RU2813511C2 - Recombinant strain based on escherichia coli and method of its construction and use - Google Patents
Recombinant strain based on escherichia coli and method of its construction and use Download PDFInfo
- Publication number
- RU2813511C2 RU2813511C2 RU2021139991A RU2021139991A RU2813511C2 RU 2813511 C2 RU2813511 C2 RU 2813511C2 RU 2021139991 A RU2021139991 A RU 2021139991A RU 2021139991 A RU2021139991 A RU 2021139991A RU 2813511 C2 RU2813511 C2 RU 2813511C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- leu
- gly
- ala
- nucleotide sequence
- strain
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент Китая №2019109276005, поданной в Национальное управление интеллектуальной собственности Китая 27 сентября 2019 г., и заявки на патент Китая №2019108040353 от 28 августа 2019 г, содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.This application claims priority based on Chinese Patent Application No. 2019109276005 filed with the National Intellectual Property Office of China on September 27, 2019, and Chinese Patent Application No. 2019108040353 dated August 28, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD
Настоящее изобретение относится к области генной инженерии и микроорганизмов, и, в частности, к рекомбинантному штамму на основе Escherichia coli, способу его конструирования и его применению.The present invention relates to the field of genetic engineering and microorganisms, and, in particular, to a recombinant strain based on Escherichia coli, a method for its construction and its use.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE ART
L-треонин является одной из восьми незаменимых аминокислот и представляет собой аминокислоту, которую люди и животные не могут синтезировать самостоятельно. L-треонин может улучшать усвояемость зерна, регулировать баланс метаболизма in vivo и способствовать росту и развитию организмов, поэтому он широко применяется в кормовой, медицинской и пищевой промышленности.L-threonine is one of the eight essential amino acids and is an amino acid that humans and animals cannot synthesize on their own. L-threonine can improve grain digestibility, regulate in vivo metabolic balance, and promote the growth and development of organisms, so it is widely used in the feed, medical and food industries.
В настоящее время L-треонин может быть получен главным образом методом химического синтеза, методом гидролиза белка и методом микробной ферментации, при этом метод микробной ферментации обладает преимуществами в виде низкой стоимости производства, высокой интенсивности производства и малого загрязнения окружающей среды, тем самым становясь наиболее широко применяемым методом промышленного производства L-треонина. Для продуцирования L-треонина путем микробной ферментации могут быть использованы различные бактерии, такие как мутанты, полученные путем индукции Escherichia coli (Ε. coli), Corynebacterium и Serratia дикого типа, взятых в качестве штаммов-продуцентов. Конкретные примеры включают в себя мутантов или различных ауксотрофов, устойчивых к аналогам аминокислот, таких как метионин, треонин и изолейцин. Однако при традиционной мутационной селекции штамм растет медленно и производит больше побочных продуктов из-за случайной мутации, так что получить высокопроизводительный штамм непросто. Следовательно, конструирование рекомбинантной Е. coli с помощью метаболической инженерии является эффективным способом получения L-треонина. В настоящее время сверхэкспрессия или аттенуация ключевых генов ферментов в биосинтезе аминокислот и конкурентном пути, опосредованном экспрессионными плазмидами, является основным средством генетической модификации Е. coli. По-прежнему существует необходимость в разработке более экономичного способа получения L-треонина с высоким выходом.At present, L-threonine can mainly be produced by chemical synthesis method, protein hydrolysis method and microbial fermentation method, and microbial fermentation method has the advantages of low production cost, high production intensity and low environmental pollution, thereby becoming the most widely used the method used for the industrial production of L-threonine. Various bacteria can be used to produce L-threonine by microbial fermentation, such as mutants obtained by inducing Escherichia coli (E. coli), wild-type Corynebacterium and Serratia taken as producer strains. Specific examples include mutants or various auxotrophs that are resistant to amino acid analogues such as methionine, threonine and isoleucine. However, in traditional mutation breeding, the strain grows slowly and produces more by-products due to random mutation, so it is not easy to obtain a high-yielding strain. Therefore, the construction of recombinant E. coli by metabolic engineering is an effective way to obtain L-threonine. Currently, overexpression or attenuation of key enzyme genes in the amino acid biosynthesis and competitive pathway mediated by expression plasmids is the main means of genetic modification of E. coli. There is still a need to develop a more economical method for producing L-threonine in high yield.
Е. coli в качестве хозяина для экзогенной экспрессии генов обладает преимуществами в виде чистого генетического фона, простых технических условий эксплуатации и культивирования, а также экономичной крупномасштабной ферментации, и поэтому специалисты по генной инженерии уделяют ей все больше внимания. Геномная ДНК Е. coli представляет собой кольцевую молекулу в нуклеоиде, а также может быть представлено множество кольцевых плазмидных ДНК. Нуклеоид в клетках Е. coli состоит из одной молекулы ДНК длиной около 4 700 000 пар нуклеотидов и содержит около 4400 генов, распределенных по молекуле ДНК, причем средняя длина каждого гена составляет около 1000 пар нуклеотидов. Для штаммов Е. coli, обычно используемых в молекулярной биологии, наиболее часто используемыми штаммами в экспериментах по рекомбинации ДНК, за некоторыми исключениями, являются штамм Е. coli K12 и его производные.E. coli, as a host for exogenous gene expression, has the advantages of a clean genetic background, simple operating and cultivation technical conditions, and economical large-scale fermentation, and has therefore received increasing attention from genetic engineers. The genomic DNA of E. coli is a circular molecule in the nucleoid, and there may also be a variety of circular plasmid DNAs. The nucleoid in E. coli cells consists of a single DNA molecule about 4,700,000 base pairs in length and contains about 4,400 genes distributed throughout the DNA molecule, with the average length of each gene being about 1,000 base pairs. For E. coli strains commonly used in molecular biology, the most commonly used strains in DNA recombination experiments, with some exceptions, are E. coli strain K12 and its derivatives.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
Согласно настоящему изобретению предложены рекомбинантный штамм Escherichia coli на основе штамма К12 или его производный штамм, способ его рекомбинантного конструирования и его применение в ферментативном получении аминокислоты.According to the present invention, a recombinant Escherichia coli strain based on the K12 strain or a derivative strain thereof, a method for its recombinant construction and its use in the enzymatic production of amino acids are proposed.
Настоящее изобретение главным образом относится к гену deoB дикого типа (последовательность ORF (Открытая Рамка Считывания) представлена в последовательности 3902352 3903575 в GenBank под идентификационным номером СР032667.1) и последовательности промотора гена rhtA дикого типа PrhtA (представлена в последовательности 850520 850871 в GenBank под идентификационным номером АР009048.1) штамма Е. coli К12 и его производного штамма (например, MG1655 и W3110), а также в настоящем изобретении обнаружено, что мутантный ген, полученный путем сайт-направленного мутагенеза, и рекомбинантный штамм, содержащий мутантный ген, можно применять для получения L-треонина, и, по сравнению с немутированным штаммом дикого типа, полученный штамм может значительно улучшить выход L-треонина, данный штамм обладает хорошей стабильностью, а также имеет более низкую стоимость производства и повышенную эффективность производства в качестве штамма для получения L-треонина.The present invention primarily relates to the wild type deoB gene (the ORF sequence is represented by sequence 3902352 3903575 in GenBank under accession number CP032667.1) and the promoter sequence of the wild type rhtA gene PrhtA (represented by sequence 850520 850871 in GenBank accession number AP009048.1) of E. coli strain K12 and its derivative strain (for example, MG1655 and W3110), and in the present invention it is found that a mutant gene obtained by site-directed mutagenesis and a recombinant strain containing the mutant gene can be used to produce L-threonine, and compared with the unmutated wild-type strain, the resulting strain can greatly improve the yield of L-threonine, this strain has good stability, and also has lower production cost and increased production efficiency as a strain for producing L-threonine. threonine.
На основании указанной выше информации, согласно настоящему изобретению предложены два следующих технических решения:Based on the above information, the present invention proposes the following two technical solutions:
Согласно первому техническому решению предложена нуклеотидная последовательность, содержащая последовательность, образованную посредством мутации, возникшей в 1049-м основании кодирующей последовательности гена deoB дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1.According to the first technical solution, a nucleotide sequence is proposed containing a sequence formed by a mutation occurring in the 1049th base of the coding sequence of the wild type deoB gene presented in SEQ ID NO: 1.
Согласно настоящему изобретению мутация относится к изменению основания/нуклеотида в сайте, и способ мутации может быть по меньшей мере одним, выбранным из следующих способов: мутагенез, ПЦР сайт-направленный мутагенез и/или гомологичная рекомбинации, и тому подобное.According to the present invention, mutation refers to a change in base/nucleotide at a site, and the method of mutation may be at least one selected from the following methods: mutagenesis, PCR site-directed mutagenesis and/or homologous recombination, and the like.
Согласно настоящему изобретению мутация состоит в том, что гуанин (G) заменен на аденин (А) в 1049-м основании в SEQ ID NO: 1; в частности, мутированная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2According to the present invention, the mutation is that guanine (G) is replaced by adenine (A) at the 1049th base in SEQ ID NO: 1; in particular, the mutated nucleotide sequence is presented in SEQ ID NO: 2
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный белок, кодируемый указанной выше нуклеотидной последовательностью.The present invention also provides a recombinant protein encoded by the above nucleotide sequence.
Описанный в данном документе рекомбинантный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.The recombinant protein described herein contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный вектор, содержащий указанную выше нуклеотидную последовательность.The present invention also provides a recombinant vector containing the above nucleotide sequence.
Описанный в данном документе рекомбинантный вектор сконструирован путем введения указанной выше нуклеотидной последовательности в плазмиду; в одном из вариантов осуществления плазмида представляет собой плазмиду pKOV. В частности, нуклеотидная последовательность и плазмида могут быть расщеплены эндонуклеазой с образованием комплементарных когезионных концов, которые лигируют для конструирования рекомбинантного вектора.The recombinant vector described herein is constructed by introducing the above nucleotide sequence into a plasmid; in one embodiment, the plasmid is a pKOV plasmid. In particular, the nucleotide sequence and plasmid can be digested with an endonuclease to form complementary cohesive ends, which are ligated to construct a recombinant vector.
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный штамм, который содержит кодирующую нуклеотидную последовательность гена deoB с точечной мутацией, возникшей в кодирующей последовательности.The present invention also provides a recombinant strain that contains the coding nucleotide sequence of the deoB gene with a point mutation occurring in the coding sequence.
Описанный в данном документе рекомбинантный штамм содержит указанную выше мутированную нуклеотидную последовательность.The recombinant strain described herein contains the above mutated nucleotide sequence.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.In one embodiment of the present invention, the recombinant strain contains the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рекомбинантный штамм содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.In one embodiment of the present invention, the recombinant strain contains the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
Описанный в данном документе рекомбинантный штамм сконструирован путем введения указанного выше рекомбинантного вектора в штамм-хозяин; штамм-хозяин конкретно не определен и может быть выбран из известного в данной области техники штамма, продуцирующего L-треонин, который сохраняет ген deoB, например, из Escherichia coli. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой штамм Е. coli K12 (W3110) или штамм Е. coli CGMCC 7.232.The recombinant strain described herein is constructed by introducing the above recombinant vector into a host strain; the host strain is not specifically defined and may be selected from a L-threonine-producing strain known in the art that retains the deoB gene, for example from Escherichia coli. In one embodiment of the present invention, the host strain is E. coli strain K12 (W3110) or E. coli strain CGMCC 7.232.
Для описанного в данном документе рекомбинантного штамма использовали плазмиду pKOV в качестве вектора.For the recombinant strain described herein, the pKOV plasmid was used as a vector.
Описанный в данном документе рекомбинантный штамм может дополнительно содержать другие модификации.The recombinant strain described herein may further contain other modifications.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, который включает следующую стадию:The present invention also provides a method for constructing a recombinant strain, which includes the following step:
модификация нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена deoB дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, для обеспечения возможности возникновения мутации в 1049-м основании последовательности для получения продуцирующего L-треонин рекомбинантного штамма, содержащего мутированный кодирующий ген deoB.modifying the nucleotide sequence of the wild-type deoB gene open reading frame region shown in SEQ ID NO: 1 to allow a mutation to occur at base 1049 of the sequence to produce an L-threonine-producing recombinant strain containing the mutated deoB coding gene.
Согласно способу конструирования по настоящему изобретению, модификация включает по меньшей мере один из следующих способов: мутагенез, ПЦР сайт-направленный мутагенез и/или гомологичная рекомбинация, и тому подобное.According to the construction method of the present invention, the modification includes at least one of the following methods: mutagenesis, PCR site-directed mutagenesis and/or homologous recombination, and the like.
Согласно способу конструирования по настоящему изобретению, мутация состоит в том, что гуанин (G) заменен на аденин (А) в 1049-м основании в SEQ ID NO: 1, в частности, мутированная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 2.According to the construction method of the present invention, the mutation is that guanine (G) is replaced by adenine (A) at the 1049th base in SEQ ID NO: 1, in particular, the mutated nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
Иллюстративно, способ конструирования включает следующие этапы:Illustratively, the design method includes the following steps:
(1) модификация нуклеотидной последовательности области открытой рамки считывания гена deoB дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, для обеспечения возможности возникновения мутации в 1049-м основании последовательности, для того чтобы получить мутированную нуклеотидную последовательность области открытой рамки считывания гена deoB;(1) modifying the nucleotide sequence of the wild-type deoB gene open reading frame region shown in SEQ ID NO: 1 to allow a mutation to occur at the 1049th base of the sequence to obtain a mutated nucleotide sequence of the deoB gene open reading frame region;
(2) лигирование мутированной нуклеотидной последовательности с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и(2) ligating the mutated nucleotide sequence to the plasmid to construct a recombinant vector; And
(3) введение рекомбинантного вектора в штамм-хозяин для получения продуцирующего L-треонин рекомбинантного штамма, содержащего точечную мутацию.(3) introducing the recombinant vector into the host strain to obtain an L-threonine-producing recombinant strain containing the point mutation.
