RU2743963C1 - Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты) - Google Patents
Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2743963C1 RU2743963C1 RU2021103099A RU2021103099A RU2743963C1 RU 2743963 C1 RU2743963 C1 RU 2743963C1 RU 2021103099 A RU2021103099 A RU 2021103099A RU 2021103099 A RU2021103099 A RU 2021103099A RU 2743963 C1 RU2743963 C1 RU 2743963C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- cov2
- sars
- cov
- agent
- Prior art date
Links
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 70
- 230000036039 immunity Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 230000006698 induction Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 title claims abstract description 27
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 87
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 78
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 71
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims abstract description 50
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 40
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 25
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 21
- 241000990167 unclassified Simian adenoviruses Species 0.000 claims abstract description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 claims abstract description 6
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 6
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 53
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 52
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 28
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 34
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 33
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 27
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 26
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 18
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 14
- 241000205701 Human adenovirus 26 Species 0.000 description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 10
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 10
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 10
- 108091005774 SARS-CoV-2 proteins Proteins 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 9
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 6
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 6
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 description 4
- 229940025109 Oxford–AstraZeneca COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 4
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 4
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700022167 ChAdOx1 nCoV-19 Proteins 0.000 description 3
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 3
- 229940024452 Janssen COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 3
- 101710167605 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940022962 COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 2
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 206010068319 Oropharyngeal pain Diseases 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 229940026233 Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 208000036071 Rhinorrhea Diseases 0.000 description 2
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 2
- 206010039424 Salivary hypersecretion Diseases 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 208000026451 salivation Diseases 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- AVWQQPYHYQKEIZ-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-dodecylbenzenesulfonate;3-dodecylbenzenesulfonate;4-dodecylbenzenesulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].CCCCCCCCCCCCC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1.CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O AVWQQPYHYQKEIZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700022172 2019-nCoV Vaccine mRNA-1273 Proteins 0.000 description 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 1
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 description 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020843 Hyperthermia Diseases 0.000 description 1
- 206010022086 Injection site pain Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 1
- 208000029001 Mediastinal disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 229940026207 Moderna COVID-19 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 206010028347 Muscle twitching Diseases 0.000 description 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 1
- 206010028735 Nasal congestion Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010062106 Respiratory tract infection viral Diseases 0.000 description 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 108700010904 coronavirus proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 208000017574 dry cough Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 208000016253 exhaustion Diseases 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 230000027950 fever generation Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036031 hyperthermia Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 1
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012768 mass vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000007479 persistent immune response Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/08—Solutions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10323—Virus like particles [VLP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10371—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20071—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/50—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating RNA stability, not being an intron, e.g. poly A signal
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Описано средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3. В другом варианте средство содержит в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3. Еще в одном варианте средство содержит в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3. При этом, в частном случае его выполнения, буферный раствор средства для жидкой формы содержит, масс. %: трис от 0,1831 до 0,3432, хлорид натрия от 0,3313 до 0,6212, сахароза от 3,7821 до 7,0915, магния хлоридагексагидрат от 0,0154 до 0,0289, ЭДТА от 0,0029 до 0,0054, полисорбат-80 от 0,0378 до 0,0709, этанол 95% от 0,0004 до 0,0007, вода остальное. Средство предназначено для применения интраназально или внутримышечно. Также средство может быть введено совместно и одновременно интраназально и внутримышечно. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, обеспечивая эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоёв населения. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл., 12 пр.
Description
Область техники.
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
Уровень техники.
Эпидемия коронавирусной инфекции COVID-19, которая началась в конце 2019 года в Китайской Народной Республике, за несколько месяцев распространилась по всему миру и бросила беспрецедентный вызов современной системе здравоохранения. В настоящее время число заболевших COVID-19 более106млн человек, а число погибших более 2,3 млн человек.
Возбудителем заболевания является одноцепочечный РНК-содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae к линии Beta-CoV.
Коронавирус передается от человека к человеку воздушно-капельным, воздушно-пылевым и контактным путями. Инкубационный период составляет в среднем 5-6 дней, после чего развиваются первые симптомы заболевания. Для COVID-19 характерными симптомами являются: повышение температуры тела, сухой кашель, отдышка, утомляемость. Реже встречаются - боль в горле, в суставах, насморк, головная боль. При этом тяжесть заболевания может варьироваться, от бессимптомной инфекции до тяжелого острого респираторного синдрома и смерти.
Быстрое распространение SARS-CoV-2 и высокий процент смертности создали острую необходимость в разработке эффективных средств профилактики заболеваний, вызываемых данным вирусом. Разработка безопасной и эффективной вакцины против SARS-CoV-2 в настоящее время является важнейшим глобальным приоритетом.
В течение года после начала пандемии различные фармацевтические компаний предложили свои варианты кандидатной вакцины против COVID-19.
Фармацевтическая компания Pfizer при сотрудничестве с биотехнологической компанией BioNTech разработала вакцину BNT162b2 (tozinameran). Данная вакцина представляет собой липидные наночастицы, внутрь которых инкапсулирована модифицированная мРНК, кодирующая мутантную форму S белка SARS-CoV-2. Схема вакцинации предполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 21 день (F.P. Polacketal. SafetyandEfficacyoftheBNT162b2 mRNACovid-19 Vaccine. NEnglJMed 2020; 383: 2603-2615).
Фармацевтическая компания Moderna в сотрудничестве с Национальным Институтом здоровья (США) разработала вакцину mRNA-1273. Активным компонентом данной вакцины является мРНК, кодирующая S белок SARS-CoV-2, которая окружена липидной оболочкой. Схема вакцинациипредполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 28 дней (L. A. Jacksonetal. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 — Preliminary Report. NEnglJMed 2020; 383:1920-1931 ).
Оксфордский университет в сотрудничестве с фармацевтической компанией AstraZeneca разработал векторную вакцину ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222). Активным компонентном данной вакцины является аденовирус шимпанзе ChAdOx1, содержащий кодон-оптимизированную кодирующую последовательность полноразмерного S белка вируса SARS-CoV-2 (GenBank MN908947) с лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена. Схемавакцинациипредполагаетдвукратнуюиммунизациюсинтерваломв 28 дней (M. Voysey et al. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. TheLancet. Vol. 397, Issue 10269, P99-111, 2021).
Компания CanSino разработала векторную вакцину против COVID-19, в основе которой репликативно-дефектный аденовирус человека 5 серотипа (Ad5), экспрессирующий полноразмерный S гликопротеин SARS-CoV-2. Схема вакцинации предусматривает однократную иммунизацию. (GenBankYP_009724390) (Feng-CaiZhuetal. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. TheLancet. Vol. 369, Issue 10249, P479-488, 2020).
Исследовательскиегруппы Johnson and Johnson и Janssen Pharmaceutical.всотрудничествесМедицинскимцентром Beth Israel Deaconess, спомощьютехнологии Janssen AdVac® создалинесколькокандидатныхвакцин. После проведенных исследований безопасности и эффективности была выбрана кандидатная вакцина Ad26.COV2.S (Ad26COVS1). Активным компонентном данной вакцины является рекомбинантный аденовирусный вектор 26 серотипа с делецией Е1 и Е3 области, содержащий ген S белка SARS-CoV-2, с мутацией сайта расщепления фурина и с двумяпролин-стабилизирующими мутациями. В настоящий момент исследуются две схемы вакцинации: однократная и двукратная с интервалом 8 недель (J. Sadoff etal. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. NEnglJMed, 2021 Jan 13.DOI: 10.1056 / NEJMoa2034201).
