RU2811791C1

RU2811791C1 - Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 19 серотипа и способ его применения

Info

Publication number: RU2811791C1
Application number: RU2023109668A
Authority: RU
Inventors: Полина Павловна Голдовская; Ольга Попова; Ольга Вадимовна Зубкова; Татьяна Андреевна Ожаровская; Денис Игоревич Зрелкин; Дарья Владимировна Воронина; Дмитрий Викторович Щебляков; Инна Вадимовна Должикова; Дарья Михайловна Гроусова; Алина Шахмировна Джаруллаева; Амир Ильдарович Тухватулин; Наталья Михайловна Тухватулина; Дмитрий Николаевич Щербинин; Ильяс Булатович Есмагамбетов; Елизавета Александровна Токарская; Алина Сергеевна Банделюк; Андрей Павлович Карпов; Александр Сергеевич Семихин; Владимир Алексеевич Гущин; Максим Михайлович Шмаров
Filing date: 2023-04-16
Publication date: 2024-01-17

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Создан экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащий: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с целевым геном; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о. В частном варианте исполнения экспрессионного вектора константная последовательность до экспрессионной кассеты имеет последовательность SEQ ID NO:1, а после экспрессионной кассеты имеет последовательность SEQ ID NO:2. Экспрессионная кассета в качестве гена вакцинного антигена может содержать SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, или SEQ ID NO:7. Также описан способ получения экспрессионного вектора, отличающийся тем, что в нем используется челночная плазмида, содержащая последовательность, которая гомологична участку генома аденовируса, серотип которого отличается от 19. Группа изобретений обеспечивает создание экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 19 серотипа, который способен индуцировать иммунный ответ к вакцинному антигену. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 10 ил., 5 табл., 9 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Оно касается рекомбинантных векторов, которые могут быть использованы в фармацевтической промышленности для разработки вакцин.

Уровень техники

Вакцинация считается одним из наиболее эффективных способов борьбы с инфекционными заболеваниями. Принимая во внимание, что широкая вакцинопрофилактика имеет не столь длительную историю применения, уже к настоящему моменту, считается доказанным факт, что она спасла больше жизней, чем любое другое вмешательство в области общественного здравоохранения. Согласно исследованию, опубликованному в журнале The Lancet, иммунизация населения только против 10 патогенов в 98 странах позволила в период 2000-2019 гг. спасти жизни около 37 млн людей.

Вирусные векторы представляют собой относительно новую вакцинную платформу, основанную на использовании рекомбинантных вирусов для доставки генетического материала, кодирующего антиген, в клетки млекопитающих. В настоящее время шесть вакцин на основе вирусных векторов уже разрешены к применению и еще более 100 находятся на разных стадиях доклинических и клинических исследований.

Одним из наиболее востребованных вирусных векторов является вектор на основе рекомбинантного аденовируса. К преимуществам данного типа векторов можно отнести высокую безопасность, широкий диапазон тканевого тропизма, хорошо охарактеризованный геном, высокую пакующую емкость, возможность получения препаратов с высокими титрами и т.д. После введения в организм млекопитающих аденовирусы индуцируют устойчивый Т-клеточный и гуморальный иммунный ответ к вакцинному антигену. Кроме того, данные векторы приводят к активации врожденного иммунитета и не требуют добавления адъюванта в вакцинную композицию.

Среди аденовирусных векторов наиболее изученным является вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа.

Известно решение (CN1276777C), в котором предложена вакцина против тяжелого острого респираторного синдрома на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего последовательность S белка вируса SARS-CoV.

Известно решение по заявке на изобретение US20080267992A1, где описана вакцина против тяжелого острого респираторного синдрома на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV, или последовательность, которая включает домен S1 антигена S вируса SARS-CoV или домен S2 антигена S вируса SARS-CoV, или оба домена. Кроме того, данный рекомбинантный аденовирус в составе экспрессионной кассеты содержит промотор цитомегаловируса человека (CMV-промотор) и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (polyА BGH).

Известно решение CN111218459, в котором разработан экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, в котором были удалены Е1, Е3 области, содержащий ген S белка. Данный вектор применяется для создания вакцины против COVID-19.

Однако ограничением к широкому применению векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа является наличие у части населения предсуществующего иммунного ответа. В связи с этим актуальным направлением является разработка различных векторов, отличающихся генетически, в том числе на основе аденовирусов других серотипов. Однако из более 80 известных серотипов аденовирусов человека в настоящий момент в качестве экспрессионных векторов используется меньше 10 серотипов.

Таким образом, в области техники существует потребность в разработке новых экспрессионных векторов на основе других серотипов аденовируса.

Осуществление изобретения

Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала экспрессионных векторов на основе аденовирусов человека.

Технический результат заключается в создании экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 19 серотипа, который способен индуцировать иммунный ответ к вакцинному антигену.

Указанный технический результат достигается тем, что создан экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащий: константную последовательность с делецией Е1 и Е3областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с целевым геном; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о.

В частном варианте исполнения экспрессионного вектора константная последовательность до экспрессионной кассеты имеет последовательность SEQ ID NO:1, а после экспрессионной кассеты имеет последовательность SEQ ID NO:2.

Также в частном варианте исполнения экспрессионного вектора экспрессионная кассета в качестве гена вакцинного антигена содержит ген S белка вируса SARS-CoV2 SEQ ID NO:3.

В другом варианте исполнения экспрессионного вектора экспрессионная кассета в качестве гена вакцинного антигена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:4.

Кроме того, представлен вариант исполнения экспрессионного вектора, в котором экспрессионная кассета в качестве гена вакцинного антигена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:5.

Кроме того, представлен вариант исполнения экспрессионного вектора, в котором экспрессионная кассета в качестве гена вакцинного антигена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:6.

Кроме того, представлен вариант исполнения экспрессионного вектора, в котором экспрессионная кассета в качестве гена вакцинного антигена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:7.

Указанный технический результат также достигается тем, что разработан способ получения экспрессионного вектора, отличающийся тем, что в нем используется челночная плазмида, содержащая последовательность, которая гомологична участку генома аденовируса, серотип которого отличается от 19.

Также технический результат достигается тем, что разработан способ применения экспрессионного вектора для индукции иммунного ответа к вакцинному антигену.

Краткое описание фигур

На фиг. 1

представлено схематичное изображение экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего константную последовательность с делецией Е1 и Е3областей,вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о. и экспрессионную кассету с целевым геном.

На фиг.2 представлена схема получения плазмиды pAd19-dlE1.

На фиг.3 представлена схема получения плазмиды pAd19-dlE1-dlE3.

На фиг.4 представлена схема получения плазмиды pAd19-dlE1-dlE3-S-nCov.

На фиг. 5 представлена электрофореграмма результатов ПЦР-анализа полученного экспрессионного вектора Ad19-S-nCov с праймерами, фланкирующими участок гена гексона Ad19 и праймерами, фланкирующими ген Sбелка SARS-CoV2.

1 - Маркер молекулярного веса;

2 -Отрицательный контроль;

3 - Положительный контроль;

4 - Контроль выделения;

5 - Ad19-S-nCov.

На фиг. 6 представлена электрофореграмма результатов ПЦР-анализа полученных вариантов экспрессионного вектора Ad19-HA-H1, Ad19-HA-H3, Ad19-HA-B(Victoria), Ad19-HA-B(Yamagata) с праймерами, фланкирующими участок гена гексона Ad19.

1 - Маркер молекулярного веса;

2 - Отрицательный контроль;

3 - Положительный контроль;

4 - Контроль выделения;

5 - Ad19-HA-H1;

6 - Ad19-HA-H3;

7 - Ad19-HA-B(Victoria);

8 -Ad19-HA-B(Yamagata).

На фиг. 7 представлена электрофореграмма результатов ПЦР-анализа экспрессионного вектора Ad19-HA-H1 с праймерами, фланкирующими участок гена гемагглютинина вируса гриппа А H1N1.

1 - Маркер молекулярного веса;

2 - Отрицательный контроль;

3 - Положительный контроль;

4 - Контроль выделения;

5 - Ad19-HA-H1.

На фиг. 8 представлена электрофореграмма результатов ПЦР-анализа экспрессионного вектора Ad19-HA-H3 с праймерами, фланкирующими участок гена гемагглютинина вируса гриппа А H3N2.

1 - Маркер молекулярного веса;

2 - Отрицательный контроль;

3 - Положительный контроль;

4 - Контроль выделения;

5 - Ad19-HA-H3.

На фиг. 9 представлена электрофореграмма результатов ПЦР-анализа экспрессионного вектора Ad19-HA-B(Yamagata) с праймерами, фланкирующими участок гена гемагглютинина вируса гриппа BYamagata.

1 - Маркер молекулярного веса;

2 - Отрицательный контроль;

3 - Положительный контроль;

4 - Контроль выделения;

5 - Ad19-HA-B(Yamagata).

На фиг. 10 представлена электрофореграмма результатов ПЦР-анализа экспрессионного вектора Ad19-HA-B(Victoria) с праймерами, фланкирующими участок гена гемагглютинина вируса гриппа BVictoria.

1 - Маркер молекулярного веса;

2 - Отрицательный контроль;

3 - Положительный контроль;

4 - Контроль выделения;

5 - Ad19-HA-B(Victoria).

Краткое описание нуклеотидных последовательностей:

SEQIDNO:1 последовательность константной последовательности разработанного экспрессионного вектора до экспрессионной кассеты.

SEQIDNO:2 последовательность константной последовательности разработанного экспрессионного вектора после экспрессионной кассеты.

SEQIDNO:3 последовательность гена S белка вируса SARS-CoV-2;

SEQIDNO:4 последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа А H1N1;

SEQIDNO:5 последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа А H3N2;

SEQIDNO:6 последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа BYamagata;

SEQIDNO:7 последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа BVictoria;

Реализация изобретения

Авторы изобретения на основании проведенных исследований определили серотипы аденовирусных векторов, которые настолько отличаются генетически от аденовируса человека 5 серотипа, чтобы при последовательной иммунизации не влиять на генерацию антиген-специфических иммунных ответов против вакцинного антигена. Для дальнейшей работы был выбран аденовирус человека 19 серотипа. Затем был отобран вирусный клон, отличающийся повышенными ростовыми свойствами, который в дальнейшем был использован для получения экспрессионного вектора.

Способ получения данного экспрессионного вектора основан на способе получения аденовирусных векторов, описанном в патенте RU 2 731 356 C9, и включает следующие этапы: получение экспрессионной кассеты с целевым геном; получение челночной плазмиды, содержащей экспрессионную кассету с целевым геном; получение плазмиды, содержащей аденовирусный геном и экспрессионную кассету с целевым геном; получение рекомбинантного аденовируса. Главной отличительной особенностью нового метода является использование челночной плазмиды, содержащей области (плечи гомологии), которые только частично гомологичны геному аденовируса человека 19 серотипа. Во время гомологичной рекомбинации между челночной плазмидой и плазмидой, содержащей геном аденовируса человека 19 серотипа с делецией Е1 и Е3 областей, образуется новая плазмида. При этом в последовательностьна правом конце генома аденовируса может попасть последовательность (разного размера) из челночной плазмиды, т.к. гомология в данной области ниже 100%. У всех вариантов разработанного экспрессионного вектора данная область немного отличается, поэтому она была названа «вариабельный участок». Схематичное изображение разработанного экспрессионного вектора представлено на фиг.1.

Использование челночной плазмиды с плечами гомологии аденовируса человека 26 серотипа для получения экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 19 дает преимущество в скорости получения экспрессионного вектора и снижает его себестоимость.