Согласно способу конструирования по настоящему изобретению, этап (1) включает: конструирование кодирующей области гена deoB, содержащей точечную мутацию, в частности, включающее синтез двух пар праймеров для амплификации фрагментов кодирующей области гена deoB в соответствии с кодирующей последовательностью гена deoB, и введение точечной мутации в кодирующую область гена deoB дикого типа (SEQ ID NO: 1) путем ПЦР сайт-направленного мутагенеза для получения нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 2) кодирующей области гена deoB, содержащей точечную мутацию, где нуклеотидная последовательность обозначена как deoB(G1049A).According to the construction method of the present invention, step (1) includes: constructing a coding region of the deoB gene containing a point mutation, particularly including synthesizing two pairs of primers for amplifying fragments of the coding region of the deoB gene according to the coding sequence of the deoB gene, and introducing the point mutation into the coding region of the wild-type deoB gene (SEQ ID NO: 1) by PCR site-directed mutagenesis to obtain the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) of the coding region of the deoB gene containing the point mutation, where the nucleotide sequence is designated deoB (G1049A) .
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения на этапе (1) праймеры представляют собой:In one embodiment of the present invention, in step (1), the primers are:
П1: 5' CGGGATCCATGGACGGCAACGCTGAAG 3' (подчеркнутая часть обозначает сайт разрезания эндонуклеазой рестрикции ВаmH I) (SEQ ID NO: 5);P1: 5' CG GGATCC ATGGACGGCAACGCTGAAG 3' (the underlined part indicates the site of restriction endonuclease BamH I) (SEQ ID NO: 5);
П2: 5' GATCGTAACCGTGGTCAG 3' (SEQ ID NO: 6);P2: 5' GATCGTAACCGTGGTCAG 3' (SEQ ID NO: 6);
П3: 5' CTGACCACGGTTACGАТС 3' (SEQ ID NO: 7); иP3: 5' CTGACCACGGTTACGATC 3' (SEQ ID NO: 7); And
П4: 5' AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCTCGTGAGTGCGGATGT 3' (подчеркнутая часть обозначает сайт разрезания эндонуклеазой рестрикции Not I) (SEQ ID NO: 8).P4: 5' AAGGAAAAAA GCGGCCGC GCTCGTGAGTGCGGATGT 3' (underlined portion indicates Not I restriction endonuclease cleavage site) (SEQ ID NO: 8).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения этап (1) включает: применение праймеров П1/П2 и П3/П4 для ПЦР-амплификации путем применения Е. coli K12 в качестве матрицы для получения двух выделенных фрагментов ДНК (deoB Up и deoB Down), составляющих в длину 836 п. н. и 890 п. н. и содержащих кодирующие области гена deoB; и разделение и очистку данных двух фрагментов ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле, а затем выполнение ПЦР с перекрывающимися праймерами путем применения П1 и П4 в качестве праймеров и двух фрагментов ДНК в качестве матрицы для получения deoB(G1049A)-Up-Down.In one embodiment of the present invention, step (1) includes: using primers P1/P2 and P3/P4 for PCR amplification by using E. coli K12 as a template to obtain two isolated DNA fragments (deoB Up and deoB Down) constituting 836 bp long and 890 bp and containing coding regions of the deoB gene; and separating and purifying these two DNA fragments by agarose gel electrophoresis, and then performing PCR with overlapping primers by using P1 and P4 as primers and the two DNA fragments as a template to obtain deoB( G1049A) -Up-Down.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность deoB(G1049A)-Up-Down имеет длину 1726 п.н.In one embodiment of the present invention, the nucleotide sequence of deoB( G1049A) -Up-Down is 1726 bp in length.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 30 с (всего 30 циклов).In one embodiment of the present invention, PCR amplification is carried out as follows: denaturation at 94°C for 30 s, annealing at 52°C for 30 s and elongation at 72°C for 30 s (a total of 30 cycles).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 60 с (всего 30 циклов).In one embodiment of the present invention, PCR amplification is carried out as follows: denaturation at 94°C for 30 s, annealing at 52°C for 30 s and elongation at 72°C for 60 s (a total of 30 cycles).
Согласно способу конструирования по настоящему изобретению, этап (2) включает: конструирование рекомбинантного вектора, в частности, отделение и очистку фрагмента deoB(G1049A)-Up-Down с помощью электрофореза в агарозном геле, затем двойное расщепление очищенного фрагмента и плазмиды pKOV с помощью ВаmН I/Not I, и отделение и очистку расщепленного фрагмента deoB(G1049A)-Up-Down и расщепленной плазмиды pKOV с помощью электрофореза в агарозном геле с последующим лигированием для получения рекомбинантного вектора pKOV- deoB(G1049A).According to the construction method of the present invention, step (2) includes: construction of the recombinant vector, in particular, separation and purification of the deoB( G1049A) -Up-Down fragment by agarose gel electrophoresis, then double cleavage of the purified fragment and plasmid pKOV with BamH I/Not I, and separation and purification of the digested deoB( G1049A) -Up-Down fragment and the digested pKOV plasmid by agarose gel electrophoresis followed by ligation to obtain the recombinant vector pKOV-deoB (G1049A) .
Согласно способу конструирования по настоящему изобретению, этап (3) включает: конструирование рекомбинантного штамма, в частности, трансформацию рекомбинантного вектора pKOV-deoB(G1049A)- в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма.According to the construction method of the present invention, step (3) includes: constructing a recombinant strain, in particular, transforming the recombinant vector pKOV-deoB( G1049A) into a host strain to obtain a recombinant strain.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения трансформация на этапе (3) представляет собой процесс электротрансформации; иллюстративно, на этапе (3) рекомбинантный вектор вводят в штамм-хозяин.In one embodiment of the present invention, the transformation in step (3) is an electrotransformation process; Illustratively, in step (3), the recombinant vector is introduced into the host strain.
Согласно способу конструирования по настоящему изобретению, указанный способ дополнительно включает стадию скрининга рекомбинантного штамма; иллюстративно, скрининг осуществляют с использованием питательной среды с добавлением хлорамфеникола.According to the construction method of the present invention, the method further includes the step of screening a recombinant strain; Illustratively, screening is performed using a culture medium supplemented with chloramphenicol.
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный штамм, полученный указанным выше способом конструирования.The present invention also provides a recombinant strain obtained by the above construction method.
Согласно настоящему изобретению также предложено применение указанного выше рекомбинантного штамма для получения L-треонина или увеличения объема ферментации L-треонина.The present invention also provides the use of the above recombinant strain for the production of L-threonine or for increasing the fermentation rate of L-threonine.
Применение данного рекомбинантного штамма для получения L-треонина включает ферментацию рекомбинантного штамма для получения L-треонина.Use of this recombinant strain to produce L-threonine involves fermenting the recombinant strain to produce L-threonine.
Согласно второму техническому решению предложен промотор, содержащий нуклеотидную последовательность, образованную посредством мутации, возникшей в 67-м основании выше по нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13.According to the second technical solution, a promoter is proposed containing a nucleotide sequence formed by a mutation occurring at the 67th base upstream of the nucleotide sequence presented in SEQ ID NO: 13.
Согласно настоящему изобретению мутация относится к изменению основания в сайте, и способ мутации может быть по меньшей мере одним, выбранным из следующих способов: мутагенез, ПЦР сайт-направленный мутагенез и/или гомологичной рекомбинации, и тому подобное.According to the present invention, mutation refers to a change in base at a site, and the mutation method may be at least one selected from the following methods: mutagenesis, PCR site-directed mutagenesis and/or homologous recombination, and the like.
Согласно настоящему изобретению мутация состоит в том, что аденин (А) заменен на гуанин (G) в 67-м основании в SEQ ID NO: 13, в частности, мутированная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 14.According to the present invention, the mutation is that adenine (A) is replaced by guanine (G) at the 67th base in SEQ ID NO: 13, in particular, the mutated nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
Согласно настоящему изобретению предложена экспрессионная кассета, содержащая указанный выше промотор и кодирующую нуклеотидную последовательность гена rhtA. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения промотор расположен на 5' конце выше по кодирующей нуклеотидной последовательности гена rhtA, образуя экспрессионную кассету.According to the present invention, an expression cassette is provided containing the above-mentioned promoter and the coding nucleotide sequence of the rhtA gene. In one embodiment of the present invention, the promoter is located 5' upstream of the coding nucleotide sequence of the rhtA gene, forming an expression cassette.
Согласно экспрессионной кассете по настоящему изобретению кодирующая нуклеотидная последовательность гена rhtA содержит нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15, и данная нуклеотидная последовательность кодирует последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQIDNO: 16.According to the expression cassette of the present invention, the coding nucleotide sequence of the rhtA gene contains the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15, and this nucleotide sequence encodes the sequence containing the amino acid sequence shown in SEQIDNO: 16.
Согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный вектор, который содержит указанный выше промотор.According to the present invention, a recombinant vector is provided that contains the above promoter.
Описанный в данном документе рекомбинантный вектор сконструирован путем введения нуклеотидной последовательности, содержащей указанную выше промоторную нуклеотидную последовательность, в плазмиду; в одном из вариантов осуществления плазмида представляет собой плазмиду pKOV. В частности, нуклеотидная последовательность, содержащая промоторную нуклеотидную последовательность, и плазмида могут быть расщеплены эндонуклеазой для образования комплементарных когезионных концов, которые лигируют для конструирования рекомбинантного вектора.The recombinant vector described herein is constructed by introducing a nucleotide sequence containing the above promoter nucleotide sequence into a plasmid; in one embodiment, the plasmid is a pKOV plasmid. In particular, the nucleotide sequence containing the promoter nucleotide sequence and the plasmid can be digested with an endonuclease to form complementary cohesive ends, which are ligated to construct a recombinant vector.
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный штамм, который содержит указанный выше промотор.The present invention also provides a recombinant strain that contains the above promoter.
Описанный в данном документе рекомбинантный штамм содержит промоторную нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14; кроме того, данный рекомбинантный штамм содержит указанную выше экспрессионную кассету.The recombinant strain described herein contains the promoter nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 14; in addition, this recombinant strain contains the above expression cassette.
Описанный в данном документе рекомбинантный штамм получают путем введения указанного выше рекомбинантного вектора в штамм-хозяин; штамм-хозяин конкретно не определен и может быть выбран из известного в данной области техники штамма, продуцирующего L-треонин, который сохраняет ген rhtA, например, из Escherichia coli. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой штамм Е. coli K12 (W3110), или его производный штамм Е. coli K12 (W3110), или штамм coli CGMCC 7.232.The recombinant strain described herein is obtained by introducing the above recombinant vector into a host strain; the host strain is not specifically defined and may be selected from a L-threonine-producing strain known in the art that retains the rhtA gene, for example from Escherichia coli. In one embodiment of the present invention, the host strain is E. coli K12 strain (W3110), or its derivative E. coli K12 strain (W3110), or coli strain CGMCC 7.232.
Для описанного в данном документе рекомбинантного штамма использовали плазмиду pKOV в качестве вектора.For the recombinant strain described herein, the pKOV plasmid was used as a vector.
Согласно настоящему изобретению рекомбинантный штамм может содержать или не содержать дополнительно другие модификации.According to the present invention, the recombinant strain may or may not additionally contain other modifications.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, который включает следующий этап:The present invention also provides a method for constructing a recombinant strain, which includes the following step:
модификация промоторной области, представленной в SEQ ID NO: 13 для обеспечения возможности возникновения мутации в -67-м основании области, для получения рекомбинантного штамма промотора, содержащего точечную мутацию.modifying the promoter region shown in SEQ ID NO: 13 to allow a mutation to occur at the -67th base of the region to produce a recombinant promoter strain containing the point mutation.
Согласно способу конструирования настоящего изобретения, модификация включает по меньшей мере один способ, выбранный из следующих способов: мутагенез, ПЦР сайт-направленный мутагенез и/или гомологичной рекомбинации, и тому подобное.According to the construction method of the present invention, the modification includes at least one method selected from the following methods: mutagenesis, PCR site-directed mutagenesis and/or homologous recombination, and the like.
Согласно способу конструирования настоящего изобретения, мутация состоит в том, что аденин (А) заменен на гуанин (G) в -67-м основании в SEQ ID NO: 13; в частности, промоторная нуклеотидная последовательность гена rhtA с точечной мутацией представлена в SEQ ID NO: 14.According to the construction method of the present invention, the mutation is that adenine (A) is replaced by guanine (G) at the -67th base in SEQ ID NO: 13; in particular, the promoter nucleotide sequence of the point mutation rhtA gene is shown in SEQ ID NO: 14.
Кроме того, способ конструирования включает следующие этапы:In addition, the construction method includes the following steps:
(1) модификация промоторной области гена rhtA дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 13 для обеспечения возможности возникновения мутации в -67-м основании области, для получения нуклеотидной последовательности мутированной промоторной области;(1) modifying the promoter region of the wild type rhtA gene shown in SEQ ID NO: 13 to allow mutation to occur at the -67th base of the region to obtain the nucleotide sequence of the mutated promoter region;
(2) лигирование нуклеотидной последовательности мутированной промоторной области с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и(2) ligating the nucleotide sequence of the mutated promoter region with the plasmid to construct a recombinant vector; And
(3) введение рекомбинантного вектора в штамм-хозяин для получения рекомбинантного штамма, содержащего мутированную промоторную область.(3) introducing the recombinant vector into the host strain to obtain a recombinant strain containing the mutated promoter region.
Согласно настоящему изобретению на этапе (1) способ мутации основания включает мутагенез, ПЦР сайт-направленный мутагенез или гомологичную рекомбинацию, и предпочтительно ПЦР сайт-направленный мутагенез.According to the present invention, in step (1), the base mutation method includes mutagenesis, PCR site-directed mutagenesis or homologous recombination, and preferably PCR site-directed mutagenesis.
