RU2848673C1

RU2848673C1 - Пробиотическая композиция для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта

Info

Publication number: RU2848673C1
Application number: RU2025116311A
Authority: RU
Inventors: Сослан Сергеевич Габоев; Евгения Александровна Кукес; Николай Сергеевич Фокичев; Юлия Валентиновна Чернявская; Игорь Олегович Петров
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "БИННОФАРМ ГРУПП"
Filing date: 2025-06-11
Publication date: 2025-10-21

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пробиотической композиции для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта, восстановления микрофлоры кишечника, профилактики синдрома избыточного бактериального роста и диарей, включая антибиотик-ассоциированную диарею и Clostridium dificile-ассоциированную диарею. Пробиотическая композиция выполнена в форме капсулы, содержащей сухую смесь пробиотических бактерий в соответствующем соотношении, мас. %: Bifidobacterium lactis HN019 2%, Lacticaseibacillus casei Lc-11 1%, Lactobacillus acidophilus La-14 0,7%, Lactococcus lactis Ll-23 0,6%, Lactiplantibacillus plantarum Lp-115 0,4%, Lacticaseibacillus rhamnosus GG 0,3%, Streptococcus thermophiles St-21 0,3%, Bifidobacterium lactis DSM 15954 0,13%, Bifidobacterium lactis Bl-04 0,07% и нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты в соответствующем соотношении, мас. %: микрокристаллическую целлюлозу 40%, инулин 14%, диоксид кремния 0,5%, стеарат магния 40%. Композиция обеспечивает коррекцию баланса микрофлоры у пациентов с нарушениями пищеварения, синдромом избыточного бактериального роста и диарей. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 18 табл., 9 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, более конкретно к пробиотической композиции (биологически активной пищевой добавке) для профилактики воспалительного заболевания кишечника и функциональных кишечных расстройств.

Уровень техники

Среди множества способов лечения, направленных на терапию и/или профилактику патологий желудочно-кишечного тракта, нормализацию микрофлоры желудочно-кишечного тракта, восстановление микрофлоры кишечника, профилактику синдрома избыточного бактериального роста и диарей, включая антибиотик-ассоциированную диарею и Clostridium dificile-ассоциированную диарею, выделяют способы лечения, основанные на применении лекарственных средств. У данной группы способов лечения есть несколько противопоказаний, которые ограничивают их применение в т.ч. связанные с плохой переносимостью лекарственных препаратов некоторыми категориями пациентов.

На текущий момент сохраняется потребность в лечении, которое не имеет ограничений основанных на применении лекарственных средств способов лечения и которое можно применять для большинства категорий пациентов.

Одним из возможных подходов является создание пробиотических композиций для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта пациента.

В литературе неоднократно было показано, что микроорганизмы, колонизирующие кишечник человека еще при рождении, оказывают важное влияние на здоровье хозяина, играя важную роль в работе пищеварительной системы, в том числе, в усвоении минеральных веществ, в работе иммунной системы.

Из уровня техники известны многочисленные препараты пробиотических бифидо- и лактобактерий, предназначенные для применения в различных специфических целях.

Например, в патенте РФ 2636027 раскрывается применение пробиотического штамма Lactobacillus paracasei 8700:2, DSM 13434 для лечения или профилактики остеопороза, лечения или профилактики потери костной ткани или для повышения абсорбции ионов Са²⁺ у млекопитающего.

В патенте РФ 2464994 описывается применение бактерий, выбранных из штаммов Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, способных стимулировать развитие начальной бифидогенной кишечной микробиоты, в производстве пробиотической композиции для снижения у грудного ребенка риска развития избыточного веса или ожирения в последующей жизни, где пробиотик назначают в перинатальный и/или постнатальный период в суточной дозе 10³-10¹²КОЕ.

В патенте РФ 2826972 показано применение кисломолочных продуктов, ферментированных пробиотическими штаммами бактерий Bacillus subtilis ТНП-3 и Bacillus subtilis ТНП-5, при лечении больных туберкулезом легких стандартной длительной противотуберкулезной терапией с учетом лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в качестве дополнительного питания в дополнение к стационарному питанию ежедневно один раз в день в полдник.

В патенте РФ 2767400 раскрывается способ изготовления пробиотической композиции, включающий раздельное высевание культур пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus и пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve в жидкую среду МРС с последующим термостатированием указанных культур в течение 24-72 часов при температуре 37±0,5°С и с последующими засеванием термостатированными культурами емкостей с жидким МРС агаром и инкубированием в течение 48-60 часов при температуре 37±0,5°С, перенос указанных культур в ферментер с последующим выращиванием указанных культур в указанном ферментере при температуре 37±0,5°С, pH 6,0-7,0 и избыточном давлении в полости ферментера, составляющем 0,025±0,005 МПа, концентрирование указанных культур до заданного объема концентрата, добавление защитной среды, охлаждение концентратов, сублимационную сушку концентратов, объединение сухих бактериальных масс культур Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium breve, смешивание с предварительно подготовленными нутрицевтически приемлемыми вспомогательными компонентами, включая пребиотик, нутрицевтически приемлемое связующее и нутрицевтически приемлемый лубрикант, с последующим перемешиванием до образования однородной смеси, и инкапсулирование указанной смеси или таблетирование указанной смеси с получением таблетки.

В патенте РФ 2712751 раскрывается применение композиции, содержащей следующие культуры бактерий, депонированные в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ): Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, депонированный 23.07.2009; Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604, депонированный 20.07.2004; в профилактическом и/или терапевтическом лечении патологий, выбранных из группы, включающей аллергии, атопию, аллергический ринит, пищевую гиперчувствительность, атопический дерматит, экзему, астму или иммунодефициты.

При этом одной из важнейших областей применения пробиотических бифидо- и лактобактерий является профилактика воспалительного заболевания кишечника, а также восстановление нормального баланса кишечной микрофлоры и устранение симптомов кишечных расстройств. В связи с этим, важной является задача разработки оптимального состава пробиотической композиции, которые позволил бы использовать полезные свойства нескольких разных видов пробиотических лактобактерий и бифидобактерий.

Важнейшими для поддержания здоровья человека пробиотическими микроорганизмами являются бифидобактерии и лактобактерии. Во многих исследованиях многократно было показано положительное влияние бифидобактерий и лактобактерий на здоровье человека.

Streptococcus thermophilus - единственный широко используемый пищевой вид рода Streptococcus, который в основном состоит из комменсальных и условно-патогенных видов. S. thermophilus - единственный вид стрептококков, происходящий из молочных источников, и, как правило, признан безопасным (GRAS). Другие зеленящие стрептококки, включая S. salivarius и S. vestibularius, являются обычными комменсалами млекопитающих полости рта, ЖКТ и половых путей и связаны с оппортунистическими инфекциями у людей. (Delorme, 2008) Было показано, что геномы штаммов S. thermophilus не содержат (или содержат инактивированную форму) факторов вирулентности, связанных с патогенными стрептококками (Болотин и др., 2004). Streptococcus thermophilus обычно включается в категорию молочнокислых бактерий, которые долгое время считались безопасными и подходящими для употребления в пищу человеком. Очень мало случаев заражения было связано с данной группой микроорганизмов, и несколько опубликованных исследований рассматривали их безопасность. В обзоре «Безопасность молочнокислых бактерий и их встречаемость при клинических инфекциях у человека» утверждается, что S. thermophilus находится вне сферы охвата, поскольку «никогда не был вовлечен в клинические инфекции у человека» (Gasser, 1994). Streptococcus thermophilus признан имеющим техническую роль в ферментированных пищевых продуктах. S. thermophilus имеет долгую историю безопасного использования при потреблении в составе молочных продуктов и пищевых добавок и указан в бюллетене Международной молочной федерации (IDF) № 377: Перечень микроорганизмов с документированной историей использования в пищевых продуктах (Mogensen et al., 2002). Многочисленные обновления, включая последний бюллетень IDF № 495, Перечень микробных пищевых культур с демонстрацией безопасности в ферментированных пищевых продуктах, продолжают включать S. thermophilus со ссылкой на использование в молочных продуктах с 1919 года. (Bourdichon et al., 2018). S. thermophilus исторически использовался в производстве ферментированных продуктов по всему миру. Это важный термофильный микроорганизм для производства молочных продуктов, и он считается второй по важности промышленной закваской после Lactococcus lactis (Hols et al., 2005). S. thermophilus использовался в качестве пробиотика из-за его способности ферментировать лактозу, тем самым улучшая переваривание лактозы у людей с непереносимостью лактозы (Hill et al., 2014).

Бифидобактерии являются грамположительными, не образующими спор и, как правило, каталазоотрицательными. Они представляют собой неподвижные палочки, встречающиеся в различных формах, включая раздвоенные клубы и изгибы, формы V или Y и звездообразные агрегаты (Scardovi, 1986) (Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов, 2007). Хотя некоторые виды и штаммы могут выдерживать кислород, бифидобактерии, как правило, являются строго анаэробными (Scardovi, 1986) (Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов, 2007). Способные ферментировать фруктозу, глюкозу и галактозу - глюкозу, ферментированную до молочной и уксусной кислоты, бифидобактерии считаются сахаролитическими организмами. Они различаются на уровне видов по своей способности ферментировать спирты и другие углеводы (Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов, 2007).

Бифидобактерии являются доминирующими микробными резидентами микробиоты толстой кишки (Mitsuoka, 1996). Они являются одним из первых родов, колонизирующих кишечник младенцев, являются частью нормальной микробиоты кишечника взрослых, а также нормальными обитателями кишечника многих видов животных (Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов, 2007). Виды Bifidobacterium долгое время считались безопасными и подходящими для потребления человеком, и было опубликовано несколько исследований, посвященных безопасности (Aguirre & Collins, 1993) (Borriello, et al., 2003) (Boyle, Robins-Browne, & Tang, 2006) (Salminen, et al., 1998). Некоторые виды Bifidobacterium исторически использовались в молочных продуктах, а в последнее время - в кисломолочных напитках и йогурте (Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов, 2007).

Bifidobacterium lactis - это грамположительный, неспорообразующий, неподвижный вид бактерий, встречающийся в плеоморфных палочках размером 0,75 мкм × 1,0-1,5 мкм. Этот вид является каталазоотрицательным и гетероферментативным. Он производит L (+)-молочную кислоту в качестве своего основного метаболита.

