RU2848211C1

RU2848211C1 - Вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V

Info

Publication number: RU2848211C1
Application number: RU2024137151A
Authority: RU
Inventors: Максим Игоревич Доронин; Анжела Алексеевна Шишкова; Илья Александрович Чвала; Виктор Викторович Никифоров; Татьяна Владимировна Оковытая; Евгения Александровна Разгуляева; Дмитрий Игоревич Кара
Filing date: 2024-12-11
Publication date: 2025-10-16

Abstract

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V. Вакцина, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «SAT-3/Уганда/V», в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить раннюю эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотических штаммов вируса ящура генотипа SAT-3/V, циркулирующих в странах Африки. Кроме того, вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V изготовлена с применением масляного адъюванта ADYUVAC 70. 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 14 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V.

Наиболее контагиозным вирусным заболеванием млекопитающих по-прежнему остается ящур, который вызывает везикулезно-эрозивные поражения слизистых оболочек ротовой и носовой полости, а также кожи межпальцевых складок и околоногтевого ложа [1].

Существует семь серотипов вируса ящура: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом представители серотипа SAT-3 является распространенным на территории Африки и острове Мадагаскар, что определяет высокую актуальность изготовления вакцин для ранней защиты от ящура данного серотипа.

При этом каждый из серотипов разделен на более чем 60 генотипов. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного 1D-гена, который кодирует аминокислотную последовательность поверхностного белка VP₁ [2].

Восстановление животного после переболевания ящуром, вызванным каким-либо одним генотипом не обеспечивает иммунную защиту против другого генотипа вируса ящура [3-5].

Серотип SAT-3 включает в себя 5 следующих топотипов: I (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), II (WESTERN ZIMBABWE, WZ), III (NORTHWEST ZIMBABWE, NWZ), IV, V (East Africa, EA) [1, 3]. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики для ранней защиты от ящура генотипа SAT-3/V, представители которых активно распространяются на территории Африки и Мадагаскара.

С целью недопущения возникновения ящура в хозяйствах Российской Федерации применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую вакцинацию животных в буферной зоне, проведение мониторинга иммунного статуса крупного, мелкого рогатого скота и свиней [6, 7, 8, 9, 10, 11].

Данная инфекция продолжает оставаться экономически значимой проблемой. Цельновирионные вакцины на сегодняшний день в отношении ящура по-прежнему признаются наиболее эффективными, что крайне важно для борьбы с самым контагиозным заболеванием в мире [8-12].

Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной и безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной составляющей антиген вируса, соответствующий эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин по-прежнему является крайне актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучных регионах и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура с целью обеспечения ветеринарного благополучия [13-16].

Экстренная вакцинация является одной из нескольких мер, которые могут быть применены для борьбы со вспышками ящура. Это является ценным дополнением к применению основных мер зоосанитарного контроля, которые должны включать быструю диагностику, отслеживание, контроль за передвижением и дезинфекцию, а также убой инфицированных и контактирующих животных и их безопасное удаление. Критерии, определяющие успешное осуществление экстренной вакцинации для ранней защиты, включают в себя доступ к вакцине, которая: 1) содержит штамм вируса ящура с достаточным антигенным родством по отношению к изолятам, циркулирующим в очаге; 2) относится к требуемому виду среди разработанных вакцин; 3) характеризуется приемлемой безвредностью и эффективностью; 4) имеет соответствующий доступ, в том числе объем партий и своевременность их поставок.

Планирование на случай непредвиденных обстоятельств должно включать обеспечение экстренной вакцинации и учитывать возможность сложных решений не только в отношении того, когда, где и как применять вакцину, но и экономическую целесообразность ее использования [8].

В литературных источниках указывают, что экстренная вакцинация животных может быть эффективной для профилактики заболевания в течение первых 4-5 дней после вакцинации. Данные исследования показывают, что риск распространения инфекции уменьшается по мере увеличения интервала между вакцинацией и заражением вирусом ящура. Кроме того, вакцинация может уменьшить количество выделяемого вируса по сравнению с не иммунизированными животными [9, 10].