Согласно настоящему изобретению этап (1) включает:According to the present invention, step (1) includes:
синтез двух пар праймеров для амплификации фрагментов промоторной области гена rhtA в соответствии с последовательностью промотора гена rhtA дикого типа в GenBank и замена промоторной области гена rhtA в штамме-хозяине аллелями.synthesizing two pairs of primers to amplify fragments of the rhtA gene promoter region according to the wild-type rhtA gene promoter sequence in GenBank and replacing the rhtA gene promoter region in the host strain with alleles.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения праймеры представляют собой:In one embodiment of the present invention, the primers are:
П1: 5' CGGGATCCTCGCTGGTGTCGTGTTTGTAGG 3' (подчеркнутая часть обозначает сайт разрезания эндонуклеазой рестрикции BamH I) (SEQ ID NO: 17);P1: 5' CG GGATCC TCGCTGGTGTCGTGTTTGTAGG 3' (underlined portion indicates BamH I restriction endonuclease cleavage site) (SEQ ID NO: 17);
Π2: 5' ΤATACCСAATGCTGGTCGAG 3' (SEQ ID NO: 18);Π2: 5' ΤATACCCAATGCTGGTCGAG 3' (SEQ ID NO: 18);
ПЗ: 5' CGACCAGCATTGGGTATATC 3' (SEQ ID NO: 19); иPZ: 5' CGACCAGCATTGGGTATATC 3' (SEQ ID NO: 19); And
П4: 5' AAGGAAAAAAGCGGCCGCCGAAAATTAACGCTGCAATCAAC 3' (подчеркнутая часть обозначает сайт разрезания эндонуклеазой рестрикции Not I) (SEQ ID NO: 20).P4: 5' AAGGAAAAAA GCGGCCG CCGAAAATTAACGCTGCAATCAAC 3' (underlined portion indicates Not I restriction endonuclease cleavage site) (SEQ ID NO: 20).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения этап (1) включает: применение праймеров П1/П2 и П3/П4 для ПЦР-амплификации путем применения Е. coli K12 в качестве матрицы для получения двух выделенных фрагментов ДНК, составляющих в длину 690 п. н. и 640 п. н. и содержащих промоторные области гена rhtA, в частности фрагменты PrthA(А(-67)G)-Up и PrthA(A(-67)G)-Down; и затем выполнение ПЦР с перекрывающимися прайм ерами путем применения П1 и П4 в качестве праймеров и двух фрагментов ДНК в качестве матрицы для получения фрагмента PrthA(А(-67)G)-Up-Down, где ПЦР с перекрывающимися праймерами выполняют следующим образом: денатурирование при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 60 с (всего 30 циклов).In one embodiment of the present invention, step (1) includes: using primers P1/P2 and P3/P4 for PCR amplification by using E. coli K12 as a template to obtain two isolated DNA fragments of 690 bp in length. and 640 bp and containing promoter regions of the rhtA gene, in particular fragments PrthA (A(-67)G) -Up and PrthA (A(-67)G) -Down; and then performing PCR with overlapping primers by using P1 and P4 as primers and two DNA fragments as template to obtain PrthA fragment (A(-67)G) -Up-Down, where PCR with overlapping primers is performed as follows: denaturation at 94°C for 30 s, annealing at 52°C for 30 s and elongation at 72°C for 60 s (30 cycles in total).
Согласно настоящему изобретению этап (2) включает: отделение и очистку фрагмента PrthA(А(-67)G)- Up-Down с помощью электрофореза в агарозном геле, затем двойное расщепление очищенного фрагмента с помощью ΒamH I/INot I и лигирование дважды расщепленной плазмиды с помощью EcoR I/Sph I для получения аллель-замещенного рекомбинантного вектора.According to the present invention, step (2) includes: separation and purification of the PrthA fragment (A(-67)G) - Up-Down by agarose gel electrophoresis, then double digestion of the purified fragment with BamH I/INot I and ligation of the double digested plasmid using EcoR I/Sph I to obtain an allele-replaced recombinant vector.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения трансформация на этапе (3) представляет собой процесс электротрансформации.In one embodiment of the present invention, the transformation in step (3) is an electrical transformation process.
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный штамм, полученный указанным выше способом конструирования.The present invention also provides a recombinant strain obtained by the above construction method.
Согласно настоящему изобретению предложено применение указанного выше рекомбинантного штамма для получения L-треонина.According to the present invention, the use of the above recombinant strain for the production of L-threonine is proposed.
Применение рекомбинантного штамма для получения L-треонина включает ферментацию рекомбинантного штамма для получения L-треонина.Use of the recombinant strain to produce L-threonine involves fermenting the recombinant strain to produce L-threonine.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Указанные выше и другие признаки и преимущества настоящего изобретения объяснены и проиллюстрированы более подробно в следующем описании примеров настоящего изобретения. Следует понимать, что следующие примеры предназначены для иллюстрации технических решений настоящего изобретения и никоим образом не предназначены для ограничения объема правовой охраны настоящего изобретения, определенного в формуле изобретения и ее эквивалентах.The above and other features and advantages of the present invention are explained and illustrated in more detail in the following description of examples of the present invention. It should be understood that the following examples are intended to illustrate the technical solutions of the present invention and are in no way intended to limit the scope of legal protection of the present invention as defined in the claims and their equivalents.
Если не указано иное, материалы и реагенты согласно настоящему описанию либо коммерчески доступны, либо могут быть приготовлены специалистом в данной области техники в свете предшествующего уровня техники.Unless otherwise indicated, the materials and reagents described herein are either commercially available or can be prepared by one skilled in the art in light of the prior art.
Пример 1Example 1
(1) Конструирование плазмиды pKOV- deoB(G1049A) с кодирующей областью гена deoB, содержащей сайт-направленную мутацию (G1049А) (эквивалентно тому, что цистеин замещен тирозином в 350-м положении (C350Y) в кодирующей белок аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, замещенная аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID NO: 4)(1) Construction of plasmid pKOV-deoB (G1049A) with the coding region of the deoB gene containing a site-directed mutation (G1049A) (equivalent to cysteine being replaced by tyrosine at position 350 (C350Y) in the protein-coding amino acid sequence SEQ ID NO: 3, the substituted amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4)
Пентозофосфат мутазу кодировали геном deoB, и в штамме Е. coli K12 и его производном штамме (например, MG1655), последовательность ORF гена deoB дикого типа представлена в последовательности 3902352-3903575 в GenBank под идентификационным номером СР032667.1. Две пары праймеров для амплификации deoB разработали и синтезировали в соответствии с последовательностью, и сконструировали вектор для осуществления замены основания G на основание А в 1049-м положении в кодирующей области гена deoB последовательности (в SEQ ID NO: 1) исходного штамма (для получения мутированной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2). Праймеры (синтезированные Шанхайской корпорацией Invitrogen) сконструировали следующим образом:Pentose phosphate mutase is encoded by the deoB gene, and in E. coli strain K12 and its derivative strain (eg, MG1655), the ORF sequence of the wild-type deoB gene is represented by sequence 3902352-3903575 in GenBank under accession number CP032667.1. Two pairs of deoB amplification primers were designed and synthesized according to the sequence, and a vector was constructed to effect the substitution of a G base with an A base at position 1049 in the coding region of the deoB gene sequence (in SEQ ID NO: 1) of the original strain (to produce a mutated nucleotide sequence SEQ ID NO: 2). The primers (synthesized by Shanghai Invitrogen Corporation) were designed as follows:
П1: 5' CGGGATCCATGGACGGCAACGCTGAAG 3' (подчеркнутая часть обозначает сайт разрезания эндонуклеазой рестрикции ВаmН I) (SEQ ID NO: 5);P1: 5' CGG GATCC ATGGACGGCAACGCTGAAG 3' (the underlined part indicates the site of restriction endonuclease BamH I) (SEQ ID NO: 5);
П2: 5' GATCGTAACCGTGGTCAG 3' (SEQ ID NO: 6);P2: 5' GATCGTAACCGTGGTCAG 3' (SEQ ID NO: 6);
ПЗ: 5' CTGACCACGGTTACGАТС 3' (SEQ ID NO: 7); иPZ: 5' CTGACCACGGTTACGATC 3' (SEQ ID NO: 7); And
П4: 5' AAGGAAAAAAGCGGCCGCGCTCGTGAGTGCGGATGT 3' (подчеркнутая часть обозначает сайт разрезания эндонуклеазой рестрикции Not I) (SEQ ID NO: 8).P4: 5' AAGGAAAAAA GCGGCCGC GCTCGTGAGTGCGGATGT 3' (underlined portion indicates Not I restriction endonuclease cleavage site) (SEQ ID NO: 8).
Способ конструирования был следующим: применение праймеров П1/П2 и ПЗ/П4 для ПЦР-амплификации путем применения гена Е. coli K12 дикого типа в качества матрицы для получения двух фрагментов ДНК, составляющих в длину 836 п. н. и 890 п.н. и содержащих точечную мутацию (фрагменты deoB(G1049)A)-Up и deoB(Gl049A)-Down). ПЦР система: 10-кратный буффер Ex Taq 5 мкл, dNTP (дезоксинуклеозидтрифосфаты) смесь (2.5 мМ каждого) 4 мкл, MgCh (25 мМ) 4 мкл, праймеры (10 пМ) 2 мкл каждого, образец 1 мкл, Ех Taq (5 Ед/мкл) 0.25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: предварительная денатурация при 94°С в течение 5 минут, (денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 90 с, всего 30 циклов), и финальная элонгация при 72°С в течение 10 минут. Два фрагмента ДНК разделили и очистили электрофорезом в агарозном геле, а затем два очищенных фрагмента ДНК использовали в качестве образцов, и П1 и П4 применяли в качестве праймеров для выполнения ПЦР с перекрывающимися последовательностями для получения фрагмента (deoB(G1049A)-Up-Down), составляющего в длину около 1726 п. н. ПЦР с перекрывающимися последовательностями: 10-кратный буффер Ex Taq 5 мкл, dNTP смесь (2.5 мМ каждого) 4 мкл, MgCh (25 мМ) 4 мкл, праймеры (10 пм) 2 мкл каждого, образец 1 мкл, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0.25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: предварительная денатурация при 94°С в течение 5 минут, (денатурация при 94°С в течение 30 секунд, отжиг при 52°С в течение 30 секунд и элонгация при 72°С в течение 90 секунд, всего 30 циклов), и финальная элонгация при 72°С в течение 10 минут. Фрагмент deoB(G1049A)-Up-Down разделили и очистили электрофорезом в агарозном геле, затем очищенный фрагмент и плазмиду pKOV (приобретенную у Addgene) дважды обработали с помощью ΒamH I/Not I, и обработанные фрагмент deoB(G1049A)-Up-Down и плазмиду pKOV разделили и очистили электрофорезом в агарозном геле с последующим лигированием для получения вектора pKOY- deoB(G1049A). Вектор pKOV- deoB(G1049A отправили в компанию по секвенированию для секвенирования и идентификации, и результат представлен в SEQ ID NO: 11. Вектор pKOV- deoB(G1049A) с правильной точечной мутацией (deoB(G1049A)) сохранили для последующего применения.The construction method was as follows: use of primers P1/P2 and PZ/P4 for PCR amplification by using the wild-type E. coli K12 gene as a template to obtain two DNA fragments of 836 bp in length. and 890 bp and containing a point mutation (fragments deoB (G1049)A) -Up and deoB (Gl049A) -Down). PCR system: 10x buffer Ex Taq 5 µl, dNTP (deoxynucleoside triphosphates) mixture (2.5 mM each) 4 µl, MgCh (25 mM) 4 µl, primers (10 pM) 2 µl each, sample 1 µl, Ex Taq (5 U/μl) 0.25 μl, total volume 50 μl, where PCR amplification was carried out as follows: preliminary denaturation at 94°C for 5 minutes, (denaturation at 94°C for 30 s, annealing at 52°C for 30 s and elongation at 72°C for 90 s, a total of 30 cycles), and final elongation at 72°C for 10 minutes. The two DNA fragments were separated and purified by agarose gel electrophoresis, and then the two purified DNA fragments were used as samples, and P1 and P4 were used as primers to perform PCR with overlapping sequences to obtain the fragment (deoB (G1049A) -Up-Down), being about 1726 bp in length. PCR with overlapping sequences: 10x Ex Taq buffer 5 µl, dNTP mixture (2.5 mM each) 4 µl, MgCh (25 mM) 4 µl, primers (10 pm) 2 µl each, sample 1 µl, Ex Taq (5 U /µl) 0.25 µl, total volume 50 µl, where PCR amplification was carried out as follows: preliminary denaturation at 94°C for 5 minutes, (denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 52°C for 30 seconds and elongation at 72°C for 90 seconds, a total of 30 cycles), and a final elongation at 72°C for 10 minutes. The deoB (G1049A) -Up-Down fragment was separated and purified by agarose gel electrophoresis, then the purified fragment and plasmid pKOV (purchased from Addgene) were treated twice with ΒamH I/Not I, and the treated deoB (G1049A) -Up-Down fragment and the pKOV plasmid was separated and purified by agarose gel electrophoresis followed by ligation to obtain the pKOY-deoB (G1049A) vector. The pKOV-deoB (G1049A ) vector was sent to a sequencing company for sequencing and identification and the result is shown in SEQ ID NO: 11. The pKOV-deoB (G1049A) vector with the correct point mutation (deoB (G1049A) ) was saved for later use.
(2) Конструирование модифицированного штамма с геном deoB(G1049A) содержащим точечную мутацию(2) Construction of a modified strain with the deoB gene (G1049A) containing a point mutation
Ген deoB дикого типа был сохранен в хромосомах Escherichia coli дикого типа штамма Е. coli K12 (W3110) и штамма Е. coli CGMCC 7.232, продуцирующего L-треонин с высоким выходом (хранится в Общем центре сбора микробиологических культур Китая (CGMCC)). Сконструированную плазмиду pKOV- deoB(G1049A) перенесли в Е. coli K12 (W3110) и Ε. coli CGMCC 7.232 соответственно, и путем замены аллеля основание G заменили на основание А в 1049-м участке последовательности гена deoB в хромосомах двух штаммов, как представлено в SEQ ID NO: 1.The wild-type deoB gene was conserved in the chromosomes of wild-type Escherichia coli strain E. coli K12 (W3110) and E. coli strain CGMCC 7.232, which produces L-threonine in high yield (stored at the China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC)). The constructed plasmid pKOV-deoB (G1049A) was transferred into E. coli K12 (W3110) and E. coli CGMCC 7.232, respectively, and by allelic substitution, the base G was replaced by base A in the 1049th region of the deoB gene sequence in the chromosomes of the two strains, as shown in SEQ ID NO: 1.
