RU2829715C2 - Variant of corynebacterium glutamicum with improved ability to produce l-lysine and method of producing l-lysine using same - Google Patents
Variant of corynebacterium glutamicum with improved ability to produce l-lysine and method of producing l-lysine using same Download PDFInfo
- Publication number
- RU2829715C2 RU2829715C2 RU2023128587A RU2023128587A RU2829715C2 RU 2829715 C2 RU2829715 C2 RU 2829715C2 RU 2023128587 A RU2023128587 A RU 2023128587A RU 2023128587 A RU2023128587 A RU 2023128587A RU 2829715 C2 RU2829715 C2 RU 2829715C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lysine
- corynebacterium glutamicum
- promoter
- variant
- strain
- Prior art date
Links
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 102
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 19
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 54
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 44
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 24
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 claims description 29
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 101150024271 TKT gene Proteins 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 6
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- -1 etc. Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000007376 cm-medium Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- 241000186248 Corynebacterium callunae Species 0.000 description 1
- 241001014386 Corynebacterium canis Species 0.000 description 1
- 241000644075 Corynebacterium caspium Species 0.000 description 1
- 241001605246 Corynebacterium crudilactis Species 0.000 description 1
- 241000446654 Corynebacterium deserti Species 0.000 description 1
- 241000272936 Corynebacterium doosanense Species 0.000 description 1
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 1
- 241001134763 Corynebacterium flavescens Species 0.000 description 1
- 241000521406 Corynebacterium freiburgense Species 0.000 description 1
- 241000291063 Corynebacterium halotolerans Species 0.000 description 1
- 241000015585 Corynebacterium humireducens Species 0.000 description 1
- 241000024402 Corynebacterium imitans Species 0.000 description 1
- 241000095130 Corynebacterium lubricantis Species 0.000 description 1
- 241000778959 Corynebacterium marinum Species 0.000 description 1
- 241000128247 Corynebacterium pollutisoli Species 0.000 description 1
- 241000186246 Corynebacterium renale Species 0.000 description 1
- 241000334675 Corynebacterium singulare Species 0.000 description 1
- 241001098119 Corynebacterium spheniscorum Species 0.000 description 1
- 241000186308 Corynebacterium stationis Species 0.000 description 1
- 241000158523 Corynebacterium striatum Species 0.000 description 1
- 241000960580 Corynebacterium testudinoris Species 0.000 description 1
- 241000737368 Corynebacterium uterequi Species 0.000 description 1
- HAIWUXASLYEWLM-UHFFFAOYSA-N D-manno-Heptulose Natural products OCC1OC(O)(CO)C(O)C(O)C1O HAIWUXASLYEWLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FNZLKVNUWIIPSJ-RFZPGFLSSA-N D-xylulose 5-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-RFZPGFLSSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- HSNZZMHEPUFJNZ-UHFFFAOYSA-N L-galacto-2-Heptulose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(=O)CO HSNZZMHEPUFJNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- HAIWUXASLYEWLM-AZEWMMITSA-N Sedoheptulose Natural products OC[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@](O)(CO)O1 HAIWUXASLYEWLM-AZEWMMITSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 102100028601 Transaldolase Human genes 0.000 description 1
- 108020004530 Transaldolase Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose 5-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- HSNZZMHEPUFJNZ-SHUUEZRQSA-N sedoheptulose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)CO HSNZZMHEPUFJNZ-SHUUEZRQSA-N 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯFIELD OF INVENTION
Настоящее раскрытие относится к варианту Corynebacterium glutamicum с улучшенной способностью к продуцированию L-лизина и к способу продуцирования L-лизина с его применением.The present disclosure relates to a variant of Corynebacterium glutamicum with improved ability to produce L-lysine and to a method for producing L-lysine using the same.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИPRIOR ART
L-лизин представляет собой незаменимую аминокислоту, которая не синтезируется в человеческом или животном организме и должна поставляться извне, и он обычно продуцируется посредством ферментации с использованием микроорганизмов, таких как бактерии или дрожжи. При продукции L-лизина можно использовать полученные в природе штаммы дикого типа или варианты, модифицированные для наличия у них повышенной способности к продуцированию L-лизина. Недавно для того, чтобы улучшить эффективность продукции L-лизина разработали разные рекомбинантные штаммы или варианты с превосходной способностью к продуцированию L-лизина и способы продуцирования L-лизина с их использованием посредством применения технологии генной инженерии к таким микроорганизмам, как Escherichia coli и Corynebacterium, и т.д., которые широко используются при продукции L-аминокислот и других полезных веществ.L-lysine is an essential amino acid that is not synthesized in the human or animal body and must be supplied from outside, and it is usually produced by fermentation using microorganisms such as bacteria or yeast. In the production of L-lysine, naturally occurring wild-type strains or variants modified to have an enhanced ability to produce L-lysine can be used. Recently, in order to improve the efficiency of L-lysine production, various recombinant strains or variants with excellent ability to produce L-lysine and methods for producing L-lysine using them have been developed by applying genetic engineering technology to microorganisms such as Escherichia coli and Corynebacterium, etc., which are widely used in the production of L-amino acids and other beneficial substances.
Согласно корейским патентам №10-0838038 и 10-2139806 нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки, включающие ферменты, связанные с продукцией L-лизина, или их аминокислотные последовательности, модифицируют для увеличения экспрессии генов или для удаления не являющихся необходимыми генов и, посредством этого, улучшают способность к продуцированию L-лизина. Кроме того, в публикации корейского патента №10-2020-0026881 раскрыт способ замены существующего промотора гена промотором с сильной активностью для того, чтобы увеличить экспрессию гена, кодирующего фермент, участвующий в продукции L-лизина.According to Korean Patent Nos. 10-0838038 and 10-2139806, nucleotide sequences of genes encoding proteins including enzymes related to L-lysine production or amino acid sequences thereof are modified to increase gene expression or to remove unnecessary genes, and thereby improve the ability to produce L-lysine. In addition, Korean Patent Publication No. 10-2020-0026881 discloses a method for replacing an existing gene promoter with a promoter having strong activity in order to increase the expression of a gene encoding an enzyme involved in L-lysine production.
Как было описано, разрабатывают целый ряд способов для увеличения способности к продуцированию L-лизина. Тем не менее, поскольку существуют десятки типов белков, таких как ферменты, транскрипционные факторы, транспортные белки и т.д., которые прямо или опосредованно участвуют в продукции L-лизина, необходимо проводить много исследований по тому, увеличивается ли или нет способность к продуцированию L-лизина согласно изменениям активностей данных белков.As described, a variety of methods are being developed to increase the ability to produce L-lysine. However, since there are dozens of types of proteins such as enzymes, transcription factors, transport proteins, etc. that are directly or indirectly involved in the production of L-lysine, much research needs to be done on whether or not the ability to produce L-lysine is increased according to changes in the activities of these proteins.
Документы предшествующего уровня техникиPrior Art Documents
Патентные документыPatent documents
Корейский патент №10-0838038Korean Patent No. 10-0838038
Корейский патент №10-2139806Korean Patent No. 10-2139806
Публикация корейского патента №10-2020-0026881Korean Patent Publication No.10-2020-0026881
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION
Техническая проблемаTechnical problem
Целью настоящего раскрытия является предложение варианта Corynebacterium glutamicum с улучшенной способностью к продуцированию L-лизина.The purpose of the present disclosure is to provide a variant of Corynebacterium glutamicum with improved L-lysine producing ability.
Кроме того, другой целью настоящего раскрытия является предложение способа продуцирования L-лизина с использованием данного варианта.Furthermore, another object of the present disclosure is to provide a method for producing L-lysine using this variant.
Техническое решениеTechnical solution
Авторы настоящего изобретения исследовали разработку нового варианта с улучшенной способностью к продуцированию L-лизина с использованием штамма Corynebacterium glutamicum и, в результате, они обнаружили то, что продукция L-лизина увеличивается посредством замены нуклеотидной последовательности в конкретном положении в промоторе гена tkt, кодирующего транскетолазу, который участвует в биосинтетическом пути L-лизина, посредством этого осуществляя настоящее раскрытие.The present inventors studied the development of a new variant with improved L-lysine producing ability using a Corynebacterium glutamicum strain and, as a result, they found that L-lysine production was increased by replacing the nucleotide sequence at a specific position in the promoter of the tkt gene encoding transketolase, which is involved in the biosynthetic pathway of L-lysine, thereby completing the present disclosure.
Согласно одному аспекту настоящего раскрытия предложен вариант Corynebacterium glutamicum с улучшенной способностью к продуцированию L-лизина посредством усиления активности транскетолазы.According to one aspect of the present disclosure, there is provided a variant of Corynebacterium glutamicum with improved ability to produce L-lysine by enhancing transketolase activity.
