RU2847814C1

RU2847814C1 - Вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная эмульсионная

Info

Publication number: RU2847814C1
Application number: RU2024134950A
Authority: RU
Inventors: Максим Игоревич Доронин; Дмитрий Валерьевич Михалишин; Виктор Викторович Никифоров; Маргарита Эдуардовна Воеводина; Марина Анатольевна Прокопенко; Наталья Васильевна Шабина; Николай Геннадьевич Зиняков
Filing date: 2024-11-22
Publication date: 2025-10-15

Abstract

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральной моновалентной инактивированной эмульсионной. Вакцина, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Подтверждена возможность осуществления представленного. Данная вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I. Вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная эмульсионная изготовлена с применением масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG. По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 55,90 ПД₅₀ и 0,04 ИмД₅₀ для свиней (высокая эффективность вакцинного препарата). 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 7 табл., 14 пр.

Description

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная эмульсионная.

Ящур наносит огромный экономический ущерб секторам животноводства в эндемичных странах в результате торговых ограничений на товары для животноводства, снижения продуктивности животных, смертности большого [1].

Вирусный геном представляет собой позитивную одноцепочечную РНК длиной около 8400 н.о., заключенную в икосаэдрический капсид, состоящий из 60 копий структурных белков, а именно VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄.

Существует семь следующих серотипов вируса ящура: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом представители серотипа А являются наиболее распространенными, в том числе и на территории Африканского континента, в частности, в Уганде.

Большинство животных, инфицированных ящуром, находятся в Азии, Африке, на Ближнем Востоке и в Венесуэле в Южной Америке. Распространение ящура характеризуется наличием семи географических эндемичных групп, которые поддерживают отдельные вирусные линии: группа 1 - Восточная Азия, группа 2 - Южная Азия, группа 3 - Западная Евразия, группа 4 - Восточная Африка, группа 5 - Западная Африка, группа 6 - Южная Африка и группа 7 - Южная Африка/Америка.

Серологические типы вируса ящура разделены на более чем 60 генотипов, различия между которыми определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного 1D-гена, кодирующего аминокислотную последовательность поверхностного и наиболее вариабельного вирусного белка VP₁ [2]. Высоковариабельный структурный белок VP₁ содержит два иммуногенных участка: петлю G-H высококонсервативного мотива трипептида RGD и С-конец, которые участвуют в прикреплении и проникновении вируса, иммунной защите и специфичности к серотипу.

Моделируя эволюцию нуклеотидных последовательностей, полученных из кодирующей области VP₁, можно определить серотипы вируса ящура, топотипы (расхождение ≈ 15%), генетические линии (расхождение ≈ 10%) и сублинии (расхождение ≈ 5%) на основе пороговых значений генетического сходства.

Восстановление животного после переболевания ящуром, каким-либо одним генотипом не обеспечивает иммунную защиту против другого [3-5].

Поскольку вакцинация используется в качестве основного инструмента контроля в эндемичных районах, анализируя каждый пул и генотипы в нем, возможно подобрать наиболее специфичные вакцины, соответствующие топотипам, присутствующим в этом пуле, вместо того, чтобы продолжать полагаться на более широко доступные в настоящее время генетические вакцины.

Для изолятов вируса ящура серотипа А характерно наибольшее генетическое разнообразие. Серотип А включает в себя 3 охарактеризованных генотипа ASIA, AFRICA, EURO-SA и одну пока еще малоизученную группу изолятов [2, 5], что приводит к проблемам при специфической профилактики ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин. В результате возникает необходимость создания новых средств специфической профилактики в отношении ящура серотипа А [1, 6, 7].

В целях обеспечения биологической безопасности на территории Российской Федерации применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую вакцинацию животных в буферной зоне, проведение мониторинга иммунного статуса КРС и свиней, для которых применяют культуральные инактивированные вакцины против ящура.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам, что подтверждено исследованиями многих ученых [6, 7, 8, 9, 10, 11].

Вакцины инактивированные, изготовленные преимущественного из 146S компонента, на сегодняшний день в отношении ящура по-прежнему признаются наиболее эффективными [8, 9, 12, 13-16].

Генетическое и антигенное разнообразие вируса ящура серотипа А приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа А и, в частности, генотипа А/AFRICA/G-I, представители которого распространялись на территории Африки [3].

На территории Африки вспышки ящура серотипа А имеют спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи России со странами этого региона, в частности, Танзанией, Угандой, Кенией, Демократической Республикой Конго и др. Исходя из этого, высоки риски заноса изолятов данного генотипа на территорию Российской Федерации, что угрожает биологической безопасности нашей страны по ящуру.

На протяжении многих лет периодически фиксировали вспышки ящура серотипа А в странах Африки, в частности, в Демократической Республике Конго в 2011 г., в Кении в 2021 г., в Бурунди в августе 2022 г, Республике Уганда в 2023 г. Распространение ящура генотипа A/AFRICA/G-I является опасным и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура данного генотипа.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа А, которые применяются для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «А₂₂/Ирак/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм «А/Забайкальский/2013» (генотип A/ASIA/Sea-97),

- штамм «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII),

- штамм «А №2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV),

- штамм «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I).

