RU2848886C1 - Способ прогнозирования вибрационной болезни у работников горнообогатительных предприятий - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к гигиене труда и профессиональных заболеваний, и может быть использовано для прогнозирования вибрационной болезни у работников горнообогатительных предприятий. Из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК. Проводят генотипирование полиморфного локуса rs527590 гена нейрональной синтазы оксида азота (NOS1). При выявлении генотипа CC прогнозируют высокий риск развития вибрационной болезни у работников горнообогатительных предприятий. Способ обеспечивает повышение точности прогнозирования вибрационной болезни у работников горнообогатительных предприятий за счет выявления генотипа CC полиморфного локуса rs527590 гена NOS1. 1 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к гигиене труда и профзаболеваний, предназначено для прогнозирования риска развития вибрационной болезни (ВБ).

ВБ представляет собой профессиональное заболевание, возникающее в результате продолжительного воздействия вибрации с различными частотами на производстве. Развитие ВБ связано с различными регуляторными нарушениями, которые могут быть обусловлены нейрогуморальными, нейроэндокринными или рефлекторными дисфункциями [Бабанов С.А., Азовскова Т.А., Вакурова Н.В., Бараева Р.А. О современных аспектах классификации вибрационной болезни // Терапевт.- 2019. - N 4. - С. 21-27; Вибрационная болезнь: эволюция классификационных представлений, диагностика, вопросы экспертизы / С.А. Бабанов, Т.А. Азовскова, Т.М. Кирюшина и др. // Врач. - 2023. - N 4. - С. 11-17. doi: 10.29296/25877305-2023-04-02]. Изменения в регуляции сосудистого тонуса способствуют локальным нарушениям кровообращения, включая ангиодистонические синдромы и спазмы сосудов. Со временем это приводит к дистрофии, и патологический процесс может перейти в ангиотрофоневроз, который в запущенных случаях имеет тенденцию к генерализации. В патогенезе ВБ играют роль, как специфические реакции организма, так и адаптационные и компенсаторные механизмы. На развитие заболевания влияет много факторов, включая генетический компонент.

Химическим посредником, который опосредует такие функции, как вазодилатация и нейротрансмиссия, является оксид азота. При этом оксид азота участвует в нейротоксичности, связанной с инсультом и нейродегенеративными заболеваниями, а также нервной регуляцией гладких мышц. Образование оксида азота катализирует семейство цитохром P-450-подобных гемопротеинов - NO-синтаз (NOS). Это семейство включает синтазу оксида азота 1 типа, известную как нейрональная синтаза оксида азота (NOS1), которая кодируется геном NOS1. Однако, несмотря на свое название, она экспрессируется не только в мозге, но и в мышцах и других тканях организма. Оксид азота, вырабатываемый эндотелиальными клетками, вызывает вазодилатацию и гипотонию. Он также обладает рядом антитромботических и антиатеросклеротических свойств. Таким образом, NOS1 играет ключевую роль в развитии атеросклероза и регуляции кровотока, и вполне вероятно, что его влияние на ишемический инсульт может быть опосредовано этими двумя основными клиническими факторами риска. Известны полиморфизмы гена NOS1, связанные с восприимчивостью к ишемическому инсульту [Variants within the nitric oxide synthase 1 gene are associated with stroke susceptibility / H. Manso, T. King, J. Sobral et al. // Atherosclerosis. - 2012. - Vol. 220, N 2. - P. 443-448. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2011.11.011; Association of nNOS gene polymorphism with ischemic stroke in Han Chinese of North China / Y. Dai, Z. He, R. Sui et al. // ScientificWorldJournal. - 2013. - Vol. 2013. - P. 891581. doi: 10.1155/2013/891581]. Показано, что полиморфный локус rs527590 гена NOS1 ассоциирован с феноменом Рейно в общей популяции, а также влияет на экспрессию гена NOS1 [Association of Raynaud's phenomenon with a polymorphism in the NOS1 gene / S. Munir, M.B. Freidin, S. Brain, F.M.K. Williams // PLoS One. - 2018. - Vol. 13, N 4. - P. e0196279. doi: 10.1371/journal.pone.0196279]. Роль гена NOS1 в развитии ВБ требует уточнения.

Известен способ прогнозирования развития ВБ, заключающийся в воздействии на человека дозированной вибрационной нагрузки и последующим контролем его состояния [патент UA 15007 А, 1993 г.]. Авторы патента осуществляли контроль состояния по значениям латентных периодов пиков вестибулярных вызванных потенциалов, дополнительно контролировали исходное состояние, показатели которого сравнивали с показателями состояния после вибрационного воздействия, по результатам сравнения при отсутствии восстановления латентных периодов пиков N1 и Р2 после 30-45-минутного отдыха прогнозировали развитие ВБ. К недостаткам данного метода можно отнести трудоемкость получения результатов из-за большого количества исследований и корректной их обработки.

