SI9520093A - Process for manufacture of a modified collagen-induced platelet aggregation inhibitor pallidipin. - Google Patents
Process for manufacture of a modified collagen-induced platelet aggregation inhibitor pallidipin. Download PDFInfo
- Publication number
- SI9520093A SI9520093A SI9520093A SI9520093A SI9520093A SI 9520093 A SI9520093 A SI 9520093A SI 9520093 A SI9520093 A SI 9520093A SI 9520093 A SI9520093 A SI 9520093A SI 9520093 A SI9520093 A SI 9520093A
- Authority
- SI
- Slovenia
- Prior art keywords
- pallidipin
- asp
- protein
- seq
- amino acid
- Prior art date
Links
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 title claims abstract description 40
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 title claims abstract description 40
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 108010077752 pallidipin Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 101000783577 Dendroaspis angusticeps Thrombostatin Proteins 0.000 title description 3
- 101000783578 Dendroaspis jamesoni kaimosae Dendroaspin Proteins 0.000 title description 3
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 title description 3
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 146
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 142
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 140
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 60
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 34
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 27
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 19
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 15
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 11
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 10
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims 2
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NONSEUUPKITYQT-BQBZGAKWSA-N Arg-Asn-Gly Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N)CN=C(N)N NONSEUUPKITYQT-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- BJDHEININLSZOT-KKUMJFAQSA-N Asp-Tyr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O BJDHEININLSZOT-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- UWXFFVQPAMBETM-ZLUOBGJFSA-N Cys-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O UWXFFVQPAMBETM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- JIVJQYNNAYFXDG-LKXGYXEUSA-N Cys-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JIVJQYNNAYFXDG-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 3
- IRKLTAKLAFUTLA-KATARQTJSA-N Cys-Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CS)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O IRKLTAKLAFUTLA-KATARQTJSA-N 0.000 description 3
- IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N IVGJYOOGJLFKQE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- MFYLRRCYBBJYPI-JYJNAYRXSA-N Glu-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O MFYLRRCYBBJYPI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- RMWAOBGCZZSJHE-UMNHJUIQSA-N Glu-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RMWAOBGCZZSJHE-UMNHJUIQSA-N 0.000 description 3
- 241000545744 Hirudinea Species 0.000 description 3
- DLFAACQHIRSQGG-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DLFAACQHIRSQGG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- QESXLSQLQHHTIX-RHYQMDGZSA-N Leu-Val-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QESXLSQLQHHTIX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- LMMBAXJRYSXCOQ-ACRUOGEOSA-N Lys-Tyr-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O LMMBAXJRYSXCOQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 3
- MDDUIRLQCYVRDO-NHCYSSNCSA-N Lys-Val-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MDDUIRLQCYVRDO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N Thr-Gly-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 3
- MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N 0.000 description 3
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 3
- NMPXRFYMZDIBRF-ZOBUZTSGSA-N Val-Asn-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N NMPXRFYMZDIBRF-ZOBUZTSGSA-N 0.000 description 3
- FRUYSSRPJXNRRB-GUBZILKMSA-N Val-Cys-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N FRUYSSRPJXNRRB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- AHHJARQXFFGOKF-NRPADANISA-N Val-Glu-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N AHHJARQXFFGOKF-NRPADANISA-N 0.000 description 3
- AEMPCGRFEZTWIF-IHRRRGAJSA-N Val-Leu-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O AEMPCGRFEZTWIF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 3
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 108010019832 glycyl-asparaginyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 108010033670 threonyl-aspartyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- ZABMJSAHPWHMNM-QCOJBMJGSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-1-[2-[[(2s)-1-[(2s)-4-carboxy-2-[[2-[[(2s)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]butanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)CCC1 ZABMJSAHPWHMNM-QCOJBMJGSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KKJUPNGICOCCDW-UHFFFAOYSA-N 7-N,N-Dimethylamino-1,2,3,4,5-pentathiocyclooctane Chemical compound CN(C)C1CSSSSSC1 KKJUPNGICOCCDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N Ala-Thr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O YNOCMHZSWJMGBB-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- HILMIYALTUQTRC-XVKPBYJWSA-N Glu-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HILMIYALTUQTRC-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 2
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N Gly-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCCN VEPBEGNDJYANCF-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 2
- AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N Gly-Val-Thr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AFMOTCMSEBITOE-YEPSODPASA-N 0.000 description 2
- SYPULFZAGBBIOM-GVXVVHGQSA-N His-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N SYPULFZAGBBIOM-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- BJECXJHLUJXPJQ-PYJNHQTQSA-N Ile-Pro-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N BJECXJHLUJXPJQ-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 2
- PXHCFKXNSBJSTQ-KKUMJFAQSA-N Lys-Asn-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O PXHCFKXNSBJSTQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N Lys-Pro-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MIROMRNASYKZNL-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N Pro-Lys-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Lys Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O CSNBWOJOEOPYIJ-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 2
- ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N Val-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010055353 lysyl-prolyl-glycyl-glutamyl-prolyl-glycyl-prolyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- SSZGOKWBHLOCHK-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N SSZGOKWBHLOCHK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HCAUEJAQCXVQQM-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- JPPLRQVZMZFOSX-UWJYBYFXSA-N Asn-Tyr-Ala Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JPPLRQVZMZFOSX-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- HOQGTAIGQSDCHR-SRVKXCTJSA-N Asp-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HOQGTAIGQSDCHR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PXLNPFOJZQMXAT-BYULHYEWSA-N Asp-Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PXLNPFOJZQMXAT-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N Asp-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HICVMZCGVFKTPM-BQBZGAKWSA-N Asp-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O HICVMZCGVFKTPM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- KABHAOSDMIYXTR-GUBZILKMSA-N Cys-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N KABHAOSDMIYXTR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- PKYAVRMYTBBRLS-FXQIFTODSA-N Glu-Cys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PKYAVRMYTBBRLS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DWBBKNPKDHXIAC-SRVKXCTJSA-N Glu-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O DWBBKNPKDHXIAC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CBEUFCJRFNZMCU-SRVKXCTJSA-N Glu-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CBEUFCJRFNZMCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XQHSBNVACKQWAV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N Gly-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN KGVHCTWYMPWEGN-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- DNVDEMWIYLVIQU-RCOVLWMOSA-N Gly-Val-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DNVDEMWIYLVIQU-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000237902 Hirudo medicinalis Species 0.000 description 1
- RXVOMIADLXPJGW-GUBZILKMSA-N His-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RXVOMIADLXPJGW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GNRPTBRHRRZCMA-RWMBFGLXSA-N Leu-Met-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N GNRPTBRHRRZCMA-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 1
- JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N Lys-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O JPNRPAJITHRXRH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- YWJQHDDBFAXNIR-MXAVVETBSA-N Lys-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N YWJQHDDBFAXNIR-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- WBSCNDJQPKSPII-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WBSCNDJQPKSPII-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- XIGAHPDZLAYQOS-SRVKXCTJSA-N Met-Pro-Pro Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 XIGAHPDZLAYQOS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 206010050661 Platelet aggregation inhibition Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FDINZVJXLPILKV-DCAQKATOSA-N Pro-His-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FDINZVJXLPILKV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LPGSNRSLPHRNBW-AVGNSLFASA-N Pro-His-Val Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C([O-])=O)NC(=O)[C@H]1[NH2+]CCC1)C1=CN=CN1 LPGSNRSLPHRNBW-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N Pro-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- SHTKRJHDMNSKRM-ULQDDVLXSA-N Pro-Tyr-His Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)O SHTKRJHDMNSKRM-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- DCLBXIWHLVEPMQ-JRQIVUDYSA-N Thr-Asp-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 DCLBXIWHLVEPMQ-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- GDPDVIBHJDFRFD-RNXOBYDBSA-N Trp-Tyr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O GDPDVIBHJDFRFD-RNXOBYDBSA-N 0.000 description 1
- ABSXSJZNRAQDDI-KJEVXHAQSA-N Tyr-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ABSXSJZNRAQDDI-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 1
- XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N Val-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- CPGJELLYDQEDRK-NAKRPEOUSA-N Val-Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CPGJELLYDQEDRK-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N Val-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- 101710099833 Venom protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000879 anti-atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000006328 chemical modification of amino acids Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N glycylvaline Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN STKYPAFSDFAEPH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108010000867 moubatin Proteins 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001175 peptic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 108010081580 platelet adhesion inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 101150075675 tatC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002446 thrombocytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
POSTOPEK ZA IZDELAVO MODIFICIRANEGA, S KOLAGENOM
INDUCIRANEGA, TROMBOCITNEGA AG REG ACI J SKEGA INHIBITORJA
PALLIDIPINA
Izum se nanaša na postopek izdelave modificiranega, s kolagenom inuciranega, trombocitnega agregacijskega inhibitorja, imenovanega Pallidipin. Nadalje izum vključuje snov Pallidipin, ki je modificirana.
Kolagen je najmočnejši znani povzročitelj trombocitne agregacije pri ljudeh. Na primer, po poškodbi stene krvne žile in izpostavitvi kolagenu, se krvni trombociti hitro vežejo in postanejo aktivirani. (H.R. Baumgartner (1977) Thromb. Haemostas. 37:1-16; J. Hawiger (1987) Human Pathol. 18:111122.)
S kolagenom inducirana, trombocitna agregacija človeških trombocitov, tako predstavlja rizičen faktor za bolnike, ki prestajajo postopke, ki se nanašajo na krvne žile, med drugim npr. angioplastijo ali sepse, za tiste, ki trpijo miokardijski infarkt in za tiste, ki okrevajo po zdravljenju miokardijskega infarkta.
