RU2834919C1

RU2834919C1 - Вариант Corynebacterium glutamicum, обладающий улучшенной способностью продуцировать L-лизин, и способ продуцирования L-лизина с его использованием

Info

Publication number: RU2834919C1
Application number: RU2023123643A
Authority: RU
Inventors: Ми РЮ; Мин У МУН; Ин Пё ХОН; Сок Хён ПАК; Чжун Хён ПАК
Original assignee: СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2025-02-17

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен промотор, в котором нуклеотидная последовательность в областях -18 и -17 в последовательности промотора гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу в соответствии с SEQ ID NO: 1, заменена с CG на GT. Также предложены микроорганизм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-лизин, содержащий указанный промотор, и способ продуцирования L-лизина с использованием указанного микроорганизма. Изобретение обеспечивает высокую продукцию L-лизина. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 4 пр.

Description

Область изобретения

Описание настоящего изобретения относится к варианту Corynebacterium glutamicum, обладающему улучшенной способностью продуцировать L-лизин, и способу продуцирования L-лизина с его использованием.

Предшествующий уровень техники

L-Лизин представляет собой незаменимую аминокислоту, которая не синтезируется у человека или в организме животных и должен поступать извне и, как правило, продуцируется путем ферментации микроорганизмами, такими как бактерии или дрожжи. В производстве L-лизина могут быть использованы природные штаммы дикого типа или их варианты, модифицированные таким образом, что обладают усиленной способностью продуцировать L-лизин. Недавно для того, чтобы улучшить экономическую эффективность производства L-лизина, были разработаны различные рекомбинантные штаммы или варианты, обладающие превосходной способностью продуцировать L-лизин, и способы продукции L-лизина с их использованием, путем применения технологии генетической рекомбинации в отношении микроорганизмов, таких как Escherichia coli и Corynebacterium, и т.п., которые широко используются в производстве L-аминокислот и другие полезных веществ.

В соответствии с патентами Кореи №№10-0838038 и 10-2139806 нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки, включающие ферменты, связанные с продукцией L-лизина, или их аминокислотные последовательности модифицированы для увеличения экспрессии генов или для удаления генов, не являющихся необходимыми, и, таким образом, улучшения способности продуцировать L-лизин. Кроме того, в публикации патента Кореи №10-2020-0026881 раскрыт способ замены существующего промотора гена на промотор, обладающий сильной активностью, для увеличения экспрессии гена, кодирующего фермент, вовлеченный в продукцию L-лизина.

Как описано, разрабатывается множество способов, увеличивающих способность продуцировать L-лизин. Тем не менее, поскольку существуют десятки типов белков такой как ферменты, транскрипционные факторы, белки-переносчики и т.п, которые непосредственно или косвенно вовлечены в продукцию L-лизина, необходимо провестимножество исследований в отношении того, увеличивается ли или не увеличивается ли способность продуцировать L-лизин в зависимости от изменений активности этих белков.

Документы предшествующего уровня техники

Патентные документы

патент Кореи №10-0838038

патент Кореи №10-2139806

Публикация патента Кореи №10-2020-0026881

Техническая проблема

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить вариант Corynebacterium glutamicum, обладающий улучшенной способностью продуцировать L-лизин.

Кроме того, еще одна задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ продуцирования L-лизина с использованием варианта. Техническое решение

Авторы настоящего изобретения проводили исследования для разработки нового варианта, обладающего улучшенной способностью продуцировать L-лизин с использованием штамма Corynebacterium glutamicum, и в качестве результата они обнаружили, что продукция L-лизина увеличивается путем замещения нуклеотидной последовательности в конкретной позиции в промоторе гена lysA, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу, который действует на последней стадии пути биосинтеза L-лизина, таким образом, завершая описание настоящего изобретения.

В аспекте описания настоящего изобретения предложен вариант Corynebacterium glutamicum, обладающий улучшенной способностью продуцировать L-лизин за счет усиления активности диаминопимелатдекарбоксилазы.