В приведенных ниже примерах проиллюстрировано получение вариантов экспрессионного вектора, в котором экспрессионная кассета в качестве целевого гена содержит генS белка вируса SARS-CoV-2 или гемагглютинин вируса гриппа. Результаты проведенных экспериментов показывают, что при введении данных вариантов экспрессионного вектора в организм млекопитающих формируется иммунный ответ против соответствующего антигена. Поэтому различные варианты экспрессионного вектора могут быть использованы в составе иммунобиологических средств для профилактики инфекционных заболеваний.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Получение плазмиды, содержащей геном аденовируса человека 19 серотипа с делецией Е1 и Е3 областей.

В работе использовали аденовирус человека 19-го серотипа из Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. Данный аденовирус добавляли в культуру клеток почки человеческого эмбриона(НЕК293). Далее клетки культивировали в инкубаторе при температуре 37°С, 5% СО₂ до наступления цитопатического действия (определяли путем микроскопирования). Затем аденовирус выделяли из клеток и концентрировали методом ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия, после чего выделяли вирусную ДНК из вирионов методом фенол-хлороформной экстракции. Нуклеотидная последовательность аденовируса человека 19-го серотипа была определена методом полногеномного секвенирования.

ДНК, выделенную из вирионов аденовируса человека 19-го серотипа, использовали в реакции гомологичной рекомбинации с плазмидой pAd26-Ends (получена в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России), линеаризованной с помощью эндонуклеазы рестрикции MluI. Плазмида pAd26-Ends содержит два участка, гомологичных геному аденовируса человека 26 серотипа (два плеча гомологии). Одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 26-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pIX белок. Второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4 области до конца генома. Далее проводили трансформацию клеток E.coli штамма BJ5183полученной смесью. В результате была получена плазмида pAd19-dlE1.

На следующем этапе с помощью стандартных генно-инженерных методов была получена плазмида р19-dlE3, которая представляет собой челночный вектор, содержащий два плеча гомологии, фланкирующих Е3 область. Далее проводили гомологичную рекомбинацию плазмиды р19-dlE3 и плазмиды pAd19-dlE1, полученной на предыдущем этапе. Для этого обе плазмиды были линеаризованы по уникальным сайтам рестрикции и смешаны. После чего проводили трансформацию клеток E.coli штамма BJ5183полученной смесью.

В результате проведенной работы была получена pAd19-dlE1-dlE3, содержащая геном аденовируса человека 19 серотипа с делецией Е1 и Е3 областей.

Пример 2. Способ получения экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа.

Способ получения экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего константную последовательность с делецией Е1 и Е3областей,внутри которой находится экспрессионная кассета с геном вакцинного антигена, и вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о. состоит из следующих этапов.

Этап 1. Получение экспрессионной кассеты.

На первом этапе необходимо было разработать дизайн экспрессионной кассеты, которая содержит промотор, целевой ген и сигнал полиаденилирования. Кроме того, в состав экспрессионной кассеты может входить полилинкерная последовательность, необходимая для генно-инженерных манипуляций. В качестве промотора авторы использовали промотор цитомегаловируса человека (CMV). Однако, специалисту среднего уровня очевидно, что в качестве промотора в данной экспрессионной кассете может быть использован любой из известных промоторов, обеспечивающих экспрессию целевого гена.

В качестве целевого гена может быть использована последовательность любого вакцинного антигена, в том числе модифицированная. В данном примере авторы использовали оптимизированные последовательности гена S белка вируса SARS-CoV-2 (SEQIDNO:3), гена гемагглютинина вируса гриппа А H1N1(SEQIDNO:4), гена гемагглютинина вируса гриппа А H3N2(SEQIDNO:5), гена гемагглютинина вируса гриппа B/Yamagata(SEQIDNO:6) и гена гемагглютинина вируса гриппа B/Victoria(SEQIDNO:7).

В качестве сигнала полиаденилирования в данных примерах был использован сигнал позднего полиаденилирования SV40.

Фрагменты экспрессионной кассеты были синтезированы ЗАО «Евроген» и собраны в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» с помощью стандартных генно-инженерных методик. Таким образом, были получены следующие экспрессионные кассеты:

1) Экспрессионная кассета, которая в качестве целевого гена содержит генS белка вируса SARS-CoV-2 SEQIDNO:3.

2) Экспрессионная кассета, которая в качестве целевого гена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:4.

3) Экспрессионная кассета, которая в качестве целевого гена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:5.

4) Экспрессионная кассета, которая в качестве целевого гена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:6.

5) Экспрессионная кассета, которая в качестве целевого гена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:7.

Этап 2. Получение челночной плазмиды, содержащей экспрессионную кассету.

В работе использовали плазмиду pAd26-Ends (получена в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России),которая содержит участки, гомологичные геному аденовируса человека 26 серотипа.

На основе плазмиды pAd26-Ends генно-инженерным методом были получены конструкции, содержащие экспрессионные кассеты, полученные на предыдущем этапе, а также несущие участки, гомологичные геному аденовируса человека 26 серотипа. Таким образом, были получены плазмиды:

1) pArms-26-S-nCoVс экспрессионной кассетой, которая в качестве целевого гена содержит генS белка вируса SARS-CoV-2 SEQIDNO:3.

2) pArms-26-HA-H1с экспрессионной кассетой, которая в качестве целевого гена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:4.

3) pArms-26-HA-H3с экспрессионной кассетой, которая в качестве целевого гена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:5.

4) pArms-26-HA-B(Yamagata)с экспрессионной кассетой, которая в качестве целевого гена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:6.

5) pArms-26-HA-B(Victoria)с экспрессионной кассетой, которая в качестве целевого гена содержит ген гемагглютинина вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:7.

Этап 3. Получение плазмиды, содержащей геном аденовируса 19 серотипа и экспрессионную кассету с целевым геном.

Конструкцииp Arms-26-S-nCoV, pArms-26-HA-H1, pArms-26-HA-H3, pArms-26-HA-B(Yamagata), pArms-26-HA-B(Victoria), полученные на предыдущем этапе, линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии. Затем каждую плазмиду смешивали с лианеризованной плазмидой pAd19-dlE1-dlE3. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd19-dlE1-dlE3-S-nCoV, pAd19-dlE1-dlE3-HA-H1, pAd19-dlE1-dlE3-HA-H3, pAd19-dlE1-dlE3-HA-B(Yamagata),pAd19-dlE1-dlE3-HA-B(Victoria). Данные плазмиды помимо экспрессионной кассеты несут геном аденовируса человека 19 серотипа с делецией E1 и Е3-областей. Однако за счет того, что рекомбинация каждый раз происходила между двумя плазмидами, содержащими плечи гомологии от аденовирусов разных серотипов, образовалась вариабельная область. В данную область может попасть последовательность (разного размера) из челночной плазмиды, т.к. гомология в данной области ниже 100%.При получении каждого экспрессионного вектора с новым целевым геном данная область может меняться.

Этап 4. Получение рекомбинантного аденовируса.

На последнем этапе плазмиды pAd19-dlE1-dlE3-S-nCoV, pAd19-dlE1-dlE3-HA-H1, pAd19-dlE1-dlE3-HA-H3, pAd19-dlE1-dlE3-HA-B(Yamagata),pAd19-dlE1-dlE3-HA-B(Victoria) гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.

В результате был получен экспрессионный вектор, на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащий константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей (SEQIDNO:1), вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о. и экспрессионную кассету с целевым геном S белка вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO:3 (Ad19-S-nCoV), или геном гемагглютинина вируса гриппа А H1N1 SEQ ID NO:4 (Ad19-HA-H1), или геном гемагглютинина вируса гриппа А H3N2 SEQ ID NO:5 (Ad19-HA-H3), или геном гемагглютинина вируса гриппа B/Yamagata SEQ ID NO:6 (Ad19-HA-B(Yamagata)), или геном гемагглютинина вируса гриппа B/Victoria SEQ ID NO:7 (Ad19-HA-B(Victoria)).

Пример 3. Оценка подлинности полученных вариантов разработанного экспрессионного вектора.

Для проверки подлинности полученных вариантов разработанного экспрессионного вектора использовали метод ПЦР. Для каждого образца вируса использовали праймеры, комплементарные фрагменту генома аденовируса, и уникальные праймеры на целевой ген:

1) образец ДНК: Ad19-S-nCoV

праймеры, фланкирующие участок векторной части экспрессионного вектора:

hexon19-прямой: AGAAACAGCCGATAATCCTCC

hexon19-обратный: ATCGATATTGTCACCAGTTTTAAG

праймеры, фланкирующие участок гена Sбелка SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилированияSV40:

Nov-S-F AAGAATTTCACCACCGCTCCA

SV40-R GTGGTATGGCTGATTATGATC

Результаты ПЦР анализа представлены на фиг.5.

2) образец ДНК: Ad19-HA-H1

hexon19-прямой: AGAAACAGCCGATAATCCTCC

hexon19-обратный: ATCGATATTGTCACCAGTTTTAAG

праймеры, фланкирующие участок гена гемагглютинина вируса гриппа гемагглютинина вируса гриппа H1N1:

hexon19-прямой: AGAAACAGCCGATAATCCTCC

hexon19-обратный: ATCGATATTGTCACCAGTTTTAAG

H1-прямой GGGCATTCACCATCCTCC

H1-обратный CAGGTTTCCAGTTGCTTCG

Результаты ПЦР анализа представлены на фиг.6-7.

3) Образец ДНК: Ad19-HA-H3

hexon19-прямой: AGAAACAGCCGATAATCCTCC

hexon19-обратный: ATCGATATTGTCACCAGTTTTAAG

H3-прямой: TCCCGAGAAACAGACCCG

H3-обратный: GCCGATTCAGCTTCCCAT

Результаты ПЦР анализа представлены на фиг.6-8.

4) Образец ДНК: Ad19-HA-B(Yamagata)

hexon19-прямой: AGAAACAGCCGATAATCCTCC

hexon19-обратный: ATCGATATTGTCACCAGTTTTAAG

B-PH-прямой: CTTGGACAGGATTGCTGCA

B-PH-обратный: TCTGCTCACCATGTAGACG

Результаты ПЦР анализа представлены на фиг.6-9.

5) Ad19-HA-B(Victoria)

hexon19-прямой: AGAAACAGCCGATAATCCTCC

hexon19-обратный: ATCGATATTGTCACCAGTTTTAAG

B-aus-прямой: TCTGCGGGCTGATACAATAAG

B-aus-обратный: GCTAAATTCTCCTGCATCAAAG

Для проведения ПЦР использовали набор 5X Screen Mix-HS (Евроген, Россия). Готовили реакционную смесь из расчета для 1 пробы: 5-кратная смесь (Евроген, Россия) 4 мкл, по 0,1 мкл каждого праймера, 14,8 мкл деионизированной воды, 1 мкл образца ДНК. ПЦР проводили в амплификаторе Bio-Rad T100 Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, США). Продукты амплификации анализировали в горизонтальном гель электрофорезе с помощью системы детектирования гелей Gel-Doc EZ Imager (Bio-Rad, США). Для определения молекулярного веса фрагментов ДНК использовали маркер молекулярного веса 1 kb DNA Ladder (Евроген, Россия).

Как видно из полученных данных в каждом экспериментальном образце были обнаружена ДНК аденовируса человека 19 серотипа и целевой ген.

Таким образом, результаты эксперимента подтверждают получение экспрессионных векторов на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о. и экспрессионную кассету с целевым геном.

Пример 4. Оценка иммуногенности разработанного экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном S белка вируса SARS;вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о.

Целью данного эксперимента являлось определение способности разработанного вектора на основе аденовируса человека 19 серотипа, содержащего: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном S белка вируса SARS; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о. (Ad19-S-nCov), индуцировать развитие гуморального иммунного ответа у млекопитающих.