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что в Намибии в 2011, 2019, 2020 гг. обнаружили возбудитель ящура генотипа SAT-3/II. Множество вспышек ящура серотипа SAT-3 зафиксировано в Зимбабве в 2013 г., ЮАР в 2015-2016 гг., Республике Зимбабве в 2015-2018 гг. При этом следует отметить, что представители генотипа SAT-3/V вируса ящура встречаются в основном на территории Центральной и Восточной Африки в частности, в Уганде. В настоящее время в мире встречаются изоляты и штаммы вируса ящура серотипа SAT-3 только трех топотипов: I, II и V, остальные не фиксируются несколько десятилетий, поэтому для производственных целей используют штаммы именно этих генотипов. Распространение ящура генотипа SAT-3/V является опасным и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-3/V.

На территории Африканского континента вспышки ящура генотипа SAT-3/V теперь имеют спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы активно продолжают усиливаться торгово-экономические связи Российской Федерации со странами Африки. Исходя из этого, крайне высоки риски заноса изолятов данного генотипа на территорию Российской Федерации, что угрожает биологической безопасности нашей страны по ящуру. Кроме того, для профилактики данного заболевания на указанных континентах важно производить вакцину для ранней защиты в условиях периодически возникающих вспышек ящура указанного генотипа.

Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину культуральную инактивированную эмульсионную для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики заболевания.

В 2013 г. на территории Республики Уганда из патологического материала от крупного рогатого скота в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был выделен изолят вируса ящура. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм был охарактеризован и получил название - штамм «SAT-3/Уганда/V». По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу SAT-3/V вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-3 (Фиг. 1).

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная эмульсионная [17], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «SAT-2/XIV/2023», в количестве не менее 5,0 мкг; масляный адъювант ADYUVAC 70 с содержанием 70% по массе, поддерживающую среду - до 1,0 см³ (прототип) [17]. На сегодняшний день вакцина против ящура, вызванного штаммами серологического типа SAT-3, в России не запатентована.

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его низкой иммуногенной активности на ранних этапах после иммунизации (на 4 сутки) относительно штаммов/изолятов вируса ящура генотипа SAT-3/V.

Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S иммуногенного компонента вируса ящура генотипа SAT-3/V в дозе препарата.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала культуральных инактивированных эмульсионных вакцин для ранней защиты против вируса ящура генотипа SAT-3/V.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 2,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-3/Уганда/V» (генотип SAT-3/V) вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 25,0 мкг; 2) масляный адъювант ADYUVAC 70, обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных с содержанием 70% по массе, 3) поддерживающая среда - до 2,0 см³.

Штамм вируса ящура «SAT-3/Уганда/V» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №503 - деп / 23-53 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Указанный штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Хэнкса без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 6,0% от общего объема при рН среды 7,55-7,65. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,03% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,04% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-3/Уганда/V» (генотип SAT-3/V) вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура каждого генотипа. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18, 19].

Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 2,0 см³ не менее 25,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура генотипа SAT-3/V. Заявленную концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall.

Вакцину культуральную инактивированную эмульсионную для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта ADYUVAC 70 в соотношении 30% и 70% по массе соответственно. Полученная вакцина представляет собой стабильную простую обратную эмульсию белого или бледно-розового цвета, содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура генотипа SAT-3/V, который обеспечивает формирование специфического иммунитета.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штаммов «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штаммов «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 25,0 мкг в 2,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант ADYUVAC 70.

4. Вакцина содержит масляный адъювант ADYUVAC 70 в количестве 70% (по массе) в 2,0 см³ готового препарата.

5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V вируса ящура, полученного в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант ADYUVAC 70, добавка в готовом препарате объемом 2,0 см³ в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V вируса ящура	не менее 25,0 мкг
Масляный адъювант ADYUVAC 70	70% (по массе)
Поддерживающая среда	до 2,0 см³

Предлагаемая вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа SAT-3/V.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной эмульсионной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, который в последние годы вызывает вспышки в странах Африки.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа SAT-3. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура генотипа SAT-3/V;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР₁ штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура генотипа SAT-3/V.

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура имеет следующую таксономию: семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип SAT-3, генотип SAT-3/V. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура относится к серотипу SAT-3. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются специфические антитела, выявляемые в реакции микронейтрализации, иммуноферментном анализе и реакции связывания комплемента.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-3/V (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса в высокочувствительной перевиваемой клеточной линии почки свиньи IB-RS-2 с помощью перекрестного исследования данного штамма возбудителя ящура со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «SAT-3 ZIM 4/81» (генотип SAT-3/I),

- штамм «SAT-3 Bech 1/65» (генотип SAT-3/II),

- штамм «SAT-3 ZIM/05/91/3» (генотип SAT-3/III).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-3, против 2,0 lg ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в реакции микронейтрализации (РМН) при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в log₂ SN₅₀. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности log₂ SN₅₀ титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7-10].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-3/Уганда/V» составили r₁ от 0,01 до 0,07, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-3.

