SE1150982A1 - Marker genes for prostate cancer classification - Google Patents
Marker genes for prostate cancer classification Download PDFInfo
- Publication number
- SE1150982A1 SE1150982A1 SE1150982A SE1150982A SE1150982A1 SE 1150982 A1 SE1150982 A1 SE 1150982A1 SE 1150982 A SE1150982 A SE 1150982A SE 1150982 A SE1150982 A SE 1150982A SE 1150982 A1 SE1150982 A1 SE 1150982A1
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- tumor
- genes
- cancer
- gene expression
- survival
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 196
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 93
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 92
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 211
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 136
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 71
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 42
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 135
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 74
- 101000622236 Homo sapiens Transcription cofactor vestigial-like protein 3 Proteins 0.000 claims description 43
- 102100023476 Transcription cofactor vestigial-like protein 3 Human genes 0.000 claims description 39
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 34
- 102100039189 Transcription factor Maf Human genes 0.000 claims description 31
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 24
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 23
- 102100031168 CCN family member 2 Human genes 0.000 claims description 22
- 102100040410 Alpha-methylacyl-CoA racemase Human genes 0.000 claims description 20
- 108010044434 Alpha-methylacyl-CoA racemase Proteins 0.000 claims description 20
- 101000882127 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase EZH2 Proteins 0.000 claims description 20
- 101000804804 Homo sapiens Protein Wnt-5b Proteins 0.000 claims description 20
- 102100038970 Histone-lysine N-methyltransferase EZH2 Human genes 0.000 claims description 19
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 12
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 9
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 claims description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 3
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 claims description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 claims description 2
- 238000003498 protein array Methods 0.000 claims description 2
- 101000777550 Homo sapiens CCN family member 2 Proteins 0.000 claims 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 claims 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims 1
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 35
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 29
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 24
- 108010039419 Connective Tissue Growth Factor Proteins 0.000 description 20
- 102000004374 Insulin-like growth factor binding protein 3 Human genes 0.000 description 19
- 108090000965 Insulin-like growth factor binding protein 3 Proteins 0.000 description 19
- 102100035331 Protein Wnt-5b Human genes 0.000 description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 16
- 230000034994 death Effects 0.000 description 16
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 12
- -1 EXH2 Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 11
- 102100022708 Insulin-like growth factor-binding protein 3 Human genes 0.000 description 9
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 9
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 7
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 6
- 108010084438 Oncogene Protein v-maf Proteins 0.000 description 6
- 108050004365 Transcription factor Maf Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 5
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 101150055869 25 gene Proteins 0.000 description 4
- 101000818517 Homo sapiens Zinc-alpha-2-glycoprotein Proteins 0.000 description 4
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 4
- 102100021144 Zinc-alpha-2-glycoprotein Human genes 0.000 description 4
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 238000012549 training Methods 0.000 description 4
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 3
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 3
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 3
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000007417 hierarchical cluster analysis Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000011472 radical prostatectomy Methods 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000004547 gene signature Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 2
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 101150072531 10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001556567 Acanthamoeba polyphaga mimivirus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100023226 Early growth response protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037181 Fructose-1,6-bisphosphatase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100038367 Gremlin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241001326189 Gyrodactylus prostae Species 0.000 description 1
- 101000952934 Homo sapiens Atrial natriuretic peptide-converting enzyme Proteins 0.000 description 1
- 101001049697 Homo sapiens Early growth response protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001028852 Homo sapiens Fructose-1,6-bisphosphatase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001032872 Homo sapiens Gremlin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000941892 Homo sapiens Leucine-rich repeat and calponin homology domain-containing protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000941871 Homo sapiens Leucine-rich repeat neuronal protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001043598 Homo sapiens Low-density lipoprotein receptor-related protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000781981 Homo sapiens Protein Wnt-11 Proteins 0.000 description 1
- 101001019136 Homo sapiens Putative methyltransferase-like protein 7A Proteins 0.000 description 1
- 101000659879 Homo sapiens Thrombospondin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000004372 Insulin-like growth factor binding protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000964 Insulin-like growth factor binding protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100032655 Leucine-rich repeat neuronal protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000003657 Likelihood-ratio test Methods 0.000 description 1
- 102100021918 Low-density lipoprotein receptor-related protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 101100346932 Mus musculus Muc1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004820 Pressure-sensitive adhesive Substances 0.000 description 1
- 102100036567 Protein Wnt-11 Human genes 0.000 description 1
- 101710130181 Protochlorophyllide reductase A, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 102100034758 Putative methyltransferase-like protein 7A Human genes 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 1
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 1
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000008473 connective tissue growth Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000092 prognostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011471 prostatectomy Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4746—Cancer-associated SCM-recognition factor, CRISPP
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
- G01N2333/7454—Tissue factor (tissue thromboplastin, Factor III)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Föreliggande uppfinning hänför sig till ett förfarande för klassificering avprostatacancer hos en patient, varvid förfarandet innefattar stegen att a)bestämma en genuttrycksnivå eller ett genuttrycksmönster för generna F3 ochIGFBP3 i ett prov från patienten och b) klassificera tumören genom att jämföragenuttrycksnivån bestämd i a) med ett referensgenuttryck för samma gener hosreferenspatienter kända att ha en högrisk- respektive en lågrisktumör.Dessutom hänför sig uppfinningen till ett förfarande för att bestämma prognosför en patient diagnostiserad med prostatacancer, ett förfarande för att fattabehandlingsbeslut för en patient diagnostiserad med prostatacancer och en fastbärare eller ett kit för klassificering av en tumör hos en patient diagnostiserad med prostatacancer.
Description
kastrationsresistenta metastaser inom tre år eller dö av kardiovaskulära och andra biverkningar av kastrationsbehandlingen. För närvarande finns det inga metoder som kan prediktera vilken typ av patienter som skulle ha nytta av kastrationsbehandling.
En majoritet av prostatacancer framskrider så långsamt att de aldrig kan nå ett livshotande tillstånd, huvudsakligen på grund av hög ålder och andra konkurerande sjukdomar. En liten andel av prostatacancer framskrider dock mycket fort och kan döda patienter på mindre än fem år. Vid diagnos, med konventionella parametrar inkluderande ålder, tumörgrad, Gleason poäng, klinisk grad och komorbiditet kan prediktionen av cancerspecifik och allmän överlevnad nå en exakthet på upp till 60-70 %. Även patienter med samma kliniska prognostiska parametrar kan uppvisa stora skillnader i överlevnad så väl som i svar på behandling. Följaktligen är prostatacancer en patologisk (morfologisk) diagnos som kan inkludera flera olika biologiska undergrupper eller subtyper.
Det finns ett behov av en metod som kan särskilja dessa biologiska undergrupper eller subtyper av prostatacancerpatienter. Det finns också ett behov av en metod som kan klassificera dessa subtyper i aggressiva eller högrisktumörer och mindre aggressiva eller lågrisktumörer, liksom en metod som kan prediktera överlevnad för patienter med respektive tumörsubtyp.
Vidare, finns det ett behov av en metod som kan användas för att fatta beslut beträffande behandling för patienter som har en tumör av respektive subtyp, eventuellt även med hänsyn till kliniska parametrar.
Känd teknik Patentdokument WO2008/013492 A1 beskriver ett tillvägagångssätt för identifiering av gener relaterade till embryonala stamceller, benämnda ES- tumörprediktorgener (ESTP-gener), som kan vara viktiga för funktionen hos cancerstamceller. 641 ESTP-gener identifierades och fanns användbara för klassificering av prostatacancertumörer. 10 15 20 25 30 Patentdokument WO09021338 A1 beskriver en metod för prognos av en cancersjukdom, t.ex. prostatacancer, hos en patient genom detektion av en signatur av splicinghändelser. F3 omnämns som en av många gener som kan användas.
Patentdokument WO0171355 beskriver simultan analys av PSA, IGF-l och IGFBP-3 i blodplasma för att prediktera risken för en man att få prostatacancer.
US2003054419 A1 beskriver en metod för att bestämma risken för framskridning hos en prostatacancerpatient efter terapi, varvid nivåerna av TGF-ß1, IGFBP-2 eller IGFBP-3 i plasma mäts.
Patentdokument WO10006048 A och US2009298082 A beskriver respektive metoder för prediktion av överlevnad av en patient med diagnosen prostatacancer och huruvida en patient med PSA återfall senare kommer att utveckla systemiskt sjukdomstillstånd. l båda dokumenten nämns IGF BP-3 som en av många gener som, tillsammans med andra molekylära markörer, kan användas.
Dokument WOO9105154 och WO06028867A beskriver en metod för att bestämma en prognos för en individ som har cancer och en metod för diagnos av multipelt myelom. c-MAF omnämns som en av många gener som kan användas.
WO1010188A beskriver en metod för att störa aktiviteten hos CTGF, varvid aktiviteten hos CTGT är förknippad med metastaser av prostatacancer.
Syfte med uppfinningen Det är ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla molekylära markörer som är användbara för klassificering, för prediktion av prognos och för att vägleda beslut beträffande behandling av prostatacancer hos en patient. 10 15 20 25 30 Ett annat syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla nya metoder för klassificering av prostatacancer hos en patient, liksom för att använda klassificeringen för prognosprediktion hos patienten och för att ta beslut beträffande behandling av patienten.
Ett ytterligare syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla en metod för behandling av en patient som har prostatacancer, vilken metod är basered på patientens tumörsubtyp. Ännu ett syfte med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla verktyg för klassificering av prostatacancer eller -tumörer hos en patient.
Beskrivninq av uppfinningen ldentifiering av gener och gensignaturer som är signifikant korrelerade till överlevnad hos prostatacancerpatienter För att stödja konceptet beträffande biologisk subtyp, har tidigare studier som använt cDNA mikroarrays baserade på hela genom klassificerat bröstcancer såväl som prostatacancer i molekylära subtyper med skilda kliniska och patologiska särdrag. Den föreliggande beskrivningen utvidgar konceptet och betydelsen ytterligare. Istället för att endast använda statistisk analys, drevs selektionen av genmarkörskandidater i föreliggande studie av cancerstamcells- (CSC)/ embryonalstamcells- (ESC) hypotesen, med syfte att identifiera endast ett fåtal ESC-/CSC-genmarkörer av högsta betydelse. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara effektivt eftersom de mest signifikanta prediktiva genmarkörerna som identifierades i den föreliggande studien var från listan med identifierade embryonala stamcellsgenprediktorer (ESCGP:er).
Uppfinnarnas hypotes var att den biologiska aggressiviteten hos prostatacancer och förmåga att svara på kastrationsbehandling till största delen bestäms av huvudsakliga genuttrycksmönster hos prostatacancerstamceller (CSCs) (Visvader, Nature 2011, 4692314-22; Ratajczak et al, Differentiation 2011, 10 15 20 25 30 81 :153-161; Lang et al, J Pathol 2009, 2171299-306). Ännu en hypotes var att gener som har en viktig funktion i embryonala stamceller (ESC:er) också kan vara av betydelse i prostata-CSC:er. Därmed skulle direkt mätning av uttrycksmönster av gener besläktade med embryonala stamcellsgener hos prostatacancerceller avspegla den biologiska aggressiviteten hos cancern och möjliggöra prediktion av effekten av kastrationsbehandling såväl som prediktion av patientöverlevnad.
Baserat på denna hypotes har uppfinnarna tidigare identifierat gener, dvs. embryonala stamcellsgenprediktorer (ESCGP:er) som har en konsekvent hög eller konsekvent låg uttrycksnivå i ECS-linjer (WO 2008/013492 A1).
I korthet identifierades ESCGP:erna genom analys av tidigare publicerade dataset av microarraydata från helgenom-cDNA härlett från 5 humana ESC- linjer och 115 humana normala vävnader från olika organ med hjälp av en enkel enklass-SAM (Significance Analysis of Microarrays), varvid generna rangordnades enligt deras grad av konsekvens i uttrycksnivåer i ESC:erna.
Detta var baserat på konceptet att gener med antingen konsekvent höga eller konsekvent låga uttrycksnivåer i alla ESC:linjer kan ha betydelsefulla funktioner i att upprätthålla ESC status/tillstånd och att förändringar av deras uttryck i olika mönster kan leda till differentiering i olika riktningar. Dessa ESC-gener kan även ha funktioner i att upprätthålla olika status hos CSC:er och därmed kan olika uttrycksmönster av ESC-gener i CSC:er klassificera tumörer i olika subtyper med olika aggressivitet och känslighet för olika typer av behandling. Genom att utgå från denna lista av ESCGP:er identifierade föreliggande studie några viktiga prognostiska och prediktiva genmarkörer för prostatacancer.
Från en lista med 641 ESCGP:er identifierade i WO 2008/013492 A1 valdes i föreliggande studie en delmängd på 33 ESCGP:er ut, som kandidater som kan möjliggöra klassificering av prostatacancer med hjälp av färre markörer.
Kandidaterna valdes ut enligt tre kriterier såsom beskrivits i Exempel 2A (se även Figur 1), dvs. enligt deras rangordningsposition i ESCGP-listan och enligt deras rangordningspositioner i genlistor från en tidigare studie (Lapointe et al, 10 15 20 25 30 Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101 :81 1-816), vilken identifierade gener som potentiellt kunde användas för klassificering av subtyper av prostatacancer och gener som kunde särskilja prostatacancer från normal vävnad.
Vidare valdes 5 gener som inte var från ESCGP-listan ut enligt ett fjärde kriterium; de var beskrivna och kända för att vara betydelsefulla i prostatacancer. Dessa beskrivna gener användes som kontroll för att utvärdera betydelsen av ESCGP-gener i förhållande till icke-ESCGP-gener vid klassificering av prostatacancer. Vidare kunde de eventuellt inkluderas i en molekylär markörsignatur för användning vid klassificering av prostatacancer.
Uttryck av de 33 utvalda ESCGP:erna och de 5 beskrivna generna undersöktes i tre olika prostatacancercellinjer med hjälp av RT-PCR (se Exempel 2B). Av dessa 33 gener identifierades 24 gener (19 ESCGP:er och 5 beskrivna gener) som hade annorlunda uttrycksmönster i den mindre aggressiva cellinjen LNCap jämfört med de aggressiva cellinjerna DU145 och PC3 (se Figur 2). Dessa 24 gener ansågs mer sannolikt vara användbara för tumörklassificering för att särskilja mindre aggressiv från mer aggressiv cancer. Därmed valdes de 24 generna (25 genmarkörerna) ut för optimering av multiplex kvantitativ PCR och utvärdering av förmåga att klassificera prostatacancer i prover från finnålsaspiration (FNA) från 189 patienter med prostatacancer med känt kliniskt utfall (se Exempel 3A). Gener vars uttrycksprofil korrelerade med överlevnad identifierades först med hjälp av analys av ett träningsset, dvs. en delmängd av hela gruppen på 189 patienter. De identifierade genernas förmåga att klassificera tumörer bekräftades sedan med hjälp av analys av hela patientgruppen.