В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против Sбелка вируса SARS через 21 день после однократной внутримышечной иммунизации животных Ad19-S-nCov мышей линии C57BL/6, самки 18г. Все животные были разделены на 7 групп по 6 животных, которым внутримышечно вводили:

1) Ad19-S-nCov10⁸БОЕ/мышь

2) Ad19-S-nCov 10⁹БОЕ/мышь

3) Ad19-S-nCov 10¹⁰БОЕ/мышь

4) Ad19-null 10⁸БОЕ/мышь

5) Ad19-null 10⁹БОЕ/мышь

6) Ad19-null 10¹⁰БОЕ/мышь

7) фосфатно-солевой буфер

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:

1) Белок (S) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.

2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5% молоком, растворенном в TPBS в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.

3) Методом 2-кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.

4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.

8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером

10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 1.

Группа	Титр антител
Ad19-S-nCov 10⁸БОЕ/мышь	713
Ad19-S-nCov 10⁹БОЕ/мышь	2851
Ad19-S-nCov 10¹⁰БОЕ/мышь	32254
Ad19-null 10⁸БОЕ/мышь	0
Ad19-null 10⁹БОЕ/мышь	0
Ad19-null 10¹⁰БОЕ/мышь	0
фосфатно-солевой буфер	0

Результаты эксперимента показали, что разработанный экспрессионный вектор, на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о. и экспрессионную кассету с геном S белка вируса SARS-CoV2, введенный в организм млекопитающего, индуцирует гуморальный иммунный ответ к Sбелку SARS-CoV-2 во всем диапазоне выбранных доз. При этом, очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.

Пример 5. Оценка иммуногенности разработанного экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа А H1N1; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о.

Целью данного эксперимента являлось определение способности разработанного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа А H1N1; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о.(Ad19-HA-H1), индуцировать развитие гуморального иммунного ответа у млекопитающих.

В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против гемагглютинина вируса гриппа А H1N1 через 21 день после однократной внутримышечной иммунизации животных Ad19-HA-H1мышей линии C57BL/6, самки 18г. Все животные были разделены на 7 групп по 6 животных, которым внутримышечно вводили:

1) Ad19-HA-H1,10⁸БОЕ/мышь

2) Ad19-HA-H1, 10⁹БОЕ/мышь

3) Ad19-HA-H1, 10¹⁰БОЕ/мышь

4) Ad19-null, 10⁸БОЕ/мышь

5) Ad19-null, 10⁹БОЕ/мышь

6) Ad19-null, 10¹⁰БОЕ/мышь

7) фосфатно-солевой буфер

1) Гемагглютинин вируса гриппа А H1N1 адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Титр антител кгемагглютинину вируса гриппа А H1N1 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 2.

Группа	Титр антител
Ad19-HA-H1 10⁸БОЕ/мышь	504
Ad19-HA-H1 10⁹БОЕ/мышь	1600
Ad19-HA-H1 10¹⁰БОЕ/мышь	28735
Ad19-null 10⁸БОЕ/мышь	0
Ad19-null 10⁹БОЕ/мышь	0
Ad19-null 10¹⁰БОЕ/мышь	0
фосфатно-солевой буфер	0

Результаты эксперимента показали, что разработанный экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащий константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа А H1N1, и вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о., введенный в организм млекопитающего, индуцирует гуморальный иммунный ответ к гемагглютинину вируса гриппа А H1N1 во всем диапазоне выбранных доз. При этом очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.

Пример 6. Оценка иммуногенности разработанного экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа А H3N2; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о.

Целью данного эксперимента являлось определение способности разработанного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа А H3N2; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о.(Ad19-HA-H3), индуцировать развитие гуморального иммунного ответа у млекопитающих.

В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против гемагглютинина вируса гриппа А H3N2 через 21 день после однократной внутримышечной иммунизации животных экспрессионным вектором Ad19-HA-H3мышей линии C57BL/6, самки 18г. Все животные были разделены на 7 групп по 5 животных, которым внутримышечно вводили:

1) Ad19-HA-H3,10⁸БОЕ/мышь

2) Ad19-HA-H3,10⁹БОЕ/мышь

3) Ad19-HA-H3, 10¹⁰БОЕ/мышь

4) Ad19-null, 10⁸БОЕ/мышь

5) Ad19-null, 10⁹БОЕ/мышь

6) Ad19-null, 10¹⁰БОЕ/мышь

7) фосфатно-солевой буфер

1) Гемагглютинин вируса гриппа А H3N2 адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.

3) Методом 2-хкратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Титр антител к гемагглютинину вируса гриппа А H3N2 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 3.

Группа	Титр антител
Ad19-HA-H3 10⁸БОЕ/мышь	2016
Ad19-HA-H3 10⁹БОЕ/мышь	5080
Ad19-HA-H3 10¹⁰БОЕ/мышь	36204
Ad19-null 10⁸БОЕ/мышь	0
Ad19-null 10⁹БОЕ/мышь	0
Ad19-null 10¹⁰БОЕ/мышь	0
фосфатно-солевой буфер	0

Результаты эксперимента показали, что разработанный экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащий константную последовательность с делецией Е1 и Е3областей, внутри которой находится экспрессионная кассетас геном гемагглютинина вируса гриппа А H3N2, и вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о., введенный в организм млекопитающего, индуцирует гуморальный иммунный ответ к гемагглютинину вируса гриппа А H3N2 во всем диапазоне выбранных доз. При этом очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.

Пример 7. Оценка иммуногенности разработанного экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа BYamagata; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о.

Целью данного эксперимента являлось определение способности разработанного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа BYamagata; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о. (Ad19-HA-B(Yamagata)), индуцировать развитие гуморального иммунного ответа у млекопитающих.

В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против гемагглютинина вируса гриппа B/Yamagataчерез 21 день после однократной внутримышечной иммунизации животных экспрессионным вектором Ad19-HA-B(Yamagata)мышей линии C57BL/6, самки 18г. Все животные были разделены на 7 групп по 6 животных, которым внутримышечно вводили:

1) Ad19-HA-B(Yamagata),10⁸БОЕ/мышь

2) Ad19-HA-B(Yamagata),10⁹БОЕ/мышь

3) Ad19-HA-B(Yamagata), 10¹⁰БОЕ/мышь

4) Ad19-null, 10⁸БОЕ/мышь

5) Ad19-null, 10⁹БОЕ/мышь

6) Ad19-null, 10¹⁰БОЕ/мышь

7) фосфатно-солевой буфер

1) Гемагглютинин вируса гриппа B/Yamagata адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Титр антител к гемагглютинину вируса гриппа B/Yamagataв сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 4.

Группа	Титр антител
Ad19-HA-B(Yamagata)10⁸БОЕ/мышь	283
Ad19-HA-B(Yamagata)10⁹БОЕ/мышь	2263
Ad19-HA-B(Yamagata)10¹⁰БОЕ/мышь	10159
Ad19-null 10⁸БОЕ/мышь	0
Ad19-null 10⁹БОЕ/мышь	0
Ad19-null 10¹⁰БОЕ/мышь	0
фосфатно-солевой буфер	0

Результаты эксперимента показали, что разработанный экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащий константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа BYamagata, и вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о., введенный в организм млекопитающего, индуцирует гуморальный иммунный ответ к гемагглютинину вируса гриппа BYamagata во всем диапазоне выбранных доз. При этом очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.

Пример 8. Оценка иммуногенности разработанного экспрессионного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа BVictoria; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о.

Целью данного эксперимента являлось определение способности разработанного вектора на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащего: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа BVictoria; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о. (Ad19-HA-B(Victoria)), индуцировать развитие гуморального иммунного ответа у млекопитающих.

В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против гемагглютинина вируса гриппа B/Victoria через 21 день после однократной внутримышечной иммунизации животных экспрессионным вектором Ad19-HA-B (Victoria) мышей линии C57BL/6, самки 18г. Все животные были разделены на 7 групп по 6 животных, которым внутримышечно вводили:

1) Ad19-HA-B(Victoria),10⁸БОЕ/мышь

2) Ad19-HA-B(Victoria),10⁹БОЕ/мышь

3) Ad19-HA-B(Victoria), 10¹⁰БОЕ/мышь

4) Ad19-null, 10⁸БОЕ/мышь

5) Ad19-null, 10⁹БОЕ/мышь

6) Ad19-null, 10¹⁰БОЕ/мышь

7) фосфатно-солевой буфер

1) Гемагглютинин вируса гриппа B/Victoriaадсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.

Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Титр антител к гемагглютинину вируса гриппа B/Victoriaв сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 5.

Группа	Титр антител
Ad19-HA-B(Victoria)10⁸БОЕ/мышь	566
Ad19-HA-B(Victoria)10⁹БОЕ/мышь	2016
Ad19-HA-B(Victoria) 10¹⁰БОЕ/мышь	20319
Ad19-null 10⁸БОЕ/мышь	0
Ad19-null 10⁹БОЕ/мышь	0
Ad19-null 10¹⁰БОЕ/мышь	0
фосфатно-солевой буфер	0

Результаты эксперимента показали, что разработанный экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащий константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа BVictoria, и вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о., введенный в организм млекопитающего, индуцирует гуморальный иммунный ответ к гемагглютинину вируса гриппа BVictoria во всем диапазоне выбранных доз. При этом очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.

Пример 9. Проверка безопасности разработанных вариантов экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 19 серотипа.

Целью данного эксперимента являлась проверка токсичности разработанного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 19 серотипа при однократном внутримышечном введении (острая токсичность) на мышах.

В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.

Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 10⁸в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.

В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы средства:

10⁹в.ч. - увеличенная эффективная доза (ЭД) для мышей в 20 раз;

10¹⁰в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;

10¹¹в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;

Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:

1) Ad19-S-nCov,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

2) Ad19-S-nCov,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

3) Ad19-S-nCov,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

4) Ad19-HA-H1,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

5) Ad19-HA-H1,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

6) Ad19-HA-H1,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

7) Ad19-HA-H3,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

8) Ad19-HA-H3,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

9) Ad19-HA-H3,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

10) Ad19-HA-B(Yamagata),10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

11) Ad19-HA-B(Yamagata),10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

12) Ad19-HA-B(Yamagata),10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

13) Ad19-HA-B(Victoria),10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

14) Ad19-HA-B(Victoria),10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

15) Ad19-HA-B(Victoria),10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

16) Фосфатно-солевой буферный раствор, 20 мышей.

Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.

Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.

На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.

Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.

При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Cтатистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.

Таким образом, в ходе проведенной работы определяли безопасность разработанных средств путем оценки острой токсичности. Исходя из полученных данных, можно заключить, что все исследованные варианты экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 19 серотипа безопасны.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают способность разработанного экспрессионного вектора на основе аденовируса человека 19 серотипа индуцировать гуморальный ответ против целевого антигена и его промышленную применимость для создания вакцин против различных инфекционных заболеваний.