Таким образом, можно отметить, что большая часть вакцин против COVID-19 предполагают двукратную вакцинацию.
Каждая из представленных вакцин имеет свои сильные стороны и недостатки. Так, вакцины на основе РНК обладают менее выраженными побочными эффектами, но по сравнению с векторными вакцинами обладают меньшей иммуногенностью. Кроме того, РНК более хрупкая, чувствительная к условиям хранения.
Вакцины, основанные на рекомбинантных вирусных векторах, обладают высокой иммуногенностью. Однако недостатком данного типа вакцин является возможность формирования иммунного ответа на векторную часть, что затрудняет ревакцинацию. Также за счет того, что аденовирусы циркулируют в популяции человека, часть населения может иметь предсуществующий иммунитет против данных вирусов. Экспрессионные векторы, основанные на аденовирусах других млекопитающих, позволяют решить проблему с предсуществующим иммунитетом, однако, такие векторы хуже проникают в клетки человека, а за счет этого снижается эффективность вакцин.
Техническое решение согласно патенту РФ №2731342 (опубликован 01.09.2020), выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип. Из данного патента известны варианты фармацевтического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2:
- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
Кроме того, в данном патенте раскрыто применение указанных вариантов средств для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, включающее использование компонента 1 и 2 в эффективном количестве последовательно с интервалом не менее 1 недели.
Нужно отметить, что такой способ применения имеет ряд недостатков. Так, например, каждый из компонентов фармацевтического средства может вызывать побочные эффекты и аллергические реакции, следовательно при двукратной схеме вакцинации, количество таких явлений будет возрастать. Также такая схема иммунизации имеет ряд практических трудностей, заключающихся в том, что необходимо обеспечить явку пациентов с определенным интервалом времени. Кроме того, имеется ряд логистических трудностей, связанных со своевременной доставкой нужных компонентов средства.
Таким образом, в области техники существует потребность в расширении арсенала фармацевтических средств, способных индуцировать иммунный ответ против вируса SARS-CoV-2 у широких слоев населения.
Технической задачей заявленной группы изобретений является создание средств, содержащих один активный компонент, и при этом обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоёв населения.
Раскрытие сущности изобретения
Решением технической задачи является вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
Также создан вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
Кроме того, заявлен вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
При этом,частном случае его выполнения, буферный раствор средства для жидкой формы содержит, масс. %:
| трис | от 0,1831 до 0,3432 |
| хлорид натрия | от 0,3313 до 0,6212 |
| сахароза | от 3,7821 до 7,0915 |
| магния хлоридагексагидрат | от 0,0154 до 0,0289 |
| ЭДТА | от 0,0029 до 0,0054 |
| полисорбат-80 | от 0,0378 до 0,0709 |
| этанол 95% | от 0,0004 до 0,0007 |
| вода | остальное |
Каждый вариант средства применяют для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
При этом средство предназначено для применения интраназально или внутримышечно. Также средство может быть введено совместно и одновременно интраназально и внутримышечно.
Причем в частном случае выполнения средство интраназально вводят в дозе от 5*10 10 до 5*1011 вирусных частиц или внутримышечно в дозе от 5*10 10 до 5*1011 вирусных частиц. А совместное введение интраназально и внутримышечно осуществляют в дозе от 5*10 10 до 5*1011 вирусных частиц внутримышечно, в дозе от 5*10 10 до 5*1011вирусных частиц интраназально.
Совместное введение предусматривает интраназальное и внутримышечное введение в рамках одной процедуры вакцинации.
Технический результат заключается в разработке средства, обеспечивающего развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоёв населения.
Основная цель вакцинации - обеспечить эффективную и долгосрочную защиту от патогена. Одним из вариантов достижения этой цели является многократная вакцинация. Когда организм человека впервые встречает вакцинный антиген это приводит к активации двух основных компонентов адаптивного иммунного ответа: В-лимфоцитов и эффекторных Т-лимфоцитов. Активированные B-лимфоциты трансформируются в плазматические клетки, способные к продукции антител, а также превращаются в B-клетки памяти. Эффекторные Т-лимфоциты делятся на два основных типа: Т-хелперы (CD4+) и Т-киллеры (CD8+). Главной функцией Т-хелперов является поддержка в развитии гуморального или клеточного иммунного ответа. Основной функцией Т-киллеров является уничтожение повреждённых клеток собственного организма. Т-киллеры являются одним из главных компонентов антивирусного иммунитета. Однако через некоторое время после вакцинации, количество антиген-специфичных иммунных клеток в организме начинает уменьшаться, тогда вводят бустерную дозу вакцины, которая позволяет поддерживать количество антиген-специфичных Т- и В-клеток на должном уровне (обеспечивающем протекцию организма от патогена).
Разработка однокомпонентного средства, которое будет вызывать стойкий иммунный ответ после однократной иммунизации является сложной научно-практической задачей. При этом значимость такой разработки сложно переоценить. Однократное введение способно обеспечить более быстрые темпы массовой вакцинации, что в условиях пандемии имеет критическое значение.Также данное средство может быть полезно для экстренной вакцинации, для иммунизации мобильных групп граждан (кочевые народы и пр.) и др. Кроме того, можно отметить, что при однократном введении снижается неблагоприятное воздействие на человека: травматичность, количество побочных эффектов и аллергических реакций.
Краткое описание фигур.
На фиг. 1
представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных жидкой формой разработанного
средства по варианту 1,
Ось ординат – титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2.
Ось абсцисс – дни.
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 14 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 21 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 28 день
Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 14, 21 и 28 дней обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т- критерию Вилкоксона.
На фиг. 2
представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных жидкой формой разработанного средства по варианту 2,
Ось ординат – титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2.
Ось абсцисс – дни.
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 14 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 21 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 28 день
Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 14, 21 и 28 дней обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т- критерию Вилкоксона.
На фиг.3 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев жидкой формой разработанного средства по варианту 1 по оценке доли пролиферирующих CD8+ (А) и CD4+ (Б) лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс – дни.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 28 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, p<0,05; **, p<0,01; ****, p<0,001 по критерию Манна-Уитни.
На фиг.4 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев жидкой формой разработанного средства по варианту 2 по оценке доли пролиферирующих CD8+ (А) и CD4+ (Б) лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс – дни.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 28 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD4+ у каждого добровольца на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, p<0,05; **, p<0,01; ****, p<0,001 по критерию Манна-Уитни.
Осуществление изобретения.
Активным компонентом разработанного средства является экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма аденовируса, со встроенной экспрессионной кассетой, содержащей ген антигена вируса SARS-CoV-2.
Аденовирусные векторы способны проникать в различные типы клеток человека, обеспечивают высокие уровни экспрессии целевого антигена, приводят к индукции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. В ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России было разработано 3 варианта экспрессионных векторов на основе аденовирусов млекопитающих:
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
В качестве антигена был выбран S белок SARS-CoV-2, который находится на поверхности вирусной частицы. Это один из наиболее перспективных антигенов, позволяющих индуцировать мощный и длительный иммунный ответ. Также было показано, что антитела к S белку SARS-CoV-2 являются вирус-нейтрализующими.
Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы разработали различные варианты экспрессионных кассет, содержащих ген S белка.
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. CMV промотор – это промотор ранних генов цитомегаловируса, который обеспечивает конститутивную экспрессию во множестве типов клеток. Однако сила экспрессии гена-мишени, управляемая промотором CMV, варьируется в зависимости от типов клеток. Кроме того, было показано, что уровень экспрессии трансгена под контролем CMV-промотора уменьшается с увеличением времени культивирования клеток из-за подавления экспрессии генов, которое связано с метилированием ДНК [Wang W., Jia YL., Li YC., Jing CQ., Guo X., Shang XF., Zhao CP., Wang TY. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells. // Scientific Reports – 2017. – Vol. 8. – P. 10416].
