SK168397A3

SK168397A3 - Ionic molecular conjugates of n-acylated derivatives of poly(2- -amino-2-deoxy-d-glucose) and polypeptides

Info

Publication number: SK168397A3
Application number: SK1683-97A
Authority: SK
Inventors: Shalaby W Shalaby; Steven A Jackson; Francis Ignatious; Jacques-Pierre Moreau
Original assignee: Biomeasure Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-05-24
Publication date: 1998-04-08
Also published as: US5821221A; WO1996039160A1; CA2222995C; CN1192152A; EP0830137A1; AU5878996A; CZ391697A3; SI9620090A; RU2172323C2; AU717188B2; ATE245031T1; EP0830137B1; KR19990022399A; DK0830137T3; US5665702A; JPH11508289A; PL323735A1; DE69629114T2; HUP9901627A3; PT830137E

Description

Doterajší stav techniky

Na riadené uvoľňovanie farmaceutický významných polypeptidov sa vyvinuli polymérne systémy nosičov liečiv. Napríklad sa použili syntetické polyestery, ako sú poly(kyselina DLmliečna), poly(kyselina glykolová) a poly(s-kaprolaktón) vo forme mikrokapsúl, fólií alebo tyčiniek uvoľňujúcich biologicky aktívne polypeptidy. Pozri napr. patenty USA č. 4,767,628 a č. 4,675,189 a prihlášku PCT č. WO 94/00148.

Okrem syntetických polymémych reťazcov sa ako zložky podobných kompozícií na trvalé uvoľňovanie liečiv použili prírodné polyméry a ich deriváty, ktoré sa štiepia enzymatickou degradáciou. Príkladom takýchto prírodných polymérov sú polyméry na báze chitínu, poly(Nacetylglukózamín). Keďže chitín je nerozpustný vo vode, iní autori študovali rozpustné deriváty, ktoré sú založené hlavne na čiastočne deacetylovanom chitíne, napr. na chitozane. Pozri napr. P.A. Sanford a kol. (Eds.), Advances in Chitin & Chitosan (Pokroky v chitíne a chitozane) (1992). Hoci sa chitozan nachádza v niektorých hubách, biodegradabilný chitozan sa väčšinou vyrába synteticky. Pozri Mima a kol., J. Appl. Polym Sci. 28:1909-1917 (1983). Aby sa zmodifikovali charakteristické biologické in vivo vlastnosti polyméru, pripravili sa tiež syntetické deriváty chitozanu. Pozri Muzzarelli a kol., Carbohydrate Res. 207:199-214 (1980).

Použitie chitínu ako aj derivátov chitínu sa navrhlo pre rad systémov nosičov liečiv. Pozri napr. prihlášky európskych patentov č. 486,959, 482,649, 525,813 Al a 544,000 Al a patent USA č. 5,271,945.

Podstata vynálezu

Jeden aspekt predloženého vynálezu sa týka kopolyméru, ktorý zahrnuje N-acylovaný derivát poly(2-amino-2-deoxy-D-glukózy), v ktorom 1 až 50 percent voľných amínov poly(2amino-2-deoxy-D-gl'ikózy) je acylovaných prvou acylovou skupinou, pričom prvou acylovou skupinou je COEi, kde Ei je vybrané zo skupiny obsahujúcej karboxyalkyly C3.33, karboxyalkenyly C3.33, karboxyarylalkyly C7-39 a karboxyarylalkenyly C9.39, a 50 až 99 percent voľných amínov poly(2-amino-2-deoxy-D-glukózy) je acylovaných druhou acylovou skupinou, pričom druhá acylová skupina je COE₂, kde E₂ je vybrané zo skupiny obsahujúcej alkyly C1.30, alkenyly C₂-3o, arylalkyly Cfr.37 a arylalkenyly Cg.37, ža predpokladu, že aspoň jeden z voľných amínov derivátu je acylovaný prvou acylovou skupinou a do 30 percent voľných hydroxy skupín uvedenej poly(2amino-2-deoxy-D-glukózy) je acylovaných prvou acylovou skupinou alebo druhou acylovou skupinou.