Указанный способ заключался в следующем: трансформация плазмиды pKOV- deoB(G1049A) в компетентные клетки бактерии-хозяина путем процесса электротрансформации и добавление данных клеток в 0,5 мл жидкой питательной среды SOC; перемешивание смеси в шейкере при температуре 30°С и 100 об/мин в течение 2 ч.; покрытие твердой питательной среды LB с содержанием хлорамфеникола 34 мг/мл питательным раствором в количестве 100 мкл и культивирование при 30°С в течение 18 ч; отбор выращенных моноклональных колоний, инокуляция колоний в 10 мл жидкой питательной среды LB и культивирование при 37°С и 200 об/мин в течение 8 ч; покрытие твердой питательной среды LB с содержанием хлорамфеникола 34 мг/мл питательным раствором в количестве 100 мкл и культивирование при 42°С в течение 12 ч; отбор 1-5 одиночных колоний, инокуляция колоний в 1 мл жидкой среды LB и культивирование при 37°С и 200 об/мин в течение 4 ч; покрытие твердой питательной среды LB, содержащей 10% сахарозы, питательным раствором в количестве 100 мкл и культивирование при 30°С в течение 24 часов; отбор моноклональных колоний и нанесение колоний на твердую питательную среду LB с содержанием хлорамфеникола 34 мг/мл и твердую питательную среду LB в соотношении один к одному; и отбор штаммов, которые выросли на твердой питательной среде LB и не смогли вырасти на твердой питательной среде L B с содержанием хлорамфеникола 34 мг/мл, для идентификации методом ПЦР-амплификации. Праймеры (синтезированные Шанхайской корпорацией Invitrogen) для применения в ПЦР-амплификации были следующими:This method consisted of the following: transformation of the plasmid pKOV-deoB (G1049A) into competent cells of the host bacterium through the process of electrotransformation and adding these cells to 0.5 ml of liquid nutrient medium SOC; stirring the mixture in a shaker at a temperature of 30°C and 100 rpm for 2 hours; coating solid LB nutrient medium containing chloramphenicol 34 mg/ml with nutrient solution in an amount of 100 μl and culturing at 30°C for 18 hours; selection of grown monoclonal colonies, inoculation of colonies in 10 ml of LB liquid nutrient medium and cultivation at 37°C and 200 rpm for 8 hours; coating solid LB nutrient medium containing chloramphenicol 34 mg/ml with nutrient solution in an amount of 100 μl and culturing at 42°C for 12 hours; selection of 1-5 single colonies, inoculation of colonies in 1 ml of liquid LB medium and cultivation at 37°C and 200 rpm for 4 hours; covering solid LB nutrient medium containing 10% sucrose with nutrient solution in an amount of 100 μl and culturing at 30°C for 24 hours; selecting monoclonal colonies and applying the colonies to LB solid nutrient medium containing 34 mg/ml chloramphenicol and LB solid nutrient medium in a one to one ratio; and selecting strains that grew on solid LB medium and failed to grow on solid LB medium containing 34 mg/ml chloramphenicol for identification by PCR amplification. The primers (synthesized by Shanghai Invitrogen Corporation) for use in PCR amplification were as follows:
П5: 5' TGACGCCАССАТСAAAGAGА 3' (SEQ ID NO: 9); иP5: 5' TGACGCCASSATCAAAGAGA 3' (SEQ ID NO: 9); And
П6: 5' GTCAACGCTCCGCCCAAAT 3' (SEQ ID NO: 10).P6: 5' GTCAACGCTCCGCCCAAAT 3' (SEQ ID NO: 10).
SSCP (одноцепочечный конформационный полиморфизм) анализ с помощью электрофореза проводили на ПЦР-амплифицированном продукте; амплифицированный фрагмент плазмиды pKOV- deoB(G1049A) использовали в качестве положительного контроля, амплифицированный фрагмент Escherichia coli дикого типа использовали в качестве отрицательного контроля, и воду использовали в качестве пустого контроля. В SSCP анализе методом электрофореза одноцепочечные олигонуклеотидные цепи, имеющие одинаковую длину, но различное расположение последовательностей, образовывали разные пространственные структуры в ледяной ванне, а также обладали разной подвижностью во время электрофореза. Следовательно, положение фрагмента при электрофорезе не соответствовало положению отрицательного контроля, и штамм, положение фрагмента которого при электрофорезе соответствовало положению положительного контроля, является штаммом с успешно замененным аллелем. ПЦР-амплификацию проводили на фрагменте-мишени, использовав штамм с успешно замененным аллелем в качестве образца и праймеры П5 и П6, и затем фрагмент-мишень лигировали с вектором pMD19-T для секвенирования. Путем сравнения последовательностей результатов секвенирования, результат секвенирования показан в SEQ ID NO: 12, рекон, образованный путем замены основания G на основание А в 1049-м положении последовательности кодирующей области гена deoB, позволяет судить об успешной модификации штамма. Рекон, полученный из Е. coli K12 (W3110), был назван YPThr09, а рекон, полученный из Е. coli CGMCC 7.232, был назван YPThr10.SSCP (single-strand conformational polymorphism) analysis by electrophoresis was performed on the PCR-amplified product; an amplified fragment of plasmid pKOV-deoB (G1049A) was used as a positive control, an amplified fragment of wild-type Escherichia coli was used as a negative control, and water was used as a blank control. In SSCP electrophoresis analysis, single-stranded oligonucleotide chains having the same length but different sequence arrangements formed different spatial structures in the ice bath and also had different mobilities during electrophoresis. Therefore, the position of the fragment during electrophoresis did not correspond to the position of the negative control, and the strain whose fragment position during electrophoresis corresponded to the position of the positive control is the strain with a successfully replaced allele. PCR amplification was performed on the target fragment using the successfully substituted allele strain as a sample and primers P5 and P6, and then the target fragment was ligated into the pMD19-T vector for sequencing. By comparing the sequences of the sequencing results, the sequencing result shown in SEQ ID NO: 12, the recon formed by replacing the G base with an A base at the 1049th position of the coding region sequence of the deoB gene, allows us to judge the successful modification of the strain. The recon derived from E. coli K12 (W3110) was named YPThr09, and the recon derived from E. coli CGMCC 7.232 was named YPThr10.
(3) Эксперимент по ферментации треонина(3) Threonine fermentation experiment
Штамм Е. coli K12 (W3110), штамм Е. coli CGMCC 7.232 и мутантные штаммы YPThr09 и YPThr10 инокулировали в 25 мл жидкой питательной среды, описанной в таблице 1 соответственно, и культивировали при 37°С и 200 об/мин в течение 12 ч. Затем 1 мл полученной культуры каждого штамма инокулировали в 25 мл жидкой питательной среды, описанной в таблице 1, и подвергали культуру ферментации при 37°С и 200 об/мин в течение 36 ч. Содержание L-треонина определяли методом ВЭЖХ, отбирали три копии каждого штамма, рассчитывали среднее значение, результаты приведены в таблице 2.E. coli strain K12 (W3110), E. coli strain CGMCC 7.232 and mutant strains YPThr09 and YPThr10 were inoculated into 25 ml of liquid nutrient medium described in Table 1, respectively, and cultured at 37°C and 200 rpm for 12 h Then 1 ml of the resulting culture of each strain was inoculated into 25 ml of the liquid nutrient medium described in Table 1, and the culture was subjected to fermentation at 37°C and 200 rpm for 36 hours. The L-threonine content was determined by HPLC, triplicates were selected of each strain, the average value was calculated, the results are shown in Table 2.
Как видно из результатов таблицы 2, замена цистеина в 350-м положении аминокислотной последовательности гена deoB на тирозин способствует улучшению выхода L-треонина для исходного штамма, продуцирующего L-треонин как с высоким, так и с низким выходом.As can be seen from the results of Table 2, replacing cysteine at the 350th position of the amino acid sequence of the deoB gene with tyrosine improves the yield of L-threonine for the original strain producing L-threonine with both high and low yield.
Пример 2Example 2
(1) Конструирование трансформационного вектора pKOY-PrhtA(A(-67)G) с промотором гена rhtA, содержащим сайт-направленную мутацию(1) Construction of the transformation vector pKOY-PrhtA (A(-67)G) with the rhtA gene promoter containing a site-directed mutation
Экспортеры гомосерина и треонина (ферменты RHTA) кодировали генами rhtA, и в штамме Е. coli K12 и его производном штамме (например, W3110) последовательность промотора гена rhtA дикого типа PrhtA представлена в последовательности 850520-850871 в GenBank под идентификационным номером АР009048.1. Согласно указанной последовательности разработали и синтезировали две пары праймеров для амплификации промотора FrhtA, и сконструировали вектор для осуществления замены основания А на основание G в -67-м положении выше по нуклеотидной последовательности (SEQ ID NO: 13) промотора PrhtA исходного штамма (для получения нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 14).Homoserine and threonine exporters (RHTA enzymes) are encoded by the rhtA genes, and in E. coli strain K12 and its derivative strain (e.g., W3110), the wild-type rhtA gene promoter sequence PrhtA is listed as sequence 850520-850871 in GenBank under accession number AP009048.1. According to the specified sequence, two pairs of primers were designed and synthesized for amplification of the FrhtA promoter, and a vector was constructed to replace base A with base G at the -67th position upstream of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 13) of the PrhtA promoter of the original strain (to obtain the nucleotide sequence SEQ ID NO: 14).
Праймеры (синтезированные Шанхайской корпорацией hwitrogen) разработали следующим образом:The primers (synthesized by Shanghai hwitrogen Corporation) were designed as follows:
П1: 5' CGGGATCCTCGCTGGTGTCGTGTTTGTAGG 3' (подчеркнутая часть обозначает сайт разрезания эндонуклеазой рестрикции ВаmН I) (SEQ ID NO: 17);P1: 5' CG GGATC CTCGCTGGTGTCGTGTTTGTAGG 3' (the underlined part indicates the site of restriction endonuclease BamH I cutting) (SEQ ID NO: 17);
П2: 5' ΤATАСССAATGCTGGTCGAG 3' (SEQ ID NO: 18);P2: 5' ΤATACCAATGCTGGTCGAG 3' (SEQ ID NO: 18);
П.3: 5' CGACCAGCATTGGGTATATC 3' (SEQ ID NO: 19); иItem 3: 5' CGACCAGCATTGGGTATATC 3' (SEQ ID NO: 19); And
П4: 5' AAGGAAAAAAGCGGCCGCCGAAAATTAACGCTGCAATCAAC 3' (подчеркнутая часть обозначает сайт разрезания эндонуклеазой рестрикции Not I) (SEQ ID NO: 20).P4: 5' AAGGAAAAAA GCGGCCGC CGAAAATTAACGCTGCAATCAAC 3' (underlined portion indicates Not I restriction endonuclease cleavage site) (SEQ ID NO: 20).
Способ конструирования был следующим: применение праймеров П1/П2 и П3/П4 для ПЦР-амплификации путем применения гена Е. coli K12 дикого типа в качества матрицы для получения двух фрагментов ДНК, составляющих в длину 690 п. н. и 640 п. н. и содержащих точечную мутацию (фрагменты PrhtA(A(-67)G-Up и PrhtA(A(-67)G)-Dowm). ПЦР система: 10-кратный буффер Ex Taq 5 мкл, dNTP смесь (2,5 мМ каждого) 4 мкл, Mg2+ (25 мМ) 4 мкл, праймеры (10 пМ) 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: предварительная денатурация при 94°С в течение 5 минут (денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 30 с, всего 30 циклов) и финальная элонгация при 72°С в течение 10 мин.The construction method was as follows: using primers P1/P2 and P3/P4 for PCR amplification by using the wild-type E. coli K12 gene as a template to obtain two DNA fragments of 690 bp in length. and 640 bp and containing a point mutation (fragments PrhtA (A(-67)G -Up and PrhtA (A(-67)G) -Dowm). PCR system: 10x Ex Taq buffer 5 µl, dNTP mixture (2.5 mM each ) 4 µl, Mg 2+ (25 mM) 4 µl, primers (10 pM) 2 µl each, Ex Taq (5 U/µl) 0.25 µl, total volume 50 µl, where PCR amplification was carried out as follows: preliminary denaturation at 94°C for 5 minutes (denaturation at 94°C for 30 s, annealing at 52°C for 30 s and elongation at 72°C for 30 s, a total of 30 cycles) and final elongation at 72° C for 10 min.
Два фрагмента ДНК разделили и очистили электрофорезом в агарозном геле, а затем два очищенных фрагмента ДНК использовали в качестве образцов, и П1 и П4 использовали в качестве праймеров для выполнения ПЦР с перекрывающимися последовательностями для получения фрагмента (PrhtA(A(-67)G)-Up-Down), составляющего в длину около 1310 п. н.The two DNA fragments were separated and purified by agarose gel electrophoresis, and then the two purified DNA fragments were used as samples, and P1 and P4 were used as primers to perform PCR with overlapping sequences to obtain the fragment (PrhtA (A(-67)G) - Up-Down), which is about 1310 bp in length.
ПЦР система: 10-кратный буффер Ex Taq 5 мкл, dNTP смесь (2,5 мМ каждого) 4 мкл, Mg2+(25 мМ) 4 мкл, праймеры (10 пМ) 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0.25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР с перекрывающимися последовательностями проводили следующим образом: денатурирование при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 60 с (всего 30 циклов).PCR system: 10x Ex Taq buffer 5 µl, dNTP mixture (2.5 mM each) 4 µl, Mg2+ (25 mM) 4 µl, primers (10 pM) 2 µl each, Ex Taq (5 U/µl) 0.25 µl, total volume 50 µl, where PCR with overlapping sequences was carried out as follows: denaturation at 94°C for 30 s, annealing at 52°C for 30 s and elongation at 72°C for 60 s (total 30 cycles) .
Фрагмент PrhtA(A(-67)G)-Up-Down разделили и очистили электрофорезом в агарозном геле, затем очищенный фрагмент и плазмиду pKOV (приобретенную у Addgene) дважды обработали с помощью ВаmН I/Not I, и обработанные фрагмент deoB(G1049A)-Up-Down и плазмиду pKOV разделили и очистили электрофорезом в агарозном геле с последующим лигированием для получения вектора pKOV- PrhtA(A(-67)G). Вектор pKOV- PrhtA(A(-67)G) отправили в компанию по секвенированию для секвенирования и идентификации, и вектор pKOV- PrhtA(A(-67)G) с правильной точечной мутацией (PrhtA(A(-67)G)) сохранили для последующего применения.The PrhtA (A(-67)G) -Up-Down fragment was separated and purified by agarose gel electrophoresis, then the purified fragment and plasmid pKOV (purchased from Addgene) were treated twice with BamH I/Not I, and the treated fragment deoB(G1049A) -Up-Down and pKOV plasmid were separated and purified by agarose gel electrophoresis followed by ligation to obtain vector pKOV-PrhtA (A(-67)G). The pKOV-PrhtA (A(-67)G) vector was sent to a sequencing company for sequencing and identification, and the pKOV-PrhtA (A(-67)G ) vector with the correct point mutation (PrhtA (A(-67)G) ) saved for later use.
