JP7683041B2

JP7683041B2 - Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたｌ－リシンの生産方法

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Publication number: JP7683041B2
Application number: JP2023566853A
Authority: JP
Inventors: ジンチェ、ミン; ギキム、ボン; ウンキム、ハ; ヒョンパク、ソク; ヒョンパク、ジュン
Original assignee: シージェイチェイルジェダングコーポレイション
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2025-05-26
Anticipated expiration: 2041-05-26
Also published as: AU2021442655B2; CN115261247A; CN115261247B; BR112023022652A2; EP4083197A1; MX2023012825A; EP4353827A3; EP4353827A2; KR20240000418A; WO2022231055A1; CA3217309A1; CN117551593A; KR102869882B1; US20240209402A1; JP2024515391A; AU2021442655A1

Description

本発明は、Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株及びそれを用いたＬ－リシンの生産方法に関する。

Ｌ－リシンは、ヒトや動物の体内で合成されない必須アミノ酸であり、外部から供給されなければならず、一般に、細菌や酵母のような微生物を用いた発酵により生産される。Ｌ－リシンの生産は、自然状態で得られた野生型菌株やそのＬ－リシン生産能が向上するように改変された変異株を用いることができる。最近、Ｌ－リシンの生産効率を改善させるために、Ｌ－アミノ酸及びその他の有用物質の生産に多く利用される大腸菌、コリネバクテリウムなどの微生物を対象に遺伝子組換え技術を適用して優れたＬ－リシン生産能を有する多様な組換え菌株または変異株及びそれを用いたＬ－リシン生産方法が開発されている。

特許文献１及び特許文献２によると、Ｌ－リシンの生産に関連した酵素を含むタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列またはアミノ酸配列を変更してその遺伝子の発現を増加させたり、不要な遺伝子を除去することによりＬ－リシン生産能を向上させることができる。また、特許文献３には、Ｌ－リシンの生産に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるために、遺伝子の既存のプロモーターを強い活性を有するプロモーターに変更する方法を開示している。

このように、Ｌ－リシン生産能を増加させる多様な方法が開発されているが、Ｌ－リシンの生産に直接、間接的に関連した酵素、転写因子、輸送タンパク質などのタンパク質の種類が数十種余りに達するため、このようなタンパク質の活性変化によるＬ－リシン生産能増加の有無に関し依然として多くの研究が必要なのが現状である。

韓国登録特許第１０－０８３８０３８号公報韓国登録特許第１０－２１３９８０６号公報韓国公開特許第１０－２０２０－００２６８８１号公報

ＭａｎｕａｌｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＧｅｎｅｒａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．（２００１）"ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ"，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ．ｖｏｌｕｍｅ２．１３．３６～１３．３９Ｓｈａｗｅｔａｌ．、１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３０（４４）：１０８０６Ｋｉｍｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ８４（２０１１）１２８－１３０Ｔａｕｃｈｅｔａｌ．，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌｅｔｔｅｒｓ１２３（１９９４）３４３－３４７Ｓｃｈａｆｅｒｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ１４５（１９９４）６９－７３

本発明は、Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株を提供することを目的とする。

また、本発明は、前記変異株を用いたＬ－リシンの生産方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株を用いてＬ－リシン生産能が向上した新たな変異株を開発するために研究した結果、Ｌ－リシン生合成経路でリシン前駆体であるオキサロアセテートの供給に関与するピルベートカルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝子のプロモーター内の特定位置の塩基配列を置換した場合、ピルベート由来副産物の生成が減少しながらＬ－リシン生産量が増加することを確認することにより本発明を完成した。

本発明の一様相は、ピルベートカルボキシラーゼの活性が強化されてＬ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を提供する。

本発明で用いられた「ピルベートカルボキシラーゼ（ｐｙｒｕｖａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）」は、Ｌ－リシン生合成経路でピルベートのカルボキシル化（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）を誘導してリシン前駆体であるオキサロアセテート（ｏｘａｌｏａｃｅｔａｔｅ，ＯＡＡ）を生成する反応を触媒する酵素を意味する。