Kopolymér má výhodne molekulovú hmotnosť okolo 3 000 až 90 000 daltonov, ako sa stanovilo gélovou chromatografiou (GPC) alebo inou podobnou metódou. V ďalších výhodných praktických uskutočneniach sa viac než 90 percent voľných amínov poly(2-amino-2-deoxy-Dglukózy) acylovalo buď prvou acylovou skupinou alebo druhou acylovou skupinou. Výhodne 10 až 30 percent voľného amínu poly(2-amino-2-deoxy-D-glukózy) je acylovaných prvou acylovou skupinou. Niektoré z voľných hydroxy skupín (napr. 1 až 30 percent) derivátu môže byť acylovaných buď prvou acylovou skupinou alebo druhou acylovou skupinou.

Vo výhodnom praktickom uskutočnení má kopolymér vzorec:

v ktorom:

Ri, pre každú jednotlivú opakovanú jednotku, je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H;

Ri pre každú jednotlivú opakovanú jednotku, je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H;

R-, pre každú jednotlivú opakovanú jednotku, je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H;

R4 je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H;

Rs je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H;

Rfi je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H;

R7 je vybrané zo skupiny obsahujúcej COH a CH₂ORg;

Rg je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H;

n je 2 až 200; a pre 1 až 50 percent opakovaných jednotiek Ri je prvá acylová skupina a pre 50 až 99 percent opakovaných jednotiek Ri je druhá acylová skupina za predpokladu, že aspoň pre jednu z opakovaných jednotiek Ri je prvá acylová skupina.

Výrazy COEi a COE₂ znamenajú -C=O»Ei, resp. -C=O«E₂. Karboxyalkylový, karboxyalkenylový, karboxyarylalkylový a karboxyarylalkenylový substituent môže obsahovať 1 - 4 funkčné skupiny karboxylovej kyseliny. Príklady prvej acylovej skupiny zahrnujú, ale neobmedzujú sa iba na tieto, sukcinyl, 2-(Ci._3O alkyl)sukcinyl, 2-(C₂.₃₀ alkenyl)sukcinyl, maleyl, ftalyl, glutaryl a itakonyl. Príklady druhej acylovej skupiny zahrnujú, ale neobmedzujú sa iba na tieto, acetyl, benzoyl, propionyl a fenylacetyl.

Tento vynález sa tiež týka kompozície obsahujúcej vyššie uvedený kopolymér a polypeptid, pričom polypeptid pozostáva aspoň z jedného účinného ionogénneho amínu, v ktorom aspoň 50 hmotnostných percent polypeptidu prítomného v kompozícii je iónovo viazaných na polymér. Kompozícia obsahuje výhodne 5 až 50 hmotnostných percent polypeptidu.

Príkladmi vhodných polypeptidov sú peptid uvoľňujúci rastový hormón (GHRP), hormón uvoľňujúci luteinizujúci hormón (LHRH), somatostatín, bombezín, peptid uvoľňujúci gastrín (GRP), kalcitonín, bradykinín, galanín, hormón stimulujúci melanocyty (MSH), faktor uvoľňujúci rastový hormón (GRF), rastový hormón (GH), amylín, tachykiníny, sekretín, paratyroidný hormón (PTH), enkafelín, endotelín, peptid uvoľňujúci kalcitoninový gén (CGRP), neuromedíny, proteín príbuzný paratyroidnému hormónu (PTHrP), glukagón, neurotenzín, adrenokortikotropný hormón (ACTH), peptid YY (PYY), peptid uvoľňujúci glukagón (GLP), vazoaktívny intestinálny peptid (VIP), peptid aktivujúci adenylátovú cyklázu hypofýzy (PACAP), motilin, substancia P, neuropeptid Y (NPY), TSH a ich biologicky aktívne analógy. Pojem biologicky aktívne analógy sa tu používa na označenie prirodzene sa vyskytujúcich, rekombinantných a syntetických peptidov, polypeptidov a proteinov, ktoré majú fýziologickú alebo terapeutickú aktivitu. Vo všeobecnosti tento pojem zahrňuje všetky fragmenty alebo deriváty peptidu, proteínu alebo polypeptidu, ktoré vykazujú kvalitatívne podobný agonistický alebo antagonistický účinok, aký má pôvodný alebo prirodzene sa vyskytujúci peptid, proteín alebo polypeptid, napr. také, v ktorých jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov nachádzajúcich sa v prírodných látkach je substituovaný alebo vylúčený, alebo v ktorých N- alebo C-terminálne zvyšky sa štruktúrne modifikovali. Pojem účinný ionogénny amín označuje voľný amín nachádzajúci sa na polypeptide, ktorý má schopnosť vytvárať iónovú väzbu s voľnými karboxylovými skupinami na kopolymére.