(2) Конструирование модифицированного штамма с геном PrhtA(A(-67)G содержащим точечную мутацию(2) Construction of a modified strain with the PrhtA gene (A(-67)G containing a point mutation
Ген PrhtA дикого типа был сохранен в хромосомах Escherichia coli дикого типа штамма Е. coli K12 (W3110) и штамма Е. coli CGMCC 7.232, продуцирующего L-треонин с высоким выходом (хранится в Общем центре сбора микробиологических культур Китая). Сконструированную плазмиду pKOY- PrhtA(A(-67)G) перенесли вЕ. coli K12 (W3110) и Ε. coli CGMCC 7.232 соответственно, и путем замены аллеля основание А заменили на основание G в -67-м участке выше по нуклеотидной последовательностям промоторов YrhtA в хромосомах двух штаммов.The wild-type PrhtA gene was conserved in the chromosomes of wild-type Escherichia coli strain E. coli K12 (W3110) and E. coli strain CGMCC 7.232, which produces L-threonine in high yield (stored in the General Microbiological Culture Collection Center of China). The constructed plasmid pKOY-PrhtA (A(-67)G) was transferred into E. coli K12 (W3110) and E. coli CGMCC 7.232, respectively, and by replacing the allele, base A was replaced by base G in the -67th region upstream of the nucleotide sequence of the YrhtA promoters in the chromosomes of the two strains.
Указанный способ заключался в следующем: трансформация плазмиды pKOY- PrhtA(A(-67)G) в компетентные клетки бактерии-хозяина путем процесса электротрансформации, и добавление данных клеток в 0,5 мл жидкой питательной среды SOC; перемешивание смеси в шейкере при температуре 30°С и 100 об/мин в течение 2 ч.; покрытие твердой питательной среды LB с содержанием хлорамфеникола 34 мг/мл питательным раствором в количестве 100 мкл и культивирование при 30°С в течение 18 ч; отбор выращенных моноклональных колоний, инокуляция колоний в 10 мл жидкой питательной среды LB и культивирование при 37°С и 200 об/мин в течение 8 ч; покрытие твердой питательной среды LB с содержанием хлорамфеникола 34 мг/мл питательным раствором в количестве 100 мкл и культивирование при 42°С в течение 12 ч; отбор 1-5 одиночных колоний, инокуляция колоний в 1 мл жидкой среды LB и культивирование при 37°С и 200 об/мин в течение 4 ч; покрытие твердой питательной среды LB, содержащей 10% сахарозы, питательным раствором в количестве 100 мкл и культивирование при 30°С в течение 24 часов; отбор моноклональных колоний и нанесение колоний на твердую питательную среду LB с содержанием хлорамфеникола 34 мг/мл и твердую культуральную среду LB в соотношении один к одному; и отбор штаммов, которые выросли на твердой питательной среде LB и не смогли вырасти на твердой питательной среде LB с содержанием хлорамфеникола 34 мг/мл, для идентификации методом ПЦР-амплификации. Праймеры (синтезированные Шанхайской корпорацией mvitrogen) для применения в ПЦР-амплификации были следующими:This method consisted of the following: transformation of the plasmid pKOY-PrhtA (A(-67)G) into competent cells of the host bacterium through the process of electrotransformation, and adding these cells to 0.5 ml of liquid nutrient medium SOC; stirring the mixture in a shaker at a temperature of 30°C and 100 rpm for 2 hours; coating solid LB nutrient medium containing chloramphenicol 34 mg/ml with nutrient solution in an amount of 100 μl and culturing at 30°C for 18 hours; selection of grown monoclonal colonies, inoculation of colonies in 10 ml of LB liquid nutrient medium and cultivation at 37°C and 200 rpm for 8 hours; coating solid LB nutrient medium containing chloramphenicol 34 mg/ml with nutrient solution in an amount of 100 μl and culturing at 42°C for 12 hours; selection of 1-5 single colonies, inoculation of colonies in 1 ml of liquid LB medium and cultivation at 37°C and 200 rpm for 4 hours; covering solid LB nutrient medium containing 10% sucrose with nutrient solution in an amount of 100 μl and culturing at 30°C for 24 hours; selecting monoclonal colonies and applying the colonies to LB solid culture medium containing 34 mg/ml chloramphenicol and LB solid culture medium in a one to one ratio; and selecting strains that grew on solid LB medium and failed to grow on solid LB medium containing 34 mg/ml chloramphenicol for identification by PCR amplification. The primers (synthesized by Shanghai mvitrogen Corporation) for use in PCR amplification were as follows:
П5: 5' ATACАССGCTАТССATCT 3' (SEQ ID NO: 21); и P5: 5' ATACACGCCTATCCATCT 3' (SEQ ID NO: 21); And
П6: 5' AACCAGGCATCCTTTCTC 3' (SEQ ID NO: 22).P6: 5' AACCAGGCATCCTTTCTC 3' (SEQ ID NO: 22).
ПЦР система: 10-кратный буффер Ex Taq 5 мкл, dNTP смесь (2,5 мМ каждого) 4 мкл, Mg2+ (25 мМ) 4 мкл, праймеры (10 пМ) 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, общий объем 50 мкл, где ПЦР-амплификацию проводили следующим образом: предварительная денатурация при 94°С в течение 5 минут (денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг при 52°С в течение 30 с и элонгация при 72°С в течение 30 с, всего 30 циклов) и финальная элонгация при 72°С в течение 10 мин. SSCP (одноцепочечный конформационный полиморфизм) анализ с помощью электрофореза проводили на ПЦР-амплифицированном продукте; амплифицированный фрагмент плазмиды pKOY-Prht(A(-67)G) использовали в качестве положительного контроля, амплифицированный фрагмент Escherichia coli дикого типа использовали в качестве отрицательного контроля, и воду использовали в качестве пустого контроля. В SSCP анализе методом электрофореза одноцепочечные олигонуклеотидные цепи, имеющие одинаковую длину, но различное расположение последовательностей, образовывали разные пространственные структуры в ледяной ванне, а также обладали разной подвижностью во время электрофореза. Следовательно, положение фрагмента при электрофорезе не соответствовало положению отрицательного контроля, и штамм, положение фрагмента которого при электрофорезе соответствовало положению положительного контроля, является штаммом с успешно замененным аллелем. ПЦР-амплификацию проводили на фрагменте-мишени, использовав штамм с успешно замененным аллелем в качестве образца и праймеры П5 и П6, и затем фрагмент-мишень лигировали с вектором pMD19-T для секвенирования. Путем сравнения последовательностей результатов секвенирования, рекон, образованный заменой основания А на основание G в -67-м положении выше по нуклеотидной последовательности промотора PrhtA, позволяет судить об успешной модификации штамма. Рекон, полученный из Е. coli K12 (W3110), был назван YPThr01, а рекон, полученный из Е. coli CGMCC 7.232, был назван YPThr02.PCR system: 10x Ex Taq buffer 5 µl, dNTP mixture (2.5 mM each) 4 µl, Mg 2+ (25 mM) 4 µl, primers (10 pM) 2 µl each, Ex Taq (5 U/µl ) 0.25 μl, total volume 50 μl, where PCR amplification was carried out as follows: pre-denaturation at 94°C for 5 minutes (denaturation at 94°C for 30 s, annealing at 52°C for 30 s and elongation at 72°C for 30 s, 30 cycles in total) and final elongation at 72°C for 10 min. SSCP (single-strand conformational polymorphism) analysis by electrophoresis was performed on the PCR-amplified product; an amplified fragment of plasmid pKOY-Prht (A(-67)G) was used as a positive control, an amplified fragment of wild-type Escherichia coli was used as a negative control, and water was used as a blank control. In SSCP electrophoresis analysis, single-stranded oligonucleotide chains having the same length but different sequence arrangements formed different spatial structures in the ice bath and also had different mobilities during electrophoresis. Therefore, the position of the fragment during electrophoresis did not correspond to the position of the negative control, and the strain whose fragment position during electrophoresis corresponded to the position of the positive control is the strain with a successfully replaced allele. PCR amplification was performed on the target fragment using the successfully substituted allele strain as a sample and primers P5 and P6, and then the target fragment was ligated into the pMD19-T vector for sequencing. By comparing the sequences of the sequencing results, the recon formed by replacing base A with base G at the -67th position upstream of the nucleotide sequence of the PrhtA promoter allows us to judge the successful modification of the strain. The recon derived from E. coli K12 (W3110) was named YPThr01, and the recon derived from E. coli CGMCC 7.232 was named YPThr02.
(3) Эксперимент по ферментации треонина(3) Threonine fermentation experiment
Штамм E. coli K12 (W3110), штамм Е. coli CGMCC 7.232 и мутантные штаммы YPThr01 и YPThr02 инокулировали в 25 мл жидкой питательной среды, описанной в таблице 1, и культивировали при 37°С и 200 об/мин в течение 12 ч. Затем 1 мл полученной культуры каждого штамма инокулировали в 25 мл жидкой питательной среды, описанной в таблице 1, и подвергали культуру ферментации при 37°С и 200 об/мин в течение 36 ч. Содержание L-треонина определяли методом ВЭЖХ, отбирали три копии каждого штамма, рассчитывали среднее значение, результаты приведены в таблице 2.E. coli strain K12 (W3110), E. coli strain CGMCC 7.232 and mutant strains YPThr01 and YPThr02 were inoculated into 25 ml of liquid nutrient medium described in Table 1 and cultured at 37°C and 200 rpm for 12 h. Then, 1 ml of the resulting culture of each strain was inoculated into 25 ml of the liquid nutrient medium described in Table 1, and the culture was subjected to fermentation at 37°C and 200 rpm for 36 hours. The L-threonine content was determined by HPLC, three copies of each were selected strain, the average value was calculated, the results are shown in Table 2.
Таблица 1 Состав питательной средыTable 1 Composition of the nutrient medium
Как видно из результатов таблицы 2, замена основания А в -67-м положении промоторной последовательности гена rhtA на основание G способствует улучшению выхода L-треонина для исходного штамма, продуцирующего L-треонин как с высоким, так и с низким выходом.As can be seen from the results of Table 2, replacing base A in the -67th position of the promoter sequence of the rhtA gene with base G improves the yield of L-threonine for the original strain producing L-threonine with both high and low yield.
Примеры настоящего изобретения были описаны выше. Однако настоящее изобретение не ограничивается приведенными выше примерами. Любые изменения, эквиваленты, улучшения и тому подобное, сделанные без отступления от сущности и принципа настоящего изобретения, подпадают под объем правовой охраны настоящего изобретения.Examples of the present invention have been described above. However, the present invention is not limited to the above examples. Any changes, equivalents, improvements, etc., made without departing from the essence and principle of the present invention, fall within the scope of legal protection of the present invention.