本発明の一具体例によると、前記ピルベートカルボキシラーゼは、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株に由来したものであってもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スラナレアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｕｒａｎａｒｅｅａｅ）、コリネバクテリウム・ルブリカンティス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｕｂｒｉｃａｎｔｉｓ）、コリネバクテリウム・ドオサネンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｏｏｓａｎｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ウテレキ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｕｔｅｒｅｑｕｉ）、コリネバクテリウム・スタチティニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・パカエンセ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐａｃａｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ヒュミレデュセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈｕｍｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、コリネバクテリウム・マリヌム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｒｉｎｕｍ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・スフェニスコルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｈｅｎｉｓｃｏｒｕｍ）、コリネバクテリウム・フレイブルゲンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｉｂｕｒｇｅｎｓｅ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・カニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｎｉｓ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・レナーレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｅｎａｌｅ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・カスピウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｃａｓｐｉｕｍ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）、コリネバクテリウム・シュードペラーギ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃａｔｅｒｉｕｍｐｓｅｕｄｏｐｅｌａｒｇｉ）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよく、これに限定されるものではない。

本発明で用いられた「活性が強化」とは、目的とする酵素、転写因子、輸送タンパク質などのタンパク質をコードする遺伝子の発現が新たに導入されたり増大して野生型菌株または変形前の菌株に比べて発現量が増加することを意味する。このような活性の強化は、遺伝子をコードするヌクレオチドの置換、挿入、欠失またはこれらの組み合わせを通じてタンパク質自体の活性が本来微生物が有するタンパク質の活性に比べて増加した場合と、これをコードする遺伝子の発現増加または翻訳増加などにより細胞内で全体的な酵素活性の程度が野生型菌株または変形前の菌株に比べて高い場合、これらの組み合わせも含む。

本発明の一具体例によると、前記ピルベートカルボキシラーゼの活性強化は、ピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターに位置特異的変異を誘発するものであってもよい。

本発明の一具体例によると、前記ピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーターは、配列番号１の塩基配列で表されるものであってもよい。

本発明で用いられた「プロモーター」とは、目的とする遺伝子のｍＲＮＡ転写を開始するＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）に対する結合部位を含み遺伝子の転写を調節するＤＮＡの特定部位を意味し、一般に、転写開始点を基準として上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に位置する。原核生物におけるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが結合する転写開始点周辺の部位と定義され、一般に、転写開始点から上流に－１０領域と－３５領域の塩基対が離れている二つの短い塩基配列で構成される。本発明におけるプロモーター変異は、野生型プロモーターに比べて高い活性を有するように改良することであり、転写開始点の上流に位置したプロモーター領域内で変異を誘発することにより、下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に位置した遺伝子の発現を増加させることができる。

本発明の一具体例によると、前記ピルベートカルボキシラーゼの活性強化は、ピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーター配列内の転写開始点から上流に－９０～－３０領域のうちの一つ以上の塩基が置換されたものであってもよい。

より具体的には、本発明におけるプロモーター変異は、－９０～－３０領域のうちの１個以上の塩基、好ましくは、－９０～－３０領域、－８０～－４０領域、－７５～－４５領域、－５５～－４０領域、または－７５～－６０領域において１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の塩基が連続的にまたは非連続的に置換されたものであってもよい。

本発明の一実施例によると、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のピルベートカルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝子のプロモーター配列において－７３～－６１領域の塩基配列をｇｇｇｇｔｔａｃｇａｔａｃからｔｇｔｇｇｔａｔｇａｔｇｇに置換し、－５１～－３８領域の塩基配列をｇｔｇａｃｔｇｃｔａｔｃａｃからａｃａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｔに置換してｐｙｃ遺伝子の新たなプロモーター配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を得た。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号２の塩基配列で表されるｐｙｃ遺伝子の変異されたプロモーターを含むものであってもよい。