Uvoľňovanie polypeptidu z kompozície sa môže modifikovať zmenou chemickej štruktúry kompozície. Zvýšenie molekulovej hmotnosti polyméru zníži rýchlosť uvoľňovania peptidu z konjugátu. Zvýšenie počtu skupín karboxylovej kyseliny na polymére zvýši množstvo polypeptidu iónovo viazaného v kompozícii, v dôsledku čoho sa zvýši množstvo uvoľňovaného peptidu z konjugátu.

Uvoľňovanie peptidu sa môže ďalej ovplyvňovať (a) pôsobením rozpustných solí dvojmocných alebo viacmocných kovových iónov so slabými kyselinami (napr. vápnika, železa, horčíka alebo zinku) na kompozíciu; (b) obalením častíc tenkou absorbovateľnou vrstvou glykolidového kopolyméru alebo silikónového oleja v guľovitej, valcovitej alebo planárnej konfigurácii; alebo (c) mikrokapsuláciou kompozície do absorbovateľného glykolidového kopolyméru. V jednom praktickom uskutočnení vynálezu obsahuje kompozícia 0,01 až 20 hmotnostných percent viacmocného kovu.

V závislosti od výberu polypeptidu sa môžu tieto kompozície použiť na liečbu radu ochorení. Napríklad sa ukázalo, že somatostatín, bombezín, GRP, LHRH a ich analógy liečia rozličné formy rakoviny. Rastové faktory, ako sú GH, GRF a GHRP a ich analógy, vykazujú podporu rastu u adolescentov aj u starších ľudí. Ukázalo sa tiež, že kalcitonín, amylín, PTH a PTHrP a ich analógy liečia osteoporózu a iné kostné ochorenia.

.Ί

Kompozície sú určené na parenterálne podávanie, napr. intramuskulárne, subkutánne, intradurálne alebo intraperitoneálne injekcie. Výhodne sa kompozície podávajú intramuskulárne.

Kompozície podľa predloženého vynálezu môžu byť vo forme prášku alebo mikročastíc podávaných ako suspenzia s farmaceutický prijateľným nosičom (napr. voda s nosnou substanciou, ako je manitol alebo polysorbát, alebo bez nej). Kompozície sa tiež môžu pripraviť vo forme tyčinky na parenterálnu implantáciu s použitím trokáru, napr. ako intramuskulárny implantát.

Dávkovanie kompozície podľa predloženého vynálezu pri liečbe vyššie uvedených chorôb alebo porúch sa mení v závislosti od spôsobu podávania, veku a telesnej hmotnosti subjektu, stavu liečeného subjektu, pričom konečné rozhodnutie urobí ošetrujúci lekár alebo veterinár. Takéto množstvo kompozície, ktoré určí ošetrujúci lekár alebo veterinár, sa tu označuje ako terapeuticky účinné množstvo.