Alla patienter i den föreliggande gruppen hade kliniskt signifikant prostatacancer och majoriteten (80 %) av patienterna hade inte behandlats med radikal prostatektomi eller full dos strålningsbehandling utan endast med kastrationsbehandling när sjukdomen var långt framskriden. Således påverkades inte överlevnadsdatat av de kurativa effekterna av radikala behandlingar, vilka, när de används vid ett tidigt stadium hos vissa patienter 10 15 20 25 30 med biologiskt aggressiv cancer, kan eliminera cancern och därmed livshotet. I föreliggande grupp var uppföljningstiden 7-20 år och majoriteten (94.5 %) av patienterna avled vilket möjliggjorde en fullständig analys av den faktiska allmänna överlevnadstiden med minimalt censurerat data. Dessa egenskaper säkerställde upptäckten av nya biomarkörer för prediktion av överlevnad och var unika jämfört med de flesta tidigare studier, där PSA-återfall och progressionsfri överlevnad har använts som surrogat för allmän och cancerspecifik överlevnad. l föreliggande studie har både allmän och cancerspecifik överlevnad använts för att utvärdera det kliniska värdet av prognostiska biomarkörer. Cancerspecifik överlevnad bestäms huvudsakligen av cancercellers biologiska aggressivitet.
Dock kan exaktheten och betydelsen av korrelationen mellan prognostiska såväl som prediktiva parametrar (såsom kliniska parametrar och/eller uttryck av biomarkörer) och cancerspecifik överlevnad påverkas av hur cancerspecifik överlevnad definieras och hur mycket data som censureras på grund av andra konkurrerande dödsorsaker. Å andra sidan är den allmänna överlevnaden överlevnadsdata utan någon censurering av dödsorsaker och inkluderar alla dödsorsaker.
Därför återspeglar allmän överlevnad inte bara den biologiska aggressiviteten hos cancerceller utan också många andra faktorer såsom konkurrerande sjukdomar eller komorbiditeter, komplikationer såväl som bieffekter av behandling, ålder och förväntad livslängd. Den allmänna överlevnaden kan för prostatacancerpatienter ha större betydelse än cancerspecifik överlevnad eftersom de flesta patienter är diagnostiserade vid hög ålder och vanligen har andra konkurrerande sjukdomar såsom kardiovaskulära sjukdomar, diabetes mellitus eller andra elakartade sjukdomar (Daskivich et al, Cancer 2011, Apr 8. doi: 10.1002/cncr.26104. [Epub före publikation]).
Tio molekylära markörgener visade signifikant korrelation med allmän och/eller cancerspecifik överlevnad vid envariatanalys (se Tabell 1), och kan användas för klassificering av prostatatumörer, för prognosprediktion och även för att fatta 10 15 20 25 30 beslut beträffande behandling för patienter, beroende på klassificeringen av patientens tumör. Dessa markörer var F3 (koaguleringsfaktor lll; coagulation factor Ill), WNT5B (wingless-typ MMTV integrationsplats familj, medlem 5B; winglesstype MMTV integration site family, member 5B), VGLL3 (rudimentärlik 3 (Drosophila); vestigial like 3 (Drosophila)), CTGF (bindvävnadstillväxtfaktor; connective tissue growth factor), IGFBP3 (insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 3; insulin-like growth factor binding protein 3), c-MAF-a (lång form av v- maf muskuloaponeurotisk fibrosarkom oncogenhomolog (aviär); long form of v- maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), c-MAF-b (kort form av v-maf muskuloaponeurotisk fibrosarkom oncogenhomolog (aviär); short form of v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), AMACR (alfa-metylacyl-CoA racemas; alpha-methylacyl-CoA racemase), MUC1 (cellytesassocierad mucin 1; mucin 1, cell surface associated) och EZH2 (förstärkare av zestehomolog 2 (Drosophila); enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila)). Fem av dessa tio gener (F3, WNT5B, CTGF, VGLL3 och IFGBP3) var ESCGP:er som identifierats från listan av gener med konsekvent hög eller låg uttrycksnivå i embryonala stamceller. Två av dessa gener (c-MAF-a och c-MAF-b) var tidigare beskrivna gener som var kända för att ha viktiga funktioner i myelom.
Tre av de signifikanta generna (EZH2, AMACR och MUC1) är gener som tidigare beskrivits i samband med prostatacancer. Flera tidigare studier har identifierat biomarkörer som AMACR, EXH2, MUC1 samt AZGP1 och en stamcellsaktig signatur som är korrelerade med återfallsfri överlevnad efter radikal prostatektomi (Varambally et al, Nature 2002, 419:624-9; Rubin et al, JAMA 2002, 28711662-70; Oon et al, Nat Rev Urol 2011, 81131-8; Lapointe et al, Cancer Res 2007, 6728504-10; Rubin et al, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005, 1421424-32; Strawbridge et al, Biomark lnsights 2008, 32303-15; Glinsky et al, J Clin Oncol 2008, 2846-53; Glinsky et al, J Clin lnvest 2005, 115:1503-21). Föreliggande resultat visar att uttrycksnivån av MUC1, AMACR och EXH2 i FNA-prover från prostatacancer faktiskt korrelerar med antingen cancerspecifik eller allmän överlevnad. Emellertid, av de tidigare beskrivna genmarkörerna, var endast korrelationen med c-MAF-a lika stark som Tabell 1. Envariat proportioneli riskanalys enligt Cox av 25 ESCGP:er och kliniska parametrar.
Variabel PSA>50 vs. PSASSO (ng/ml) WHO Tumörgrad Lågt vs. Medelhögt / Högt Kliniskt stadium 1' Framskriden vs. Begränsad Ålder 1 PSA § F3 ll WNT5B || VGLL3 || c-MAF-a || CTGF || |GFBP3 || c-MAF-b || EzH2 || AMAcR || Muc1 || WNT11 || BAsP1 || AZGP1 || co|_12A1 || EGR1 || LRRN1 || ERBB3 || cYR61 || FBP1 || PTN || LRP4" THBS1 || GREM1 || METTL7A || 001-11 || Provnummer* 161 181 175 185 161 92 89 152 174 100 169 69 144 148 143 177 177 148 176 175 182 89 79 79 27 27 27 35 35 35 Allmän Överlevnad Riskkvot (95% C |) 2.34 (165-331) 1.59 (1.16-2.18) 1.70 (1.23-2_35) 1.04 (102-106) 1.00 (1.00-1.00) 1.11(1_04-1.17) 1.14 (104-125) 1.08 (1.03-1_13) 1.09 (1.03-1_17) 1.13 (1.03-1.23) 1.04 (0_98-1.10) 1.13 (0.96-1.33) 0.94 (0_84-1.05) 1.08 (1.02-1.16) 1.07 (1.00-1.13) 1.02 (0.97-mos) 1.99 (093-106) 0.99 (0.94-1.05) 1.02 (0_9s-1.07) 1.03 (095-111) 1.02 (098-107) 1.04 (098-110) 1.12 (099-127) 1_11(1.00-1_23) 0.99 (079-124) 1.06 (090-124) 1.03 (091-117) 1.04(0.94-1.16) 1.08 (091-128) 1.12 (0.96-1.30) P-värde <0.001 0.004 0.001 <0.001 0,005 0.001 0.004 0.002 0.007 0.008 0,16 0,13 0.26 0.01 0.04 0.38 0.87 0.81 0,34 0.47 0.26 0.23 0.07 0.06 0.93 0.47 0.66 0.40 0.37 0.14 Cancer Överlevnad Riskkvot (95% Cl) 2.61 (1.68-4.05) 1.94 (1 _28-2.94) 2.20 (1 .44-388) 1.03 (100-105) 1.00 (1 .00-1 _00) 1.14 (1_06-1.22) 1.26 (111-142) 1.07 (1 .01-1 .14) 1.09 (1_01-1.19) 1.15 (1.02-1.29) 1.09 (1_01-1,17) 1.28 (1 .04-1 _57) 0.85 (074-098) 1.08 (1.00-1.17) 1.06(0_98-1.14) 1.02 (096-109) 0.97 (089-1 _05) 1.02 (096-108) 0.97 (091-103) 1.07 (0.97-1.18) 1.03 (098-1 _09) 1.04 (0.96-1 _13) 1.08 (0.91-1 _28) 1.08 (093-1 _25) 1.02 (073-1 _42) 1.11 (086-139) 1.02 (088-125) 1.12 (095-133) 0.96 (0_72-1_25) 0.94 (072-1 _24) P-värde <0.001 0.002 <0.001 0.04 0.004 <0.001 <0.001 0.02 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02 0.06 0.13 0.55 0.45 0.55 0.36 0.17 0.29 0.29 0.36 0.32 0.91 0.37 0,88 0.17 0.69 0.67 10 15 20 25 10 * Varje ESCGP har ett eget provantal eftersom inte alla ESCGP:er har profilerats över alla prover, 1' Grupper av kliniska stadier klassificerades med hjälp av Tumör-Nod-Metastas-systemet (TNM) och PSA-värde.
Framskridet kliniskt stadium definierades som vilket som helst TNM-stadium där T23, N1, M1 eller PSA > 100.0 ng/ml.
Begränsat kliniskt stadium definierades som T1-2NOM0 och PSAs100.0 ng/ml. 1: Ålder modellerades som en kontinuerlig variabel. Riskkvoten anges för varje 1.0-års ökning i ålder.
§ PSA-värdet modellerades som en kontinuerlig variabel. Riskkvoten anges för varje ökning av 1.0 ng/ml PSA i serum.
|| Genens centrerade deita-Ct-värde modellerades som en kontinuerlig variabel. Det svarar omvänt mot genuttrycksnivå. Riskkvoten anges för varje ökning av 1.0 enhet av genens centrerade delta-Ct-värde. korrelationen med ESCGP:erna F3, |GFBP3 och VGLL3, identifierade i den föreliggande studien.
Uttrycksnivåerna (omvänt korrelerade med det centrerade delta-Ct-värdet) av alla dessa signifikanta gener utom EZH2 visade en positiv korrelation med överlevnadstid (Tabell 1, Riskkvot > 1). Endast uttrycksnivån av EZH2 i FNA- proven var omvänt korrelerad med patientöverlevnad. Denna negativa korrelation av EZH2 överensstämde med dess dokumenterade roll som en onkogen. De föreliggande resultaten för EZH2, AMACR, |GFBP3 och c-MAF-a generna är i linje med relevanta resultat från tidigare studier (Varambally et al, Nature 2002, 419:624-9; Rubin et al, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005, 14:1424-32; Mehta et al, Cancer Res 2011, 7115154-63; Li et al, Genes Chromosomes Cancer 1999, 242175-82). |GFBP3 har en väl bevisad funktion i att undertrycka metastasprocessen hos prostatacancer (Mehta et al, Cancer Res 2011, 71 :5154-63).
Den positiva korrelationen mellan MUC1 och F3 och överlevnad var oväntad.
F3 och MUC1 har dokumenterade funktioner i att främja utvecklingen av cancer (Strawbridge et al, Biomark lnsights 2008, 31303-15; Kasthuri et al, J Clin Oncol 2009, 27:4834-8). Den positiva korrelationen med överlevnad kan tyda på att prostatacancerceller med hög uttrycksnivå av F3 och MUC1 är starkt androgenberoende och känsliga för kastrationsbehandling (Strawbridge et al, Biomark lnsights 2008, 32303-15; Kasthuri et al, J Clin Oncol 2009, 27:4834-8; Mitchell et al, Neoplasia 2002, 4:9-18; Brodin et al, Semin Thromb Hemost 2001, 37:87-94). Det finns några prognostiska och prediktiva markörer med liknande tvåfaldiga aspekter i andra cancertyper, såsom HER-2/neu/ERBB2- amplifiering i bröstcancer, där bröstcancer med amplifiering av HER- 10 15 20 25 30 35 11 2/neu/ERBB2 har aggressiva biologiska såväl som kliniska drag men som svarar på Tratsuzumab(Herceptin)-behandling med åtföljande förlängd överlevnad.
Funktionen av VGLL3 med avseende på prostatacancer är fortfarande okänd.
Vidare genomfördes multivariat analys för att identifiera gener som, oberoende av all kliniska parametrar, visar korrelation med överlevnad (se Exempel 3A).
Fyra gener (F3, IGFBPS, CTGF och AMACR) visade korrelation med både allmän och cancerspecifik överlevnad oberoende av alla kliniska parametrar (Figur 4A-K). Alla de fyra generna utom AMACR kom från listan med ESCGP:er. Två gener (VVNT5B och EZH2) uppvisade, oberoende av kliniska parametrar, korrelation med cancerspecifik överlevnad och en gen (VGLL3) uppvisade, oberoende av kliniska parametrar, korrelation med allmän överlevnad.
För att studera eventuella additiva eller synergistiska effekter av flerfaldiga gener med avseende på prediktion av överlevnad, testades olika kombinationer av de tio signifikanta generna i en serie av oövervakade hierarkiska klusteranalyser (se Exempel 3B och Figur 6-7). Av vikt är att två signaturer identifierades som på ett likartat sätt kunde klassificera tumörer in i tre undergrupper eller subtyper med signifikant skillnad i allmän och cancerspecifik överlevnad. Den första ESCGP-signaturen (Signatur 1) inkluderar generna VGLL3, lGFBP3 och F3. Den andra ESCGP-signaturen (Signatur 2) inkluderar generna c-MAF-a, lGFBP3 och F3. Klassificeringen hade en stark korrelation med och kan användas för prediktionen av en patients allmänna och cancerspecifika överlevnad (se Figur 6-7 och Tabell 2-3). Denna prognostiska och prediktiva uttryckssignatur var oberoende av ålder, PSA-nivå, tumörgrad och kliniskt stadium.