また、本発明の一実施例によると、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株のピルベートカルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝子のプロモーター配列において－７３～－６１領域の塩基配列をｇｇｇｇｔｔａｃｇａｔａｃからｔｇｔｔｇｔａｔｇａｔｔｇに置換し、－５１～－３８領域の塩基配列をｇｔｇａｃｔｇｃｔａｔｃａｃからａｃｔｇｃｔｇｃｔａｃｔａｃに置換してｐｙｃ遺伝子の新たなプロモーター配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を得た。このようなコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、配列番号３の塩基配列で表されるｐｙｃ遺伝子の変異されたプロモーターを含むものであってもよい。

本発明で用いられた「生産能が向上した」とは、親株に比べてＬ－リシンの生産性が増加したことを意味する。前記親株は、変異の対象となる野生型または変異株を意味し、直接変異の対象になったり組換えされたベクターなどで形質転換される対象を含む。本発明において、親株は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム菌株または野生型から変異された菌株であってもよい。

本発明の一具体例によると、前記親株は、リシン生産に関与する遺伝子（例えば、ｌｙｓＣ、ｚｗｆ及びｈｏｍ遺伝子）の配列に変異が誘発された変異株であり、韓国微生物保存センター（ＫｏｒｅａｎＣｕｌｔｕｒｅＣｅｎｔｅｒｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に２０２１年４月２日付で受託番号ＫＣＣＭ１２９６９Ｐとして寄託されたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株（以下「コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株」という）であってもよい。

このような本発明のＬ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、ピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子の変異されたプロモーター配列を含むものであってもよい。

本発明の一具体例によると、前記変異株は、配列番号２～３で表される塩基配列のいずれか一つをピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター配列として含むものであってもよい。

本発明の一実施例によると、前記変異株は、ピルベートカルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝子のプロモーター変異を含むことにより、親株に比べて増加したＬ－リシン生産能を示し、特に親株に比べてＬ－リシン生産量が３％以上、具体的には３～４０％、さらに具体的には５～３０％増加し、菌株培養液１リットル当たり６５～７５ｇのＬ－リシンを生産することができ、好ましくは６５～７０ｇのＬ－リシンを生産することができる。

本発明の一具体例によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、親株にピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーター配列が一部置換された変異体を含む組換えベクターを通じて具現される。

本発明で用いられた「一部」とは、塩基配列またはポリヌクレオチド配列の全部ではないことを意味し、１～３００個、好ましくは、１～１００個、より好ましくは、１～５０個であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明で用いられた「変異体」とは、Ｌ－リシンの生合成に関与するピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター配列内の－９０～－３０領域のうちの一つ以上の塩基が置換されたプロモーター変異体を意味する。

本発明の一具体例によると、ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター配列内の－７３～－６１領域の塩基配列がｔｇｔｇｇｔａｔｇａｔｇｇに、－５１～－３８領域の塩基配列がａｃａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｔに置換された変異体は、配列番号２の塩基配列を、－７３～－６１領域の塩基配列がｔｇｔｔｇｔａｔｇａｔｔｇに、－５１～－３８領域の塩基配列がａｃｔｇｃｔｇｃｔａｃｔａｃに置換された変異体は、配列番号３の塩基配列を有するものであってもよい。

本発明で用いられた「ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現できる発現ベクターであり、遺伝子挿入物が発現するように作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）必須の調節要素を含む遺伝子製造物を意味する。ここで、「作動可能に連結された」とは、発現が必要な遺伝子とその調節配列が互いに機能的に結合して遺伝子発現を可能にする方式で連結されたことを意味し、「調節要素」は、転写を行うためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。このようなベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、ウイルスベクターなどを含むが、これに限定されるものではない。

本発明で用いられた「組換えベクター」は、適した宿主細胞内に形質転換された後、宿主細胞のゲノムと無関係に複製可能であるか、またはゲノムそれ自体に組み込まれる。この時、前記「適した宿主細胞」は、ベクターが複製可能なものとして複製が開始される特定の塩基配列である複製起点を含むことができる。