--->

Список последовательностей

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Ad19.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-04-15">

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное

бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр

эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи"

Министерства здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>The National Research Center for Epidemiology and

Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the

Ministry of Health of the Russian Federation </ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Экспрессионный вектор на основе

аденовируса человека 19 серотипа и способ его

применения</InventionTitle>

<INSDSeq_length>536</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..536</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>catcatcaataatataccccacaaagtaaacaaaagttaatatgcaaatgag

cttttgaattttaacggttttggggcggagccaacgctgattggacgagaaacggtgatgcaaatgacgt

cacgacgcacggctaacggtcgccgcggaggcgtggcctagcccggaagcaagtcgcggggctgatgacg

tataaaaaagcggactttagacccggaaacggccgattttcccgcggccacgcccggatatgaggtaatt

ctgggcggatgcaagtgaaattaggtcattttggcgcgaaaactgaatgaggaagtgaaaagcgaaaaat

accggtccctcccagggcggaatatttaccgagggccgagagactttgaccgattacgtgggggtttcga

ttgcggtgtttttttcgcgaatttccgcgtccgtgtcaaagtccggtgtttatgtcacagatcagctggt

ttaaacactgttaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccg</INSD

Seq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>26612</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..26612</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>aaggaaacgtatacctataaaggcgggtgtcttacgagggtctttttgcttt