De viktigaste markörgenerna som hittades i denna studie visade korrelation med både allmän och cancerspecifik överlevnad. Detta var delvis på grund av möjligheten att prostatacancer eller bieffekter av behandlingarna även bidrog till dödsfall som direkt orsakades av andra sjukdomar. Detta kan också delvis bero på det faktum att ESCGP-signaturen kan delas av både cancerstamceller och vissa typer av normala stamceller i kroppen. Därför kan ESCFP-signaturen vara av betydelse för utvecklingen av både cancer och andra sjukdomar. Till 12 Tabell 2. “ ,. riskanalys enligt Cox av EåCüPsignatur 1 och kliniska pararnetrar (Envariat och Multivarial analys). variabel Allmän överlevnad Canceroverlevnad Envariat analys Mullivanat Analys Envariat analys Mumvaria! Analys Antal prover' Riskkvor P varde Rlskkvot P-varde Qrskkvol P-va rde Rvskkvot P-várde 195% Cl) (95%) Cl) i95% Cll l95% Cl) ESCGP-signatur l f sfuppi vs Grupp: fn sasiz 9141 var <0 uoi 417 rz zr-io m; <0 om rem 04-19 se) <0 om r iziz 56-19 ss) fo oi» Gmppzvs srupea av 345m 7943561 <0 om 25i Psßvso vs PsAsso ing/mn a? 2 93 n Visa sei <9 001 2 09 rim-s 94) o oz z 33 :i ns -iii <0 om i ris :o 11-4 os) u ia wHo rumfgiau Làgivs meaeinøgi/Hegi av issii 03-2661 om iir-p 69-2110) oss 193 ri 04-151) u :i-i izo ic 61-2 39) oso Kliniskt Stadium 1 Frarrlâkndell VS. Begränsad 87 2.13 ;1 32-3 45) O 002 l 68 (0 91-3 0G) 010 3 B? (l 94-7 70) <0 G01 3 52;155-8 45) O 003 Ål0er§ 87 'lfJišl103-109l <0 00) 5.031,1 00-106) 005 l 06 11 02-1 10) 0003 1030994 08) 011 " Antalet prover för klusteranalysen var 95. 87 prover hade all klinisk information inklusive ålder vid diagnos, PSA-värde, tumörgrad enligt WHO och kliniskt stadium. Envariat och multivariat analys genomfördes på dessa 87 prover. 1- ESCGP-signatur 1 inkluderade uttryckssignatur för VGLL3, IGFBP3 och F3. Den klassificerade proven itre subtyper av tumörer: Grupp 1, Grupp 2 och Grupp 3 genom klusteranalys (Figur 6, panel A). 1: Grupper av kliniska stadier klassificerades med hjälp av Tumör-Nod-Metastas-systemet (TNM) och PSA-värde. Framskridet kliniskt stadium definierades som vilket som helst TNM~stadium där TaB. N1, M1 eller PSA > 100.0 ng/ml. Begränsat kliniskt stadium definierades som T1-2NOM0 och PSAs100.0 ng/ml § Ålder modellerades som en kontinuerlig variabel. Riskkvoten anges för varje 1.0-års ökning i ålder.
Tabell 3. Proportionell riskanalys enligt Cox av ESCGP-signatur 2 och kliniska parametrar (Envariat och Multivarial analys). variabel Allman Overlevnad Canceroverlevllad Envariat analys Multivarlat Analys Envariat analys Mulbvariai Analys Antal prover' Rlskkvot P-varrle Rlskkvot P-varde Rlskkvol Pwarde Rlskltvol P~varde T95% Cl) l95l°4i Cl) l95% Cl) i95% Cli ESGP-szgnattir 2 t Grlløølvs Grupp? 87 3 lñjt 71-5 81.
GIUDD 2 vs 'SrUDD 3 37 2 02 !l.Û9-3.77) 6.03 138 :O 67-2 83i U 38 219m 95-5 05) i.) 'J7 S12 :Cl 644.543 0.29 PSA>50 VS PSAS5Û (Mimi) S7 2 93 il 76-4 362 <0 001 339 ll 04-3113) Q 94 3 33i173-6 41) <3 001 11110 79-3 71) 51.75' WHO Tufmrgrad Lågt VS Medelhógl/Hogl 87 155 il 03-2561- 004 138 'O 93-2 28) 0.21 193 il 04-3 57) G04 14210 74-273) 0.29 Kliniskt Stadium I Framskridet) 45 Begränsad 87 2 13 ll 32-3 45) Ü M2 179HO2-314) 3 04 3 87 ll *lå-Y 75)) <0 (101 3 6411 67-? Elli 0 001 Ålder§ 37 lüfii* 03-109) <0Û0l lßlßlt 01-1 08) 002 lfJ6"O2-110| 0003 l 06101994 08) 0.09 * Antalet prover för klusteranalysen var 95. 87 prover hade all klinisk information inklusive ålder vid diagnos, PSA-värde, tumörgrad enligt WHO och kliniskt stadium. Envariat och multivariat analys genomfördes på dessa 87 prover. fESCGP-signalurz inkluderade uttryckssignaturför c-MAF-a, IGFBP3 and F3. Den klassificerade proven itre subtyper av tumörer: Grupp 1, Grupp 2 och Grupp 3 genom klusteranalys (Figur 7). t Grupper av kliniska stadier klassificerades med hjälp av Tumör-Nod-Metastas-systemet (TNM) och PSA-värde. Framskridet kliniskt stadium definierades som vilket som helst TNM-stadium där T23, N1, M1 eller PSA > 100.0 ng/ml. Begränsat kliniskt stadium definierades som T1-2NOM0 och PSAs100.0 ng/ml § Ålder modellerades som en kontinuerlig variabel. Riskkvoten anges för varje 1.0-års ökning i ålder. 10 15 20 25 30 35 13 exempel har |GFBP3 identifierats att ha viktiga suppressiva funktioner i både cancer och diabetes (Yeap et al, Eur J Endocrinol 2011, 1641715-23; Mehta et al, Cancer Res 2011, 71 :5451-63).
Utföríngsformer av föreliggande uppfinning Enligt en första aspekttillhandahållerföreliggande uppfinning ett förfarande för klassificering av prostatacancer hos en patient, innefattande att a) bestämma en genuttrycksnivå för generna F3 och |GFBP3 i ett prov från patienten, med andra ord bestämma genuttrycksmönstret för nämnda genen b) klassificera tumören genom att jämföra genuttrycksnivån, dvs. genuttrycksmönstret, som bestämdes i a) med ett referensgenuttryck för samma gener hos referenspatienter som är kända att ha en högrisk- respektive Iågrisktumör; och c) dra slutsatsen att om den/det i a) bestämda genuttrycksnivån/ genuttrycksmönstret matchar referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en högrisktumör, är tumören hos patienten en högrisktumör, och om den i a) bestämda genuttrycksnivån överensstämmer med referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en lågrisktumör, är tumören hos patienten en lågrisktumör.
I en föredragen utföringsform bestäms uttrycksnivån för generna F3 och |GFBP3 och någon av VGLL3 och c-MAF i a), och används därmed för klassificering av tumören. Företrädesvis bestäms uttrycksnivån av F3, |GFBP3 och VGLL3.
Dessa gensignaturer har visats särskilt användbara för klassificering av prostatacancertumörer (Figur 6-7) och den resulterande klassificeringen har visats vara signifikant korrelerad med överlevnad hos prostatacancerpatienter (Figur 6 och 9-12, Tabell 2 och 3).
Enligt en utföringsform innefattar således steg a) vidare att bestämma en genuttrycksnivå för en eller flera av generna VGLL3 och c-MAF, företrädesvis VGLL3.
Enligt en ytterligare utföringsform innefattar steg a) också att bestämma en genuttrycksnivå för en eller flera av generna WNT5B och CTGF, EZH2, AMACR och MUC1. 5 10 15 20 25 30 35 14 Enligt en andra aspekt tillhandahåller den föreliggande uppfinningen ett förfarande för klassificering av prostatacancer hos en patient, innefattande stegen av att: a) bestämma en genuttrycksnivå, för minst en av gen vald från F3, lGFBP3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och/eller CTGF i ett prov från patienten; b) klassificera tumören genom attjämföra den i a) bestämda genuttrycksnivån med ett referensgenuttryck för samma gen(er) hos referenspatienter som är kända att ha en högrisk- respektive en lågrisktumör; och c) dra slutsatsen att om den i a) bestämda genuttrycksnivån matchar referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en högrisktumör, är tumören hos patienten en högrisktumör, och om den i a) bestämda genuttrycksnivån stämmer överens med referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en lågrisktumör, är tumören hos patienten en lågrisktumör.
Den andra aspekten av den föreliggande uppfinningen är baserad på det häri insedda faktum att uttrycket av någon av F3, lGFBP3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och CTGF in prover från patienter som har prostatacancer kan tjäna som indikator på sjukdomstillstånd hos nämnda patient. Uppfinnarna har funnit att det finns en positiv korrelation mellan genuttrycksnivåerna av någon av nämnda gener och överlevnad. Mer specifikt har uppfinnarna av föreliggande uppfinning funnit en korrelation mellan en hög uttrycksnivå av någon av F3, IGFBP3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och CTGF och längre överlevnad, således lågrisktumörer. Å andra sidan är en låg uttrycksnivå av någon av nämnda gener korrelerad med kortare överlevnad och således högrisktumörer.
Enligt en utföringsform av denna andra aspekt bestäms uttrycksnivån för minst två, såsom två, tre eller fyra av generna F3, lGFBP3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och CTGF i steg a) av förfarandet enligt föreliggande uppfinning och används därmed för klassificering av tumören.
Enligt en ytterligare utföringsform bestäms uttrycksnivån för samtliga gener F3, lGFBP3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och CTGF i steg a) av förfarandet enligt föreliggande uppfinning och används därmed för klassificering av tumören. 10 15 20 25 30 35 15 Enligt ännu en utföringsform bestäms uttrycksnivån även, dvs. utöver vilken som helst av kombinationerna ovan, för minst en av generna EZH2, AMACR och MUC1 och används därmed för klassificeringen.
Huruvida uttrycksnivån för en av nämnda gener hos en patient med prostatacancer är hög eller låg kan bestämmas genom attjämföra genuttrycksnivån i ett prov från patienten med ett gentuttrycksreferensvärde för samma gen(er) hos en referenspatient, eller grupp av referenspatienter, kända för att ha en högrisk- respektive lågrisktumör. Om uttrycksnivån för den valda genen/generna i patientprovet är lika hög eller högre än uttrycksnivån för samma gen hos en referenspatient känd för att ha en lågrisktumör kan tumören hos patienten klassificeras som låg risk. Om uttrycksnivån för den valda genen/generna i patientprovet är lika låg eller lägre än uttrycksnivån av samma gen hos en referenspatient känd för att ha en högrisktumör kan tumören hos patienten klassificeras som hög risk. När en grupp av referenspatienter används för jämförelse, kan den valda genens/genernas medel- eller medianuttrycksnivå i gruppen användas som genuttrycksreferensvärde.
Med att matcha genuttrycksnivån för den valda genen med referensgenuttrycket hos en referenspatient menas, när genuttrycksnivån bestäms för en gen, att när uttrycksnivån för den valda genen är lika hög eller högre än referensgenuttrycket hos en referenspatient som är känd för att ha en lågrisktumör matchar genuttrycksnivån med det referensgenuttrycket. På samma sätt, när uttrycksnivån för den valda genen är lika låg eller lägre än referensgenuttrycket hos en referenspatient som är känd för att ha en högrisktumör matchar genuttrycksnivån med det referensgenuttrycket.
Med att matcha genuttrycksnivån för den valda genen med referensuttrycket hos en referenspatient menas, när genuttrycksnivån bestäms för två eller fler gener, att det övergripande genuttrycksmönstret för de två eller fler valda generna måste matcha det övergripande referensgenuttrycksmönstret för de två eller fler valda generna hos en referenspatient. Således behöver inte uttrycket för båda eller samtliga valda gener, såsom det utvärderats var och en för sig, helt matcha referensgenuttrycket för de valda generna var och en för sig.
Snarare kan en väldigt hög genuttrycksnivå för en av generna kompensera för en lägre genuttrycksnivå för den/de andra genen/generna, och uttrycksmönstret 10 15 20 25 30 35 16 skulle fortfarande anses matcha. Med genuttrycksmönster menas genuttrycksnivån för generna i en selektion av två eller fler gener.
Matchning av genuttrycksprofiler erhållna från patienten respektive referenspatienten kan till exempel göras med hjälp av hierarkisk klustring av genuttrycksdatat från både patient- och referensproverna medelst metoder som är kända inom teknikområdet (set.ex. Eisen et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95214863-8). Klustringsmetoder är lämpliga för att utvärdera trender i stora datamängder. Oövervakad klusteranalys såsom hierarkisk klusteranalys används med fördel för att detektera grupper eller klasser i datamängder som inte lätt skulle kännas igen genom att bara titta igenom datat. Om patienten, vars tumör ska klassificeras, klustras eller grupperas tillsammans med referenspatienter som är kända för att ha en lågrisktumör, klassificeras tumören hos patienten också som en lågrisktumör. Om patienten, vars tumör ska klassificeras, klustras eller grupperas tillsammans med referenspatienter som är kända för att ha en högrisktumör, klassificeras tumören hos patienten också som en högrisktumör.
Med en högrisktumör menas att tumörsubtypen, såsom den bestämts genom användning av en grupp av patienter med känd tumörsubtyp och känd överlevnad, är förknippad med kortare allmän och/eller cancerspecifik överlevnadstid än en lågrisktumör. Subtypen kan exempelvis definieras som en tumörsubtyp med vissa kliniska parametrar eller med visst uttryck av vissa gener. När man bestämmer om det finns en signifikant skillnad avseende överlevnadstid mellan patienter med kända subtyper och kända överlevnadstider kan man använda beräkning av riskkvot (Hazard ratio), vilket är välkänt inom teknikområdet (Cox DR, J Royal Statist Soc B 1972, 342187- 220). En risk i en grupp är takten med vilken händelser, såsom dödsfall, inträffar. Risken i en grupp antas vara en konstant andel av risken i den andra gruppen. Denna andel är riskkvoten. Således, om riskkvoten är, med signifikans, högre eller lägre än ett föreligger det en högre risk hos en grupp jämfört med den andra.
Klassificeringen av tumören kan också inkludera fler klasser än högrisk och lågrisk, såsom en eller flera intermediära riskgrupp(er). 10 15 20 25 30 35 17 Provet från patienten kan vara ett tumörprov, såsom ett tumörprov som erhållits med finnålsaspiration (FNA), nålbiopsi eller genom kirurgi. Alternativt kan provet vara ett blodprov, plasma-, serum-, ryggmärgsvätske-, urin-, sädesvätske-, exsudat- eller ett avföringsprov erhållet från patienten. I synnerhet, kan genuttrycksnivån för lGFBP3 och F3 med fördel bestämmas genom analys av ett blodprov.