前記形質転換は、宿主細胞により適したベクター導入技術が選択されて目的とする遺伝子を宿主細胞内で発現させることができる。例えば、ベクターの導入は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、熱衝撃（ｈｅａｔ－ｓｈｏｃｋ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）の沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）の沈殿、微量注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法、またはこれらの組み合わせにより行われ得る。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現できるものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入または染色体外に位置しているものでも制限なく含まれ得る。

前記宿主細胞は、生体内または試験管内で本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドで形質感染、形質転換、または感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞、組換え細胞または組換え微生物である。

また、本発明による組換えベクターは、選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒ）を含むことができるが、前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された形質転換体（宿主細胞）を選別するためのものであり、前記選択マーカーが処理された培地で選択マーカーを発現する細胞だけが生存できるため、形質転換された細胞の選別が可能である。前記選択マーカーは、代表的な例としてカナマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコールなどがあるが、これに限定されるものではない。

本発明の形質転換用組換えベクター内に挿入された遺伝子は、相同性組換えの交差によりコリネバクテリウム属微生物のような宿主細胞内に置換される。
本発明の一具体例によると、前記宿主細胞は、コリネバクテリウム属菌株であってもよく、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株であってもよい。

また、本発明の他の一様相は、ａ）前記コリネバクテリウム・グルタミカム変異株を培地で培養する段階；及びｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－リシンを回収する段階を含むＬ－リシンの生産方法を提供する。

前記培養は、当業界において知られている適切な培地と培養条件により行われ、通常の技術者であれば、培地及び培養条件を容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培地は液体培地であってもよいが、これに限定されるものではない。培養方法は、例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅ）またはこれらの組み合わせ培養を含み得るが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によると、前記培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならず、通常の技術者により適切に変形され得る。コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は、公知となった文献（ＭａｎｕａｌｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＧｅｎｅｒａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１）を参照することができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によると、培地に多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含むことができる。使用できる炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これら物質は、個別にまたは混合物として使用でき、これに限定されるものではない。使用可能な窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれ得る。窒素源も、個別にまたは混合物として使用でき、これに限定されるものではない。使用可能なリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウムを含有する塩が含まれ、これに限定されるものではない。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができ、これに限定されるものではない。その他に、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が含まれ得る。また、培養培地に適切な前駆体が使用できる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式により回分式でまたは連続式で添加されるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によると、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制することができる。さらに、培養液の好気状態を維持するために、培養液内に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は、通常、２０℃～４５℃、例えば２５℃～４０℃であってもよい。培養期間は、有用物質が目的の生産量が得られるまで継続でき、例えば、１０～１６０時間であってもよい。

本発明の一具体例によると、前記培養された変異株及び変異株が培養された培地からＬ－リシンを回収する段階は、培養方法により当該分野において知られた適切な方法を利用して培地から生産されたＬ－リシンを収集または回収することができる。例えば、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性及びサイズ排除）などの方法を利用できるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例によると、リシンを回収する段階は、培養培地を低速遠心分離し、バイオマスを除去して得られた上澄液を、イオン交換クロマトグラフィーを通じて分離することができる。

本発明の一具体例によると、前記Ｌ－リシンを回収する段階は、Ｌ－リシンを精製する工程を含むことができる。

本発明によるコリネバクテリウム・グルタミカム変異株は、ピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子の発現を増加または強化させることにより親株に比べてＬ－リシンの生産収率を向上させることができる。

本発明の一実施例によりピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター配列内－７３～－６１領域の塩基配列がｔｇｔｇｇｔａｔｇａｔｇｇに、－５１～－３８領域の塩基配列がａｃａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｔに置換されたプロモーターを含むｐＣＧＩ（Ｐｍ１－ｐｙｃ’）ベクターの構造を示したものである。ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーター配列内－７３～－６１領域の塩基配列がｔｇｔｔｇｔａｔｇａｔｔｇに、－５１～－３８領域の塩基配列がａｃｔｇｃｔｇｃｔａｃｔａｃに置換されたプロモーターを含むｐＣＧＩ（Ｐｍ２－ｐｙｃ’）ベクターの構造を示したものである。