Iný aspekt predloženého vynálezu sa týka spôsobu syntézy kopolyméru, pričom tento spôsob zahrnuje nasledujúce kroky: reakciu chitozanu so slabou kyselinou za vzniku polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou; reakciu 1 až 50 percent voľných amínov polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou s prvým acylačným činidlom, pričom prvé acylačné činidlo je vybrané zo skupiny obsahujúcej polykarboxyalkány C4-C34, polykarboxyalkény C4-C34, polykarboxyarylalkány C8-C40, polykarboxyarylalkény C10-C40 alebo ich acylačné deriváty; a reakciu 50 až 100 percent voľného amínu polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou s druhým acylačným činidlom, pričom druhé acylačné činidlo je vybrané zo skupiny obsahujúcej monokarboxyalkány C2-31, monokarboxyalkény C3.31, monokarboxyarylalkány C7.38, monokarboxyarylalkény C9.35 alebo ich acylačné deriváty. Priebeh reakcie polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou s prvým aj s druhým acylačným činidlom je možné merať činidlom na detekciu amínov (napr. fluorescamín), čím sa zabezpečí, že 1 až 50 percent voľných amínov polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou sa acyluje prvým acylačným činidlom a 50 až 99 percent voľných amínov polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou sa acyluje druhým acylačným činidlom. Pozri napr. P.D. Bailey, An Introduction to Peptide Chemistry (Úvod do chémie peptidov), Wiley, NY (1990); H. Oppenheimer a kol., Archives Biochem. Biophys. 120:108-118 (1967); S. Stein, Árch. Biochem. Biophys. 155:203-212 (1973).

Reakciou chitozanu so slabou kyselinou (napr. kyselinou dusitou) sa polymér štiepi, čím sa znižuje jeho molekulová hmotnosť (napr. 2 500 - 80 000 daltonov). Vo výhodnom praktickom uskutočnení prvá acylačná skupina a druhé acylačné činidlo sa nechajú reagovať s polysacharidom s nižšou molekulovou hmotnostou postupne, t. j. bud prvé acylačné činidlo sa nechá reagovať pred druhým acylačným činidlom alebo druhé acylačné činidlo sa nechá reagovať pred prvým acylačným činidlom, alebo obe reakcie prebiehajú súčasne. Pri acylácii voľných amínov sa môžu acylovať aj niektoré voľné hydroxy skupiny polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou. Rozsah acylácie voľných hydroxy skupín sa môže meniť zmenou pH alebo rozpúšťadiel alebo činidiel použitých pri acylačných reakciách alebo použitých acylačných činidiel.

Príklady acylačných derivátov zahrnujú, ale neobmedzujú sa iba na tieto, anhydridy a Nacetylované heterocykly (napr. imidazoly a pyrazoly). Pozri napr. Bodansky a kol., The Practice of Peptide Synthesis (Praktická syntéza peptidov), s. 87-150, Springer Verlag (1984). Polykarboxyalkánové, polykarboxyalkénové, polykarboxyarylalkánové a polykarboxyarylalkénové činidlá alebo ich acylačné deriváty obsahujú alebo vznikajú z reaktantov obsahujúcich 2-5 funkčných skupín karboxylovej kyseliny. Monokarboxyalkánové, monokarboxyalkénové, monokarboxyarylalkánové a monokarboxyarylalkénové substituenty obsahujú alebo vznikajú z reaktantov obsahujúcich len jednu skupinu karboxylovej kyseliny. Príklady prvého acylačného činidla zahrnujú, ale neobmedzujú sa iba na tieto, sukcínanhydrid, 2-(alkyl C|.3o)sukcínanhydrid, 2-(alkenyl C₂.3o)sukcínanhydrid, maleínanhydrid, glutaranhydrid, itakonanhydrid a ftalanhydrid. Príklady druhého acylačného činidla zahrnujú, ale neobmedzujú sa iba na tieto, acetanhydrid, benzoanhydrid, N,N'-diacetyl-3,5-dimetylpyrazol, Ν,Ν'-diacetylimidazol, fenylacetanhydrid, propionanhydrid a butyranhydrid.