Enligt en utföringsform bestäms genuttrycksnivån för de utvalda generna medelst kvantifiering av mängden RNA eller mRNA som uttrycks från generna.
Mängden RNA eller mRNA kan exempelvis bestämmas genom användning av ett förfarande valt från mikroarrayteknologi, Northern-blotting och kvantitativ PCR (qPCR), såsom kvantitativ realtids-PCR (qrt-PCR), valbart multiplex PCR, eller någon annan inom teknikområdet känd metod för mätning av genuttryck.
Uppfinnarna har i föreliggande studie exempelvis utvecklat ett enkelt multiplext kvantitativt PCR(qPCR)-förfarande för att mäta uttrycksnivån för ett flertal valda markörgener i finnålsaspirationsprover (FNA-prover) från prostata. Det utvecklade förfarandet kan även användas för att mäta uttrycksnivåer i vilket tumör- eller blodprov som helst taget från patienten.
En viktig teknisk fördel med detta tillvägagångssätt är att, trots att markörgenerna enligt den föreliggande uppfinningen är identifierade med hjälp av ett stamcellstillvägagångssätt och tros vara viktiga för en cancerstamcellsfunktion, så behöver man inte direkt isolera CSC:erna från tumörproverna. Den enkla och robusta multiplex-qPCR-metoden som etablerats i den föreliggande studien kan appliceras direkt på färska prover från rutinmässiga nålbiopsier eller aspirationscytologi för prediktion av överlevnad och effekt av kastrationsbehandling vid tidpunkten för diagnos. Alla analyserade prover i den föreliggande studien var färskfrusna cytologiska cellutstryk som skulle säkerställa isolering av rena cancercell-RNA-molekyler av hög kvalitet för qPCR-analys. I några fall lyckades dock inte isoleringen av RNA på grund av att för få celler fanns på glasskivorna med FNA-cytologiutstryk. Vid framtida kliniska tillämpningar kan detta problem lätt lösas genom att omedelbart använda färska cellsuspensioner från FNA eller mikrodissekerade tumörprover från nålbiopsier för isolering av RNA. 10 15 20 18 Eftersom markörgenerna enligt föreliggande uppfinning (F3, IGFBP3, VGLL3, c- MAF, WNT5B och CTGF) kodar för proteiner är det också möjligt att använda immunohistokemi och andra proteinanalytiska metoder för att mäta deras uttryck av protein som en uppskattning eller en funktion av deras genuttryck.
Således kan, enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning, genuttrycksnivån indirekt bestämmas genom mätning av mängden protein som kodas för av nämnda gener. Mängden protein kan exempelvis bestämmas genom användning av metoder såsom ELlSA, RlA och masspektrometri, liksom andra inom teknikområdet kända metoder för proteindetektion.
Fackmannen inser att användbarheten hos den föreliggande uppfinningen inte är begränsad till kvantifieringen av genuttryck av någon särskild variant av markörgenerna enligt den föreliggande uppfinningen. Som icke-begränsande exempel, kan markörgenerna ha kodande sekvenser och aminosyrasekvenser såsom specificeras i Tabell 4.
Tabell 4 Gen/kodande Protein sekvens sekvens Gen Fullstäncæt namn SEKV ID NR: SEKV ID NR: IGFBP3 insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 3; 1 11 insulin-like growth factor binding protein 3 F3 koagulationsfaktor Ill; coagulation factor lll 2 12 VGLL3 Rudimentärlik 3 (Drosophila); vestigial like 3 3 13 (Drosophila) c-MAF-a lång form av v-maf muskuloaponeurotisk 4 14 fibrosarkom onkogen homolog (aviär); long form of v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian) c-MAF-b kort form av v-maf muskuloaponeurotisk 5 15 fibrosarkom onkogen homolog (aviär); short form of v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian) WNT5B wingless-typ MMTV integrationsplats familj, 6 16 medlem 5B; wingless-type MMTV integration site family, member 5B CTGF bindvävstillväxtfaktor; connective tissue growth 7 17 factor EZH2 förstärkare av zestehomolog 2 (Drosophila); 8 18 enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila) AMACR alfa-metylacyl-CoA-racemas; alpha-methylacyl- 9 19 CoA racemase MUC1 cellyteassocierad mucin 1; mucin 1, cell surface 10 20 associated Enligt några utföringsformer har de cDNA-sekvenser eller aminosyrasekvenser som är minst 85% identiska med eller liknande de listade sekvenserna, såsom 10 15 20 25 30 35 19 minst 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% eller åtminstone 99% identiska med eller liknande de sekvenser som är listade i Tabell 4.
Begreppet ”%-identitet”, såsom det används i denna beskrivning, är beräknat enligt följande. Söksekvensen inpassas (alignas) med målsekvensen medelst CLUSTAL W algoritmen (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acid Research, 22: 4673-4680 (1994)). En jämförelse görs över ett fönster som motsvarar den kortaste av de inpassade sekvenserna. Den kortaste av de inpassade sekvenserna kan i vissa fall vara målsekvensen. I andra fall kan söksekvensen utgöra den kortaste av de inpassade sekvenserna.
Aminosyraresterna jämförs i varje positionoch den procentuella andelen av positionerna i söksekvensen som har identiska motsvarigheter i målsekvensen anges som %-identitet.
Begreppet ”%-likhet" såsom det används i denna beskrivning, är beräknat på det följande sätt. lnpassning av sekvenserna och sekvensjämförelsen utförs i grunden på samma sätt som beskrivet för beräkningen av %-identitet. ”Likhet” bör dock tolkas enligt följande. Två aminosyrarester anses vara liknande om de tillhör samma grupp av aminosyrarester. Icke-begränsande exempel på grupper av aminosyrarester är den hydrofoba gruppen innefattande aminosyraresterna Ala, Val, Phe, Pro, Leu, Ile, Trp, Met och Cys; den basiska gruppen innefattande aminosyraresterna Lys, Arg och His; den sura gruppen innefattande aminosyraresterna Glu och Asp; den hydrofila gruppen innefattande de oladdade aminosyrorna Gln, Asn, Ser, Thr och Tyr; och den neutrala gruppen innefattande aminosyraresten Gly. Således jämförs aminosyrarester i varje position och procentandelen av positionerna i söksekvensen som har liknande motsvarigheter i målsekvensen anges som %- likhet.
Förfarandet enligt föreliggande uppfinning för klassificering av en tumör hos en patient som har prostatacancer kan ha många fördelar. Till exempel kan den, enligt en utföringsform av uppfinningen, användas för att prediktera nämnda patients överlevnad. För en patient med en tumör som är klassificerad som en lågrisktumör indikeras det att patienten har en god prognos, medan för en patient som har en tumör som är klassificerad som en högrisktumör indikeras det att patienten har en dålig prognos. 10 15 20 25 30 35 20 En dålig prognos för en patient kan betyda att patienten har en minskad sannolikhet för överlevnad eller förkortad överlevnadstid jämfört med en patient som har predikterats att ha en god prognos. En dålig prognos kan även betyda att patienten har en ökad risk för återfall eller metastasering jämfört med en patient med en god prognos. Till exempel kan sannolikheten för femårsöverlevnad hos en patient med en lågrisktumör vara 90% eller lägre, såsom 85%, 80%, 75%, 70%, 60% eller lägre medan sannolikheten för femårsöverlevnad hos en patient med en högrisktumör kan vara 50% eller lägre, såsom 45%, 40%, 30%, 20%, 10% eller lägre. Medianlängden för överlevnad hos patienter med lågrisktumörer kan likaledes vara 6 år eller längre, såsom 7 år, 8 år, 9 år, 10 år eller längre, medan medianlängden för överlevnad hos patienter med högrisktumörer kan vara 5 år eller kortare, såsom 4 år, 3 år, 2 år, 1 år eller kortare.
Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning kan klassificeringen av en tumör användas för att förbättra prediktlon av överlevnad med användning av kliniska parametrar. Uppfinnarna har till exempel visat (Exempel 3C) att när subtypklassificering genom användning av Signatur 1 (VGLL3, lGFBP3 och F3) adderas till konventionella prediktionsmodeller vilka endast nyttjar kliniska parametrar förbättras noggrannheten hos prediktionen signifikant.
Enligt en aspekt av föreliggande uppfinning tillhandahålls ett förfarande för att fatta beslut beträffande framtida behandling av patienten, varvid beslutet är beroende på klassificeringen enligt föreliggande uppfinning. Patienter som har en tumör som har blivit klassificerad att vara en högrisktumör behöver mer radikala eller kurativa behandlingar än patienter med lågrisktumörer, och därtill på ett tidigare stadium. Radikal eller kurativ behandling omfattar behandlingskurer valda från prostatektomi, strålning, kemoterapi, Kastrering eller en kombination därav. Patienter med tumörer som har klassificerats som lågrisktumörer behöver mindre eller ingen radikal eller kurativ behandling alls, utan kan föreskrivas uppmärksam väntan/"vänta-och se” eller aktiv övervakning.
Enligt vissa utföringsformer av föreliggande uppfinning behöver patienter med begränsad cancer av tumörsubtyp med hög eller intermediär risk, radikala eller kurativa behandlingar utan dröjsmål, medan patienter med begränsad cancer av lågrisktumörsubtyp tryggt kan bli tilldelade uppmärksam väntan med minimal oro eftersom kastrationsbehandling fortfarande kan vara en garanti för långtidsöverlevnad i fall att sjukdomen framskrider. För patienter med cancer 10 15 20 25 30 35 21 som är framskriden vid diagnos, kan de med Iågrisksubtyp ha största möjliga nytta av kastrationsbehandling eller anti-androgenterapi, medan patienter med högrisksubtyp eller intermediärrisksubtyp kan behöva bli behandlade tidigt med kemoterapi eller andra nya terapier.
Enligt en aspekt tillhandahåller uppfinningen vidare ett förefarande för behandling av patienten som har blivit diagnostiserad med prostatacancer, och vars tumör har klassificerats enligt uppfinningen, i enlighet med behandlingsbeslutet som tagits enligt ovan.
Enligt en aspekt tillhandahåller uppfinningen användning av någon av generna |GFBP3, F3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och/eller CTGF eller av proteinerna som kodas därav som prognostisk(a) markör(er) för prostatacancer. Enligt olika utföringsformer av denna aspekt tillhandahåller uppfinningen användning av en kombination av två, tre eller flera av generna IGF BP3, F3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och/eller CTGF eller proteinerna som kodas därav som prognostiska markörer för prostatacancer. En särskilt användbar utföringsform tillhandahåller användning av en kombination av generna |GRBP3 och F3 och, valbart, någon av VGLL3 och c-MAF, eller proteinerna som kodas därav som prognostiska markörer för prostatacancer.
Enligt en aspekt tillhandahåller uppfinningen en fast bärare eller ett kit för klassificering av en tumör hos en patient diagnostiserad med prostatacancer, innefattande nukleinsyrasonder (prober) eller antikroppar som är användbara för bestämning av genuttryck och är specifika för en kombination av minst två av generna |GFBP3, F3, VGLL3, c-MAF, WNT5B och CTGF. Enligt en utföringsform därav, innefattar nämnda fasta bärare eller kit nukleinsyrasonder eller antikroppar som är specifika för |GFBP3 och F3. Enligt en annan utföringsform innefattar den fasta bäraren eller kitet nukleinsyrasonder eller antikroppar som är specifika för |GFBP3 och F3 och endera eller båda av VGLL3 och c-MAF. Enligt ytterligare en utföringsform innefattar den fasta bäraren eller kitet vidare nukleinsyrasonder eller antikroppar som är specifika för EXH2, AMACR och MUC1.
Den fasta bäraren kan vara en array, såsom en cDNA-mikroarray, en polynukleotidarray eller en proteinarray. 22 Nukleinsyrasonderna för vilken som helst av kit-utföringsformerna kan exempelvis bara valda från sekvenserna som beskrivs i Tabell 6. Sådant kit är särskilt användbart för bestämning av genuttrycksnivåer genom användning av multiplex-PCR, t.ex. multiplex-kvantitativ-PCR. 5 Kitet kan även innefatta ytterligare reagenser som är nödvändiga för mätningen av genuttrycksnivå, som sekundära inmärkta sonder eller affinitetsligander för detektering och/eller kvantifiering av bundna eller amplifierade nukleinsyror eller antikroppar, beroende på valt förfarande. Sådana märkningar kan också vara 10 direkt bundna med eller kopplade till nukleinsyrasonder eller antikroppar.
Kitet kan vidare innefatta olika hjälpsubstanser för att möjliggöra att kitet kan användas enkelt och effektivt, till exempel lösningsmedel, tvättbuffertar o.s.v.
Vidare kan kitet företrädesvis även innefatta referensprover eller information om 15 referensgenuttrycksnivåer erhållna från patienter med kända högrisk- och lågriskstumörer genom användning av samma metod.