Используемая здесь “диаминопимелатдекарбоксилазя” относится к ферменту, который катализирует реакцию продуцирования диоксида углерода и L-лизина путем расщепления углеродных связей хезо-диаминогептандиоата (mDAP) на последней стадии пути биосинтеза L-лизина.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения диаминопимелатдекарбоксилаза может быть получена из штамма рода Corynebacterium. Specifically, где штамм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium callunae, Corynebacterium suranareeae, Corynebacterium lubricantis, Corynebacterium doosanense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium uterequi, Corynebacterium stationis, Corynebacterium pacaense, Corynebacterium singulare, Corynebacterium humireducens, Corynebacterium marinum, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium freiburgense, Corynebacterium striatum, Corynebacterium canis, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium renale, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium caspium, Corynebacterium testudinoris, Corynebacaterium pseudopelargi или Corynebacterium flavescens, но не ограничивается ими.

Используемое здесь “усиление активности” означает то, что уровни экспрессии генов, кодирующих белки, такие как желаемые ферменты, транскрипционные факторы, белки-переносчики и т.п.увеличиваются за счет вновь встроенных генов или путем усиления генов по сравнению с штаммом дикого типа или штаммом перед модификацией. Такое усиление активности также включает случай, когда активность самого белка увеличивается посредством замещения, вставки или делеции нуклеотида, кодирующего ген или их комбинацию по сравнению с активностью белка, которой микроорганизм обладал исходно, и случай, когда общая активность фермента в клетках выше, чем у штамма дикого типа или штамма до модификации, за счет увеличенной экспрессии или увеличенной трансляции кодирующих его генов, и их комбинации.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения усиление активности диаминопимелатдекарбоксилазы может быть индуцировано путем сайт-специфической мутации в промоторе гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения промотор гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу, может быть представлен нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 1.

Используемый здесь “промотор” относится к конкретной области ДНК, которая регулирует транскрипцию генов путем включения сайта связывания с РНК-полимеразой, которая инициирует транскрипцию мРНК интересующего гена, и, как правило, располагается против хода транскрипции относительно сайта начала транскрипции. Промотор у прокариот определяется как область около сайта начала транскрипции, где связывается РНК-полимераза, и обычно состоит из двух коротких нуклеотидных последовательностей в области пар оснований от -10 до - 35 против хода транскрипции от сайта начала транскрипции. В описании настоящего изобретения мутация промотора приводит к тому, что промотор улучшается таким образом, что обладает более высокой активностью по сравнению с промотором дикого типа, и может увеличивать экспрессию генов, расположенных по ходу транскрипции, путем индукции мутаций в областипромотора, расположенной против хода транскрипции относительно сайта начала транскрипции.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения усиление активности диаминопимелатдекарбоксилазы может быть осуществлено путем замены одного или более чем одного основания в областях от -25 до -10 против хода течения относительно сайта начала транскрипции в последовательности промотора гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу.

Конкретней, мутация промотора в соответствии с описанием настоящего изобретения может представлять собой последовательную или не последовательную замену одного или более чем одного основания в областях от -25 по -10, предпочтительно, последовательную или непоследовательную замену одного, двух, трех, четырех или пяти оснований в областях от -20 по -15, в областях от -19 по -16 или в областях от -18 по -17.

В соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения ген lysA, кодирующий диаминопимелатдекарбоксилазу, образует оперон вместе с геном argS, кодирующим аргинил-тРНК синтетазу, и оперон argS-lysA регулируется одним промотором. Таким образом, CG, который представляет собой нуклеотидную последовательность в областях с-17по-18 последовательности промотора оперона argS-lysA штамма Corynebacterium glutamicum, заменен на СТ с получением варианта Corynebacterium glutamicum, обладающего новой последовательностью промотора гена lysA. Такой вариант Corynebacterium glutamicum может включать мутантную последовательность промотора гена lysA, которая представлена нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 2.