Виды Lactobacillus давно признаны безопасными, обнаруженными в нормальной кишечной флоре здоровых людей (Saxelin, 1996) (De Vos, 2009). Виды Lactobacillus часто встречаются в различных ферментированных продуктах, их разнообразные метаболические свойства способствуют вкусу, сохранности и доступности питательных веществ. Исторически сложилось так, что поскольку Lactobacillus естественным образом загрязняют исходное вещество, их часто включают в качестве преднамеренных заквасок для ферментации. Помимо ферментированных продуктов, Lactobacillus используются для производства многих молочных продуктов, как с другими молочнокислыми бактериями, так и отдельно, а также хлеба, особенно хлеба на закваске. Lactobacillus rhamnosus является одним из типичных видов, обнаруженных в хлебе на закваске (Batt, 2014). Роль видов Lactobacillus в пищевых ингредиентах, как встречающихся в природе, так и намеренно включенных, давно изучается для определения их эффектов и значения. Большое внимание уделяется их вкладу в пробиотики, поскольку сообщаемые эффекты потребления Lactobacilli включают снижение вирусной диареи, снижение активности фекальных ферментов, профилактику кишечных расстройств и усиление иммунитета. Считается, что большинство пробиотических штаммов способны колонизировать кишечный тракт, что может исключить колонизацию патогенов и положительно повлиять на микрофлору (Batt, 2014).

Lactobacillus rhamnosus - это грамположительный, неспорообразующий, неподвижный вид бактерий, встречающийся либо в виде пар, либо в виде коротких цепочек палочек размером 0,75 мкм × 1,5-6,0 мкм. Этот вид является каталазоотрицательным и факультативно гетероферментативным. Он производит L(+)-молочную кислоту в качестве своего основного метаболита. Первоначально считалось, что Lactobacillus rhamnosus является подвидом L. casei; только в 1989 году его таксономическое название было изменено с L. casei subsp. rhamnosus на L. rhamnosus после того, как генетические исследования показали, что это отдельный вид (Collins, 1989).

Lactobacillus casei - грамположительная, не образующая спор, гомоферментативная палочка. Она является обычным обитателем кишечного тракта человека, а также естественным образом встречается в ферментированных овощах, молоке и мясе. Штаммы этого вида используются в качестве заквасочных культур во многих ферментированных пищевых продуктах, включая традиционное ферментированное молоко и сыр. При более низкой оптимальной температуре роста L. casei обычно растет в сыре как естественный загрязнитель. Известно, что она способствует образованию аромата в различных сырах. Определенные штаммы L. casei, способные производить диацетил из цитрата, используются для приготовления японского ферментированного молока, якулта. (Salminen et al., 1993) Отдельные штаммы этого вида также используются в пробиотических продуктах питания и диетических добавках. Lactobacillus был задокументирован как признанный имеющий техническую роль в ферментированных пищевых продуктах. Виды Lactobacillus имеют долгую историю безопасного использования при потреблении в составе молочных продуктов и пищевых добавок, при этом многочисленные виды Lactobacillus перечислены в Бюллетене Международной молочной федерации (IDF) № 377: Перечень микроорганизмов с документированной историей использования в пищевых продуктах (Mogensen et al., 2002). Многочисленные обновления, включая последний Бюллетень IDF № 495, Перечень микробных пищевых культур с демонстрацией безопасности в ферментированных пищевых продуктах, продолжают включать L. casei, со ссылкой на использование в молочных продуктах и вине, начиная с 1970 года. (Bourdichon et al., 2018).

Lactococcus lactis - грамположительный, не образующий спор, неподвижный, мезофильный, факультативный анаэроб, который является гомоферментативным и производит в основном L(+) молочную кислоту из глюкозы. Из двух подвидов Lactococcus lactis, используемых в производстве молочных продуктов, Lactocococcus lactis subsp. lactis можно отличить от Lactococcus lactis subsp. cremoris, поскольку он растет при 40OC, растет в 4% NaCl и производит аммиак из аргинина. Методы на основе нуклеиновых кислот, такие как секвенирование 16S рРНК и электрофорез в пульсирующем поле, также использовались для дальнейшего различения двух подвидов. Было признано, что Lactococcus играет техническую роль в ферментированных пищевых продуктах. Lactococcus lactis subsp. lactis и cremoris имеют долгую историю безопасного использования при потреблении в составе молочных продуктов и пищевых добавок, как указано в Бюллетене Международной молочной федерации (IDF) № 377: Перечень микроорганизмов с документированной историей использования в пищевых продуктах (Международная молочная федерация, 2002). Многочисленные обновления, включая последний Бюллетень IDF № 495, Перечень микробных пищевых культур с демонстрацией безопасности в ферментированных пищевых продуктах, продолжают включать L. lactis со ссылкой на использование в молочных продуктах и мясе, начиная с 1903 года. (Международная молочная федерация, 2018).

Lactobacillus plantarum - факультативный, с отрицательной реакцией на каталазу, гетероферментер, который был выделен из пищевых продуктов, растительного материала, ротовой полости, вагинальной полости, желудочно-кишечного тракта и других участков тела (Axelsson, 2004; Douillard и De Vos, 2014; Molin, 2001, 2008). L. plantarum - это распространенная культура, используемая для консервирования таких продуктов, как овощи, колбасные изделия и силосы, рассольные оливки, квашеная капуста, маниока и кимчи; и является закваской для хлеба на закваске, мясных продуктов и вина (Khemariya, 2016; De Vos et al., 2009).

Lactobacillus acidophilus был впервые выделен в 1900 году Моро из детских фекалий. Это грамположительная, не образующая спор, гомоферментативная, каталазоотрицательная палочка, которая в то время была обозначена как Bacillus acidophilus. Изоляты L. acidophilus являются частью естественной микробиоты человека и были культивированы из ротовой полости, пищеварительного и вагинального трактов. Он также обнаружен в некоторых традиционных ферментированных молочных продуктах (например, кефире) и сегодня является основным коммерческим видом молочнокислых бактерий (МКБ), доступных в таких продуктах, как молоко, йогурт и детские смеси, а также в пищевых добавках с зарегистрированными пробиотическими эффектами (Bull et al., 2013; Bull et al., 2014). Таксономически L. acidophilus претерпела многочисленные ревизии одновременно с изменениями и усовершенствованиями в методах идентификации и характеристики бактерий. Идентичность L. acidophilus La-14 была подтверждена путем секвенирования всего генома (Stahl & Barrangou 2013), и она была успешно идентифицирована из образцов кала и вагинальных мазков с помощью методов на основе ПЦР с использованием видоспецифичных праймеров рДНК в сочетании с автоматизированным риботипированием для специфического обнаружения пробиотических лактобацилл (Massi et al., 2004). L. acidophilus La-14 имеет человеческое происхождение и был депонирован в Американской коллекции типовых культур (ATCC) как SD5212.

Из документа РФ 2724585 известна предлагаемая в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения пробиотическая композиция для восстановления микрофлоры кишечника и для профилактики синдрома избыточного бактериального роста и диарей, включая антибиотик-ассоциированную диарею и Clostridium dificile-ассоциированную диарею, отличающаяся тем, что указанная композиция выполнена в форме капсулы, содержащей сухую смесь пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum и пробиотических лактобацилл Lactobacillus rhamnosus в количестве от 0,05 до 0,1 г, а также лизат дрожжей Saccharomyces cerevisiae в количестве 0,0005 г, и нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты, включая микрокристаллическую целлюлозу и нутрицевтически приемлемую соль стеариновой кислоты в количестве от 0,002 до 0,004 г, выбранную из кальция стеарата и магния стеарата, причем содержание в указанной композиции каждого из видов пробиотических бифидобактерий, включая Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum, составляет не менее 1×10⁸ КОЕ на 1 грамм сухой смеси, содержание пробиотических лактобактерий Lactobacillus rhamnosus также составляет не менее 1×10⁸ КОЕ на 1 грамм сухой смеси. Несмотря на известность из уровня техники композиции по настоящему аналогу, по-прежнему остается актуальной задача расширения арсенала пробиотических композиций (биологически активных пищевых добавок), предназначенных для профилактики воспалительного заболевания кишечника, а также для восстановления баланса кишечной микрофлоры, устранения симптомов кишечных расстройств (диареи, запора, метеоризма, вздутия живота и др.) и для укрепления общей неспецифической резистентности организма, оптимальным образом использующих пробиотический потенциал бифидобактерий и лактобактерий. При этом указанные пробиотические композиции (биологически активные пищевые добавки) должны изготавливаться достаточно простыми способами, обеспечивающими в то же время сохранение жизнеспособности и полезных свойств пробиотических бифидобактерий и лактобактерий как в процессе изготовления композиции, так и на протяжении всего срока хранения.

Задача настоящего изобретения заключалась в отборе специфических микроорганизмов, обладающих пробиотической активностью, которые переносятся пациентами и способны колонизировать кишечный тракт для последующего применения в составе пробиотической композиции для коррекции баланса микрофлоры у пациентов с нарушениями пищеварения, синдромом избыточного бактериального роста и диарей, включая антибиотик-ассоциированную диарею и Clostridium dificile - ассоциированную диарею.

В настоящем изобретении предложено решение вышеупомянутой задачи путем отбора специфических пробиотических бактериальных видов по результатам проведенной научно-исследовательской работы. Объект настоящего изобретения представляет собой композицию в форме капсулы, содержащую не менее семи видов пробиотических бактерий, как заявлено в формуле изобретения.

Определение пробиотической активности осуществлялось по результатам анализа ряда параметров, включающих: оценку продукции биогенных аминов, устойчивость к антибиотикам, устойчивость к кислоте и желчи, производство L/D молочной кислоты, углеводный профиль, острую токсичность.

Биогенные амины

Грамположительные и грамотрицательные бактерии могут продуцировать биогенные амины (БА), которые представляют собой органические основания с низкой молекулярной массой, обладающие биологической активностью (Gardini, 2016) (Ladero, Calles-Enriquez, Fernandez, & Alvarez, 2010). БА содержатся в растениях, включая фрукты и овощи, а также в животных, включая рыбу, и во многих видах продуктов питания и напитков (Maintz, 2007) (Gardini, 2016) (Ladero, Calles-Enriquez, Fernandez, & Alvarez, 2010). У людей БА являются неотъемлемой частью метаболизма, развития и важных физиологических функций, таких как иммунный ответ, регуляция температуры тела и pH желудка, рост и дифференцировка клеток, активность мозга и секреция желудочной кислоты (Ladero, Calles-Enriquez, Fernandez, & Alvarez, 2010). Благодаря этой важной роли организм регулирует концентрацию ЖК посредством катаболизма, поглощения, биосинтеза и выведения; однако равновесие ЖК в организме может быть нарушено неконтролируемой микробной ферментативной активностью, вызывающей накопление ЖК, а также потреблением продуктов с высоким содержанием ЖК. Различные побочные реакции могут возникнуть в результате превышения человеком его/ее индивидуальной толерантности к БА, включая головные боли, астму, сыпь, риноконъюнктивальные симптомы, аритмию, учащенное сердцебиение, гипотонию, рвоту, диарею и многое другое (Maintz, 2007) (Gardini, 2016) (Ladero, Calles-Enriquez, Fernandez, & Alvarez, 2010). В целом, допустимый предел содержания БА в пище не установлен, в основном потому, что токсикологический порог может сильно различаться у разных людей (Gardini, 2016). Гистамин и тирамин - два типа биогенных аминов, которые, по-видимому, потенциально оказывают более острые неблагоприятные эффекты на человека, хотя все еще проводятся исследования того, как другие БА влияют на организм, как по отдельности, так и в сочетании с гистамином, тирамином и другими БА (Gardini, 2016) (EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ), 2011). Образование гистамина происходит в результате катаболизма гистидина гистидиндекарбоксилазой, тогда как образование тирамина происходит в результате катаболизма тирозина тирозиндекарбоксилазой.

