RU2815029C1

RU2815029C1 - N-(гуанидиноалкил)амиды эремомицина и их применение для лечения бактериальных инфекций

Info

Publication number: RU2815029C1
Application number: RU2022124658A
Authority: RU
Inventors: Андрей Егорович Щекотихин; Елена Игоревна Моисеенко; Наталья Эдуардовна Грамматикова; Елена Борисовна Исакова; Светлана Евгеньевна Соловьева
Filing date: 2022-09-19
Publication date: 2024-03-11

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к производному фармацевтически приемлемой соли амида эремомицина, содержащему необязательно замещенный остаток гуанидина, соединенный алкильным линкером с атомом азота С-концевой группы амида эремомицина, и его гидратам, соответствующему формуле:

Description

Область техники

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается структуры новых производных гликопептидного антибиотика эремомицина, содержащих гуанидиновый фрагмент, соединенный алкильным линкером с атомом азота С-концевой амидной группы эремомицина, их действия на планктонные формы и биопленки, грамположительными бактериями, а также их медицинского применения для лечения бактериальных инфекций.

Уровень техники

Ванкомицин (1) - гликопептидный антибиотик, применяемый как препарат резерва для лечения тяжелых бактериальных инфекций, прежде всего вызванных резистентными к противомикробным средствам грамположительными бактериями, например метициллин-резистентным Staphylococcus aureus (MRSA). Антибактериальная активность ванкомицина, как и других гликопептидных антибиотиков, основана на способности ингибировать стадии транспептидации и трасгликозилирования синтеза муреина бактериальной клеточной стенки [С. Watanakunakorn. J. Antimicrob. Chemother., 1984, 14, 7].

Активное распространение резистентных к гликопептидам энтерококков VRE (Vancomycin-Resistant Enterococci) и стафилококков GISA (Glycopeptide-Intermediate S. aureus), вызванное широким применением ванкомицина (в медицине) и авопарцина (в ветеринарии), обуславливает необходимость создания новых гликопетидов, активных в отношении резистентных штаммов бактерий [WHO, Global Priority List of Antibiotic-Resistant Bacteria to Guide Research, Discovery, and Development of New Antibiotics, 2017].

Показано, что химическая модификация гликопептидов, в том числе по С-концевой карбоксильной группе пептидного кора, позволяет преодолеть перекрестную резистентность к природным гликопептидам, а также снизить значительные побочные эффекты природных антибиотиков [D. Kahne et al. Chem. Rev., 2005, 105, 425; E.N. Olsufyeva, A.N. Tevyashova. Curr. Topics in Med. Chem., 2017, 17, 2166].

Эремомицин (2) - гликопептидный антибиотик, близкий по структуре к ванкомицину, отличительной особенностью которого является дисахарид, состоящий из β-D-глюкозы и эремозамина, а также эремозамин, присоединенный к 6 аминокислотному остатку [Г.Ф. Гаузе и др. Антибиотики и химиотерапия, 1989, 5, 348].

Эремомицин (2) в экспериментах in vitro и in vivo в 3-5 раз более активен, чем ванкомицин в отношении большинства значимых для клиники грамположительных бактерий, включая MRSA, а также обладает менее выраженными побочными эффектами [I.V. Malkova. Antibiot. Chemother., 1989, 34, 52; Патент РФ 2641912; Патент РФ 2661613]. Полусинтетические производные эремомицина также имеют преимущества в биологических свойствах перед аналогичными производными ванкомицина [K.R. Maples ei al. J. Med. Chem., 2007, 50, 3681]. Кроме того, для ряда амидов эремомицина отмечено боле низкое псевдоаллергическое действие по сравнению с эремомицином [Olsufyeva E.N., et al. Drug Design Devel. Ther., 2018, 12, 2875; Патент РФ №2641912].