w

Ďalší aspekt predloženého vynálezu sa týka spôsobu syntézy kompozície, ktorý zahrnuje nasledujúce kroky: reakciu chitozanu so slabou kyselinou za vzniku polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou; reakciu 1 až 50 percent voľných amínov polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou s prvým acylačným činidlom, pričom prvé acylačné činidlo je vybrané zo skupiny obsahujúcej polykarboxyalkány C4-C34, polykarboxyalkény C4-C34, polykarboxyarylalkány Cg-C₄o, polykarboxyarylalkény C10-C40 alebo ich acylačné deriváty; reakciu 50 až 100 percent voľného amínu polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou s druhým acylačným činidlom, pričom druhé acylačné činidlo je vybrané zo skupiny obsahujúcej monokarboxyalkány C₂.3i, monokarboxyalkény C3.31, monokarboxyarylalkány C7.38, monokarboxyarylalkény C9.35 alebo ich acylačné deriváty; neutralizáciu acylovaného polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou zásadou; a zmiešanie zneutralizovaného acylovaného polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou so soľou polypeptidu, kde soľ peptidu obsahuje aspoň jeden ionogénny amín, čím sa vytvorí iónový konjugát polypeptid-kopolymér.

V neutralizačnom kroku sa výhodne získa polysacharid nižšou molekulovou hmotnosťou, ktorý je emulgovateľný alebo je rozpustný vo vode. Zásada je vo výhodnom praktickom uskutočnení anorganickou zásadou (napr. hydroxid sodný). Soľ polypeptidu je výhodne soľou slabej kyseliny (napr. acetát, laktát alebo citrát). Iónový konjugát sa môže oddeliť filtráciou alebo odstredením výslednej zmesi.

Iónové konjugáty podľa predloženého vynálezu sa dajú ľahko pripraviť ako mikroguľôčky alebo mikročastice vhodné pre injekcie a ako fólie a tyčinky, ktoré možno implantovať, pričom netreba využívať postupy spracovania do viacfázových emulzií. Mikročastice sa výhodne vyrábajú (a) rozpustením kompozície v aprotickom, s vodou sa miešajúcom organickom rozpúšťadle; (b) zmiešaním organického rozpúšťadla s vodou; a (c) oddelením mikročastíc od vody. Vo výhodnom praktickom uskutočnení je organické rozpúšťadlo vybrané zo skupiny obsahujúcej acetón, acetonitril, tetrahydrofurán, dimetylformamid a dimetyletylénglykol.

w ι I

Ďalšie stránky a výhody predloženého vynálezu budú zrejmé z jeho podrobného opisu na príkladoch uskutočnenia a z patentových nárokov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Syntéza a použitie kopolyméru a kopolymér-polypeptidového iónového konjugátu podľa predloženého vynálezu nepredstavuje žiadny problém pre osobu s bežnou praxou v príslušnej problematike. Ak nie je uvedené ináč, všetky tu použité technické a vedecké pojmy majú taký význam, pod akým ho bežne chápu osoby s bežnou praxou v problematike, do ktorej tento vynález patrí. Taktiež všetky publikácie, prihlášky vynálezov, patenty a iné tu uvedené odkazy sú tu zaradené ako odkaz.

Predpokladá sa, že osoba s praxou v problematike na základe uvedeného opisu môže využiť tento vynález v jeho plnej šírke. Nasledujúce jednotlivé praktické uskutočnenia je preto treba chápať len ako ilustráciu a nepredstavujú v žiadnom smere obmedzenie vynálezu.

Príklad 1: Depolymerizácia chitozanu

Chitozan (Protan, Inc., Portsmouth, NH) sa rozpustí vo vodnom roztoku kyseliny octovej miešaním mechanickým miešadlom počas jedného dňa. Cez roztok sa nechá prebublávať plynný dusík a zároveň sa pridáva vodný roztok dusitanu sodného. Po pol hodine sa roztok prefiltruje cez lievik so sklenenou fritou za zníženého tlaku, aby sa odstránili nerozpustné častice, ktoré sú prítomné v pôvodnom roztoku chitozanu. K prefiltrovanému roztoku sa pridá vodný roztok NaOH a roztok sa intenzívne mieša v metanole, čím sa vyzráža polymér. Výsledná zrazeB nina sa potom odfiltruje a striedavo premyje päťkrát vodou a metanolom. Zrazenina sa potom • suší dva dni vo vákuovej sušiarni pri 60 °C. Depolymerizovaný chitozan obsahuje na jednom konci reťazca aldehydickú skupinu. Aldehydická koncová skupina sa môže zredukovať na primárnu hydroxylovú skupinu reakciou s NaBH4. Depolymerizovaný produkt sa môže analyzovať gélovou chromatografiou (GPC), pričom sa určí jeho molekulová hmotnosť, ako aj distribúcia molekulovej hmotnosti (MWD) v porovnaní s Pullulanovým referenčným štandardom. Na stanovenie rozsahu N-acetylácie depolymerizovaného produktu sa môžu použiť štúdie NMR (jadrovou magnetickou rezonanciou) a ER. (infračervenou spektroskopiou).