Кроме того, в соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения, CG, который представляет собой нуклеотидную последовательность областей от -17 по -18 последовательности промотора оперона argS-lysA штамма Corynebacterium glutamicum, заменен на GA с получением варианта Corynebacterium glutamicum, обладающего новой последовательностью промотора гена lysA. Такой вариант Corynebacterium glutamicum может включать мутантную последовательность промотора гена lysA, который представлен нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 3.

В соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения CG, которая представляет собой нуклеотидную последовательность в областях от -17 по -18 последовательности промотора оперона argS-lysA штамма Corynebacterium glutamicum, заменена на GT с получением варианта Corynebacterium glutamicum, обладающего новой последовательностью промотора гена lysA. Такой вариант Corynebacterium glutamicum может включать мутантную последовательность промотора гена lysA, который представлен нуклеотидной последовательностью в соответствии с SEQ ID NO: 4.

Используемая здесь “улучшенная способность продуцировать” означает увеличенную продукцию L-лизина по сравнению с родительским штаммом. Родительский штамм относится к штамму дикого типа или варианту штамма, который подвергнут мутации, и включает штамм, который непосредственным образом мутирован или трансформирован рекомбинантным вектором и т.п.В описании настоящего изобретения родительский штамм может представлять собой штамм Corynebacterium glutamicum дикого типа или штамм, подвергнутый мутации из дикого типа.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения родительский штамм представляет собой вариант, в котором мутации индуцированы в последовательностях генов (например, гены lysC, zwf и hom), вовлеченных в продукцию лизина, и может представлять собой штамм Corynebacterium glutamicum (далее названный как “штамм Corynebacterium glutamicum DS1”), депонированный в Корейском центре культур микроорганизмов (Korean Culture Center of Microorganisms) 2 апреля 2021 года под инвентарным №КССМ12969Р.

В соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения вариант Corynebacterium glutamicum, обладающий улучшенной способностью продуцировать L-лизин, может включать мутацию промотора гена lysA, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу, таким образом, демонстрируя увеличенную способность продуцировать L-лизин по сравнению с родительским штаммом, и в частности, может демонстрировать 2% или большее, в частности, от 2% до 40%, и, конкретней, от 3% до 30% увеличение продукции L-лизина по сравнению с родительским штаммом, таким образом, продуцируя от 60 г до 80 г L-лизина, предпочтительно от 65 г до 75 г L-лизина на 1 л культуры штамма.

Вариант Corynebacterium glutamicum в соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения может быть получен при помощи рекомбинантного вектора, включающего вариант, в котором часть последовательности промотора гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу в родительском штамме, заменена.

Используемая здесь “часть” обозначает не всю нуклеотидную последовательность или полинуклеотидную последовательность, и может составлять от 1 до 300, предпочтительно, от 1 до 100, и более предпочтительно, от 1 до 50, но не ограничивается этим.

Используемые здесь “вариант” относится к варианту промотора, в котором одно или более чем одно основание в областях от -25 по -10 в последовательности промотора гена диаминопимелатдекарбоксилазы, вовлеченного в биосинтез L-лизина, заменено.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения варианты, в каждом из которых нуклеотидная последовательность в-17и-18 областях в последовательности промотора гена диаминопимелатдекарбоксилазы заменена на СТ, GA или GT, могут иметь нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, соответственно.

Используемый здесь “вектор” представляет собой экспрессирующий вектор, способный экспрессировать желаемый белок в подходящей клетке-хозяине, и относится к генной конструкции, включающей существенные регуляторные элементы, которые функционально связаны таким образом, что экспрессируется генная вставка. Здесь “функционально связанный” означает то, что ген, требующий экспрессии, и его регуляторная последовательность функционально связаны друг с другом, чтобы индуцировать экспрессию гена, и “регуляторные элементы” включают промотор для осуществления транскрипции, любую операторную последовательность для контроля транскрипции, последовательность кодирующую подходящий сайт связывания мРНК с рибосомой, и последовательность, контролирующую прекращение транскрипции и трансляции. Такой вектор может включать плазмидный вектор, космидный вектор, бактериофаговый вектор, вирусный вектор и т.п, но не ограничивается ими.