Традиционный скрининг разрабатываемых антимикробных средств базируется на определении активности по отношению к свободно живущим микроорганизмам. Однако патогенные бактерии зачастую могут формировать биопленки, как в естественной среде, так и в клинических условиях. В такой форме метаболическая активность и чувствительность патогена к антибиотикам значительно отличается от планктонной формы [Н. Boudarel, J.D. Mathias, B. Blaysat, et al. npj Biofilms Microbiomes. 2018, 4, 17]. Поскольку бактерии в биопленке более устойчивы к действию антибиотиков, при создании эффективных антимикробных средств, необходимо исследовать способность новых соединений разрушать биопленки. Более того, известно, что ванкомицин в субингибирующих концентрациях способен стимулировать формирование биопленок [J.В. Kaplan Int. J. Art. Org., 2011, 34, 737], что также следует учитывать при разработке новых производных гликопептидных антибиотиков. Лишь для некоторых производных ванкомицина продемонстрирована способность к подавлению роста биопленок [I.S. Shchelik, et.al., ACS Med. Chem. Lett., 2021, 12, 1898], однако исследование их влияния в субингибирующих концентрациях на стимуляцию формирования биопленок не проведено.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения ставится создание более эффективных антибактериальных средств на основе эремомицина. Неожиданно было обнаружено, что введение гуанидиноалкильного фрагмент по атому азота С-концевой амидной группы амида эремомицина позволяет получить производные, действующее как на планктонные формы, так и биопленки, формируемые чувствительными и резистентными к гликопептидам штаммами патогенов. Настоящее изобретение включает соединения, соответствующие формуле 3, их фармакологически приемлемые соли, действующие на антибиотикорезистентные формы возбудителей бактериальных инфекций, прежде всего, на штаммы MRSA, GISA и VRE.

где R - независимо означает водород, алкил или необязательно замещенный арилалкил;

m независимо от 2 до 3.

Соединения формулы 3 могут быть получены конденсацией эремомицина (2) или его солей и соответствующего аминоалкилгуанидина или его солей, с использованием методов, хорошо известных из уровня развития техники. Так, для конденсации могут быть использованы конденсирующие агенты (РуВОР, ВОР, TBTU, HBTU, HATU), а также вспомогательные основания или соли, необходимых для поддержания оптимального рН в подходящем инертном апротонном растворителе (Схема 1).

Схема 1

Сравнительное исследование антибактериальных свойств новых производных эремомицина, соответствующих формуле 3, и используемого в клинике ванкомицина (1) на контрольном штамме S. aureus АТСС №29213, а также на панели грамположительных бактерий показали, что новая модификация карбоксильной группы эремомицина повышает его активность в отношении планктонных форм резистентных к гликопептидам бактерий при сохранении активности в отношении чувствительных штаммов. Помимо этого, новые производные способны разрушать биопленки, при полном отсутствии стимулирующего их рост действия. Кроме того, производные формулы 3 существенно превосходит по эффективности ванкомицин (1) на моделях системной бактериальной инфекции in vivo.

Таким образом, изобретение также включает способ лечения бактериальных инфекций, вызванных штаммами грамположительных патогенов, такими как Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Clostridium spp., Bacillus spp., в том числе, нечувствительными или малочувствительных к другим антибиотикам, например MRSA (метициллин-резистентный) и VRSA (ванкомицин-резистентный), предусматривающий введение нуждающемуся субъекту терапевтически эффективного количества производного эремомицина, соответствующего формуле 3.

Если не указано иное, термины, используемые в описании заявки и пунктах формулы изобретения, имеют значения, указанные ниже. Следует отметить, что, если не указано иное, используемые в описании и пунктах формулы формы единственного числа включают также формы множественного числа.

"Алкил" означает, одновалентный насыщенный углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью или циклический радикал, включающий только атомы углерода и водорода и содержащий от 1 до включительно 14 атомов углерода.

"Арил" означает, необязательно замещенный одновалентный циклический ароматический углеводородный радикал, содержащий один или более конденсированных циклов, из которых, по меньшей мере, один цикл является ароматическим. Примеры арильных радикалов включают, без ограничения перечисленным, фенил, нафтил, бифенил, и т.п.

"Арилалкил" означает, необязательно замещенный арильный радикал, присоединенный через алкильную группу. Примеры арилалкильных радикалов включают, без ограничения перечисленным, бензил, фенилэтил и т.п.