Tabell 6 SEKV SEKV SEKV Gen- Probsekvens ID ID ID symbol (5'-3') NR: Sensprimersekvens (S'-3') NR: Antisensprimersekvens(5'-3') NR: AMACR CTGCTGGAGCCCWCCGCCGC 21 CTGTGCAAGCGGTCGGATG 22 CACTCAGCCTGGCATAAATAAGC 23 CTGF TGTGTGACGAGCCCAAGGACCAAACC 24 GGAAATGCTGCGAGGAGTGG 25 CGTGTCTTCCAGTCGGTAAGC 26 EZH 2 ACACGCTTCCGCCAACAAACTGGTCC 27 GCGGGACGAAGAATAATCATGG 28 TGTCTCAGTCGCATGTACTCTG 29 F3 ACAACAGACACAGAGTGTGACCTCACCGA 30 AGTCAGGAGATFGGAAAAGCAAATG 31 CCGTGCCAAGTACGTCTGC 32 IGFBPB ACCCAGAACTTCTCCTCCGAGTCCAAGC 33 GACTACGAGTCTCAGAGCACAG 34 CTCTACGGCAGGGACCATATTC 35 IGFBP3 ACAGATACCCAGAACTTCTCCTCCGAGTCCA 36 TACAAAGTTGACTACGAGTCTCAGAG 37 AGTGTGTCTTCCATTTCTCTACGG 38 c»MAF TFITCATAACTGAGCCCACTCGCAAGTTGG 39 AGCGACAACCCGTCCTCTC 40 GGCGTATCCCACTGATG GC 41 c~MAF CAATCCATGAGCCAGACACCCATFCCCT 42 TCGAGITFGTGGTGGTGGTG 43 CTAGCAAGTTATGGAGAATTTCAGATTG 44 c-MAF 'ITTTCATAACTGAGCCCACTCGCAAGTFGG 45 AGCGACAACCCGTCCTCTC 46 GGCGTATCCCACTGATGGC 47 c-MAF TTFTCATAACTGAGCCCACTCGCAAGITGG 48 AGCGACAACCCGTCCTCTC 49 GGCGTATCCCACTGATGGC S0 MUC1 CCCCTCCCCACCCATTTCACCACCA 51 CGCCTGCCTGAATCTGTTCTG 52 CTGTAAGCACTGTGAGGAGCAG S3 VGLL3 AGACAGCTCAGCTCTCTCAAGCCAGC 54 AAAGCAAGATGGGGCTAACCC 55 TCCAAAAGGAAGTTGGGAAACTATTC 56 VGLL3 TGCTGTAGACCTGTATCGAATCCCACGC 57 TGGAGCCTITCATGGAACAGTAG 58 TACCACGGTGATTCCTTACTCTTG S9 VG LL3 CTGAATACCGCTAACTTCTTCTGCTGGCC 60 CCCCACAGCCTACTATCAGC 61 GACTTCCAGAGAGTCCTGCATC 62 VGLL3 AGACAGCTCAGCTCTCTCAAGCCAGC 63 AAAGCAAGATGGGGCTAACCC 64 GGTCCAAAAGGAAGTTGGGAAAC 65 WNTSB AGCCCTGCGACCGGCCTCGT 66 GGTGCTCATGAACCTGCAAAAC 67 AGGCTACGTCTGCCATCTTATAC 68 Beskrivninq av fiqurerna Figur 1 illustrerar tillvägagångssättet för identifiering av viktiga kandidat- 20 ESCGP:er i prostatacancer. A. Stegvis identifiering av kandidat-ESCGP:er för prediktering av prostatacancerprognos. B. 19 högt rankade ESCGP:er och 5 10 15 20 25 30 35 23 kontrollgener valdes ut enligt 4 kriterier såsom beskrivet i Exempel 2A. C.
Uttrycket av dessa 24 gener i prostatacancercellinjer verifierades genom qPCR.
Genuttycksmönstret visualiserades med hjälp av användning av Treeviewmjukvara med gen-mediancentrerade delta-Ct-värden. Nivån av genuttryck ökade från ljusgrå till svart medan delta-Ct-värdena minskade från ljusgrå till svar. Vitt representerar data som saknas.
Figur 2 illustrerar uttrycket av ESCGP:er genom RT-PCR i prostatacancercellinjer såsom beskrivs i Exempel 2B. Uttrycksmönstret för 34 ESCGP:er och 5 kontrollgener (c-MAF, AZGP1, AMACR, MUC1 and EZH2) verifierades med RT-PCR i de tre prostatacancerlinjerna (LNCaP, DU145 och PC3) med 50ng cDNA som mallmolekyl för varje reaktion. G|yceraldehyd-3- fosfatdehydrogenas (GAPDH) användes som intern laddningskontrollgen.
Figur 3 illustrerar verifiering av korrektheten i 4-plex-qPCR genom jämförelse med enkel (singel) qPCR. I en serie av cDNA-spädningsanalyser (cDNA- standardkurvmetoden) jämfördes resultaten av enkel qPCR och 4-plex-qPCR.
De optimerade förhållandena för 4-plex-qPCR definierades som de som gav det resultat som var mest likt resultatet av enkel qPCR.
Figur 4A-k visar resultattabeller från multivariat analys som gjordes för att identifiera markörgener som visar korrelation med överlevnad oberoende av alla kliniska parametrar (se Exempel 3A).
Figur 5 illustrerar tumörsubtypsklassificering för ett träningsset av patienter genom ESCGP-signatur 1 och ESCGP-signatur 2. l träningssetet hade 28 av 36 FNA-prover uttrycksdata för de fyra signifikanta generna (F3, |GFBP3, VGLL3 och c-MAF-a). En serie av klusteranalyser av olika genkombinationer visade att två genkombinationer eller signaturer på ett likartat sätt kunde klassificera prover i tre subtyper med hög korrelation med överlevnad. Den första (ESCGPsignatur 1) inkluderade F3, |GFBP3 och VGLL3 och den andra (ESCGP-signatur 2) inkluderade F3, |GFBP3 och c-MAF-a. Genuttrycksnivån ökar med minskande ACt-värde.
Figur 6 illustrerar skillnader i överlevnad mellan tumörsubtyper klassificerade med hjälp av ESCGPsignatur 1 (F3, |GFBP3 och VGLL3). A. FNA-prover från 95 patienter klassificerades in i tre tumörsubtyper eller grupper (Grupp 1, Grupp 10 15 20 25 30 35 24 2 och Grupp 3) med hjälp av ESCGP-signatur 1 (F3, IGFBP3 och VGLL3) såsom beskrivs i Exempel 3B. Varje patients kliniska parametrar är representerade såsom visas av olika rutor. Tomma rutor representerar längre överlevnad, lägre PSA-nivå, begränsat kliniskt stadium respektive högt/medelhögt differentierad tumörgrad. Rutor med olika ifyllnad representerar kortare överlevnad, högre PSA-nivå, framskridet kliniskt stadium, lågt differentierad tumörgrad. Nivån av genuttryck ökar med minskande ACt-värde.
B. Analys av allmän och cancerspecifik överlevnad hos tre undergrupper visas med Kaplan-Meier-kurvor. C. Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för patienter med PSAs50ng/ml vid diagnos. D. Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för patienter med en ålder av S73 vid diagnos. E och F är statistiska låddiagram som visar skillnad i överlevnad mellan de tre subtyperna eller grupperna. Ändarna hos lådorna är 25:e och 75:e kvartiler och linjen genom mitten av lådan visar medianvärdet med 95% konfidensintervall (Kl). P-värdena beräknades med hjälp av t-test och de p-värden som är markerade med en stjärna var av statistisk signifikans.
Figur 7 illustrerar klassificering av tumörsubtyp hos hela patientgruppen med hjälp av ESGCPsignatur 2. Samma 95 FNA-prover klassificerades i tre huvudtumörsubtyper eller grupper (Grupp 1, Grupp 2 och Grupp 3) med hjälp av signatur 2 (F3, IGFBP 3 och c-MAF-a). Genuttrycksnivån ökar med minskande ACt-värde.
Figur 8 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för patientgrupper som definieras med hjälp av PSA, ålder, kliniskt stadium och tumörgrad. A. 87 av de 95 patienterna i Figur 6 hade data avseende PSA i serum vid diagnos samt överlevnad. Patienterna delades in i två grupper, den ena med PSA>50ng/ml och den andra med PSAs50ng/ml. B. 92 av de 95 patienterna i Figur 6 hade data avseende ålder vid diagnos samt överlevnad. Patienterna delades in itvå grupper, den ena med ålder s 73 år och den andra med ålder > 73 år. C. 89 av de 95 patienterna i Figur 6 hade data beträffande kliniskt stadium och överlevnad. Patienterna delades in i två grupper baserat på kliniskt stadium, den ena med begränsat stadium (TsT2 och NO och MO och PSAs100ng/ml) och den andra med framskridet stadium (T>T2 eller N1 eller M1 eller PSA>100 ng/ml). D. 92 av de 95 patienterna i Figur 6 hade data beträffande tumörgrad och överlevnad. Patienterna delades in i två grupper, en med lågt differentierad 10 15 20 25 30 25 cancer och den andra med högt eller medelhögt differentierad cancer information. Alla p-värden beräknades med Log-rang testmetoden.
Figur 9 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för de tre tumörsubtyper som klassificerats med hjälp av ESCGPsignatur 1, hos patienter inom samma grupp definierad med hjälp av kliniska parametrar. Av de 95 patienterna i Figur 6, uppvisade 48 av de 95 patienterna PSAs5O ng/ml, 39 uppvisade PSA>5O ng/ml (B), 40 var av en ålder S73 (C), 52 var av en ålder >73 (D), 38 uppvisade begränsat stadium (E), 51 uppvisade framskridet stadium (F), 39 hade högt eller medelhögt differentierad cancer (G) och 53 hade lågt differentierad cancer (H). Patienter inom gruppen med samma kliniska parametrar kunde alltjämt klassificeras med ESCGP-signatur 1 (F3, lGFBP3 and VGLL3) i högrisksubtyp (Grupp 1), intermediärriskgrupp (Grupp 2) och Iågrisksubtyp (Grupp 3) med tydligt skild överlevnad. Övre och nedre del av varje panel visar allmän respektive cancerspecifik överlevnad. Log-rangtestet användes för att beräkna signifikans eller p-värde för skillnaden i överlevnad mellan subtyperna eller grupperna.
Figur 10 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för de tre tumörsubtyperna som klassificerats med hjälp av ESCGP-signatur 1 hos patienter primärt behandlade endast med kastrationsbehandling. Av de 95 patienterna i Figur 6 erhöll 65 kastrationsbehandling som den primära behandlingen. En tydlig skillnad i överlevnad mellan de tre tumörsubtyperna klassificerade enligt ESCGP-signatur 1 kunde observeras.
Figur 11 illustrerar Kaplan-Meier-överlevnadskurvor för de tre tumörsubtyperna som klassificerats med hjälp av ESCGP-signatur 1 hos patienter som primärt endast behandlats med kastrationsterapi och inom samma grupp som definierats med hjälp av kliniska parametrar. Av de 95 patienterna i Figur 6 erhöll 65 kastrationsterapi som den primära behandlingen. Av dessa 65 patienter, uppvisade 29 PSAs50 ng/ml (A), 37 uppvisade PSA>5O ng/ml (B), 24 var av en ålder S73 (C), 41 var av en ålder age>73 (D), 22 uppvisade begränsat stadium (E), 44 uppvisade framskridet stadium (F), 26 uppvisade högt eller medelhögt differentierad cancer (G) och 39 uppvisade lågt differentierad cancer (H). Tydlig skillnad i överlevnad kunde alltjämt observeras mellan högrisk- 10 15 20 25 30 26 (Grupp 1) och lågrisksubtyp (Grupp 3) hos patienter inom samma grupp av kliniska parametrar.
Figur 12 illustrerar prediktion av överlevnadstid med hjälp av parametrisk modell. Prediktion av överlevnadstid modellerades genom användning av den parametriska modellen med antagandet om Weibulls fördelning. A. Allmän (vänster del) och cancerspecifik (höger del) överlevnad predikterades med hjälp av kliniska parametrar inklusive PSA (>50 ng/ml vs. S50 ng/ml), kliniskt stadium (framskridet vs. begränsat), tumörgrad (lågt vs. högt + medelhögt differentierad) och ålder vid diagnos. B. Allmän (vänster del) och cancerspecifik (höger del) överlevnad predikterades med hjälp av kliniska parametrar tillsammans med tumörsubtyper eller grupper klassificerade med hjälp av ESCGP-signatur 1. Y- axeln representerar den faktiska överlevnadstiden medan X-axeln representerar den predikterade överlevnadstiden. Överlevnad i 5 år och 8 år är markerade i respektive grafer för förenklad tolkning. C. Tabellen presenterar uppskattad förbättring av överlevnadsprediktion genom att lägga till parametrar från klassificeringen av tumörsubtyp med hjälp av ESCGPsignatur 1. D. Tabellen representerar bidrag från ESCGP-signatur 1 respektive från kliniska parametrar för prediktionen av allmän och cancerspecifik överlevnad.
Exempel Allmänna metoder Bioinformatikanalys Bioinformatikanalys för identifiering av embryonala stamcellsgenprediktorer (ESCGPier) har beskrivits tidigare (WO 2008/013492 A1). Kortfattat hämtades genuttrycksdataset från tidigare publicerad cDNA-mikroarray från Stanford Microarray Databasen (SMD, http://smd.stanford.edu/). Kriterierna som användes för att hämta in data var som följer: Gen-/punkt(spot)selektion: alla gener eller kloner på arrayer selekterades, kontrollpunkter och tomma punkter inkluderades inte.
Datakollaps and inhämtning: raddata inhämtades och medelvärdesberäknades med SUID; UID-kolumnen innehåller NAMN. 10 15 20 25 30 27 Inhämtat data: Log(bas2) av R/G Normaliserad Kvot (Medelvärde).
Valda datafilter: Punkt är inte flaggad av experimentatorn.
Datafilter för GENEPIX resultatset: Kanal 1 Medelintensitet / Median Bakgrundsintesitet > 1.5 OCH normaliserad Kanal 2 (Medelintensitetl Median Bakgrundsintensitet) > 1.5.
För att genomföra oövervakad hierarkisk klusteranalys av medelkoppling användes programmet Cluster (version 3.0) och programmet TreeView användes för att visualisera klusterresultatet (Eisen et al, Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95214863-8). SAM (signifikant analys av mikroarrays) utfördes såsom tidigare beskrivet (Tusher et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 9825116-21).
Datacentrering av Inhämtat cDNA-Mikroarray Dataset: cDNA-mikroarraydatat från 5 humana ESC-linjer (Sperger et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100:13350-5) och 115 humana normala vävnader från olika organ (Shyamsundar et al, Genome Biol 2005, 6:R22) inhämtades från SMD enligt ovan beskrivna parametrar. Datamängden delades in i undergrupper enligt olika arrayomgångar. Generna centrerades inom varje arrayomgång genom användning av gencentreringsfunktionen hos programmet Cluster.
Undergrupperna kombinerades åter och arrayer centrerades genom användning av arraycentreringsfunktionen hos programmet Cluster. Efter centreringen sparades datamängden och konverterades till Excel-format.
ProstafacancerceI/injer Tre prostatacancercellinjer LNCaP, DU145 och PC3 köptes in från the American Type Culture Collection (ATCC). Cellodling genomfördes med medium och metoder enligt instruktion från ATCC. LNCaP, DU145 och PC3 celler upprätthålls med lscove's Modified Dulbeccds Medium (IMDM, Kat Nr. 21980-032, lnvitrogen) kompletterat med 10% Fetalt Kalvserum (Kat Nr. 10082- 147, lnvitrogen) och 50 enheter/ml och and 50 ug/ml Penicillin/Streptomycin (Kat Nr.15140-163, lnvitrogen). 10 15 20 25 30 28 FNA-prover FNA-prover (finnålsaspiration) från prostata togs enligt rutinmässigt tillvägagångssätt för cytologidiagnos vid Institutionen för Klinisk Cytologi och Patologi, Karolinska Sjukhuset, Stockholm, Sverige. FNA-prover erhölls från 241 patienter vid tidpunkten för diagnos före någon behandling. Minst ett färsk cytologiutstryk från varje patient Giemsa-infärgades för klinisk cytologidiagnos.