Используемый здесь “рекомбинантный вектор” трансформируют в подходящую клетку-хозяина и затем он реплицируется независимо от генома клетки-хозяина, или может быть интегрирован в сам геном. В этом отношении “подходящая клетка-хозяин”, в которой вектор является реплицируемым, может включать ориджин репликации, который представляет собой конкретную нуклеотидную последовательность, для которой инициирована репликация.

Для трансформации подходящую технологию введения вектора выбирают в зависимости от клетки-хозяина для экспрессии гена-мишени в клетке-хозяине. Например, введение вектора может быть осуществлено путем электропорации, теплового шока, осаждения при помощи фосфата кальция (CaPO₄), осаждения при помощи хлорида кальция (CaCl₂), микроинъекции, способа с использованием полиэтиленгликоля (PEG), способа с использованием DEAE (диэтиламиноэтил)-декстрана, способа с использованием катионнойлипосомы, способа с использованием ацетата лития - DMSO (диметилсульфоксида), или путем их комбинации. Пока трансформированный ген может экспрессироваться в клетке-хозяине, он может быть включен без ограничения, независимо от того, встроен ли ген в хромосому клетки-хозяина или расположен за пределами хромосомы.

Клетки-хозяева включают клетки, трансфицированные, трансформированные или инфицированные рекомбинантным вектором или полинуклеотидом в соответствии с описанием настоящего изобретения in vivo или in vitro. Клетки - хозяева, включающие рекомбинантный вектор в соответствии с описанием настоящего изобретения представляют собой рекомбинантные клетки-хозяева, рекомбинантные клетки или рекомбинантные микроорганизмы.

Кроме того, рекомбинантный вектор в соответствии с описанием настоящего изобретения может включать селектируемый маркер, который предназначен для отбора транформанта (клетки-хозяина), трансформированного вектором. В среде, обработанной селектируемым маркером, могут выживать только клетки, экспрессирующие селектируемый маркер, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки. Селектируемый маркер может быть представлен канамицином, стрептомицином, хлорамфениколом и т.п., но не ограничивается ими.

Гены, встроенные в рекомбинантный вектор для трансформации в соответствии с описанием настоящего изобретения, могут быть встроены в клетки-хозяева, такие как микроорганизмы рода Corynebacterium, вследствие гомологичной рекомбинации.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения клетка-хозяин может представлять собой штамм рода Corynebacterium, например, штамм Corynebacterium glutamicum DS1.

Кроме того, в еще одном аспекте описания настоящего изобретения предложен способ продуцирования L-лизина, где способ включает стадии а) выращивания варианта Corynebacterium glutamicum в среде; и б) выделения L-лизина из варианта или среды, в которой выращивают вариант.