Устойчивость к антибиотикам

Устойчивость к антибиотикам можно определить как способность бактерий выживать или даже расти в присутствии определенного вещества, которое обычно подавляет или убивает бактерии. Устойчивость, присущая определенному виду бактерий, когда вид не восприимчив к данному антибиотику из-за своих функциональных или структурных особенностей, не связанных с каким-либо предыдущим воздействием антибиотика, называется внутренней устойчивостью (Bhattacharjee, 2016). И наоборот, когда штамм или субпопуляция вида бактерий устойчивы к определенному антибиотику, к которому вид обычно восприимчив, это считается приобретенной устойчивостью (EFSA Panel on Additives and Products or Substances Used in Animal Feed (FEEDAP), 2012). Приобретенная устойчивость может быть получена путем мутации местных генов (т.е. точечной мутации) или путем добавления генов (т.е. приобретения генов или обмена генами между бактериями) (Ammor, Florez, & Mayo, 2007). Из двух типов приобретенной устойчивости к антибиотикам добавленные гены вызывают наибольшую озабоченность, поскольку они обладают способностью горизонтально переноситься. Это представляет серьезную угрозу, поскольку устойчивость к антибиотикам может передаваться не только другим бактериям внутри вида, но и между видами и, таким образом, патогенным бактериям (Devirgiliis, Barile, & Perozzi, 2011). Чтобы определить, восприимчив ли или устойчив штамм пробиотика к определенным антибиотикам, составляется антибиотикограмма или профиль чувствительности к антибиотикам для штамма. Панель антибиотиков, включенных в антибиотикограмму, рассматривается как «соответствующий диапазон противомикробных препаратов, имеющих значение для человека и ветеринарии» (EFSA Panel on Additives and Products or Substances Used in Animal Feed (FEEDAP), 2012). Если рост штамма не подавляется при концентрации антибиотика, определенной FEEDAP как пороговое значение для вида, и вместо этого превышает установленную точку разрыва, штамм считается устойчивым к этому антибиотику. Кроме того, он считается приобретенной устойчивостью на основе вышеупомянутых определений. Если антибиотикограмма штамма демонстрирует приобретенную устойчивость к антибиотикам, соответствующий геном штамма затем анализируется на наличие известных генов устойчивости к антибиотикам вблизи предполагаемых мобильных элементов, чтобы определить потенциал для горизонтального переноса.

Устойчивость к кислоте/желчи

Общепринятое определение пробиотиков - «живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу для здоровья хозяина» (Hill et al., 2014). Хотя это и не указано явно, это определение подразумевает, что пробиотик должен выживать при прохождении через желудочно-кишечный тракт и, согласно некоторым интерпретациям, временно колонизировать кишечник и слизистую оболочку кишечника хозяина (Guarner, Requena, & Marcos, 2010). Считается, что для выживания при прохождении через желудочно-кишечный тракт важны различные признаки, наиболее важными из которых являются толерантность как к сильнокислым условиям, присутствующим в желудке, так и к концентрациям желчных солей, обнаруженных в тонком кишечнике.

Производство L/D молочной кислоты

Благодаря своей молекулярной структуре молочная кислота имеет два оптических изомера: L(+)-молочную кислоту и ее зеркальное отражение, D(-)-молочную кислоту. Бактерии могут производить как L(+), так и D(-)-молочную кислоту, или любую из них, в зависимости от вида. Однако люди производят почти исключительно L(+)-молочную кислоту, образуя только наномолярные концентрации D(-)-молочной кислоты (Lipsa, Tudorachi, & Vasile, 2010).

Углеводный профиль

Исторически профили ферментации углеводов использовались для идентификации молочнокислых бактерий на уровне видов. Однако, поскольку многие виды тесно связаны, это не точный идентификационный тест. Несмотря на это, эти профили все еще могут раскрыть интересные детали относительно использования углеводов. Для разработки профиля ферментации углеводов для St-21™ штамм выращивали в течение ночи в MRS при 37°C. Аликвоту объемом 10 мл центрифугировали, а затем MRS отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 5 мл PBS и центрифугировали перед окончательным ресуспендированием в 5 мл PBS для подготовки к использованию в наборе полосок для ферментации углеводов bioMérieux API 50 CH.

Острая токсичность

Исследования проводились в соответствии с надлежащей лабораторной практикой FDA (21 CFR Часть 58) и в целом в соответствии с существующими нормативными рекомендациями по оценке острой пероральной токсичности (US EPA, 2002; OECD, 2008; US FDA, 1993). Все животные наблюдались на предмет клинических признаков токсичности три раза в день введения дозы и один раз в день в течение двухнедельного периода наблюдения после введения дозы. Вес тела регистрировался до введения дозы и примерно еженедельно в течение двухнедельного периода наблюдения. В конце периода наблюдения все животные были гуманно умерщвлены и подвергнуты полной аутопсии.

Обнаружено, что микроорганизмы по настоящему изобретению обладают высоким пробиотическим действием и, таким образом, полезны для лечения патологий, связанных с нарушениями баланса микрофлоры в желудочно-кишечном тракте, в частности использоваться для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта, восстановления микрофлоры кишечника, профилактики синдрома избыточного бактериального роста и диарей, включая антибиотик-ассоциированную диарею и Clostridium dificile-ассоциированную диарею. По результатам проведенных скрининговых исследований, заявителем были отобраны следующие микроорганизмы, обладающие наибольшей пробиотической активностью в составе композиции:

Bifidobacterium lactis,

Lacticaseibacillus casei,

Lactobacillus acidophilus,

Lactococcus lactis,

Lactiplantibacillus plantarum,

Lacticaseibacillus rhamnosus,

Streptococcus thermophilus.

В контексте настоящего изобретения перечисленные выше культуры пробиотических бактерий могут находиться в форме живых бактерий, мертвых бактерий или клеточных компонентов, клеточных экстрактов или их лизатов.

В предпочтительном воплощении композиция применяется в форме капсулы, содержащей сухую смесь выбранных групп пробиотических бактерий.

В предпочтительном воплощении композиция отличается тем, что количество сухой смеси на одну капсулу указанной пробиотической композиции составляет от 0,02 до 1 г.

В предпочтительном воплощении композиция отличается тем, что содержание каждого из видов пробиотических бактерий, составляет не менее 1×10⁹ КОЕ на 1 грамм сухой смеси.

В предпочтительном воплощении композиция отличается тем, что пробиотические микроорганизмы из выбранных групп относятся к штаммам: Bifidobacterium lactis HN019, Lacticaseibacillus casei Lc-11, Lactobacillus acidophilus La-14, Lactococcus lactis Ll-23, Lactiplantibacillus plantarum Lp-115, Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Streptococcus thermophilus St-21, Bifidobacterium lactis DSM 15954, Bifidobacterium lactis Bl-04.

В предпочтительном воплощении композиция отличается тем, что указанные пробиотические микроорганизмы взяты в количестве (мг/капсулу): Bifidobacterium lactis HN019 - 13 мг, Lacticaseibacillus casei Lc-11 - 6 мг, Lactobacillus acidophilus La-14 - 5 мг, Lactococcus lactis Ll-23 - 4 мг, Lactiplantibacillus plantarum Lp-115 - 3 мг, Lacticaseibacillus rhamnosus GG - 2 мг, Streptococcus thermophilus St-21 - 2 мг, Bifidobacterium lactis DSM 15954 - 0,8 мг, Bifidobacterium lactis Bl-04 - 0,5 мг.

В предпочтительном воплощении композиция отличается тем, что содержит дополнительно нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты, которые взяты в количестве (мг/капсулу): микрокристаллическую целлюлозу - 265 мг, инулин - 67 мг, диоксид кремния- 2,65 мг, стеарат магния - 265 мг.

В предпочтительном воплощении композиция отличается тем, что выполнена в форме капсулы, содержащей сухую смесь пробиотических бактерий в соответствующем соотношении, мас. %: Bifidobacterium lactis HN019 - 2%, Lacticaseibacillus casei Lc-11 - 1%, Lactobacillus acidophilus La-14 - 0,7%, Lactococcus lactis Ll-23 - 0,6%, Lactiplantibacillus plantarum Lp-115 - 0,4%, Lacticaseibacillus rhamnosus GG - 0,3%, Streptococcus thermophilus St-21 - 0,3%, Bifidobacterium lactis DSM 15954 - 0,13%, Bifidobacterium lactis Bl-04 - 0,07% и нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты в соответствующем соотношении, мас. %: микрокристаллическую целлюлозу - 40%, инулин - 14%, диоксид кремния - 0,5%, стеарат магния- 40%.

Нижеприведенные примеры, описывающие частные воплощения композиции по изобретению, а также ее использование у пациентов с синдромом раздраженного кишечника, приводятся исключительно в целях иллюстрации настоящего изобретения и не могут быть использованы для ограничения объема притязаний.

Пример 1. Исследование пробиотических свойств штаммов Bifidobacterium lactis

Исследование пробиотических свойств штаммов Bifidobacterium lactis HN019, Bifidobacterium lactis DSM 15954, Bifidobacterium lactis Bl-04 проводили на примере штамма Bifidobacterium lactis DSM 15954.

Штамм Bifidobacterium lactis DSM 15954 был идентифицирован в соответствии со стандартными таксономическими рекомендациями. Таксономия была первоначально установлена путем частичного секвенирования генов, кодирующих 16S рРНК, дополненного частичным секвенированием гена tuf, кодирующего фактор элонгации Tu.

Биогенные амины

Применительно к геному Bifidobacterium. lactis DSM 15954 не обнаружены гены гистидиндекарбоксилазы или ген тирозиндекарбоксилазы. Следовательно, маловероятно, что данный штамм будет производить гистамин или тирамин (Таблица 1).