tctgcagacatcatgaacgggactggcggggccttcgaaggggggctttttagcccttatttgacaaccc

gcctgccgggatgggccggagttcgtcagaatgtgatgggatcgacggtggatgggcgcccagtgcttcc

agcaaattcctcgaccatgacctacgcgaccgtggggaactcgtcgctcgacagcaccgccgcagccgcg

gcagccgcagccgccatgacagcgacgagactggcctcgagctacatgcccagcagcggtagtagcccct

ctgtgcccagttccatcatcgccgaggagaaactgctggccctgctggccgagctggaagccctgagccg

ccagctggccgccctgacccagcaggtgtccgagctccgcgaacagcagcagcagcaaaataaatgattc

aataaacacagattctgattcaaacagcaaagcatctttattatttattttttcgcgcgcggtaggccct

ggtccacctctcccgatcattgagagtgcggtggattttttccaggacccggtagaggtgggattggatg

ttgaggtacatgggcatgagcccgtcccggggatggaggtagcaccactgcatggcctcgtgctctgggg

tcgtgttgtagatgatccagtcatagcaggggcgctgggcgtggtgctggatgatgtccttgaggaggag

actgatggccacggggagccccttggtgtaggtgttggcaaagcggttgagctgggagggatgcatgcga

ggggagatgatgtgcagtttggcctggatcttgaggttggcgatgttgccgcccagatcccgcctggggt

tcatgttgtgcaggaccaccaggacggtgtagcccgtgcacttggggaacttatcatgcaacttggaagg

gaatgcgtggaagaatttggagacgcccttgtgcccgcccaggttttccatgcactcatccatgatgatg

gcgatgggcccgtgggctgcggctttggcaaagacgtttctggggtcagagacatcataattatgctcct

gggtgagatcatcataagacattttaatgaattttgggcggagggtgccagattgggggacgatggttcc

ctcgggccccggggcgaagttcccctcgcagatctgcatctcccaggctttcatctcggagggggggatc

atgtccacctgcggggcgatgaaaaaaacggtttccggggcgggggtgatgagctgcgaggagagcaggt

ttctcaacagctgggacttgccgcacccggtcgggccgtagatgaccccgatgacgggttgcaggtggta

gttcaaggacatgcagctgccgtcgtcccggaggaggggggccacctcgttgagcatgtctctaacttgg

aggttttcccggacgagctcgccgaggaggcggtccccgcccagcgagaggagctcttgcagggaagcaa

agtttttcaggggcttgagtccgtcggccatgggcatcttggcgagggtctgcgagaggagttcgagacg

gtcccagagctcggtgacgtgctctacggcatctcgatccagcagacttcctcgtttcgggggttgggac

gactgcgactgtagggcacgagacgatgggcgtccagcgcggccagcgtcatgtccttccagggtctcag

ggtccgcgtgagggtggtctccgtcacggtgaaggggtgggcccctggctgggcgcttgcaagggtgcgc

ttgagacttatcctgctggtgctgaaacgggcacggtcttcgccctgcgcgtcggcgagatagcagttga

ccatgagctcgtagttgagggcctcggcggcgtggcccttggcgcggagcttgcccttggaagagcgtcc

gcaggcgggacagaggagggattgcagggcgtagagcttgggcgcaagaaagaccgactcgggagcgaaa

gcgtccgctccgcagtgggcgcagacggtctcgcactcgacgagccaggtgagctcgggctgctcggggt

caaaaaccagttttcccccgttctttttgatgcgcttcttacctcgcgtctccatgagtctgtgtccgcg

ctcggtgacaaacaggctgtcggtgtccccgtagacggacttgattggcctgtcctgcaggggcgtcccg

cggtcctcctcgtagagaaactcggaccactctgagacaaaggcgcgcgtccacgccaagacaaaggagg

ccacgtgcgaggggtagcggtcgttgtccaccagggggtccaccttttccaccgtgtgcagacacatgtc

cccctcctccgcatccaagaaggtgattggcttgtaggtgtaggccacgtgaccgggggtccccgacggg

ggggtataaaagggggcgggtctgtgctcgtcctcactctcttccgcgtcgctgtccacgagcgccagct

gttggggtaggtattccctctcgagagcgggcatgacctcggcactcaggttgtcagtttctagaaacga

ggaggatttgatgttggcttgccctgccgcgatgctttttaggagactttcatccatctggtcagaaaag

actatttttttattgtcaagcttggtggcaaaggagccatagagggcgttggagagaagcttggcgatgg

atctcatggtctgatttttgtcacggtcggcgcgctccttggccgcgatgttgagctggacatactcgcg

cgcgacacacttccattcggggaagacggtggtgcgctcgtcaggcacgatcctgacgcgccagccgcgg

ttatgcagggtgaccaggtccacgctggtggccacctcgccgcgcaggggctcgttggtccagcagagtc

tgccgcccttgcgcgagcagaacggtggcagcacatcaagcagatgctcgtcaggggggtccgcatcgat

ggtgaagatgccgggacagagttccttgtcaaaatagtctatttttgaggatgcatcatccaaggccatc

tgccactcgcgggcggccattgctcgctcgtaggggttgaggggcggaccccagggcatgggatgcgtga

gggcggaggcgtacatgccgcaaatgtcgtagacatagatgggctccgagaggatgccgatgtaggtggg

ataacagcgccccccgcggatgctggcgcgcacgtagtcatacaactcgtgcgagggggccaagaaggcg

gggccgagattggtgcgctggggctgctcggcgcggaagacaatctggcgaaagatggcgtgcgagttgg

aggagatggtgggccgttggaagatgttaaagtgggcgtggggcaagcggaccgagtcgcggatgaagtg

cgcgtaggagtcttgcagcttggcgacgagctcggcggtgacgaggacgtccatggcgcagtagtccagc

gtttcgcggatgatgtcataacccgcctctcctttcttctcccacagctcgcggttgagggcgtattcct

cgtcatccttccagtactcccggagcgggaatcctagatcgtccgcacggtaagagcccagcatgtagaa

atggttcacggccttgtagggacagcagcccttctccacggggagggcgtaagcttgtgcggccttgcgg

agcgaggtgtgcgtcagggcgaaggtgtccctgaccatgactttcaagaactggtacttgaaatccgagt

cgtcgcagccgccgtgctcccatagctcgaaatcggtgcgcttcttcgagagggggttaggcagagcgaa

agtgacgtcattgaagagaatcttgcctgctcgcggcatgaaattgcgggtgatgcggaaagggcccggg

acggaggctcggttgttgatgacctgggcggcgaggacgatctcgtcgaagccgttgatgttgtgcccga

cgatgtagagttccatgaatcgcgggcggcctttgatgtgcggcagctttttgagctcctcgtaggtgag

gtcctcggggcattgcaggccgtgctgctcgagcgcccattcctggagatgtgggttggcttgcatgaag

gaagcccagagctcgcgggccatgagggtctggagctcgtcgcgaaagaggcggaactgctggcccacgg

ccatcttttcgggtgtgacgcagtagaaggtgagggggtcccgctcccagcgatcccagcgtaagcgcgc

ggctagatcgcgagcaagggcgaccagctctgggtcccccgagaatttcatgaccagcatgaaggggacg

agctgcttgccgaaggaccccatccaggtgtaggtttctacatcgtaggtgacaaagagccgctccgtgc

gaggatgagagccgattgggaagaactggatttcctgccaccagttggacgagtggctgttgatgtgatg

aaagtagaaatcccgccggcgaaccgagcactcgtgctgatgcttgtaaaagcgtccgcagtactcgcag

cgctgcacgggctgtacctcatccacgagatacacagcgcgtcccttgaggaggaacttcaggagtggcg

gccctggctggtggttttcatgttcgcctgcgtgggactcaccctggggctcctcgaggacggagaggct

gacgagcccgcgcgggagccaggtccagatctcggcgcggcgggggcggagagcgaagacgagggcgcgc

agttgggagctgtccatggtgtcgcggagatccaggtccgggggcagggttctgaggttgacctcgtaga

ggcgggtgagggcgtgcttgagatgcagatggtacttgatttctacgggtgagttggtggccgtgtccac

gcattgcatgagcccgtagctgcgcggggccacgaccgtgccgcggtgcgcttttagaagcggtgtcgcg

gacgcgctcccggcggcagcggcggttccggccccgcgggcaggggcggcagaggcacgtcggcgtggcg

ctcgggcaggtcccggtgttgcgccctgagagcgctggcgtgcgcgacgacgcggcggttgacatcctgg

atctgccgcctctgcgtgaagaccactggccccgtgactttgaacctgaaagacagttcaacagaatcaa

tctcggcgtcattgacggcggcctgacgcaggatctcttgcacgtcgcccgagttgtcctggtaggcgat

ctcggacatgaactgctcgatctcctcctcctggagatcgccgcgacccgcgcgctccacggtggcggcg

aggtcattcgagatgcgacccatgagctgcgagaaggcgcccaggccgctctcgttccagacgcggctgt

agaccacgtccccgtcggcgtcgcgcgcgcgcatgaccacctgcgcgaggttgagctccacgtgccgcgt

gaagacggcgtagttgcgcaggcgctggaagaggtagttgagggtggtggcgatgtgctcggtgacgaag

aagtacatgatccagcggcgcaggggcatctcgctgatgtcgccaatggcctccagcctttccatggcct

cgtagaaatccacggcgaagttgaaaaactgggcgttgcgggccgagaccgtgagctcgtcttccaggag

ccgaatgagctcggcgatggtggcgcgcacctcgcgctcgaaatccccgggggcctcctcctcctcttcc

tcttcttccatgacgacctcttcttctatttcttcctctgggggcggtggtggtggcggggcccgacgac

gacggcgacgcaccgggagacggtcgacgaagcgctcgatcatctccccgcggcggcgacgcatggtttc

ggtgacggcgcgaccccgttcgcgaggacgcagcgtgaagacgccgccggtcatctcccggtaatggggt

gggtccccgttgggcagcgatagggcgctgacgatgcatcttatcaattgcggtgtaggggacgtgagcg

cgtcgagatcgaccggatcggagaatctttcgaggaaagcgtctagccaatcgcagtcgcaaggtaagct

caaacacgtagcagccctgtggacgctgttagaattgcggttgctgatgatgtaattgaagtaggcgttt

ttgaggcggcggatggtggcgaggaggaccaggtccttgggtcccgcttgctggatgcggagccgctcgg

ccatgccccaggcctggccctgacaccggctcaggttcttgtagtagtcatgcatgagcctctcaatgtc

atcactggcggaggtggagtcttccatgcgggtgaccccgacgcccctgagcggctgcacgagcgccagg

tcggcgacgacgcgctcggcgaggatggcctgttgcacgcgggtgagggtgtcctggaagtcgtccatgt

cgacgaagcggtggtaggccccggtattgatggtgtaggtgcagttggccatgagcgaccagttgacggt

ctgcaggccgggctgcacgacctcggagtacctgagccgcgagaaggcgcgcgagtcgaagacgtagtcg

ttgcaggtgcgcacgaggtactggtagccgactaggaagtgcggcggcggctggcggtagagcggccagc

gctgggtggccggcgcgcccggggccaggtcctcgagcatgaggcggtggtagccgtagaggtagcggga

catccaggtgatgccggcggcggtggtggaggcgcgcgggaactcgcggacgcggttccagatgttgcgc

agcggcaggaaatagtccatggtcggcacggtctggccggtgagacgcgcgcagtcattgacgctctaga

ggcaaaaacgaaagcggttgagcgggctcttcctccgtagcctggcggaacgcaaacgggttaggtcgcg

tgtgtaccccggttcgagtcccctcgaatcaggctggagccgcgactaacgtggtattggcactcccgtc

tcgacccgagcccgatagccgccaggatacggcggagagccctttttgccggccgcggggagtcgctaga

cttgaaagcggccgaaaaccctgccgggtagtggctcgcgcccgtagtctggagaagcatcgccagggtt

gagtcgcggcagaacccggttcgaggacggccgcggcgagcgggacttggtcaccccgccgatttaaaga

cccacagccagccgacttctccagttacgggagcgagcccccttttttctttttgccagatgcatcccgt

cctgcgccaaatgcgtcccacccccccggcgaccaccgcgaccgcggccgtagcaggcgccggcgctagc

cagccaccacagacagagatggacttggaagagggcgaagggctggcgagactgggggcgccgtccccgg

agcgacatccccgcgtgcagctgcagaaggacgtgcgcccggcgtacgtgcctgcgcagaacctgttcag

ggaccgcagcggggaggagcccgaggagatgcgcgactgccggtttcgggcgggcagggagctgcgcgag

ggcctggaccgccagcgcgtgctgcgcgacgaggatttcgagccgaacgagcagacggggatcagccccg

cgcgcgctcacgtggcggcggccaacctggtgacggcctacgagcagacggtgaagcaggagcgcaactt

ccaaaagagtttcaacaaccatgtgcgcacgctgatcgcgcgcgaggaggtggccctgggcctgatgcac

ctgtgggacctggcggaggccatcgtgcagaacccggacagcaagcctctgacggcgcagctgttcctgg

tggtgcagcacagcagggacaacgaggcgttcagggaggcgctgctgaacattgccgagcccgagggtcg

ctggctgctggagctgatcaacatcttgcagagcatcgtagtgcaggagcgcagcctgagcctggccgag

aaggtggcggcgatcaactactcggtgctgagcctgggcaagttttacgcgcgcaagatttacaagacgc

cgtacgtgcccatagacaaggaggtgaagatagacagcttttacatgcgtatggcgctcaaggtgttgac

gctgagcgacgacctgggcgtgtatcgcaacgaccgcatccacaaggccgtgagcacgagccggcggcgc

gagctgagcgaccgtgagctgatgctgagtctgcgccgggcgctggtagggggcgccgccggcggcgagg

agtcctacttcgacatgggggcggacctgcattggcagccgagccggcgcgccttggaggccgcctacgg

tccagaggacttggatgaggaagaggaagaggaggaggatgcacccgctgcggggtactgacgcctccgt

gatgtgtttttagatgtcccagcaagccccggaccccgccataagggcggcgctgcaaagccagccgtcc

ggtctagcatcggacgactgggaggccgcgatgcaacgcatcatggccctgacgacccgcaaccccgagt

cctttagacaacagccgcaggccaacagactctcggccattctggaggcggtggtcccctctcggaccaa

ccccacgcacgagaaggtgctggcgatcgtgaacgcgctggcggagaacaaggccatccgtcccgacgag

gccgggctggtgtacaacgccctgctggagcgcgtgggccgctacaacagcacgaacgtgcagtccaacc

tggaccggctggtgacggacgtgcgcgaggccgtggcgcagcgcgagcggttcaagaacgagggcctggg

ctcgctggtggcgctgaacgccttcctggcgacgcagccggcgaacgtgccgcgcgggcaggacgattac

accaactttatcagcgcgctgcggctgatggtgactgaggtgccccagagcgaggtgtaccagtcgggcc

cggactactttttccagacgagccggcagggcttgcagacggtgaacctgagtcaggctttcaagaacct

gcgcgggttgtggggcgtgcaggcgcccgtgggcgaccggtcgacggtgagcagcttgctgacgcccaac

tcgcggctgttgctgctgcttatcgcgcccttcaccgacagcggcagcgtgaaccgcaactcgtacctgg

gccacctgctgacgctgtaccgcgaggccataggccaggcgcaggtggacgagcagaccttccaggagat

cacgagcgtgagtcgcgcgctgggccaaaacgacaccgacagtctgagggccaccctgaacttcttgctg

accaatagacagcagaagatcccggcgcagtacgcgctgtcggccgaggaggaaaggatcctgagatatg

tgcagcagagcgtagggcttttcctgatgcaggagggcgccacccccagcgccgcgctggacatgaccgc

gcgcaacatggaacctagcatgtacgccgccaaccggccgttcatcaataagctgatggactacctgcac

cgcgcggcgtccatgaactcggactactttacaaacgccatcctgaacccgcactggctcccgccgccgg

ggttctacacgggcgagtacgacatgcccgaccccaacgacgggttcctgtgggacgacgtggacagcgc

ggtgttctccccgaccttgcaaaagcgccaggaggcggtacgcacgcccgcgagcgagggcgcggtgggt

cggagcccctttcctagcttagggagtttgcatagcttgccgggctcggtgaacagcggcagggtgagcc

ggccgcgcttgctgggcgaggacgagtacctgaacgactcgctgctgcagccgccacgggtcaagaacgc

catggccaataacgggatagagagtctggtggacaaactgaaccgctggaagacctacgctcaggaccat

agggacgcgcccgcgccgcggcgacagcgccacgaccggcagcggggcctggtgtgggacgacgaggact

cggccgacgatagcagcgtgttggacttgggcgggagcggtggggccaacccgttcgcgcatctgcagcc

caaactggggcggcggatgttttgaaatgcaaaataaaactcaccaaggccatagcgtgcgttctcttcc