Гено- и хемотаксономические характеристики

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,075×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,874×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,4% РНК и 68,6% белка. РНК возбудителя ящура является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Данные полипептидные молекулы, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных белков вируса ящура.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,468×10^-18 г. Плавучая плотность 1,46 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,45-7,80. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,0°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для мозоленогих и парнокопытных животных до инактивации.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении до инактивации.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного вирусом генотипа SAT-3/V, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки безопасной и эффективной вакцины для ранней защиты.

Получена безопасная и эффективная вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования

Проводили анализ первичной структуры гена 1D (белок VP₁) вакцинного штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-3. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами/штаммами вируса ящура серотипа SAT-3.

Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «SAT-3/Уганда/V» с другими изолятами и штаммами.

Последовательность нуклеотидов гена белка VР₁ штамма «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VР₁ штамма «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.

Осуществлен филогенетический анализ для вакцинного штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура. Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA 6 и алгоритма Neighbor-Joining [20]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (1000 повторов), показан рядом с ветвями [21, 22]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [23] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 14 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена вакцинного штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [24].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) вакцинного штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа SAT-3 определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (Фиг. 1). Таким образом, штамм «SAT-3/Уганда/V» относится к генотипу SAT-3/V, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 20%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт КРС (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,35-0,40 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД₅₀/кл.

По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 24 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 5,70±0,10 до 7,00±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,00±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,25±0,02 до 0,75±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (0,75±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 99,78 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» в промышленных масштабах

В процессе промышленного культивирования штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла МЕМ; 2) среда 199; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,35-0,40 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 85%. Результаты репродукции штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что при репродукции штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса с 6% ГБК и 2% сыворотки крови КРС, позволяющая за 16-17 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 0,75±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,04±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании сред 199 и Игла MEM показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Хэнкса с 6% гидролизата белков крови, 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Культивирование вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 16-29 ч (таблица 1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 16-17 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 0,75±0,02 мкг/см³и титром инфекционной активности вируса 7,04±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «SAT-3/Уганда/V» в отдельности при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Хэнкса с 6% ГБК и 2% сыворотки крови КРС.

Репродукцию вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 16-24 ч до специфического разрушения клеток на 85-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 0,75±0,02 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,04±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры их репродукции в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Хэнкса с 6% ГБК и 2% сыворотки крови КРС; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в промышленных масштабах

При промышленном культивирования штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию данных штаммов вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 млн кл./см³. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,2°С, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%.

Результаты суспензионного культивирования штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, при культивировании вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 3,5 млн кл./см³составило 0,91±0,02 мкг/см³, с концентрацией 4,0 млн кл./см³- 1,12±0,02 мкг/см³, с концентрацией 4,5 млн кл./см³ - 1,39±0,02 мкг/см³, и с концентрацией 5,0 млн кл./см³- 1,44±0,02 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура оптимальной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 4,5 млн кл./см³ (при концентрации 5,0 млн кл./см³содержание 146S компонента и титра инфекционной активности вируса незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,44±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 90% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток).

По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой в течение 14 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (1,39±0,02 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 8,44±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура.

Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (1,39±0,02 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,44±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах.

Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением - 4,5 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,2°С), в вируссодержащие суспензии добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,03%. Инактивацию вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С с периодическим перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ через 1, 2, 4, 6, 12 ч производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 3, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» в отдельности, репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения 1,2-АЭЭИ.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Для штамма «SAT-3/Уганда/V» концентрация 146S компонента составила 1,35±0,02 мкг/см³.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензий вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V»

Суспензии вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V», полученные при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,030, 0,040 и 0,050%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура указанных штаммов в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов.

Результаты анализа отражены в таблице 4, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» с помощью ПГМГ в концентрации 0,030% отмечали снижение концентрации балластного белка на 10,0%, иммуногенных компонентов - на 1,5%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,040% наблюдали снижение количества балластного белка на 25%, 146S компонента - на 3,0%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,050% содержание балластного белка уменьшалось на 44%, а иммуногенных компонентов - на 12%.

Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «SAT-3/Уганда/V», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,040%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V»

Культуральную инактивированную суспензию штамма «SAT-3/Уганда/V», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 35 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall в течение 4 ч при рабочем давлении на фильтр 2,2-2,3 атм.

До и после процесса концентрирования суспензий антигена вируса ящура определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Из данных таблицы 5 видно, что при концентрировании антигена штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 29 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 31 раз. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в суспензии в 35 раз.

Таким образом, технология тангенциальной фильтрации позволила получить антиген вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» с высокой концентрацией 146S компонента для получения вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант

Для изготовления получения вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V в качестве адъюванта была выбран масляный адъювант ADYUVAC 70 в количестве 70% по массе. Антиген составлял 30% по массе.

Пример 9. Компоновка вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» изготовили вакцину культуральную инактивированную эмульсионную для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V с применением масляного адъюванта ADYUVAC 70. Количество 146S иммуногенного компонента в дозе 2,0 см³вакцины 146S компонентавируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» составило 27,51 мкг/см³.

Пример 10. Иммунизация животных вакциной культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V

Из полученной вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-ти кратным шагом. 15 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу животных (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№ 11-15) - вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура

Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации и через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней < 50%).

Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V (предлагаемое изобретение)

Для определения авирулентности вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно свиньям по 0,1 см³. В исследовании использовали свиней породы ландрас массой 30-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на животных проводили путём внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³ (тройная доза по 2,0 см³). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 40,5°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.

По результатам исследований вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных

На 4 и 7 сутки после введения вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V (предлагаемое изобретение) у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3].

Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител против штамма «SAT-3/Уганда/V» на 4 сутки после иммунизации составили 5,30±0,27 log₂ SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) - 4,05±0,11 log₂ SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) - 3,40±0,22 log₂ SN₅₀ (таблица 7). Средние значения титра антител против штамма «SAT-3/V» на 7 сутки после иммунизации составили 7,62±0,16 log₂ SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) - 5,20±0,27 log₂ SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) - 4,15±0,14 log₂ SN₅₀. Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂SN₅₀) уже через 4 дня после вакцинации, что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Изучение защитной способности вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V (предлагаемое изобретение) на естественно восприимчивых видах животных

Свиньи, иммунизированные в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «SAT-3/Уганда/V», адаптированного к этим животным в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V (предлагаемое изобретение) в цельном виде, а также в разведениях 1/5 и 1/25, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины для каждого из заложенных в препарат штаммов антигена вируса ящура содержится 55,9 ПД₅₀ и 0,036 ИмД₅₀ для свиней.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «SAT-3/Уганда/V», в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить раннюю эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотических штаммов вируса ящура генотипа SAT-3/V, циркулирующих в странах Африки. Кроме того, вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V изготовлена с применением масляного адъюванта ADYUVAC 70.

Источники информации

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 18.10.2024).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 11.10.2024).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2023 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, Т. Doel [et.al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 14.10.2024).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - Р. 746-754.

13. Рахманов А.М. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

15. Мельник Р.Н., Хаустова Н.В., Мельник Н.В., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С.29-31.

16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. - P. 2657-2667.

17. Патент РФ на изобретение № 2 824 660 «Вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная эмульсионная» / приоритет изобретения 03 апреля 2024 г., заявка № 2024108919.

18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

19. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

20. aitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

21. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

22. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

23. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

24. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.

Таблица 1

Результаты адаптации штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 в разных условиях

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр	Условия культивирования	Время репродукции, ч	ЦПД, %	Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см ³	Титр инфекционной активности, lg ТЦД ₅₀ /см ³
Состав поддерживающей среды	Среда Игла МЕМ+ 2% S_КРС	19-20	95-100	0,45±0,02	6,41±0,10
	Среда 199 + 2% S_КРС	19-20	95-100	0,49±0,02	6,44±0,10
	Раствор Хэнкса с 6 % ГБК + 2% S_КРС	16-17	95-100	0,75±0,02	7,04±0,10
Температура, °С	35,0±0,2	28-29	85-90	0,12±0,02	4,56±0,10
	36,0±0,2	21-22	85-90	0,44±0,03	6,40±0,10
	37,0±0,2	16-17	95-100	0,75±0,02	7,04±0,10
	38,0±0,2	18-19	95-100	0,45±0,02	6,47±0,10
Доза заражения	0,1-0,01	17-18	90-95	0,60±0,02	6,75±0,10
	0,01-0,001	16-17	95-100	0,75±0,02	7,04±0,10
	0,001-0,0001	23-24	85-90	0,25±0,02	5,35±0,10

Примечание: S_КРС - сыворотка крови крупного рогатого скота,

ГБК - гидролизат белков крови,

МЕМ - название среды Игла,

ЦПД - цитопатическое действие.