Таблица 1. Наличие генов гистидиндекарбоксилазы и тирозиндекарбоксилазы

Штамм	Ген гистидиндекарбоксилазы	Ген тирозиндекарбоксилазы
Bifidobacterium. lactis DSM 15954	-	-

Устойчивость к антибиотикам

Антибиограмма B. lactis DSM 15954 была установлена с использованием метода ISO 10932 IDF223 и микроразведений VetMIC Lact-1 и 2, которые включают 10 антибиотиков. Зарегистрированные МИК (минимальная ингибирующая концентрация) или самая низкая концентрация антибиотика, которая препятствует росту B. lactis DSM 15954, показаны в таблице ниже (Таблица 2). Все значения МИК для B. lactis DSM 15954 ниже или равны микробным контрольным точкам (МБП), определенным для Bifidobacterium, за исключением тетрациклина (EFSA Panel on Additives and Products or Substances Used in Animal Feed (FEEDAP), 2018).

Таблица 2. B. lactis DSM 15954 Профиль чувствительности к антибиотикам*

	Ген	Кан	Стр	Ттр	Эри	Кли	Хмф	Амп	Ван	Вир
	МИК мг/Л
Bifidobacterium. lactis DSM 15954	16	64	16	16	0,06	0,06	1	0,06	0,5	0,5
МИК для Bifidobacterium	64	-	128	8	1	1	4	2	2	1

* Ген - гентамицин, Кан -канамицин, Стр - стрептомицин, Ттр - тетрациклин, Эри - эритромицин, Кли - клиндамицин, Хмф - хлорамфеникол, Амп - ампицилин, Ван - ванкомицин, Вир - виргинамицин.

Устойчивость к кислоте/желчи

Было проведено внутреннее in vitro тестирование на кислотоустойчивость и толерантность к желчи для характеристики потенциального выживания B. lactis DSM 15954 через желудочно-кишечный тракт. Для проведения теста культура B. lactis DSM 15954 выращивалась в течение ночи при 37°C в анаэробных условиях. Десять миллилитров культуры центрифугировали, промывали и ресуспендировали в 1 мл буфера Баттерфилда; 0,25 мл этой суспензии добавляли к 25 мл предварительно темперированного желудочного сока (0,2% NaCl, 0,32% пепсина, pH доводили до 3,5 с помощью 6N HCl). Образцы для подсчета брали немедленно (время ноль) и через один час при 37°C. Дополнительный образец культуры/желудочного сока B. lactis DSM 15954 был взят и подсчитан с помощью агара MRS с 0,3% соли бычьей желчи для тестирования переносимости желчи. Процент выживаемости был рассчитан после получения подсчетов на чашках Петри, чтобы сравнить образцы, инкубированные в желудочном соке в течение одного часа и в агаре бычьей желчи с нулевым временем, с образцом.

Кислотная переносимость B. lactis DSM 15954 составляет +++ Очень хорошо (80-89% выживаемости в HCl и 1% пепсине при pH 3,5 в течение 1 часа при 37 °C), в то время как переносимость желчи B. lactis DSM 15954 составляет ++ Хорошо (70-79% выживаемости в среде, содержащей 0,3% соли желчи).

Производство L/D молочной кислоты

Внутреннее тестирование B. lactis DSM 15954 показало, что штамм производит L(+)-молочную кислоту в качестве своего основного метаболита (тест-набор bioMérieux).

Углеводный профиль

Для разработки профиля ферментации углеводов для B. lactis DSM 15954 штамм выращивали в течение ночи в MRS при 37°C. 10 мл аликвоты центрифугировали, а затем MRS отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 5 мл PBS и центрифугировали перед окончательным ресуспендированием в 5 мл PBS, готовя к использованию в наборе полосок для ферментации углеводов bioMérieux API 50 CH. Результаты теста ферментации углеводов представлены в таблице 3.

Таблица 3 Углеводный профиль B. lactis DSM 15954.

37°C, 48 ч
Контроль	-	Фруктоза	+	Эскулин	+	Ксилитол	-
Глицерин	-	Манноза	-	Алицин	+	Гентиобиоза	+
Эритрит	-	Сорбоза	-	Целлобиоза	+	D - тураноза	+
D - арабиноза	-	Рамноза	-	Мальтоза	+	D - ликсоза	-
L - арабиноза	+	Дульцитол	-	Лактоза	+	D - тагатоза	-
Рибоза	+	Инозитол	-	Мелибиоза	+	D - фукоза	-
D - ксилоза	+	Маннитол	+	Сахароза	+	L - фукоза	-
L - ксилоза	-	Сорбитол	+	Трегалоза	+	D - арабитол	-
Адонитол	-	а-Метил-D-Маннозид	+	Инулин	-	L - арабитол	-
Бета-метил-D-ксилозид	-	a-Метил-D-глюкозид	-	Мелезитоза	+	Глюконат	-
Галактоза	+	N-ацетил-глюкозамин	+	Раффиноза	+	2 - кето - глюконат	-
Глюкоза	+	Амигдалин	+	Крахмал	-	5 - кето - глюконат	-
		Арбутин	+			Гликоген	+

Острая токсичность

Исследования проводились в соответствии с надлежащей лабораторной практикой FDA (21 CFR Часть 58) и в целом в соответствии с существующими нормативными рекомендациями по оценке острой пероральной токсичности (US EPA, 2002; OECD, 2008; US FDA, 1993). Для каждого исследования пяти молодым взрослым самкам крыс Crl:CD(SD) вводили однократную болюсную дозу пробиотических микробов посредством желудочной интубации. Тестовые вещества суспендировали в соответствующих водных буферах и вводили в дозе 5000 мг/кг веса тела. Концентрации микроорганизмов в дозируемых составах определялись аналитически путем подсчета, и для Bifidobacterium lactis DSM 15954 вводимая доза 5000 мг/кг массы тела эквивалентна 1,98 × 10¹² КОЕ/кг массы тела. Это эквивалентно суточной дозе 1,44 × 10¹⁴ КОЕ на взрослого человека (предполагая, что средний вес взрослого человека составляет 72,57 кг).

Все животные наблюдались на предмет клинических признаков токсичности три раза в день введения дозы и один раз в день в течение двухнедельного периода наблюдения после введения дозы. Вес тела регистрировался до введения дозы и примерно еженедельно в течение двухнедельного периода наблюдения. В конце периода наблюдения все животные были гуманно умерщвлены и подвергнуты полной аутопсии.

Не было выявлено влияния на смертность, вес тела или набор веса тела. Аналогичным образом, не было никаких клинических признаков токсичности, отмеченных при жизни или при вскрытии, указывающих на неблагоприятные эффекты пробиотических микроорганизмов, вводимых в виде однократной болюсной дозы на уровне дозы 5000 мг/кг массы тела, соответственно протестированный пробиотический микроорганизм не считался остро токсичным, и значения LD50 не рассчитывались.

Таким образом, штамм Bifidobacterium lactis DSM 15954 был идентифицирован в соответствии со стандартными таксономическими подходами. Была проведена оценка безопасности, включая острую токсичность, устойчивость к антибиотикам. Выявлены пробиотические характеристики продукции молочной кислоты, кислотоустойчивости и толерантности к желчи, а также исключения патогенов. Все данные указывают на то, что B. lactis DSM 15954 демонстрирует общие пробиотические характеристики, и в сочетании с безопасной историей глобального использования B. lactis в пищевых продуктах, установлено, что штамм безопасен для использования в качестве пробиотика.

Пример 2. Исследование пробиотических свойств штаммов Lacticaseibacillus

Исследование пробиотических свойств штаммов Lacticaseibacillus casei Lc-11, Lacticaseibacillus rhamnosus GG проводили на примере штамма Lactobacillus rhamnosus GG (DGCC12645).

Таксономия Lactobacillus rhamnosus GG (DGCC12645) была первоначально установлена путем частичного секвенирования генов, кодирующих 16S рРНК, завершенного путем частичного секвенирования гена dnaK, кодирующего молекулярный шаперон (Хуан, 2011), и подтверждена как штамм Lactobacillus rhamnosus. L. rhamnosus GG не является генетически модифицированным, как определено Директивами 2009/41/EC и 2001/18/EC. Lactobacillus rhamnosus GG - это штамм, первоначально выделенный из кишечника человека.

Биогенные амины

Применительно к геному Lactobacillus rhamnosus GG (DGCC12645) не обнаружены гены гистидиндекарбоксилазы или ген тирозиндекарбоксилазы. Следовательно, маловероятно, что данный штамм будет производить гистамин или тирамин.

Таблица 4. Наличие генов гистидиндекарбоксилазы и тирозиндекарбоксилазы

Штамм	Ген гистидиндекарбоксилазы	Ген тирозиндекарбоксилазы
Lactobacillus rhamnosus GG (DGCC12645)	-	-

Устойчивость к антибиотикам

Антибиограмма GG была установлена с использованием метода ISO 10932 IDF223 и микроразведений VetMIC Lact-1 и 2, которые включают 10 антибиотиков. Зарегистрированные МИК (минимальная ингибирующая концентрация) или самая низкая концентрация антибиотика, которая препятствует росту GG, отображены в таблице ниже. Все значения МИК для GG ниже или равны микробным контрольным точкам (МБП), определенным для Lactobacillus rhamnosus (EFSA Panel on Additives and Products or Substances Used in Animal Feed (FEEDAP), 2012). Согласно этим результатам, GG не имеет приобретенной устойчивости к антибиотикам (таблица 5).

Таблица 5. Lactobacillus rhamnosus GG (DGCC12645) Профиль чувствительности к антибиотикам*

	Ген	Кан	Стр	Ттр	Эри	Кли	Хмф	Амп	Ван	Вир
	МИК мг/Л
Lactobacillus rhamnosus GG	4	64	32	1	0,12	0,5	4	2	128	2
МИК для Lactobacillus rhamnosus	16	64	32	8	1	1	4	4	-	4

* Ген - гентамицин, Кан - канамицин, Стр - стрептомицин, Ттр - тетрациклин, Эри - эритромицин, Кли - клиндамицин, Хмф - хлорамфеникол, Амп - ампицилин, Ван - ванкомицин, Вир - виргинамицин.

Устойчивость к кислоте/желчи

Исследование на кислотность и толерантность к желчи in vitro было проведено для характеристики потенциальной выживаемости L. rhamnosus GG через желудочно-кишечный тракт. Для проведения испытания культура GG выращивалась в течение ночи при температуре 37°C в анаэробных условиях. Десять миллилитров культуры центрифугировались, промывались и ресуспендировались в 1 мл буфера Баттерфилда; 0,25 мл этой суспензии добавлялись к 25 мл предварительно темперированного желудочного сока (0,2% NaCl, 0,32% пепсина, pH доводился до 3,5 с помощью 6N HCl). Образцы отбирались для подсчета немедленно (время ноль) и через один час при температуре 37°C. Дополнительный образец культуры GG/желудочного сока отбирался и подсчитывался с помощью агара MRS с 0,3% соли бычьей желчи для испытания на толерантность к желчи. Процент выживаемости был рассчитан после получения подсчетов на чашках Петри, чтобы сравнить образцы, инкубированные в желудочном соке в течение одного часа и в агаре с бычьей желчью и солью, с образцом в нулевом времени.