--->--->
Sequence listing Sequence listing
<110> Inner Mongolia Eppen Biotech Co., Ltd<110> Inner Mongolia Eppen Biotech Co., Ltd
<120> Рекомбинантный Штамм На Основе Escherichia Coli, Способ Его <120> Recombinant Strain Based on Escherichia Coli, Its Method
Конструирования И Его ПрименениеDesign And Its Application
<130> CPWO20110938<130>CPWO20110938
<160> 22<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1<210> 1
<211> 1224<211> 1224
<212> ДНК<212> DNA
<213> Escherichia coli<213> Escherichia coli
<400> 1<400> 1
atgaaacgtg catttattat ggtgctggac tcattcggca tcggcgctac agaagatgca atgaaacgtg catttattat ggtgctggac tcattcggca tcggcgctac agaagatgca
60 60
gaacgctttg gtgacgtcgg ggctgacacc ctgggtcata tcgcagaagc ttgtgccaaa gaacgctttg gtgacgtcgg ggctgacacc ctgggtcata tcgcagaagc ttgtgccaaa
120 120
ggcgaagctg ataacggtcg taaaggcccg ctcaatctgc caaatctgac ccgtctgggg ggcgaagctg ataacggtcg taaaggcccg ctcaatctgc caaatctgac ccgtctgggg
180 180
ctggcgaaag cacacgaagg ttctaccggt ttcattccgg cgggaatgga cggcaacgct ctggcgaaag cacacgaagg ttctaccggt ttcattccgg cgggaatgga cggcaacgct
240 240
gaagttatcg gcgcgtacgc atgggcgcac gaaatgtcat ccggtaaaga taccccgtct gaagttatcg gcgcgtacgc atgggcgcac gaaatgtcat ccggtaaaga taccccgtct
300 300
ggtcactggg aaattgccgg tgtcccggtt ctgtttgagt ggggatattt ctccgatcac ggtcactggg aaattgccgg tgtcccggtt ctgtttgagt ggggatattt ctccgatcac
360 360
gaaaacagct tcccgcaaga gctgctggat aaactggtcg aacgcgctaa tctgccgggt gaaaacagct tcccgcaaga gctgctggat aaactggtcg aacgcgctaa tctgccgggt
420 420
tacctcggta actgccactc ttccggtacg gtcattctgg atcaactggg cgaagagcac tacctcggta actgccactc ttccggtacg gtcattctgg atcaactggg cgaagagcac
480 480
atgaaaaccg gcaagccgat tttctatacc tccgctgact ccgtgttcca gattgcctgc atgaaaaccg gcaagccgat tttctatacc tccgctgact ccgtgttcca gattgcctgc
540 540
catgaagaaa ctttcggtct ggataaactc tacgaactgt gcgaaatcgc ccgtgaagag catgaagaaa ctttcggtct ggataaactc tacgaactgt gcgaaatcgc ccgtgaagag
600 600
ctgaccaacg gcggctacaa tatcggtcgt gttatcgctc gtccgtttat cggcgacaaa ctgaccaacg gcggctacaa tatcggtcgt gttatcgctc gtccgtttat cggcgacaaa
660 660
gccggtaact tccagcgtac cggtaaccgt cacgacctgg ctgttgagcc gccagcaccg gccggtaact tccagcgtac cggtaaccgt cacgacctgg ctgttgagcc gccagcaccg
720 720
accgtgctgc agaaactggt tgatgaaaaa cacggccagg tggtttctgt cggtaaaatt accgtgctgc agaaactggt tgatgaaaaa cacggccagg tggtttctgt cggtaaaatt
780 780
gcggacatct acgccaactg cggtatcacc aaaaaagtga aagcgactgg cctggacgcg gcggacatct acgccaactg cggtatcacc aaaaaagtga aagcgactgg cctggacgcg
840 840
ctgtttgacg ccaccatcaa agagatgaaa gaagcgggtg ataacaccat cgtcttcacc ctgtttgacg cccacatcaa agagatgaaa gaagcgggtg ataacaccat cgtcttcacc
900 900
aacttcgttg acttcgactc ttcctggggc caccgtcgcg acgtcgccgg ttatgccgcg aacttcgttg acttcgactc ttcctggggc caccgtcgcg acgtcgccgg ttatgccgcg
960 960
ggtctggaac tgttcgaccg ccgtctgccg gagctgatgt ctctgctgcg cgatgacgac ggtctggaac tgttcgaccg ccgtctgccg gagctgatgt ctctgctgcg cgatgacgac
1020 1020
atcctgatcc tcaccgctga ccacggttgc gatccgacct ggaccggtac tgaccacacg atcctgatcc tcaccgctga ccacggttgc gatccgacct ggaccggtac tgaccacacg
1080 1080
cgtgaacaca ttccggtact ggtatatggc ccgaaagtaa aaccgggctc actgggtcat cgtgaacaca ttccggtact ggtatatggc ccgaaagtaa aaccgggctc actgggtcat
1140 1140
cgtgaaacct tcgcggatat cggccagact ctggcaaaat attttggtac ttctgatatg cgtgaaacct tcgcggatat cggccagact ctggcaaaat attttggtac ttctgatatg
1200 1200
gaatatggca aagccatgtt ctga gaatatggca aagccatgtt ctga
1224 1224
<210> 2<210> 2
<211> 1224<211> 1224
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 2<400> 2
atgaaacgtg catttattat ggtgctggac tcattcggca tcggcgctac agaagatgca atgaaacgtg catttattat ggtgctggac tcattcggca tcggcgctac agaagatgca
60 60
gaacgctttg gtgacgtcgg ggctgacacc ctgggtcata tcgcagaagc ttgtgccaaa gaacgctttg gtgacgtcgg ggctgacacc ctgggtcata tcgcagaagc ttgtgccaaa
120 120
ggcgaagctg ataacggtcg taaaggcccg ctcaatctgc caaatctgac ccgtctgggg ggcgaagctg ataacggtcg taaaggcccg ctcaatctgc caaatctgac ccgtctgggg
180 180
ctggcgaaag cacacgaagg ttctaccggt ttcattccgg cgggaatgga cggcaacgct ctggcgaaag cacacgaagg ttctaccggt ttcattccgg cgggaatgga cggcaacgct
240 240
gaagttatcg gcgcgtacgc atgggcgcac gaaatgtcat ccggtaaaga taccccgtct gaagttatcg gcgcgtacgc atgggcgcac gaaatgtcat ccggtaaaga taccccgtct
300 300
ggtcactggg aaattgccgg tgtcccggtt ctgtttgagt ggggatattt ctccgatcac ggtcactggg aaattgccgg tgtcccggtt ctgtttgagt ggggatattt ctccgatcac
360 360
gaaaacagct tcccgcaaga gctgctggat aaactggtcg aacgcgctaa tctgccgggt gaaaacagct tcccgcaaga gctgctggat aaactggtcg aacgcgctaa tctgccgggt
420 420
tacctcggta actgccactc ttccggtacg gtcattctgg atcaactggg cgaagagcac tacctcggta actgccactc ttccggtacg gtcattctgg atcaactggg cgaagagcac
480 480
atgaaaaccg gcaagccgat tttctatacc tccgctgact ccgtgttcca gattgcctgc atgaaaaccg gcaagccgat tttctatacc tccgctgact ccgtgttcca gattgcctgc
540 540
catgaagaaa ctttcggtct ggataaactc tacgaactgt gcgaaatcgc ccgtgaagag catgaagaaa ctttcggtct ggataaactc tacgaactgt gcgaaatcgc ccgtgaagag
600 600
ctgaccaacg gcggctacaa tatcggtcgt gttatcgctc gtccgtttat cggcgacaaa ctgaccaacg gcggctacaa tatcggtcgt gttatcgctc gtccgtttat cggcgacaaa
660 660
gccggtaact tccagcgtac cggtaaccgt cacgacctgg ctgttgagcc gccagcaccg gccggtaact tccagcgtac cggtaaccgt cacgacctgg ctgttgagcc gccagcaccg
720 720
accgtgctgc agaaactggt tgatgaaaaa cacggccagg tggtttctgt cggtaaaatt accgtgctgc agaaactggt tgatgaaaaa cacggccagg tggtttctgt cggtaaaatt
780 780
gcggacatct acgccaactg cggtatcacc aaaaaagtga aagcgactgg cctggacgcg gcggacatct acgccaactg cggtatcacc aaaaaagtga aagcgactgg cctggacgcg
840 840
ctgtttgacg ccaccatcaa agagatgaaa gaagcgggtg ataacaccat cgtcttcacc ctgtttgacg cccacatcaa agagatgaaa gaagcgggtg ataacaccat cgtcttcacc
900 900
aacttcgttg acttcgactc ttcctggggc caccgtcgcg acgtcgccgg ttatgccgcg aacttcgttg acttcgactc ttcctggggc caccgtcgcg acgtcgccgg ttatgccgcg
960 960
ggtctggaac tgttcgaccg ccgtctgccg gagctgatgt ctctgctgcg cgatgacgac ggtctggaac tgttcgaccg ccgtctgccg gagctgatgt ctctgctgcg cgatgacgac
1020 1020
atcctgatcc tcaccgctga ccacggttac gatccgacct ggaccggtac tgaccacacg atcctgatcc tcaccgctga ccacggttac gatccgacct ggaccggtac tgaccacacg
1080 1080
cgtgaacaca ttccggtact ggtatatggc ccgaaagtaa aaccgggctc actgggtcat cgtgaacaca ttccggtact ggtatatggc ccgaaagtaa aaccgggctc actgggtcat
1140 1140
cgtgaaacct tcgcggatat cggccagact ctggcaaaat attttggtac ttctgatatg cgtgaaacct tcgcggatat cggccagact ctggcaaaat attttggtac ttctgatatg
1200 1200
gaatatggca aagccatgtt ctga gaatatggca aagccatgtt ctga
1224 1224
<210> 3<210> 3
<211> 407<211> 407
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Escherichia coli<213> Escherichia coli
<400> 3<400> 3
Met Lys Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Asp Ser Phe Gly Ile Gly AlaMet Lys Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Asp Ser Phe Gly Ile Gly Ala
1 5 10 151 5 10 15
Thr Glu Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Val Gly Ala Asp Thr Leu GlyThr Glu Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Val Gly Ala Asp Thr Leu Gly
20 25 30 20 25 30
His Ile Ala Glu Ala Cys Ala Lys Gly Glu Ala Asp Asn Gly Arg LysHis Ile Ala Glu Ala Cys Ala Lys Gly Glu Ala Asp Asn Gly Arg Lys
35 40 45 35 40 45
Gly Pro Leu Asn Leu Pro Asn Leu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Lys AlaGly Pro Leu Asn Leu Pro Asn Leu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Lys Ala
50 55 60 50 55 60
His Glu Gly Ser Thr Gly Phe Ile Pro Ala Gly Met Asp Gly Asn AlaHis Glu Gly Ser Thr Gly Phe Ile Pro Ala Gly Met Asp Gly Asn Ala
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Val Ile Gly Ala Tyr Ala Trp Ala His Glu Met Ser Ser Gly LysGlu Val Ile Gly Ala Tyr Ala Trp Ala His Glu Met Ser Ser Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Asp Thr Pro Ser Gly His Trp Glu Ile Ala Gly Val Pro Val Leu PheAsp Thr Pro Ser Gly His Trp Glu Ile Ala Gly Val Pro Val Leu Phe
100 105 110 100 105 110
Glu Trp Gly Tyr Phe Ser Asp His Glu Asn Ser Phe Pro Gln Glu LeuGlu Trp Gly Tyr Phe Ser Asp His Glu Asn Ser Phe Pro Gln Glu Leu
115 120 125 115 120 125
Leu Asp Lys Leu Val Glu Arg Ala Asn Leu Pro Gly Tyr Leu Gly AsnLeu Asp Lys Leu Val Glu Arg Ala Asn Leu Pro Gly Tyr Leu Gly Asn
130 135 140 130 135 140
Cys His Ser Ser Gly Thr Val Ile Leu Asp Gln Leu Gly Glu Glu HisCys His Ser Ser Gly Thr Val Ile Leu Asp Gln Leu Gly Glu Glu His
145 150 155 160145 150 155 160
Met Lys Thr Gly Lys Pro Ile Phe Tyr Thr Ser Ala Asp Ser Val PheMet Lys Thr Gly Lys Pro Ile Phe Tyr Thr Ser Ala Asp Ser Val Phe
165 170 175 165 170 175
Gln Ile Ala Cys His Glu Glu Thr Phe Gly Leu Asp Lys Leu Tyr GluGln Ile Ala Cys His Glu Glu Thr Phe Gly Leu Asp Lys Leu Tyr Glu
180 185 190 180 185 190
Leu Cys Glu Ile Ala Arg Glu Glu Leu Thr Asn Gly Gly Tyr Asn IleLeu Cys Glu Ile Ala Arg Glu Glu Leu Thr Asn Gly Gly Tyr Asn Ile
195 200 205 195 200 205
Gly Arg Val Ile Ala Arg Pro Phe Ile Gly Asp Lys Ala Gly Asn PheGly Arg Val Ile Ala Arg Pro Phe Ile Gly Asp Lys Ala Gly Asn Phe
210 215 220 210 215 220
Gln Arg Thr Gly Asn Arg His Asp Leu Ala Val Glu Pro Pro Ala ProGln Arg Thr Gly Asn Arg His Asp Leu Ala Val Glu Pro Pro Ala Pro
225 230 235 240225 230 235 240
Thr Val Leu Gln Lys Leu Val Asp Glu Lys His Gly Gln Val Val SerThr Val Leu Gln Lys Leu Val Asp Glu Lys His Gly Gln Val Val Ser
245 250 255 245 250 255
Val Gly Lys Ile Ala Asp Ile Tyr Ala Asn Cys Gly Ile Thr Lys LysVal Gly Lys Ile Ala Asp Ile Tyr Ala Asn Cys Gly Ile Thr Lys Lys
260 265 270 260 265 270
Val Lys Ala Thr Gly Leu Asp Ala Leu Phe Asp Ala Thr Ile Lys GluVal Lys Ala Thr Gly Leu Asp Ala Leu Phe Asp Ala Thr Ile Lys Glu
275 280 285 275 280 285
Met Lys Glu Ala Gly Asp Asn Thr Ile Val Phe Thr Asn Phe Val AspMet Lys Glu Ala Gly Asp Asn Thr Ile Val Phe Thr Asn Phe Val Asp
290 295 300 290 295 300
Phe Asp Ser Ser Trp Gly His Arg Arg Asp Val Ala Gly Tyr Ala AlaPhe Asp Ser Ser Trp Gly His Arg Arg Asp Val Ala Gly Tyr Ala Ala
305 310 315 320305 310 315 320
Gly Leu Glu Leu Phe Asp Arg Arg Leu Pro Glu Leu Met Ser Leu LeuGly Leu Glu Leu Phe Asp Arg Arg Leu Pro Glu Leu Met Ser Leu Leu
325 330 335 325 330 335
Arg Asp Asp Asp Ile Leu Ile Leu Thr Ala Asp His Gly Cys Asp ProArg Asp Asp Asp Ile Leu Ile Leu Thr Ala Asp His Gly Cys Asp Pro
340 345 350 340 345 350
Thr Trp Thr Gly Thr Asp His Thr Arg Glu His Ile Pro Val Leu ValThr Trp Thr Gly Thr Asp His Thr Arg Glu His Ile Pro Val Leu Val
355 360 365 355 360 365
Tyr Gly Pro Lys Val Lys Pro Gly Ser Leu Gly His Arg Glu Thr PheTyr Gly Pro Lys Val Lys Pro Gly Ser Leu Gly His Arg Glu Thr Phe
370 375 380 370 375 380
Ala Asp Ile Gly Gln Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gly Thr Ser Asp MetAla Asp Ile Gly Gln Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gly Thr Ser Asp Met
385 390 395 400385 390 395 400
Glu Tyr Gly Lys Ala Met PheGlu Tyr Gly Lys Ala Met Phe
405 405
<210> 4<210> 4
<211> 407<211> 407
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 4<400> 4
Met Lys Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Asp Ser Phe Gly Ile Gly AlaMet Lys Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Asp Ser Phe Gly Ile Gly Ala
1 5 10 151 5 10 15
Thr Glu Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Val Gly Ala Asp Thr Leu GlyThr Glu Asp Ala Glu Arg Phe Gly Asp Val Gly Ala Asp Thr Leu Gly
20 25 30 20 25 30
His Ile Ala Glu Ala Cys Ala Lys Gly Glu Ala Asp Asn Gly Arg LysHis Ile Ala Glu Ala Cys Ala Lys Gly Glu Ala Asp Asn Gly Arg Lys