Известен способ прогнозирования ВБ, основанный на исследовании агрегатного состояния крови и определении скорости АДФ-агрегации тромбоцитов плазмы крови как показателя ранних нарушений функции тромбоцитов плазмы крови у лиц, подвергающихся воздействию локальной вибрации; при увеличении скорости АДФ-агрегации тромбоцитов на 40% относительно нормы при условии относительного постоянства других показателей агрегатного состояния крови прогнозируют ВБ [патент SU 1801211 A3, 1993 г.]. Способ позволяет повысить точность выявления предпатологического состояния ВБ в общем комплексе клинико-биохимических исследований, а именно предпатологии в системе регуляции агрегатного состояния крови. К недостаткам известного способа следует отнести то, что он основан на анализе только прогностических клинико-биохимических показателей и не учитывает индивидуальные генетические особенности больного, определяющие генетическую предрасположенность к развитию заболевания.

Известен способ прогнозирования течения ВБ у лиц, работающих в контакте с локальной вибрацией, характеризующийся тем, что определяют содержание фолликулостимулирующего гормона и в случае, если этот показатель составляет более 6,0 МЕД/мл прогнозируют переход болезни из I степени во II [авторское свидетельство SU 1735770 А1, 1992 г.]. Данный способ разработан для прогноза только течения ВБ и не предназначен для прогноза развития ВБ.

Прототипом изобретения является способ прогнозирования формирования и течения ВБ на основании анализа распределения частоты встречаемости генотипов полиморфизма Pro198Leu гена GPX1 и Ala16Val гена MnSOD, а также оценки метаболических процессов у больных ВБ с разной устойчивостью к действию производственной вибрации [Потеряева Е.Л., Смирнова Е.Л., Никифорова Н.Г. Прогнозирование формирования и течения вибрационной болезни на основе изучения геннометаболических маркеров // Медицина труда и промышленная экология. - 2015. - N 6. С.19-22]. Данный способ предполагает прогнозирование формирования и течения ВБ в постконтактном периоде, т.е. после прекращения контакта с производственной вибрацией.

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования развития ВБ у работников горнообогатительных предприятий.

Технический результат - повышение точности прогноза за счет получения прогностических критериев высокого риска развития ВБ у работников горнообогатительных предприятий.

Предлагаемый способ прогнозирования ВБ у работников горнообогатительных предприятий осуществляется следующим образом. У работников осуществляют забор натощак периферической венозной крови в количестве 4 мл. Проводят выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование методом ПЦР полиморфного локуса rs527590 гена нейрональной синтазы оксида азота (NOS1). При выявлении генотипа СС полиморфного локуса rs527590 гена NOS1 прогнозируют высокий риск развития ВБ.

Нами было обследовано 78 работников горнообогатительных предприятий с ВБ, находившихся на стационарном лечении в неврологическом-профпатологическом отделении клиники ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека». В качестве контрольной группы было обследовано 106 человек, не подвергавшихся в профессиональной деятельности воздействию вибрации.

ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта использовали раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 4 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью [Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y., L.: Human Press.; -1984. - V.2. - P. 31-34].

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трисНCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин. при 4000 об./мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1М трисHCl до рН 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной H₂O; раствор хранят при -20°С.

Анализ полиморфизма проводился методом полимеразной цепной реакции с детекцией накопления аллелей в реальном времени. Для проведения ПЦР использовались аликвоты исследуемых образцов ДНК. Амплификация проводилась с использованием прибора Rotor-GeneQ производства компании Quiagen. Условия амплификации были подобраны опытным путем. Температура отжига праймера расчитывалась по формуле:

Где А, Т, G и С - количество адениновых, тимидиновых, гуаниновых и цитозиновых остатков в последовательности праймера соответственно. Необходимое количество праймера расчитывалось по формуле:

где ОЕ - количество оптических единиц праймера, L - длина праймера (п.о.).

Для генотипирования полиморфного локуса rs527590 гена NOS1 использовались праймеры: rs527590-F (5'-CTCTTCAATTGTATAAAATGTATTTGC-3') и rs527590-R (5'-ACACTCCAGATGAGAAATAA-3'). Для детекции накопления аллелей в реальном времени были использованы следующие олигонуклеотидные пробы, меченные флуорофором и гасителем: rs527590-FAM-Crev (FAM-CACATTCATGCTAAGGTAG-BHQ1), rs527590-VIC-Trev (VIC-CACATTCATACTAAGGTAGG-BHQ1+N-LNA). Режим амплификации: 50 циклов со следующими параметрами: денатурация (95°С, 3 мин); денатурация (95°С, 10 сек), отжиг (54°С, 30 сек) и элонгация (72°С, 30 сек).