ttgttagagatgaggcgcgcggtggtgtcttcctctcctcctccctcgtacgagagcgtgatggcgcagg

cgaccctggaggttccgtttgtgcctccgcggtatatggctcctacggagggcagaaacagcattcgtta

ctcggagctggctccgcagtacgacaccactcgcgtgtacttggtggacaacaagtcggcggacatcgct

tccctgaactaccaaaacgaccacagcaacttcctgaccacggtggtgcagaacaacgatttcacccccg

ccgaggccagcacgcagacgataaattttgacgagcggtcgcggtggggcggtgatctgaagaccattct

gcacaccaacatgcccaatgtgaacgagtacatgttcaccagcaagtttaaggcgcgggtgatggtgtct

aggaagcggccagagggggcgacagatgcaagtcaggatattttaaagtatgagtggtttgagtttaccc

tgcccgagggcaacttttccgagaccatgaccatagacctgatgaacaacgccatcttggaaaactactt

gcaagtggggcggcagaatggcgtgctggagagcgatatcggagtcaagtttgacagcaggaatttcaag

ctgggctgggacccggtgaccaagctggtgatgccaggggtctacacctacgaagccttccacccggacg

tggtgctgctgccgggctgcggggtggacttcacagagagccgcctgagcaacctcctgggcattcgcaa

gaagcaacctttccaagagggcttcagaatcatgtatgaggatctagaaggcggtaatatccccgctctc

ctggataccaaaaaatatctggatagcaagaaagaaattgaagatgcaaaacagaaagcggcccagccag

gtggcgagatcagaggagacagtgctgatactaaagctgcagaacaggcggctgaaaaagagctggttat

tgagcccatcgagcaagatgaaagcaagagaagctataatgtgatcaagggtacccatgacaccctgtac

cgaagttggtacctgtcctatacctacggggaccccgagaagggggtgcagtcgtggacgctgctcacca

ccccggacgtcacctgcggcgcggagcaagtctactggtcgctgccggacctcatgcaagaccccgtcac

cttccgctctacccagcaagtcagcaactaccctgtggtcggcgccgagctcatgcccttccgcgccaag

agcttttacaacgacctcgccgtctactcccagctcatccgcagctacacctccctcacccacgtcttca

accgcttccccgacaaccagatcctctgccgcccgcccgcgcccaccatcaccaccgtcagtgaaaacgt

gcctgctctcacagatcacgggacgcttccgctgcgcagcagtatccgcggagtccagcgagtgaccgtc

actgacgcccgtcgccgcacctgtccctacgtctacaaggccctgggcatagtcgcgccgcgcgtgctct

ccagtcgcaccttctaaaaaatgtctattctcatctcgcccagcaataacaccggctggggtcttactag

gcccagcaccatgtacggaggagccaagaagcgctcccagcagcaccccgtccgcgtacgcggccacttc

cgcgctccctggggcgcttacaagcgcgggcggactgccaccgccgccgccgtgcgcaccaccgtcgacg

acgtcatcgactcggtggtcgccgacgcgcgcaactatacccccgccccttcgaccgtggacgcggtcat

cgacagcgtggtggccgacgcgcgcgactatgccagacgcaagagccggcggcgacgaatcgccaggcgc

caccggagcacgcccgccatgcgcgccgctcgggctctgctgcgccgcgccagacgcacgggccgccggg

ccatgatgcgagccgcgcgtcgcgccgccgccgcgcccacccccgcaggcaggactcgcagacgagcggc

cgccgccgccgccgcggccatctctagcatgaccagacccaggcgcggaaacgtgtactgggtgcgcgac

tccgtcacgggcgtgcgcgtgcccgtgcgcacccgtcctcctcgtccctgatctaatgcttgtgtcctcc

cccgcaagcgacgatgtcaaagcgcaaaatcaaggaggagatgctccaggtcgtcgccccggagatttac

ggaccaccccaggcggaccagaaaccccgcaaaatcaagcgggttaaaaaaaaggatgaggtggacgagg

gggcagtagagtttgtgcgcgagttcgctccgcggcggcgcgtaaattggaaggggcgcagggtgcagcg

cgtgttgcggcccggcacggcggtggtgttcacgcccggcgagcggtcctcggtcaggagcaagcgtagc

tatgacgaggtgtacggcgacgacgacatcctggaccaggcggcggagcgggcgggcgagttcgcctacg

ggaagcggtcgcgcgaagaggagctgatctcgctgccgctggacgagagcaaccccacgccgagcctgaa

gcccgtgaccctgcagcaggtgctgccccaggcggtgctgctgccgagccgcggggtcaagcgcgagggc

gagagcatgtacccgaccatgcagatcatggtgcccaagcgccggcgcgtggaggacgtgctggacaccg

tgaaaatggatgtggagcccgaggtcaaggtgcgccccatcaagcaggtggcgccgggcctgggcgtgca

aaccgtggacattcagatccccaccgacatggatgtcgacaaaaaaccctcgaccagcatcgaggtgcaa

accgacccctggctcccagcctccaccgctaccacgtccacttctaccgccgccacggctaccgagcctc

ccaggaggcgaagatggggcgccgccagccggctgatgcccaactacgtgttgcatccttccattatccc

gacgccgggctaccgcggcacccggtactacgccagccgcaggcgcccagccagcaaacgccgccgccgc

accgccacccgccgccgtctgccccccgcccgcgtgcgccgcgtaaccacgcgccggggccgctcgctcg

ttctgcccaccgtgcgctaccaccccagcatcctttaatccgtgtgctgtgatactgttgcagagagatg

gctctcacttgccgcctgcgcatccccgttccgaattaccgaggaagatcccgccgcaggagaggcatgg

caggcagcggcctgaaccgccgccggcggcgggccatgcgcaggcgcctgagtggcggctttctgcccgc

gctcatccccataatcgcggcggccatcggcacgatcccgggcatagcttccgttgcgctgcaggcgtcg

cagcgccgttgatgtgcgaataaagcctctttagactctgacacacctggtcctgtatatttttagaatg

gaagacatcaattttgcgtccctggctccgcggcacggcacgcggccgttcatgggcacctggaacgaga

tcggcaccagccagctgaacgggggcgccttcaattggagcagtgtctggagcgggcttaaaaatttcgg

ctcgacgctccggacctatgggaacaaggcctggaatagtagcacggggcagttgttgagggaaaagctc

aaagaccagaacttccagcagaaggtggtggacggcctggcctcgggcattaacggggtggtggacatcg

cgaaccaggcagtgcagcgcgagataaacagccgtctggacccgcggccgcccacggtggtggagatgga

agatgcaactcttccgccgtcgaagggcgagaagcggccgcggccagatgcggaggagacgatcctgcag

gtggacgagccgccctcgtacgaggaggccgtgaaggccggcatgcccaccacgcgcatcatcgcgccac

tggccacgggtgtaatgaaacccgccacccttgacctgcctccaccacccacgcccgctccaccgaaggc

agctccggttgtgcagccccctccggtggcgaccgccgtgcgccgcgtccccgcccgccgccaggcccag

aactggcagagcacgctgcacagtattgtgggcctgggagtgaaaagtctgaagcgccgccgatgctatt

gagagagaggaaggaggacactaaagggagagcttaacttgtatgtgccttaccgccagagaacgcgcga

agatggccaccccctcgatgatgccgcagtgggcgtacatgcacatcgccgggcaggacgcctcggagta

cctgagcccgggtctggtgcagtttgcccgcgccaccgacacgtacttcagcctgggcaacaagtttagg

aaccccacggtggccccgacccacgatgtgaccacggaccggtcccagcgtctgacgctgcgcttcgtgc

ccgtggatcgcgaggacaccacgtactcgtacaaggcgcgcttcactctggccgtgggcgacaaccgggt

gctagacatggccagcacttactttgacatccgcggcgtcctggaccgcggtcccagcttcaaaccctac

tcgggcacggcttacaacagcctggcccccaagggcgcccccaactccagtcagtgggatgctcaagaaa

aaaatggacaaggaggaaatgacatggttaccaaaactcacacatttggtgtggctgctatgggaggaac

aaatattacaaaccagggtttgttaattggaactgaagaaacagccgataatcctccaaaggaaatcttt

gcagacaaattattccagccagaacctcaagtaggagaggaaaactggcaagacaccaatgcattctatg

gaggcagggctcttaagaaggaaactaaaatgaaaccatgctatggatcttatgctagaccaacaaacac

aagtggcggacaggctaagcttaaaactggtgacaatatcgatcctaccaaggatttcgacatagatctt

gctttcttcgatactcctggcggaaatcctccagcaggtggtagtggaacggaagaatacaaagcagaca

ttgttatgtacactgaaaatgtcaaccttgaaacacctgacactcatgtggtgtacaaaccaggcaaaga

ggatgaaagttctgaggccaacttggttcagcagtccatgcccaacagacccaactacattggcttcaga

gacaattttgtggggctcatgtattacaacagcactggcaacatgggtgtgctggctggtcaggcctctc

agttgaatgctgtggtggacttgcaagacagaaacacagagctgtcttaccagctcttgctagattctct

gggcgacagaaccaggtactttagcatgtggaactctgcggtggacagctatgatcccgacgtcaggatc

attgaaaatcacggtgtggaagatgaacttccaaactattgctttccattggatggctctggtaccaatg

ctgcctaccaaggtgtaaaggttcaagatggtgaagacggggataaagaaactgaatgggaaaaagatac

caaagtcgcagatcgtaaccaactgtgcaagggtaacatctttgccatggagatcaacctccaggccaac

ctgtggaagagttttctgtactcgaacgtggccttgtacctgcccgactcctacaagtacacgccggcca

acgtcacgctgcccgccaacaccaacacctacgagtacatgaacggccgcgtggtagccccctcgctggt

ggacgcatacgtcaacatcggtgcgcgctggtcgctggaccccatggacaacgtcaaccccttcaaccac

caccgcaacgctggcctgcgctaccgctccatgcttctgggcaacggccgctacgtgcccttccacatcc

aagtgccccaaaagttctttgccatcaagaacctgctcctgctccccggctcctacacctacgagtggaa

cttccgcaaggatgtcaacatgatcctgcagagttccctcggaaacgacctgcgcgttgacggcgcctcc

gtgcgctttgacagcgttaacctctacgccacattcttccccatggcgcacaacaccgcctccaccctgg

aagccatgctgcgcaacgacaccaacgaccagtccttcaacgactacctctcggccgccaacatgctcta

ccccatcccggccaaggccaccaacgtgcccatctccatcccctcgcgcaactgggccgccttccgaggc

tggagttttacccggctcaagaccaaggaaactccctccctcggctcgggtttcgacccctactttgtat

actctggctccatcccctatctcgacgggaccttctacctcaaccacaccttcaagaaggtctccatcat

gttcgactcctcggtcagctggcccggcaacgaccggctgctcacgccgaacgagttcgagatcaagcgc

agcgtcgacggggagggctacaatgtggcccaatgcaacatgaccaaggactggttcctcgtccagatgc

tctcccactacaacatcggctaccagggcttccatgtgcccgagggctacaaggaccgcatgtactcctt

cttccgcaacttccagcccatgagcaggcaggtggtcgatgagatcaactacaaggactacaaggccgtc

accctgcccttccagcacaacaactcgggcttcaccggctacctagcacccaccatgcgtcaggggcagc

cctaccccgccaacttcccctacccgctcattggctccaccgcagtgccctccgtcacccagaaaaagtt

cctctgcgacagggtcatgtggcgcatccccttctccagcaacttcatgtccatgggcgccctcaccgac

ctgggtcagaacatgctctacgccaactcggcccacgcgctcgacatgaccttcgaggtggaccccatgg

atgagcccaccctcctctatcttctcttcgaagttttcgacgtggtcagagtgcaccagccgcaccgcgg

cgtcatcgaggccgtctacctgcgcacgcccttctccgccggcaacgccaccacataagcatgagcggct

ccagcgaaagagagctcgcggccatcgtgcgcgacctgggctgcgggccctactttttgggcacccacga

caagcgcttcccgggcttcctcgccggcgacaagctggcctgcgccatcgtcaacacggccggccgcgag

accgggggcgtgcactggctcgccttcggctggaacccgcgctcgcgcacctgctacatgttcgacccat

ttgggttctcggaccgccggctcaaacagatttacagcttcgagtacgaggccatgctgcgccgcagcgc

cctggcctcctcgcccgaccgctgtctcagcctcgagcagtccacccagaccgtgcaggggcccgactcc

gccgcctgcggacttttctgttgcatgttcttgcatgctttcgtgcactggcccgaccaacccatggacg

ggaaccccaccatgaacttgctgacgggggtgcccaacggcatgctacagtcgccacaggtgctgcccac

cctcaggcgcaaccaggaggagctctaccgcttcctcgcgcgccactccccttactttcgctcccaccgc

gccgccatcgaacacgccaccgcttttgacaaaatgaaacaactgcgtgtatctcaataaacagcacttt

tattttacatgcactggagtatatgcaagttatttaaaagtcgaaggggttatcccgcttgtcgttgtgc

gccgcgctggggagggccacgttgcggtactggaacttgggctgccacttgaactcggggatcaccagtt

tgggaacagcaatctcggggaaggtctcgctccacatgcgccggctcatctgcagggcgcccagcatgtc

aggcgcggagatcttgaaatcacagttggggccggtgctctgcgcgcgcgagttgcggtacacggggttg

cagcactggaacaccatcagactggggtacttcacactggccagcacgctcttgtcgctgatctgatcct

tgtccaggtcctcggcattgcttaggccaaacggggtcatcttgcacagctggcggcccaagaagggcac

gctctgaggcttgtggttacactcgcagtgcacgggcatcagcatcatccccgcgccgcgctgcatattc

gggtagagggccttgacaaaagccgagatctgcttgaaagcttgctgggccttggccccctcgctgaaaa

acagaccgcagctcttcccgctgaactggttattcccgcatccggcatcctgcacgcagcagcgcgcgtc

atggctggtcagttgcaccacgcttcttccccagcggttctgggtcaccttggccttgctgggttgctcc

ttcagcgcgcgctgtccgttctcgctggtcacatccatctccaccacgtggtccttgtggatcatcaccg

ttccatgcagacacttgagctggccttccacctcggtgcagccgtgatcccacaggacgcatccggtgca

ctcccagttcttgtgcgcgatcccgctgtgactgaagatgtaaccttgcaacatgcggcccatcacggtg

ctaaatgatttactggtgctgaaggtcagttgcaggccgcgggcctcctcgttcatccaggtctgacaca

tcttctggaagatctcggtctgctcgggcatgagcttgtaggcatcgcgcaggccgctgtcgacgcggta

gcgttccatcagcacgttcatggtatccatgcccttctcccaggacgagaccagaggcaaactcaggggg

ttgcgcacgttcaggataccgggggtcgcgggctcgacgatgcgttttccgtccttgccttccttcaaca

gaaccggaggctggctgaatcccactcccacgatcacggcttcttcctggggcatttcttcgtcggggtc

cgtcttggtcacatgcttggtctttctggcttgcttcttttttggagggctgtccacggggaccacgtcc

tcctcggaagacccggagcccacccgctgatactttcggcgcttggtgggcagaggaggtggcggcgagg

ggctcctctcctgctccggcggatagcgcgccgacccgtggccccggggcggagtggcctctcgctccat

gaaccggcgcacgtcctgactgccgccggccattgtttcctaggggaagatggaggagcagccgcgtaag

caggagcaggaggaggacttaaccacccacaagcaacccaaaatcgagcaggacctgggcttcgaagagc

cggctcgtctagaacccccacaggatgaacaggagcacgagcaagacgcaggccaggaggagaccgacgc

tgggctcaagcatggctacctgggaggagaggaggatgtgctgctgaaacacctgcagcgccagtccctc

atcctccgggacgccctggccgaccggagcgaaacccccctcagcgtcgaggagctaagtagggcctacg

agctcaaccttttctcgccgcgcgtgccccccaaacgccagcccaacggcacatgcgagcccaacccgcg

tctcaacttctatcccgttttcgcggtccccgaggcccttgccacctatcacatctttttcaagaaccaa

aagatccccgtctcctgccgcgccaaccgcacccgcgccgacgcgctcctcgctctggggcccggcgcgc

gcatacctgatatcgcttccctggaagaggtgcccaagatcttcgaagggctcggtcgggacgagacgcg

cgcggcgaacgctctgaaagaaacagcagaggaagagggtcacactagcgccttggtagagttggaaggc

gacaacgccaggctggccgtgctcaagcgcagcgtcgagctcacccacttcgcctaccccgccgtcaacc

tcccgcccaaggtcatgcgtcgcatcatggatcagctcatcatgccccacatcgaggccctcgatgaaag

tcaggagcagcggcccgaggacgcccagcccgtggtcagcgacgagcagcttgcgcgctggctcgggaac