以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、このような説明は、本発明の理解を助けるために例示的に提示されたものに過ぎず、本発明の範囲がこのような例示的な説明により制限されるものではない。

実施例１．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の製造
ピルベートカルボキシラーゼの活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を製造するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株を用いてランダムに突然変異を誘発した。

１－１．突然変異の誘発
コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株を種培養ＣＭ液体培地（蒸溜水１Ｌにグルコース５ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ウレア（ｕｒｅａ）１．０ｇ、ポリペプトン１０．０ｇ及びビーフ（ｂｅｅｆ）抽出物５．０ｇを含有、ｐＨ６．８）５０ｍｌ入りのフラスコに接種し、突然変異誘発物質であるＮ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ，ＮＴＧ）を最終濃度３００μｇ／ｍｌで添加した後、３０℃で２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。培養を終了した後、培養液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上層液を除去し、食塩水（ｓａｌｉｎｅ）で１回洗浄し、リン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ）で３回さらに洗浄した。これをリン酸緩衝液５ｍｌに懸濁した後、種培養固体培地（種培養液体培地に寒天１５ｇ／ｌをさらに含む）に塗抹し、３０℃で３０時間培養してコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）１００個を分離した。

１－２．Ｌ－リシン生産能が向上した変異株の選別及び変異ライブラリーの製作
前記分離したコロニー１００個を下記表１のリシン生産液体培地１０ｍｌ入りのフラスコにそれぞれ５％ずつ接種し、３０℃で２００ｒｐｍで３０時間振盪培養した。各培養液をＯＤ６１０ｎｍで吸光度を測定し、Ｌ－リシン生産量を比較してＬ－リシンを７５．０ｇ／ｌ以上生産するコロニー１０個を選別し、塩基配列の分析を行ってｐｙｃ遺伝子のプロモーター変異位置を確認した。

実施例２．ｐｙｃプロモーターの改良
２－１．プロモーターの改良：変異の導入
実施例１で選別されたｐｙｃプロモーター上の変異位置を含む最大１５個の塩基配列の変形を有する３０個の候補配列を［Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔａｌ．（２００１）“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ．ｖｏｌｕｍｅ２．１３．３６～１３．３９］の方法で合成し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のｐｙｃプロモーター配列（配列番号１を参考）及び合成されたｐｙｃプロモーター領域をそれぞれＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）レポーターベクターｐＳＫ１－ＣＡＴベクター内にクローニングした。ＤＮＡクローニング時、オリエンテーション（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と変異の発生有無は、ＤＮＡシーケンシングを通じて確認した。このように製作された変異ライブラリーをｐＳＫ１－ｐｙｃ１～ｐＳＫ１－ｐｙｃ３０と命名した。最終的に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換してプロモーター活性を比較検討した。

２－２．コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２へのｐＳＫ１－ＣＡＴ構造体の形質導入
シーケンス分析を通じて確認されたそれぞれの上記製作されたｐＳＫ１－ｐｙｃ１～ｐＳＫ１－ｐｙｃ３０それぞれをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）するために水溶性細胞を製作した。１００ｍｌのＢＨＩＳ培地に１０ｍｌの培養されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２を接種して３０℃で一晩中培養した後、さらに１００ｍｌのＣＭ液体培地にＯＤ６００が０．３になるように接種して１８℃で１２０ｒｐｍでＯＤ６００が０．８になるまで約２８時間培養した。培養液を４℃で６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を回収し、２０ｍｌの１０％グリセロール溶液で懸濁した後、遠心分離する過程を３回繰り返した。回収された細胞は、さらに１０％グリセロール溶液で懸濁し、１００μｌずつＥ－チューブに分注して－７０℃ ｄｅｅｐｆｒｅｅｚｅｒに使用するまで保管した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２水溶性細胞１００μｌにＤＮＡ１μｇを添加し、冷却されたエレクトロポレーションキュベット（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎｃｕｖｅｔｔｅ）に添加してＢｉｏ－Ｒａｄ社のマイクロパルサー（ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ）を用いて電気穿孔を行った。パルス（Ｐｕｌｓｅ）した直後、４６℃で予熱（ｐｒｅ－ｗａｒｍｉｎｇ）したＣＭ液体培地１ｍｌを添加して細胞を回収し、氷（ｉｃｅ）で２分間反応させた後、３０℃の下でインキュベーターで１８０ｒｐｍで培養した。そして、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）が添加されたＢＨＩＳアガープレート（ａｇａｒｐｌａｔｅ）に１００μｌ塗抹した後、３０℃の培養器で培養した。