Устойчивость GG к кислоте составляет +++ Очень хорошо (80-89% выживаемости в HCl и 1% пепсине при pH 3,5 в течение 1 часа при 37 °C), в то время как устойчивость GG к желчи также составляет +++ Очень хорошо (80-89% выживаемости в среде, содержащей 0,3% желчных солей).

Производство L/D молочной кислоты

Внутреннее тестирование Lactobacillus rhamnosus GG (DGCC12645) показало, что штамм производит L (+)-молочную кислоту в качестве своего основного метаболита (тест-набор bioMérieux).

Углеводный профиль

Для разработки профиля ферментации углеводов для GG штамм выращивали в течение ночи в MRS при 37°C. Аликвоту объемом 10 мл центрифугировали, а затем MRS отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 5 мл PBS и центрифугировали перед окончательным ресуспендированием в 5 мл PBS для подготовки к использованию в наборе полосок для ферментации углеводов bioMérieux API 50 CH (таблица 6).

Таблица 6. Углеводный профиль Lactobacillus rhamnosus GG (DGCC12645)

37°C, 48 ч
Контроль	-	Фруктоза	+	Эскулин	+	Ксилитол	-
Глицерин	-	Манноза	+	Алицин	+	Гентиобиоза	+
Эритрит	-	Сорбоза	-	Целлобиоза	+	D - тураноза	-
D - арабиноза	+	Рамноза	+	Мальтоза	+	D - ликсоза	-
L - арабиноза	-	Дульцитол	+	Лактоза	-	D - тагатоза	+
Рибоза	-	Инозитол	+	Мелибиоза	-	D - фукоза	-
D - ксилоза	-	Маннитол	+	Сахароза	+	L - фукоза	+
L - ксилоза	-	Сорбитол	+	Трегалоза	+	D - арабитол	-
Адонитол	-	а-Метил-D-Маннозид	-	Инулин	-	L - арабитол	-
Бета-метил-D-ксилозид	-	a-Метил-D-глюкозид	-	Мелезитоза	+	Глюконат	+
Галактоза	+	N-ацетил-глюкозамин	+	Раффиноза	-	2 - кето - глюконат	-
Глюкоза	+	Амигдалин	+	Крахмал	-	5 - кето - глюконат	-
		Арбутин	+			Гликоген	-

Острая токсичность

Исследования проводились в соответствии с надлежащей лабораторной практикой FDA (21 CFR Часть 58) и в целом в соответствии с существующими нормативными рекомендациями по оценке острой пероральной токсичности (US EPA, 2002; OECD, 2008; US FDA, 1993). Для каждого исследования пяти молодым взрослым самкам крыс Crl:CD(SD) вводили однократную болюсную дозу пробиотических микробов посредством желудочной интубации. Тестовые вещества суспендировали в соответствующих водных буферах и вводили в дозе 5000 мг/кг веса тела. Концентрации микроорганизмов в дозируемых составах определялись аналитически путем подсчета, и для Lactobacillus rhamnosus GG (DGCC12645) вводимая доза 5000 мг/кг массы тела эквивалентна 1,98 × 10¹² КОЕ/кг массы тела. Это эквивалентно суточной дозе 1,44 × 10¹⁴ КОЕ на взрослого человека (предполагая, что средний вес взрослого человека составляет 72,57 кг).

Таким образом, штамм Lactobacillus rhamnosus GG (DGCC12645) был идентифицирован в соответствии со стандартными таксономическими рекомендациями. Была проведена оценка безопасности, включая острую токсичность, устойчивость к антибиотикам. Выявлены пробиотические характеристики продукции молочной кислоты, кислотоустойчивости и толерантности к желчи, а также исключения патогенов. Все данные указывают на то, что Lactobacillus rhamnosus GG (DGCC12645) демонстрирует общие пробиотические характеристики, и в сочетании с безопасной историей глобального использования Lactobacillus rhamnosus в пищевых продуктах, установлено, что оно безопасно для использования в качестве пробиотика.

Пример 3. Исследование пробиотических свойств штамма Streptococcus thermophilus St-21

Штамм Streptococcus thermophilus Health St-21 является изолятом из молочных продуктов. Таксономия St-21 (DGCC7693) была первоначально установлена путем частичного секвенирования генов, кодирующих 16S рРНК, и подтверждена как штамм Streptococcus thermophilus. S. thermophilus St-21 не является генетически модифицированным.

Биогенные амины:

Применительно к геному St-21 не обнаружены гены гистидиндекарбоксилазы или ген тирозиндекарбоксилазы. Следовательно, маловероятно, что St-21 будет производить гистамин или тирамин.

Таблица 7. Наличие генов гистидиндекарбоксилазы и тирозиндекарбоксилазы.

Штамм	Ген гистидиндекарбоксилазы	Ген тирозиндекарбоксилазы
Streptococcus thermophilus St-21	-	-

Устойчивость к антибиотикам

Антибиограмма St-21 была установлена с использованием метода ISO 10932 IDF223 и микроразведений VetMIC Lact-1 и 2, включающих 10 антибиотиков. Зарегистрированные МИК (минимальная ингибирующая концентрация) или самая низкая концентрация антибиотика, которая препятствует росту St-21, показаны в таблице ниже. Все значения МИК для St-21 ниже или равны микробным контрольным точкам (МБП), определенным для Streptococcus thermophilus (EFSA FEEDAP, 2012). Согласно этим результатам, St-21 не имеет приобретенной устойчивости к антибиотикам (таблица 8).

Таблица 8. St-21 Профиль чувствительности к антибиотикам*

	Ген	Кан	Стр	Ттр	Эри	Кли	Хмф	Амп	Ван	Вир
	МИК мг/Л
S. thermophilus St-21	2	64	16	4	0,06	0,12	4	0,12	0,5	0,06
МИК для S. thermophilus	32	64	64	4	2	2	4	2	4	4

Устойчивость к кислоте/желчи

Испытание на кислотность и толерантность к желчи in vitro было проведено для характеристики потенциальной выживаемости S. thermophilus St-21 в желудочно-кишечном тракте. Для проведения испытания культура St-21 выращивалась в течение ночи при температуре 37°C в анаэробных условиях. Десять миллилитров культуры центрифугировались, промывались и ресуспендировались в 1 мл буфера Баттерфилда; 0,25 мл этой суспензии добавлялись к 25 мл предварительно темперированного желудочного сока (0,2% NaCl, 0,32% пепсина, pH доводился до 3,5 с помощью 6N HCl). Образцы отбирались для подсчета немедленно (время ноль) и через один час при температуре 37°C. Дополнительный образец культуры St-21/желудочного сока отбирался и подсчитывался с помощью агара MRS с 0,3% соли бычьей желчи для испытания на толерантность к желчи. Процент выживаемости рассчитывался после получения подсчетов на чашках Петри, чтобы сравнить образцы, инкубированные в желудочном соке в течение одного часа и в агаре с бычьей желчью и солью, с образцом в нулевой точке времени.

Устойчивость к кислоте у St-21 составляет + Удовлетворительная (<69% выживаемости в HCl и 1% пепсине при pH 3,5 в течение 1 часа при 37 °C), а устойчивость к желчи у St-21 составляет + Очень Хорошая (<69% выживаемости в среде, содержащей 0,3% желчных солей).

Производство L/D молочной кислоты:

Внутреннее тестирование St-21 показало, что он производит 100% L(+) молочной кислоты (тестовый набор bioMérieux).

Углеводный профиль

Для разработки профиля ферментации углеводов для St-21 штамм выращивали в течение ночи в MRS при 37°C. 10 мл аликвоты центрифугировали, а затем MRS отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 5 мл PBS и центрифугировали перед окончательным ресуспендированием в 5 мл PBS, готовя к использованию в наборе полосок для ферментации углеводов bioMérieux API 50 CH. Результаты теста ферментации углеводов представлены в таблице 9.

Таблица 9. Углеводный профиль S. thermophilus St-21

37°C, 48 ч
Контроль	-	Фруктоза	+	Эскулин	+	Ксилитол	-
Глицерин	-	Манноза	+	Алицин	+	Гентиобиоза	+
Эритрит	-	Сорбоза	-	Целлобиоза	+	D - тураноза	+
D - арабиноза	-	Рамноза	-	Мальтоза	+	D - ликсоза	-
L - арабиноза	+	Дульцитол	-	Лактоза	+	D - тагатоза	-
Рибоза	+	Инозитол	-	Мелибиоза	+	D - фукоза	-
D - ксилоза	-	Маннитол	+	Сахароза	+	L - фукоза	-
L - ксилоза	-	Сорбитол	+	Трегалоза	+	D - арабитол	-
Адонитол	-	а-Метил-D-Маннозид	+	Инулин	-	L - арабитол	-
Бета-метил-D-ксилозид	-	a-Метил-D-глюкозид	-	Мелезитоза	+	Глюконат	+
Галактоза	+	N-ацетил-глюкозамин	+	Раффиноза	+	2 - кето - глюконат	-
Глюкоза	+	Амигдалин	+	Крахмал	-	5 - кето - глюконат	-
		Арбутин	+			Гликоген	-

Острая токсичность

Исследования проводились в соответствии с надлежащей лабораторной практикой FDA (21 CFR Часть 58) и в целом в соответствии с существующими нормативными рекомендациями по оценке острой пероральной токсичности (US EPA, 2002; OECD, 2008; US FDA, 1993). Для каждого исследования пяти молодым взрослым самкам крыс Crl:CD(SD) вводили однократную болюсную дозу пробиотических микробов посредством желудочной интубации. Тестовые вещества суспендировали в соответствующих водных буферах и вводили в дозе 5000 мг/кг веса тела. Концентрации микроорганизмов в дозируемых составах определялись аналитически путем подсчета, и для S. thermophilus St-21 вводимая доза 5000 мг/кг массы тела эквивалентна 1,98 × 10¹² КОЕ/кг массы тела. Это эквивалентно суточной дозе 1,44 × 10¹⁴ КОЕ на взрослого человека (предполагая, что средний вес взрослого человека составляет 72,57 кг).

Все полученные данные указывают на то, что штамм St-21 демонстрирует общие пробиотические характеристики, и в сочетании с безопасной историей глобального использования S. thermophilus в пищевых продуктах, установлен как безопасный для использования в качестве пробиотика.