Kvarvarande dubbletter av färska utstryk överfördes till frys och hölls färskfrysta vid -80°C tills isoleringen av RNA-prover. De flesta FNA-cytologiutstryken med prostatacancerdiagnos uppskattades att innehålla mer än 80% tumörceller på grund av den välkända selekteringseffekten att aspirationsprovtagningsförfarandet kan anrika cancerceller på grund av deras minskade cellvidhäftning. Av de 241 patienterna, var isoleringen av RNA av god kvalitet från 193 patienter lyckad. Av dessa diagnostiserades 189 med prostatacancer medan 4 hade inte prostatacancer.
Kliniska särdrag hos gruppen Totalt analyserades färskfrysta FNA-prover från 189 prostatacancerpatienteri föreliggande studie. Dessa 189 patienter diagnostiserades mellan åren 1986- 2001. Alla de 189 patienterna hade kliniska symptom som ledde fram diagnosen prostatacancer. Under övervakning av en onkolog, samlade en praktikantläkare in relevant kliniskt data såsom ålder vid diagnos, diagnosdatum, cytologi- och biopsidiagnos, PSA i serum vid diagnos, kliniskt stadium, primär behandling osv. Tabell 5 visar detaljer beträffande kliniska särdrag hos dessa 189 patienter.
Data avseende diagnosdatum, dödsdatum och dödsorsak för alla patienterna erhölls först från regionala och nationella register och verifierades sedan med hjälp av tillgängliga läkarjournaler i original. Datumet för censurering av data var 31 december 2008. Vid denna tidpunkt var 22 av de 189 patienterna fortfarande vid liv, 163 hade avlidit och 4 saknade data i registren. Prostatacancerspecifik död definierades som att den primära eller sekundära dödsorsaken var prostatacancer eller metastaser. Dödsfall av andra orsaker definierades som att de primära och sekundära dödsorsakerna inte var prostatacancer eller 29 TABELL 5 Tabell 5. Kliniska särdrag hos patienterna, särdrag Träningsset Valideringsset 1 Valideringsset 2 Komplett set FinnàlsaspiratlonflFNA)~prover Genprofilerad FNA, Antal (%) 36 65 88 189 Median överlevnad (Nlln-ltâax) är 7 65 (0 07-17 80) 4 00 (0 21-15 67) 4 32 (0 19-15 08) 4 32 (0 07-17 80) Prostataspecifik dod, Antal (9/0) '13 (361) 40 (61 6) 45 (51 1) 98 (51 8) Annan död, Antal (Wu) 19 (52 8) 21 (32 3) 25 (28 4) 65 (34 4) Levande Antal (%) 3 (B 3) 3 (4 ö) 16 (18 2) 221116) Saknas, Antal (%) 'l (2 8) 1 (1 5) 2 (2 3) 4 (2 1) Ålder ar ' llfledelálder àr 70 4:7 8 72 1:87 73 828.9 72 6:8 7 Saknas 1 'l 2 4 PSA-nivå (ng/lnl), Antal (%)1 >500 10135 7) 23143 4) 35143 8) 68 (42 2) S500 18(64 3) 3066 6) 45156 3) 93 (57 8) Saknas 8 12 8 28 Kliniskt Stadium Antal (170): Frarnskridet 13 (40 6) 321542) 53 (60 7) 96 (549) Begransat 19 (59 4) 27 (45 8) 31 (39 3) 79 (45 1) Saknas 4 ö 4 14 WHO Tilmorgrad, Antal (fl/n) § Lågt 14 (389) 31 (50 O) 54 (62 1) 99 (53 5) lvledelhögt I Högt 22 (61 l) 31 (500) 33 (37 9) 86 (46 5) Saknas 0 3 1 4 Behandhng, Antal 1%) || Radikal prostatektomi 1 (3 2) 31,5 0) 4 (4 9) 8 (4 7) Strålning 51161) 2103) 11 (130) |8(10 5) Hormon 'Ablatio testis 19 (61 .3) 531883) 62 (76 5) 134 (77 9) Aldrig behandlad 6 (_19 4) 2 (3 3) 4 (4 9) 12 (7 0) Saknas 5 5 7 17 metastaser. Dessa fall inkluderade även patienter som avled av sjukdomar eller tillstånd som kunde förvärras på grund av prostatacancer eller vara relaterade till bieffekter och komplikationer av behandlingar.
Samtliga 189 patienter uppvisade kliniska symptom som ledde till digital undersökning av rektum, PSA-tester och påföljande FNA av prostata. Vid framskriden sjukdom var kastrationsbehandling den enda primära behandlingen för de flesta patienter (77,9%). 10 15 20 30 Isolering av RNA AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Kat Nr.80204, QIAGEN) användes för isolering av total-RNA från prostatacancercellinjer. RNAqueous®-Micro Kit (Kat Nr.1931, Ambion) för isolering av total-RNA mindre än 100 ng användes för att isolera total-RNA från färskfrysta FNA-prover från prostatacancerpatienter. Kvantitet och kvalitet av RNA kontrollerades genom användning av Agilent RNA 6000 Nano Kit (Kat Nr.5067-1511, Agilent) på en 2100 RNA Bioanalyzer (Agilent).
RNA-prover med ett RNA-integritetsnummer (RIN) större än 7 ansågs vara kvalificerade. I föreliggande studie isolerades kvalificerat total-RNA från 193 av de 241 FNA-proverna för vidare syntes av cDNA och kvantivativ-PCR-försök (qPCR)_ RT-PCR För reaktioner med omvänd transkription (RT), utfördes syntes av cDNA för PCR (polymeraskedjereaktion) med hjälp av Cloned AMV First-Strand cDNA Synthesis Kit (Kat Nr. 12328-032, lnvitrogen) enligt tillverkarens anvisningar.
För omvänd transkription (RT) användes maximalt 2 pg total-RNA i en reaktionsvolym av 20 pl. Uttrycksmönstret för 33 ESCGP:er och 5 kontrollgener validerades med hjälp av RT-PCR i prostatacancercellinjer med genspecifika primerpar (Figur 2). 50 ng cDNA användes till varje reaktion och försöket upprepades tre gånger. Konventionella metoder användes för design av primrar och förhållanden för PCR-cykling. 4-plex kvantitativ realtids-PCR Syntes av första strängen av cDNA för kvantitativ PCR (qPCR) kördes med ett QuantiTect® Reverse Transcription Kit (Kat Nr. 205311, QIAGEN). För varje qPCR användes upp till 1 pg total-RNA i en 20 ul reaktionsvolym. Reaktionen kördes på en ABI 7500 real time cycler som i realtid simultant kunde följa densiteten för fyra olika fluorescerande färgämnen (4-plex). Ingen passiv referens valdes vid denna kombination av fyra färgämnen. Förhållandena för 4- plex-qPCR var 1 cykel vid 50°C i 2 minuter; 1 cykel vid 94°C i 10 minuter; 40 cyklar vid 94°C i 1 minut och 1 cykel vid 60°C i 1.5 minut. Fast baslinjestartvärde 10 15 31 och slutvärde valdes för analys av Ct-värden (Schmittgen and Livak, Nat Protoc 2008, 3:1101-8; Wittwer et al, Methods 2001, 251430-42).
Optimering av 4-plex kvantitativ rea/tids-PCR En 4-plex-qPCR innehåller fyra par av genspecifika primers och fyra genspecifika Taqman-sonder varav varje dubbelinmärkts med en flourofor vid 5'-änden och en släckare (quencher) vid 3'-änden. I vår studie användes Cy5, FAM, Texas Red och VlC för inmärkning av 5'-änden medan BHQ-3, BHQ-1, BHQ-2 och TAMRA användes som 3'-släckare. De fyra olika kombinationerna av fluorofor-släckar-par möjliggjorde specifik detektion av PCR-produkter från de 4 olika generna. Totalt designades 45 predikterade 4-plex-sonder och 24 primerpar med Beacon Designer 7.0 mjukvara (Primer Biosoft) för de 19 ESCGP:erna och 5 kontrollgenerna. Sekvensinformation avseende sonder och primers för generna enligt föreliggande uppfinnings visas i Tabell 6.
För att validera huruvida 4-plex-qPCR har samma specificitet och effektivitet som singel-sonds-qPCR, användes cDNA-standardkurvmetoden. cDNA från totalt RNA som renats från LNCap-, DU145- och PC3-celler späddes till en koncentrationsserie på 10 pg, 100 pg, 1000 pg, 10000 pg, 100 000 pg och användes som mall för både singel-sonds-qPCR och 4-plex-qPCR.
Standardkurvor görs baserat på Ct-värdet för varje sond och mängden cDNA.
Lutnings- och r-värdena för cDNA-standardkurvorna härledda från singel-sonds- qPCR och 4-plex qPCR för samma gen jämfördes. Optimering av koncentrationer av sonder och primerpar utfördes tills det inte fanns någon signifikant skillnad i dessa värden mellan singel-sonds- och 4-plex-qPCR.
Dessa resultat visar att 0,2 uM sonder och 0,2 uM primerpar var de bästa koncentrationerna för 4-plex-qPCR. Validering av resultaten för 4-plex-qPCR presenteras i Figur 3.
Normalisering och centrering av Ct-värde från resultat av qPCR Ct (cykeltröskel) är ett mått på antalet PCR-cykler (i realtids-PCR) som krävs för att erhålla en fluorescerande signal eller tillräckligt med PCR-produkt. l föreliggande studie genererades Ct-värdet för en gen i ett prov efter realtids- 10 15 20 25 30 32 PCR genom användning av 7500 mjukvara (version 2.0.5, ABI). För att normalisera Ct-värdena för varje gen, beräknades delta-Ct-värdet enligt en ekvation ACt=CtgenX-CtGApDH där Ctgenx var Ct-värdet för genen som analyseras och CtGApDH var Ct-värdet för basgenen GAPDH (glyceraldehyd-3- fosfatdehydrogenas) (Schmittgen and Livak, Nat Protoc 2008, 3:1101-8; Wittwer et al, Methods 2001, 251430-42). Därmed normaliserades uttrycksnivån för varje gen i provet med uttrycksnivån av GAPDH. ACt-värdet var omvänt korrelerad med genuttrycksnivån. Varje panel av 4-plex-qPCT innehåller en specifik GAPDH sond respektive. Prover med svaga signaler uteslöts från analys (Ct-värde hos GAPDH >28). Ct-värdet sattes till 40 (sattes som det maximala Ct-värdet) för prover med svaga signaler för gener som ska analyseras. Delta-Ct-värdet för gener i alla prov centrerades genom användning av genmediancentreringsfunktionen hos ett Clusterprogram (version 3.0) (Eisen et al, Proc Natl Acad Sci U S A 1998, 95114863-8). Det centrerade deIta-Ct- värdet användes för statistiska analyser.
Statistisk analys av överlevnadskorrelation Allmän överlevnad och prostatacancerspecifik överlevnad användes som respektive slutpunkter i överlevnadsanalys för korrelationen med molekylära och kliniska parametrar. Överlevnadstid definierades som tiden från datumet för diagnos till dödsdatumet och användes som en kontinuerlig variabel. För förenklad tolkning definierades lång, intermediär och kort överlevnadstid som >8, 5-8 respektive <5 år. För patienter som primärt behandlats endast med kastrationsbehandling definierades ledtiden före behandling som tiden från datumet för diagnos till det datum kastrationsbehandlingen påbörjades och användes som en kontinuerlig variabel. Det centrerade delta-Ct-värdet för varje gen, ålder vid diagnos och serumnivå av PSA vid diagnos användes som kontinuerliga variabler. Med oövervakad hierarkisk klusteranalys klassificerades prov i tre grupper eller subtyper och grupperingen användes som en ickekontinuerlig variabel. Även PSA analyserades som en icke-kontinuerlig variabel med två kategorier S50 ng/ml eller >50 ng/ml. WHOs tumörgrad integrerades in i två kategorier: högt-medelhögt differentierad eller lågt differentierad. Det kliniska stadiet integrerades in itvå kategorier: framskriden 10 15 20 25 33 (vilken som helst av T2T3 eller N1 eller M1 eller PSA2100 ng/ml) eller begränsad (T multivariat analys av proportionell riskkvot enligt Cox och Cox-regression ufördes med Stata statistikmjukvara (Version 10.1, StataCorp LP). Kaplan- Meyer-analys så väl som statistiska blockdiagram utfördes med JMP® statistikmjukvara (version 8.0.1, SAS Institute lnc.).
Utformning av studie Studien utfördes i tre steg: 1) identifiering av en embryonal stamcellsgenprediktorsignatur (ESCGP- signatur) med 641 gener. 2) selektion av en delmängd av viktiga kandidatgener från ESCGP-signaturen för klassificering av prostatacancersubtyper och optimering av multiplex- qPCR i prostatacancercellinjer. 3) verifiering av den kliniska betydelsen genom mätning av uttrycksnivåer för dessa selekterade gener i FNA-prover från prostatacancerpatienter med 7- 20 års överlevnadsdata.
Detta resulterade i identifikationen av en delmängd av genmarkörer som visar en signifikant korrelation med antingen allmän eller cancerspecifik överlevnad.
Exempel 1. Identifiering av en ESCGP-signatur En ESCGP-signatur för klassificering av olika typer av cancer identifierades såsom beskrivs i patentdokumentet WO 2008/013492 A1. ln korthet inhämtades tidigare publicerade dataset av microarraydata för helgenom-cDNA, häriett från 5 humana ESC-linjer och 115 humana normala vävnader från olika organ, från Stanford Microarray Database (SMD) enligt ovanbeskrivna parametrar. Datacentrering av de inhämtade dataseten genomfördes också som beskrivs ovan. Dataset från normal vävnad användes för att underlätta centrering av data. Efter centrering isolerades subdatasetet för ESC-linjer från 10 15 20 25 30 34 hela datasetet. En enklass-SAM utfördes med enbart detta ESC-linjedataset, genom vilken alla gener rangordnades enligt hur konsekvent deras uttrycksnivåer var över de 5 ESC-linjerna. Genom att använda ett q-värde 50.05 som gränsvärdeidentifierade analysen 328 gener med konsekvent höga och 313 med konsekvent låga uttrycksnivåer i ESC:erna. De 641 generna benämndes embryonala stamcellsgenprediktorer (ESCGP:er.) Exempel 2A: Selektion av viktiga ESCGP-kandidater i prostatacancer.