"Инертный органический растворитель" означает растворитель, инертный в условиях описываемой в тексте реакции, включающий, например, бензол, толуол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид, N-метилпирролидон, диметилсульфоксид, сульфолан, хлороформ, дихлорметан, дихлорэтан, этилацетат, ацетон, метилэтилкетон, метанол, этанол, пропанол, изопропанол, трет-бутанол, диоксан, пиридин и т.п. Если не указано иное, растворители, использованные в реакциях по настоящему изобретению, являются инертными растворителями.

"Сольваты" означает сольватированные формы, содержащие стехиометрическое или нестехиометрическое количество растворителя. Некоторые соединения способны удерживать в кристаллической решетке фиксированное количество молекул растворителя, образуя сольват. Гидраты образуются в том случае, если в качестве растворителя используется вода, а алкоголяты образуются в том случае, если растворителем является спирт.

"Субъект" означает млекопитающих, т.е. любого члена класса млекопитающих, включая, без ограничения перечисленным, человека, приматов, сельскохозяйственных животных, лабораторных животных и т.п., предпочтительно человека. Термин субъект не означает конкретный возраст или пол пациента.

"Терапевтически эффективное количество" означает количество соединения, которое при введении субъекту (пациенту) для лечения патологического состояния является достаточным для оказания фармакологического действия при лечении патологического состояния субъекта. Терапевтически эффективное количество варьируется в зависимости от типа соединения, патологического состояния подлежащего лечению, тяжести болезни, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, от способа и формы введения, от мнения лечащего врача или практикующего ветеринара и других факторов.

"Фармакологическое действие" означает термин, используемый в описании заявки, включает результаты воздействия на субъект, при которых достигается предполагаемая цель терапии. Например, фармакологическое действие означает такие результаты воздействия, которые приводят к излечению или замедлению развития, предупреждению рецидива заболевания.

"Фармацевтически приемлемый" означает материал, который используют при получении фармацевтической композиции, и который обычно является безопасным, не токсичным, безопасным в биологическом или ином отношении и включает материал, приемлемый как в ветеринарии, так и в фармацевтике.

"Фармацевтически приемлемые соли" соединений означают соли, которые являются фармацевтически приемлемыми и обладают необходимой фармакологической активностью исходного соединения. Такие соли включают кислотно-аддитивные соли неорганических кислот, таких, как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и т.п., или органических кислот, таких, как уксусная кислота, бензойная кислота, лимонная кислота, фумаровая кислота, глутаминовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, малеиновая кислота, яблочная кислота, метансульфоновая кислота, пропионовая кислота, салициловая кислота, янтарная кислота, винная кислота, толуолсульфоновая кислота и т.п. Подразумевается, что фармацевтически приемлемые соли включают сольваты или кристаллические формы (полиморфные образования) указанной кислотно-аддитивной соли. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми солями являются соли соляной кислоты, серной кислоты, метансульфоновой кислоты, уксусной кислоты, адипиновой кислоты, янтарной кислоты, фумаровой кислоты, щавелевой кислоты, фосфорной кислоты.

Исходный эремомицин (2) получен ферментацией Amycolatopsis orientalis, РуВОР, триэтиламин, диметилсульфоксид, растворители и прочие реагенты являются коммерческими химическими соединениями, поставляемыми фирмами, такими, как Merck, Abcr или Acros. Исходные аминоалкилгуанидины можно получить методами, известными специалисту в данной области или описанными в литературе.

Примеры, показывающие возможность получения новых производных эремомицина, соответствующих формуле 3, являющихся предметом настоящего изобретения, а также их физико-химические свойства, антибактериальная активность и терапевтическая эффективность in vivo, описанные ниже, приводятся лишь для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения объема притязаний.

Пример 1. Гидрохлорид N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-1)