V nekaterih primerih je nujno inhibirati, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo. Znano je, da nekatere spojine inhibirajo tako agregacijo. Na primer, sintetični oligopeptidi inhibirajo, s kolagenom inducirano trombocitno agregacijo, z vezanjem na trombocite. Glej npr. Bevers s sod. (1985) Collagen Derived Octapeptide Inhibits Platelet Procoagulant Activity Induced by the Combined Action of Collagen and Thrombin, Thrombosis Research, 37:365-370; Karniguian s sod. (1983) Effect of a Collagen Derived Octapeptide on Different Steps of the
-2Platelet/Collagen Interaction, Thrombosis Research 32:593-604; Caen s sod. (1981) Oligopeptides with specific inhibiting properties of collageninduced aggregation, process for preparing the same and pharmaceutical compositions containing them; in EPA 0 040 149.
Drug vir, s kolagenom induciranega, trombocitnega agregacijskega inhibitorja je inhibitor, identificiran v kačjem strupu, ki ima nepoznano sestavo. Glej Smith s sod., Identification of 50 kDalton snake venom proteins which specifically inhibit platelet adhesion to collagen. (1991) FEBS 283:307-310.
Tretjega takega inhibitorja iz sline zdravilnih pijavk je opisal Munro s sod. (1991) Calin - a platelet adhesion inhibitor from the šaliva of the medicinal leech, Blood Coagulation and Fibrinolysis 2:179-184. Objava evropske patentne prijave EP 0 480 651 (Merck & Co. inc., objavljena 15. aprila 1992) opisuje protein, ki ima molekularno težo približno 16 kDaltonov (kD) in sposobnost inhibirati, s kolagenom inducirano agregacijo človeških trombocitov, protein je dobljen iz žleze slinavke, pijavke Haemaenteria officinalis. LAPP je 16 kDa-ski protein iz pijavke Haemaenteria officinalis, opisan v Connolly s sod. (1992) J. Biol. Chem. 267:6893-6898. Glej tudi Moubatin, opisan v Waxman and Connolly (1993) J. Biol. Chem. 268:54455449.
Še druga vrsta s kolagenom inducirane, trombocitne agregacije je lahko izolirana iz insektov, kot je opisano v evropski objavi EP 0 530 937. Ti proteini so imenovani Pallidipini.
Alkalna fosfataza (APaza) je protein E. coli, ki je izločen v periplazmatski prostor. APaza je sintetizirana kot prokurzorski protein, ima 21-aminokislin
-3dolgo vodečo sekvenco, ki je odstrižena z vodečo peptidazo med potekom premestitve preko bakterijske notranje membrane v periplazmatski prostor (Y. Kikuchi s sod. (1981) Nucl. Acids Res. 9:5671-5678). Njegova biosinteza je regulirana s koncentracijo fosfata v hranilnem mediju in iznos produktov heterolognih genov, nameščenih vzdolž AP-aznega promotorja je dosežen z uporabljanjem nizkih koncentracij fosfata (C. Monteilhet s sod. (1993) Gene 125:223-228).
Naravni vir proteina Pallidipina je omejen. Postopki, ki uporabljajo biotehnološke metode, so logična rešitev za izdelovanje Pallidipina. Ekspresija Pallidipina v celicah ledvic mladičev hrčkov (EP 0 530 937), se dogaja pri hitrosti produkcije, ki bi morala biti povečana, da bi prišlo do ekspresije Pallidipina v industrijskih količinah. Zaradi tega je bil nujen izboljšan sistem ekspresije.
Tako je bila tu potreba za izboljšan postopek izdelave rekombinantnega Pallidipina, ki inhibira s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo in postopka, ki ima visok donos in omogoča reproducibilno izolacijo proteina, z visoko stopnjo čistosti. Nov postopek nebi smel negativno prizadeti biološke aktivnosti nastalega proteina Pallidipina.
Sedaj je bilo odkrito, da je problem lahko rešen, s postopkom izdelave rekombinantnega proteina Pallidipina (Asp-Pallidipina), v katerem AspPallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:
(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino,
-4v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;
s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence:
a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID ΝΟ.Ί; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;
ali
b) alelne variante ali modifikacije, ali muteine sekvenc, v vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelne variacije ali modifikacije ali muteini, bistveno ne prizadanejo aktivnosti proteina, ali
c) protein, po vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3 ali njihovih variantah ali muteinih omenjenih pod b), ki ima posttranslacijske modifikacije, ki bistveno ne prizadanejo aktivnosti izgrajenega proteina;
vključuje stopnje:
aa) transfektiranje vsaj ene bakterije s primernim vektorjem, pri čemer vektor vsebuje:
(i) DNA ali cDNA, ki kodira za rekombinantni Asp-Pallidipin (ii) ustrezno signalno peptidno sekvenco, katerega signalna sekvenca je tako razcepljena, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence, gledano iz pozicije Pallidipina in (iii) ustrezen promotor;
bb) izražanje predproteina, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno sekvenco;
-5cc) transportiranje Asp-Pallidipina iz bakterijske citoplazme v periplazmo, med transportom cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, proizvajanje Asp-Pallidipina, dd) izoliranje Asp-Pallidipina z ekstrahiranjem periplazme, in ee) čiščenje Asp-Pallidipina.
E. coli je hiter ekspresijski sistem za produkcijo heterolognih, npr. eukariotskih proteinov. Nepravilno zvijanje proteinov je med ekspresijo eukariotskih genskih produktov z E. coli pogosto problem, ki ima lahko za posledico zmanjšano aktivnost produktov ekspresije. Verjetnost pravilnega zvijanja proteinov je mnogo večja, kadar je protein transportiran v periplazmo celic E. coli, kot kadar je protein zadržan v citoplazmi. Transport proteinov v periplazmo je induciran s signalnimi peptidnimi sekvencami, nalepljenimi na izgrajene proteine; te signalne peptidne sekvence, skupaj z izgrajenimi proteinskimi sekvencami, so imenovane predproteini. Pravilna cepitev proteina med signalno peptidno sekvenco in izgrajenim proteinom je za ekspresijo izgrajenih, eukariotskih proteinov v E. coli nujna; sekvenca signalne sekvence in sekvenca izgrajenega proteina, imata vpliv na pravilno cepitev. Zaradi tega, niso vse signalne peptidne sekvence kompatibilne z vsemi kodirajočimi sekvencami.
Za alkalno fosfatazno signalno sekvenco E. coli je poznano, da je učinkovita za iznos proteinov. Toda poznano je, da kombinacija dane signalne peptidne sekvence in sekvence izgrajenega proteina, ne bo nujno imela za posledico dobrega proizvajanja predproteina.
-6Presenetljivo je bilo odkrito, da je dobitek inventivnega postopka izdelave 15-krat višji, kot dobitek ekspresijskega sistema, z uporabljanem ledvičnih celic mladičev hrčkov. Ti rezultati so prikazani v primerih. Funkcija in aktivnost Asp-Pallidipina, v primerjavi z eukariotskim ekspresijskim sistemom ledvice hrčka, z inventivnim postopkom nista negativno prizadeti. Nadaljna prednost je, da je proteaza (npr. vodeča peptidaza), nujna za cepitev predproteina, izdelana z E. coli samo.
Čiščenje izgrajenega Asp-Pallidipina je z uporabljanjem inventivnega postopka mnogo lažje, kot je čiščenje izraženih proteinov, izdelanih in shranjenih znotraj bakterijske citoplazme. Da se sprosti Asp-Pallidipin, akomuliran v periplazmi je zadosten že osmotski šok.
V prednostni izvedbeni obliki ima DNA nakodirane signalne peptidne sekvenčne kode za signalno sekvenco alkalne fosfataze (APaze), prednostno E. coli APaze.
Izum vsebuje postopek v katerem je vektor, za Asp-Pallidipin izuma, dobljen iz vektorja pSB94 (U. Boidol s sod. (1982) Mol. Gen. Genet. 185:510-512).
Nadaljni vidik izuma je vektor, kot je predhodno omenjeno in dodatno, ustrezen signalni peptid, ustrezen promotor in, če mora biti, ustrezen pospeševalec. Vektorji so podrobno opisani v literaturi primerov in tudi v evropskih objavah EP 0 480 651; 0 462 632 in 0 173 177.
Bakterija E. coli je prednosten gostitelj. Ustrezni so tudi drugi mikroorganizmi, npr. Bacillus subtilis.
-7V dodatku, izum vsebuje rekombinantni protein Asp-Pallidipin, v katerem
Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje (i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina:
s čimer ima Asp-Pallidipin aminokislinske sekvence izbrane iz:
a) sekvenco izbrano iz aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;
ali
b) alelne variante ali modifikacije, ali muteina sekvence, SEQ ID NOS:1 do 3, katere alelna varianta ali modifikacija ali mutein ima bistveno isto aktivnost, kot Asp-Pallidipin SEQ ID NO:1 do 3;
ali
c) proteina, po SEQ ID NOS: 1 do 3 ali njihovih variantah ali muteinih, omenjenih pod b), ki ima posttranslacijske modifikacije, ki bistveno ne prizadanejo aktivnosti izgrajenega proteina.