Термин «транскетолаза» в том виде, как он здесь используется, относится к ферменту, который катализирует реакцию продуцирования седогептулозофосфата посредством переноса группы кетола (HOCH2CO-) от ксилулозофосфата на рибозофосфат в пентозофосфатном пути. Ген, кодирующий транскетолазу, состоит из оперона вместе с генами, каждый из которых кодирует трансальдолазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и 6-фосфоглюконолактоназу, и экспрессия генов данного оперона регулируется одним промотором.The term "transketolase" as used herein refers to the enzyme that catalyzes the reaction for the production of sedoheptulose phosphate by transferring a ketol group ( HOCH2CO- ) from xylulose phosphate to ribose phosphate in the pentose phosphate pathway. The gene encoding transketolase consists of an operon with genes each encoding transaldolase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and 6-phosphogluconolactonase, and expression of the genes in this operon is controlled by a single promoter.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия транскетолаза может происходить из штамма рода Corynebacterium. В частности, штамм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium callunae, Corynebacterium suranareeae, Corynebacterium lubricantis, Corynebacterium doosanense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium uterequi, Corynebacterium stationis, Corynebacterium pacaense, Corynebacterium singulare, Corynebacterium humireducens, Corynebacterium marinum, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium freiburgense, Corynebacterium striatum, Corynebacterium canis, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium renale, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium caspium, Corynebacterium testudinoris, Corynebacaterium pseudopelargi или Corynebacterium flavescens, но не ограничивается ими.According to a specific embodiment of the present disclosure, the transketolase may be derived from a strain of the genus Corynebacterium. In particular, the strain of the genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium callunae, Corynebacterium suranareeae, Corynebacterium lubricantis, Corynebacterium doosanense, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium uterequi, Corynebacterium stationis, Corynebacterium pacaense, Corynebacterium singulare, Corynebacterium humireducens, Corynebacterium marinum, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium spheniscorum, Corynebacterium freiburgense, Corynebacterium striatum, Corynebacterium canis, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium renale, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium caspium, Corynebacterium testudinoris, Corynebacaterium pseudopelargi, or Corynebacterium flavescens, but is not limited to them.
Термин «усиление активности» в том виде, как он здесь используется, означает то, что уровни экспрессии генов, кодирующих белки, такие как целевые ферменты, транскрипционные факторы, транспортные белки и т.д., увеличиваются посредством введения вновь или усиления данных генов по сравнению с генами штамма дикого типа или штамма перед модификацией. Такое усиление активности также включает случай, где активность самого белка увеличивается посредством замены, вставки или делеции нуклеотида кодирующего гена или их комбинации по сравнению с активностью белка, которым исходно обладал микроорганизм, и случай, где общая ферментативная активность в клетках выше, чем активность штамма дикого типа или штамма перед модификацией из-за повышенной экспрессии или повышенной трансляции кодирующих их генов и их комбинации.The term "enhancement of activity" as used herein means that the expression levels of genes encoding proteins such as target enzymes, transcription factors, transport proteins, etc., are increased by reintroduction or enhancement of these genes as compared to the genes of the wild-type strain or the strain before modification. Such enhancement of activity also includes the case where the activity of the protein itself is increased by substitution, insertion or deletion of a nucleotide of the encoding gene or a combination thereof as compared to the activity of the protein originally possessed by the microorganism, and the case where the total enzymatic activity in the cells is higher than the activity of the wild-type strain or the strain before modification due to increased expression or increased translation of the genes encoding them and a combination thereof.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия усиление активности транскетолазы может быть индуцировано сайт-специфичной мутацией в промоторе гена, кодирующего транскетолазу.According to a specific embodiment of the present disclosure, an increase in transketolase activity can be induced by a site-specific mutation in the promoter of a gene encoding transketolase.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия промотор гена, кодирующего транскетолазу, может быть представлен нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.According to a specific embodiment of the present disclosure, the promoter of the gene encoding transketolase can be represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1.
Термин «промотор» в том виде, как он здесь используется, относится к специфической области ДНК, которая регулирует транскрипцию гена посредством включения сайта связывания РНК-полимеразы, которая инициирует транскрипцию мРНК интересующего гена и обычно находится выше сайта начала транскрипции. Промотор у прокариот определяется как область около сайта начала транскрипции, где связывается РНК-полимераза, и он обычно состоит из двух коротких нуклеотидных последовательностей в областях пар оснований -10 и -35 выше сайта начала транскрипции. В настоящем раскрытии мутация промотора заключается в том, что промотор улучшен для того, чтобы иметь более высокую активность по сравнению с промотором дикого типа и может увеличивать экспрессию генов, расположенных ниже, посредством индуцирования мутаций в промоторной области, расположенной выше сайта начала транскрипции.The term "promoter" as used herein refers to a specific region of DNA that regulates the transcription of a gene by including a binding site for RNA polymerase, which initiates transcription of the mRNA of the gene of interest, and is typically located upstream of the transcription start site. A promoter in prokaryotes is defined as a region near the transcription start site where RNA polymerase binds, and it typically consists of two short nucleotide sequences in the -10 and -35 base pair regions upstream of the transcription start site. In the present disclosure, a mutation of a promoter is that the promoter is improved to have a higher activity compared to a wild-type promoter and can increase the expression of downstream genes by inducing mutations in the promoter region located upstream of the transcription start site.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия усиление активности транскетолазы может быть обусловлено заменой одного или более чем одного основания в областях от -300 до -10 выше от сайта начала транскрипции в последовательности промотора гена, кодирующего транскетолазу.According to a specific embodiment of the present disclosure, the enhancement of transketolase activity may be due to the substitution of one or more bases in the regions from -300 to -10 upstream of the transcription start site in the promoter sequence of the gene encoding transketolase.
Более конкретно, мутация промотора по настоящему раскрытию может представлять собой последовательную или непоследовательную замену одного или более чем одного основания в областях от -300 до -10, предпочтительно последовательную или непоследовательную замену одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти оснований в областях от -250 до -50, областях от -230 до -200, областях от -190 до -160 или областях от -90 до -60.More specifically, the promoter mutation of the present disclosure may be a sequential or non-sequential substitution of one or more bases in the regions from -300 to -10, preferably a sequential or non-sequential substitution of one, two, three, four, five, six, seven, eight, nine or ten bases in the regions from -250 to -50, the regions from -230 to -200, the regions from -190 to -160 or the regions from -90 to -60.
Согласно одному типичному воплощению настоящего раскрытия ccaattaacc, которая представляет собой нуклеотидную последовательность в областях от -83 до -74 промоторной последовательности гена tkt, кодирующего транскетолазу, штамма Corynebacterium glutamicum, заменяется на tgtgctgtca с получением варианта Corynebacterium glutamicum, имеющего новую последовательность промотора гена tkt. Такой вариант Corynebacterium glutamicum может включать мутировавшую последовательность промотора гена tkt, которая представлена нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2.According to one exemplary embodiment of the present disclosure, ccaattaacc, which is the nucleotide sequence in the regions from -83 to -74 of the promoter sequence of the tkt gene encoding transketolase of a strain of Corynebacterium glutamicum, is replaced with tgtgctgtca to obtain a variant of Corynebacterium glutamicum having a new promoter sequence of the tkt gene. Such a variant of Corynebacterium glutamicum may include a mutated promoter sequence of the tkt gene, which is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
Согласно одному типичному воплощению настоящего раскрытия ccaattaacc, которая представляет собой нуклеотидную последовательность в областях от -83 до -74 промоторной последовательности гена tkt, кодирующего транскетолазу штамма Corynebacterium glutamicum, заменяется на tgtggtatca с получением варианта Corynebacterium glutamicum, имеющего новую промоторную последовательность гена tkt. Такой вариант Corynebacterium glutamicum может включать мутировавшую промоторную последовательность гена tkt, которая представлена нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3.According to one exemplary embodiment of the present disclosure, ccaattaacc, which is the nucleotide sequence in the regions from -83 to -74 of the promoter sequence of the tkt gene encoding transketolase of a strain of Corynebacterium glutamicum, is replaced with tgtggtatca to obtain a variant of Corynebacterium glutamicum having a new promoter sequence of the tkt gene. Such a variant of Corynebacterium glutamicum may include a mutated promoter sequence of the tkt gene, which is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
Термин «улучшенная способность к продукции» в том виде, как он здесь используется, означает повышенную продуктивность в отношении L-лизина по сравнению с продуктивностью родительского штамма. Родительский штамм относится к штамму дикого типа или варианту штамма, который подвергся мутации, и он включает субъекта, который непосредственно мутирован или преобразован рекомбинантным вектором и т.д. В настоящем раскрытии родительский штамм может представлять собой штамм Corynebacterium glutamicum или штамм, мутировавший из дикого типа.The term "improved production ability" as used herein means an increased productivity of L-lysine compared to the productivity of the parent strain. The parent strain refers to a wild-type strain or a variant of the strain that has undergone mutation, and includes a subject that is directly mutated or transformed by a recombinant vector, etc. In the present disclosure, the parent strain may be a Corynebacterium glutamicum strain or a strain mutated from the wild type.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия родительский штамм представляет собой вариант, в котором индуцируются мутации в последовательностях генов (например, генов lysC, zwf и hom), участвующих в продукции лизина, и он может представлять собой штамм Corynebacterium glutamicum (далее именуемый «штамм DS1 Corynebacterium glutamicum»), депонированный в Корейский центр культивирования микроорганизмов 2 апреля 2021 г. с номером доступа KCCM12969P.According to a specific embodiment of the present disclosure, the parent strain is a variant in which mutations are induced in gene sequences (e.g., lysC, zwf, and hom genes) involved in lysine production, and it may be a Corynebacterium glutamicum strain (hereinafter referred to as the “DS1 Corynebacterium glutamicum strain”) deposited with the Korea Microorganism Culture Center on April 2, 2021 under accession number KCCM12969P.