Пример 4. Исследование пробиотических свойств штамма Lactococcus lactis Ll-23

Штамм Lactococcus lactis subsp. lactis. L. lactis Ll-23 является изолятом молочных продуктов. Таксономия Ll-2 (DGCC8656) была первоначально установлена путем частичного секвенирования генов, кодирующих 16S рРНК, и подтверждена как штамм Lactococcus lactis subsp. lactis. L. lactis Ll-23 не является генетически модифицированным.

Биогенные амины

Применительно к геному Ll-23 не обнаружены гены гистидиндекарбоксилазы или ген тирозиндекарбоксилазы. Следовательно, маловероятно, что Ll-23 будет производить гистамин или тирамин.

Таблица 10. Наличие генов гистидиндекарбоксилазы и тирозиндекарбоксилазы.

Штамм	Ген гистидиндекарбоксилазы	Ген тирозиндекарбоксилазы
Lactococcus lactis subsp. lactis. L. lactis Ll-23	-	-

Устойчивость к антибиотикам

Антибиограмма Ll-23 была установлена с использованием метода ISO 10932 IDF223 и микроразведений VetMIC Lact-1 и 2, которые включают 10 антибиотиков. Зарегистрированные МИК (минимальная ингибирующая концентрация) или самая низкая концентрация антибиотика, которая препятствует росту Ll-23, показаны в таблице ниже. Все значения МИК для Ll-23 ниже микробных контрольных точек (МБП), определенных для Lactococcus lactis (Группа EFSA по добавкам и продуктам или веществам, используемым в кормах для животных (FEEDAP), 2012). Согласно этим результатам, Ll-23 не имеет приобретенной устойчивости к антибиотикам (таблица 11).

Таблица 11. St-21 Профиль чувствительности к антибиотикам*

	Ген	Кан	Стр	Ттр	Эри	Кли	Хмф	Амп	Ван	Вир
	МИК мг/Л
L. lactis Ll-23	1	4	16	0,5	0,12	0,06	4	0,25	0,5	1
МИК для L. lactis	32	64	32	4	1	1	8	2	4	4

Устойчивость к кислоте/желчи

Внутреннее испытание на кислотоустойчивость и толерантность к желчи in vitro было проведено для характеристики потенциальной выживаемости Lactococcus lactis Ll-23 в желудочно-кишечном тракте. Для проведения испытания культура Ll-23 культивировались в течение ночи при температуре 37°C в анаэробных условиях. Десять миллилитров культуры центрифугировались, промывались и ресуспендировались в 1 мл буфера Баттерфилда; 0,25 мл этой суспензии добавлялись к 25 мл предварительно темперированного желудочного сока (0,2% NaCl, 0,32% пепсина, pH доводился до 3,5 с помощью 6N HCl). Образцы отбирались для подсчета немедленно (время ноль) и через один час при температуре 37°C. Дополнительный образец культуры Ll-23/желудочного сока отбирался и подсчитывался с помощью агара MRS с 0,3% соли бычьей желчи для испытания на толерантность к желчи. Процент выживаемости был рассчитан после получения подсчетов на чашках Петри, чтобы сравнить образцы, инкубированные в желудочном соке в течение одного часа и в агаре с бычьей желчью и солью, с образцом в нулевом времени.

Кислотная устойчивость Ll-23 составляет ++++ Отличная (>90% выживаемости в HCl и 1% пепсине при pH 3,5 в течение 1 часа при 37°C), в то время как желчная устойчивость Lr-32 составляет ++ Хорошая (70-79% выживаемости в среде, содержащей 0,3% желчных солей).

Производство L/D молочной кислоты

Внутреннее тестирование Ll-23 показало, что он продуцирует 10% D(-)-молочной кислоты и 90% L(+) молочной кислоты (тестовый набор bioMérieux).

Углеводный профиль

Для разработки профиля ферментации углеводов для Ll-23 штамм выращивали в течение ночи в MRS при 37°C. 10 мл аликвоты центрифугировали, а затем MRS отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 5 мл PBS и центрифугировали перед окончательным ресуспендированием в 5 мл PBS, готовя к использованию в наборе полосок для ферментации углеводов bioMérieux API 50 CH. Результаты теста ферментации углеводов можно найти в таблице 12.

Таблица 12. Углеводный профиль Ll-23

37°C, 48 ч
Контроль	-	Фруктоза	+	Эскулин	+	Ксилитол	-
Глицерин	-	Манноза	+	Алицин	+	Гентиобиоза	-
Эритрит	-	Сорбоза	-	Целлобиоза	+	D - тураноза	-
D - арабиноза	-	Рамноза	-	Мальтоза	+	D - ликсоза	-
L - арабиноза	+	Дульцитол	-	Лактоза	+	D - тагатоза	-
Рибоза	+	Инозитол	-	Мелибиоза	-	D - фукоза	-
D - ксилоза	-	Маннитол	-	Сахароза	+	L - фукоза	-
L - ксилоза	-	Сорбитол	-	Трегалоза	+	D - арабитол	-
Адонитол	-	а-Метил-D-Маннозид	-	Инулин	-	L - арабитол	-
Бета-метил-D-ксилозид	-	a-Метил-D-глюкозид	-	Мелезитоза	-	Глюконат	-
Галактоза	+	N-ацетил-глюкозамин	+	Раффиноза	+	2 - кето - глюконат	-
Глюкоза	+	Амигдалин	-	Крахмал	-	5 - кето - глюконат	-
		Арбутин	+			Гликоген	-

Острая токсичность

Исследования проводились в соответствии с надлежащей лабораторной практикой FDA (21 CFR Часть 58) и в целом в соответствии с существующими нормативными рекомендациями по оценке острой пероральной токсичности (US EPA, 2002; OECD, 2008; US FDA, 1993). Для каждого исследования пяти молодым взрослым самкам крыс Crl:CD(SD) вводили однократную болюсную дозу пробиотических микробов посредством желудочной интубации. Тестовые вещества суспендировали в соответствующих водных буферах и вводили в дозе 5000 мг/кг веса тела. Концентрации микроорганизмов в дозируемых составах определялись аналитически путем подсчета, и для L. lactis Ll-23 вводимая доза 5000 мг/кг массы тела эквивалентна 8,63 × 10¹² КОЕ/кг массы тела. Это эквивалентно суточной дозе 6,26 × 10¹⁴ КОЕ на взрослого человека (предполагая, что средний вес взрослого человека составляет 72,57 кг или 160 фунтов). Все животные наблюдались на предмет клинических признаков токсичности три раза в день введения дозы и один раз в день в течение двухнедельного периода наблюдения после введения дозы. Вес тела регистрировался до введения дозы и примерно еженедельно в течение двухнедельного периода наблюдения. В конце периода наблюдения все животные были гуманно умерщвлены и им была проведена полная аутопсия. Не было никакого влияния на смертность, вес тела или увеличение веса тела. Аналогичным образом, не было никаких клинических признаков токсичности, отмеченных при жизни или при вскрытии, указывающих на неблагоприятные эффекты пробиотических микробов, вводимых в виде однократной болюсной дозы на уровне дозы 5000 мг/кг массы тела. На основании имеющихся данных и в условиях этих исследований ни один из протестированных пробиотических микробов не считался остро токсичным, и значения LD₅₀ не рассчитывались.

Все данные указывают на то, что штамм Ll-23 демонстрирует общие пробиотические характеристики, и в сочетании с безопасной историей глобального использования Lactococcus lactis в пищевых продуктах он признан безопасным для использования в качестве пробиотика.

Пример 5. Исследование пробиотических свойств штамма Lactobacillus plantarum Lp-115

Штамм Lactobacillus plantarum Lp-115 был первоначально выделен из растительного материала. Таксономия Lp-115 (DGCC 4715) была первоначально установлена путем частичного секвенирования генов, кодирующих 16S рРНК, и подтверждена как штамм Lactobacillus plantarum. L. plantarum Lp-115 не является генетически модифицированным, как определено Директивами 2009/41/EC и 2001/18/EC.

Биогенные амины

Применительно к геному Lp-115 не обнаружены гены гистидиндекарбоксилазы или ген тирозиндекарбоксилазы. Следовательно, маловероятно, что Lp-115 будет производить гистамин или тирамин.

Таблица 13. Наличие генов гистидиндекарбоксилазы и тирозиндекарбоксилазы.

Штамм	Ген гистидиндекарбоксилазы	Ген тирозиндекарбоксилазы
Lactobacillus plantarum Lp-115	-	-

Устойчивость к антибиотикам

Антибиограмма L. plantarum Lp-115 была установлена с использованием метода ISO 10932 IDF223 и микроразведений VetMIC Lact-1 и 2, которые включают 10 антибиотиков. Зарегистрированные МИК (минимальная ингибирующая концентрация) или самая низкая концентрация антибиотика, которая препятствует росту Lp-115, показаны в таблице ниже. Все значения МИК для Lp-115 ниже или равны микробным контрольным точкам (МБП), определенным для Lactobacillus plantarum (EFSA Panel on Additives and Products or Substances Used in Animal Feed (FEEDAP), 2012).

Согласно полученным результатам, Lp-115 не имеет приобретенной устойчивости к антибиотикам (таблица 14).

Таблица 14. Lp-115 Профиль чувствительности к антибиотикам*

	Ген	Кан	Стр	Ттр	Эри	Кли	Хмф	Амп	Ван	Вир
	МИК мг/Л
L. plantarum Lp-115	8	64	64	32	0,5	2	8	0,5	>128	2
МИК для L. plantarum	16	64	-	32	1	2	8	2	-	4

Устойчивость к кислоте/желчи

Внутреннее испытание на кислотность и толерантность к желчи in vitro было проведено для характеристики потенциальной выживаемости L. plantarum Lp-115 в желудочно-кишечном тракте. Для проведения испытания культура Lp-115 культивировалась в течение ночи при температуре 37 °C в анаэробных условиях. Десять миллилитров культуры центрифугировались, промывались и ресуспендировались в 1 мл буфера Баттерфилда; 0,25 мл этой суспензии добавлялись к 25 мл предварительно темперированного желудочного сока (0,2% NaCl, 0,32% пепсина, pH доводился до 3,5 с помощью 6N HCl). Образцы отбирались для подсчета немедленно (время ноль) и через один час при температуре 37 °C. Дополнительный образец культуры Lp-115/желудочного сока отбирался и подсчитывался с помощью агара MRS с 0,3% соли бычьей желчи для испытания на толерантность к желчи. Процент выживаемости был рассчитан после получения подсчетов на чашках Петри, чтобы сравнить образцы, инкубированные в желудочном соке в течение одного часа и в агаре с бычьей желчью и солью, с образцом нулевого времени.