２－３．ＣＡＴ分析
ｐｙｃプロモーター領域変異体のＣＡＴ分析（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｓｓａｙ）は、Ｓｈａｗ方法で（Ｓｈａｗｅｔａｌ．、１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３０（４４）：１０８０６）測定した。簡略に要約すると、形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株をカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（５０ μｇ／ｍｌ）が添加されたＣＭ液体培地に培養した後、細胞を回収してタンパク質溶解物（ｐｒｏｔｅｉｎｌｙｓａｔｅ）を確保した。それぞれのｐｒｏｔｅｉｎ５μｇと０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．８）、０．４ｍｇ／ｍｌの５，５’－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ－２－ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ（ＤＴＮＢ；ＳｉｇｍａＤ８１３０）、０．１ｍＭＡｃｅｔｙｌＣｏＡ（ＳｉｇｍａＡ２０５６）及び０．１ｍＭｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌを添加してＲＴで１５分間反応させた後、ＯＤ４１２ｎｍで吸光度を測定した。これを通じてコリネバクテリウム・グルタミカム野生型ｐｙｃプロモーター配列と比較してＣＡＴ活性が最も多く向上したｐＳＫ－ｐｙｃ３及びｐｓｋ－ｐｙｃ２３の２種を選別した。

ｐＳＫ－ｐｙｃ３は、ピルベートカルボキシラーゼ遺伝子の開始コドンの上流領域であるプロモーター配列内－７３～－６１領域の塩基配列がｔｇｔｇｇｔａｔｇａｔｇｇに、－５１～－３８領域の塩基配列がａｃａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｔに置換され、ｐＳＫ－ｐｙｃ２３は－７３～－６１領域の塩基配列がｔｇｔｔｇｔａｔｇａｔｔｇに、－５１～－３８領域の塩基配列がａｃｔｇｃｔｇｃｔａｃｔａｃに置換された。その後、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株を利用してｐｙｃ遺伝子のプロモーター変異によるＬ－リシン生産性の増加を検証するための実験を行った。

実施例３．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の製造
ピルベートカルボキシラーゼの活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を製造するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株及びＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ（ＨＩＴＣｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌｌｓ^ＴＭ、ＣａｔＮｏ．ＲＨ６１８）を用いた。

前記コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株は、蒸溜水１Ｌにグルコース５ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、ウレア（ｕｒｅａ）１．０ｇ、ポリペプトン１０．０ｇ及びビーフ（ｂｅｅｆ）抽出物５．０ｇの組成のＣＭ－ｂｒｏｔｈ培地（ｐＨ６．８）で３０℃の温度で培養した。

Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａは、蒸溜水１Ｌにトリプトン１０．０ｇ、ＮａＣｌ１０．０ｇ及び酵母抽出物５．０ｇの組成のＬＢ培地上で３７℃の温度で培養した。
カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）及びストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社の製品を使用し、ＤＮＡシーケンシング分析は、マクロジェン（株）に依頼して分析した。