Från listan av 614 ESCGP:er valdes en delmängd på 33 ESCGP:er liksom 5 kontrollgener ut som kandidater som kan möjliggöra klassificering av prostatacancer med användning av färre ESCGP:er. Kandidaterna valdes enligt fyra kriterier (se figur 1B); i) position i rangordning i genlistan på 641 ESCGP (benämnd ”ESCGP-listan” i figur S1 B); ii) position i rangordningen igenlistan som identifierats av Lapointe et al (Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101 :81 1- 816) innefattande signifikanta gener för klassificering av subtyper av prostatacancer (betecknade “PCa vs. PCa” ifigur 1B); iii) position i rangordningen i genlistan som identifierats av Lapointe et al (Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 1012811-816) innefattande signifikanta gener som särskiljer mellan prostatacancer och normal vävnad (betecknade ”Normal vs. PCa” i figur 1B); och iv) gener från tidigare viktiga publikationer (Lapointe et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2004, 101181 1-816; Varambally et al, Nature 2002, 4191624-629; Rubin et al, JAMA 2002, 28721662-70). I figur 1B markerades generna med ”1” om närvarande och ”O” om inte närvarande i de respektive genlistorna. Således uppfyllde vissa gener alla fyra kriterier, medan andra generna uppfyllde 1-3 av de fyra kriterierna. AZGP1, c-MAF, AMACR, MUC1 och EZH identifierades inte i listan av ESCGP:er men inkluderades som viktiga kontrollgener eftersom de befunnits ha betydelse i prostatacancer vid tidigare studier. Ett fåtal gener som c-MAF har olika RNA-transkript ((http://www.ncbi.n|m.nih.gov/gene/4094).
Primers och sonder designades att målinriktas mot dessa respektive olika RNA- transkript. 10 15 20 25 30 35 Exempel 2B: verifiering av uttryck av de selekterade generna i prostatacancercellinjer.
Uttryck av de 33 selekterade ESCGP:erna och 5 kontrollgenerna i tre olika prostatacancercellinjer validerades med RT-PCR som använde genspecifika primerpar (se Figur 2). Cellinjerna som användes för analys var LNCap, viken är härledd från en mindre aggressiv cancer, samt DU145 och PC3, båda härledda från aggressiva cancerformer. Av de 38 analyserade generna hade 14 likartat uttryck i alla tre cellinjer och ansågs mindre sannolikt vara värdefulla för tumörklassificering. De återstående 24 generna hade olika uttrycksmönster i den mindre aggressiva cellinjen LNCap och de aggressiva cellinjerna DU145 och PC3, och ansågs således mer sannolika att vara användbara för tumörklassificering för att skilja mellan mindre aggressiva och mer aggressiva cancerformer. Således valdes totalt 24 gener (25 genmarkörer) ut för optimering av multiplex-qPCR och utvärdering av förmåga att klassificera prostatacancer.
Exempel 3A: Fokuserad genuttrycksprofilering av FNA-prover från prostatacancer och identifiering av signifikanta ESCGP:er som korrelerar med överlevnad.
Uttryck av de 24 generna (25 genmarkörerna) analyserades i finnålsaspirationsprover (FNA-prover) från 189 prostatacancerpatienter med hjälp av multiplex-qPCR och analyserades sedan för korrelation med överlevnadsdata. Kliniska särdrag hos patientgruppen så väl som den statistiska analysen beskrivs ovan.
Alla kandidatgener kunde inte analyseras i varje FNA-prov på grund av för liten mängd av total-RNA i de flesta FNA-prover. För att kompromissa för denna begränsning delades gruppen på 189 patienter in i tre delar enligt tidsordningen av experimentet. De tre delarna innehöll prover från 36, 65 respektive 88 patienter (Tabell 5). Enbart gener som uppvisade signifikant korrelation med överlevnad i den första delmängden inkluderades, tillsammans med nya kandidatgener, i efterföljande delmängder. Överlevnadsanalys utfördes i var 10 15 20 25 30 36 och en av de tre delmängderna liksom i den slutliga kompletta gruppen (Tabell 1, Figur 5-7). Denna kompromissade screeningprocess säkerställde upptäckten av de mest signifikanta genmarkörerna men kan missa ett fåtal genmarkörer med mer blygsam signifikans.
Analys av korrelation med överlevnad utfördes både för kända kliniska parametrar hos patienterna och för genuttryck av de selekterade kandidatgenerna. Vid envariat analys visade alla kliniska parametrar signifikant korrelation med både allmän och cancerspecifik överlevnad (Tabell 1). Tio av de 25 genmarkörerna, F3 (koaguleringsfaktor lll; coagulation factor lll), WNT5B (wingless-typ MMTV integrationsplats familj, medlem 5B; winglesstype MMTV integration site family, member 5B), VGLL3 (rudimentärlik 3 (Drosophila); vestigial like 3 (Drosophila)), CTGF (bindvävnadstillväxtfaktor; connective tissue growth factor), IGF BP3 (insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein 3; insulin- like growth factor binding protein 3), c-MAF-a (lång form av v-maf muskuloaponeurotisk fibrosarkom oncogenhomolog (aviär); long form of v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), c-MAF-b (kort form av v-maf muskuloaponeurotisk fibrosarkom oncogenhomolog (aviär); short form of v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog (avian)), AMACR (alfa-metylacyl-CoA racemas; alpha-methylacyl-CoA racemase), MUC1 (cellytesassocierad mucin 1; mucin 1, cell surface associated) och EZH2 (förstärkare av zestehomolog 2 (Drosophila); enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila)) uppvisade signifikant korrelation med antingen allmän och/eller cancerspecifik överlevnad (Tabell 1). Ett p-värde < 0,05 anses signifikant genomgående genom studien. Uttrycksnivåerna (omvänt korrelerade till delta- Ct-värdet) för alla signifikanta gener utom EZH2 visade positiv korrelation med överlevnadstid (värde <1 iTabell 1).
Var och en av de 10 genmarkörerna med signifikant korrelation med överlevnad enligt envariat analys analyserades tillsammans med kliniska parametrar som inkluderar ålder vid diagnos, två-kategori PSA, tumörgrad samt kliniskt stadium med multivariat analys (Figur 4A-K). Multivariat analys indikerar hur mycket signifikansen av genvariabeln påverkas av kliniska parametrar. Antalet patienter som inkluderades i den multivariata analysen var mindre än det i den envariata 10 15 20 25 30 37 analysen på grund av att data för olika parametrar saknades.
Sammanfattningsvis uppvisade 4 gener (F3, lGFBP3, CTGF och AMACR) korrelation med både allmän och cancerspecifik överlevnad oberoende av alla kliniska parametrar. Alla fyra generna utom AMACR var från listan med ESCGP:er. Två gener (VVNT5B och EZH2) uppvisade oberoende korrelation med cancerspecifik överlevnad och en gen (VGLL3) uppvisade oberoende korrelation med allmän överlevnad.
Exempel 3B: Identifiering av signifikanta ESCGP-signaturer som korrelerar med överlevnad.
För att studera möjliga additiva effekter eller synergieffekter av flera gener i prediktionen av överlevnad, provade uppfinnarna olika kombinationer av de tio signifikanta generna i en serie av oövervakade hierarkiska klusteranalyser, med användning av data från patienter i det första setet (träningssetet). Två signaturer kunde på ett likartat sätt klassificera tumörer i tre undergrupper eller subtyper med signifikant skillnad i allmän och cancerspecifik överlevnad (Figur 5). Den första ESCGP-signaturen (Signatur 1) inkluderar markörgenerna VGLL3, lGFBP3 och F3. Den andra ESCGP-signaturen (Signatur 2) inkluderar markörgenerna c-MAF-a, lGFBP3 och F3. Klassificeringen av tumörsubtyp med hjälp av respektive signatur bekräftades genom användning av data från patienter i hela gruppen (Figur 6 och 7).
ESCGP-Signatur 1 (VGLL3, lGFBP3 och F3) uppvisade bättre resultat än ESCGP-Signatur 2 (c-MAF-a, lGFBP3 och F3) (Tabell 2 och 3). Av de 189 patienterna hade 87 data för både alla kliniska parametrar och för subtypsklassificering enligt Signatur 1. Multivariat analys för allmän och cancerspecifik överlevnad visade att subtypsklassificiering med Signatur 1 var den mest signifikanta parametern och oberoende av ålder, PSA-nivå, tumörgrad och kliniskt stadium (Tabell 2).
Medianen för allmän överlevnad var 2,60 år för högrisksubtypen, 3,85 år för den intermediära risksubtypen och 7,98 år för lågrisksubtypen (Figur 6E), motsvarande en riskkvot på 5,86 (95% Kl 2,91-11,78, P<0,001) för högrisk- och 10 15 20 25 30 38 3.45 (95% Kl 1,79-6,66, P<0,001) för den intermediära subtypen över lågrisksubtypen (Tabell 3). Skillnaden i allmän överlevnad tillskrevs både cancerspecifik och icke-cancerspecifik överlevnad (Figur 6E).
Intressant nog var medianöverlevnadstiden för ospecifika dödsfall 3,54 år för högrisk-, 3,70 år för intermediära risk- och 7,98 år i lågrisksubtypen. Inom fem år efter diagnos var andelen dödsfall som inte var direkt orsakade av prostatacancer endast 4/31 (12,9 %) i lågrisksubtypen jämfört med 9/31 (29%) i högrisksubtypen respektive 9/32 (28%) i den intermediära risksubtypen. Av de tre fallen med kortast överlevnadstid i lågrisksubtypen (symboliserade punkter), behandlades PC39 och PC140 aldrig efter prostatacancerdiagnos och dog av andra sjukdomar, och PC234 diagnostiserades vid 81 års ålder, behandlades bara med kastrationsbehandling och dog av prostatacancer.
Vidare visade Kaplan-Meier kurvor tydlig överlevnadsskillnad mellan de tre subtyperna klassificerade med tumör-ESCGP-Signaturen 1. Allmän överlevnad hos högrisksubtyp (Grupp 1), intermediär risksubtyp (Grupp 2) och lågrisksubtyp (Grupp 3) var 20 %, 40 % respektive 80 % vid 5 år och 10,3 %, 25,0 % respektive 64,4 % vid 8 år. Överlevnadsskillnaden mellan högrisk- och lågrisksubtyperna var mycket mer imponerande än resultaten med vilka som helst kliniska parametrar och observerades inom varje patientgrupp eller blev ännu mer tydlig inom samma patientgrupp definierad med PSA, kliniskt stadium, tumörgrad eller ålder (Figur 6C-D).
Till exempel hade 48 av 92 patienter serumnivåer av PSA s 50 ng/ml vid diagnos. Av dessa 48 patienter var allmänna överlevnaden vid 8 år 21 ,4% för högrisksubtypen, 47,1 % för den intermediära risksubtypen respektive 76,5 % för lågrisksubtypen. Mest imponerande var 40 av 92 patienter vid en ålder av S73. Av dessa 40 unga patienter var allmänna överlevnaden vid 8 år 7,1 % för högrisksubtypen, 44,4 % för den intermediära risksubtypen respektive 88,2 % för lågrisksubtypen. Dessutom sågs även skillnaden i överlevnad mellan de klassificerade grupperna hos patientgrupper som endast behandlats med kastrationsbehandling (Figurer 6-11). 10 15 39 Exempel 3C: Förbättrad prediktion av överlevnad genom att lägga till ESCGP- Signaturen till kliniska parametrar.
Parametrisk modell användes för överlevnadsprediktion för att uppskatta hur mycket subtypsklassificering med signaturen med VGLL3, IGFBP3 och F3 (Signatur 1) kunde förbättra prediktion med användning av samtliga kliniska parametrar (Figur 12). Jämfört med prediktionsmodellen som bara använde kliniska parametrar, förbättrar tillägget av subtypsklassificering med Signatur 1 exaktheten hos prediktionen av allmän överlevnad från 70,1 % upp till 78,2 % och för cancerspecifik överlevnad från 65,5 % till 71,3 % vid 5 år (Figur 12C).
Baserat på Cox-regressionsanalys visade nästlat likelihood-kvottest att subtypsklassificieringen med Signatur 1 signifikant bidrar till förbättringen av regressionsgraden i en multivariat modell tillsammans med kliniska parametrar (Figur 12D).
Claims (25)
1. 0 15 20 25 30 Ändrade krav 2012-10-22 SE 1150982-5 Patentkrav . Förfarande för klassificering av prostatacancer hos en patient, innefattande att: a) bestämma en genuttrycksnivå för generna F3 och |GFBP3 och för en eller flera av generna VGLL3 och c-MAF-a i ett prov från patienten; b) klassificera tumören genom att jämföra genuttrycksnivån bestämd i a) med ett referensgentuttryck för samma gener hos referenspatienter som är kända att ha en högrisk- respektive en Iågrisktumör; och c) dra slutsatsen att om genuttrycksnivån bestämd i a) matchar med referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en högrisktumör, är tumören hos patienten en högrisktumör, och om genuttrycksnivån bestämd i a) matchar med referensgenuttrycket hos referenspatienterna med en lågrisktumör, är tumören hos patienten en lågrisktumör. . Förfarande enligt krav 1, varvid a) vidare innefattar att bestämma en genuttrycksnivå för en eller flera av generna WNT5B och CTGF, EZH2, AMACR och MUC1. . Förfarande enligt något av kraven 1-2, varvid genuttrycksnivån bestäms genom kvantifiering av mängden av RNA eller mRNA som uttrycks från nämnda gener. . Förfarande enligt krav 3, varvid nämnda mängd av RNA eller mRNA bestäms genom användning av ett förfarande valt från mikroarrayteknologi, Northern-blotting och kvantitativ PCR (qPCR), såsom kvantitativ realtids-PCR (qrt-PCR), valbart multiplex-PCR. . Förfarande enligt något av kraven 1-2, varvid genuttrycksnivån bestäms genom kvantifiering av mängden av protein som kodas för av nämnda gener 10 15 20 25 30 35 6. Förfarande enligt krav 5, varvid nämnda mängd protein bestäms genom användning av ett förfarande valt från immunohistokemi, Western- blotting, ELISA, RIA och masspektrometri. 7. Förfarande enligt något av kraven 1-6, varvid provet är ett tumörprov erhållet från patienten. 8. Förfarande enligt något av kraven 1-6, varvid provet är ett blodprov erhållet från patienten. 9. Förfarande för att bestämma prognos för en patient diagnostiserad med prostatacancer och som har en tumör, varvid nämnda förfarande innefattar att a) klassificera tumören med förfarandet enligt något av kraven 1-8; och b) dra slutsatsen att en lågrisktumör indikerar att patienten har en god prognos och en högrisktumör indikerar att patienten har en dålig prognos. 10.Förfarande enligt krav 9, varvid den dåliga prognosen är en minskning i sannolikheten för överlevnad jämfört med den goda prognosen. 11.Förfarande enligt krav 9, varvid den dåliga prognosen är en minskning av allmän överlevnadstid jämfört med den goda prognosen. 12.Förfarande enligt krav 9, varvid den dåliga prognosen implicerar en minskning av cancerspecifik överlevnadstid jämfört med den goda prognosen. 13.Förfarande enligt krav 9, varvid den dåliga prognosen implicerar en ökad mortalitetsrisk jämfört med den goda prognosen. 14. Förfarande för att fatta ett behandlingsbeslut för en patient diagnostiserad med prostatacancer och som har en tumör, varvid nämnda förfarande innefattar att 10 15 20 25 a) klassificera tumören med förfarandet enligt något av kraven 1-8; och b) fatta ett behandlingsbeslut för nämnda patient beroende på klassificeringen erhållen i a). 15.Förfarande enligt krav 14, varvid nämnda behandlingsbeslut är att ge radikal eller kurativ behandling till en patient med begränsad cancer och en högrisktumör. 16.Förfarande enligt krav 14, varvid nämnda behandlingsbeslut är att avvakta med behandling eller att ge hormonterapi, såsom kastrationsbehandling eller anti-androgenbehandling, till en patient med begränsad cancer och en lågrisktumör. 17.Förfarande enligt krav 14, varvid nämnda behandlingsbeslut är att ge kemoterapi till en patient med framskriden cancer och en högrisktumör. 18.Förfarande enligt krav 14, varvid nämnda behandlingsbeslut är att ge kastrationsbehandling till en patient med framskriden cancer och en lågrisktumör. 19.Användning av generna F3 och lGFBP3 och någon av VGLL3 och c- MAF-a, eller proteinerna som kodas därav, som prognostiska markörer för prostatacancer.