Выращивание может быть осуществлено в соответствии с подходящей средой и условиями выращивания, известными в области техники, и любой специалист в данной области техники может легко скорректировать и использовать среду и условия выращивания. В частности, среда может представлять собой жидкую среду, но не ограничивается этим. Способ выращивания может включать, например, выращивание партиями, непрерывное выращивание, периодическое выращивание с подпиткой или их комбинацию, но не ограничивается этим.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения среда должна удовлетворять требованиям конкретного штамма подходящим образом, и может быть подходящим образом модифицирована специалистом в данной области техники. В отношении культуральной среды для штамма рода Corynebacterium можно обратиться к известному документу (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981), но не ограничиваться этим.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения среда может включать различные источники углерода, источники азота и компоненты микроэлементов. Источники углерода, которые могут быть использованы, включают сахариды и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал, целлюлоза и т.п., масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло, кокосовое масло и т.п., жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества могут быть использованы индивидуально или в смеси, но не ограничиваются этим. Источники азота, которые могут быть использованы, включают пептон, дрожжевой экстракт, экстракт мяса, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевую муку, мочевину, или неорганические соединения, например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота также могут использоваться по отдельности или в смеси, но не ограничиваются этим. Источники фосфора, которые могут быть использованы, могут включать первичный кислый фосфат калия или вторичный кислый фосфат калия или соответствующие соли, содержащие натрий, но не ограничиваются этим. Культуральная среда может включать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые требуются для роста, но не ограничиваются этим. Кроме того, культуральная среда может включать необходимые ростовые вещества, такие как аминокислоты и витамины. Кроме того, в культуральной среде может быть использованы подходящие предшественники. Среда или отдельные компоненты могут быть добавлены в культуральную среду периодически или непрерывным образом при помощи подходящего способа во время выращивания, но не ограничиваясь этим.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения рН культуральной среды может быть скорректирован путем добавления соединений, таких как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, ортофосфорная кислота и серная кислота, в культурную среду микроорганизма подходящим образом во время выращивания. Кроме того, во время выращивания вспенивание может быть подавлено с использованиемпеногасителя, такого как полигликолевый сложный эфир жирной кислоты. Кроме того, для поддержания культуральной среды в аэробном состоянии кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух) может быть инжектирован в культуральную среду. Температура культуральной среды как правило может составлять от 20°С до 45°С, пример, от 25°С до 40°С. Выращивание может продолжался до тех пор, пока не получают желаемое количество полезного вещества. Например, время выращивание может составлять от 10 часов до 160 часов.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения на стадии выделения L-лизина из выращиваемого варианта и среды, в которой выращивают вариант, продуцированный L-лизин может быть собран или выделен из культурной среды с использованием подходящего способа, известного в области техники, в зависимости от способа выращивания. Например, может быть использовано центрифугирование, фильтрование, экстракция, распыление, сушка, упаривание, осаждение, кристаллизация, электрофорез, фракционное растворение (например, осадка сульфата аммония), хроматография (например, ионный обмен, аффинная, гидрофобная и гель-фильтрационная), и т.п, но способ не ограничивается этим.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения на стадии выделения лизина культурную среду центрифугируют при низкой скорости для удаления биомассы, и полученный супернатант может быть разделен при помощи ионообменной хроматографии.

В соответствии с конкретным воплощением описания настоящего изобретения стадия выделения L-лизина может включать процесс очистки L-лизина.

Благоприятные эффекты

Вариант Corynebacterium glutamicum в соответствии с описанием настоящего изобретения может улучшать выход L-лизина путем увеличения или усиления экспрессии гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу, по сравнению с родительским штаммом.

Краткое описание графических материалов

ФИГ. 1 демонстрирует конструкцию вектора pCGI(Pm1-argS+lysA), включающего промотор оперона argS-lysA, в котором CG в позициях -17 и -18 промотора заменены на СТ в соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения;

ФИГ. 2 демонстрирует конструкцию вектора pCGI(Pm2-argS+lysA) включающего промотор оперона argS-lys А, в котором CG в позициях -17 и -18 промотора заменены на GA в соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения; и

ФИГ. 3 демонстрирует конструкцию вектора pCGI(Pm3-argS+lysA) включающего промотор оперона argS-lysA, в котором CG в позициях -17 и -18 промотора заменены на GT в соответствии с одним из примеров воплощений описания настоящего изобретения.

Способ осуществления изобретения

Далее, описание настоящего изобретения будет описано более подробно. Тем не менее, данное описание приведено исключительно с целью понимания описания настоящего изобретения, и объем описания настоящего изобретения не ограничен данным примером описания.

Пример 1. Получение варианта Corynebacterium glutamicum

Для получения варианта Corynebacterium glutamicum, обладающего усиленной диаминопимелатдекарбоксилазной активностью, использовали штамм Corynebacterium glutamicum DS1 иЕ. coli DH5a (HIT Competent cells™, кат. №RH618).