Izum vsebuje tudi rekombinantni protein Asp-Pallidipin, v katerem AspPallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:
(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino,
-8v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;
s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence:
a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;
ali
b) alelne variante ali muteine sekvenc v vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelne variante ali muteini, bistveno ne prizadanejo aktivnosti proteina, ali
c) protein, po vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3 ali njihovih variantah ali muteinih omenjenih pod b), ki ima posttranslacijske modifikacije, ki bistveno ne prizadanejo aktivnosti izgrajenega proteina;
v katerem je Asp-Pallidipin proizveden s postopkom, ki vključuje stopnje:
aa) transfektiranje vsaj ene bakterije z ustreznim vektorjem, pri čemer vektor vsebuje izvedljivo povezavo:
(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinantni AspPailidipin, (ii) druga DNA molekula ima nekodirano ustrezno signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;
s čimer je, po ekspresiji, predprotein, ki vsebuje signalni peptid in AspPallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega Asp-Pallidipina,
-9bb) izražanje predproteina, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno peptidno sekvenco;
cc) transportirale Asp-Pallidipina iz bakterijske citoplazme v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, dd) izoliranje Asp-Pallidipina z ekstrahiranjem periplazme, in ee) čiščenje Asp-Pallidipina.
V nadaljni prednostni izvedbeni obliki je Asp-Pallidipin proizveden s postopkom, ki vključuje stopnje:
gojenje bakterije, transfektirane z ustreznim vektorjem, pri čemer vektor vsebuje izvedljivo povezavo:
(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinantni Asp-Pallidipin, (ii) druga DNA molekula ima nakodirano ustrezno signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;
s čimer je po ekspresiji protein, ki vsebuje signalni peptid in Asp-Pallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega Asp-Pallidipina, pod pogoji s katerimi je izražen predprotein, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno peptidno sekvenco, in je Asp-Pallidipin transportiran iz bakterijske citoplazme v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, in čiščenje Asp-Palidipina iz periplazme.
-10Prednosten je protein, v katerem je signalna peptična sekvenca, signalna sekvenca alkalne fosfataze (APaze), prednostno APaze E. coli.
Industrijska uporaba proteinov izuma je uporaba proteinov, kot farmacevtskega pripravka, ki vsebuje protein po izumu v povezavi s farmacevtsko sprejemljivim razredčilom ali nosilcem.
Alelne variacije ali modifikacije, kot je bilo prej omenjeno, vključujejo spremembo v sekvenci nukleotidov ali aminokislin, spremembo genotipa ali fenotipa. Vsaj en nukleotid ali ena aminokislina je lahko zamenjana (substituted), odstranjena (deleted) ali dodana (inserted).
Ni za pričakovati, da bo večina delecij, insercij in posebno substitucij, ustvarjala radikalne spremembe v značilnostih proteina izuma. Modificirani ali mutirani proteini, so po izumu lahko rutinsko narejeni in preiskani, zato da bi določili natančen učinek substitucije, delecije ali insercije, s primerjavo funkcij modificiranega ali mutiranega proteina z značilnimi funkcijami proteina izuma, npr. proteinov SEQ ID NOS:1 do 3, ali z naravnim Pallidipinom in s tem ugotavili, če ima spremenjen protein primerljivo aktivnost, npr. biološko aktivnost.
Genetska koda je degenerativna; to je, večina aminokislin je nakodiranih z več kot enim kodonom treh nukleotidov. Skladno, alelna variacija ali modifikacija v nukleotidni sekvenci sme ali pa ne sme spremeniti aminokislinske sekvence. Zato so alelne variacije primarno na DNA nivoju in lahko obstajajo tudi sekundarno, na nivoju aminokislinske sekvence.
DNA sekvenca, ki kodira za protein izuma je lahko modificirana z običajnimi tehnikami, da proizvaja variacije v končnem proteinu izuma, ki
-11ima še vedno v bistvu isto aktivnost, kot protein izuma, npr. Asp-Pallidipin SEQ ID NOS.1 do 3, ali kot primerjano z naravnim pallidipinskim proteinom. Aktivnost je merjena glede na primere. Tako je ena ali več aminokislin, npr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10... do 15 aminokislin lahko dodana, substituirana ali odstranjena, brez da bi bila bistveno prizadeta aktivnost proteina izuma. Substitucije so splošno lahko narejene skladno s sledečo tabelo 1, kadar je zaželjeno končno spremeniti aminokislinsko sekvenco proteina izuma.
Bistvene spremembe v delovanju ali imunološki identiteti, so narejene z izbiranjem substitucij, ki so manj konzervativne, kot te v tabeli 1, npr. izbiranjem ostankov, ki se bolj značilno razlikujejo v svojem učinku na vzdrževanje (a) strukture polipeptidne hrbtenice v področju substitucije, npr., kot plasti ali helične konformacije, (b) naboja ali hidrofobnosti molekule, ali (c) obsega končnih verig.
-12TABELA 1
NAVADNE SUBSTITUCIJE AMINOKISLIN V PROTEINU
| ORIGINALNI OSTANKI | PONAZORITVENE SUBSTITUCIJE |
| Ala | Gly, Ser |
| Arg | Lys |
| Asn | Gin, His |
| Asp | Glu |
| Cys | Ser |
| Gin | Asn |
| Glu | Asp |
| Giy | Ala, Pro |
| His | Asn, Gin |
| Ile | Leu, Val |
| Leu | Ile, Val |
| Lys | Arg, Gin, Glu |
| Met | Leu, Tyr, lie |
| Phe | Met, Leu, Tyr |
| Ser | Thr |
| Thr | Ser |
| Trp | Tyr |
| Tyr | Trp, Phe |
| Val | Ile, Leu |
Muteini so definirani s homologijo med dvema primerjanima proteinoma. Izraz homologija, obsega podobnosti aminokislin in vrzeli v obeh primerjanih sekvencah. Podobnost aminokislin je npr. definirana v tabeli 1. Prednostno muteini tega izuma, vsebujejo aminokislinsko sekvenco, ki ima vsaj 60% homologijo, bolj prednostno vsaj 80%, veliko bolj prednostno vsaj 90% in najbolj prednostno vsaj 95% homologijo s sekvenco enega od proteinov SEQ ID NOS:1 do 3.
S posttranslacijskimi variacijami, kot je omenjeno zgoraj, je mišljeno variacije med ali po translaciji, kot je tvorjenje disulfidnih mostičkov in kemične modifikacije aminokislin.
-13Proteini pogosto tvorijo kovalentne medverižne vezi. Te disulfidne vezi se tvorijo med cisteinskimi-SH aminokislinami in zvitim proteinom ali proteinom, ki se zvija med translacijo. Vezi stabilizirajo tridimenzionalno zgradbo proteina. Take disulfidne vezi so redko tvorjene v proteinskih molekulah, ki so še vedno v celičnem citosolu, zato ker visoka intracelularna koncentracija -SS-(disulfidnega) reducirajočega sredstva glutationa, cepi večino takih vezi. Ko so proteini enkrat zunaj citoplazme, so izločeni ali pa so na površini celice, pogosto tudi tvorijo dodatne, kovalentne, medverižne vezi.
Nadalje so lahko aminokisline spremenjene, kot je opisano v PCT prijavi WO 91/10684. Možne so tudi druge spremembe stranskih verig aminokislin.
Protein izuma ima čistost vsaj 40%, prednostno vsaj 60%, bolj prednostno vsaj 80% in najbolj prednostno vsaj 90%. Čistost je definirana s količino proteina izuma, glede na celotno količino proteina. Z uporabljanjem metod čiščenja, opisanih v primerih, niso mogli odkriti nobenih drugih proteinov, kot le proteine izuma.
Z uporabljanjem očiščenega proteina izuma, so lahko monoklonska protitelesa proizvedena po dobro znani Koehler in Milstein metodi, ki vključuje zlasti običajno imunizirane miši ali kunce, z očiščenim proteinom izuma, kot imunogenom, čemur sledi produkcija hibridomov iz celic miši ali kunca, ki proizvajajo protitelesa.
Prednostna izvedbena oblika izuma je protein, omenjen v SEQ ID NO:1, izražen v E. coli, sev E 15.
-14I Asp-Pallidipin kaže farmakološko aktivnost in se zato lahko uporablja, kot farmacevtski. Asp-Pallidipin je lahko uporabljen v farmacevtskem pripravku, ki vsebuje Asp-Pallidipin v povezavi s farmacevtsko sprejemljivim razredčilom ali nosilcem. Dodatno izum vključuje farmacevtski pripravek, ki vsebuje farmacevtsko aktiven Asp-Pallidipin po izumu in farmacevtsko sprejemljivo sol ali farmacevtsko sprejemljiv nosilec.
Asp-Pallidipin zlasti inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo in inhibira adhezijo tumorskih celic, prednostno metastaznih, tumorskih celic, na kolagen.
Asp-Pallidipin inhibira trombocitno agregacijo. Testni sistem je opisan v primerih. Asp-Pallidipin značilno inhibira trombocitno agregacijo pri koncentraciji 0.5 do 50 gg proteina. Po primerih najbolj prednosten AspPallidipin, protein SEQ ID ΝΟ.Ί, ima IC50, 50 nmol/L visoko očiščenega proteina. Asp-Pallidipin inhibira trombocitno agregacijo pri koncentracijah od 5 nmol/L do okoli 1,000 nmol/L.
/ Rezultati iz in vitro testnih sistemov kažejo, da so lahko proteini izuma
I uporabljeni, kot zdravilo ali pa so lahko uporabljeni za zdravniško zdravljenje. Testni rezultati za in vitro sistem so lahko korelirani z in vivo sistemom, zato ker je ta sistem na tem področju že uveljavljen. R.J. Shebuski s sod. (1990) Thrombosis and Haemostasis, 64:576-581.
Asp-Pallidipin se lahko da z intraperitonealnimi injekcijami, ki so lahko dane dnevno ali 2 do 3-krat na teden. Kadar živali prejmejo dnevne injekcije, da bi v krvi dosegli koncentracijo 100 nmol/L, je njihova trombocitna agregacija zmanjšana. Pod temi pogoji niso zabeležili nobenih resnih stranskih učinkov. Asp-Pallidipin povzroča to inhibicijo trombocitne
-15agregacije v miših pri dnevnih dozah, ki v krvi dosegajo koncentracijo od okoli 10 nmol/L do 1,000 nmol/L.