Устойчивость Lp-115 к кислоте составляет ++++ Отличная (>90% выживаемости в HCl и 1% пепсине при pH 3,5 в течение 1 часа при 37 °C), в то время как устойчивость Lp-115 к желчи составляет ++++ Отличная (>90% выживаемости в среде, содержащей 0,3% желчных солей).

Производство L/D молочной кислоты

L. plantarum Lp-115 производит 45% D (-)-молочной кислоты и 55% L(+) молочной кислоты.

Углеводный профиль

Для разработки профиля ферментации углеводов для Lp-115 штамм выращивали в течение ночи в MRS при 37°C. 10 мл аликвоты центрифугировали, а затем MRS отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 5 мл PBS и центрифугировали перед окончательным ресуспендированием в 5 мл PBS, готовя к использованию в наборе полосок для ферментации углеводов bioMérieux API 50 CH.

Результаты теста ферментации углеводов можно найти в таблице 15.

Таблица 15. Углеводный профиль Lp-115

37°C, 48 ч
Контроль	-	Фруктоза	+	Эскулин	+	Ксилитол	-
Глицерин	-	Манноза	+	Алицин	+	Гентиобиоза	+
Эритрит	-	Сорбоза	-	Целлобиоза	+	D - тураноза	-
D - арабиноза	-	Рамноза	-	Мальтоза	+	D - ликсоза	-
L - арабиноза	+	Дульцитол	-	Лактоза	+	D - тагатоза	-
Рибоза	+	Инозитол	-	Мелибиоза	+	D - фукоза	-
D - ксилоза	-	Маннитол	-	Сахароза	+	L - фукоза	-
L - ксилоза	-	Сорбитол	-	Трегалоза	+	D - арабитол	-
Адонитол	-	а-Метил-D-Маннозид	+	Инулин	-	L - арабитол	-
Бета-метил-D-ксилозид	-	a-Метил-D-глюкозид	+	Мелезитоза	+	Глюконат	+
Галактоза	+	N-ацетил-глюкозамин	+	Раффиноза	+	2 - кето - глюконат	-
Глюкоза	+	Амигдалин	+	Крахмал	-	5 - кето - глюконат	-
		Арбутин	+			Гликоген	-

Острая токсичность

Исследования проводились в соответствии с надлежащей лабораторной практикой FDA (21 CFR Часть 58) и в целом в соответствии с существующими нормативными рекомендациями по оценке острой пероральной токсичности (US EPA, 2002; OECD, 2008; US FDA, 1993). Для каждого исследования пяти молодым взрослым самкам крыс Crl:CD(SD) вводили однократную болюсную дозу пробиотических микробов посредством желудочной интубации. Тестовые вещества суспендировали в соответствующих водных буферах и вводили в дозе 5000 мг/кг веса тела. Концентрации микроорганизмов в дозируемых составах определялись аналитически путем подсчета, и для L. plantarum Lp-115 вводимая доза 5000 мг/кг массы тела эквивалентна 4,20 × 10¹² КОЕ/кг массы тела. Это эквивалентно суточной дозе 3,05 × 10¹⁴ КОЕ на взрослого человека (предполагая, что средний вес взрослого человека составляет 72,57 кг или 160 фунтов).

Все животные наблюдались на предмет клинических признаков токсичности три раза в день введения дозы и один раз в день в течение двухнедельного периода наблюдения после введения дозы. Вес тела регистрировался до введения дозы и примерно еженедельно в течение двухнедельного периода наблюдения. В конце периода наблюдения все животные были гуманно умерщвлены и подвергнуты полному вскрытию.

Не было никакого влияния на смертность, вес тела или набор веса тела. Аналогичным образом, не было никаких клинических признаков токсичности, отмеченных при жизни или при вскрытии, указывающих на неблагоприятные эффекты пробиотических микробов, вводимых в виде однократной болюсной дозы на уровне дозы 5000 мг/кг массы тела.

На основании имеющихся данных и в условиях этих исследований ни один из протестированных пробиотических микробов не считался остро токсичным, и значения LD₅₀ не рассчитывались.

Все проведенные исследования указывают на то, что штамм Lp-115 демонстрирует общие пробиотические характеристики, и в сочетании с безопасной историей глобального использования L. plantarum в пищевых продуктах, он признан безопасным для использования в качестве пробиотика.

Пример 6. Исследование пробиотических свойств штамма Lactobacillus acidophilus La-14

Штамм Lactobacillus acidophilus La-14 был первоначально выделен из растительного материала. Таксономия La-14 (DGCC 4715) была первоначально установлена путем частичного секвенирования генов, кодирующих 16S рРНК, и подтверждена как штамм Lactobacillus acidophilus La-14 не является генетически модифицированным, как определено Директивами 2009/41/EC и 2001/18/EC.

Биогенные амины

Применительно к геному La-14 не обнаружены гены гистидиндекарбоксилазы или ген тирозиндекарбоксилазы. Следовательно, маловероятно, что La-14 будет производить гистамин или тирамин.

Таблица 16. Наличие генов гистидиндекарбоксилазы и тирозиндекарбоксилазы.

Штамм	Ген гистидиндекарбоксилазы	Ген тирозиндекарбоксилазы
Lactobacillus acidophilus Lа-14	-	-

Устойчивость к антибиотикам

Антибиограмма Lactobacillus acidophilus La-14 была установлена с использованием метода ISO 10932 IDF223 и микроразведений VetMIC Lact-1 и 2, которые включают 10 антибиотиков. Зарегистрированные МИК (минимальная ингибирующая концентрация) или самая низкая концентрация антибиотика, которая препятствует росту La-14, показаны в таблице ниже. Все значения МИК для La-14 ниже или равны микробным контрольным точкам (МБП), определенным для Lactobacillus acidophilus (EFSA Panel on Additives and Products or Substances Used in Animal Feed (FEEDAP), 2012) (таблица 17).

Согласно полученным результатам, La-14 не имеет приобретенной устойчивости к антибиотикам.

Таблица 17. La-14 Профиль чувствительности к антибиотикам*

	Ген	Кан	Стр	Ттр	Эри	Кли	Хмф	Амп	Ван	Вир
	МИК мг/Л
L. acidophilus La-14	1	32	2	2	0,06	0,25	4	0,5	0,5	1
МИК для L. acidophilus	16	64	16	4	1	1	4	1	2	4

Устойчивость к кислоте/желчи

Внутреннее испытание на кислотность и толерантность к желчи in vitro было проведено для характеристики потенциальной выживаемости Lactobacillus acidophilus La-14 в желудочно-кишечном тракте. Для проведения испытания культура La-14 культивировалась в течение ночи при температуре 37°C в анаэробных условиях. Десять миллилитров культуры центрифугировались, промывались и ресуспендировались в 1 мл буфера Баттерфилда; 0,25 мл этой суспензии добавлялись к 25 мл предварительно темперированного желудочного сока (0,2% NaCl, 0,32% пепсина, pH доводился до 3,5 с помощью 6N HCl). Образцы отбирались для подсчета немедленно (время ноль) и через один час при температуре 37°C. Дополнительный образец культуры La-14 /желудочного сока отбирался и подсчитывался с помощью агара MRS с 0,3% соли бычьей желчи для испытания на толерантность к желчи. Процент выживаемости был рассчитан после получения подсчетов на чашках Петри, чтобы сравнить образцы, инкубированные в желудочном соке в течение одного часа и в агаре с бычьей желчью и солью, с образцом нулевого времени.

Устойчивость La-14 к кислоте составляет ++++ Отличная (>90% выживаемости в HCl и 1% пепсине при pH 3,5 в течение 1 часа при 37°C), в то время как устойчивость La-14 к желчи составляет ++++ Отличная (>90% выживаемости в среде, содержащей 0,3% желчных солей).

Производство L/D молочной кислоты

Lactobacillus acidophilus La-14 производит 60% D (-)-молочной кислоты и 40% L(+) молочной кислоты.

Углеводный профиль

Для разработки профиля ферментации углеводов для La-14 штамм выращивали в течение ночи в MRS при 37°C. 10 мл аликвоты центрифугировали, а затем MRS отбрасывали. Осадок ресуспендировали в 5 мл PBS и центрифугировали перед окончательным ресуспендированием в 5 мл PBS, готовя к использованию в наборе полосок для ферментации углеводов bioMérieux API 50 CH.

Результаты теста ферментации углеводов можно найти в таблице 18.

Таблица 18. Углеводный профиль La-14

37°C, 48 ч
Контроль	-	Фруктоза	+	Эскулин	+	Ксилитол	+
Глицерин	-	Манноза	+	Алицин	+	Гентиобиоза	+
Эритрит	-	Сорбоза	-	Целлобиоза	+	D - тураноза	-
D - арабиноза	-	Рамноза	-	Мальтоза	+	D - ликсоза	-
L - арабиноза	-	Дульцитол	-	Лактоза	+	D - тагатоза	-
Рибоза	-	Инозитол	-	Мелибиоза	+	D - фукоза	-
D - ксилоза	-	Маннитол	-	Сахароза	+	L - фукоза	-
L - ксилоза	-	Сорбитол	-	Трегалоза	+	D - арабитол	-
Адонитол	-	а-Метил-D-Маннозид	+	Инулин	-	L - арабитол	-
Бета-метил-D-ксилозид	-	a-Метил-D-глюкозид	+	Мелезитоза	+	Глюконат	+
Галактоза	+	N-ацетил-глюкозамин	+	Раффиноза	-	2 - кето - глюконат	-
Глюкоза	+	Амигдалин	+	Крахмал	-	5 - кето - глюконат	-
		Арбутин	+			Гликоген	-

Острая токсичность:

Исследования проводились в соответствии с надлежащей лабораторной практикой FDA (21 CFR Часть 58) и в целом в соответствии с существующими нормативными рекомендациями по оценке острой пероральной токсичности (US EPA, 2002; OECD, 2008; US FDA, 1993). Для каждого исследования пяти молодым взрослым самкам крыс Crl:CD(SD) вводили однократную болюсную дозу пробиотических микробов посредством желудочной интубации. Тестовые вещества суспендировали в соответствующих водных буферах и вводили в дозе 5000 мг/кг веса тела. Концентрации микроорганизмов в дозируемых составах определялись аналитически путем подсчета, и для Lactobacillus acidophilus La-14 вводимая доза 5000 мг/кг массы тела эквивалентна 4,20 × 10¹² КОЕ/кг массы тела. Это эквивалентно суточной дозе 3,05 × 10¹⁴ КОЕ на взрослого человека (предполагая, что средний вес взрослого человека составляет 72,57 кг или 160 фунтов).

На основании имеющихся данных и в условиях этих исследований ни один из протестированных пробиотических микробов не считался остро токсичным, и значения LD50 не рассчитывались.