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. CAG-промотор – синтетический промотор, который включает ранний энхансер промотора CMV, промотор β-актина курицы и химерный интрон (β-актина курицы и β-глобин кролика). Экспериментально показано, что транскрипционная активность промотора СAG выше, чем у промотора CMV. [Yang C.Q., Li X.Y., Li Q., Fu S.L., Li H., Guo Z.K., Lin J.T., Zhao S.T. Eval-uation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation. // Genet. Mol. Res. – 2014. – Vol. 13. – P. 1270-1277].
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. Промотор EF1 – промотор человеческого эукариотического фактора элонгации трансляции 1α (EF-1α). Промотор является конститутивно активным в широком диапазоне типов клеток [Wang X, Xu Z, Tian Z, Zhang X, Xu D, Li Q, Zhang J, Wang T. The EF-1α promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells. J Cell Mol Med. 2017 Nov;21(11):3044-3054. doi: 10.1111/jcmm.13216. Epub 2017 May 30. PMID: 28557288; PMCID: PMC5661254.]. Ген EF-1α кодирует фактор элонгации-1α, который является одним из наиболее распространенных белков в эукариотических клетках и экспрессируется почти во всех типах клеток млекопитающих. Данный промотор EF-1α часто активен в клетках, в которых вирусные промоторы не способны экспрессировать контролируемые гены, и в клетках, в которых вирусные промоторы постепенно заглушаются.
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Таким образом, в результате проведенной работы было разработано 3 варианта средства.
1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3
2) средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
3) средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1 Получение активного компонента средствадля индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа.
На первом этапе работы был разработан дизайн 3 вариантов экспрессионных кассет:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России: плазмида pAd26-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа, и плазмида pAd26-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd26-Ends, были получены плазмиды pAd26-Ends-CMV-S-CoV2, pAd26-Ends-CAG-S-CoV2, pAd26-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-too-CMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pAd26-too-CMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы humanadenovirus 26-го серотипа: Ad26-too-CMV-S-CoV2, Ad26-too-CAG-S-CoV2, Ad26-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм humanadenovirus26-го серотипа:Ad26-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, был полученэкспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5 со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.
Пример 2. Получение активного компонента средствадля индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа.
В данной работе также использовали 3 варианта экспрессионных кассет:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России:
- плазмида pAd5-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа (одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 5-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pIX белок; второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4-области до конца генома)
- плазмида pAd5-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd5-Ends, были получены плазмиды pAd5-Ends-CMV-S-CoV2, pAd5-Ends-CAG-S-CoV2, pAd5-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы humanadenovirus5-го серотипа: Ad5-too-CMV-S-CoV2, Ad5-too-CAG-S-CoV2, Ad5-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм humanadenovirus5-го серотипа:Ad5-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, был полученэкспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма humanadenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.
Пример 3. Получение активного компонента средствадля индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа.
В данной работе использовали 3 варианта экспрессионных кассет:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России:
- плазмида pSim25-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса обезьян 25-го серотипа
- плазмида pSim25-null, несущая геном рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pSim25-Ends, были получены плазмидыp-Sim25-Ends-CMV-S-CoV2, p-Sim25-Ends-CAG-S-CoV2, p-Sim25-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса обезьян25-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pSim25-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса обезьян 25-го с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы simianadenovirus25-го серотипа: simAd25-too-CMV-S-CoV2, simAd25-too-CAG-S-CoV2, simAd25-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм simianadenovirus25-го серотипа: simAd25-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, был полученэкспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.
Пример 4. Разработка буферного раствора.
Авторами изобретения был подобран буферный раствор на водной основе, обеспечивающий стабильность рекомбинантных аденовирусных частиц. Для поддержания рН раствора в буфер добавили Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис). Для достижения необходимой ионной силы и осмолярности был добавлен хлорид натрия. Для криопротекции в буфер добавили сахарозу. Магния хлорида гексагидрат добавили в качестве источника двухвалентных катионов, ЭДТА - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления, полисорбат-80 - в качестве поверхностно-активного вещества, этанол 95% - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для жидкой формы средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (таблица 1). В каждый из полученных буферных растворов добавляли один из активных компонентов средства:
1. экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1 (Ad26-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).
2. экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1 (Ad5-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).
3. экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:4 (simAd25-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).
Полученные средства хранили при температуре -18ºС и -70 ºС в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.
Таблица 1 – Состав экспериментальных буферных растворов для жидкой формы средства.
Таблица 1.
| № группы |
Состав буферного раствора | |||||||
| Трис (мг) | Хлорид натрия (мг) | Сахароза (мг) | Магния хлорида гексагидрат (мг) | ЭДТА (мг) | Полисорбат-80 (мг) | Этанол 95% (мг) | Вода | |
| 1 | 0,968 | 2,19 | 25 | 0,102 | 0,019 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 2 | 1,815 | 2,19 | 25 | 0,102 | 0,019 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 3 | 1,21 | 1,752 | 25 | 0,102 | 0,019 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 4 | 1,21 | 3,285 | 25 | 0,102 | 0,019 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 5 | 1,21 | 2,19 | 20 | 0,102 | 0,019 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 6 | 1,21 | 2,19 | 37,5 | 0,102 | 0,019 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 7 | 1,21 | 2,19 | 25 | 0,0816 | 0,019 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 8 | 1,21 | 2,19 | 25 | 0,153 | 0,019 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 9 | 1,21 | 2,19 | 25 | 0,102 | 0,0152 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 10 | 1,21 | 2,19 | 25 | 0,102 | 0,0285 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 11 | 1,21 | 2,19 | 25 | 0,102 | 0,019 | 0,2 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 12 | 1,21 | 2,19 | 25 | 0,102 | 0,019 | 0,375 | 0,0025 | до 0,5 мл |
| 13 | 1,21 | 2,19 | 25 | 0,102 | 0,019 | 0,25 | 0,002 | до 0,5 мл |
| 14 | 1,21 | 2,19 | 25 | 0,102 | 0,019 | 0,25 | 0,00375 | до 0,5 мл |
| 15 | 1,21 | 2,19 | 25 | 0,102 | 0,019 | 0,25 | 0,0025 | до 0,5 мл |
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для жидкой формы средства при температурах -18ºС и -70 ºС в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для жидкой формы средства обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного средства в следующем диапазоне действующих веществ (масс %):
Трис: от 0,1831 масс. % до 0,3432 масс. %;
Хлорид натрия: от 0,3313 масс. % до 0,6212 масс. %;
Сахароза: от 3,7821 масс. % до 7,0915 масс. %;
Магния хлорида гексагидрат: от 0,0154 масс. % до 0,0289 масс. %;
ЭДТА: от 0,0029 масс. % до 0,0054 масс. %;
Полисорбат-80: от 0,0378 масс. % до 0,0709 масс. %;
Этанол 95%: от 0,0004 масс. % до 0,0007 масс. %;
Растворитель: остальное.
Пример 5. Получение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме.
Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 1 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3 в буферном растворе.
Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 2 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus5-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3 в буферном растворе.
Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 3 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3 в буферном растворе.
Активный компонент смешивается с компонентами буферного раствора во время технологического процесса. Фармацевтическое средство разливается в стерильные флаконы. Хранение производят в защищенном от света месте, при температуре не выше минус 18°С. Перед использованием необходимо достать из холодильной камеры и выдержать при комнатной температуре до полного размораживания не более 30 минут; перед применением перемешать, осторожно покачивая флакон (ампулу). Не допускается резко встряхивать препарат. Не допускается повторная заморозка.