Asp-Pallidipin je zato uporaben za zdravljenje ateroskleroznih ali tromboznih bolezenskih poškodb ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta. Asp-Pallidipin je lahko uporabljen kot, antiaterosklerozno in antitrombozno sredstvo pri sesalcih, vključno ljudeh, npr., da zdravi aterosklerozne/trombozne poškodbe, nastale npr. zaradi pretrganja področij, kjer so stene arterij obložene ali tistih nastalih, zaradi perturbacije ali odstranitve endotela, npr. pri sepsah ali transplantih, ali da zdravi nestabilno angino (pektoris). Lahko se uporablja tudi za preprečevanje ponovnih zamašitev žil po zdravljenju miokardijskega infarkta s fibrinolizo ali z angioplastijo (PTCA). Če je fibrinolizna terapija (s streptokinazo, t-PA ali drugimi plazminogenimi aktivatorji), dana za zdravljenje miokardijskega infarkta je Asp-Pallidipin lahko uporabljen, kot koristno sredstvo za preprečevanje ponovne zamašitve krvne žile. Zdravljenje miokardijskega infarkta z balonskim katetrom (PTCA), tudi poškoduje steno žile in to lahko vodi do nastanka novega strdka. To je lahko preprečeno z dajanjem Asp-Pallidipina med in po postopku. AspPallidipin je lahko uporabljen v koronarni angioplastiji, kakor tudi pri drugih uporabah angioplastije.
Izum zagotavlja
a) uporabo proteina izuma za izdelavo ') zdravila, za zdravljenje aterosklerozne ali trombozne bolezni ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta (tako so proteini uporabni kot profilaktično učinkovita zdravila pri zdravljenje bolnikov, za
-16katere je znano, da so v nevarnosti, da se pri njih razvije bolezen ali pogoj zanjo);
b) metodo zdravljenja aterosklerozne ali trombozne bolezni ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta, ki vključuje dajanje učinkovite količine proteina izuma, da se zatre bolezen pri bolniku, ki potrebuje tako zdravljenje.
c) farmacevtski pripravek za zdravljenje aterosklerozne ali trombozne bolezni ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta, ki vsebuje protein izuma in farmacevtsko sprejemljiv nosilec ali razredčilo.
Za te potrebe se bo primerna doza seveda spreminjala, odvisno od, npr. uporabljene spojine izuma, gostitelja, načina dajanja in narave ter resnosti stanja, ki se ga zdravi. Vendar se je v splošnem pokazalo, da so zadovoljivi rezultati pri živalih, za dosego koncentracije v krvi od 10 do 1,000 nmol/L, bili dobljeni pri dnevnih dozah, prednostno pri dnevnih dozah od 30 do 300 nmol/L.
Proteini izuma so lahko dani po vsaki običajni poti, posebno enteralno ali parenteralno, npr. v obliki raztopin aii suspenzij, ki se jih lahko injicira. Prednostno je intraperitonealno injiciranje.
Protein SEQ ID NO:1 je prednostna spojina.
Pričujoči izum zagotavlja farmacevtske pripravke, ki vsebujejo spojine izuma, v povezavi z vsaj enim farmacevtskim nosilcem ali razredčilom. Taki pripravki so lahko izdelani na običajen način. Glej Remington’s
ΑΊPharmaceutical Science, 15th ed. Mačk Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980).
Proteini izuma tudi inhibirajo adhezijo metastaznih tumorskih celic na kolagen. Testni sistem je opisan v primerih. Proteini izuma kažejo značilno adhezijsko inhibicijo metastaznih tumorskih celic na kolagen, pri koncentraciji 1 do 100 pg proteina.
Test najbolj prednostnega proteina, proteina SEQ ID NOJ, po primerih 2 in 15 kaže vrednost IC5o, 100 nmol/L visoko očiščenega proteina. Proteini izuma kažejo adhezijsko inhibicijo metastaznih tumorskih celic na kolagen, pri koncentraciji od 10 do 2,000 nmol/L
Rezultati iz in vitro testnih sistemov kažejo, da so proteini izuma lahko uporabljeni kot zdravilo ali pa so lahko uporabljeni za medicinsko zdravljenje. Testni rezultati se lahko prenesejo iz in vitro sistema v in vivo sistem, ker je to uveljavljen sistem na tem področju. Chan s sod. (1990), Science, 2J 600-1602.
Proteini izuma so lahko dani med ali po kirurških operacijah primarnega tumorja, da se prepreči tvorjenje metastaz z izločitvijo tumorskih celic, ki lahko vstopijo v krvni tok med operacijo. Ti proti-metastazni učinki so lahko demonstrirani v “eksperimentalnem” in “spontanem” živalskem modelu, kot je opisal Chan s sod. (1990), Science, 2J600-1602.
Proteini izuma so lahko dani z intraperitonealnimi injekcijami, ki so dane dnevno ali 2 do 3-krat na teden. Kadar živali prejmejo dnevne injekcije, da se v krvi doseže koncentracija 200 nmol/L, imajo zmanjšano adhezijo metastaznih tumorskih celic, merjenih s štetjem vrednosti centrov usedenih
-18metastaznih celic. Pod temi pogoji, niso bili zabeleženi nobeni resni stranski učinki.
Proteini izuma pri miših kažejo to adhezijsko inhibicijo metastaznih tumorskih celic na kolagen pri dnevnih dozah, da se v krvi doseže koncentracija od 20 do 2,000 nmol/L, prednostno koncentracije od 60 do 600 nmol/L.
Proteini izuma so zato uporabni za zdravljenje raka, posebno raka z metastaznimi tumorskimi celicami, najbolj prednostno, raka z visoko metastaznimi tumorskimi celicami.
Izum tako zagotavlja
a) uporabo proteina izuma, za izdelavo zdravila, za zdravljenje raka z metastaznimi tumorskimi celicami (proteini so tako uporabni za profilaktično učinkovita zdravila dana pred, npr. kirurško odstranitvijo tumorjev);
b) metodo zdravljenja raka z metastaznimi tumorskimi celicami, ki vključuje dajanje učinkovite količine proteina izuma, da se zatre bolezen pri bolniku, ki potrebuje tako zdravljenje;
c) farmacevtski pripravek za zdravljenje raka z metastaznimi tumorskimi celicami, ki vsebuje protein izuma in farmacevtsko sprejemljiv nosilec ali razredčilo.
Za te potrebe se bo primerna doza seveda spreminjala, odvisno od, npr.
uporabljene spojine izuma, gostitelja, načina dajanja in narave ter resnosti stanja, ki se ga zdravi. Vendar se je v glavnem pokazalo, da so
-19zadovoljivi rezultati pri živalih, da bi v krvi dosegli koncentracijo od 20 do 2,000 nmol/L, dobljeni pri dnevnih dozah, prednostno pri dnevnih dozah 60 do 600 nmol/L.
Proteini izuma so lahko dani po vsaki običajni poti, posebno enteralno ali parenteralno, npr. v obliki raztopin ali suspenzij, ki se jih lahko injicira.
Protein SEQ ID NO:1 je prednostna spojina.
Pričujoči izum zagotavlja farmacevtske pripravke, ki vsebujejo spojine izuma v povezavi z vsaj enim farmacevtskim nosilcem ali razredčilom. Taki pripravki so lahko izdelani na običajen način. Glej Remington’s Pharmaceutical Science, 15th ed. Mačk Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980).
V še enem vidiku tega izuma, so zagotovljene DNA sekvence, vektorji, ki vsebujejo te sekvence, celice, ki vsebujejo navedene vektorje, metode rekombinantno proizvajanih proteinov in protitelesa za proteine tega izuma. Zagotovljene so tudi izolirane in/ali rekombinantne DNA sekvence (npr., genomska ali cDNA), ki kodirajo za protein, ki inhibira s kolagenom inducirano, agregacijo človeških trombocitov. V še nadaljnem vidiku izum zagotavlja rekombinantno proizvedene proteine tega izuma, npr. proteine, ki imajo sekvence, ki so navedene tu notri.
Z izrazom izoliran je mišljeno, da je inhibitor tega izuma ali druga esenca, navzoč v obliki, ločeni od (očiščeni od) spojin, s katerimi je rekombinantno ali sintetično proizveden. Vse stopnje take izolacije ali čiščenja so vključene splošno. Prednostne so stopnje izolacije ali čiščenja, s pomočjo katerih je inhibitor uporaben za farmacevtske namene. Na
-20primer, take stopnje izolacije (npr., aktivnosti ali čistosti) so lahko dosežene rutinsko, s kromatografskimi tehnikami, takimi kot so tiste uporabljene v primerih. Nadaljna čiščenja, npr., do homogenosti, so lahko dosežena rutinsko, z uporabljanjem običajnih metod, kot so metode opisane v tekstu, ki sledi:
Methods of Enzymology, Volume 182, Guide to Protein Purification, ed. Murray P. Deutscher, Academic Press 1990;
Protein Purification Applications - A Practical Approach. ed. E.L.V. Harris in S. Angel, IRL-Press 1990;
Protein Purification, Principles and Practice, Robert Scopes, Springer-Verlag
1982;
in
Protein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications, ed. J.-C. Janson in L. Ryden, VCH Publishers 1989.