v

Príklad 2: Čiastočná sukcinylácia depolymerizovaného chitozanu

Depolymerizovaný chitozan z príkladu 1 sa rozpustí v 0,1 M vodnom roztoku kyseliny octovej. K tomuto roztoku sa pridá metanol a potom roztok sukcínanhydridu v acetóne. Výsledný roztok sa mieša 24 hodín pri izbovej teplote. Po ukončení sukcinylácie sa roztok vyzráža vo vodnom roztoku acetónu. Výsledná zrazenina sa oddelí odstredením a premyje sa päťkrát metanolom. Zrazenina sa potom rozpustí v 0,5 M KOH a dialyzuje sa oproti vode na pH 7. Dialyzovaný roztok sa potom skoncentruje pri zníženom tlaku, vyzráža sa vodným roztokom acetónu a vysuší sa vo vákuovej sušiarni pri 60 °C.

K tomu, aby sa dosiahla rozličná úroveň sukcinylácie, počas priebehu acylácie sa môže sledovať rozsah reakcie na základe analýzy množstva neacylovaných amínových skupín. Množstvo neacylovaných amínových skupín sa môže stanoviť zreagovaním odobratej vzorky reakčnej zmesi s činidlom na detekciu amínu (napr. s fluorescamínom). Množstvo prítomného amínu sa môže merať spektroforeticky s použitím štandardnej krivky pre kopolymér. Naviac sa teda následne môže pridať sukcínanhydrid, až kým sa dosiahne požadovaný percentuálny podiel acylácie. Presný stupeň sukcinylácie prečisteného produktu je možné určiť s použitím *H NMR spektroskopie a konduktometrickou titráciou.

Príklad 3: Acetylácia N-sukcinylovaného chitozanu

Čiastočne sukcinylovaná vzorka z príkladu 2 sa rozpustí v 0,1 M vodnom roztoku kyseliny octovej. K tomuto roztoku sa potom pridá metanol a acetanhydrid a reakčná zmes sa mieša jeden deň pri izbovej teplote. Roztok sa potom vyzráža vodným roztokom acetónu. Výsledná zrazenina sa oddelí odstredením a premyje sa päťkrát metanolom. Zrazenina sa potom rozpustí v 0,1 N KOH a dialyzuje sa oproti vode do pH 7. Výsledný roztok sa lyofilizuje, čím sa získa výsledný produkt. Postup acylácie sa môže merať spektroforeticky, ako sa diskutuje v príklade 2, a presný stupeň acylácie vyčisteného produktu sa môže určiť *H NMR spektroskopiou a konduktometrickou titráciou.

I

Príklad 4: Príprava iónového konjugátu poly(N-acyl-D-glukózamín)-peptid

Draselná soľ N-sukcinylovaného chitozanu z príkladu 3 sa rozpustí vo vode. K miešanému roztoku polyméru sa pridá vodný roztok octanovej soli polypeptidového analógu somatostatínu SOMATULINE™ (D-Nal-c[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; Kinerton, Dublin, Írsko). Tvorí sa zrazenina, ktorá sa odfiltruje a vysuší vo vákuovej sušiarni pri 40 °C.

Obsah polypeptidu vo výslednom iónovom konjugáte sa môže určiť z rozdielu medzi množstvom pridaného východiskového peptidu a množstvom voľného zvyšného peptidu, ktorý sa nachádza vo filtráte a v premývacom roztoku. Obsah peptidu vo výslednom iónovom konjugáte sa môže stanoviť porovnaním pomeru uhlík/dusík vo východiskovom N-sukcinylovanom chitozane a vo výslednom iónovom konjugáte. Na stanovenie molekulovej hmotnosti a MWD sa môže použiť analýza s GPC, na určenie tepelných vlastností diferenciálna kalorimetria (DSC) a na chemickú identifikáciu NMR a IR.