Пример 6. Токсичность разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах при внутривенном и внутримышечном введении.
В данном исследовании оценивали острую токсичность:
- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.
Расчет дозы средства проводили исходя из иммунизирующей дозы (108в.ч.), полученной в предварительном эксперименте на чувствительном виде животных – сирийских хомячках. Расчет доз для мышей проводили исходя из массы тела. Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 108в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.
В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы средства:
108в.ч. – близкая к эффективной дозе(ЭД) для мышей;
109в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 20 раз;
1010в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;
1011в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;
Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:
1) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;
2) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;
3) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;
4) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;
5) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;
6) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;
7) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;
8) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;
9) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;
10) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;
11) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;
12) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;
13) плацебо (буферныйраствор), 20 мышей.
Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.
Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных:активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей.Физиологические функции:дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.
На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.
Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.
При макроскопическом исследовании не обнаруженовлияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Cтатистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.
Пример 7.
Определение эффективности иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответа.
Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против SARS-CoV-2 через 21 день после введения средства лабораторным животным.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на 13 групп по 5 животных, которым внутримышечно вводили варианты разработанного средства в жидкой форме в дозе 5*1010вирусных частиц/200мкл.
Были получены следующие группы животных:
1) Ad26-too-CMV-S-CoV2,
2) Ad26-too-CAG-S-CoV2,
3) Ad26-too-EF1-S-CoV2
4) Ad26-too
5) Ad5-too-CMV-S-CoV2,
6) Ad5-too-CAG-S-CoV2,
7) Ad5-too-EF1-S-CoV2
8) Ad5-too
9) simAd25-too-CMV-S-CoV2,
10) simAd25-too-CAG-S-CoV2,
11) simAd25-too-EF1-S-CoV2
12) simAd25-too
13) плацебо (буфер)
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5 % молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 2.
| № | Название группы животных | Титр антител |
| 1 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, | 2425 |
| 2 | Ad26-too-CAG-S-CoV2, | 2111 |
| 3 | Ad26-too-EF1-S-CoV2 | 2786 |
| 4 | Ad26-too | 0 |
| 5 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, | 38802 |
| 6 | Ad5-too-CAG-S-CoV2, | 29407 |
| 7 | Ad5-too-EF1-S-CoV2 | 33779 |
| 8 | Ad5-too | 0 |
| 9 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, | 14703 |
| 10 | simAd25-too-CAG-S-CoV2, | 16890 |
| 11 | simAd25-too-EF1-S-CoV2 | 12800 |
| 12 | simAd25-too | 0 |
| 13 | плацебо (буфер) | 0 |
Таким образом, результаты эксперимента показывают, что все разработанные средства вызывают гуморальный иммунный ответ против SARS-CoV-2.
Пример 8. Изучение иммуногенности разработанного средства путем оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинации
Цель данного эксперимента заключалась в определении напряженности иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 у добровольцев в различные сроки после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.
В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.
1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой формесодержащее в качестве единственного активного компонентаэкспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
2) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой формесодержащее в качестве единственного активного компонентаэкспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек
Добровольцы были однократно внутримышечно иммунизированы соответствующим средством. Перед иммунизацией, а также через 14, 21, 28 и 42 дней, у пациентов отбирали образцы крови. Из полученных образцов выделяли сыворотку крови, которую в дальнейшем использовали для определения титра антител к S антигену вируса SARS-CoV-2.
Титр антител определяли с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа, разработанной в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России (РЗН 2020/10393 2020-05-18), которая позволяет определять титр IgG к RBD домену S антигена вируса SARS-CoV-2.
Планшеты с предварительно адсорбированным RBD (100 нг/лунку) промывали 5 раз
промывочным буфером. Далее в лунки планшета вносили в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля.В остальные лунки планшета добавляли серию двукратных разведений исследуемых образцов (по два повтора на каждый образец).Планшет заклеивали пленкой и инкубировали в течение 1 ч при температуре +37 °С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл рабочего раствора конъюгатамоноклональных антител, планшет закрывали липкой пленкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре +37 °С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту. Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировали в течение 15 минут в темном месте при температуре от +20°С. После этого останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты). Результат учитывали в течение 10 мин после остановки реакции путем измерения на спектрофотометре оптической плотности при длине волны450 нм.
Титр IgG определяли как максимальное разведение сыворотки, при котором значение OD450 сыворотки иммунизированного участника превышаетзначение контрольной сыворотки (сыворотка участника до иммунизации) более чем в 2 раза.
Результаты анализа титра антител к антигену вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови добровольцев после введения различных вариантов разработанного средства представлены на фиг.1,2.
Как видно из представленных данных, иммунизация добровольцев обоими вариантами разработанного средства позволяет сформировать выраженный (статистически достоверно отличимый от показателей контрольной не иммунизированной группы добровольцев) гуморальный иммунитет, характеризующийся повышением титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. При этом рост напряженности гуморального иммунного ответа отмечается с увеличением дней после иммунизации.
Пример 9. Изучение иммуногенности разработанного средства путем оценки клеточного иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинации.
Цель данного эксперимента заключалась определении напряженности клеточного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 у добровольцев после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.
В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.
1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
2) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
Добровольцы были однократно внутримышечно иммунизированы соответствующим средством. Перед иммунизацией, а также через 14 и 28 дней, у пациентов отбирали образцы крови, из которых выделяли мононуклеарные клетки методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла (1,077 g/mL; ПанЭко). Далее выделенные клетки окрашивали флуоресцентным красителем CFSE (Invivogen, США) и высевали на лунки 96л планшета (2*105 кл/лунку). Затем проводили повторную стимуляцию лимфоцитов в условиях in vitro добавлением в культуральную среду S белка коронавируса (конечная концентрация белка 1мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали интактные клетки, к которым не добавляли антиген. Через 72 часа после добавления антигена проводили измерение % пролиферирующих клеток, а культуральную среду отбирали для измерения количества гамма-интерферона.
Для определения % пролиферирующих клеток проводили их окрашивание антителами против маркерных молекул Т лимфоцитов CD3, CD4, CD8 (anti-CD3 Pe-Cy7 (BDBiosciences, клон SK7), anti-CD4 APC (BDBiosciences, клон SK3), anti-CD8 PerCP-Cy5.5 (BDBiosciences, клон SK1)). Пролиферирующие (с меньшим количеством красителя CFSE клеток) CD4+ и CD8+ Т лимфоциты определяли в клеточной смеси с использованием проточного цитофлюориметра BD FACS AriaIII (BDBiosciences, США). Результирующий процент пролиферирующих клеток в каждом образце определяли путем вычитания результата, полученного при анализе интактных клеток их результата, полученного при анализе клеток рестимулированных антигеном S коронавируса. Полученные результаты представлены на Фиг.3,4.
Результаты проведенного исследования показали, что рост напряженности клеточного иммунитета, вызванного иммунизацией добровольцев различными вариантами средства, согласно медиане значений пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, отмечается с увеличением дней после иммунизации. Во всех группах максимальные значения, пролиферирующих как CD4+, так и CD8+ Т-лимфоцитов наблюдаются на 28 день после иммунизации. Между 0 и 28 днем исследования наблюдается максимальная статистически достоверная разница в значениях, пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов - p<0,001.