Čistost je lahko določena s katero koli od številnih rutinskih metod, npr., SDS poliakrilamidno gelsko elektroforezo, analitsko HPLC, itd. Očiščeni inhibitor je lahko uporabljen za določitev aminokislinske sekvence proteina po metodah, ki so popolnoma rutinske za nekoga, ki je običajno izkušen v tem delu. Hewick, R.M. s sod. (1981) J. Biol. Chem. 256,7990-7997.
Aminokislinska sekvenca inhibitorja pričujočega izuma je lahko uporabljena za določitev sekvence ustreznih DNA prob, ki so lahko uporabljene za iskanje novih inhibitorjev, npr., pri drugih vrstah. Take probe so lahko sintetizirane rutinsko, npr. z uporabljanjem avtomatiziranega DNA sintetizatorja in preiskovanje genomskih ali cDNA knjižnic je podobno rutina za nekoga, ki je običajno izkušen v tem delu. (Glej International Publication WO 90/07861, z dne 26 julija, 1990).
-21Zato, pričujoči izum vključuje tudi DNA sekvenco, ki se ujema z (kodira za) obema, DNA sekvenco (genom) za Asp-Pallidipin, ko je izoliran iz naravnega okolja, npr. v raztopini ali na vektorju, kakor tudi njegovimi muteini. Metode za proizvajanje muteinov so tudi rutinske in običajne za nekoga, ki je izkušen v tem delu, kot so takšne tudi metode preiskovanja za testiranje učinkovitosti takih novih proteinov, npr. tako, kot je tu notri opisano.
Ustrezni muteini so tisti, ki imajo vsaj frakcijo, npr., vsaj 5%, prednostno vsaj 50%, najbolj prednostno vsaj 90% biološke aktivnosti, npr., s kolagenom inducirane, trombocitne agregacijske inhibicije, ihibitorja, kot je opisan tu notri.
Nadalje izum vsebuje metodo čiščenja, v kateri čiščenje vključuje sledeče zaporedne stopnje:
(i) čiščenje s kationsko izmenjevalno kromatografijo;
(ii) čiščenje z anionsko izmenjavo in (iii) čiščenje z izločanjem po velikosti.
Verjeti je, da nekdo, ki je izkušen v tem delu, z uporabljanjem predhodnega opisa, brez nadaljnega izpopolnjevanja, lahko pričujoči izum do največjega obsega koristno uporabi. Sledeče prednostne, specifične izvedbene oblike morajo zato biti tolmačene, kot samo edino ponazorilne in vsekakor ne omejitvene za preostali del odkritja.
V prej omenjenih in primerih, ki sledijo, so vse temperature pokazane v stopinjah Celzija; in, razen, če je drugače naznačeno, so vsi deleži in procenti utežni.
-22Celotna razkritja vseh prijav, patentov in objav, citiranih zgoraj in spodaj, če so kakršnakoli, vključno EP 94250224.6, dovršena 2. septembra, 1994, so tu nekje vključena z navedbo.
-23PRIMER1
Primer 1: Konstrukcija ekspresijskega vektorja
Za konstrukcijo inventivnega vektorja, ki kodira za Asp-Pallidipin, sta uporabljena sledeči smiselni (sense) in nesmiselni (antisense) primer: p3:
5’-GCGATATCGCGACGAAGAATGCGAACTCATG-3’ (Nrul) (SEQ ID NO:4); in p4:
5-GCGATAGGATCCAAGCTTATTACTTCATGTTATC-3’ (SamHI) (SEQ ID N0:5).
PCR (polimerazna verižna reakcija) poteka v 8 ciklih po 2 minuti pri 94°C, 1 munuto in 30 sekund pri 42°C in 2 minuti in 30 sekund pri 72°C, z uporabljanjem p3 in p4, kot primerskega para in 1 gg matrične DNA. Po gelskem čiščenju in digestiji z Nrul in BamHI je fragment subkloniran v pSB/pho. Plazmid je pripravljen z Xmal digestijo, ki ji sledita, Mung-ova “bean” obdelava za nastanek 5’ topega konca in SamHI digestija.
Konstrukt je preverjen s celotnim DNA sekvenciranjem dodanih fragmentov, z uporabljanjem dideoksi verižne-terminacijske metode (F. Sanger s sod. (1977) Proč. Nat’l. Acad. Sci. USA 74:5463-5467) in priborom za sekvenciranje z [35S]dATP. Transformacija kompetentne E. coli, E15 s Pallidipinskim ekspresijskim konstruktom ali praznim plazmidom (slepa transformacija) je izvršena z uporabljanjem standardnih metod (J. Sambrook s sod. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Karbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
-24Primer 2: Ekspresija in ekstrakcija Asp-Palidipina
Za pSB/pho plazmid (dobljen iz pSB94; glej J. Daum s sod. (1989) Eur. J. Biochem. 185:347-354), so kulture E15 preko noči (S.J. Hayashi s sod. (1964) J. Biol. Chem. 239:3091-3106) v nizko fosfatnem mediju razredčene na 8% (vol/vol) in nato so 6 ur rastle pri 37°C. (A. Becker s sod. (1994) Protein Expression and Purification 5:50-56). Bakterije so po indukciji pobrane s centrifugacijo in ponovno suspendirane v 1/10 volumna 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)/100 mmol/L NaCI. Ta pripravek je zamrznjen, odmrznjen in centrifugiran, ter tako daje frakcijo supernatanta (SN1). Bakterijski pelet je ponovno suspendiran in pred centrifugiranjem, 10 minut pri sobni temperaturi uravnotežen v 0.5 mol/L saharoze. Supernatant (SN2) je shranjen za analizo, medtem ko je pelet ponovno suspendiran v ledeno hladni vodi, dopolnjen z 1 mmol/L PMSF (fenilmetilsulfonilfluorida) in za 10 min inkubiran na ledu. Celice sledijo temu osmotskemu šoku in se odcentrifugirajo, zbran pa je supernatant (SN3). Pelet, ki vsebuje citoplazemsko frakcijo (CF) je ponovno suspendiran v 50 mmol/L Tris-HCL (pH 8.0)/1 OOmmol/L NaCI.
Primer 3: Čiščenje rekombinantnega Asp-Pallidiplna
Supernatantna frakcija, ki vsebuje večino rekombinantnega Asp-Pallidipina (SN1) je z ocetno kislina naravnana na pH 4.0 in nanešena na kationsko izmenjevalno kolono (Mono S, Pharmacia), z uporabljanjem FPLC sistema. Po izpiranju z gradientom 0 do 500 mmol/L NaCI v natrijevem acetatu, pH 4.0 je elucija Asp-Pallidipina dosežena z 20 mmol/L NaPi, pH 7.0. Eluirane frakcije, ki vsebujejo Asp-Pallidipin, kot je bilo določeno z SDSpoliakrilamidno gelsko elektroforezo (PAGE) in imunoblotingom, so združene, naravnane na pH 8.0 in nanesene na anionsko izmenjevalno
-25kolono (Fractogel-EMD-TMAE 650, Merck). Elucija Asp-Pallidipina je dosežena z gradientom 0 do 1 mol/L NaCl v 20 mmol/L natrijevega acetata, pH 8.4. Za končno čiščenje so frakcije eluenta, ki vsebujejo AspPallidipin združene, koncentrirane v Seed-Vac (Bachofer) in podvržene izločitveni kromatografiji na osnovi velikosti molekul z uporabljanjem Superoze 12 (Pharmacia).
Primer 4: Test trombocitne agregacije
Test je bistveno tako izvršen, kot je opisano v objavi C. Noeske-Jungblut (C. Noeske-Jungblut (1994) J. Biol. Chem. 269:5050-5053). Na kratko, človeška kri je zbrana v 1/6 volumna 71 mmol/l citronske kisline/85 mmol/L trinatrijevega citrata/111 mmol/L glukoze. S trombociti bogata plazma je dobljena z 20 minutno centrifugacijo pri 135 g. Asp-Pallidipin je za 1 min pri 37°C, pred dodatkom kolagena (2 gg/ml), inkubiran z 500 μΙ s trombociti bogato plazmo. Agregacija je beležena z Micron agregometrom in določena je maksimalna vrednost. IC50 ima vrednost okoli 50 nM. Med spojinama z ali brez Asp v prvi poziciji ni bilo videti znatne razlike.
Določena sta biološka aktivnost in dobitek Asp-Pallidipina, očiščenega iz periplazemskega prostora E. coli. S trombociti bogata plazma je inkubirana z Asp-Pallidipinom in kontrolami. Agregacija je inducirana z dodajanjem kolagena. Divja vrsta Pallidipina, očiščenega iz sline je uporabljena kot pozitivna kontrola. Nadalje so nekateri drugi konstrukti uporabljeni kot kontrole, da kažejo prednost inventivnega Asp-Pallidipina. Protein izuma in kontrole kažejo različne dobitke (tabela 2).
-26TABELA 2
| Sev | Dobitek |
| rekombinantni Pallidipin | 461 μg |
| rekombinantni arginil-Pallidipin | 298 pg |
| rekombinantni aspartil-Pallidipin | 864 μg |
Primer 5: Adhezija tumorskih celic na kolagen je v prisotnosti proteina izuma zmanjšana
Protein izuma inhibira adhezijo tumorskih celic na kolagensko matrico. Zato, kadar je protein izuma znotraj pacientove krvi ali plazme, lahko delno ali popolnoma prepreči, da bi se tumorske celice, ki se selijo po telesu, ustalile v organih ali krvnih žilah.