Штамм Corynebacterium glutamicum DS1 выращивали при температуре 30°C в среде СМ-бульон (рН 6,8), имеющей состав 5 г глюкозы, 2,5 г NaCl, 5,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г мочевины, 10,0 г полипептона и 5,0 г мясного экстракта в 1 л дистиллированной воды.

Е. coli DH5a выращивали при температуре 37°С в среде LB (Луриа-Бертани), имеющей композицию 10,0 г триптона, 10,0 г NaCl и 5,0 г дрожжевого экстракта в 1 л дистиллированной воды.

В качестве антибиотиков использовали канамицин и стрептомицин, произведенные Sigma. Анализ секвенирования тДНК осуществляли в Macrogen Co., Ltd.

1-1. Получение рекомбинантного вектора

Для увеличения продукции лизина в штамме вводили улучшение диаминопимелатдекарбоксилазы, которая действует на последней стадии пути биосинтеза лизина. Способ, используемый в этом примере, индуцировал специфическую мутацию в промоторе оперона argS-lysA для увеличения экспрессии гена lysA, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу. Нуклеотидная последовательность в позициях -17 и -18 промотора оперона argS-lysA была заменена с CG на СТ, и 510 п. о. левого плеча и 480 п. о. правого плеча, расположенных вокруг оперона argS-lysA в геноме Corynebacterium glutamicum, амплифицировали с использованием ПЦР (полимерадной цепной реакции), и связывали с использованием ПЦР с перекрывающимися праймерами, и затем клонировали в рекомбинантный вектор pCGI (смотри Kim et at, Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 128-130). Плазмида была названа pCGI (Pm1-argS+lysA) (смотри Фиг. 1). Для конструирования плазмиды прайм еры, представленные в таблице 1 ниже, использовали для амплификации каждого фрагмента гена.

ПЦР осуществляли с использованием вышеупомянутых праймеров в следующих условиях. Выполнялось от 25 до 30 циклов с использованием термоциклера (ТР600, TAKARA BIO Inc., Япония) в присутствии 1 единицы смеси ДНК-полимеразы pfu-X (Solgent) с использованием 1 пМ олигонуклеотида и 10 нг хромосомной ДНК штамма Corynebacterium glutamicum DS1 в качестве матрицы в реакционном растворе, к которому добавляли 100 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dATP (дезоксиаденозина трифосфат), dCTP (дезоксицитидина трифосфат), dGTP (дезоксигуанозина трифосфат), dTTP (дезокситимидина трифосфат)). ПЦР осуществляли в условиях (1) стадии денатурации: при 94°С в течение 30 секунд, (2) стадии отжига: при 58°С в течение 30 секунд, и (3) стадии удлинения: при 72°С в течение от 1 минуты до 2 минут (время полимеризации 2 минуты на 1 т.п.о.).

Каждый полученный таким образом фрагмент гена клонировали в вектор pCGI с использованием самособирающегося клона. Вектор трансформировали в Е. coli DH5a, высевали на чашку с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл канамицина, и выращивали при 37°С в течение 24 часов. Образованные в конце колонии выделяли и подтверждали то, что вставка правильно присутствует в векторе. Этот вектор выделяли и использовали в рекомбинации штамма Corynebacterium glutamicum.

В качестве способа, обычно используемого в вышеуказанном способе, соответствующие гены амплифицировали при помощи ПЦР из геномной ДНК штамма Corynebacterium glutamicum DS1, и встраивали в вектор pCGI с использованием способа самособирающегося клона в соответствии со стратегией и, отбирали в Е. coli DH5a. Для замены оснований в хромосоме каждый фрагмент гена был индивидуально амплифицирован, и фрагмент ДНК-мишени получали при помощи ПЦР сперекрывающимися праймерами. Во время манипуляции с генами полимеразу Ex Taq (Takara) и полимеразу Pfu (Solgent) использовали в качестве ферментов для амплификации путем ПЦР, и различные ферменты рестрикции и ферменты модификации ДНК, доступные от NEB, использовали в соответствии с поставляемым буфером и протоколом. 1-2. Получение варианта