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE1150982A SE536352C2 (sv) | 2011-10-24 | 2011-10-24 | Markörgener för klassificiering av prostatacancer |
| JP2014536297A JP6049739B2 (ja) | 2011-10-24 | 2012-10-24 | 前立腺癌の分類のためのマーカー遺伝子 |
| EP12775526.2A EP2771481B1 (en) | 2011-10-24 | 2012-10-24 | Marker genes for prostate cancer classification |
| US14/352,107 US9790555B2 (en) | 2011-10-24 | 2012-10-24 | Marker genes for prostate cancer classification |
| CA2852020A CA2852020C (en) | 2011-10-24 | 2012-10-24 | Marker genes for prostate cancer classification |
| CN201280064273.1A CN104024436B (zh) | 2011-10-24 | 2012-10-24 | 用于前列腺癌分类的标志物基因 |
| ES12775526.2T ES2689547T3 (es) | 2011-10-24 | 2012-10-24 | Genes marcadores para la clasificación de cáncer de próstata |
| PCT/EP2012/071077 WO2013060739A1 (en) | 2011-10-24 | 2012-10-24 | Marker genes for prostate cancer classification |
| DK12775526.2T DK2771481T3 (en) | 2011-10-24 | 2012-10-24 | MARKET GENERATIONS FOR CLASSIFICATION OF PROSTATACANCES |
| US15/725,678 US20180080088A1 (en) | 2011-10-24 | 2017-10-05 | Marker genes for prostate cancer classification |
| US16/904,789 US12060617B2 (en) | 2011-10-24 | 2020-06-18 | Marker genes for prostate cancer classification |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE1150982A SE536352C2 (sv) | 2011-10-24 | 2011-10-24 | Markörgener för klassificiering av prostatacancer |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE1150982A1 true SE1150982A1 (sv) | 2013-04-25 |
| SE536352C2 SE536352C2 (sv) | 2013-09-03 |
Family
ID=47049199
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE1150982A SE536352C2 (sv) | 2011-10-24 | 2011-10-24 | Markörgener för klassificiering av prostatacancer |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US9790555B2 (sv) |
| EP (1) | EP2771481B1 (sv) |
| JP (1) | JP6049739B2 (sv) |
| CN (1) | CN104024436B (sv) |
| CA (1) | CA2852020C (sv) |
| DK (1) | DK2771481T3 (sv) |
| ES (1) | ES2689547T3 (sv) |
| SE (1) | SE536352C2 (sv) |
| WO (1) | WO2013060739A1 (sv) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE536352C2 (sv) | 2011-10-24 | 2013-09-03 | Chundsell Medicals Ab | Markörgener för klassificiering av prostatacancer |
| CN110527728A (zh) * | 2013-08-08 | 2019-12-03 | 纽约州州立大学研究基金会 | 作为子宫颈癌和存活期的生物标记物的角蛋白 |
| CA2934828A1 (en) * | 2013-12-30 | 2015-07-09 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medici, Inc. | Prostate cancer gene profiles and methods of using the same |
| EP3037545A1 (en) * | 2014-12-23 | 2016-06-29 | The Provost, Fellows, Foundation Scholars, & the other members of Board, of the College of the Holy & Undiv. Trinity of Queen Elizabeth near Dublin | A DNA-methylation test for prostate cancer |
| CN108027373B (zh) | 2015-07-13 | 2021-04-09 | 佰欧迪塞克斯公司 | 受益于阻断t细胞程序性细胞死亡1(pd-1)检查点蛋白的配体活化的抗体药物的黑素瘤患者的预测性测试和分类器开发方法 |
| EP3359692A4 (en) * | 2015-10-05 | 2019-05-01 | Cedars-Sinai Medical Center | METHOD FOR CLASSIFYING AND TREATING CANCER |
| US20170107580A1 (en) | 2015-10-15 | 2017-04-20 | Dendreon Pharmaceuticals, Inc. | Gene expression markers for predicting overall survival in subjects treated with sipuleucel-t |
| CN107362353A (zh) * | 2016-05-11 | 2017-11-21 | 上海长海医院 | 一种去势抵抗的前列腺癌相关的药物靶点及其应用 |
| CN106399509A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-02-15 | 北京致成生物医学科技有限公司 | 一种诊断前列腺癌的产品及其应用 |
| WO2018222217A1 (en) * | 2017-05-29 | 2018-12-06 | Epelbaum Michael | Lifespan in regression-based estimation of phenomenon-specific probabilities of mortality or survivorship |
| CN107460238A (zh) * | 2017-07-07 | 2017-12-12 | 沈阳宁沪科技有限公司 | 一种无创高通量甲基化前列腺癌诊断、研究和治疗方法 |
| CN108647493B (zh) * | 2018-05-09 | 2022-01-18 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种肾透明细胞癌个性化预后评估方法 |
| EP3730941A1 (en) * | 2019-04-23 | 2020-10-28 | Institut Jean Paoli & Irène Calmettes | Method for determining a reference tumor aggressiveness molecular gradient for a pancreatic ductal adenocarcinoma |
| US11319354B2 (en) | 2019-07-10 | 2022-05-03 | Masonic Medical Research Laboratory | VGLL4 with UCP-1 cis-regulatory element and method of use thereof |
| CN114842970B (zh) * | 2022-03-29 | 2025-05-02 | 广州医科大学附属第一医院（广州呼吸中心） | 一种前列腺癌患者预后风险预测模型的构建方法 |
| CN116401427A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-07-07 | 广西医科大学 | 一种前列腺癌检测用血液基因标志物的筛选方法 |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6582908B2 (en) * | 1990-12-06 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Oligonucleotides |
| US7001735B2 (en) * | 2000-03-01 | 2006-02-21 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Glucose transporter/sensor protein and uses thereof |
| AU2001250051A1 (en) | 2000-03-23 | 2001-10-03 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Use of igf-i, igfbp-3 and psa to predict the risk of prostate cancer |
| US20030054419A1 (en) | 2001-02-07 | 2003-03-20 | Slawin Kevin M. | Method to determine prognosis after therapy for prostate cancer |
| US7935679B2 (en) | 2001-11-07 | 2011-05-03 | Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Gene expression profiling based identification of CKS1B as a potential therapeutic target in multiple myeloma |
| US20070099209A1 (en) | 2005-06-13 | 2007-05-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
| AU2007277508A1 (en) | 2006-07-28 | 2008-01-31 | Chundsell Medicals Ab | Embryonic stem cell markers for cancer diagnosis and prognosis |
| WO2008118148A2 (en) * | 2006-11-07 | 2008-10-02 | Thomas Jefferson University | Adiponectin for the treatment and diagnosis of albuminuria |
| EP2094719A4 (en) | 2006-12-19 | 2010-01-06 | Genego Inc | NEW PROCEDURES FOR THE FUNCTIONAL ANALYSIS OF EXPERIMENTAL HIGH-PERFORMANCE DATA AND IDENTIFIED GENDER GROUPS THEREOF |
| WO2008121132A2 (en) * | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Source Precision Medicine, Inc. D/B/A Source Mdx | Gene expression profiling for identification, monitoring, and treatment of prostate cancer |
| WO2009021338A1 (en) | 2007-08-15 | 2009-02-19 | UNIVERSITé DE SHERBROOKE | Alternative splicing gene variants in cancer detection |
| WO2009105154A2 (en) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | The Jackson Laboratory | Diagnostic and prognostic methods for cancer |
| EP2799557B1 (en) | 2008-02-28 | 2016-09-07 | The Ohio State University Research Foundation | MiR-32 antagonists for increasing responsiveness of prostate cancer to apoptosis |
| AU2009253675A1 (en) * | 2008-05-28 | 2009-12-03 | Genomedx Biosciences, Inc. | Systems and methods for expression-based discrimination of distinct clinical disease states in prostate cancer |
| US20090298082A1 (en) | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Klee George G | Biomarker panels for predicting prostate cancer outcomes |
| EP2315858A2 (en) | 2008-07-08 | 2011-05-04 | Source Precision Medicine, Inc. | Gene expression profiling for predicting the survivability of prostate cancer subjects |
| US20120156216A1 (en) | 2009-03-02 | 2012-06-21 | Youngman Oh | Methods and Compositions for Treatment of Tumor Metastasis |
| US20110166030A1 (en) | 2009-09-30 | 2011-07-07 | Yixin Wang | Prediction of response to docetaxel therapy based on the presence of TMPRSSG2:ERG fusion in circulating tumor cells |
| SE536352C2 (sv) | 2011-10-24 | 2013-09-03 | Chundsell Medicals Ab | Markörgener för klassificiering av prostatacancer |
-
2011
- 2011-10-24 SE SE1150982A patent/SE536352C2/sv unknown
-
2012
- 2012-10-24 ES ES12775526.2T patent/ES2689547T3/es active Active
- 2012-10-24 WO PCT/EP2012/071077 patent/WO2013060739A1/en not_active Ceased
- 2012-10-24 US US14/352,107 patent/US9790555B2/en active Active
- 2012-10-24 JP JP2014536297A patent/JP6049739B2/ja active Active
- 2012-10-24 DK DK12775526.2T patent/DK2771481T3/en active
- 2012-10-24 CN CN201280064273.1A patent/CN104024436B/zh active Active
- 2012-10-24 CA CA2852020A patent/CA2852020C/en active Active
- 2012-10-24 EP EP12775526.2A patent/EP2771481B1/en active Active
-
2017
- 2017-10-05 US US15/725,678 patent/US20180080088A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-06-18 US US16/904,789 patent/US12060617B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2852020C (en) | 2021-06-08 |
| CN104024436B (zh) | 2016-10-19 |
| CN104024436A (zh) | 2014-09-03 |
| EP2771481B1 (en) | 2018-07-04 |
| CA2852020A1 (en) | 2013-05-02 |
| WO2013060739A1 (en) | 2013-05-02 |
| US20180080088A1 (en) | 2018-03-22 |
| EP2771481A1 (en) | 2014-09-03 |
| DK2771481T3 (en) | 2018-10-15 |
| US12060617B2 (en) | 2024-08-13 |
| JP2015501151A (ja) | 2015-01-15 |
| US9790555B2 (en) | 2017-10-17 |
| ES2689547T3 (es) | 2018-11-14 |
| SE536352C2 (sv) | 2013-09-03 |
| JP6049739B2 (ja) | 2016-12-21 |
| US20140243433A1 (en) | 2014-08-28 |
| US20210017606A1 (en) | 2021-01-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12060617B2 (en) | Marker genes for prostate cancer classification | |
| JP6908571B2 (ja) | 前立腺癌の予後を定量化するための遺伝子発現プロフィールアルゴリズムおよび試験 | |
| Onken et al. | An accurate, clinically feasible multi-gene expression assay for predicting metastasis in uveal melanoma | |
| US8911940B2 (en) | Methods of assessing a risk of cancer progression | |
| JP2008521412A (ja) | 肺癌予後判定手段 | |
| KR20140024907A (ko) | 폐암용 바이오마커 | |
| WO2012158780A2 (en) | Lung cancer signature | |
| CN105102636A (zh) | 用于检测和测定前列腺癌预后的组合物和方法 | |
| WO2012125411A1 (en) | Methods of predicting prognosis in cancer | |
| US20150024956A1 (en) | Methods for diagnosis and/or prognosis of gynecological cancer | |
| US9195796B2 (en) | Malignancy-risk signature from histologically normal breast tissue | |
| WO2015154715A1 (en) | A method of diagnosis, prognosis or treatment of a cancer | |
| Guo et al. | Screening and identification of specific markers for bladder transitional cell carcinoma from urine urothelial cells with suppressive subtractive hybridization and cDNA microarray | |
| US20150011411A1 (en) | Biomarkers of cancer | |
| US20080119367A1 (en) | Prognosis of Renal Cell Carcinoma | |
| US11976330B2 (en) | MiRNA signature expression in cancer | |
| CN113817834A (zh) | 一种基于遗传因素的肺癌预后分期检测试剂、系统及应用 | |
| WO2021047992A1 (en) | Superior biomarker signature to predict the response of a breast cancer patient to chemotherapy | |
| CN119570928A (zh) | 用于结直肠癌诊断和预后预测的lncRNA组合 | |
| HK1197686B (en) | Marker genes for prostate cancer classification | |
| HK1197686A (en) | Marker genes for prostate cancer classification | |
| Clarke et al. | Clinical validation of a gene expression signature that differentiates benign nevi from malignant melanoma. |