Вариант Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию, имеющий улучшенную способность к продуцированию L-лизина, может включать мутировавшую последовательность промотора гена, кодирующего транскетолазу.The Corynebacterium glutamicum variant of the present disclosure having an improved ability to produce L-lysine may comprise a mutated promoter sequence of a gene encoding transketolase.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия данный вариант может включать любую из нуклеотидных последовательностей, представленных SEQ ID NO: 2-4, в качестве последовательности промотора гена транскетолазы.According to a specific embodiment of the present disclosure, the variant may comprise any of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 2-4 as a transketolase gene promoter sequence.
Согласно одному конкретному воплощению настоящего раскрытия данный вариант может включать мутацию промотора гена tkt, кодирующего транскетолазу, демонстрируя, посредством этого, повышенную способность к продуцированию L-лизина по сравнению с родительским штаммом, и, в частности, может демонстрировать 5%-ное или большее, в частности, от 5%-ного до 40%-ного и, более конкретно, от 10%-ного до 30%-ного увеличения продукции L-лизина по сравнению с родительским штаммом, продуцируя посредством этого от 65 г до 90 г L-лизина, предпочтительно от 70 г до 80 г L-лизина на 1 л культуры данного штамма. Кроме того, данный вариант может демонстрировать примерно 4%-ное или большее увеличение продукции L-лизина по сравнению с существующим вариантом промотора гена tkt с другим сайтом мутации, посредством этого продуцируя L-лизин с высоким выходом.According to one specific embodiment of the present disclosure, this variant may comprise a mutation of the tkt gene promoter encoding transketolase, thereby showing an increased ability to produce L-lysine compared to the parent strain, and in particular may show a 5% or more, in particular from 5% to 40% and more in particular from 10% to 30% increase in L-lysine production compared to the parent strain, thereby producing from 65 g to 90 g L-lysine, preferably from 70 g to 80 g L-lysine per 1 liter of culture of this strain. Furthermore, this variant may show about 4% or more increase in L-lysine production compared to an existing variant of the tkt gene promoter with another mutation site, thereby producing L-lysine in high yield.
Получение варианта Corynebacterium glutamicum по конкретному воплощению настоящего раскрытия может быть достигнуто посредством рекомбинантного вектора, включающего вариант, в котором часть последовательности промотора гена, кодирующего транскетолазу, у родительского штамма заменена.The production of a variant of Corynebacterium glutamicum according to a specific embodiment of the present disclosure can be achieved by means of a recombinant vector comprising a variant in which a portion of the promoter sequence of the gene encoding transketolase in the parent strain has been replaced.
Термин «часть» в том виде, как он здесь используется, означает не всю нуклеотидную последовательность или последовательность полинуклеотида, и может содержать от 1 до 300, предпочтительно от 1 до 100 и более предпочтительно от 1 до 50 нуклеотидов, но не ограничиваясь ими.The term "portion" as used herein does not mean the entire nucleotide sequence or polynucleotide sequence, and may comprise, but is not limited to, 1 to 300, preferably 1 to 100, and more preferably 1 to 50 nucleotides.
Термин «вариант» в том виде, как он здесь используется, относится к варианту промотора, в котором заменено одно или более чем одно основание в областях от -300 до -10 в последовательности промотора гена транскетолазы, участвующего в биосинтезе L-лизина.The term "variant" as used herein refers to a promoter variant in which one or more bases in the -300 to -10 regions of the promoter sequence of the transketolase gene involved in L-lysine biosynthesis are substituted.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия варианты, в каждом из которых нуклеотидная последовательность в областях от -83 до -74 в промоторной последовательности гена транскетолазы заменена на tgtgctgtca или tgtggtatca, могут иметь нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 соответственно.According to a specific embodiment of the present disclosure, variants in each of which the nucleotide sequence in the regions from -83 to -74 in the promoter sequence of the transketolase gene is replaced with tgtgctgtca or tgtggtatca may have the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, respectively.
Термин «вектор» в том виде, как он используется в данном документе, представляет собой экспрессионный вектор, способный экспрессировать целевой белок в подходящей клетке-хозяине, и он относится к генетической конструкции, включающей существенные регуляторные элементы, которые связаны функциональным образом таким образом, что экспрессируется вставка гена. Здесь термин «связанный функциональным образом» означает то, что ген, требующий экспрессии, и его регуляторная последовательность функционально связаны друг с другом с индукцией экспрессии гена, и «регуляторные элементы» включают промотор для осуществления транскрипции, любую последовательность оператора для осуществления контроля транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосомы с мРНК, и последовательность, контролирующую терминацию транскрипции и трансляции. Такой вектор может включать плазмидный вектор, космидный вектор, бактериофаговый вектор, вирусный вектор и т.д., но не ограничивается ими.The term "vector" as used herein is an expression vector capable of expressing a target protein in a suitable host cell, and refers to a genetic construct comprising essential regulatory elements that are operably linked such that the gene insert is expressed. Here, the term "operably linked" means that the gene requiring expression and its regulatory sequence are operably linked to each other to induce expression of the gene, and "regulatory elements" include a promoter for transcription, any operator sequence for transcription control, a sequence encoding a suitable ribosome binding site for mRNA, and a sequence controlling transcription and translation termination. Such a vector may include a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, a viral vector, etc., but is not limited to them.
«Рекомбинантный вектор» в том виде, как здесь используется данный термин, трансформируют в подходящую клетку-хозяина, и затем он реплицируется независимо от генома данной клетки-хозяина или может быть интегрирован в сам геном. В данном отношении «подходящая клетка-хозяин», где данный вектор является реплицируемым, может включать репликатор, который представляет собой конкретную нуклеотидную последовательность, в которой инициируется репликация.A "recombinant vector," as the term is used herein, is transformed into a suitable host cell and then replicates independently of the host cell's genome or may be integrated into the genome itself. In this regard, a "suitable host cell" where the vector is replicable may include a replicator, which is a specific nucleotide sequence at which replication is initiated.
Для трансформации выбирают подходящую технологию введения вектора, в зависимости от клетки-хозяина для экспрессии целевого гена в данной клетке-хозяине. Например, введение вектора может осуществляться электропорацией, тепловым шоком, осаждением с фосфатом кальция (CaPO4), осаждением с хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекцией, способом с полиэтиленгликолем (PEG), способом с DEAE-декстраном, способом с катионными липосомами, способом с ацетатом лития-DMSO (диметилсульфоксид) или их комбинациями. При условии, что трансформированный ген может экспрессироваться в клетке-хозяине, он может быть включен без ограничения, независимо от того, вставлен ли или не вставлен данный ген в хромосому клетки-хозяина или локализуется вне хромосомы.For transformation, a suitable vector introduction technology is selected depending on the host cell for expressing the target gene in the host cell. For example, the vector introduction can be carried out by electroporation, heat shock, calcium phosphate ( CaPO4 ) precipitation, calcium chloride ( CaCl2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, lithium acetate-DMSO (dimethyl sulfoxide) method or combinations thereof. As long as the transformed gene can be expressed in the host cell, it can be included without limitation, regardless of whether the gene is inserted into the chromosome of the host cell or is localized outside the chromosome.
Клетки-хозяева включают клетки, трансфицированные, трансформированные или инфицированные рекомбинантным вектором или полинуклеотидом по настоящему раскрытию in vivo или in vitro. Клетки-хозяева, включающие рекомбинантный вектор по настояшему раскрытию, представляют собой рекомбинантные клетки-хозяева, рекомбинантные клетки или рекомбинантные микроорганизмы.Host cells include cells transfected, transformed, or infected with a recombinant vector or polynucleotide of the present disclosure in vivo or in vitro. Host cells comprising a recombinant vector of the present disclosure are recombinant host cells, recombinant cells, or recombinant microorganisms.
Кроме того, рекомбинантный вектор по настоящему раскрытию может включать селективный маркер, который предназначен для отбора трансформанта (клетки-хозяина), трансформированного данным вектором. В среде, обработанной селективным маркером, только клетки, экспрессирующие данный селективный маркер, могут выживать, и, таким образом, могут быть отобраны трансформированные клетки. Селективный маркер может быть представлен канамицином, стрептомицином, хлорамфениколом и т.д., но не ограничивается ими.In addition, the recombinant vector of the present disclosure may include a selectable marker, which is intended to select a transformant (host cell) transformed with the vector. In a medium treated with the selectable marker, only cells expressing the selectable marker can survive, and thus transformed cells can be selected. The selectable marker may be represented by kanamycin, streptomycin, chloramphenicol, etc., but is not limited to them.