Таким образом, исходя из приведенных данных можно заключить, что иммунизация разработанным средством способна вызвать формирование напряженного антиген-специфического клеточного звена противоинфекционного иммунитета, что подтверждается высокой степенью статистической достоверности в измеряемых параметрах до и после иммунизации.
Пример 10. Оценка нежелательных явлений у добровольцев после однократной и двукратной иммунизации вариантами разработанного средства.
Цельданного эксперимента заключалась определении побочных эффектов у добровольцев после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.
В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. Все участники исследования были разделены на несколько групп.
1) Однократноевнутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
2) Однократное внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
3) Двукратная схема иммунизации, при которой вначале вводят средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме 1011 вирусных частиц/дозу, а через 21 день вводят средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме 1011 вирусных частиц/дозу, 20 человек.
В таблице 3включены данные об основных нежелательных явлениях, зарегистрированных с момента начала исследования и вплоть до визита (телефонного контакта) 180-го дня в рамках исследования.
| Кол-во субъектов (%) Кол-во событий | ||||
|
Группа 1
(Ad26-too-CMV-S-CoV2) |
Группа 2
(Ad5-too-CMV-S-CoV2) |
Группа 3
(Ad26-too-CMV-S-CoV2+ Ad5-too-CMV-S-CoV2) |
||
| Лабораторные и инструментальные данные | ||||
| Повышение числа Т-лимфоцитов | 3 (33.33%) 3 | 6 (66.67%) 6 | 7 (35.00%) 7 | |
| Снижение числа естественных клеток-киллеров | 5 (55.56%) 5 | 4 (44.44%) 4 | 7 (35.00%) 8 | |
| Повышение числа B-лимфоцитов | 3 (33.33%) 3 | 5 (55.56%) 5 | 5 (25.00%) 5 | |
| Повышение числа моноцитов | 5 (55.56%) 5 | 0 (0.00%) 0 | 1 (5.00%) 1 | |
| Увеличение количества CD4-лимфоцитов | 2 (22.22%) 2 | 2 (22.22%) 2 | 6 (30.00%) 6 | |
| Уменьшение процентного содержания лимфоцитов CD8 | 4 (44.44%) 4 | 0 (0.00%) 0 | 5 (25.00%) 5 | |
| Повышение количества CD8-лимфоцитов | 1 (11.11%) 1 | 2 (22.22%) 2 | 4 (20.00%) 4 | |
| Повышение уровня иммуноглобулина Е (IgE) в крови | 1 (11.11%) 1 | 2 (22.22%) 2 | 3 (15.00%) 3 | |
| Повышение скорости оседания эритроцитов | 1 (11.11%) 1 | 1 (11.11%) 1 | 2 (10.00%) 2 | |
| Повышение числа естественных клеток-киллеров | 0 (0.00%) 0 | 2 (22.22%) 2 | 4 (20.00%) 4 | |
| Уменьшение соотношения CD4/CD8 | 1 (11.11%) 1 | 1 (11.11%) 1 | 4 (20.00%) 4 | |
| Повышение числа лейкоцитов | 1 (11.11%) 1 | 0 (0.00%) 0 | 1 (5.00%) 1 | |
| Повышение числа тромбоцитов | 1 (11.11%) 1 | 0 (0.00%) 0 | 1 (5.00%) 1 | |
| Снижение количества CD4-лимфоцитов | 1 (11.11%) 1 | 0 (0.00%) 0 | 2(10.00%) 2 | |
| Увеличение процентного содержания лимфоцитов | 1 (11.11%) 1 | 0 (0.00%) 0 | 7(35.00%) 7 | |
| Увеличение соотношения CD4/CD8 | 0 (0.00%) 0 | 1 (11.11%) 1 | 2 (10.0%) 2 | |
| Общие нарушения и реакции в месте введения | ||||
| Боль в месте вакцинации | 7 (77.78%) 7 | 5 (55.56%) 5 | 8 (40.00%) 10 | |
| Гипертермия | 8 (88.89%) 9 | 2 (22.22%) 2 | 19 (55.00%) 35 | |
| Астения | 3 (33.33%) 3 | 3 (33.33%) 3 | 11 (55.00%) 13 | |
| Боль | 3 (33.33%) 4 | 2 (22.22%) 2 | 4 (20.00%) 7 | |
| Снижение аппетита | 2 (22.22%) 2 | 0 (0.00%) 0 | 1 (5.00%) 1 | |
| Пирексия | 0 (0.00%) 0 | 1 (11.11%) 1 | 1 (5.00%) 1 | |
| Нарушения со стороны нервной системы | ||||
| Головная боль | 6 (66.67%) 6 | 3 (33.33%) 3 | 11 (55.00%) 15 | |
| Нарушения со стороны дыхательной системы, органов грудной клетки и средостения | ||||
| Боль в ротоглотке (орофарингеальная) | 0 (0.00%) 0 | 1 (11.11%) 1 | 1 (5.00%) 1 | |
| Ринорея | 0 (0.00%) 0 | 0 (0.00%) 0 | 4 (20.00%) 4 | |
| Першение в горле | 0 (0.00%) 0 | 0 (0.00%) 0 | 2(10.00%) 2 | |
| Заложенность носа | 0 (0.00%) 0 | 0 (0.00%) 0 | 1 (5.00%) 1 | |
| Чихание | 0 (0.00%) 0 | 0 (0.00%) 0 | 1 (5.00%) 1 | |
| Вирусная инфекция верхних дыхательных путей | 1 (11.11%) 1 | 0 (0.00%) 0 | 0 (0.00%) 0 | |
| Желудочно-кишечные нарушения | ||||
| Диарея | 1 (11.11%) 1 | 0 (0.00%) 0 | 3(15.00) 3 | |
| Нарушения со стороны иммунной системы | ||||
| Крапивница | 1 (11.11%) 1 | 0 (0.00%) 0 | 0 (0.00%) 0 | |
Как видно из представленных данных однократная схема иммунизации разработанным средством для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой формевызывает существенно меньше побочных эффектов, по сравнению с двукратной схемой иммунизации.
Пример 11. Определение эффективности интраназальной иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответа.
Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного средства при интраназальном введении.
В эксперименте использованы мыши линии C57/Bl6, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:
1) Однократное интраназальноевведение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
2) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
3) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
4) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
5) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
6) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
7) Однократное интраназальное введение буферного раствора (отрицательный контроль).
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.
Таблица 4 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
| Группа животных | Титр антител |
| Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозу | 919 |
| Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозу | 8445 |
| simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозу | 6400 |
| Ad26-too-CMV-S-CoV2,5*1011вч/дозу | 1838 |
| Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозу | 19401 |
| simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозу | 12800 |
| Буферный раствор | 0 |
Как видно из полученных результатов интраназальная иммунизация животных разработанным средством приводила к повышению титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме путем его интраназальноговведения.
Пример 12. Оценка иммуногенности разработанного средства при совместной внутримышечной и интраназальной иммунизации.
Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного средства при совместном интраназальном введении и внутримышечном введении.
В эксперименте использованы мыши линии C57/Bl6, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:
1) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
2) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу
3) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
4) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
5) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
6) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
7) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
8) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу
9) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу
10) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
11) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу
12) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
13) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
14) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
15) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
16) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
17) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
18) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
19) Интраназальное введение буферного раствора и одновременно внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).
20) Интраназальное введение буферного раствора(отрицательный контроль).
21) Внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 % молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.