35 40 45 35 40 45
Gly Pro Leu Asn Leu Pro Asn Leu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Lys AlaGly Pro Leu Asn Leu Pro Asn Leu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Lys Ala
50 55 60 50 55 60
His Glu Gly Ser Thr Gly Phe Ile Pro Ala Gly Met Asp Gly Asn AlaHis Glu Gly Ser Thr Gly Phe Ile Pro Ala Gly Met Asp Gly Asn Ala
65 70 75 8065 70 75 80
Glu Val Ile Gly Ala Tyr Ala Trp Ala His Glu Met Ser Ser Gly LysGlu Val Ile Gly Ala Tyr Ala Trp Ala His Glu Met Ser Ser Gly Lys
85 90 95 85 90 95
Asp Thr Pro Ser Gly His Trp Glu Ile Ala Gly Val Pro Val Leu PheAsp Thr Pro Ser Gly His Trp Glu Ile Ala Gly Val Pro Val Leu Phe
100 105 110 100 105 110
Glu Trp Gly Tyr Phe Ser Asp His Glu Asn Ser Phe Pro Gln Glu LeuGlu Trp Gly Tyr Phe Ser Asp His Glu Asn Ser Phe Pro Gln Glu Leu
115 120 125 115 120 125
Leu Asp Lys Leu Val Glu Arg Ala Asn Leu Pro Gly Tyr Leu Gly AsnLeu Asp Lys Leu Val Glu Arg Ala Asn Leu Pro Gly Tyr Leu Gly Asn
130 135 140 130 135 140
Cys His Ser Ser Gly Thr Val Ile Leu Asp Gln Leu Gly Glu Glu HisCys His Ser Ser Gly Thr Val Ile Leu Asp Gln Leu Gly Glu Glu His
145 150 155 160145 150 155 160
Met Lys Thr Gly Lys Pro Ile Phe Tyr Thr Ser Ala Asp Ser Val PheMet Lys Thr Gly Lys Pro Ile Phe Tyr Thr Ser Ala Asp Ser Val Phe
165 170 175 165 170 175
Gln Ile Ala Cys His Glu Glu Thr Phe Gly Leu Asp Lys Leu Tyr GluGln Ile Ala Cys His Glu Glu Thr Phe Gly Leu Asp Lys Leu Tyr Glu
180 185 190 180 185 190
Leu Cys Glu Ile Ala Arg Glu Glu Leu Thr Asn Gly Gly Tyr Asn IleLeu Cys Glu Ile Ala Arg Glu Glu Leu Thr Asn Gly Gly Tyr Asn Ile
195 200 205 195 200 205
Gly Arg Val Ile Ala Arg Pro Phe Ile Gly Asp Lys Ala Gly Asn PheGly Arg Val Ile Ala Arg Pro Phe Ile Gly Asp Lys Ala Gly Asn Phe
210 215 220 210 215 220
Gln Arg Thr Gly Asn Arg His Asp Leu Ala Val Glu Pro Pro Ala ProGln Arg Thr Gly Asn Arg His Asp Leu Ala Val Glu Pro Pro Ala Pro
225 230 235 240225 230 235 240
Thr Val Leu Gln Lys Leu Val Asp Glu Lys His Gly Gln Val Val SerThr Val Leu Gln Lys Leu Val Asp Glu Lys His Gly Gln Val Val Ser
245 250 255 245 250 255
Val Gly Lys Ile Ala Asp Ile Tyr Ala Asn Cys Gly Ile Thr Lys LysVal Gly Lys Ile Ala Asp Ile Tyr Ala Asn Cys Gly Ile Thr Lys Lys
260 265 270 260 265 270
Val Lys Ala Thr Gly Leu Asp Ala Leu Phe Asp Ala Thr Ile Lys GluVal Lys Ala Thr Gly Leu Asp Ala Leu Phe Asp Ala Thr Ile Lys Glu
275 280 285 275 280 285
Met Lys Glu Ala Gly Asp Asn Thr Ile Val Phe Thr Asn Phe Val AspMet Lys Glu Ala Gly Asp Asn Thr Ile Val Phe Thr Asn Phe Val Asp
290 295 300 290 295 300
Phe Asp Ser Ser Trp Gly His Arg Arg Asp Val Ala Gly Tyr Ala AlaPhe Asp Ser Ser Trp Gly His Arg Arg Asp Val Ala Gly Tyr Ala Ala
305 310 315 320305 310 315 320
Gly Leu Glu Leu Phe Asp Arg Arg Leu Pro Glu Leu Met Ser Leu LeuGly Leu Glu Leu Phe Asp Arg Arg Leu Pro Glu Leu Met Ser Leu Leu
325 330 335 325 330 335
Arg Asp Asp Asp Ile Leu Ile Leu Thr Ala Asp His Gly Tyr Asp ProArg Asp Asp Asp Ile Leu Ile Leu Thr Ala Asp His Gly Tyr Asp Pro
340 345 350 340 345 350
Thr Trp Thr Gly Thr Asp His Thr Arg Glu His Ile Pro Val Leu ValThr Trp Thr Gly Thr Asp His Thr Arg Glu His Ile Pro Val Leu Val
355 360 365 355 360 365
Tyr Gly Pro Lys Val Lys Pro Gly Ser Leu Gly His Arg Glu Thr PheTyr Gly Pro Lys Val Lys Pro Gly Ser Leu Gly His Arg Glu Thr Phe
370 375 380 370 375 380
Ala Asp Ile Gly Gln Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gly Thr Ser Asp MetAla Asp Ile Gly Gln Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gly Thr Ser Asp Met
385 390 395 400385 390 395 400
Glu Tyr Gly Lys Ala Met PheGlu Tyr Gly Lys Ala Met Phe
405 405
<210> 5<210> 5
<211> 27<211> 27
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 5<400> 5
cgggatccat ggacggcaac gctgaag cgggatccat ggacggcaac gctgaag
27 27
<210> 6<210> 6
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 6<400> 6
gatcgtaacc gtggtcag gatcgtaacc gtggtcag
18 18
<210> 7<210> 7
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 7<400> 7
ctgaccacgg ttacgatc ctgaccacgg ttacgatc
18 18
<210> 8<210> 8
<211> 36<211> 36
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 8<400> 8
aaggaaaaaa gcggccgcgc tcgtgagtgc ggatgt aaggaaaaaa gcggccgcgc tcgtgagtgc ggatgt
36 36
<210> 9<210> 9
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 9<400> 9
tgacgccacc atcaaagaga tgacgccacc atcaaagaga
20 20
<210> 10<210> 10
<211> 19<211> 19
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 10<400> 10
gtcaacgctc cgcccaaat gtcaacgctc cgcccaaat
19 19
<210> 11<210> 11
<211> 1684<211> 1684
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 11<400> 11
gacggcaacg ctgaagttat cggcgcgtac gcatgggcgc acgaaatgtc atccggtaaa gacggcaacg ctgaagttat cggcgcgtac gcatgggcgc acgaaatgtc atccggtaaa
60 60
gataccccgt ctggtcactg ggaaattgcc ggtgtcccgg ttctgtttga gtggggatat gataccccgt ctggtcactg ggaaattgcc ggtgtcccgg ttctgtttga gtggggatat
120 120
ttctccgatc acgaaaacag cttcccgcaa gagctgctgg ataaactggt cgaacgcgct ttctccgatc acgaaaacag cttcccgcaa gagctgctgg ataaactggt cgaacgcgct
180 180
aatctgccgg gttacctcgg taactgccac tcttccggta cggtcattct ggatcaactg aatctgccgg gttacctcgg taactgccac tcttccggta cggtcattct ggatcaactg
240 240
ggcgaagagc acatgaaaac cggcaagccg attttctata cctccgctga ctccgtgttc ggcgaagagc acatgaaaac cggcaagccg attttctata cctccgctga ctccgtgttc
300 300
cagattgcct gccatgaaga aactttcggt ctggataaac tctacgaact gtgcgaaatc cagattgcct gccatgaaga aactttcggt ctggataaac tctacgaact gtgcgaaatc
360 360
gcccgtgaag agctgaccaa cggcggctac aatatcggtc gtgttatcgc tcgtccgttt gcccgtgaag agctgaccaa cggcggctac aatatcggtc gtgttatcgc tcgtccgttt
420 420
atcggcgaca aagccggtaa cttccagcgt accggtaacc gtcacgacct ggctgttgag atcggcgaca aagccggtaa cttccagcgt accggtaacc gtcacgacct ggctgttgag
480 480
ccgccagcac cgaccgtgct gcagaaactg gttgatgaaa aacacggcca ggtggtttct ccgccagcac cgaccgtgct gcagaaactg gttgatgaaa aacacggcca ggtggtttct
540 540
gtcggtaaaa ttgcggacat ctacgccaac tgcggtatca ccaaaaaagt gaaagcgact gtcggtaaaa ttgcggacat ctacgccaac tgcggtatca ccaaaaaagt gaaagcgact
600 600
ggcctggacg cgctgtttga cgccaccatc aaagagatga aagaagcggg tgataacacc ggcctggacg cgctgtttga cgccaccatc aaagagatga aagaagcggg tgataacacc
660 660
atcgtcttca ccaacttcgt tgacttcgac tcttcctggg gccaccgtcg cgacgtcgcc atcgtcttca ccaacttcgt tgacttcgac tcttcctggg gccaccgtcg cgacgtcgcc
720 720
ggttatgccg cgggtctgga actgttcgac cgccgtctgc cggagctgat gtctctgctg ggttatgccg cgggtctgga actgttcgac cgccgtctgc cggagctgat gtctctgctg
780 780
cgcgatgacg acatcctgat cctcaccgct gaccacggtt acgatccgac ctggaccggt cgcgatgacg acatcctgat cctcaccgct gaccacggtt acgatccgac ctggaccggt
840 840
actgaccaca cgcgtgaaca cattccggta ctggtatatg gcccgaaagt aaaaccgggc actgaccaca cgcgtgaaca cattccggta ctggtatatg gcccgaaagt aaaaccgggc
900 900
tcactgggtc atcgtgaaac cttcgcggat atcggccaga ctctggcaaa atattttggt tcactgggtc atcgtgaaac cttcgcggat atcggccaga ctctggcaaa atattttggt
960 960
acttctgata tggaatatgg caaagccatg ttctgatgga tttgggcgga gcgttgactc acttctgata tggaatatgg caaagccatg ttctgatgga tttgggcgga gcgttgactc
1020 1020
cgcctttgtt atgtcacaaa aaggataaaa caatggctac cccacacatt aatgcagaaa cgcctttgtt atgtcacaaa aaggataaaa caatggctac cccacacatt aatgcagaaa
1080 1080
tgggcgattt cgctgacgta gttttgatgc caggcgaccc gctgcgtgcg aagtatattg tgggcgattt cgctgacgta gttttgatgc caggcgaccc gctgcgtgcg aagtatattg
1140 1140
ctgaaacttt ccttgaagat gcccgtgaag tgaacaacgt tcgcggtatg ctgggcttca ctgaaacttt ccttgaagat gcccgtgaag tgaacaacgt tcgcggtatg ctgggcttca
1200 1200
ccggtactta caaaggccgc aaaatttccg taatgggtca cggtatgggt atcccgtcct ccggtactta caaaggccgc aaaatttccg taatgggtca cggtatgggt atcccgtcct
1260 1260
gctccatcta caccaaagaa ctgatcaccg atttcggcgt gaagaaaatt atccgcgtgg gctccatcta caccaaagaa ctgatcaccg atttcggcgt gaagaaaatt atccgcgtgg
1320 1320
gttcctgtgg cgcagttctg ccgcacgtaa aactgcgcga cgtcgttatc ggtatgggtg gttcctgtgg cgcagttctg ccgcacgtaa aactgcgcga cgtcgttatc ggtatgggtg
1380 1380
cctgcaccga ttccaaagtt aaccgcatcc gttttaaaga ccatgacttt gccgctatcg cctgcaccga ttccaaagtt aaccgcatcc gttttaaaga ccatgacttt gccgctatcg
1440 1440
ctgacttcga catggtgcgt aacgcagtag atgcagctaa agcactgggt attgatgctc ctgacttcga catggtgcgt aacgcagtag atgcagctaa agcactgggt attgatgctc
1500 1500
gcgtgggtaa cctgttctcc gctgacctgt tctactctcc ggacggcgaa atgttcgacg gcgtgggtaa cctgttctcc gctgacctgt tctactctcc ggacggcgaa atgttcgacg
1560 1560
tgatggaaaa atacggcatt ctcggcgtgg aaatggaagc ggctggtatc tacggcgtcg tgatggaaaa atacggcatt ctcggcgtgg aaatggaagc ggctggtatc tacggcgtcg
1620 1620
ctgcagaatt tggcgcgaaa gccctgacca tctgcaccgt atctgaccac atccgcactc ctgcagaatt tggcgcgaaa gccctgacca tctgcaccgt atctgaccac atccgcactc
1680 1680
acga acga
1684 1684
<210> 12<210> 12
<211> 401<211> 401
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 12<400> 12
tgacgccacc atcaaagaga tgaaagaagc gggtgataac accatcgtct tcaccaactt tgacgccacc atcaaagaga tgaaagaagc gggtgataac accatcgtct tcaccaactt
60 60
cgttgacttc gactcttcct ggggccaccg tcgcgacgtc gccggttatg ccgcgggtct cgttgacttc gactcttcct ggggccaccg tcgcgacgtc gccggttatg ccgcgggtct
120 120
ggaactgttc gaccgccgtc tgccggagct gatgtctctg ctgcgcgatg acgacatcct ggaactgttc gaccgccgtc tgccggagct gatgtctctg ctgcgcgatg acgacatcct
180 180
gatcctcacc gctgaccacg gttacgatcc gacctggacc ggtactgacc acacgcgtga gatcctcacc gctgaccacg gttacgatcc gacctggacc ggtactgacc acacgcgtga
240 240
acacattccg gtactggtat atggcccgaa agtaaaaccg ggctcactgg gtcatcgtga acacattccg gtactggtat atggcccgaa agtaaaaccg ggctcactgg gtcatcgtga
300 300
aaccttcgcg gatatcggcc agactctggc aaaatatttt ggtacttctg atatggaata aaccttcgcg gatatcggcc agactctggc aaaatatttt ggtacttctg atatggaata
360 360
tggcaaagcc atgttctgat ggatttgggc ggagcgttga c tggcaaagcc atgttctgat ggatttgggc ggagcgttga c
401 401
<210> 13<210> 13
<211> 355<211> 355
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 13<400> 13
cataaccacc tcaaatgtga ttcaaataag tcctaagttt taaatatatc aaaaattaat cataaccacc tcaaatgtga ttcaaataag tcctaagttt taaatatatc aaaaattaat
60 60
gggaaactct tcgcgatttg tgatgtctaa cgggccattt catgtaacag aacgtttcca gggaaactct tcgcgatttg tgatgtctaa cggggccatt catgtaacag aacgtttcca
120 120
tacaccgcta tccatctaaa tttaaatcac tttttcagag aactgcgtaa gtattacgca tacaccgcta tccatctaaa tttaaatcac tttttcagag aactgcgtaa gtattacgca
180 180
tgttttccct gtcattcatc cagattattc ctaatcacca gactaatgat tccatcaatc tgttttccct gtcattcatc cagattattc ctaatcacca gactaatgat tccatcaatc
240 240
ctggcgcatt ttagtcaaaa cgggggaaaa ttttttcaac aaatgctcaa ccagcattgg ctggcgcatt ttagtcaaaa cgggggaaaa ttttttcaac aaatgctcaa ccagcattgg
300 300
gtatatccag tacactccac gctttactta agtctagata tttgtgggag aaagg gtatatccag tacactccac gctttactta agtctagata tttgtgggag aaagg
355 355
<210> 14<210> 14
<211> 355<211> 355
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 14<400> 14
cataaccacc tcaaatgtga ttcaaataag tcctaagttt taaatatatc aaaaattaat cataaccacc tcaaatgtga ttcaaataag tcctaagttt taaatatatc aaaaattaat
60 60
gggaaactct tcgcgatttg tgatgtctaa cgggccattt catgtaacag aacgtttcca gggaaactct tcgcgatttg tgatgtctaa cggggccatt catgtaacag aacgtttcca
120 120
tacaccgcta tccatctaaa tttaaatcac tttttcagag aactgcgtaa gtattacgca tacaccgcta tccatctaaa tttaaatcac tttttcagag aactgcgtaa gtattacgca
180 180
tgttttccct gtcattcatc cagattattc ctaatcacca gactaatgat tccatcaatc tgttttccct gtcattcatc cagattattc ctaatcacca gactaatgat tccatcaatc
240 240