Все проведенные исследования указывают на то, что штамм La-14 демонстрирует общие пробиотические характеристики, и в сочетании с безопасной историей глобального использования Lactobacillus acidophilus в пищевых продуктах, он признан безопасным для использования в качестве пробиотика.

Пример 7. Приготовление пробиотической композиции

Для получения композиции готовят сухую смесь пробиотических бактерий, содержащую: Bifidobacterium lactis HN019 - 2 г, Lacticaseibacillus casei Lc-11 - 1 г, Lactobacillus acidophilus La-14 - 0,7 г, Lactococcus lactis Ll-23 - 0,6 г, Lactiplantibacillus plantarum Lp-115 - 0,4 г, Lacticaseibacillus rhamnosus GG - 0,3 г, Streptococcus thermophilus St-21 - 0,3 г, Bifidobacterium lactis DSM 15954 - 0,13 г, Bifidobacterium lactis Bl-04 - 0,07 г. Добавляют нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты в следующем количестве: микрокристаллическая целлюлоза - 40 г, инулин - 14 г, диоксид кремния - 0,5 г, стеарат магния- 40 г. тщательно перемешивают и фасуют в капсулы, например, по 325 мг на капсулу.

Пример 8. Оценка эффективности терапии пробиотической композицией по динамике изменения характера стула с использованием Бристольской шкалы

Открытое проспективное наблюдательное исследование на 120 пациентах с легкими или среднетяжелыми проявлениями дисбиоза кишечника, которые были разделены на 2 группы: основную (группа 1, n = 60) и группу сравнения (группа 2, n = 60). Исследование включало 2 обязательных визита пациента: 1-й визит - исходный; 2-й визит - заключительный (день 30) после приема препарата пробиотической композиции в течение месяца в количестве 325 мг (в виде капсулы). В ходе каждого визита проводился анализ стула, соответственно в начале исследования и по прошествии 30 суток после начала приема пробиотической композиции (оценка формы и консистенции стула по Бристольской шкале), результаты представлены на фиг.1.

Большинство значимых различий в характере стула на фоне терапии произошло у пациентов, принимавших композицию число детей с 3-м и 4-м типами стула по Бристольской шкале, характеризующих нормальную консистенцию кала, увеличилось на 30,5% (р = 0,02 и р = 0,02 соответственно). Также значимо уменьшились доли пациентов 1-й группы с 5-м и 6-м типами кала (р = 0,007 и р = 0,005 соответственно), а также уменьшилось число пациентов с неустойчивым стулом (р = 0,015, фиг 1). Важно отметить, что доля пациентов с нормальными типами стула после исследования стала выше, чем до исследования. При этом статистическая разница находилась на уровне тенденции (53,3% против 36,7%, р = 0,07). Таким образом, у пациентов, получавших пробиотическую композицию, произошло статистически значимое улучшение показателей, характеризующих консистенцию стула, особенно в отношении его нормальных типов.

Пример 9. Исследование активности пробиотической композиции в отношении биопленок патогенных микроорганизмов (грамотрицательных и грамположительных паттогенных бактерий и микромицетов)

Оценку антибиопленочной активности композиции против зрелых биопленок тест-штаммов осуществляли следующим образом: полную петлю ночной культуры тест-штамма суспендировали в 0,5 мл ФР, вносили 0,1 мл суспензии в 5 мл соответствующей жидкой питательной среды для тест-штамма, вносили 4 стерильных купона (300 мм²) из промышленного полипропилена, инкубировали при температуре 37°С в течение 72 ч с аэрацией при скорости вращения 150 об/мин на шейкере Unimax 1010 (Heidolph Instruments, Германия). Затем купоны извлекали, трижды промывали в 10 мл стерильной воды и переносили по 2 купона в две пробирки типа Фалькон (50 мл) с 4 мл жидкой питательной среды Бликфельдта. В одну из пробирок вносили 1 мл суспензии пробиотической композиции, приготовленной как описано выше, а во вторую - равное количество ФР. Пробирки закрывали пленкой Parafilm, аккуратно перемешивали и инкубировали в атмосфере 5% CO₂ при температуре 37°С в течение 72 ч. Затем купоны извлекали, трижды промывали в 10 мл стерильной воды и дезинтегрировали биопленку в 5 мл стерильного ФР ультразвуком на гомогенизаторе Soniprep 150 (MSE Ltd, Великобритания) при амплитуде 4 × 10^-6 м в течение 2 мин. Суспензию титровали и высевали на чашки Петри с селективными средами для соответствующих тест-штаммов, выращивали при температуре 37°С в течение 24 ч и подсчитывали показатель КОЕ. Антибиопленочную активность композиции на зрелую биопленку тест-штамма определяли как статистически достоверное снижение показателя КОЕ относительно числа КОЕ тест-штамма в контроле.

В результате проведенного исследования изучена in vitro способность пробиотической композиции по настоящему изобретению подавлять формирование биопленок клинически значимых микроорганизмов - патогенных грамотрицательных и грамположительных бактерий, а также дрожжеподобных грибов рода Candida. Консорциум пробиотических штаммов пробиотической композиции эффективно подавлял формирование биопленок большинства (75 %) тест-штаммов, а также значительной части зрелых биопленок грамположительных бактерий - стафилококков (55 %) и грамотрицательных бактерий - E. coli и K. pneumoniae (30%).

Полученные данные указывают на возможность успешного использования пробиотической композиции при профилактике заболеваний, связанных с биопленками патогенных микроорганизмов. На фиг. 2 показано изменение плотности формирующихся биопленок при воздействии на них препарата пробиотической композиции (белый цвет), контроль - черный цвет: (а) - штаммов грамотрицательных бактерий; (б) - штаммов грамположительных бактерий; (в) - штаммов дрожжеподобных грибов Candida spp.

Литература:

1) Ammor, M., Florez, A., & Mayo, B. (2007). Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and bifidobacteria. Food Microbiology, 24(6), 559-70.

2) Bhattacharjee, M. (2016). Chapter 2: Development of Resistance to Antibiotics. In M. Bhattacharjee, Chemistry of Antibiotics and Related Drugs (p. 29). Springer.

3) Bolotin, A., Quinquis, B., Renault, P., Sorokin, A., Ehrlich, S. D., Kulakauskas, S., & Fonstein, M. (2004). Complete sequence and comparative genome analysis of the dairy bacterium Streptococcus thermophilus. Nature biotechnology, 22(12), 1554.

4) Bourdichon, F., Boyaval, P., Casaregola, S., Dupont, J., Farrokh, C., Frisvad, J. C., … & Ouwehand, A. (2012). 3 The 2012 Inventory of Microbial Species with technological beneficial role in fermented food products. Bulletin of the International Dairy Federation, 455, 22-61.

5) Delorme, C. (2008). Safety assessment of dairy microorganisms: Streptococcus thermophilus. International journal of food microbiology, 126(3), 274-277.

6) Devirgiliis, C., Barile, S., & Perozzi, G. (2011). Antibiotic resistance determinants in the interplay between food and gut microbiota. Genes & Nutrition, 6, 275-84.

7) EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). (2012). Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Journal, 10(6), 2740.

8) EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). (2011). Scientific Opinion on risk based control of biogenic amine formation in fermented foods. EFSA Journal, 9(10), 2393.

9) EFSA Panel on Biological Hazards, B., 2018. Scientific Opinion on the Maintenance on the list of QPS biological agents intestinally added to food and feed (2018 update). EFSA Journal 2018;16(1):4664.

10) EFSA Panel on Genetically Modified Organisms. (2011). Guidance for risk assessment of food and feed from genetically modified plants. EFSA Journal, 9(5), 2150. Retrieved from EFSA Info Session on Applications - GMO.

11) European Food Safety Authority. (2007). Introduction of a Qualified Presumption of Safety (QPS) approach for assessment of selected microorganisms referred to EFSA. EFSA Journal, 587, 1-16.

12) Gardini, F. Ö. (2016). Technological Factors Affecting Biogenic Amine Content in Foods: A Review. Frontiers in Microbiology, 7, 1218.

13) Gasser, F. (1994). Safety of lactic acid bacteria and their occurrence in human clinical infections. Bulletin de l'Institut Pasteur, 92(1), 45-67.

14) Guarner, F., Requena, T., & Marcos, A. (2010). Consensus statements from the Workshop "Probiotics and Health: Scientific Evidence". Nutricion Hospitalaria, 25(5), 700-4.

15) Hill, C., Guarner, F., Reid, G., Gibson, G., Merenstein, D., Pot, B., … Sanders, M. (2014, Aug). Expert Consensus Document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics Consensus Statement on the Scope and Appropriate Use of the Term Probiotic. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 11(8), 506-14.

16) Hols, P., Hancy, F., Fontaine, L., Grossiord, B., Prozzi, D., Leblond-Bourget, N., ... & Guédon, E. (2005). New insights in the molecular biology and physiology of Streptococcus thermophilus revealed by comparative genomics. FEMS microbiology reviews, 29(3), 435-463.

17) Ladero, V., Calles-Enriquez, M., Fernandez, M., & Alvarez, M. (2010). Toxicological Effects of Dietary Biogenic Amines. Current Nutrition & Food Science, 6, 145-56.

18) Lipsa, R., Tudorachi, N., & Vasile, C. (2010). Poly(α-hydroxyacids) in biomedical applications: synthesis and properties of lactic acid polymers. e-Polymers, 087.

19) Mogensen, G., Salminen, S., O'brien, J., Ouwenhand, A., Holzapfel, W., Shortt, C., … & Crittenden, R. G. (2002). Inventory of microoganisms with a documented history of use in food.

Claims

1. Пробиотическая композиция для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта восстановления микрофлоры кишечника, профилактики синдрома избыточного бактериального роста и диарей, отличающаяся тем, что указанная композиция выполнена в форме капсулы, содержащей сухую смесь пробиотических бактерий в соответствующем соотношении, мас. %: Bifidobacterium lactis HN019 2%, Lacticaseibacillus casei Lc-11 1%, Lactobacillus acidophilus La-14 0,7%, Lactococcus lactis Ll-23 0,6%, Lactiplantibacillus plantarum Lp-115 0,4%, Lacticaseibacillus rhamnosus GG 0,3%, Streptococcus thermophilus St-21 0,3%, Bifidobacterium lactis DSM 15954 0,13%, Bifidobacterium lactis Bl-04 0,07% и нутрицевтически приемлемые вспомогательные компоненты в соответствующем соотношении, мас. %: микрокристаллическую целлюлозу 40%, инулин 14%, диоксид кремния 0,5%, стеарат магния 40%.

2. Пробиотическая композиция по п.1 для восстановления микрофлоры кишечника и для профилактики синдрома избыточного бактериального роста и диарей, включая антибиотик-ассоциированную диарею и Clostridium dificile-ассоциированную диарею.