cgcgacccccaggccctggagcagcggcgcaagctcatgctggccgtggtcctggtcaccctcgagctgg

aatgcatgcgccgcttcttcaccgaccccgacaccctgcgcaaggtggaggagaccctgcactacacttt

cagacacgggttcgtcaggcaggcctgcaagatctccaacgtggagctgaccaacctggtttcctgcctg

gggatcctgcacgagaaccgcctggggcagaccgtgctccactctaccctcaagggcgaggcgcgtcggg

actatgtccgcgactgcgtctttctttttctctgtcacacatggcaagcggccatgggcgtgtggcagca

gtgtctcgaggacgagaacctgaaggagctggacaagcttcttgctagaaacctcaaaaagctgtggacg

ggcttcgacgagcgcaccgtcgcctcggacctggccgagatcgtcttccccgagcgcctgaggcagacgc

tgaaaggcgggctgcccgacttcatgagccaaagcatgttgcaaaactaccgcactttcattctcgagcg

atcggggatcctgcccgccacctgcaacgctttcccctccgactttgttccgctgagctaccgcgagtgt

cccccgccgctgtggagccactgctacctcttgcaactggccaactacatcgcccaccactcggatgtga

tcgaggacgtgagcggcgaggggctgctagagtgccactgccgctgcaacctgtgctccccgcaccgctc

cctggtctgcaacccccagctcctcagcgagacccaggtcatcggtaccttcgagctgcaaggtccgcag

gagtccaccgctccgctgaaacttacgccggggttgtggacttccgcgtacctgcgcaaatttgtacccg

aggactaccacgcccatgagataaagttcttcgaggaccaatcgcggccgcagcacgcggatctcacggc

ctgcgtcatcacccagggcgcgatcctcgcccaattgcacgccatccaaaaatcccgccaagagtttctt

ctgaaaaagggtagaggggtatacctggacccccagacgggcgaggtgctcaacccgggtcttccccagc

atgccgaggaagaagcaggagccgctagtggaggagatggaagaagaatgggacagccaggcagaggagg

acgaatgggaggaggagacagaggaggaagaattggaagaggtggaagaggagcaggcaacagagcagcc

cgtcgccgcaccatccgcgccggcagccccggcggtcacggatacaacctccgcagctccggccaagcct

cctcgtagatgggatcgagtgaagggtgacggtaagcacgagcggcagggctaccgatcatggagggccc

acaaagccgcgatcatcgcctgcttgcaagactgcggggggaacatcgctttcgcccgccgctacctgct

cttccaccgcggggtgaacatcccccgcaacgtgttgcattactaccgtcaccttcacagctaagaaaaa

gcaagtcagaggagtcgccggaggaggaggaggcctgagaatcgcggcgaacgagccctcgaccaccagg

gagctgaggaaccggatcttccccactctttatgccatttttcagcagagtcgaggtcagcagcaagagc

tcaaagtaaaaaaccggtctctgcgctcgctcacccgcagttgcttgtaccacaaaaacgaagatcagct

gcagcgcactctcgaagacgccgaggctctgttccacaagtactgcgcgctcactcttaaagactaaggc

gcgcccacccggaaaaaaggcgggaattacctcatcgccaccatgagcaaggagattcccaccccttaca

tgtggagctatcagccccagatgggcctggccgcgggcgcctcccaggactactccacccgcatgaactg

gcttagtgccggcccctcgatgatctcacgggtcaacggggtccgtaaccatcgaaaccagatattgttg

gagcaggcggcggtcacctccacgcccagggcaaagctcaacccacgtaattggccctccaccctggtgt

atcaggaaatccccgggccgactaccgtactacttccgcgtgacgcactggccgaagtccgcatgactaa

ctcaggtgtccagctggccggcggcgcttcccggtgcccgctccgcccacaatcgggtataaaaaccctg

gtgatccgaggcagaggcacacagctcaacgacgagttggtgagctcttcgatcggtcttcgaccggacg

gagtgttccaactagccggagccgggagatcgtccttcactcccaaccaggcctacctgaccttgcagag

cagctcttctgagcctcgctccggaggcatcggaaccctccagttcgtggaggagtttgtgccctcagtc

tacttcaaccccttctcgggatcgccaggcctctacccggacgagttcataccgaacttcgacgcagtga

gagaagcggtggacggctacgactgaatgtcccatggtgactcggctgagctcgctcggttgaggcatct

ggaccactgccgccgcctgcgctgcttcgcccgggagagctgcggactcatctactttgagtttcccgag

gagcaccccaacggccctgcgcacggagtgcggatcaccgtagagggtaccaccgagtctcacctggtca

ggttcttcacccagcaacccttcctggtcgaacgggaccggggcaccaccacctacaccgtctactgcat

ctgtcctaccccgaagttgcatgagaatttttgctgtactctttgtggtgagtttaataaaagctgaact

agtggcgcgatggcgctggaatacgccgattaaaagcccaaaaaccaatcagacccttcctcatttcccc

atccccaatactcataagaataaatcattggaattaatcattcaataaagatcacttacttgaaatctga

aagtatgtctctggtgtagttgttcagcaacacctcggtaccctcttcccagctctggtactccagtccc

cggcgggcggcgaacttcctccacaccttgaaagggatgtcaaattcctggtccacaattttcattgtct

tccctctcagatgtcaaagaggctccgggtggaagatgacttcaaccccgtctacccctatggctacgcg

cggaatcagaatatccccttcctcactcccccctttgtctcctccgatggattcaaaaacttcccccctg

gggtactgtcactcaaactggctgatccaatcaccattaccaatggggatgtatccctcaaggtgggagg

tggtctcactttgcaagatggaagcctaactgtaaaccctaaggctccactgcaagttactactgataaa

aaacttgagcttgcatatgataatccatttgaatgtagtgctaataaatttagtttaaaagtaggacatg

gattaaaagtattagatgaaaaaagtgctgcggggttaaaagatttaattggcaaacttgtggttttaac

aggaaaaggaataggcactgaaaatttagaaaatacagatggtagcagcagaggaattggtataaatgta

agagcaagagaagggttgacatttgacaatgatggatacttggtagcatggaacccaaagtatgacacgc

gcacactttggacaacaccagacacatctccaaactgcacaattgctcaggataaggactctaaactcac

tttggtacttacaaagtgtggaagtcaaatattagctaatgtgtctttgattgtggtcgcaggaaagtac

cacatcataaataataagacaaatccagaaataaaaagttttactattaaactgttatttaataagaacg

gagtgcttttagacaactcaaatcttggaaaagcttattggaactttagaagtggaaattccaatgtttc

gacagcttatgaaaaagcaattggttttatgcctaatttagtagcgtatccaaaacccagtaattctaaa

aaatatgcaagagacatagtttatggaactatatatcttggtggaaaacctgatcagccagcagtcatta

aaactacctttaaccaagaaactggatgtgaatactctatcacatttgactttagttggtccaaaaccta

tgaaaatgttgaatttgaaaccacctcttttaccttctcctatattgcccaagaatgaaagaccaataaa

cgtgtttttcatttcaaattttcatgtatctttattgatttttacaccagcacgggtagtcagtctccca

ccaccagcccatttcacagtgtacacggttctctcagcacgggtggccttaaataggggaatgttctgat

tagtgcgggaactcaacttggggtctataatccacacagtttcctggcgagccaaacgggggtcggtgat

tgagatgaagccgtcctctgaaaagtcatccaagcgggcctcacagtccaaggtcacagtctggtggaat

gagaagaacgcacagattcatactcggaaaacaggatgggtctgtgcctctccatcagcgccctcagcag

tctctgccgccggggctcggtgcggctgctgcagatgggatcgggatcacaagtctctctgactatgatc

ccaacagccttcagcatcagtctcctggtgcgtcgggcacagcaccgcatcctgatctctgccatgttct

cacagtaagtgcagcacataatcaccatgttattcagcagcccataattcagggcgctccagccaaagct

catgttggggatgatggaacccacgtgaccatcgtaccagatgcggcagtatatcaggtgcctgcccctc

ataaacacactgcccatatacatcatctctttgggcatgtttctgttcacaatctgacggtaccagggga

agcgctggttgaacatgcacccgtaaatgactctcctgaaccacacggcaagcagggtgcctcccgcccg

acactgcagggagcccggggatgaacagtggcaatgcagtatccagcgctcgtacccgctcaccatctga

gctctcaccaagtccagggtagcggggcacaggcacactgacatacatctttttaaaatttttatttcct

ctggggtcaggatcatatcccagggtactggaaattcttggagcagtgtaaagccagcagcacatggtaa

tccacggacagaacttacattatgataatctgcatgatcacaatcgggcaacaaagggtgttgttcagtc

agagaggccctggtctcctcatcagatcgtggtaaacgggccctgcgatatggatgatggcggagcaagc

tcgactgatcctcggtttgcattgtagtgaattctcttgcgtaccttgtcgtacttctgccagcagaaat

gggcccttgaacagcagatacctctccttctcctgtctttccgctgctgacgctcagtcatccaactgaa

gtacagccattcccgcaggttctcgagcagctcctcagcatctgatgaaacaaaagtcctgtccatgcgg

attccccttaatacatcagccaggacattgtaggccatcccaatccagttaatgcagcctggtctatcat

tcagaggaggtgggggaagaactggaagaaccatttttttattccaagcggtctcgaaggacgataaagt

gtaagtcacgcaggtgacagcgttcccctccgctgtgctggtggaaacagacagccaggtcaaaacctac

tctattttcaaggtgctcgactgtagcttcgagcagtggctctacgcgtacatccagcatcaaaatcaca

ttaaaggctggccctccatcgatttcatcaatcatcaggttacactcgttcaccatccccaggtaattct

catttttccagccttggattatttctacaaattgttggtgtaagtccactccgcacatgtggtaaagctc

ccacagcgccccctccactttcataatcaggcagaccttcataatagaaacagatcctgctgctccacca

cctgcagcgtgttcaaaacaacaagattcaataaggttctgccctccgccctcagctcgcgcctcaatgt

cagctgcaaaaagtcacttaaatcctgggccactacagctgacaattcagagccagggctaagcgtggga

ctggcaagcgtgagggaaaactttaatgatccaaagctagcacccaaaaactgcatgctggaataagctc

tctttgtgtctccggtgatgccttccaaaa</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>3819</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3819</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgtttgtgttccttgtgttattgccactagtctctagtcagtgtgtgaacc

tgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaa

ggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctgg

ttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacg

acggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactgga

cagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccag

ttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttcc

gggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaagg

caagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctac

agcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtgg

atctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacc

tggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaacc

ttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcg

agacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgca

gcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgcc

accagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgc

tgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtg

cttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacag

acaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaaca

gcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatct

gaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaa

ggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccct

acagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcac

caatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagag

agcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattgccgataccacagacgccgtacgag

atccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctgg

caccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccatt

cacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccg

gctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctg

tgccagctaccagacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcc

tacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaact

tcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgta

catctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaat

agagccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcaga

tctacaagacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaa

gcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatc

aagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggac

tgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcac

aatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctac

cggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttca

acagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgt

ggtcaaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagc

tctgtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgacagactgatca

ccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctc

tgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggc

aagggctaccacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacg

tgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctag

agaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatc

atcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgt

acgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagtactttaagaaccacacaag

ccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgac

cggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagc

agtacatcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcac

aatcatgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgc

aagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacattacaca</INSDSeq_seq

uence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1698</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1698</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaaggcgatactcgtggttatgctgtacacatttaccaccgcaaatgcag