Таблица 2

Результаты репродукции штамма «SAT-3/Уганда/V» вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клеток

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр	Условия культивирования	Время репродукции, ч	ЦПД, %	Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см ³	Титр инфекционной активности, lg ТЦД ₅₀ /см ³
Концентрация клеток перед заражением, млн кл./см³	3,5	14-15	95-100	0,91±0,02	7,80±0,10
	4,0	14-15	95-100	1,12±0,02	8,11±0,10
	4,5	14	95-100	1,39±0,02	8,44±0,10
	5,0	16	95-100	1,44±0,02	8,52±0,10
Температура, °С	35,0±0,2	26-27	90-95	0,60±0,02	7,51±0,10
	36,0±0,2	18-19	90-95	0,95±0,02	7,89±0,10
	37,0±0,2	14	95-100	1,39±0,02	8,44±0,10
	38,0±0,2	18-19	95-100	0,90±0,02	7,78±0,10
Доза заражения	0,1-0,01	15	95-100	1,15±0,02	8,09±0,10
	0,01-0,001	14	95-100	1,39±0,02	8,44±0,10
	0,001-0,0001	18-19	90-95	1,02±0,02	8,00±0,10

Примечание: ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,

ТЦД - тканевая цитопатическая доза,

ЦПД - цитопатическое действие.

Таблица 3

Исследование кинетики инактивации суспензий вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V»

(n=3, M±m, p<0,05)

Время отбора проб с момента инактивации, ч	Титр инфекционной активности вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V», lg ТЦД ₅₀ /см ³
0	8,44±0,10
1	6,25±0,10
2	4,47±0,10
4	1,98±0,10
6	0
12	-12,00

Таблица 4

Содержание компонентов вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» в суспензиях до и после очистки

(n=3, M±m, p<0,005)

Название штамма	До очистки		Концен-трация ПГМГ, %	После очистки
	концентрация балластного белка, мг/см ³	концентрация 146S компонента, мкг/см ³		концентрация балластного белка, мг/см ³	концентрация 146S компонента, мкг/см ³
SAT-3/Уганда/V	9,11	1,35	0,030	8,20	1,33
			0,040	6,83	1,31
			0,050	5,10	1,19

Примечание: концентрацию балластного белка определяли по формуле Калькара:

С=1,45 × А₂₈₀-0,74 × А₂₆₀,

где А₂₈₀ - значение оптической плотности при длине волны 280 нм,

А₂₆₀ - значение оптической плотности при длине волны 260 нм,

ПГМГ - полигексаметиленгуанидин (флокулянт).

Таблица 5

Содержание компонентов антигена вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V» в суспензиях до и после концентрирования

(n=3, M±m, p<0,01)

Название штамма	Концентрация 146S компонента до концентрирования, мкг/см ³	Методы концентрирования	Концентрация 146S компонента после концентрирования, мкг/см ³
SAT-3/Уганда/V	1,31	ПЭГ-6000, 4 ч	37,99
		ПЭГ-6000, 12 ч	40,61
		Тангенциальная фильтрация, 4 ч	45,85

Примечание: ПЭГ - полиэтиленгликоль,

ОВБ - общий вирусный белок.

Таблица 6

Результаты исследования сывороток крови свиней на антитела к неструктурным белкам вируса ящура до и после вакцинации препаратом (предлагаемое изобретение), изготовленным с применением антигена вируса ящура штамма «SAT-3/Уганда/V»

№ жив-о п/п	Значение оптической плотности пробы				Процент ингибиции (PI), %
	тип образца	референс-значения	до вакцинации	на 14 сутки после вакцинации	тип образца	референс-значения	до вакцинации	на 14 сутки после вакцинации
	СПК	0,449	-//-		СПК	54,692	-//-
	ПК	0,071			ПК	92,836
	ОК	0,991			ОК	0,000
1	-//-		0,961	0,911	-//-		3,027	8,073
2	-//-		0,958	0,910	-//-		3,330	8,174

Примечание: СПК - слабоположительный контроль,

ПК - положительный контроль,

ОК - отрицательный контроль, сыворотка отрицательная при PI, меньшим 50%.