Гены, вставленные в рекомбинантный вектор для трансформации по настоящему раскрытию, могут быть введены в клетки-хозяева, такие как микроорганизмы рода Corynebacterium, из-за кроссинговера посредством гомологичной рекомбинации.Genes inserted into the recombinant transformation vector of the present disclosure can be introduced into host cells such as microorganisms of the genus Corynebacterium due to crossing over via homologous recombination.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия клетка-хозяин может представлять собой штамм рода Corynebacterium, например, штамм Corynebacterium glutamicum.According to a specific embodiment of the present disclosure, the host cell may be a strain of the genus Corynebacterium, such as a strain of Corynebacterium glutamicum.
Кроме того, согласно другому аспекту настоящего раскрытия предложен способ продуцирования L-лизина, включающий стадии а) культивирования варианта Corynebacterium glutamicum в среде; и б) выделения L-лизина из данного варианта или среды, в которой культивируется данный вариант.Furthermore, according to another aspect of the present disclosure, there is provided a method for producing L-lysine, comprising the steps of a) culturing a variant of Corynebacterium glutamicum in a medium; and b) isolating L-lysine from the variant or the medium in which the variant is cultivated.
Культивирование может осуществляться согласно подходящей среде и культуральным условиям, известным в данной области, и любой специалист в данной области может легко корректировать и применять данную среду и условия культивирования. В частности, данная среда может представлять собой жидкую среду, но не ограничивается ей. Способ культивирования может включать, например, периодическое культивирование, непрерывное культивирование, культивирование с подпиткой или их комбинации, но не ограничивается ими.The culturing can be carried out according to a suitable medium and culture conditions known in the art, and any person skilled in the art can easily adjust and apply this medium and culture conditions. In particular, this medium can be a liquid medium, but is not limited to it. The culturing method can include, for example, batch culturing, continuous culturing, fed-batch culturing, or combinations thereof, but is not limited to them.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия данная среда должна удовлетворять требованиям конкретного штамма правильным образом, и она может быть подходящим образом модифицирована специалистом в данной области. Относительно культуральной среды для штамма рода Corynebacterium может быть сделана ссылка на известный документ (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981), но не ограничиваясь им.According to a specific embodiment of the present disclosure, the medium must meet the requirements of a specific strain in a proper manner, and it can be suitably modified by a person skilled in the art. As for the culture medium for a strain of the genus Corynebacterium, reference may be made to a known document (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981), but is not limited thereto.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия данная среда может включать разные источники углерода, источники азота и компоненты-микроэлементы. Источники углерода, которые можно использовать, включают сахариды и углеводы, такие как такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал, целлюлоза и т.д., жиры и масла, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло, кокосовое масло и т.д., жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Данные вещества можно использовать индивидуально или в смеси, но не ограничиваясь ими. Источники азота, которые можно использовать, включают пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевый шрот, мочевину или неорганические соединения, например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Данные источники азота также можно использовать индивидуально или в смеси, но не ограничиваясь ими. Источники фосфора, которые можно использовать, могут включать калия дигидрофосфат или дикалия гидрофосфат, или соответствующие натрийсодержащие соли, но не ограничиваются ими. Кроме того, культуральная среда может включать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые требуются для роста, но не ограничиваются ими. Кроме того, культуральная среда может включать незаменимые ростовые вещества, такие как аминокислоты и витамины. Более того, в данной культуральной среде можно использовать подходящие предшественники. Среду или индивидуальные компоненты можно добавлять в культуральную среду во время культивирования подходящим способом периодически или непрерывно, но не ограничиваясь ими.According to a specific embodiment of the present disclosure, the medium may include various carbon sources, nitrogen sources and micronutrient components. Carbon sources that can be used include saccharides and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, etc., fats and oils such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, etc., fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These substances can be used individually or in a mixture, but are not limited to them. The nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, meat extract, malt extract, liquid corn steep liquor, soybean meal, urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. These nitrogen sources can also be used individually or in a mixture, but are not limited to them. The phosphorus sources that can be used can include potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate, or the corresponding sodium salts, but are not limited to them. In addition, the culture medium can include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate, which are required for growth, but are not limited to them. In addition, the culture medium can include essential growth substances such as amino acids and vitamins. Moreover, suitable precursors can be used in this culture medium. The medium or individual components can be added to the culture medium during the culturing in a suitable manner periodically or continuously, but are not limited to them.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия рН культуральной среды можно корректировать добавлением в культуральную среду микроорганизма подходящим способом во время культивирования таких соединений, как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Кроме того, во время культивирования пенообразование можно подавлять с использованием пеногасителя, такого как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты. Кроме того, для поддержания культуральной среды в аэробном состоянии в данную культуральную среду можно инъецировать кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух). Температура данной культуральной среды обычно может составлять от 20°С до 45°С, например, от 25°С до 40°С. Культивирование можно продолжать, пока не продуцируется желательное количество полезного вещества. Например, время культивирования может составлять от 10 часов до 160 часов.According to a specific embodiment of the present disclosure, the pH of the culture medium can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid to the culture medium of the microorganism in a suitable manner during the culturing. In addition, during the culturing, foaming can be suppressed using an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester. In addition, oxygen or an oxygen-containing gas (for example, air) can be injected into this culture medium to maintain the culture medium in an aerobic state. The temperature of this culture medium can typically be from 20 ° C to 45 ° C, for example from 25 ° C to 40 ° C. The culturing can be continued until the desired amount of the useful substance is produced. For example, the culturing time can be from 10 hours to 160 hours.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия на стадии выделения L-лизина из культивируемого варианта и среды, в которой культивируется данный вариант, продуцированный L-лизин может быть отобран или выделен из культуральной среды с использованием подходящего способа, известного в данной области, в зависимости от способа культивирования. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрование, экстракцию, распыление, сушку, упаривание, осаждение, кристаллизацию, электрофорез, фракционное растворение (например, осаждение сульфатом аммония), хроматографию (например, ионообменная, аффинная, гидрофобная и гель-фильтрация) и т.д., но способ не ограничивается ими.According to a specific embodiment of the present disclosure, in the step of isolating L-lysine from a cultured variant and a medium in which the variant is cultured, the produced L-lysine can be collected or isolated from the culture medium using a suitable method known in the art depending on the culturing method. For example, centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, evaporation, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution (e.g., ammonium sulfate precipitation), chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic and gel filtration), etc. can be used, but the method is not limited to them.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия на стадии выделения лизина культуральную среду центрифугируют на низкой скорости для удаления биомассы, и полученный супернатант можно разделять посредством ионообменной хроматографии.According to a specific embodiment of the present disclosure, in the lysine isolation step, the culture medium is centrifuged at low speed to remove biomass, and the resulting supernatant can be separated by ion exchange chromatography.
Согласно конкретному воплощению настоящего раскрытия стадия выделения L-лизина может включать способ очистки L-лизина.According to a particular embodiment of the present disclosure, the step of isolating L-lysine may comprise a method for purifying L-lysine.
Полезные эффектыBeneficial effects
Вариант Corynebacterium glutamicum по настоящему раскрытию может улучшать продукционный выход L-лизина посредством увеличения или усиления экспрессии гена, кодирующего транскетолазу, по сравнению с родительским штаммом.The Corynebacterium glutamicum variant of the present disclosure can improve the production yield of L-lysine by increasing or enhancing the expression of a gene encoding transketolase, compared to the parent strain.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВBRIEF DESCRIPTION OF GRAPHIC MATERIALS
На ФИГ. 1 показана конструкция вектора pCGI(Ptkt83-1), включающего изменение, при котором согласно одному типичному воплощению настоящего раскрытия нуклеотидная промоторная последовательность транскетолазы в положениях от -83 до -74 заменена на tgtgctgtca; иFIG. 1 shows the construction of the pCGI(Ptkt83-1) vector comprising an alteration in which, according to one exemplary embodiment of the present disclosure, the nucleotide sequence of the transketolase promoter at positions -83 to -74 is replaced with tgtgctgtca; and
На ФИГ. 2 показана конструкция вектора pCGI(Ptkt83-7), включающего изменение, при котором согласно одному типичному воплощению настоящего раскрытия нуклеотидная промоторная последовательность транскетолазы в положениях от -83 до -74 заменена на tgtggtatca.FIG. 2 shows the construction of the pCGI(Ptkt83-7) vector comprising an alteration in which, according to one exemplary embodiment of the present disclosure, the nucleotide sequence of the transketolase promoter at positions -83 to -74 is replaced with tgtggtatca.
Способ осуществления данного изобретенияMethod of carrying out the present invention
Далее настоящее раскрытие будет описано более подробно. Однако данное описание просто приводится для того, чтобы помочь пониманию настоящего раскрытия, и объем настоящего раскрытия не ограничивается данным типичным описанием.The present disclosure will now be described in more detail. However, this description is merely provided to aid in understanding the present disclosure, and the scope of the present disclosure is not limited to this typical description.
Пример 1. Получение варианта Corynebacterium glutamicumExample 1. Obtaining a variant of Corynebacterium glutamicum
Для получения варианта Corynebacterium glutamicum с повышенной транскетолазной активностью для индукции случайной мутации использовали штамм DS1 Corynebacterium glutamicum.To obtain a variant of Corynebacterium glutamicum with increased transketolase activity, the DS1 strain of Corynebacterium glutamicum was used to induce random mutation.