При слабом нагревании и интенсивном перемешивании растворяют сульфат эремомицина (0.5 г, 0.29 ммоль) и триэтиламин (0.33 мл, 2.38 ммоль) в безводном диметилсульфоксиде (12.5 мл). К полученному раствору при перемешивании прибавляют дигидрохлорид 1-(2-аминоэтил)гуанидина (0.25 г, 1.45 ммоль) и РуВОР (0.23 г, 0.44 ммоль) и выдерживают 1 ч. К перемешиваемому раствору прибавляют изопропанол (10 мл), ацетон (25 мл) и диэтиловый эфир (15 мл). Выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×10 мл), диэтиловым эфиром (2×10 мл) и высушивают в вакууме. Осадок растворяют в воде (2 мл), при перемешивании прибавляют изопропанол (3-4 мл) до помутнения раствора и повторно осаждают продукт смесью ацетона (25 мл) и диэтилового эфира (15 мл). Выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×10 мл), диэтиловым эфиром (2×10 мл) и высушивают в вакууме. Технический продукт растворяют в 3-5 мл воды и очищают методом обращенно-фазовой хроматографии (элюент: водный раствор аммиака (0.5%) - ацетонитрил). Фракции, содержащие продукт, объединяют, концентрируют в вакууме до объема ~5 мл. Раствор подкисляют при тщательном перемешивании водным раствором (1%) соляной кислоты до рН~4, упаривают до объема 1-2 мл, после чего осаждают продукт ацетоном (50 мл). Выпавший осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2×10 мл), диэтиловым эфиром (2×10 мл) и сушат в вакууме. Получают 0.36 г (56%) гидрохлорида N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-1) в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=6.4, В - MeCN; градиент В 10 → 30% (30 мин): Rt=18.47 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₇₆H₉₈ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1641.6511; найдено 1641.6561. Найдено, %: С 48.29, Н 5.90, N 10.53; вычислено для C₇₆H₉₇ClN₁₄O₂₅*4HCl*6H₂O, %: С 48.14, Н 6.01, N 10.34.

Пример 2. Фосфат N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-2)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1 -(2-аминоэтил)гуанидина при использовании ортофосфорной кислоты. Выход фосфата Н-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-2) - 58%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=6.4, В - MeCN; градиент В 10 → 30% (30 мин): Rt=18.32 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₇₆H₉₈ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1641.6511; найдено 1641.6504. Найдено, %: С 46.12, Н 5.90, N 10.06; вычислено для C₇₆H₉₇ClN₁₄HO₂₅*2H₃PO₄*8Н₂О, %: С 46.05, Н 6.05, N 9.89.

Пример 3. Адипинат N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-3)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)гуанидина при использовании адипиновой кислоты. Выход адипината N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-3) - 48%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=6.4, В - MeCN; градиент В 10 → 30% (30 мин): Rt=18.40 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₇₆H₉₈ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1641.6511; найдено 1641.6515.

Пример 4. Мезилат N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-4)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)гуанидина при использовании метансульфоновой кислоты. Выход мезилата ТМ-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-4) - 57%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=6.4, В - MeCN; градиент В 10 → 30% (30 мин): Rt=18.46 мин HRSM (ESI) вычислено для C₇₆H₉₈ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1641.6511; найдено 1641.6512. Найдено, %: С 45.92, Н 5.97, N 9.15; вычислено для C₇₆H₉₇ClN₁₄O₂₅*4CH₃SO₃H*6H₂O, %: С 45.01, Н 5.90, N 9.19.

Пример 5. Гидрохлорид N-(3-гуанидинопропил)амида эремомицина (3-5)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(3-аминопропил)гуанидина. Выход гидрохлорида N-(3-гуанидинопропил)амида эремомицина (3-5) - 52%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10 → 40% (30 мин): Rt=9.27 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₇₇H₁₀₀ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1655.6667; найдено 1655.6660.

Пример 6. Гидрохлорид N-(2-(3-метилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-6)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-3-метилгуанидина. Выход гидрохлорида N-(2-(3-метиллгуанидино)этил)амида эремомицина (3-6) - 53%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH4 (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→40% (30 мин): Rt=9.14 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₇₇H₁₀₀ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1655.6667; найдено 1655.6671.

Пример 7. Гидрохлорид N-(2-(3-бутилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-7)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-3-бутилгуанидина. Выход гидрохлорида N-(2-(3-бутилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-7) - 52%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→40% (30 мин): Rt=9.27 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₈₀H₁₀₆ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1697.7137; найдено 1697.7123.

Пример 8. Гидрохлорид N-(2-(3-октилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-8)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-3-октилгуанидин. Выход гидрохлорида N-(2-(3-октилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-8) - 53%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 20 → 60% (30 мин): Rt=12.59 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₈₄H₁₁₄ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1753.7763; найдено 1753.7793.

