之超濾膜之情形時
(式2)玻尿酸類之損失率(%)=40.84×(超濾時之pH值)-86.92
(最適pH值≦3.7)
於使用截留分子量為10,000之超濾膜之情形時
(式3)玻尿酸類之損失率(%)=24.36×(超濾時之pH值)-97.19
(最適pH值≦4.0)
於使用截留分子量為7,000之超濾膜之情形時
(式4)玻尿酸類之損失率(%)=7.09×(超濾時之pH值)-29.02
(最適pH值≦4.1)
於使用截留分子量為5,000之超濾膜之情形時
(式5)玻尿酸類之損失率(%)=0.79×(超濾時之pH值)-2.01
(最適pH值≦4.2)
將玻尿酸類之損失率成為3%以下之pH值與超濾膜之截留分子量的關係示於圖3。另外，可明確玻尿酸類之損失率成為3%以下之pH值與超濾膜之截留分子量之關係滿足以下之式6。
(式6)玻尿酸類之損失率成為3%以下之pH值=-5×10-5 ×(截留分子量)+4.4978
藉由使用式6，可求出最適pH值相對於超濾膜之截留分子量之上限，藉由以最適pH值利用超濾膜進行透析，可以3%以下之損失率純化玻尿酸類。
根據以上之實驗可確認，若使用本發明之純化方法，則可自玻尿酸類溶液中高效地去除雜質而純化高分子量之玻尿酸類。
以上，基於實施例進行了本發明。該實施例始終為示例，業者明白可實施各種變形例，且此種變形例亦包含於本發明之範圍內。
圖1係表示掃流方式所含之單程方式(A)、反沖方式(B)及反向方式(C)之過濾方式的圖；
圖2係表示超濾時之pH值與玻尿酸損失率之關係的圖表；及
圖3係表示玻尿酸類之損失率成為3%以下之pH值與超濾膜之截留分子量之關係的圖表。
(無元件符號說明)

Claims (8)

  1. 一種玻尿酸及/或其鹽之純化方法，其包括藉由於將包含玻尿酸及/或其鹽與雜質之玻尿酸溶液調整至偏酸性之pH值後、利用超濾膜進行透析處理而去除雜質之步驟，且於超濾膜之截留分子量與利用超濾膜進行透析處理時之pH值滿足下式之條件下，利用超濾膜進行透析處理：pH值≦-5×10-5 ×(截留分子量)+4.4978。
  2. 如請求項1之方法，其中超濾膜之截留分子量為25000~35000之情形時，透析處理時之pH值為3.3以下；上述超濾膜之截留分子量為12000~14000之情形時，透析處理時之pH值為3.9以下；上述超濾膜之截留分子量為9000~11000之情形時，透析處理時之pH值為4.1以下；上述超濾膜之截留分子量為6000~8000之情形時，透析處理時之pH值為4.2以下；上述超濾膜之截留分子量為4000~5000之情形時，透析處理時之pH值為4.3以下。
  3. 如請求項1或2之方法，其中上述超濾膜為疏水性有機膜。
  4. 如請求項1或2之方法，其中上述處理之過濾方式為反向方式。
  5. 如請求項1或2之方法，其中上述處理時之透過流速為20~50L/m2 ．hr。
  6. 如請求項1或2之方法，其中上述雜質包括菌體、蛋白 質、核酸、低分子化合物或內毒素。
  7. 如請求項1或2之方法，其中純化後之上述玻尿酸及/或其鹽之平均分子量為350萬~700萬Da。
  8. 如請求項1或2之方法，其中上述玻尿酸類溶液中之玻尿酸及/或其鹽之濃度為1~5g/L。
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