Rozumie sa, že i keď je vynález charakterizovaný spoločne s jeho podrobným opisom, predchádzajúci opis je určený len na ilustráciu a neobmedzuje rozsah vynálezu, ktorý je určený rozsahom pripojených patentových nárokov. Ďalšie stránky, výhody a modifikácie sú v patentových nárokoch.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kopolymér zahrnujúci acylovaný derivát poly(2-amino-2-deoxy-D-glukózy), v ktorom 1 až 50 percent voľných aminov uvedenej poly(2-amino-2-deoxy-D-glukózy) je acylovaných prvou acylovou skupinou, pričom uvedenou prvou acylovou skupinou je COEi, kde Ei je vybrané zo skupiny obsahujúcej karboxyalkyly C3.33, karboxyalkenyly C3.33, karboxyarylalkyly C7.39 a karboxyarylalkenyly C9.39, 50 až 99 percent voľných aminov uvedenej poly(2-amino-2-deoxyD-glukózy) je acylovaných druhou acylovou skupinou, pričom uvedená druhá acylová skupina je COE₂, kde E₂ je vybrané zo skupiny obsahujúcej alkyly C1.30, alkenyly C2-30, arylalkyly Ce-37 a aiylalkenyly Cg.37, za predpokladu, že aspoň jeden z voľných aminov uvedenej poly(2amino-2-deoxy-D-glukózy) je acylovaný uvedenou prvou acylovou skupinou a do 30 percent voľných hydroxy skupín uvedenej poly(2-amino-2-deoxy-D-glukózy) je acylovaných uvedenou prvou acylovou skupinou alebo uvedenou druhou acylovou skupinou.
2. Kopolymér podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený kopolymér má molekulovú hmotnosť asi 3 000 až 90 000 daltonov, ako sa stanovilo gélovou chromatografiou.
3. Kopolymér podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že vyše 90 percent uvedených voľných aminov uvedenej poly(2-amino-2-deoxy-D-glukózy) je acylovaných buď uvedenou prvou acylovou skupinou alebo uvedenou druhou acylovou skupinou.
4. Kopolymér podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že 10 až 30 percent uvedených voľných aminov uvedenej poly(2-amino-2-deoxy-D-glukózy) je acylovaných uvedenou prvou acylovou skupinou.
5. Kopolymér podľa nároku 1, v ktorom uvedený kopolymér má vzorec:

v ktorom:

Ri, pre každú jednotlivú opakovanú jednotku, je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H;

Rz. pre každú jednotlivú opakovanú jednotku, je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H;

R3, pre každú jednotlivú opakovanú jednotku, je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H;

R4 je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H; Rs je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H; R« je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H; R7 je vybrané zo skupiny obsahujúcej COH a CH₂OR«;

Re je vybrané zo skupiny obsahujúcej prvú acylovú skupinu, druhú acylovú skupinu a H; n je 2 až 200; a pre 1 až 50 percent uvedených jednotiek Ri je prvá acylová skupina a pre 50 až 99 percent uvedených opakovaných jednotiek Rj je druhá acylová skupina za predpokladu, že aspoň pre jednu z opakovaných jednotiek je Ri prvá acylová skupina.
6. Kopolymér podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedená prvá acylová skupina je COEj, kde Ei je karboxyalkyl C3-C33.
7. Kopolymér podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že uvedená prvá acylová skupina je sukcinyl.
8. Kopolymér podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že uvedená druhá acylová skupina je acetyl a R.7 je COH alebo CH₂OH.
9. Kompozícia obsahujúca uvedený kopolymér podľa nároku 1 a polypeptid, vyznačujúca sa tým, že uvedený polypeptid obsahuje aspoň jeden účinný ionogénny amín, kde aspoň 50 hmotnostných percent uvedeného polypeptidu prítomného v uvedenej kompozícii je iónovo viazaných na uvedený polymér.
10. Kompozícia podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že uvedená kompozícia obsahuje 5 až 50 hmotnostných percent uvedeného polypeptidu.
11. Kompozícia obsahujúca uvedený kopolymér podľa nároku 5 a polypeptid, vyznačujúca sa tým, že uvedený polypeptid obsahuje aspoň jeden účinný ionogénny amín, kde aspoň 50 hmotnostných percent uvedeného polypeptidu prítomného v uvedenej kompozícii je iónovo viazaných na uvedený kopolymér.
12. Kompozícia podľa nároku 11, vyznačujúca sa tým, že uvedená kompozícia obsahuje 5 až » 50 hmotnostných percent uvedeného polypeptidu.