Пример 9. Гидрохлорид N-(2-(3-додецилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-9)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-3-додецилгуанидина. Выход гидрохлорида N-(2-(3-додецилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-9) - 57%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→40% (30 мин): Rt=14.22 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₈₈H₁₂₂ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1809.8389; найдено 1809.8390.

Пример 10. Гидрохлорид N-(2-(3-тетрадецилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-10)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-3-тетрадецилгуанидина. Выход гидрохлорида N-(2-(3-тетрадецилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-10) - 57%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→40% (30 мин): Rt=17.41 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₉₀H₁₂₆ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1837.8702; найдено 1837.8694.

Пример 11. Гидрохлорид N-(2-(3-бензилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-11)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-3-бензилгуанидина. Выход гидрохлорида N-(2-(3-бензилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-11) - 53%, в виде кремового порошка ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→40% (30 мин): Rt=11.07 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₈₃H₁₀₄ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1731.6980; найдено 1731.6975.

Пример 12. Гидрохлорид N-(2-(3-(2-фторбензил)гуанидино)этил)амида эремомицина (3-12)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-3-(2-фторбензил)гуанидина. Выход гидрохлорида N-(2-(3-(2-фторбензил)гуанидино)этил)амида эремомицина (3-12) - 55%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→40% (30 мин): Rt=12.76 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₈₃H₁₀₃ClFN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1749.6886; найдено 1749.6891.

Пример 13. Гидрохлорид N-(2-(3-((4'-хлорбифенил-4-ил)метил)гуанидино)этил)амида эремомицина (3-13)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-3-((4'-хлорбифенил-4-ил)метил)гуанидина. Выход гидрохлорида N-(2-(3-((4'-хлоробифенил-4-ил)метил)гуанидино)этил)амида эремомицина (3-13) - 41%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10 → 40% (30 мин): Rt=15.23 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₈₉H₁₀₇Cl₂N₁₄O₂₅[М+Н]⁺: 1841.6903; найдено 1841.6895.

Пример 14. Гидрохлорид N-(2-(2-нафтилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-14)

Получают по методике, аналогичной приведенной в примере 1 из эремомицина (2) и дигидрохлорида 1-(2-аминоэтил)-2-нафтилгуанидина. Выход гидрохлорида N-(2-(2-нафтилгуанидино)этил)амида эремомицина (3-14) - 44%, в виде кремового порошка. ВЭЖХ (колонка Kromasil-100-5-мкм С-18 4.6×250 мм, LW=260 нм, элюент: А - HCOONH₄ (0.2%) рН=4.5, В - MeCN; градиент В 10→40% (30 мин): Rt=14.01 мин. HRSM (ESI) вычислено для C₈₇H₁₀₅ClN₁₄O₂₅[M+H]⁺: 1780.7064; найдено 1780.7060.

Пример 15. Антибактериальная активность новых производных в отношении планктонных форм чувствительных и резистентных штаммов грамположительных бактерий

Антимикробная активность N-(гуанидиноалкил)амидов эремомицина, являющихся предметом настоящего изобретения, изучена в сравнении с ванкомицином (1) на панели чувствительных к ванкомицину грамположительных бактерий: S. aureus АТСС 29213, Enteroccus faecium 2и£. faecium 4; и резистентных к ванкомицину грамположительных бактерий: Е. faecium 130, Е. faecium 3576, E.faecalis 583, Е. gallinarum 1308, полученных из музея лаборатории медицинской микробиологии Государственного научного центра по антибиотикам (ГНЦА). Минимальную подавляющую рост микроорганизмов концентрацию (МПК) для тестируемых соединений определяли микрометодом серийных разведений в бульоне, в соответствии с рекомендациями CLSI.

Полученные результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что в отношении чувствительных и резистентных к ванкомицину штаммов в большинстве случаев, по активности in vitro, гуанидин-содержащие амиды эремомицина, являющиеся предметом настоящего изобретения, превосходят препарат сравнения - ванкомицин (1), обладая в 2-64 раза большей активностью, чем препарат сравнения. Наибольшую активность в отношении чувствительных к гликопептидам штаммам показало производное 3-1 (гидрохлорид N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина).