1-1. Мутагенез1-1. Mutagenesis
Штамм DS1 Corynebacterium glutamicum инокулировали в колбу, содержащую 50 мл жидкой среды СМ (5 г глюкозы, 2,5 г NaCl, 5,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г мочевины, 10,0 г полипептона и 5,0 г говяжьего экстракта, рН 6,8), и добавляли N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG), который представляет собой мутаген, в конечной концентрации 300 мкг/мл, с последующим культивированием при 30°С со встряхиванием при 200 об./мин в течение 20 часов. После завершения культивирования культуру центрифугировали при 12000 об./мин в течение 10 минут для удаления супернатанта, и получаемое в результате один раз промывали физиологическим раствором и три раза или более промывали фосфатным буфером. Это суспендировали в 5 мл фосфатного буфера, распределяли на твердой среде для посевной культуры (в жидкую среду СМ дополнительно добавляли 15 г/л агара и 8% лизина) и культивировали при 30°С в течение 30 часов для выделения 100 колоний.The DS1 strain of Corynebacterium glutamicum was inoculated into a flask containing 50 ml of CM liquid medium (5 g glucose, 2.5 g NaCl, 5.0 g yeast extract, 1.0 g urea, 10.0 g polypeptone, and 5.0 g beef extract, pH 6.8), and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), which is a mutagen, was added at a final concentration of 300 μg/ml, followed by culturing at 30°C with shaking at 200 rpm for 20 hours. After completion of the culturing, the culture was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to remove the supernatant, and the resulting mixture was washed once with saline and washed three times or more with phosphate buffer. This was suspended in 5 ml of phosphate buffer, spread on solid seed culture medium (15 g/l agar and 8% lysine were additionally added to the liquid CM medium), and cultured at 30°C for 30 hours to isolate 100 colonies.
1-2. Отбор вариантов с улучшенной способностью к продуцированию L-. III ti l на и получение библиотек мутаций1-2. Selection of variants with improved ability to produce L-. III ti l on and obtaining libraries of mutations
Каждые 5% 100 выделенных колоний инокулировали в колбу, содержащую 10 мл жидкой среды для продукции лизина, показанной ниже в Таблице 1, и культивировали со встряхиванием при 200 об./мин при 30°С в течение 30 часов. Степень роста бактерий подтверждали измерением поглощения каждой культуры при ОП (оптическая плотность) 610 нм, и продукцию L-лизина измеряли с использованием ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) (Shimazu, Япония). Посредством этого сравнивали продукцию L-лизина, и отбирали колонии, продуцирующие 67,0 г/л или более L-лизина, и анализировали нуклеотидные последовательности их главных генов, связанных с лизином, и промоторные области, для идентификации штаммов с мутациями в промоторе гена tkt. Every 5% of 100 isolated colonies were inoculated into a flask containing 10 ml of the lysine production liquid medium shown in Table 1 below, and cultured with shaking at 200 rpm at 30°C for 30 hours. The growth rate of bacteria was confirmed by measuring the absorbance of each culture at OD (optical density) 610 nm, and the production of L-lysine was measured using HPLC (High Performance Liquid Chromatography) (Shimazu, Japan). Through this, the production of L-lysine was compared, and colonies producing 67.0 g/L or more of L-lysine were selected, and the nucleotide sequences of their major lysine-related genes and promoter regions were analyzed to identify strains with mutations in the promoter of the tkt gene.
Пример 2. Улучшение промотора tktExample 2. Improving the tkt promoter
2-1. Улучшение промотора: введение мутаций2-1. Promoter Improvement: Introducing Mutations
Синтезировали 30 последовательностей-кандидатов с вплоть до 15 модификациями нуклеотидной последовательности, охватывающими положения на промоторе tkt, которые были выбраны в Примере 1, посредством способа [Sambrook, J. et al. (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, volume 2. 13.36~13.39], последовательность промотора tkt Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (см. SEQ ID NO: 1) и синтезированную область промотора tkt клонировали в вектор с репортером хлорамфениколацетилтрансферазой (CAT) и вектор pSK1-CAT соответственно. Во время клонирования ДНК ориентацию и присутствие или отсутствие мутаций подтверждали посредством секвенирования ДНК. Полученные таким образом библиотеки мутантов называли от pSK1-tkt1 до pSK1-tkt30. Наконец их трансформировали в Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, соответственно, и их активности промотора сравнивали и проверяли.Thirty candidate sequences with up to 15 nucleotide sequence modifications covering the positions on the tkt promoter that were selected in Example 1 were synthesized by the method of [Sambrook, J. et al. (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, volume 2. 13.36~13.39], the tkt promoter sequence of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (see SEQ ID NO: 1) and the synthesized tkt promoter region were cloned into a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter vector and a pSK1-CAT vector, respectively. During DNA cloning, the orientation and the presence or absence of mutations were confirmed by DNA sequencing. The mutant libraries thus obtained were named pSK1-tkt1 to pSK1-tkt30. Finally, they were transformed into Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, respectively, and their promoter activities were compared and tested.
2-2. Трансформация конструкции pSK1-CAT в Corynebacterium glutamicum АТСС130322-2. Transformation of pSK1-CAT construct into Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Получали компетентные клетки для трансформации каждого из полученных клонов pSK-tkt, которые идентифицировали посредством анализа последовательности, в Corynebacterium glutamicum АТСС13032. 10 мл культивируемой Corynebacterium glutamicum АТСС13032 инокулировали в 100 мл среды BHIS и культивировали при 30°С в течение ночи, затем вновь инокулировали в 100 мл жидкой среды СМ при ОП 600 нм 0,3 и культивировали при 18°С и 120 об./мин в течение примерно 28 часов пока ОП 600 не становилась равной 0,8. Данную культуральную среду центрифугировали при 4°С и 6000 об./мин в течение 10 мин для выделения клеток, которые затем суспендировали в 20 мл 10%-ного раствора глицерина, и процесс центрифугирования повторяли три раза. Выделенные клетки вновь суспендировали в 10%-ном растворе глицерина, каждые 100 мкл распределяли в Е-пробирки и хранили в морозильной камере глубокой заморозки при -70°С до применения. 1 мкг ДНК добавляли к 100 мкл компетентных клеток Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, добавляли в охлажденную кювету для электропорации, и проводили электропорацию с использованием MicroPulser от Bio-Rad. Сразу после подачи импульсов клетки выделяли посредством добавления 1 мл жидкой среды СМ, предварительно нагретой при 46°С, проводили реакцию в течение 2 минут на льду и затем инкубировали при 180 об./мин в инкубаторе при 30°С. Затем ее 100 мкл распределяли на чашке с агаром BHIS, в который добавляли канамицин (50 мкг/мл), и культивировали в инкубаторе при 30°С.Competent cells were prepared for transforming each of the obtained pSK-tkt clones, which were identified by sequence analysis, into Corynebacterium glutamicum ATCC13032. 10 ml of the cultured Corynebacterium glutamicum ATCC13032 were inoculated into 100 ml of BHIS medium and cultured at 30°C overnight, then again inoculated into 100 ml of CM liquid medium at an OD600 nm of 0.3 and cultured at 18°C and 120 rpm for about 28 h until the OD600 became 0.8. This culture medium was centrifuged at 4°C and 6000 rpm for 10 min to isolate the cells, which were then suspended in 20 ml of 10% glycerol solution, and the centrifugation process was repeated three times. The isolated cells were resuspended in 10% glycerol solution, each 100 μl was distributed into E-tubes and stored in a deep freeze at -70°C until use. 1 μg DNA was added to 100 μl of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 competent cells, added to a chilled electroporation cuvette, and electroporated using a Bio-Rad MicroPulser. Immediately after pulsing, the cells were isolated by adding 1 ml of liquid CM pre-warmed at 46°C, reacted for 2 min on ice, and then incubated at 180 rpm in an incubator at 30°C. Then 100 μl of it was spread on a BHIS agar plate to which kanamycin (50 μg/ml) was added and cultured in an incubator at 30°C.
2-3. Анализ CAT2-3. CAT Analysis
Анализ хлорамфениколацетилтрансферазы (анализ CAT) вариантов промоторной области tkt проводили с использованием способа Shaw (Shaw et al, 1991. Biochemistry. 30(44): 10806). Вкратце, трансформированный штамм Corynebacterium glutamicum культивировали в среде СМ, дополненной канамицином (50 мкг/мл), и затем выделяли клетки с получением лизата белка. Добавляли 5 мкг каждого белка, 0,1 М буфера Tris-HCl (рН 7,8), 0,4 мг/мл 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоты (DTNB; Sigma D8130), 0,1 мМ ацетил-КоА (Sigma А2056) и 0,1 мМ хлорамфеникола, давали реагировать при RT (комнатная температура) в течение 15 минут и измеряли поглощение при ОП 412 нм. Посредством этого отбирали Ptkt83-1 и Ptkt83-7, имеющие улучшенную активность CAT по сравнению с последовательностью промотора tkt дикого типа.Chloramphenicol acetyltransferase assay (CAT assay) of tkt promoter region variants was performed using the method of Shaw (Shaw et al, 1991. Biochemistry. 30(44): 10806). Briefly, transformed Corynebacterium glutamicum was grown in CM medium supplemented with kanamycin (50 μg/ml), and cells were then isolated to obtain a protein lysate. Five micrograms of each protein, 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.8), 0.4 mg/ml 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB; Sigma D8130), 0.1 mM acetyl-CoA (Sigma A2056), and 0.1 mM chloramphenicol were added, reacted at RT (room temperature) for 15 min, and the absorbance at OD 412 nm was measured. By this means, Ptkt83-1 and Ptkt83-7 having improved CAT activity compared with the wild-type tkt promoter sequence were selected.