*
13. Kompozícia podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že uvedený polypeptid je somatostatín alebo analóg somatostatínu.
14. Kompozícia podľa nároku 10, vyznačujúca sa tým, že uvedená prvá acylová skupina je sukcinyl a druhá acylová skupina je acetyl.
15. Spôsob syntézy kopolyméru, vyznačujúci sa tým, že tento spôsob zahrnuje nasledujúce kroky:

reakciu chitozanu so slabou kyselinou za vzniku polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou;

reakciu 1 až 50 percent voľných amínov uvedeného polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou s prvým acylačným činidlom, pričom uvedené prvé acylačné činidlo je vybrané zo skupiny obsahujúcej polykarboxyalkány C4-C34, polykarboxyalkény C4w C34, polykarboxyarylalkány Cg-C₄o, polykarboxyarylalkény C10-C40 alebo ich acylač** né deriváty; a * reakciu 50 až 100 percent voľného amínu uvedeného polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou s druhým acylačným činidlom, pričom uvedené druhé acylačné činidlo je vybrané zo skupiny obsahujúcej monokarboxyalkány C2-31, monokarboxyalkény C3.31, monokarboxyarylalkány C7.38, monokarboxyarylalkény C9.33, alebo ich acylačné deriváty.
16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že percentuálny podiel uvedených voľných amínov, ktoré sa acylujú, sa stanoví s použitím činidla na detekciu voľného amínu.
17. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedené prvé acylačné činidlo je suk* cínanhydrid, uvedené druhé acylačné činidlo je acetanhydrid a uvedenou slabou kyselinou je « kyselina dusitá.

*
18. Spôsob syntézy kompozície, vyznačujúci sa tým, že tento spôsob zahrňuje nasledujúce kroky:

reakciu chitozanu so slabou kyselinou za vzniku polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou;

reakciu 1 až 50 percent voľných amínov uvedeného polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou s prvým acylačným činidlom, pričom uvedené prvé acylačné činidlo je vybrané zo skupiny obsahujúcej polykarboxyalkány C4-C34, polykarboxyalkény C₄15

C34, polykarboxyarylalkány C8-C40, polykarboxyarylalkény C10-C40 alebo ich acylačné deriváty;

reakciu 50 až 100 percent voľného amínu uvedeného polysacharidu s nižšou molekulovou hmotnosťou s druhým acylačným činidlom, pričom uvedené druhé acylačné činidlo je vybrané zo skupiny obsahujúcej COOH, monokarboxyalkány C2-31, monokarboxyalkény C3.31, monokarboxyarylalkány C7-3S, monokarboxyarylalkény C9.35, alebo ich acylačné deriváty; neutralizáciu uvedeného acylovaného polysacharidu s _w nižšou molekulovou hmotnosťou zásadou; a * zmiešanie uvedeného zneutralizovaného acylovaného polysacharidu s nižšou molekulo* vou hmotnosťou so soľou polypeptidu, kde uvedená soľ polypeptidu obsahuje aspoň jeden ionogénny amín, čím vznikne iónový konjugát polypeptid-kopolymér.
19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že percentuálny podiel uvedených voľných amínov, ktoré sa acylujú, sa stanoví s použitím činidla na detekciu voľného amínu.

I
20. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že uvedené prvé acylačné činidlo je sukcínanhydrid, uvedené druhé acylačné činidlo je acetanhydrid a uvedená slabá kyselina je kyselina dusitá.