Таблица 7

Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины культуральной инактивированной эмульсионной для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V на свиньях

(n=5, p<0,01, M±m)

Наименование штамма для контрольного заражения	Разведение вводимой вакцины	№ животных п/п	Титр антител в РМН, log ₂ SN ₅₀		Результаты контрольного заражения, проведенного на 7 сутки	ИмД ₅₀ /ПД ₅₀
Наименование штамма для контрольного заражения	Разведение вводимой вакцины	№ животных п/п	4 сутки после вакцинации	7 сутки после вакцинации		ИмД ₅₀ /ПД ₅₀
SAT-3/Уганда/V	без разведения	1	5,00	7,80	-	0,036/ 55,9
		2	5,50	7,50	-
		3	5,00	7,50	-
		4	5,50	7,50	-
		5	5,50	7,80	-
		M±m	5,30±0,27	7,62±0,16	0/5
	1/5	6	4,00	5,00	-
		7	4,25	5,00	-
		8	4,00	5,00	-
		9	4,00	5,50	-
		10	4,00	5,50	-
		M±m	4,05±0,11	5,20±0,27	0/5
	1/25	11	3,50	4,25	-
		12	3,25	4,25	-
		13	3,75	4,25	-
		14	3,25	4,00	-
		15	3,25	4,00	-
		M±m	3,40±0,22	4,15±0,14	0/5
	контроль без вакцинации 1		-	-	+
	контроль без вакцинации 2		-	-	+

Примечание: «-» отсутствие генерализации процесса ящура,

РМН - реакция микронейтрализации,

ИмД₅₀ - иммуногенная доза,

ПД₅₀ - протективная доза.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"

fileName="FMD-SAT3-Vaccine.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2024-10-23">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина культуральная

инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа

SAT-3/V</InventionTitle>

<INSDSeq_length>633</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..633</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actaccaccactggcgagtccgcggacccagtaaccaccacggttgaga

actacggaggagagacccaaacggcccgacggcttcacactgatgtcgccttcgttctcgacaggttcgt

gaaactcacccagcccaagagcacccaaacccttgatctcatgcagatcccttcacacacactggtcggg

gcgcttctccggtctgcgacgtactacttctcagacctggaggttgcgctcgtccacacaggaccggtca

catgggtgcccaatggtgcgcccaagaccgccttgaacaaccacaccaacccgactgcctaccagaagca

gcccatcacccgcttggcactcccctacactgctccccaccgtgtgctgtcaacagtgtacaacgggaag

acaacgtacggagaagaatcctcgcggcgtggtgatcttgccgcccttgcacacagagtgaacaaccggc

tgcccacttccttcaactacggcgctgtgaaggccgacaccatcacggagctgttgatccgcatgaagcg

tgcggaaacatactgccccaggcctctgctggctcttgacaccacacaagaccgccgtaaacaggagatc

attgcacctgagaaacagactttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>211</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..211</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTTGESADPVTTTVENYGGETQTARRLHTDVAFVLDRFVKLTQPKSTQ

TLDLMQIPSHTLVGALLRSATYYFSDLEVALVHTGPVTWVPNGAPKTALNNHTNPTAYQKQPITRLALPY

TAPHRVLSTVYNGKTTYGEESSRRGDLAALAHRVNNRLPTSFNYGAVKADTITELLIRMKRAETYCPRPL

LALDTTQDRRKQEIIAPEKQTL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

1. Вакцина культуральная инактивированная эмульсионная для ранней защиты против ящура генотипа SAT-3/V, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержится авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №503 - деп / 23-53 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 25,0 мкг; в качестве адъюванта содержит отечественный масляный адъювант ADYUVAC 70 с содержанием 70% по массе и поддерживающую среду - до 2,0 см³.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит 146S иммуногенный компонент вируса ящура генотипа SAT-3/V.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-3/Уганда/V» генотипа SAT-3/V и масляный адъювант ADYUVAC 70 в эффективном соотношении: 30% и 70% по массе соответственно.