３－１．組換えベクターの製作
菌株にリシン前駆体であるオキサロアセテートの供給を強化してリシン生産性を増加させるために、ピルベートカルボキシラーゼの強化を導入した。本実施例で用いた方法は、ピルベートカルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝子の発現を増加するために、ｐｙｃ遺伝子のプロモーターに特異的な変異を誘発した。ｐｙｃ遺伝子のプロモーター－７３～－６１位置の塩基配列をｇｇｇｇｔｔａｃｇａｔａｃからｔｇｔｇｇｔａｔｇａｔｇｇに、－５１～－３８位置の塩基配列をｇｔｇａｃｔｇｃｔａｔｃａｃからａｃａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｔに置換するために、変異配列を含むプライマーを製作し、実施例１で選別されたコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１変異株のゲノム上でｐｙｃ遺伝子プロモーターの両側変異の部分から左アーム７３５ｂｐ領域と右アーム７３０ｂｐ領域をＰＣＲで増幅し、オーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ）方法で連結した後、組換えベクターであるｐＣＧＩ（文献［Ｋｉｍｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ８４（２０１１）１２８－１３０］を参照）にクローニングした。前記製造された組換えプラスミドをｐＣＧＩ（Ｐｍ１－ｐｙｃ’）と命名した（図１を参照）。前記プラスミドを製作するためにそれぞれのＤＮＡ断片を増幅するのに下記表２のｐｙｃプロモーター変異１増幅プライマーとｐＣＧＩベクター増幅プライマーを用いた。

詳しく説明すると、下記の通りである。コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株のｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡから当該プライマーを用いて以下の条件下でＰＣＲを行った。

Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＴＰ６００，ＴＡＫＡＲＡＢＩＯＩｎｃ．、日本）を用いてそれぞれのデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）１００μＭが添加された反応液にオリゴヌクレオチド１ｐＭ、実施例１で確認されたコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１変異株の染色体ＤＮＡまたはｐＣＧＩベクター１０ｎｇを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として、ｐｆｕ－ＸＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｓｏｌｇｅｎｔ）１ユニットの存在下で２５～３０サイクル（ｃｙｃｌｅ）を行った。ＰＣＲ遂行条件は、（ｉ）変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）段階：９４℃で３０秒、（ｉｉ）アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）段階：５８℃で３０秒、及び（ｉｉｉ）伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）段階：７２℃で１～２分（１ｋｂ当たり２分の重合時間付与）の条件で行った。

このように製造された遺伝子断片をｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙｃｌｏｎｉｎｇを使用し、ｐＣＧＩベクターにクローニングした。前記ベクターをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５ａに形質転換させ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上に塗抹し、３７℃で２４時間培養した。最終形成されるコロニーを分離して挿入物（ｉｎｓｅｒｔ）が正確にベクターに存在するかを確認した後、このベクターを分離してコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株の組換えに用いた。

遺伝子操作時、ＰＣＲ増幅酵素としてはＥｘＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｏｌｇｅｎｔ）を用い、各種制限酵素及びＤＮＡｍｏｄｉｆｙｉｎｇ酵素はＮＥＢ製品を用い、供給されたバッファー及びプロトコルにより用いた。

３－２．変異株の製造
前記ｐＣＧＩ（Ｐｍ１－ｐｙｃ’）ベクターを用いてＤＳ５菌株を製造した。前記ベクターの最終濃度が１μｇ／μｌ以上になるように準備してコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株に電気穿孔法（文献［Ｔａｕｃｈｅｔａｌ．，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌｅｔｔｅｒｓ１２３（１９９４）３４３－３４７］を参照）を用いて１次組換えを誘導した。この時、電気穿孔した菌株をカナマイシン２０μｇ／μｌが含まれるＣＭ寒天プレートに塗抹してコロニーを分離した後、ゲノム上の誘導した位置に適切に挿入されたかＰＣＲ及び塩基配列分析を通じて確認した。このように分離した菌株をさらに２次組換えを誘導するためにストレプトマイシンを含有したＣＭ寒天液体培地に接種し、一晩以上培養して同一濃度のストレプトマイシンを含有した寒天培地に塗抹してコロニーを分離した。最終分離したコロニー中でカナマイシンに対する耐性の有無を確認した後、抗生剤耐性がない菌株中、ｐｙｃ遺伝子のプロモーターに変異が導入されたかどうかを塩基配列分析を通じて確認した（文献［Ｓｃｈａｆｅｒｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ１４５（１９９４）６９－７３］を参照）。最終的に、変異ｐｙｃ遺伝子のプロモーターに変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＤＳ５菌株が得られた。