Пример 16. Действие на биопленки чувствительных и резистентных штаммов грамположительных бактерий

Сравнительное исследования действия новых производных на планктонные формы и биопленки проведено на клинических изолятах Staphylococcus epidermidis штаммы 20637 и 21555, E.faecalis 23 и штамме Е. faecium 3 (VRE), полученных из коллекции ГНЦА.

Определение МПК исследуемых антибиотиков в отношении тест-культур осуществляли методом двукратных серийных разведений в триптиказо-соевом бульоне, содержащем 2% глюкозы, т.е. в условиях формирования биопленок. Для анализа чувствительности планктонной культуры в высоком титре плотность инокулята составляла 10⁸ КОЕ/мл. Инкубацию осуществляли 18-20 ч при 36°С.

Активность в отношении биопленок патогенов оценивали по величине минимальной концентрации эрадикации биопленок (МКЭБ) в отношении биопленок низкой плотности (24 ч культивации) и зрелых биопленок (48 ч культивации). Для подготовки биопленок в планшете, инокулят разводили до титра 10⁶ КОЕ/мл в триптиказо-соевом бульоне, содержащем 2% глюкозы и в количестве 100 мкл переносили в лунки, инкубировали в стационарных условиях 24 и 48 ч при 36°С. После 24 ч инкубации удаляли планктон и дважды промывали физиологическим раствором объемом 200 мкл. При культивировании 48 ч - вносили свежий бульон того же состава. Из сформированных биопленок удаляли планктон, промывали физиологическим раствором и вносили N-(2-гуанидиноэтил)амид эремомицина (3-1) в тестируемом диапазоне концентраций. Инкубировали 24 ч при температуре 36°С. Анализ плотности биопленок (CV-тест) осуществляли окраской генцианвиолетом (0.1% раствор) [J. Korenova, J. Lopasovska, Т. Kuchta. J. Food. Nutr. Res., 2008, 47(2), 100]. Плотность окраски измеряли при 580 нм на планшетном ридере Bioscreen с автоматизированной системой ("Labsystems", Финляндия) с программным обеспечением. Анализ жизнеспособности после инкубации с тестируемыми антибиотиками оценивали по метаболической активности бактерий с помощью колориметрического теста с МТТ (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия, ООО НПП ПанЭко). Оптическую плотность измеряли при 492 нм на планшетном ридере Bioscreen с автоматизированной системой ("Labsystems", Финляндия) с программным обеспечением.

Результаты исследований показывают, что амид 3-1 не только обладает более высокой активностью в отношении планктонной формы энтерококков и коагулазонегативных стафилококков, но и не теряет активность в отношении 24 ч биопленок, тогда как для ванкомицина величина МКЭБ в отношении биопленок низкой плотности увеличивается на 2-4 разведения (Таблица 2). Хотя в отношении биопленок высокой плотности (48 ч инкубации) и наблюдается снижение активности как для ванкомицина, так и для N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-1), такой эффект является закономерным ввиду образования экзополимерного матрикса, практически не чувствительного к антибиотикам. Тем не менее, стоит отметить, что активность амида 3-1 в отношении зрелых биопленок, особенно более устойчивых биопленок эпидермального стафилококка, была в среднем в 10 раз выше таковой для ванкомицина.

Исследование стимулирования образования биопленок показало, что ванкомицин (1) стимулирует образование биопленок Enterococcus spp. в субтоксических концентрациях (0.25-1 мкг/мл) на 30-45%, как на стадии формирования биопленок, так и при действии на сформированные биопленки (Таблица 3). В противоположность ванкомицину гидрохлорид N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-1, пример 1) не оказывает такого действия (Таблица 3). Полученные результаты были оценены как по плотности биопленки окраской генцианвиолетом, так и по метаболической активности бактерий с помощью колориметрического МТТ-теста, так как биомасса может содержать погибшие клетки или иметь повышенный объем матрикса.