acacgttatgtatcggttatcatgcgaacaattcaaccgacactgtggacacagttcttgagaagaatgt

caccgtgacacactctgtcaatcttctggaagacaagcataacgggaaactatgcaagctccgcggggta

gcacctttgcatcttggcaaatgtaacattgctggctggatcctgggaaatccagagtgcgaatccctct

ccacagctcgaagttggtcctacattgtggagacatcgaattcagacaacggcacgtgctacccaggaga

tttcatcaattatgaggagctgcgggagcagcttagctccgtgtcatcctttgaaaggtttgaaatcttc

cccaagacaagtagctggcctaatcacgactcggacaatggcgtcacggcagcatgtcctcacgctggag

ccaagagcttctacaagaacctgatctggctggttaagaaaggaaagtcttacccaaagatcaaccaaac

ctacattaatgataaagggaaagaggtcctcgtgctgtggggcattcaccatcctcctactattgctgac

caacaaagtctctatcagaatgcagatgcctatgtgtttgtggggacaagtcgttacagcaagaagttca

agccagagatagcaacccggcccaaggtgcgggatcaggaaggcagaatgaactattactggacactcgt

ggaaccgggagacaaaataaccttcgaagcaactggaaacctggtggcgcccagatatgcctttaccatg

gagcgcgatgctggctctggtattatcatttcagatacgcccgtccacgattgcaataccacttgtcaga

cgcccgagggtgctataaacaccagcctgccctttcagaatgtgcatccaatcaccattggcaaatgtcc

aaagtacgtgaaaagcacaaaattgcgcctggccaccggattgaggaatgtcccttctatccagtctcgt

ggcctgttcggggccattgctggcttcatcgagggtggctggacagggatggtagatggatggtacggtt

atcaccatcagaatgagcaagggagcggctatgccgccgacctgaagagcactcagaatgccattgataa

gattactaacaaagtaaactctgttatcgaaaagatgaatacacagtttaccgccgttggtaaggagttc

aaccaccttgagaaacggatcgagaatctaaacaagaaggttgatgatggcttcctggacatttggactt

acaatgccgaactgttggttctactggaaaacgaacgaactcttgactatcacgattccaacgtgaagaa

cttgtatgagaaagtcaggaaccagttaaagaacaacgccaaggagattggaaacggctgctttgaattc

taccacaaatgcgacaacacctgcatggaaagtgtcaagaacgggacttatgactacccgaaatactcag

aggaagctaaattaaacagagagaaaatcgatggagtgaagctggactccaccaggatctaccagatact

cgcgatctattccactgtggccagttcattggtgctggtagtctccctgggtgctatcagcttctggatg

tgctctaatggttctcttcagtgtagaatatgtatc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1698</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1698</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaagactatcattgctctctctaacattctctgtctggtgttcgctcaga

aaattcctggcaatgacaatagcacagccacgctgtgcctcgggcaccatgcagtcccaaacggaaccat

cgtgaagacaatcacaaatgaccgaattgaagtgaccaatgctactgagcttgtccagaactcctccata

ggtgaaatatgcggctcgcctcatcagatccttgatggagggaactgcacactaatagatgctctattgg

gtgaccctcagtgtgacggctttcagaataaggagtgggacctctttgttgaaaggtcccgggccaacag

caactgttacccttatgatgtgccagattatgcctcccttaggtccctagttgcctcatccggcacactg

gagtttaaaaatgagagcttcaattggactggcgtcaagcaaaacggaacaagttctgcgtgcataaggg

gctctagtagtagcttctttagtcggttaaattggctgaccagcttaaacaacatatatccagcacagaa

cgtgactatgccaaacaaggaacaatttgacaagttgtacatttggggggtgcaccacccggatacggac

aagaaccaaatctccctgtttgctcagtcatcaggacgtatcacagtatctaccaagcgcagccagcagg

ccgtcatcccaaatatcggctctaggcccagaatccgcggtatccctagtagaatctccatctattggac

aattgtaaaacccggagacattctgttgattaacagcaccgggaatctcattgctcctcgcggttacttc

aaaatccgaagcgggaaatcttccataatgcggtcagatgcacccattggcaaatgtaagtctgaatgca

tcactccaaatgggagcattcccaatgacaagccgttccaaaatgtaaaccgcatcacctacggggcctg

tcccagatatgttaagcaaagcaccctgaaattggcaacaggcatgcgaaatgttcccgagaaacagacc

cgtggcatctttggcgccatagcgggtttcatagagaatggatgggagggaatggtggatggttggtacg

gtttcaggcaccagaactctgagggaagaggacaggcggcagatttgaagagcactcaggccgcaatcga

tcaaatcaatgggaagctgaatcggctcatcgggaaaaccaacgagaaattccatcagattgagaaggaa

ttctcagaggtcgaaggccgggtgcaggaccttgagaaatatgtggaggacactaagatcgatttatggt

catacaacgcggagcttctggtggccctggagaaccagcatacgattgacctcactgactcggaaatgaa

caaactgtttgagaaaaccaagaagcagctgagggaaaatgctgaggatatgggcaatggttgtttcaag

atttaccacaaatgcgacaatgcctgcatcggctcaataagaaacgaaacctatgaccacaatgtgtacc

gcgatgaagcactgaacaaccggttccagatcaagggagtcgagctgaagtctgggtacaaagattggat

cctctggatttccttcgccatgagttgtttcctgctgtgtattgctctgctcgggttcatcatgtgggcc

tgccagaagggcaacattagatgcaacatttgcatt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1752</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1752</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaaggccatcattgtgctgctcatggttgtgacaagcaatgctgaccgga

tctgcactgggatcacctcttccaactcacctcacgtggtcaagacagctactcaaggagaggtgaatgt

cactggtgtgattccactgaccacaactcccaccaagagctacttcgccaacctcaaaggcaccaggact

agagggaaactgtgcccagactgtctcaactgcaccgatctggacgtggcccttggcaggcctatgtgcg

tcggaactacacccagtgctaaggcatccatcctgcacgaagttagaccagtgacctctgggtgcttccc

tatcatgcatgacaggaccaagattaggcagcttcctaatctgttgagaggatatgagaaaatcaggctg

agcactcagaacgtgattgacgcagaaaaggctccaggtggaccctacagacttggaacctctggctcct

gtcctaacgccactagcaagatcggcttctttgccaccatggcttgggcagtcccaaaggacaactacaa

gaatgctactaacccactgacagtggaggttccctacatctgtaccgaaggagaggaccagatcaccgtc

tggggattccactctgataacaagacccaaatgaagagcctctatggagactccaatcctcagaagttca

ctagctctgccaatggagtgacaactcactatgtctcccagattggtgactttccagatcaaaccgaaga

cggaggcctgcctcagagtggcagaatcgtcgtggattacatgatgcagaaaccagggaagaccggaact

atcgtgtaccaaagaggtgtcttgctgcctcagaaggtgtggtgtgcctctggcaggagcaaggtgatca

aaggatccctgcccttgattggtgaggcagactgcctccatgaggagtacggtggattgaacaagagcaa

accttactatacaggtaagcatgcaaaagccattggcaactgtcctatctgggtgaagactccactgaaa

ctcgccaatgggaccaagtacagaccacctgctaaactgttgaaggagagaggcttctttggagccattg

ctgggttcctcgagggaggctgggaaggaatgatcgctggttggcacggctacactagccacggagctca

tggtgtggcagttgctgccgacctgaagtccacccaagaagccatcaacaagattactaagaatctcaac

agcttgagtgagctggaagtcaagaatcttcagaggctgtctggagccatggatgagctccacaacgaaa

tcctggagcttgatgagaaagtggatgacctcagagctgacactatatcctctcagatcgagcttgctgt

cttgctgagcaacgaaggaatcattaacagtgaggacgagcacctcttggcactggagcggaaactcaag

aaaatgctgggtccctccgccgtggacatcggaaatggatgctttgaaactaaacacaagtgcaaccaga

cctgcttggacaggattgctgcaggcacattcaatgctggcgagttctcacttcccacttttgattcctt

gaacatcacagctgccagcttgaatgacgatggcctggacaaccacaccattctgctctattactccact

gctgcctctagcttggctgtgaccctgatgcttgccatcttcatcgtctacatggtgagcagagacaacg

tttcctgcagcatctgtctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>1746</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1746</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atgaaggccataattgtgctgctcatggtggtaacgtccaatgcagaccgaa

tctgcactgggatcacgtcgtcaaactcaccacatgtcgtcaaaactgctactcagggtgaggtcaacgt

gactggtgtaatcccactgaccacgacacccaccaaatcgcattttgcgaatctcaaagggacagaaacc

cgcgggaagctatgccctaaatgcttaaactgcacagacttagatgtagccttgggccggccaaagtgca

ctgggaaaatcccctctgccagggtgtctatcctccacgaagtcaggcctgttacctctgggtgctttcc

tatcatgcacgatcggacaaagattagacagctgcctaaccttctccgaggatatgagcatgtcaggctt

agcactcacaacgttatcaatacagaggacgcaccaggagggccctacgagatcggcacctccgggagct

gtctgaacattaccaatggcaagggattcttcgccacaatggcttgggccgtgccaaagaacaaaacagc

caccaatccgttaacaatagaggtaccgtatatttgtactgaggaggaagaccagattaccgtttggggg

ttccactccgacgacgagacacaaatggcaaggctctatggggattcaaagccccagaagttcacctcct

ctgccaacggcgtgaccacacactacgtctcacagattggtggctttccaaatcagaccgaggacggcgg

gctaccgcagagtggcagaattgtggttgactacatggtgcaaaaatctggcaaaacgggcaccattacc

tatcaaagaggtattctgctgcctcaaaaggtgtggtgcgcaagtggcaagagcaaggtgatcaagggat

ccttgcccttaattggcgaagcggattgcctccatgagaaatacggtggactgaacaaaagcaagcctta

ttacacaggggagcacgccaaggccatcggaaattgtccaatatgggtgaaaactcccttgaagctggcc

aatggcaccaaatatcgtcctcctgccaaactgctgaaggaacgcggtttcttcggcgccattgctggtt

tcttagagggcggatgggaaggaatgattgccggttggcacggctacacatcccatggggcacatggagt

ggcggtggcagcggaccttaagagcactcaggaggccatcaacaagatcacaaagaatctcaacagcttg

agtgagctggaagtgaagaatcttcagcgtctaagcggcgccatggacgaactccacaacgaaatactcg

aactagatgagaaagtggatgatctgcgggctgatacaataagctcacagatcgaactcgcagtcctgct

ttccaacgagggcatcataaacagtgaggatgaacatctcttggcgcttgagagaaagctgaagaaaatg

ctggggccctctgctgtcgagataggaaatggatgttttgaaaccaaacacaagtgtaaccagacctgtc

tggaccgcatcgctgctggtacctttgatgcaggagaatttagcctgcccacctttgatagcctgaacat

tactgctgcatctctgaatgacgatggcttggacaatcacactatcctgctttactactcaactgctgcc

tccagtttggctgtgacgctgatgatcgctatcttcgtggtttatatggtcagtcgggacaatgtttctt

gctccatttgtctg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

1. Экспрессионный вектор на основе генома аденовируса человека 19 серотипа, содержащий: константную последовательность с делецией Е1 и Е3 областей, внутри которой находится экспрессионная кассета с целевым геном; вариабельный участок на правом конце генома размером до 1000 п.о.

2. Экспрессионный вектор по п.1, в котором константная последовательность имеет последовательность SEQIDNO:1 до экспрессионной кассеты и последовательность SEQIDNO:2 после экспрессионной кассеты.

3. Экспрессионный вектор по п.1, в котором экспрессионная кассета в качестве целевого гена содержит ген S белка вируса SARS-CoV-2 SEQIDNO:3.

4. Экспрессионный вектор по п.1, в котором экспрессионная кассета в качестве целевого гена содержит генгемагглютинина вируса гриппа А H1N1 SEQIDNO:4.

5. Экспрессионный вектор по п.1, в котором экспрессионная кассета в качестве целевого гена содержит генгемагглютинина вируса гриппа А H3N2 SEQIDNO:5.

6. Экспрессионный вектор по п.1, в котором экспрессионная кассета в качестве целевого гена содержит генгемагглютинина вируса гриппа B/Yamagata SEQIDNO:6.

7. Экспрессионный вектор по п.1, в котором экспрессионная кассета в качестве целевого гена содержит генгемагглютинина вируса гриппа B/Victoria SEQIDNO:7.

8. Способ получения экспрессионного вектора по п.1, отличающийся тем, что в нем используется челночная плазмида, содержащая последовательность, которая гомологична участку генома аденовируса, серотип которого отличается от 19.

9. Применение экспрессионного вектора по п.1 для индукции иммунного ответа к целевому антигену.