В Ptkt83-1 и Ptkt83-7 нуклеотидную последовательность в областях от -83 до -74 промоторной последовательности гена tkt, кодирующего транскетолазу, заменяли на tgtgctgtca и tgtggtatca соответственно. Затем проводили эксперимент с использованием штамма DS1 Corynebacterium glutamicum для проверки увеличения продуктивности в отношении L-лизина вследствие мутации промотора гена tkt.In Ptkt83-1 and Ptkt83-7, the nucleotide sequence in the regions from -83 to -74 of the promoter sequence of the tkt gene encoding transketolase was replaced with tgtgctgtca and tgtggtatca, respectively. Then, an experiment was conducted using the DS1 strain of Corynebacterium glutamicum to test whether the tkt gene promoter mutation enhanced the productivity of L-lysine.
Пример 3. Получение варианта промотора Corynebacterium glutamicum DS1Example 3. Obtaining a variant of the Corynebacterium glutamicum DS1 promoter
Для получения варианта Corynebacterium glutamicum с усиленной транскетолазной активностью использовали штамм DS1 Corynebacterium glutamicum и DH5a Е. coli (HIT Competent cells™, кат. № RH618).To obtain a variant of Corynebacterium glutamicum with enhanced transketolase activity, the DS1 strain of Corynebacterium glutamicum and DH5a E. coli (HIT Competent cells™, cat. no. RH618) were used.
Штамм DS1 Corynebacterium glutamicum культивировали при температуре 30°C в среде СМ-бульон (рН 6,8), имеющей следующий состав: 5 г глюкозы, 2,5 г NaCl, 5,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г мочевины, 10,0 г полипептона и 5,0 г говяжьего экстракта в 1 л дистиллированной воды.The DS1 strain of Corynebacterium glutamicum was cultured at 30°C in CM broth medium (pH 6.8) containing 5 g glucose, 2.5 g NaCl, 5.0 g yeast extract, 1.0 g urea, 10.0 g polypeptone, and 5.0 g beef extract in 1 L of distilled water.
DH5a Е. coli культивировали при температуре 37°С в среде LB, имеющей следующий состав: 10,0 г триптона, 10,0 г NaCl и 5,0 г дрожжевого экстракта в 1 л дистиллированной воды.DH5a E. coli was cultured at 37°C in LB medium containing 10.0 g tryptone, 10.0 g NaCl, and 5.0 g yeast extract in 1 L distilled water.
Использовали канамицин и стрептомицин - продукты Sigma - а анализ секвенирования ДНК проводили в Macrogen Co., Ltd.Kanamycin and streptomycin, products of Sigma, were used, and DNA sequencing analysis was performed at Macrogen Co., Ltd.
3-1. Получение рекомбинантного вектора3-1. Obtaining a recombinant vector
Для увеличения продуктивности в отношении лизина посредством усиления активности транскетолазы, участвующей в пентозофосфатном пути у данного штамма, вводили усиление транскетолазы. Способ, используемый в данном Примере, индуцировал специфичную мутацию в промоторе гена tkt для того, чтобы увеличить экспрессию гена tkt, кодирующего транскетолазу. Нуклеотидную последовательность в положениях от -83 до -74 промотора гена tkt заменяли с ccaattaacc на tgtgctgtca, получали праймеры, содержащие мутировавшие последовательности, и 696 п.н. левого плеча и 697 п.н. правого плеча с центром около мутировавшей области промотора гена tkt генома варианта DS1 Corynebacterium glutamicum, отобранного в Примере 1, амплифицировали посредством ПЦР (полимеразная цепная реакция), связывали с использованием ПЦР с перекрывающимися праймерами и затем клонировали в рекомбинантный вектор pCGI (см. [Kim et at, Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 128-130]). Данную плазмиду называли pCGI(Ptkt83-1) (см. ФИГ. 1). Для конструирования данной плазмиды использовали праймеры, показанные в Таблице 2 ниже, для амплификации каждого фрагмента гена.In order to increase the productivity of lysine by enhancing the activity of transketolase involved in the pentose phosphate pathway in this strain, a transketolase enhancer was introduced. The method used in this Example induced a specific mutation in the tkt gene promoter in order to increase the expression of the tkt gene encoding transketolase. The nucleotide sequence at positions -83 to -74 of the tkt gene promoter was changed from ccaattaacc to tgtgctgtca, primers containing the mutated sequences were prepared, and 696 bp of the left arm and 697 bp of the right arm were The right arm centered around the mutated region of the tkt gene promoter of the DS1 variant genome of Corynebacterium glutamicum selected in Example 1 was amplified by PCR (polymerase chain reaction), ligated using overlapping PCR, and then cloned into the recombinant vector pCGI (see [Kim et al., Journal of Microbiological Methods 84 (2011) 128-130]). This plasmid was named pCGI(Ptkt83-1) (see FIG. 1). To construct this plasmid, the primers shown in Table 2 below were used to amplify each gene fragment.
Подробности являются следующими: ПЦР проводили с использованием геномной ДНК штамма DS1 Corynebacterium glutamicum и соответствующих праймеров при следующих условиях. От 25 до 30 циклов проводили с использованием термоциклера (ТР600, TAKARA BIO Inc., Япония) в присутствии 1 единицы смеси ДНК-полимеразы pfu-X (Solgent, Корея) с использованием 1 пМ олигонуклеотида и 10 нг хромосомной ДНК штамма DS1 Corynebacterium glutamicum в качестве матрицы в реакционном растворе, в который добавляли 100 мкл каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ). ПЦР проводили при следующих условиях: (1) стадия денатурации: при 94°С в течение 30 секунд, (2) стадия отжига: при 58°С в течение 30 секунд, и (3) стадия элонгации: при 72°С в течение 1 минуты 2 минут (время полимеризации 2 минуты на 1 т.п.н.).The details are as follows: PCR was performed using the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum strain DS1 and the corresponding primers under the following conditions. 25 to 30 cycles were performed using a thermal cycler (TP600, TAKARA BIO Inc., Japan) in the presence of 1 unit of pfu-X DNA polymerase mixture (Solgent, Korea) using 1 pM oligonucleotide and 10 ng of chromosomal DNA of Corynebacterium glutamicum strain DS1 as a template in a reaction solution to which 100 μl of each deoxynucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) was added. PCR was performed under the following conditions: (1) denaturation step: at 94°C for 30 seconds, (2) annealing step: at 58°C for 30 seconds, and (3) elongation step: at 72°C for 1 min 2 min (polymerization time 2 minutes per 1 kbp).
Каждый фрагмент гена, полученный таким образом, клонировали в вектор pCGI с использованием рестрикционных ферментов BamHI и EcoRT и набора для лигирования ДНК Ver2.1 (Takara, Япония). Данный вектор трансформировали в Е. coli DH5a, производили посев на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл канамицина, и культивировали при 37°С в течение 24 часов. Образующиеся в результате колонии выделяли, и подтверждали, правильно ли присутствовала данная вставка в векторе, который выделяли и использовали при рекомбинации штамма Corynebacterium glutamicum.Each gene fragment obtained in this way was cloned into the pCGI vector using the restriction enzymes BamHI and EcoRT and DNA ligation kit Ver2.1 (Takara, Japan). This vector was transformed into E. coli DH5a, plated on LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin, and cultured at 37°C for 24 hours. The resulting colonies were isolated, and it was confirmed whether the insert was correctly present in the vector, which was isolated and used for recombination of the Corynebacterium glutamicum strain.
3-2. Получение варианта3-2. Getting a variant
Штамм DS1-Ptkt83-1, который представляет собой вариант штамма, получали с использованием вектора pCGI(Ptkt83-1). Данный вектор получали в конечной концентрации 1 мкг/мл или больше, и первичную рекомбинацию индуцировали в штамме DS1 Corynebacterium glutamicum с использованием электропорации (см. документ [Tauch et al., FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347]). В это время подвергнутый электропорации штамм затем распределяли на чашке с СМ-агаром, содержащей 20 мкг/мкл канамицина, с выделением колоний, и затем подтверждали посредством ПЦР и анализа секвенирования оснований, правильно ли данный вектор был вставлен во введенное положение в геноме. Для индукции вторичной рекомбинации выделенный штамм инокулировали в жидкую среду с СМ-агаром, содержащую стрептомицин, культивировали в течение ночи или дольше и затем распределяли на среде с агаром, содержащей такую же концентрацию стрептомицина, для выделения колоний. После проверки устойчивости к канамицину в конечных выделенных колониях посредством анализа секвенирования оснований подтвердили, были ли введены мутации в ген tkt в штаммах без устойчивости к антибиотику (см. документ [Schafer et al., Gene 145 (1994) 69-73]). Наконец, получали вариант Corynebacterium glutamicum (DS1-Ptkt83-10), в который вводили мутировавший ген tkt.The DS1-Ptkt83-1 strain, which is a variant strain, was prepared using the pCGI(Ptkt83-1) vector. This vector was prepared at a final concentration of 1 μg/ml or more, and primary recombination was induced in the DS1 strain of Corynebacterium glutamicum using electroporation (see [Tauch et al., FEMS Microbiology letters 123 (1994) 343-347]). At this time, the electroporated strain was then spread on a CM agar plate containing 20 μg/μl kanamycin to isolate colonies, and then it was confirmed by PCR and base sequencing analysis whether the vector was correctly inserted into the introduced position in the genome. To induce secondary recombination, the isolated strain was inoculated into liquid CM agar medium containing streptomycin, cultured overnight or longer, and then spread onto agar medium containing the same concentration of streptomycin to isolate colonies. After checking for kanamycin resistance in the final isolated colonies, base sequencing analysis was used to confirm whether mutations had been introduced into the tkt gene in strains without antibiotic resistance (see [Schafer et al., Gene 145 (1994) 69-73]). Finally, a variant of Corynebacterium glutamicum (DS1-Ptkt83-10) into which the mutated tkt gene had been introduced was obtained.