ctggcgcatt ttagtcaaaa cgggggaaaa ttttttcaac aaatgctcga ccagcattgg ctggcgcatt ttagtcaaaa cgggggaaaa ttttttcaac aaatgctcga ccagcattgg
300 300
gtatatccag tacactccac gctttactta agtctagata tttgtgggag aaagg gtatatccag tacactccac gctttactta agtctagata tttgtgggag aaagg
355 355
<210> 15<210> 15
<211> 888<211> 888
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 15<400> 15
atgcctggtt cattacgtaa aatgccggtc tggttaccaa tagtcatatt gctcgttgcc atgcctggtt cattacgtaa aatgccggtc tggttaccaa tagtcatatt gctcgttgcc
60 60
atggcgtcta ttcagggtgg agcctcgtta gctaagtcac tttttcctct ggtgggcgca atggcgtcta ttcagggtgg agcctcgtta gctaagtcac tttttcctct ggtgggcgca
120 120
ccgggtgtca ctgcgctgcg tctggcatta ggaacgctga tcctcatcgc gttctttaag ccgggtgtca ctgcgctgcg tctggcatta ggaacgctga tcctcatcgc gttctttaag
180 180
ccatggcgac tgcgctttgc caaagagcaa cggttaccgc tgttgtttta cggcgtttcg ccatggcgac tgcgctttgc caaagagcaa cggttaccgc tgttgtttta cggcgtttcg
240 240
ctgggtggga tgaattatct tttttatctt tctattcaga cagtaccgct gggtattgcg ctgggtggga tgaattatct tttttatctt tctattcaga cagtaccgct gggtattgcg
300 300
gtggcgctgg agttcaccgg accactggcg gtggcgctgt tctcttctcg tcgcccggta gtggcgctgg agttcaccgg accactggcg gtggcgctgt tctcttctcg tcgcccggta
360 360
gatttcgtct gggttgtgct ggcggttctt ggtctgtggt tcctgctacc gctggggcaa gatttcgtct gggttgtgct ggcggttctt ggtctgtggt tcctgctacc gctggggcaa
420 420
gacgtttccc atgtcgattt aaccggctgt gcgctggcac tgggggccgg ggcttgttgg gacgtttccc atgtcgattt aaccggctgt gcgctggcac tggggggccgg ggcttgttgg
480 480
gctatttaca ttttaagtgg gcaacgcgca ggagcggaac atggccctgc gacggtggca gctatttaca ttttaagtgg gcaacgcgca ggagcggaac atggccctgc gacggtggca
540 540
attggttcgt tgattgcagc gttaattttc gtgccaattg gagcgcttca ggctggtgaa attggttcgt tgattgcagc gttaattttc gtgccaattg gagcgcttca ggctggtgaa
600 600
gcactctggc actggtcggt tattccattg ggtctggctg tcgctattct ctcgaccgct gcactctggc actggtcggt tattccattg ggtctggctg tcgctattct ctcgaccgct
660 660
ctgccttatt cgctggaaat gattgccctc acccgtttgc caacacggac atttggtacg ctgccttatt cgctggaaat gattgccctc acccgtttgc caacacggac atttggtacg
720 720
ctgatgagca tggaaccggc gctggctgcc gtttccggga tgattttcct cggagaaaca ctgatgagca tggaaccggc gctggctgcc gtttccggga tgattttcct cggagaaaca
780 780
ctgacaccca tacagctact ggcgctcggc gctatcatcg ccgcttcaat ggggtctacg ctgacaccca tacagctact ggcgctcggc gctatcatcg ccgcttcaat ggggtctacg
840 840
ctgacagtac gcaaagagag caaaataaaa gaattagaca ttaattaa ctgacagtac gcaaagagag caaaataaaa gaattagaca ttaattaa
888 888
<210> 16<210> 16
<211> 295<211> 295
<212> БЕЛОК<212> PROTEIN
<213> Escherichia coli<213> Escherichia coli
<400> 16<400> 16
Met Pro Gly Ser Leu Arg Lys Met Pro Val Trp Leu Pro Ile Val IleMet Pro Gly Ser Leu Arg Lys Met Pro Val Trp Leu Pro Ile Val Ile
1 5 10 151 5 10 15
Leu Leu Val Ala Met Ala Ser Ile Gln Gly Gly Ala Ser Leu Ala LysLeu Leu Val Ala Met Ala Ser Ile Gln Gly Gly Ala Ser Leu Ala Lys
20 25 30 20 25 30
Ser Leu Phe Pro Leu Val Gly Ala Pro Gly Val Thr Ala Leu Arg LeuSer Leu Phe Pro Leu Val Gly Ala Pro Gly Val Thr Ala Leu Arg Leu
35 40 45 35 40 45
Ala Leu Gly Thr Leu Ile Leu Ile Ala Phe Phe Lys Pro Trp Arg LeuAla Leu Gly Thr Leu Ile Leu Ile Ala Phe Phe Lys Pro Trp Arg Leu
50 55 60 50 55 60
Arg Phe Ala Lys Glu Gln Arg Leu Pro Leu Leu Phe Tyr Gly Val SerArg Phe Ala Lys Glu Gln Arg Leu Pro Leu Leu Phe Tyr Gly Val Ser
65 70 75 8065 70 75 80
Leu Gly Gly Met Asn Tyr Leu Phe Tyr Leu Ser Ile Gln Thr Val ProLeu Gly Gly Met Asn Tyr Leu Phe Tyr Leu Ser Ile Gln Thr Val Pro
85 90 95 85 90 95
Leu Gly Ile Ala Val Ala Leu Glu Phe Thr Gly Pro Leu Ala Val AlaLeu Gly Ile Ala Val Ala Leu Glu Phe Thr Gly Pro Leu Ala Val Ala
100 105 110 100 105 110
Leu Phe Ser Ser Arg Arg Pro Val Asp Phe Val Trp Val Val Leu AlaLeu Phe Ser Ser Arg Arg Pro Val Asp Phe Val Trp Val Val Leu Ala
115 120 125 115 120 125
Val Leu Gly Leu Trp Phe Leu Leu Pro Leu Gly Gln Asp Val Ser HisVal Leu Gly Leu Trp Phe Leu Leu Pro Leu Gly Gln Asp Val Ser His
130 135 140 130 135 140
Val Asp Leu Thr Gly Cys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Gly Ala Cys TrpVal Asp Leu Thr Gly Cys Ala Leu Ala Leu Gly Ala Gly Ala Cys Trp
145 150 155 160145 150 155 160
Ala Ile Tyr Ile Leu Ser Gly Gln Arg Ala Gly Ala Glu His Gly ProAla Ile Tyr Ile Leu Ser Gly Gln Arg Ala Gly Ala Glu His Gly Pro
165 170 175 165 170 175
Ala Thr Val Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ile Phe Val ProAla Thr Val Ala Ile Gly Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ile Phe Val Pro
180 185 190 180 185 190
Ile Gly Ala Leu Gln Ala Gly Glu Ala Leu Trp His Trp Ser Val IleIle Gly Ala Leu Gln Ala Gly Glu Ala Leu Trp His Trp Ser Val Ile
195 200 205 195 200 205
Pro Leu Gly Leu Ala Val Ala Ile Leu Ser Thr Ala Leu Pro Tyr SerPro Leu Gly Leu Ala Val Ala Ile Leu Ser Thr Ala Leu Pro Tyr Ser
210 215 220 210 215 220
Leu Glu Met Ile Ala Leu Thr Arg Leu Pro Thr Arg Thr Phe Gly ThrLeu Glu Met Ile Ala Leu Thr Arg Leu Pro Thr Arg Thr Phe Gly Thr
225 230 235 240225 230 235 240
Leu Met Ser Met Glu Pro Ala Leu Ala Ala Val Ser Gly Met Ile PheLeu Met Ser Met Glu Pro Ala Leu Ala Ala Val Ser Gly Met Ile Phe
245 250 255 245 250 255
Leu Gly Glu Thr Leu Thr Pro Ile Gln Leu Leu Ala Leu Gly Ala IleLeu Gly Glu Thr Leu Thr Pro Ile Gln Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ile
260 265 270 260 265 270
Ile Ala Ala Ser Met Gly Ser Thr Leu Thr Val Arg Lys Glu Ser LysIle Ala Ala Ser Met Gly Ser Thr Leu Thr Val Arg Lys Glu Ser Lys
275 280 285 275 280 285
Ile Lys Glu Leu Asp Ile AsnIle Lys Glu Leu Asp Ile Asn
290 295 290 295
<210> 17<210> 17
<211> 30<211> 30
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 17<400> 17
cgggatcctc gctggtgtcg tgtttgtagg cgggatcctc gctggtgtcg tgtttgtagg
30 thirty
<210> 18<210> 18
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 18<400> 18
tatacccaat gctggtcgag tatacccaat gctggtcgag
20 20
<210> 19<210> 19
<211> 20<211> 20
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 19<400> 19
cgaccagcat tgggtatatc cgaccagcat tgggtatatc
20 20
<210> 20<210> 20
<211> 41<211> 41
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 20<400> 20
aaggaaaaaa gcggccgccg aaaattaacg ctgcaatcaa c aaggaaaaaa gcggccgccg aaaattaacg ctgcaatcaa c
41 41
<210> 21<210> 21
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 21<400> 21
atacaccgct atccatct atacaccgct atccactct
18 18
<210> 22<210> 22
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<400> 22<400> 22
aaccaggcat cctttctc aaccaggcat cctttctc
18 18
<---<---
Claims (13)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910804035.3 | 2019-08-28 | ||
| CN201910927600.5 | 2019-09-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2021139991A RU2021139991A (en) | 2023-09-28 |
| RU2813511C2 true RU2813511C2 (en) | 2024-02-12 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2244007C2 (en) * | 2002-02-27 | 2005-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Method for preparing l-threonine, strain escherichia coli as producer of threonine (variants) |
| US8852898B2 (en) * | 2007-03-09 | 2014-10-07 | Korea Advanced Institute Of Science & Technology | L-threonine overproducing microorganism and method for preparing L-threonine using the same |
| CN104845995B (en) * | 2014-02-14 | 2018-11-13 | 中国科学院微生物研究所 | A kind of method that dynamic regulation threonine arranges transporter gene Expression product L-threonine outside |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2244007C2 (en) * | 2002-02-27 | 2005-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Method for preparing l-threonine, strain escherichia coli as producer of threonine (variants) |
| US8852898B2 (en) * | 2007-03-09 | 2014-10-07 | Korea Advanced Institute Of Science & Technology | L-threonine overproducing microorganism and method for preparing L-threonine using the same |
| CN104845995B (en) * | 2014-02-14 | 2018-11-13 | 中国科学院微生物研究所 | A kind of method that dynamic regulation threonine arranges transporter gene Expression product L-threonine outside |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHAO H. ET AL. Increasing L-threonine production in Escherichia coli by engineering the glyoxylate shunt and the L-threonine biosynthesis pathway. Appl Microbiol Biotechnol. 2018 Jul; 102 (13): 5505-5518. doi: 10.1007/s00253-018-9024-3. Найдено онлайн: https://link.springer.com/article/10.1007/s00253-018-9024-3. Дата обращения 24.05.2023. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110195087B (en) | Method for producing L-lysine by fermentation using bacteria with modified ppc gene | |
| KR20250019107A (en) | NCgl2747 gene mutant and its application in L-lysine production | |
| CN115916980A (en) | Transformant of bacteria of the genus Hydrogenophilus producing aspartic acid and methionine | |
| CN110592084B (en) | Recombinant strain transformed by rhtA gene promoter, construction method and application thereof | |
| CN110592109B (en) | Recombinant strain modified by spoT gene and construction method and application thereof | |
| CN110564742B (en) | Recombinant strain modified by yebN gene and construction method and application thereof | |
| CN110846333B (en) | Recombinant strain modified by deoB gene and construction method and application thereof | |
| RU2813511C2 (en) | Recombinant strain based on escherichia coli and method of its construction and use | |
| RU2813283C2 (en) | Recombinant strain based on escherichia coli, a method of its construction and use | |
| KR102768742B1 (en) | Escherichia coli-based recombinant strains and their construction methods and applications | |
| CN114181288A (en) | Method for preparing L-valine and gene used therefor and protein encoded by the gene | |
| EP3992293B1 (en) | Escherichia coli-based recombinant strain, construction method therefor and use thereof | |
| CN110804617B (en) | KdtA gene modified recombinant strain and construction method and application thereof | |
| KR20200058482A (en) | Modified strains for the production of recombinant silk | |
| CN114540399A (en) | A kind of method for preparing L-valine and its used gene mutant and biological material | |
| RU2835613C1 (en) | Recombinant strain on basis of escherichia coli, method for its construction and its use | |
| RU2841163C2 (en) | Strain having high ability to produce l-glutamic acid, as well as method for construction and use thereof | |
| CN114315998B (en) | CEY17_RS00300 gene mutant and application thereof in preparation of L-valine | |
| CN118638759B (en) | Nicotinamide phosphoribosyltransferase mutant and its application | |
| RU2841249C2 (en) | Recombinant strain with modified bbd29_04920 gene for producing l-glutamic acid, as well as method for construction and use thereof | |
| RU2832588C1 (en) | Recombinant strain for production of l-amino acid, method for construction and use thereof | |
| CN114315999A (en) | LeuD protein mutant and related biological material and application thereof in preparation of L-valine | |
| CN119708180A (en) | Application of NCgl0762 protein and mutant thereof in production of L-isoleucine | |
| JP2003289867A (en) | Aconitase gene of acetobacter, acetobacter bred by using the gene, and method for producing vinegar by using the acetobacter | |
| CN114277069A (en) | Method for preparing L-valine and biological material used therefor |