Таблица 5 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
| Группа животных | Титр антител | |
| 1 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозуи/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозув/м |
3200 |
| 2 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозуи/н | 1056 |
| 3 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозув/м | 2111 |
| 4 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозуи/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозув/м, |
38802 |
| 5 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозуи/н | 8445 |
| 6 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозув/м | 33779 |
| 7 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозуи/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозув/м |
22286 |
| 8 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозуи/н | 6400 |
| 9 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозув/м | 16890 |
| 10 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозуи/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозув/м |
44572 |
| 11 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозуи/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозув/м |
44572 |
| 12 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозуи/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозув/м |
51200 |
| 13 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозуи/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозув/м |
51200 |
| 14 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу и/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозув/м |
19401 |
| 15 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1010вч/дозуи/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1010 вч/дозу в/м |
22286 |
| 16 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозуи/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозув/м |
3676 |
| 17 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозуи/н, | 1213 |
| 18 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозув/м | 2425 |
| 19 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозуи/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозув/м |
44572 |
| 20 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозуи/н | 9701 |
| 21 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозув/м | 33779 |
| 22 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозуи/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозув/м |
25600 |
| 23 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозуи/н | 7352 |
| 24 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозув/м | 19401 |
| 25 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозуи/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозув/м |
51200 |
| 26 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозуи/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозув/м |
51200 |
| 27 | Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011 вч/дозуи/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозув/м |
51200 |
| 28 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозуи/н, Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*1011 вч/дозув/м |
58813 |
| 29 | Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011 вч/дозу и/н, simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозув/м |
22286 |
| 30 | simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*1011вч/дозуи/н, Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*1011 вч/дозу в/м |
25600 |
| 31 | Буферный раствор и/н Буферный раствор в/м |
0 |
| 32 | Буферный раствор и/н | 0 |
| 33 | Буферный раствор в/м | 0 |
Как видно из полученных результатов совместная интраназальная и внутримышечная иммунизация животных разработанным средством приводила к более мощному гуморальному иммунному ответу, по сравнению с иммунизацией только одним способом. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 путем совместного и одновременного внутримышечного и интраназальноговведения.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность фармацевтических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 и промышленную применимость.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный
исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного
академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации
<120>Средство для индукции специфического иммунитета против вируса
тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме
(варианты).
<160>7
<170>BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 4711
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 1
atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata 60
acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat 120
aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgga 180
gtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcc 240
ccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt 300
atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgat 360
gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag 420
tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttcc 480
aaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtggga 540
ggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagagatctggtaccgt 600
cgacgcggccgctcgagcctaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccac 660
tagtctctagtcagtgtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacacca 720
acagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcact 780
ctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacg 840
tgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacgggg 900
tgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacac 960
tggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaag 1020
tgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaaca 1080
agagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagt 1140
acgtgtcccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgc 1200
gcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacaccccta 1260
tcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgc 1320
ccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctga 1380
cacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacc 1440
tgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtgg 1500
attgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaa 1560
agggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttcc 1620
ccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctg 1680
tgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtaca 1740
actccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacc 1800
tgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcaga 1860
ttgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttca 1920
ccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactaca 1980
attacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctcca 2040
ccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctact 2100
tcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagag 2160
tggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaa 2220
gcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccg 2280
gcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattg 2340
ccgataccacagacgccgtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcacccctt 2400
gcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcag 2460
tgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctga 2520
cacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtc 2580
tgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggca 2640
tctgtgccagctaccagacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagcc 2700
agagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaaca 2760
actctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgt 2820
ccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgct 2880
ccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacaggga 2940
tcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctaca 3000
agacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatccta 3060
gcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccg 3120
acgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctga 3180
tttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatga 3240
tcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggag 3300
ctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcg 3360
gagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcg 3420
ccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcagg 3480
acgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaact 3540
tcggcgccatcagctctgtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccg 3600
aggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttaccc 3660
agcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgt 3720
ctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctga 3780
tgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccg 3840
ctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttc 3900
ctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttct 3960
acgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtga 4020
tcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaag 4080
aggaactggataagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatca 4140
gcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtgg 4200
ccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtaca 4260
tcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatgg 4320
tcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagct 4380
gtggcagctgctgcaagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaat 4440
tacattacacataagatatccgatccaccggatctagataactgatcataatcagccata 4500
ccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctga 4560
aacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttaca 4620
aataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagtt 4680
gtggtttgtccaaactcatcaatgtatctt a 4711
<210> 2
<211> 5984
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CAG-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 2
gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcc 60
catatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgccca 120
acgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaataggga 180
ctttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatc 240
aagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcct 300
ggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtat 360
tagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatct 420
ccccccctcccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatg 480
ggggcggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcgggg 540
cgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttcctttta 600
tggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcg 660
ctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggc 720
tctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggct 780
gtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttg 840
aggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtg 900
tgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggc 960
gcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtg 1020
ccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtggg 1080
gggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccc 1140
cgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcgggg 1200
ctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcct 1260
cgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcga 1320
ggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggactt 1380
cctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagc 1440
gggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgt 1500
gcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggac 1560
ggctgccttcggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggct 1620
ctagaaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccactagtctctagtcagt 1680
gtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagag 1740
gcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgt 1800
tcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatg 1860
gcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagca 1920
ccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagaccc 1980
agagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagt 2040
tctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaa 2100
gcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctt 2160
tcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttca 2220
agaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcggg 2280
atctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaaca 2340
tcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagca 2400
gcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaacct 2460
tcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatc 2520
ctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccaga 2580
ccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatc 2640
tgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaacc 2700
ggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttca 2760
gcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacg 2820
tgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacaga 2880
caggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattg 2940
cctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggc 3000
tgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcagg 3060
ccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcct 3120
acggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagct 3180
tcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtga 3240
agaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagaga 3300
gcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattgccgataccacagacg 3360
ccgtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggag 3420
tgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccaggacg 3480
tgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcggg 3540
tgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagc 3600
acgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctacc 3660
agacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcct 3720
acacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatcc 3780
ccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagacca 3840
gcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgc 3900
agtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacagg 3960
acaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatca 4020
aggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagc 4080
ggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatca 4140
agcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagt 4200
ttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacat 4260
ctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgc 4320
agatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatg 4380
tgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatcc 4440
aggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccaga 4500
atgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagct 4560
ctgtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgaca 4620
gactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagag 4680
ccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgg 4740
gccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagt 4800
ctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatt 4860
tcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgt 4920
tcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatca 4980
tcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaaca 5040
ataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagt 5100
actttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaatcaatgcca 5160
gcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacg 5220
agagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggt 5280
acatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgctgt 5340
gttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgca 5400
agttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacattacacataat 5460
tcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctgg 5520
ctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagc 5580
cccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgtt 5640
ggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatc 5700
agaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgccatgaaca 5760
aaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttat 5820
tccatagaaaagccttgacttgaggttagatttttttatattttgttttgtgttattttt 5880
tctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcc 5940
tgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagatc 5984
<210> 3
<211> 5314
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая EF1-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 3
ggtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagt 60
tggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactggg 120
aaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataa 180
gtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaa 240
gtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgcctt 300
gaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtg 360
ggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgagg 420
cctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcg 480
ctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttt 540
tctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttg 600
gggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcc 660
tgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctgg 720
tgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcgg 780
caccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaat 840
ggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcct 900
ttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacc 960
tcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatg 1020
cgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttga 1080
tgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctc 1140
agacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggaattagcttggtac 1200
taatacgactcacaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccactagtctc 1260
tagtcagtgtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctt 1320
taccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctaccca 1380
ggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccgg 1440
caccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactt 1500
tgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacag 1560
caagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcga 1620
gttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctg 1680
gatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtc 1740
ccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagtt 1800
cgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacct 1860
cgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcgg 1920
catcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctgg 1980
cgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcc 2040
tagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgc 2100
tctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcat 2160
ctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatat 2220
caccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgc 2280
ctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgc 2340
cagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgctt 2400
cacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccc 2460
tggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctg 2520
tgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacct 2580
gtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagat 2640
ctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccact 2700
gcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggt 2760
gctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaa 2820
tctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgct 2880
gacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattgccgatac 2940
cacagacgccgtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagctt 3000
cggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgta 3060
ccaggacgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctac 3120
atggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcgg 3180
agccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgc 3240
cagctaccagacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagccagagcat 3300
cattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctat 3360
cgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgac 3420
caagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacct 3480
gctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgt 3540
ggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccc 3600
tcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcc 3660
cagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccgg 3720
cttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgc 3780
ccagaagtttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgccca 3840
gtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgc 3900
cgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgac 3960
ccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcgg 4020
caagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggt 4080
caaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgc 4140
catcagctctgtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccgaggtgca 4200
gatcgacagactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttacccagcagct 4260
gatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtg 4320
tgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagctt 4380
ccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaaga 4440
gaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagaga 4500
aggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagcc 4560
ccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcat 4620
tgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaact 4680
ggataagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaat 4740
caatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaa 4800
tctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatcaagtg 4860
gccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaat 4920
catgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcag 4980
ctgctgcaagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacatta 5040
cacataagatctagagtcggggcggccggccgctcgctgatcagcctcgactgtgccttc 5100
tagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgc 5160
cactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtg 5220
tcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaa 5280
tagcaggcatgctggggatccgagtgtcgataag 5314
<210> 4
<211> 4678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 4
atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata 60
acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat 120
aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgga 180
gtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcc 240
ccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt 300
atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgat 360
gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag 420
tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttcc 480
aaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtggga 540
ggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagagatctggtaccat 600
gtttgtgttccttgtgttattgccactagtctctagtcagtgtgtgaacctgaccacaag 660
aacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaa 720
ggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaa 780
cgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaa 840
ccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcat 900
cagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaa 960
caacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcct 1020
gggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacag 1080
cagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaagg 1140
caagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctactt 1200
caagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctc 1260
tgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacact 1320
gctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagcagcagcggatggacagctgg 1380
tgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacga 1440
gaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtg 1500
caccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgca 1560
gcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggt 1620
gttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattg 1680
cgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacgg 1740
cgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgt 1800
gatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgacta 1860
caactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacct 1920
ggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatct 1980
gaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaa 2040
cggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaa 2100
tggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccc 2160
tgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaactt 2220
caacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgcc 2280
attccagcagtttggccgggatattgccgataccacagacgccgtacgagatccccagac 2340
actggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctgg 2400
caccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaagtgcc 2460
cgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaa 2520
tgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacga 2580
gtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccagacacagacaaacagccc 2640
cagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgc 2700
cgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatcag 2760
cgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgta 2820
catctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcac 2880
ccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggt 2940
gttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaa 3000
tttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacct 3060
gctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtct 3120
gggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgct 3180
gccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcac 3240
aatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgca 3300
gatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaa 3360
gctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcac 3420
agcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacac 3480
cctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgacatcct 3540
gagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggct 3600
gcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctc 3660
tgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtgga 3720
cttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggt 3780
gtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccat 3840
ctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcaccca 3900
ttggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacacctt 3960
cgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctct 4020
gcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagtactttaagaaccacacaag 4080
ccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaa 4140
agagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgca 4200
agaactggggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggctttat 4260
cgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctg 4320
tagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgacgaggacgattc 4380
tgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacattacacataagatatcgcggccgctcgagt 4440
ctagataactgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaa 4500
acctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaact 4560
tgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaata 4620
aagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatctta 4678
<---
Claims (9)
1. Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
2. Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
3. Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3.
4. Средство по пп. 1-3, отличающееся тем, что дополнительно содержит буферный раствор, содержащий, масс. %:
5. Применение средства по пп. 1-3 для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, где указанное средство предназначено для интраназального или внутримышечного введения или совместного интраназального и внутримышечного введения.
6. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное средство предназначено для интраназального введения в дозе 5*1010-5*1011 вирусных частиц.
7. Применение по п. 5, отличающееся тем, что указанное средство предназначено для внутримышечного введения в дозе 5*1010-5*1011 вирусных частиц.
8. Применение по п. 5, отличающееся тем, что при совместном введении интраназально и внутримышечно указанное средство внутримышечно вводят в дозе 5*1010-5*1011 вирусных частиц, а интраназально в дозе 5*1010-5*1011 вирусных частиц.
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021103099A RU2743963C1 (ru) | 2021-02-09 | 2021-02-09 | Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты) |
| KR1020227008478A KR20220115554A (ko) | 2021-02-09 | 2021-04-30 | 액체 형태의 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 제제(변이체) |
| CA3156263A CA3156263A1 (en) | 2021-02-09 | 2021-04-30 | Agent for inducing specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 in liquid form (variants) |
| BR112022004767A BR112022004767A2 (pt) | 2021-02-09 | 2021-04-30 | Agente para induzir imunidade específica contra o vírus da síndrome respiratória aguda grave sars-cov-2 na forma líquida (variantes) |
| CN202180005353.9A CN115210378A (zh) | 2021-02-09 | 2021-04-30 | 用于诱导对sars-cov-2特异性免疫的药剂 |
| PCT/RU2021/000183 WO2022086365A1 (en) | 2021-02-09 | 2021-04-30 | Agent for inducing specific immunity against sars-cov-2 |
| EP21859328.3A EP4013881A4 (en) | 2021-02-09 | 2021-04-30 | AGENT INTENDED TO INDUCE SPECIFIC IMMUNITY AGAINST SARS-COV-2 |
| JP2022516698A JP2023501869A (ja) | 2021-02-09 | 2021-04-30 | 重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための液体形態（変異型）の薬剤 |
| MX2022003069A MX2022003069A (es) | 2021-02-09 | 2021-04-30 | Agente para inducir inmunidad especifica contra el virus del sindrome respiratorio agudo grave sars-cov-2 en forma liquida (variantes). |
| ARP220100254A AR126626A1 (es) | 2021-02-09 | 2022-02-08 | AGENTE PARA INDUCIR INMUNIDAD ESPECÍFICA CONTRA EL VIRUS DEL SÍNDROME RESPIRATORIO AGUDO SEVERO SARS-CoV-2 EN FORMA LÍQUIDA (VARIANTES) |
| ZA2022/02986A ZA202202986B (en) | 2021-02-09 | 2022-03-11 | Agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome coronavirus (sars-cov-2) in liquid form (versions) |
| IL291334A IL291334A (en) | 2021-02-09 | 2022-03-13 | Agent for inducing specific immunity against severe acute respiratory syndrome coronavirus (sars-cov-2) in liquid form (versions) |
| US17/718,596 US20220259618A1 (en) | 2021-02-09 | 2022-04-12 | Agent for inducing specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 in liquid form (variants) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021103099A RU2743963C1 (ru) | 2021-02-09 | 2021-02-09 | Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2743963C1 true RU2743963C1 (ru) | 2021-03-01 |
Family
ID=74857618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021103099A RU2743963C1 (ru) | 2021-02-09 | 2021-02-09 | Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты) |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220259618A1 (ru) |
| EP (1) | EP4013881A4 (ru) |
| JP (1) | JP2023501869A (ru) |
| KR (1) | KR20220115554A (ru) |
| CN (1) | CN115210378A (ru) |
| AR (1) | AR126626A1 (ru) |
| BR (1) | BR112022004767A2 (ru) |
| CA (1) | CA3156263A1 (ru) |
| IL (1) | IL291334A (ru) |
| MX (1) | MX2022003069A (ru) |
| RU (1) | RU2743963C1 (ru) |
| WO (1) | WO2022086365A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA202202986B (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2761904C1 (ru) * | 2021-11-26 | 2021-12-13 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей |
| RU2779634C1 (ru) * | 2022-08-19 | 2022-09-12 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вирусов SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) и SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) (варианты) |
| WO2022193552A1 (zh) * | 2021-03-18 | 2022-09-22 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220356212A1 (en) * | 2021-03-26 | 2022-11-10 | Nanogen Pharmaceutical Biotechnology JSC | Modified spike protein and method of treatment |
| CN115976078B (zh) * | 2022-12-30 | 2023-08-15 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种广谱的腺病毒载体新冠疫苗 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110974950A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-04-10 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗 |
| CN111217917A (zh) * | 2020-02-26 | 2020-06-02 | 康希诺生物股份公司 | 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2疫苗及其制备方法 |
| RU2733834C1 (ru) * | 2020-07-28 | 2020-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
| WO2020243719A1 (en) * | 2019-05-30 | 2020-12-03 | Gritstone Oncology, Inc. | Modified adenoviruses |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2720614C9 (ru) * | 2020-04-23 | 2021-02-09 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) |
| RU2731342C9 (ru) * | 2020-08-22 | 2021-10-05 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) |
| RU2731356C9 (ru) * | 2020-08-22 | 2021-10-05 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Экспрессионный вектор для создания иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) |
-
2021
- 2021-02-09 RU RU2021103099A patent/RU2743963C1/ru active
- 2021-04-30 KR KR1020227008478A patent/KR20220115554A/ko not_active Ceased
- 2021-04-30 MX MX2022003069A patent/MX2022003069A/es unknown
- 2021-04-30 CN CN202180005353.9A patent/CN115210378A/zh active Pending
- 2021-04-30 EP EP21859328.3A patent/EP4013881A4/en active Pending
- 2021-04-30 CA CA3156263A patent/CA3156263A1/en not_active Abandoned
- 2021-04-30 JP JP2022516698A patent/JP2023501869A/ja active Pending
- 2021-04-30 WO PCT/RU2021/000183 patent/WO2022086365A1/en not_active Ceased
- 2021-04-30 BR BR112022004767A patent/BR112022004767A2/pt not_active Application Discontinuation
-
2022
- 2022-02-08 AR ARP220100254A patent/AR126626A1/es unknown
- 2022-03-11 ZA ZA2022/02986A patent/ZA202202986B/en unknown
- 2022-03-13 IL IL291334A patent/IL291334A/en unknown
- 2022-04-12 US US17/718,596 patent/US20220259618A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020243719A1 (en) * | 2019-05-30 | 2020-12-03 | Gritstone Oncology, Inc. | Modified adenoviruses |
| CN111217917A (zh) * | 2020-02-26 | 2020-06-02 | 康希诺生物股份公司 | 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2疫苗及其制备方法 |
| CN111217917B (zh) * | 2020-02-26 | 2020-10-23 | 康希诺生物股份公司 | 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2疫苗及其制备方法 |
| CN110974950A (zh) * | 2020-03-05 | 2020-04-10 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗 |
| CN110974950B (zh) * | 2020-03-05 | 2020-08-07 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗 |
| RU2733834C1 (ru) * | 2020-07-28 | 2020-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022193552A1 (zh) * | 2021-03-18 | 2022-09-22 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 新型冠状病毒Ad26腺病毒载体疫苗及其制备方法与应用 |
| RU2761904C1 (ru) * | 2021-11-26 | 2021-12-13 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей |
| WO2022197209A1 (en) * | 2021-11-26 | 2022-09-22 | Federal State Budgetary Institution "National Research Centre For Epidemiology And Microbiology Named After The Honorary Academician N. F. Gamaleya" Of The Ministry Of Health Of The Russian Federation | Induction of immunity to sars-cov-2 in children |
| RU2779634C1 (ru) * | 2022-08-19 | 2022-09-12 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вирусов SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) и SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) (варианты) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220115554A (ko) | 2022-08-17 |
| ZA202202986B (en) | 2023-12-20 |
| CA3156263A1 (en) | 2022-08-09 |
| AR126626A1 (es) | 2023-11-01 |
| JP2023501869A (ja) | 2023-01-20 |
| US20220259618A1 (en) | 2022-08-18 |
| EP4013881A4 (en) | 2022-11-30 |
| WO2022086365A1 (en) | 2022-04-28 |
| BR112022004767A2 (pt) | 2022-06-21 |
| IL291334A (en) | 2022-05-01 |
| EP4013881A1 (en) | 2022-06-22 |
| MX2022003069A (es) | 2022-07-12 |
| CN115210378A (zh) | 2022-10-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2743963C1 (ru) | Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты) | |
| WO2021076010A1 (en) | Pharmaceutical agent for inducing specific immunity against sars-cov-2 | |
| US20220249655A1 (en) | Agent for inducing specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 in lyophilized form (variants) | |
| JP7369276B2 (ja) | 重症急性呼吸器症候群ウイルスｓａｒｓ－ｃｏｖ－２に対する発現ベクター | |
| CN101921310A (zh) | 登革病毒特异性hla-a2限制性表位肽及应用 | |
| EA043101B1 (ru) | Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома sars-cov-2 в жидкой форме (варианты) | |
| JP2023507543A (ja) | 年齢６０歳超であり、そして／あるいは慢性疾患を有する対象において重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための作用物質（変形例）の使用 | |
| RU2779634C1 (ru) | Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вирусов SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) и SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) (варианты) | |
| EA042634B1 (ru) | СРЕДСТВО ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ТЯЖЕЛОГО ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА SARS-CoV-2 В ЛИОФИЛИЗИРОВАННОЙ ФОРМЕ (ВАРИАНТЫ) | |
| RU2811791C1 (ru) | Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 19 серотипа и способ его применения | |
| RU2761904C1 (ru) | Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей | |
| JP7360544B2 (ja) | Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２に対する特異的免疫を誘導するための医薬品 | |
| RU2823965C1 (ru) | Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против вируса Ласса и способ его применения | |
| CA3156264A1 (en) | Utilization of an agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 in children | |
| US20220265816A1 (en) | Use of the agent for induction of specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 for revaccination of population (variants) | |
| EA048601B1 (ru) | Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 19 серотипа и способ его применения | |
| EA042672B1 (ru) | ПРИМЕНЕНИЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ТЯЖЕЛОГО ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА SARS-CoV-2 У ЛИЦ СТАРШЕ 60 ЛЕТ И/ИЛИ ИМЕЮЩИХ ХРОНИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ (ВАРИАНТЫ) | |
| WO2024219994A1 (ru) | Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 19 серотипа и способ его применения | |
| EA043163B1 (ru) | Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома sars-cov-2 для ревакцинации населения (варианты) | |
| WO2023128799A1 (ru) | ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ SARS-CoV-2 И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) | |
| WO2022177466A1 (en) | The use of the agent for inducing immunity to sars-cov-2 | |
| CN103965288A (zh) | 登革病毒特异性hla-a*2402限制性表位肽及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210902 Effective date: 20210902 |