実施例４．コリネバクテリウム・グルタミカム変異株の製造
ｐｙｃ遺伝子のプロモーター－７３～－６１位置の塩基配列をｇｇｇｇｔｔａｃｇａｔａｃからｔｇｔｔｇｔａｔｇａｔｔｇに、－５１～－３８位置の塩基配列をｇｔｇａｃｔｇｃｔａｔｃａｃからａｃｔｇｃｔｇｃｔａｃｔａｃに置換した以外は、実施例３と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を製造した。

ここで、プラスミドを製作するために、それぞれのＤＮＡ断片を増幅するのに下記表３のｐｙｃプロモーター変異２増幅プライマーとｐＣＧＩベクター増幅プライマーを用い、製作されたプラスミドｐＣＧＩ（Ｐｍ２－ｐｙｃ’）ベクター（図２を参照）を用いた。最終的に、変異ｐｙｃ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＤＳ５－１菌株が得られた。

実験例１．変異株のＬ－リシン生産性の比較
親株コリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株と実施例３及び４で製造されたリシン生産変異株であるＤＳ５及びＤＳ５－１菌株のＬ－リシン生産性を比較した。

前記表１のような組成を有するリシン培地１０ｍｌを含有した１００ｍｌフラスコにそれぞれの菌株をそれぞれ接種し、３０℃で２８時間、１８０ｒｐｍの条件で振盪培養した。培養終了後、リシン分析は、ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ、日本）でＬ－リシンの生産量を測定し、その結果を表４に示した。

上記表４に示した通り、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＤＳ５及びＤＳ５－１菌株は、リシン前駆体であるオキサロアセテートの供給強化のために、ｐｙｃ遺伝子のプロモーター配列の特定位置（－７３～－６１領域及び－５１～－３８領域）が最適な塩基配列で置換されることにより、親株のコリネバクテリウム・グルタミカムＤＳ１菌株に比べてＬ－リシンの生産性がそれぞれ約８．３％、４．７％増加したことが確認された。このような結果を通じて、ｐｙｃ遺伝子の発現の強化がリシン前駆体の供給を強化することにより、菌株のＬ－リシン生産能を向上させることが分かった。

これまで本発明に関連し、その好ましい実施例を中心に調べた。本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者であれば、本発明が本発明の本質的な特性から逸脱しない範囲で変形された形態で具現されうることが理解できるだろう。従って、開示された実施例は、限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されるべきである。本発明の範囲は前述した説明ではなく特許請求の範囲に開示されており、それと同等の範囲内にあるあらゆる差異点は、本発明に含まれるものと解釈すべきである。

Claims

配列番号１のピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーター配列において、１７５～１８７位置の塩基配列をｇｇｇｇｔｔａｃｇａｔａｃからｔｇｔｇｇｔａｔｇａｔｇｇに置換し、１９７～２１０位置の塩基配列をｇｔｇａｃｔｇｃｔａｔｃａｃからａｃａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｔに置換した、プロモーター。
配列番号１のピルベートカルボキシラーゼをコードする遺伝子のプロモーター配列において、１７５～１８７位置の塩基配列をｇｇｇｇｔｔａｃｇａｔａｃからｔｇｔｇｇｔａｔｇａｔｇｇに置換し、１９７～２１０位置の塩基配列をｇｔｇａｃｔｇｃｔａｔｃａｃからａｃａｇｃｔｇｃｔａｃｔｇｔに置換した、Ｌ－リシン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）変異株。
前記変異株は、配列番号２で表される塩基配列を含むものである、請求項２に記載のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株。
ａ）請求項２に記載の変異株を培地で培養する段階；及び
ｂ）前記変異株または変異株が培養された培地からＬ－リシンを回収する段階を含むＬ－リシンの生産方法。