MTLn3 celice (prsne tumorske celice podgane) so označene z 51 Cr. Plošča z vdolbino je prevlečena s kolagenom (vrste lil) in čez noč puščena na 4°C. 2 X 104 radioaktivno označenih celic v 500 μΙ DMEM F12 medija, 20 mmol/L Hepesa, 1 mmol/l bikarbonata, 1% BSA-ja je najprej inkubiranih z 0, 2, 5 ali 10 μΙ proteina izuma (“Superose Pool”, 0.5 mg proteina/ml), oziroma za 10 min pri 37°C. Potem je ta suspenzija prenesena v s kolagenom prevlečeno vdolbino in za 2 h inkubirana pri 37°C. Nato so vdolbine sprane in sprijete celice so odstranjene z 1 mol/L NaOH. Šteje se radioaktivnost sprijetih celic.
-27TABELA 3
| količina dodanega inhibitorja | pričvrstitev celic |
| ul | (cpm). |
| 0 | 2215 |
| 2 | 2071 |
| 5 | 1608 |
| 10 | 1081 |
Primer 6: Proizvajanje protiteles
Okoli 100 gg inhibitorja, očiščenega glede na primere je dodanega k 0.5 ml popolnega Freundovega adjuvansa in sama emulzija je injicirana v kunca. Po 2 tednih je dana druga injekcija, ki je sestavljena iz okoli 80 gg očiščenega inhibitorja in 0.5 ml nepopolnega Freundovega adjuvansa. Po injiciranju je za preverjanje produkcije, vzetih več vzorcev seruma specifičnih protiteles. Analizirani so v VVestern blottingu. 20 ng očiščenega inhibitorja je danega na 12.5% SDS-poliakrilamidni gel in elektroforeza, “blotting” in detekcija so narejeni po standardnih metodah, ki sta jih opisala E. Harlowe in D. Lane, (1988) Antibodies: a laboratory manual,
Cold Spring Harbour Laboratory (redčenje testnega seruma 1:500, s kozjo anti-kunčjo peroksidazo združen IgG kot drugo protitelo, detekcija z ECLpriborom iz Amersham International, Amersham, UK). Lisa kaže, da protiserum specifično reagira z očiščenim inhibitorjem.
Predhodni primeri so lahko, s podobnim uspehom, ponovljeni z zamenjavo splošno ali specifično opisanih reaktantov in/ali pogojev delovanja tega izuma, za tiste uporabljene v predhodnih primerih.
-28Iz zgornjega opisa, lahko nekdo, ki je izkušen v tem delu, brez težav dojame bistvene značilnosti tega izuma in brez spreminjanja njegovega smisla in cilja lahko naredi različne spremembe in modifikacije izuma, da ga tako prilagodi različnim uporabam in pogojem.
-29PREDSTAVITEV SEKVENC (1) SPLOŠNA INFORMACIJA:
(i) PRIJAVITELJ:
(A) IME: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT (B) ULICA: MUELLERSTRASSE 172 - 178 (C) MESTO: BERLIN (E) DRŽAVA: NEMČIJA (F) POŠTNA KODA (ZIP); 13353 (G) TELEFON: (030) - 468-2085 (H) TELEFAX: (030) - 468-2058 (ii) NASLOV IZUMA: POSTOPEK ZA IZDELAVO MODIFICIRANEGA, S KOLAGENOM INDUCIRANEGA, TROMBOCITNEGA AGREGACIJSKEGA INHIBITORJA PALLIDIPINA (iii) ŠTEVILO SEKVENC: 5 (iv) RAČUNALNIŠKO ČITLJIVA OBLIKA:
(A) MEDIJSKI TIP: Gibljivi disk (B) RAČUNALNIK: IBM, PC kompatibilen (C) OPERACIJSKI SISTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) PROCESNA OPREMA: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (v) TEKOČI PODATKI O PRIJAVI:
ŠTEVILKA PRIJAVE: EP 94250224.6
-30(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 1:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 172 aminokislin (B) VRSTA: aminokislina (C) VIJAČNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) VRSTA MOLEKULE: protein (iii) HIPOTETIČEN: ne (v) VRSTA FRAGMENTA: N-terminalen (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:
| Asp Glu 1 | Glu Cys Glu 5 | Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu | Glu | ||||||||||||
| 10 | 15 | ||||||||||||||
| Lys | Tyr | Phe | Ser | Ile | Pro | His | Val | Tyr | Val | Thr | His | Ser | Arg | Asn | Gly |
| 20 | - | 25 | 30 | ||||||||||||
| Pro | Lys | Glu | Gin | Val | Cys | Arg | Glu | Tyr | Lys | Thr | Thr | Lys | Asn | Ser | Asp |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gly | Thr | Thr | Thr | Thr | Thr | Leu | Val | Thr | Ser | Asp | Tyr | Lys | Thr | Gly | Gly |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Lys | Pro | Tyr | His | Ser | Glu | Leu | Lys | Cys | Thr | Asn | Thr | Pro | Lys | Ser | Gly |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Gly | Lys | Gly | Gin | Phe | Ser | Val | Glu | Cys | Glu | Val | Pro | Asn | Gly | Asn | Gly |
| 85 | 90 | 95 |
| Gly | Lys | Lys | Lys | lle | His | Val | Glu | Thr | Ser | Val | lle | Ala | Thr | Asp | Tyr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Lys | Asn | Tyr | Ala | Leu | Leu | Gin | Ser | Cys | Thr | Lys | Thr | Glu | Ser | Gly | lle |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ala | Asp | Asp | Val | Leu | Leu | Leu | Gin | Thr | Lys | Lys | Glu | Gly | Val | Asp | Pro |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Gly | Val | Thr | Ser | Val | Leu | Lys | Ser | Val | Asn | Trp | Ser | Leu | Asp | Asp | Trp |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Phe | Ser | Arg | Ser | Lys | Val | Asn | Cys | Asp | Asn | Met | Lys | ||||
| 165 | 170 |
(2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 2:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 171 aminokislin (B) VRSTA: aminokislina (C) VIJAČNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) VRSTA MOLEKULE: protein (iii) HIPOTETIČEN: NE (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
| Asp 1 | Glu Glu | Cys | Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp | Leu 15 | Glu | ||||||||||
| 5 | 10 | ||||||||||||||
| Lys | Tyr | Phe | Ser | lle | Pro | His | Val | Tyr | Val | Thr | His | Ser | Arg | Asn | Gly |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| P to | Lys | Glu | Gin | Val | Cys | Arg | Glu | Tyr | Lys | Thr | Thr | Lys | Asn | Ser | Asp |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gly | Thr | Thr | Thr | Thr | Leu | Val | Thr | Ser | Asp | Tyr | Lys | Thr | Gly | Gly | Lys |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Pro | Tyr | His | Ser | Glu | Leu | Lys | Cys | Thr | Asn | Thr | Pro | Lys | Ser | Gly | Val |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Lys | Gly | Gin | Phe | Ser | Val | Glu | Cys | Glu | Val | Pro | Asn | Gly | Asn | Gly | Gly |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Lys | Lys | Lys | lle | His | Val | Glu | Thr | Ser | Val | lle | Ala | Thr | Asp | Tyr· | Lys |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Asn | Tyr | Ala | Leu | Leu | Gin | Ser | Cys | Thr | Lys | Thr | Glu | Ser | Gly | lle | Ala |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Asp | Asp | Val | Leu | Leu | Leu | Gin | Thr | Lys | Lys | Glu | Gly | Val | Asp | Pro | Gly |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Val | Thr | Ser | Val | Leu | Lys | Ser | Val | Asn | Trp | Ser | Leu | Asp | Asp | Trp | Phe |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ser | Arg | Ser | Lys | Val | Asn | Cys | Asp | Asn | Met | Lys |
165 170 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 3:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 172 aminokislin (B) VRSTA: aminokislina (C) VIJAČNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) VRSTA MOLEKULE: protein (iii) HIPOTETIČEN: NE
-33(xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
| Asp | Glu | Glu | Cys | Glu | Leu | Met | Pro | Pro | Gly | Asp | Asn | Phe | Asp | Leu | Glu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Lys | Tyr | Phe | Ser | Ile | Pro | His | Val | Tyr | Val | Thr | His | Ser | Arg | Asn | Gly |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Pro | Lys | Glu | Gin | Val | Cys | Arg | Glu | Tyr | Lys | Thr | Thr | Lys | Asn | Ser | Asp |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gly | Thr | Thr | Thr | Thr | Thr | Leu | Val | Thr | Ser | Asp | Tyr | Lys | Thr | Gly | Gly |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Lys | Pro | Tyr | His | Ser | Glu | Leu | Lys | Cys | Thr | Asn | Thr | Gin | Lys | Ser | Gly |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Gly | Lys | Gly | Gin | Phe | Ser | Val | Glu | Cys | Glu | Val | Pro | Asn | Gly | Asn | Gly |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Gly | Lys | Lys | Lys | Ile | His | Val | Glu | Thr | Ser | Val | Ile | Ala | Thr | Asp | Tyr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Lys | Asn | Tyr | Ala | Leu | Leu | Gin | Ser | Cys | Thr | Lys | Thr | Glu | Ser | Gly | Ile |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ala | Asp | Asp | Val | Leu | Leu | Leu | Gin | Thr | Lys | Lys | Glu | Gly | Val | Asp | Pro |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Gly | Val | Thr | Ser | Val | Leu | Lys | Ser | Val | Asn | Trp | Ser | Leu | Asp | Asp | Trp |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Phe | Ser | Arg | Ser | Lys | Val | Asn | Cys | Asp | Asn | Met | Lys |
165 170 (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 4:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 31 baznih parov (B) VRSTA: nukleinska kislina (C) VIJAČNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna
-34(ii) VRSTA MOLEKULE: druga nukleinska kislina (A) OPIS: /desc= “sense primer” (iii) HIPOTETIČEN: ne (iv) ANTI-SENSE: ne (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
GCGATATCGC GACGAAGAAT GCGAACTCAT G (2) INFORMACIJA ZA SEQ ID NO: 5:
(i) KARAKTERISTIKE SEKVENCE:
(A) DOLŽINA: 34 baznih parov (B) VRSTA: nukleinska kislina (C) VIJAČNOST: enojna (D) TOPOLOGIJA: linearna (ii) VRSTA MOLEKULE: druga nukleinska kislina (A) OPIS: /desc = “antisense primer” (iii) HIPOTETIČEN: NE (iv) ANTI-SENSE: DA (xi) OPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
GCGATAGGAT CCAAGCTTAT TACTTCATGT TATC
Claims (17)
- ZAHTEVKI1. Postopek izdelave rekombinantnega proteina Pallidipina (Asp-Pallidipina), v katerem Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov in (ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence:a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;alib) alelno varianto ali mutein sekvenc, v vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelna variacija ali mutein, bistveno ne prizadaneta aktivnosti proteina, alic) protein, po vsaki od SEQ ID NOS: 1 do 3 ali varianti ali muteinu omenjenima pod b), ki ima posttranslacijsko modifikacijo, ki bistveno ne prizadane aktivnosti izgrajenega proteina;vključuje stopnje:aa) transfektiranje vsaj ene bakterije z ustreznim vektorjem, pri katerem vektor vsebuje izvedljivo povezavo:-36(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinantni AspPallidipin, (ii) druga DNA molekula ima nakodirano, ustrezno signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;s čemer je po ekspresiji predprotein, ki vsebuje signalni peptid in AspPallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega Asp-Pallidipina, bb) izražanje predproteina, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno peptidno sekvenco;cc) transportiranje Asp-Pallidipina iz bakterijske citoplazme v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, dd) izoliranje Asp-Pallidipina z ekstrahiranjem periplazme in ee) čiščenje Asp-Pallidipina.