Пример 4. Получение варианта Corynebacterium glutamicumExample 4. Obtaining a variant of Corynebacterium glutamicum
Вариант Corynebacterium glutamicum получали таким же способом, как и в Примере 3, за исключением того, что производили замену нуклеотидной промоторной последовательности в положениях от -83 до -74 гена tkt с ccaattaacc на tgtggtatca.A variant of Corynebacterium glutamicum was obtained in the same manner as in Example 3, except that the nucleotide sequence of the promoter at positions -83 to -74 of the tkt gene was replaced from ccaattaacc to tgtggtatca.
Здесь для конструирования плазмиды использовали праймеры, показанные в Таблице 3 ниже, для амплификации каждого фрагмента гена, и штамм DS1-Ptkt83-7, который представляет собой вариант штамма, получали с использованием полученного вектора плазмиды pCGI(Ptkt83-7). Наконец, получали вариант Corynebacterium glutamicum (DS1-Ptkt83-7), в который вводили мутировавший ген tkt.Here, the primers shown in Table 3 below were used to construct the plasmid to amplify each gene fragment, and the strain DS1-Ptkt83-7, which is a variant strain, was obtained using the obtained plasmid vector pCGI(Ptkt83-7). Finally, a variant Corynebacterium glutamicum (DS1-Ptkt83-7) into which the mutated tkt gene was introduced was obtained.
Сравнительный пример 1. Вариант Corynebacterium glutamicumComparative example 1. Variant Corynebacterium glutamicum
Использовали вариант (Ptkt217), раскрытый в корейском патенте №10-1504900, в котором последовательность в положениях от -217 до -206 промотора гена tkt штамма Corynebacterium glutamicum была заменена от ATTGATCACACC на CCCTGACTACAAA.A variant (Ptkt217) disclosed in Korean Patent No. 10-1504900 was used, in which the sequence at positions -217 to -206 of the tkt gene promoter of the Corynebacterium glutamicum strain was changed from ATTGATCACACC to CCCTGACTACAAA.
Экспериментальньш пример 1. Сравнение продуктивности в отношении L-лизина между вариантамиExperimental example 1. Comparison of L-lysine productivity between variants
Продуктивность в отношении L-лизина сравнивали между родительским штаммом DS1 Corynebacterium glutamicum, штаммами DS1-Ptkt83-1 и DS1-Ptkt83-7, которые представляют собой варианты, продуцирующие лизин, полученные в Примерах 3-4, и штамм Ptkt217 Сравнительного примера 1, который представляет собой существующий вариант, продуцирующий лизин, таким же способом, как и в Примере 1-2. Результаты показаны в Таблице 4 ниже.The productivity of L-lysine was compared between the parent strain DS1 of Corynebacterium glutamicum, the strains DS1-Ptkt83-1 and DS1-Ptkt83-7, which are lysine-producing variants obtained in Examples 3 to 4, and the strain Ptkt217 of Comparative Example 1, which is an existing lysine-producing variant, in the same manner as in Example 1 to 2. The results are shown in Table 4 below.
Как показано в Таблице 4, подтвердили то, что варианты Corynebacterium glutamicum - штаммы DS1-Ptkt83-1 и DS1-Ptkt83-7 - демонстрировали примерно 14%-ное и 17%-ное увеличения продуктивности в отношении L-лизина, соответственно, по сравнению с родительским штаммом DS1 Corynebacterium glutamicum из-за замены специфических частей (области от -83 до -74) в промоторной последовательности гена tkt оптимальной нуклеотидной последовательностью для усиления биосинтетического пути лизина.As shown in Table 4, it was confirmed that the Corynebacterium glutamicum variants, strains DS1-Ptkt83-1 and DS1-Ptkt83-7, exhibited approximately 14% and 17% increases in L-lysine productivity, respectively, compared with the parental Corynebacterium glutamicum strain DS1 due to the replacement of specific parts (regions from -83 to -74) in the promoter sequence of the tkt gene with the optimal nucleotide sequence to enhance the lysine biosynthetic pathway.
Также подтвердили то, что варианты Corynebacterium glutamicum - штаммы DS1-Ptkt83-1 и DS1-Ptkt83-7 - демонстрировали примерно 4%-ное и 7%-ное увеличения продуктивности в отношении L-лизина, соответственно, по сравнению с существующим вариантом Ptkt217, имеющим другой сайт мутации (области от -217 до -206) и последовательность (CCCTGACTACAAA).It was also confirmed that the Corynebacterium glutamicum variants, strains DS1-Ptkt83-1 and DS1-Ptkt83-7, exhibited approximately 4% and 7% increases in L-lysine productivity, respectively, compared to the existing Ptkt217 variant, which has a different mutation site (regions from -217 to -206) and sequence (CCCTGACTACAAA).
Данные результаты показывают то, что усиленная экспрессия гена tkt из-за мутации в областях от -83 до -74 промотора может стимулировать способность к биосинтезу лизина, посредством этого улучшая способность к продуцированию L-лизина данного штамма.These results indicate that enhanced expression of the tkt gene due to mutation in the -83 to -74 regions of the promoter can stimulate the lysine biosynthetic ability, thereby improving the L-lysine producing ability of this strain.
Выше настоящее раскрытие было описано со ссылкой на его предпочтительные типичные воплощения. Специалистам в области, к которой относится настоящее раскрытие, будет понятно то, что настоящее раскрытие можно осуществлять в модифицированных формах без отступления от важных характеристик настоящего раскрытия. Соответственно, раскрытые здесь типичные воплощения следует рассматривать в иллюстративном аспекте, а не в ограничивающем аспекте. Объем настоящего раскрытия показан не в приведенном выше объяснении, а в приложенной формуле изобретения, и все различия в пределах эквивалентного ей объема следует интерпретировать как включенные в настоящее раскрытие.The present disclosure has been described above with reference to preferred exemplary embodiments thereof. It will be understood by those skilled in the art to which the present disclosure pertains that the present disclosure can be embodied in modified forms without departing from the essential characteristics of the present disclosure. Accordingly, the exemplary embodiments disclosed herein are to be considered in an illustrative aspect and not in a limiting aspect. The scope of the present disclosure is shown not in the explanation above but in the appended claims, and all differences within the equivalent scope thereof are to be interpreted as being included in the present disclosure.