Пример 17. Исследование действия на биопленки методом сканирующей ионопроводящей микроскопии

Для визуализации эффекта подавления роста биопленок N-(2-гуанидиноэтил)амидом эремомицина (3-1) исследовано его действия на биопленки S. epidermidis 21555 методом сканирующей ионопроводящей микроскопии. Биопленки подготавливали в чашках Петри диаметром 50 мм без дополнительной обработки. После 5 суток инкубации в промытые чашки вносили свежий бульон, содержащий N-(2-гуанидиноэтил)амидом эремомицина (3-1) в концентрации, равной МПК (таблица 2), инкубировали 24 ч при 36°С, перед микроскопией удаляли бульон, вновь промывали и заполняли физиологическим раствором. Сканирование проводили непосредственно после контакта с поверхностью биопленки при удерживании постоянного потенциала, равного 200 мВ и высокочастотной фильтрации сигнала (Bessel) - 4 кГц. По трехмерным изображениям, полученным методом сканирующей ионопроводящей микроскопии, были рассчитаны высоты и вычислены средние значения для каждого плана, в сравнении с контролем.

Результаты исследования показали, что гидрохлорид N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-1, пример 1) при инкубации в течение 24 ч активно разрушает биопленки высокой плотности в концентрации, соответствующей МПК (Таблица 2), приводя к снижению объема биопленки на 61%. При топографии поверхности биопленки, видны отличия от контрольного варианта (рисунок 1а) - высота агрегатов клеток значительно ниже, расположены они менее плотно (рисунок 1б). При этом средняя высота биопленки после обработки амидом эремомицина 3-1 составляла 8,08 мкм, что составляет 61% высоты биопленки в контрольном образце (13.26 мкм).

Пример 18. Антибактериальная эффективность in vivo

Сравнительное исследование эффективности гидрохлорида N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-1, пример 1) и ванкомицина (1) проведено на модели стафилококкового сепсиса мышей. В опыте использовали самок мышей SHK, весом 20-22 г. В качестве инфекционного агента использовали S. aureus (штамм 10, клинический изолят), адаптированный к росту в in vivo, путем пятикратного пассирования в организме мышей. Первоначально определялась летальная доза (LD₁₀₀) стафилококка для данной линии мышей при внутривенном пути заражения. Учет за гибелью мышей проводился ежедневно в течение 10 суток. Летальная доза (LD₁₀₀) составляла 8×10⁸ КОЕ/мышь. Мышей рассаживали в клетки по 10 голов, заражали внутривенно S. aureus в летальной дозе и определяли эффективность испытуемых препаратов по величине ED₅₀ (т.е. дозы, при которых выживает 50% подопытных животных). Через 30 мин после заражения мышам внутривенно вводили гидрохлорид N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-1) в дозах от 0.1 до 2.5 мг/кг или сульфат ванкомицина (1) в дозах от 2.5 до 7.5 мг/кг. В качестве контроля дозы в опыте присутствовала группа нелеченых животных, зараженных летальной дозой S. aureus. Определение ED₅₀ испытуемых препаратов производили в одном опыте при едином контроле, используя метод Беренса (накопления частот). За животными наблюдали в течение 14 суток, ежедневно учитывали гибель. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

На основании экспериментальных данных о выживаемости мышей (таблица 4) были рассчитаны значения показателей эффективности испытуемых препаратов (ED₅₀):

- Гидрохлорид N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-1) ED₅₀=0.29 мг/кг;

- Ванкомицин ED₅₀=4.1 мг/кг.

Полученные результаты, представленные в таблице 3, и величина ED₅₀ свидетельствуют, что по эффективности in vivo гидрохлорид N-(2-гуанидиноэтил)амида эремомицина (3-1), являющийся предметом настоящего изобретения, в 14 раз превосходит по эффективности (ED₅₀) препарат сравнения - ванкомицин (1).

Claims

1. Производное фармацевтически приемлемой соли амида эремомицина, содержащее необязательно замещенный остаток гуанидина, соединенный алкильным линкером с атомом азота С-концевой группы амида эремомицина, и его гидраты, соответствующее формуле:

m независимо от 2 до 3.

2. Способ лечения бактериальных инфекционных заболеваний, вызванных штаммами грамположительных патогенов, предусматривающий введение нуждающемуся субъекту терапевтически эффективного количества вещества по п. 1.

3. Способ лечения бактериальных инфекций по п. 2, в котором возбудитель выбран из группы Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Clostridium spp., Bacillus spp.

4. Способ лечения бактериальных инфекций по п. 2, в котором возбудитель имеет резистентность в отношении других антимикробных средств.