- 2. Postopek izdelave rekombinantnega proteina Pallidipina (Asp-Pallidipina), v katerem Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence-37a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NOJ;bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;alib) alelno varianto ali mutein sekvenc v vsaki od SEQ ID NOS J do 3, katerih alelna variacija ali mutein, bistveno ne prizadeneta aktivnosti proteina, alic) protein, po vsaki od SEQ ID NOS J do 3 ali varianti ali muteinu omenjenima pod b), ki ima posttranslacijsko modifikacijo, ki bistveno ne prizadane aktivnosti izgrajenega proteina;vključuje:gojenje bakterije, transfektirane s primernim vektorjem, v kateri vektor vsebuje izvedljivo povezavo:(i) prva DNA ali cDNA molekula, ima nakodiran rekombinantni AspPallidipin, (ii) druga DNA molekula, ima nakodirano ustrezno signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;s čimer je po ekspresiji predprotein, ki vsebuje signalni peptid in AspPallidipin tako razcepljen, da je aminokislina, aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega Asp-Pallidipina, pod pogoji, s katerimi-38(A) je izražen predprotein, ki vsebuje Asp-Pailidipin in signalno peptidno sekvenco, in (B) Asp-Pallidipin je transportiran iz citoplazme bakterije v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, in čiščenje tako proizvedenega Asp-Pallidipina iz periplazme.
- 3. Postopek po zahtevku 1 ali 2 v katerem ima DNA nakodirane signalne sekvenčne kode za signalno sekvenco alkalne fosfataze (APaze).
- 4. Postopek po zahtevkih 1 do 3 v katerem je bakterija E. coli.
- 5. Rekombinantni protein Asp-Pallidipin, v katerem Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;s čemer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence:a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;ali-39b) alelno varianto ali mutein sekvenc, v vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelna variacija ali mutein bistveno ne prizadaneta aktivnosti proteina, alic) protein, po vsaki od SEQ ID NOS.1 do 3 ali varianti ali muteinu omenjenima pod b), ki ima posttransiacijsko modifikacijo, ki bistveno ne prizadane aktivnosti izgrajenega proteina.
- 6. Rekombinantni protein Asp-Pallidipin, v katerem Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje (i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinskih proteinov, in (ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvencea) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;alib) alelno varianto aii mutein sekvenc, v vsaki SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelna varianta ali mutein bistveno ne prizadaneta aktivnosti proteina, alic) protein, po vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3 ali varianti ali muteinu omenjenima pod b), ki ima posttransiacijsko modifikacijo, ki bistveno ne prizadane aktivnosti izgrajenega proteina;-40v katerem je Asp-Pallidipin proizveden s postopkom, ki vključuje stopnje:aa) transfektiranje vsaj ene bakterije z ustreznim vektorjem, pri katerem vektor vsebuje izvedljivo povezavo:(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinantni AspPallidipin, (ii) druga DNA molekula ima nakodirano ustrezno signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;s čimer je po izražanju predprotein, ki vsebuje signalni peptid in AspPallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartnska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence, izgrajenega Asp-Pallidipina, bb) izražanje predproteina, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno peptidno sekvenco;cc) transportiranje Asp-Pallidipina iz bakterijske citoplazme v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, dd) izoliranje Asp-Pailidipina z ekstrahiranjem periplazme, in ee) čiščenje Asp-Pallidipina.
- 7. Rekombinantni protein Asp-Pallidipin, v katerem Asp-Pallidipin inhibira, s kolagenom inducirano, trombocitno agregacijo trombocitov sesalcev, in v katerem Asp-Pallidipin vsebuje:(i) protein (Pallidipin), izbran iz skupine pallidipinaskih proteinov, in-41(ii) aminokislino aspartinsko kislino, v katerem je aspartinska kislina s peptidno vezjo povezana z N-terminalnim koncem Pallidipina;s čimer ima Asp-Pallidipin sledeče aminokislinske sekvence:a) sekvence pokazane v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO:3;alib) alelno varianto ali mutein sekvenc, v vsaki SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelna variacija ali mutein bistveno ne prizadaneta učinkovitosti proteina, alic) protein, po vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3 ali varianti ali muteinu omenjenima pod b), ki ima posttranslacijsko modifikacijo, ki bistveno ne prizadane aktivnosti izgrajenega proteina;v katerem je Asp-Pallidipin proizveden s postopkom, ki vključuje:gojenje bakterije transfektirane z ustreznim vektorjem, pri katerem vektor vsebuje izvedljivo povezavo:(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinanten AspPallidipin, (ii) druga DNA molekula ima nakodirano ustreženo signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;s čimer je po ekspresiji predprotein, ki vsebuje signalni peptid in AspPallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega Asp-Pallidipina,-42pod pogoji s katerimi (A) je izražen predprotein, ki vsebuje Asp-Pallidipin in signalno peptidno sekvenco, in (B) Asp-Pallidipin je transportiran iz bakterijske citoplazme v periplazmo, s čimer cepitev predproteina, z vsaj eno proteazo, med transportom proizvaja izgrajen Asp-Pallidipin, in čiščenje Asp-Pallidipina iz periplazme.
- 8. Asp-Pallidipin po zahtevku 6 ali 7 v katerem ima DNA, ki ima nakodirano signalno peptidno sekvenco, nakodirano signalno sekvenco alkalne fosfataze (APaze).
- 9. Asp-Pallidipin po vsakem od zahtevkov 5 do 8, za uporabo kot zdravilo.
- 10. Farmacevtski pripravek po vsakem od zahtevkov 5 do 8, ki vsebuje AspPallidipin, v povezavi s farmacevtsko sprejemljivim razredčilom ali nosilcem.
- 11. Uporaba Asp-Pallidipina po vsakem od zahtevkov 5 do 8 za izdelovanje zdravila za zdravljenje aterosklerozne ali trombozne bolezni ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta.
- 12. Uporaba Asp-Pallidipina po vsakem od zahtevkov 1 do 4 za izdelavanje zdravila za zdravljenje aterosklerozne ali trombozne bolezni ali za preprečevanje ponovne zamašitve žil po zdravljenju miokardijskega infarkta.-4313. Uporaba Asp-Pallidipina po vsakem od zahtevkov 1 do 4 za izdelovanje zdravila za zdravljenje raka z metastaznimi tumorskimi celicami.
- 14. Postopek čiščenja po vsakem od zahtevkov 1 do 4 in 6 do 8 v katerem čiščenje vključuje sledeče zaporedne stopnje:(i) čiščenje s kationsko izmenjevalno kromatografijo;(ii) čiščenje z anionsko izmenjavo; in (iii) čiščenje z izločanjem po velikosti.
- 15. Rekombinantni vektor vsebuje izvedljivo povezavo:(i) prva DNA ali cDNA molekula ima nakodiran rekombinantni Asp-Pallidipin, (ii) druga DNA molekula ima nakodirano ustreženo signalno peptidno sekvenco, in (iii) ustrezen promotor;s čimer je po ekspresiji v ustreznem bakterijskem gostitelju, predprotein, ki vsebuje signalni peptid in Asp-Pallidipin tako razcepljen, da je aminokislina aspartinska kislina v poziciji +1, aminokislinske sekvence izgrajenega AspPallidipina.
- 16. Rekombinantni vektor zahtevka 15 v katerem imata DNA ali cDNA molekuli nakodiran Asp-Pallidipin, ki ima aminokislinsko sekvenco izbrano iz:a) sekvenc pokazanih v aa) SEQ ID NO:1; bb) SEQ ID NO:2; ali cc) SEQ ID NO;3;-44alib) alelne variante ali muteina sekvenc, v vsaki od SEQ ID NOS:1 do 3, katerih alelna variacija ali mutein bistveno ne prizadaneta aktivnosti proteina.