Штамм DS3, который представляет собой вариант штамма, получали с использованием вектора pCGI (Pm1-argS+lysA). Вектор получали в конечной концентрации 1 мкг/мкл, и основная рекомбинация был индуцирована в штамме Corynebacterium glutamicum DS1 с использованием электропорации (смотри Tauch et at, FEMSMicrobiology letters 123 (1994) 343-347). Подвергнутый электропорации штамм затем распределяли по чашке с СМ-агаром, содержащим 20 мкг/мкл канамицина, для того, чтобы изолировать колонии, и затем при помощи ПЦР и анализа секвенирования оснований подтверждали то, был ли вектор правильно встроен в индуцируемую позицию в геноме. Для индукции вторичной рекомбинации выделенный штамм инокулировали в жидкую среду с СМ-агаром, содержащую стрептомицин, выращивали в течение ночи или дольше, и затем распределяли по агаровой среде, содержащей такую же концентрацию стрептомицина, для выделения колоний. После проверки устойчивости к канамицину в окончательных выделенных колониях было подтверждено с помощью анализа секвенирования оснований то, были ли введены мутации в ген lysA в штаммах без устойчивости к антибиотикам (смотри Schafer et at, Gene 145 (1994) 69-73). Наконец, получали вариант Corynebacterium glutamicum (DS3), в который был введен мутантный ген lysA.

Пример 2. Получение варианта Corynebacterium glutamicum

Вариант Corynebacterium glutamicum получали тем же самым образом, как в примере 1, за исключением того, что нуклеотидная последовательность в позициях -17 и -18 промотора оперона argS-lysA была заменена с CG на GA.

В данном случае, для конструирования плазмиды праймеры, представленные в таблице 2 ниже, использовали для амплификации каждого фрагмента гена, и штамм DS3-1, который представляет собой вариант штамма, получали с использованием полученного плазмидного вектора pCGI(Pm2-argS+lysA) (смотри Фиг. 2). Наконец, получили вариант Corynebacterium glutamicum (DS3-1), в который был введен мутантный ген lysA.

Пример 3. Получение варианта Corynebacterium glutamicum

Вариант Corynebacterium glutamicum получали тем же самым образом, как в примере 1, за исключением того, что нуклеотидная последовательность в позициях -17 и -18 промотора оперона argS-lysA была заменена с CG на GT.

В данном случае, для конструирования плазмиды праймеры, представленные в таблице 3 ниже, использовали для амплификации каждого фрагмента гена, и штамм DS3-2, который представляет собой вариант штамма, получали с использованием полученного плазмидного вектора pCGI(Pm3-argS+lysA). Наконец, получили вариант Corynebacterium glutamicum (DS3-2), в который был введен мутантный ген lysA.

Экспериментальный пример 1. Сравнение продукции L-лизина между вариантами

Продукцию L-лизина сравнивали между родительским штаммом Corynebacterium glutamicum DS1 и штаммом DS2, штаммом DS2-1 и штаммом DS2-2, которые представляют продуцирующие лизин варианты, полученные в примерах 1-3.

Каждый штамм инокулировали в колбу объемом 100 мл, содержащую 10 мл лизиновой среды, имеющей состав, представленный в таблице 4 ниже, и выращивали при 30°С в течение 48 часов при встряхивании при 180 об./мин. После завершения выращивания анализ лизина осуществляли путем измерения продукции L-лизина с использованием HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) (Shimazu, Japan), и результаты представлены

в таблице 5.

В соответствии с представленным в таблице 5 варианты Corynebacterium glutamicum DS3, DS3-1 и DS3-2 демонстрировали приблизительно 4,7%, 6,3% и 12,5% увеличения продукции L-лизина, соответственно, по сравнению с родительским штаммом Corynebacterium glutamicum DS1, вследствие замены конкретных позиций (области -17 и -18) в последовательности промотора оперона argS-lysA на оптимальную нуклеотидную последовательность (СТ, GA или GT) для усиления пути биосинтеза лизина. Эти результаты свидетельствуют о том, что усиленная экспрессия гена lysA улучшает способность продуцировать L-лизин штаммом за счет того, что способствует расщеплению углеродных связей в предшественнике лизина.