--->--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> CJ CheilJedang Corporation<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> ВАРИАНТ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM С УЛУЧШЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К <120> A VARIANT OF CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM WITH IMPROVED ABILITY TO
ПРОДУКЦИИ L-ЛИЗИНА И СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ L-ЛИЗИНА С ЕГОL-LYSINE PRODUCTION AND METHOD OF PRODUCING L-LYSINE FROM ITS
ПРИМЕНЕНИЕМAPPLICATION
<130> OPA23235<130>OPA23235
<150> KR 10-2021-0056580<150> KR 10-2021-0056580
<151> 2021-04-30<151> 2021-04-30
<150> KR 10-2021-0067391<150> KR 10-2021-0067391
<151> 2021-05-26<151> 2021-05-26
<160> 9<160> 9
<170> KoPatentIn 3.0<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1<210> 1
<211> 352<211> 352
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Последовательность промотора гена tkt<223> tkt gene promoter sequence
<400> 1<400> 1
gattcgttcc gttcgtgacg ctttgtgagg ttttttgacg ttgcaccgta ttgcttgccg 60gattcgttcc gttcgtgacg ctttgtgagg ttttttgacg ttgcaccgta ttgcttgccg 60
aacatttttc ttttcctttc ggtttttcga gaattttcac ctacaaaagc ccacgtcaca 120aacatttttc ttttcctttc ggtttttcga gaattttcac ctacaaaagc ccacgtcaca 120
gctcccagac ttaagattga tcacaccttt gacacatttg aaccacagtt ggttataaaa 180gctccgac ttaagattga tcacaccttt gacacatttg aaccacagtt ggttataaaa 180
tgggttcaac atcactatgg ttagaggtgt tgacgggtca gattaagcaa agactacttt 240tgggttcaac atcactatgg ttagaggtgt tgacgggtca gattaagcaa agactacttt 240
cggggtagat cacctttgcc aaatttgaac caattaacct aagtcgtaga tctgatcatc 300cggggtagat cacctttgcc aaatttgaac caattaacct aagtcgtaga tctgatcatc 300
ggatctaacg aaaacgaacc aaaactttgg tcccggttta acccaggaag ga 352ggatctaacg aaaacgaacc aaaactttgg tcccggttta acccaggaag ga 352
<210> 2<210> 2
<211> 352<211> 352
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Мутантная последовательность промотора гена tkt<223> Mutant sequence of the tkt gene promoter
<400> 2<400> 2
gattcgttcc gttcgtgacg ctttgtgagg ttttttgacg ttgcaccgta ttgcttgccg 60gattcgttcc gttcgtgacg ctttgtgagg ttttttgacg ttgcaccgta ttgcttgccg 60
aacatttttc ttttcctttc ggtttttcga gaattttcac ctacaaaagc ccacgtcaca 120aacatttttc ttttcctttc ggtttttcga gaattttcac ctacaaaagc ccacgtcaca 120
gctcccagac ttaagattga tcacaccttt gacacatttg aaccacagtt ggttataaaa 180gctccgac ttaagattga tcacaccttt gacacatttg aaccacagtt ggttataaaa 180
tgggttcaac atcactatgg ttagaggtgt tgacgggtca gattaagcaa agactacttt 240tgggttcaac atcactatgg ttagaggtgt tgacgggtca gattaagcaa agactacttt 240
cggggtagat cacctttgcc aaatttgaat gtgctgtcat aagtcgtaga tctgatcatc 300cggggtagat cacctttgcc aaatttgaat gtgctgtcat aagtcgtaga tctgatcatc 300
ggatctaacg aaaacgaacc aaaactttgg tcccggttta acccaggaag ga 352ggatctaacg aaaacgaacc aaaactttgg tcccggttta acccaggaag ga 352
<210> 3<210> 3
<211> 352<211> 352
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Мутантная последовательность промотора гена tkt<223> Mutant sequence of the tkt gene promoter
<400> 3<400> 3
gattcgttcc gttcgtgacg ctttgtgagg ttttttgacg ttgcaccgta ttgcttgccg 60gattcgttcc gttcgtgacg ctttgtgagg ttttttgacg ttgcaccgta ttgcttgccg 60
aacatttttc ttttcctttc ggtttttcga gaattttcac ctacaaaagc ccacgtcaca 120aacatttttc ttttcctttc ggtttttcga gaattttcac ctacaaaagc ccacgtcaca 120
gctcccagac ttaagattga tcacaccttt gacacatttg aaccacagtt ggttataaaa 180gctccgac ttaagattga tcacaccttt gacacatttg aaccacagtt ggttataaaa 180
tgggttcaac atcactatgg ttagaggtgt tgacgggtca gattaagcaa agactacttt 240tgggttcaac atcactatgg ttagaggtgt tgacgggtca gattaagcaa agactacttt 240
cggggtagat cacctttgcc aaatttgaat gtggtatcat aagtcgtaga tctgatcatc 300cggggtagat cacctttgcc aaatttgaat gtggtatcat aagtcgtaga tctgatcatc 300
ggatctaacg aaaacgaacc aaaactttgg tcccggttta acccaggaag ga 352ggatctaacg aaaacgaacc aaaactttgg tcccggttta acccaggaag ga 352
<210> 4<210> 4
<211> 26<211> 26
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Ptkt-1F<223> Ptkt-1F
<400> 4<400> 4
ggaattcccc tgggcttcgt tagcgc 26ggaattcccc tgggcttcgt tagcgc 26
<210> 5<210> 5
<211> 42<211> 42
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Ptkt83-1-F2<223> Ptkt83-1-F2
<400> 5<400> 5
cctttgccaa atttgaatgt gctgtcataa gtcgtagatc tg 42cctttgccaa atttgaatgt gctgtcataa gtcgtagatc tg 42
<210> 6<210> 6
<211> 42<211> 42
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Ptkt83-1-R1<223> Ptkt83-1-R1
<400> 6<400> 6
cagatctacg acttatgaca gcacattcaa atttggcaaa gg 42cagatctacg acttatgaca gcacattcaa atttggcaaa gg 42
<210> 7<210> 7
<211> 27<211> 27
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Ptkt-R2<223> Ptkt-R2
<400> 7<400> 7
gggatccctc acgacgagca gccatgg 27gggatccctc acgacgagca gccatgg 27
<210> 8<210> 8
<211> 42<211> 42
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Ptkt83-7-F2<223> Ptkt83-7-F2
<400> 8<400> 8
cctttgccaa atttgaatgt ggtatcataa gtcgtagatc tg 42cctttgccaa atttgaatgt ggtatcataa gtcgtagatc tg 42
<210> 9<210> 9
<211> 42<211> 42
<212> DNA<212> DNA
<213> Artificial Sequence<213> Artificial Sequence
<220><220>
<223> Ptkt83-7-R1<223> Ptkt83-7-R1
<400> 9<400> 9
cagatctacg acttatgata ccacattcaa atttggcaaa gg 42cagatctacg acttatgata ccacattcaa atttggcaaa gg 42
<---<---
Claims (6)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2021-0056580 | 2021-04-30 | ||
| KR10-2021-0067391 | 2021-05-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2023128587A RU2023128587A (en) | 2024-03-21 |
| RU2829715C2 true RU2829715C2 (en) | 2024-11-05 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100015674A1 (en) * | 2003-12-18 | 2010-01-21 | Basf Se | Methods For The Preparation of Lysine By Fermentation Of Corynebacterium Glutamicum |
| KR101504900B1 (en) * | 2013-06-27 | 2015-03-23 | 백광산업 주식회사 | A Mutation of Transketolase gene Promoter and Use thereof |
| RU2615454C1 (en) * | 2011-12-21 | 2017-04-04 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Method for l-lysine production using microorganisms capable of l-lysine production |
| US20200239897A1 (en) * | 2017-06-07 | 2020-07-30 | Zymergen Inc. | Promoters from corynebacterium glutamicum and uses thereof in regulating ancillary gene expression |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100015674A1 (en) * | 2003-12-18 | 2010-01-21 | Basf Se | Methods For The Preparation of Lysine By Fermentation Of Corynebacterium Glutamicum |
| RU2615454C1 (en) * | 2011-12-21 | 2017-04-04 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Method for l-lysine production using microorganisms capable of l-lysine production |
| KR101504900B1 (en) * | 2013-06-27 | 2015-03-23 | 백광산업 주식회사 | A Mutation of Transketolase gene Promoter and Use thereof |
| US20200239897A1 (en) * | 2017-06-07 | 2020-07-30 | Zymergen Inc. | Promoters from corynebacterium glutamicum and uses thereof in regulating ancillary gene expression |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TARUTINA M.G. ET AL. Assessment of effectiveness of Corynebacterium glutamicum promoters and their application for the enhancement of gene activity in lysine-producing bacteria. Appl Biochem Microbiol 52, 692-698 (2016). https://doi.org/10.1134/S0003683816070073. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2025168674A (en) | Corynebacterium glutamicum mutant strain with improved L-lysine production ability and method for producing L-lysine using the same | |
| JP2024511393A (en) | Corynebacterium glutamicum mutant strain with improved L-citrulline production ability and method for producing L-citrulline using the same | |
| KR102682180B1 (en) | Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-lysine productivity and method for preparing L-lysine using the same | |
| RU2829715C2 (en) | Variant of corynebacterium glutamicum with improved ability to produce l-lysine and method of producing l-lysine using same | |
| JP7766704B2 (en) | Corynebacterium glutamicum mutant with improved L-lysine production ability and method for producing L-lysine using the same | |
| RU2838210C2 (en) | Variant of corynebacterium glutamicum, having improved ability to produce l-lysine, and method of producing l-lysine using same | |
| RU2837131C2 (en) | Variant of corynebacterium glutamicum, having improved ability to produce l-lysine, and method of producing l-lysine by using same | |
| JP7620123B2 (en) | Corynebacterium glutamicum mutant with improved L-lysine production ability and method for producing L-lysine using the same | |
| RU2834919C1 (en) | Variant of corynebacterium glutamicum having improved ability to produce l-lysine, and method of producing l-lysine using same | |
| JP7683040B2 (en) | Corynebacterium glutamicum mutant with improved L-lysine production ability and method for producing L-lysine using the same | |
| JP7683041B2 (en) | Corynebacterium glutamicum mutant with improved L-lysine production ability and method for producing L-lysine using the same | |
| JP2023540518A (en) | Corynebacterium glutamicum mutant strain with improved L-lysine production ability and method for producing L-lysine using the same | |
| KR102703209B1 (en) | Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-lysine productivity and method for preparing L-lysine using the same | |
| KR20220149376A (en) | Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-lysine productivity and method for preparing L-lysine using the same | |
| KR20220148694A (en) | Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-lysine productivity and method for preparing L-lysine using the same | |
| KR20220126610A (en) | Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-lysine productivity and method for preparing L-lysine using the same |