- 17. Bakterijski gostitelj transformiran z vektorjem zahtevka 15 ali 16.
- 18. Bakterijski gostitelj zahtevka 17, ki je E. coli.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94250224 | 1994-09-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SI9520093A true SI9520093A (en) | 1997-08-31 |
Family
ID=8217517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SI9520093A SI9520093A (en) | 1994-09-12 | 1995-09-11 | Process for manufacture of a modified collagen-induced platelet aggregation inhibitor pallidipin. |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5882887A (sl) |
| EP (1) | EP0781334A1 (sl) |
| JP (1) | JPH10505502A (sl) |
| CN (1) | CN1075836C (sl) |
| AU (1) | AU701643B2 (sl) |
| BG (1) | BG63276B1 (sl) |
| BR (1) | BR9508910A (sl) |
| CA (1) | CA2199719A1 (sl) |
| CZ (1) | CZ76297A3 (sl) |
| FI (1) | FI971013A0 (sl) |
| HU (1) | HU222398B1 (sl) |
| IL (1) | IL115272A0 (sl) |
| MX (1) | MX9701720A (sl) |
| NO (1) | NO971110L (sl) |
| NZ (1) | NZ293261A (sl) |
| PL (1) | PL184617B1 (sl) |
| RO (1) | RO117971B1 (sl) |
| RU (1) | RU2186110C2 (sl) |
| SI (1) | SI9520093A (sl) |
| SK (1) | SK29297A3 (sl) |
| WO (1) | WO1996008563A1 (sl) |
| ZA (1) | ZA957649B (sl) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000056885A1 (en) * | 1999-03-18 | 2000-09-28 | Merck Patent Gmbh | Protein for blocking platelet adhesion |
| AU2005321315A1 (en) * | 2004-12-28 | 2006-07-06 | Ares Trading S.A. | Compositions and methods for treating schizophrenia and related disorders |
| US7691839B2 (en) | 2005-09-28 | 2010-04-06 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for blocking platelet and cell adhesion, cell migration and inflammation |
| US20110034396A1 (en) * | 2005-09-28 | 2011-02-10 | Biovascular, Inc. | Methods and compositions for inhibiting cell migration and treatment of inflammatory conditions |
| TWI391143B (zh) * | 2005-11-04 | 2013-04-01 | Otsuka Pharma Co Ltd | 血小板凝集抑制劑組成物 |
| WO2012172427A2 (en) * | 2011-06-14 | 2012-12-20 | National Taiwan University | Peptide compounds for inhibition of platelet aggregation |
| FR2979346B1 (fr) | 2011-08-23 | 2013-09-27 | Univ Joseph Fourier | Nanocorps anti-vcam-1 |
| SG10201609345QA (en) | 2012-02-07 | 2017-01-27 | Global Bio Therapeutics Inc | Compartmentalized method of nucleic acid delivery and compositions and uses thereof |
| DK2892920T3 (da) | 2012-09-07 | 2020-06-08 | Inst Nat Sante Rech Med | Hæmmende peptider afledt af udløsningsreceptor udtrykt på myeloide celler-1 (trem-1) trem-lignende transskript 1 (tlt-1) og anvendelser deraf |
| ES2733911T3 (es) | 2013-08-08 | 2019-12-03 | Global Bio Therapeutics Inc | Dispositivo de sujeción para procedimientos minimamente invasivos |
| FR3058143B1 (fr) | 2016-10-27 | 2021-03-12 | Univ Grenoble Alpes | Nanocorps anti-tau |
| US20240366681A1 (en) | 2021-08-13 | 2024-11-07 | Triovance Holding Llc | A skin substitute composition and methods of producing and using the same |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU1987088A (en) * | 1987-06-24 | 1989-01-19 | Novo Nordisk A/S | A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation |
| US5756454A (en) * | 1991-09-05 | 1998-05-26 | Schering Aktiengesellschaft | Collagen-induced platelet aggregation inhibitor |
| WO1993005150A1 (en) * | 1991-09-05 | 1993-03-18 | Schering Aktiengesellschaft | Collagen-induced platelet aggregation inhibitor |
| US5705362A (en) * | 1992-05-25 | 1998-01-06 | Gist-Brocades, N.V. | Modified signal sequences |
-
1995
- 1995-09-11 US US08/793,294 patent/US5882887A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-11 BR BR9508910A patent/BR9508910A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-09-11 HU HU9701823A patent/HU222398B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-09-11 JP JP8509898A patent/JPH10505502A/ja not_active Ceased
- 1995-09-11 NZ NZ293261A patent/NZ293261A/en unknown
- 1995-09-11 EP EP95932714A patent/EP0781334A1/en not_active Withdrawn
- 1995-09-11 SK SK292-97A patent/SK29297A3/sk unknown
- 1995-09-11 AU AU35657/95A patent/AU701643B2/en not_active Ceased
- 1995-09-11 RU RU97105821/13A patent/RU2186110C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-09-11 MX MX9701720A patent/MX9701720A/es unknown
- 1995-09-11 CA CA002199719A patent/CA2199719A1/en not_active Abandoned
- 1995-09-11 RO RO97-00444A patent/RO117971B1/ro unknown
- 1995-09-11 CN CN95195002A patent/CN1075836C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-11 WO PCT/EP1995/003573 patent/WO1996008563A1/en not_active Ceased
- 1995-09-11 CZ CZ97762A patent/CZ76297A3/cs unknown
- 1995-09-11 PL PL95319078A patent/PL184617B1/pl unknown
- 1995-09-11 SI SI9520093A patent/SI9520093A/sl unknown
- 1995-09-12 ZA ZA957649A patent/ZA957649B/xx unknown
- 1995-09-12 IL IL11527295A patent/IL115272A0/xx unknown
-
1997
- 1997-02-12 BG BG101226A patent/BG63276B1/bg unknown
- 1997-03-11 NO NO971110A patent/NO971110L/no unknown
- 1997-03-11 FI FI971013A patent/FI971013A0/fi unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RO117971B1 (ro) | 2002-11-29 |
| EP0781334A1 (en) | 1997-07-02 |
| HU222398B1 (hu) | 2003-06-28 |
| NZ293261A (en) | 1998-11-25 |
| WO1996008563A1 (en) | 1996-03-21 |
| CZ76297A3 (cs) | 1998-01-14 |
| FI971013A7 (fi) | 1997-03-11 |
| AU701643B2 (en) | 1999-02-04 |
| HUT76972A (hu) | 1998-01-28 |
| NO971110L (no) | 1997-05-07 |
| PL184617B1 (pl) | 2002-11-29 |
| NO971110D0 (no) | 1997-03-11 |
| AU3565795A (en) | 1996-03-29 |
| JPH10505502A (ja) | 1998-06-02 |
| US5882887A (en) | 1999-03-16 |
| MX9701720A (es) | 1997-06-28 |
| CN1075836C (zh) | 2001-12-05 |
| SK29297A3 (en) | 1997-10-08 |
| BR9508910A (pt) | 1997-10-28 |
| BG63276B1 (bg) | 2001-08-31 |
| FI971013A0 (fi) | 1997-03-11 |
| IL115272A0 (en) | 1995-12-31 |
| PL319078A1 (en) | 1997-07-21 |
| CA2199719A1 (en) | 1996-03-21 |
| BG101226A (bg) | 1998-10-30 |
| ZA957649B (en) | 1996-04-15 |
| CN1159828A (zh) | 1997-09-17 |
| RU2186110C2 (ru) | 2002-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6897039B2 (en) | Apolipoprotein analogues | |
| FI120355B (fi) | Menetelmä biologisesti aktiivisten polypeptidien ja niitä sisältävien farmaseuttisten koostumusten valmistamiseksi sekä niitä koodaavia nukleotidisekvenssejä, ilmentämiskasetteja, plasmideja ja soluja | |
| JP2989853B2 (ja) | ポリペプチド、その製造方法、ｄｎａ塩基配列及び形質転換細胞宿主 | |
| HU227996B1 (hu) | A von Willebrand faktort (vWF) hasító proteáz polipeptid, a polipeptidet kódoló nukleinsav, és a polipeptid használata | |
| JP2000515370A (ja) | 膜結合剤と可溶性ペプヂド性化合物の結合体 | |
| JPH02121934A (ja) | 組合せ医薬組成物 | |
| JPH06503474A (ja) | トロンビンおよび血小板活性化の二機能性阻害剤 | |
| SI9520093A (en) | Process for manufacture of a modified collagen-induced platelet aggregation inhibitor pallidipin. | |
| EP0538459A1 (en) | Phospholipid-targeted thrombolytic agents | |
| EP0511393B1 (en) | Hirudine mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, microorganism transformed by said vector, and production of product from said microorganism | |
| KR100232683B1 (ko) | 콜라겐에 의해 유도되는 혈소판 응집 억제제 | |
| MXPA97001720A (en) | Process for the manufacture of a modified palidipine, inhibitor of platelet aggregation induced by colag | |
| RU2183214C2 (ru) | Природный и рекомбинантный ингибиторы тромбина, их получение и применение | |
| AU2005240096A1 (en) | Human complement C3 derivates with cobra venom factor-like function | |
| PT1616007E (pt) | Proteínas inibidoras de uma protease e uso das mesmas | |
| US5801017A (en) | Production of recombinant factor Xa inhibitor of leech Hirudo medicinalis | |
| CA2438658A1 (en) | Histidine proline rich glycoprotein (hprg) as an anti-angiogenic and anti-tumor agent | |
| AU2002247129A1 (en) | Histidine proline rich glycoprotein (HPRG) as an anti-angiogenic and anti-tumor agent | |
| JPWO1996003434A1 (ja) | 巨核球分化増殖因子 |