Интерпретацию результатов полимеразной цепной реакции в реальном времени проводили с помощью программных средств используемого реал-тайм амплификатора в автоматическом режиме.

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных использовали критерий χ² (р) для таблиц сопряженности 2×2. Для выявления факторов повышенного риска развития ВБ, проводили оценку показателя соотношения шансов (OR - odds ratio), а также границ его 95% доверительного интервала (CI95%). Степень ассоциаций оценивается в значениях показателя соотношения шансов по формуле:

где а и b - число лиц с наличием и отсутствием маркера среди больных; c и d - число лиц с наличием и отсутствием маркера среди здоровых.

При OR=1 нет ассоциации, OR>1 рассматривается как положительная ассоциация с аллелем или генотипом («фактор повышенного риска») и OR<1 - как отрицательная ассоциация («фактор устойчивости»).

При сравнении выборки больных ВБ и группы контроля выявлены достоверные различия по частотам генотипов полиморфного локуса rs527590 гена NOS1 (таблица).

В группе пациентов с ВБ статистически значимо чаще встречался генотип СС по сравнению с контрольной группой (70,51% и 53,77% соответственно, χ²=4,61; р=0,032). Рассчитанный коэффициент отношения шансов показал, что вероятность развития ВБ, повышается в 2 раза (OR=2,06, CI: 1,11-3,82) при носительстве генотипа СС.Таким образом, наличие в генотипе варианта СС полиморфного локуса rs527590 гена NOS1 является маркером для прогнозирования ВБ.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1.

Больной Т., 1965 г.р., работает помощником машиниста на горнообогатительном предприятии в течение 23 лет. Находился на стационарном лечении в клинике ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» с диагнозом гипертензивная болезнь сердца. Проведено исследование по предлагаемой методике. Установлено: является носителем гомозиготного генотипа ТТ полиморфного локуса rs527590 гена NOS1. В отношении развития ВБ прогноз благоприятный. В дальнейшем при повторной госпитализации через год профессиональной патологии не выявлено.

Пример 2.

Больной Р., 1977 г.р., проходчик, находился на стационарном обследовании в ФБУН «Уфимский НИИ медицины труда и экологии человека» с 2021 г. с признаками воздействия вибрации. Работает на горнообогатительном предприятии в течение 13 лет.

Проведено исследование по предлагаемой методике. Установлено: является носителем генотипа СС полиморфного локуса rs527590 гена NOS1. В отношении развития ВБ прогноз неблагоприятный. Оставлен под динамическое наблюдение клиники на год.

При очередном обследовании через год обнаружены клинико-инструментальные признаки, свидетельствующие о наличии ВБ от локальной вибрации: жалобы на ощущение зябкости кистей, повышенную чувствительность к воздействию холода кистей, повышенную потливость ладоней, приступы побеления дистальных фаланг пальцев рук, возникающие при контакте с вибрацией, при мытье рук холодной водой, боли ноющего характера в кистях. При осмотре обнаружено: мраморно-цианотичная окраска кожных покровов дистальных отделов рук, пастозность, гипергидроз и гипотермия ладоней, симптом «белого пятна».

При термометрии кожная температура на концевых фалангах пальцев рук составила 23,5°С, на тыле кистей - 25,3°С. Время восстановления исходной кожной температуры на пальцах кистей рук после холодовой пробы составило 35 минут. Реовазография периферических сосудов верхних конечностей выявила следующие изменения: снижение реографического индекса до 2,12 усл.ед., увеличение диастолического индекса до 63,2%, уменьшение дикротического индекса до 37,1%. При определении вибрационной чувствительности обнаружено повышение порогов вибрационной чувствительности на верхних конечностях на частотах 125 Гц и 63 Гц.

Диагностирована ВБ.

Больному решением врачебной комиссии рекомендовано рациональное трудоустройство без контакта с производственной вибрацией и неблагоприятным микроклиматом. Пациент был трудоустроен.

Пример 3.

Больной К., 1958 г.р., клинический диагноз: Ишемическая болезнь сердца. Работает более 20 лет слесарем механосборочных работ. Проведено исследование по предлагаемой методике. Установлено: является носителем гетерозиготного генотипа СТ полиморфного локуса rs527590 гена NOS1. В отношении развития ВБ прогноз благоприятный. В дальнейшем при повторной госпитализации через год профессиональной патологии не выявлено.

Claims (1)

1. Способ прогнозирования вибрационной болезни у работников горнообогатительных предприятий, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, отличающийся тем, что проводят амплификацию полиморфного локуса rs527590 гена нейрональной синтазы оксида азота (NOS1), и при выявлении генотипа CC прогнозируют высокий риск развития вибрационной болезни у работников горнообогатительных предприятий.