Вышеприведенное описание настоящего изобретения было описано со ссылкой на предпочтительные примеры его воплощений. Специалисту в данной области техники, для которого приведено описание настоящего изобретения, понятно то, что описание настоящего изобретения может быть осуществлено в модифицированном варианте без отклонения от существенных характеристик описания настоящего изобретения. Соответственно, раскрытые здесь примеры воплощений должны рассматриваться в иллюстративном, а не ограничительном аспекте. Объем описания настоящего изобретения представлен не в вышеуказанном раскрытии, а в приложенной формуле изобретения, и все различия в объеме, эквивалентном ему, следует интерпретировать как включенные в описание настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> DAESANG CORPORATION

<120> ВАРИАНТ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, ОБЛАДАЮЩИЙ

УЛУЧШЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ ПРОДУЦИРОВАТЬ L-ЛИЗИН, И СПОСОБ

ПРОДУЦИРОВАНИЯ L-ЛИЗИНА С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

<130> OPA23234

<150> KR 10-2021-0030960

<151> 2021-03-09

<150> KR 10-2021-0054313

<151> 2021-04-27

<160> 16

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 200

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Последовательность промотора гена lysA

<400> 1

cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60

caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120

ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180

ctcggctaga atttctcccc 200

<210> 2

<211> 200

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Мутантная последовательность промотора гена lysA

<400> 2

cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60

caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120

ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180

ctctgctaga atttctcccc 200

<210> 3

<211> 200

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<400> 3

cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60

caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120

ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180

ctgagctaga atttctcccc 200

<210> 4

<211> 200

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<400> 4

cagtcgaggc ggcaagaact gctactaccc tttttattgt cgaacggggc attacggctc 60

caaggacgtt tgttttctgg gtcagttacc ccaaaaagca tatacagaga ccaatgattt 120

ttcattaaaa aggcagggat ttgttataag tatgggtcgt attctgtgcg acgggtgtac 180

ctgtgctaga atttctcccc 200

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-LA-F1

<400> 5

tgattacgcc tccgcgaggc tgcactgcaa 30

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-LA-F2

<400> 6

tccgcgaggc tgcactgcaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-LA-R1

<400> 7

gtacacccgt cgcacagaat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-LA-R2

<400> 8

tctagcagag gtacacccgt 20

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-RA-F1

<400> 9

ctctgctaga atttctcccc atgacaccag 30

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-RA-F2

<400> 10

atttctcccc atgacaccag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-RA-R1

<400> 11

gcacacgacc caaagagtca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-RA-R2

<400> 12

gaagcctcca gcacacgacc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-LA2-R2

<400> 13

tctagctcag gtacacccgt 20

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-RA2-F1

<400> 14

ctgagctaga atttctcccc atgacaccag 30

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-LA3-R2

<400> 15

tctagcacag gtacacccgt 20

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lysA-RA3-F1

<400> 16

ctgtgctaga atttctcccc atgacaccag 30

<---

Claims

1. Промотор, в котором нуклеотидная последовательность в областях -18 и -17 в последовательности промотора гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу в соответствии с SEQ ID NO: 1, заменена с CG на GT.

2. Микроорганизм Corynebacterium glutamicum, продуцирующий L-лизин, где нуклеотидная последовательность в областях -18 и -17 в последовательности промотора гена, кодирующего диаминопимелатдекарбоксилазу в соответствии с SEQ ID NO: 1, заменена с CG на GT.

3. Микроорганизм Corynebacterium glutamicum по п. 2, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.

4. Способ продуцирования L-лизина, включающий:

а) выращивание микроорганизма по п. 2 в среде; и

б) выделение L-лизина из микроорганизма или среды, в которой выращивают указанный микроорганизм.