Изолят вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Республики Уганда в 2023 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований в 2023 г.

Штамм «А / Кирухара / 2023» был получен в результате научно-исследовательской работы путем адаптации изолята к репродукции в первично-трипсинизированной монослойной клеточной линии почки свиньи СП, в перевиваемых культурах клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, IB-RS-2, ПСГК-30, в организме крупного рогатого скота и свиней в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм вируса ящура принадлежит к генотипу A/AFRICA/G-I, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа A, в том числе, от штамма «А/Танзания/2013».

В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH и получен штамм «А / Кирухара / 2023» (генотип A/AFRICA/G-I). Филогенетическая принадлежность штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура представлена на фиг. 1.

С увеличением торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Африки, в которых периодически регистрируют вспышки ящура генотипа A/AFRICA/G-I, возникает опасность случаев возникновения ящура данного генотипа в Российской Федерации и особое значение приобретает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральную моновалентную инактивированную эмульсионную для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики заболевания.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-I из штамма «А/Танзания/2013» культуральная инактивированная сорбированная [17], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «А/Танзания/2013», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде адъюванта гидроксида алюминия и сапонина: концентрация 146S иммуногенного компонента - не менее 4,0 мкг в 1,0 см³ готового препарата, содержание гидроксида алюминия в количестве 4,5% в пересчете на сухое вещество, сапонина - 1,5 мг в 1,0 см³ готового препарата (прототип).

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его недостаточной иммуногенной активности относительно штаммов/изолятов вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I, которые циркулируют в настоящее время в странах Восточной Африки, в частности, в Уганде.

Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральной моновалентной инактивированной эмульсионной. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S иммуногенного компонента штамма «А / Кирухара / 2023» и наличие масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG в составе препарата.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала противоящурных инактивированных культуральных моновалентных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I, распространенных на территории Восточной Африки.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральной моновалентной инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в дозе препарата 2,0 см³ содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «А / Кирухара / 2023» (генотип A/AFRICA/G-I) вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 15,0 мкг; 2) масляный адъювант Montanide ISA-61 VG, обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных с содержанием 60% по массе, 3) поддерживающая среда - до 2,0 см³.

Штамм «А / Кирухара / 2023» вируса ящура депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №524 - деп / 24-04 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Хэнкса без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5,0% от общего объема при рН среды 7,50-7,70. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,025% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,035% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «А / Кирухара / 2023» (генотип А/AFRICA/G-I) вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте определяют с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18-20].

Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 2,0 см³ не менее 15,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Заявленную концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации.

Вакцину против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральную моновалентную инактивированную эмульсионную получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG в соотношении 40% и 60% по массе, соответственно.

Полученная вакцина представляет собой стабильную обратную эмульсию белого или бледно-розового цвета типа «вода в масле», содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023».

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 15,0 мкг в 2,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-61 VG.

4. Вакцина содержит масляный адъювант Montanide ISA-61 VG в количестве 60% (по массе) в 2,0 см³ готового препарата.

5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура, полученного в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант Montanide ISA-61 VG, добавка в дозе готового препарата 2,0 см³ в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура		не менее 15,0 мкг
Масляный адъювант Montanide ISA-61 VG		60% (по массе)
Поддерживающая среда		до 2,0 см³

Предлагаемая вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная эмульсионная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа А/AFRICA/G-I.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной культуральной инактивированной эмульсионной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки в мире.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP₁.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VP₁ штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура генотипа А/AFRICA/G-I;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VP₁ штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура генотипа А/AFRICA/G-I.

Штамм «А / Кирухара / 2023» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «А/Кирухара/2023» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип А, генотип А/AFRICA/G-I. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 29 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «А/Кирухара/2023» вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются специфические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «А/Кирухара/2023» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «А/Кирухара/2023» вируса ящура принадлежит к генотипу А/AFRICA/G-I (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «А/Кирухара/2023» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса с помощью перекрестного исследования данного штамма возбудителя ящура со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «А₂₂/Ирак/64» (генотип A/ASIA/Iraq-64),

- штамм «А/Турция/06» (генотип A/ASIA/Iran-05),

- штамм «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» (генотип A/ASIA/G-VII),

- штамм «А№ 2205/G-IV/2018» (генотип A/AFRICA/G-IV),

- штамм «А/Танзания/2013» (генотип A/AFRICA/G-I).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа А, против 10² ТЦД₅₀гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма;

максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «А/Кирухара/2023» составили r₁от 0,04 до 0,25, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа А.

Гено- и хемотаксономические характеристики

Штамм «А/Кирухара/2023» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,09×10⁶Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,90×10⁶Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,0% РНК и 69,0% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,49×10^-18 г. Плавучая плотность 1,49 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «А/Кирухара/2023» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,45-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,0°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «А/Кирухара/2023» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «А/Кирухара/2023» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом А/AFRICA/G-I, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки безопасной и эффективной вакцины.

Получена безопасная и эффективная вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная эмульсионная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Проводили анализ первичной структуры гена 1D (белок VP₁) штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа А. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами/штаммами вируса ящура серотипа А.

Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «А / Кирухара / 2023» с другими штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VP₁ штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.

Осуществлен филогенетический анализ для штамма «А / Кирухара / 2023». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA и алгоритма Neighbor-Joining [21]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки, показан рядом с ветвями [22, 23]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [24] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [25].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) штамма «А / Кирухара / 2023» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа А определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1). Таким образом, исследуемый штамм «А / Кирухара / 2023» относится к генотипу А/AFRICA/G-I, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 15%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт свиньи (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД₅₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 23 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 5,56±0,10 до 7,47±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,47±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,26±0,02 до 1,35±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (1,35±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 99,03 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I в промышленных масштабах.

В процессе промышленного культивирования штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DMEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса с 5% гидролизата белков крови. Посевная концентрация клеток составляла 0,1 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 90%. Результаты репродукции штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что при репродукции штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса, позволяющая за 19 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,35±0,02 мкг/см³и титром инфекционной активности 7,47±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и Игла DMEM показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Хэнкса при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 90-100% в течение 19-24 ч (табл. 1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 19 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,35±0,02 мкг/см³и титром инфекционной активности вируса 7,47±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «А / Кирухара / 2023» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Хэнкса. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 19-28 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 1,35±0,02 мкг/см³с титром инфекционной активности вируса 7,47±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «А / Кирухура / 2023» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «А / Кирухура / 2023» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Хэнкса; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 млн кл./см³. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,2°С, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%. Результаты суспензионного культивирования штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.

При культивировании вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 3,0 млн кл./см³составило 1,08±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³- 1,74±0,02 мкг/см³, с концентрацией 4,0 млн кл./см³ - 2,24±0,02 мкг/см³, и с концентрацией 4,5 млн кл./см³- 2,27±0,02 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 4,0 млн кл./см³ (при концентрации 4,5 млн кл./см³концентрация незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 4,0 млн кл./см³). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,94±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 85% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток). По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой в течение 10 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (2,24±0,02 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 8,94±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (2,24±0,02 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,94±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «А / Кирухара / 2023» в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением - 4,0 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «А / Кирухура / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I.

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,2°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С с периодическим перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 3, из данных которой видно, что инактивация вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023», репродуцированного в культиваторах, до 0,0 lg ТЦД₅₀/мл произошла через 6 часов после внесения 1,2-АЭЭИ в дозе 0,025%, а до титра -10,0lg ТЦД₅₀/мл - спустя 12 ч инкубации (табл. 3).

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 2,17±0,02 мкг/см³.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I.

Суспензию вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,030, 0,035 и 0,040%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 4, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» с помощью ПГМГ в концентрации 0,030% отмечали снижение концентрации балластного белка на 8% и 146S компонента на 1,5%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,035% наблюдали снижение количества балластного белка на 21% и 146S компонента на 5,1%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,040% содержание балластного белка на 31% и иммуногенных компонентов - на 21%.

Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «А / Кирухара / 2023», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,035%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура генотипа А/AFRICA/G-I.

Культуральную инактивированною суспензию штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура, полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 12 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации в течение 3,5 ч при рабочем давлении на фильтр 2,2-2,3 атм.

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 10,4 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 10,8 раз. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в суспензии в 12 раз. Таким образом, технология тангенциальной фильтрации позволила получить антиген штамма «А / Кирухара / 2023» с высокой концентрацией структурных вирусных белков.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.

Для изготовления противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины из антигена штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в качестве адъюванта была выбран масляный адъювант Montanide ISA-61 VG в количестве 60% по массе.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I культуральной моновалентной инактивированной эмульсионной.

Из полученного концентрата антигена штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура изготовили вакцину против ящура генотипа А/AFRICA/G-I культуральную моновалентную инактивированную эмульсионную с применением масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³антигенасоставило 24,72±0,02 мкг/см³, а в дозе - 19,78 мкг.

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура генотипа А/AFRICA/G-I культуральной моновалентной инактивированной эмульсионной.

Из полученной вакцины против ящура из штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-ти кратным шагом. 15 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу животных (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№ 11-15) - вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации и через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней < 50%).

Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура генотипа А/AFRICA/G-I культуральной моновалентной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение).

Для определения авирулентности вакцины для свиней отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали свиней массой 30-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на животных проводили путём внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³ (тройная доза по 2,0 см³). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 39,9°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.

По результатам исследований вакцина против ящура генотипа А/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура генотипа А/AFRICA/G-I культуральной моновалентной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.

На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I культуральной моновалентной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 9,00±0,31 log₂SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) - 5,00±0,50 log₂SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) - 3,60±0,22 log₂SN₅₀ (табл. 7). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Изучение защитной способности вакцины против ящура генотипа А/AFRICA/G-I культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) на естественно восприимчивых видах животных методом контрольного заражения.

Свиней, иммунизированных в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура, адаптированного к этим животным в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) в цельном виде, а также в разведениях 1/5 и 1/25, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 55,90 ПД₅₀ и 0,04 ИмД₅₀ для свиней.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «А / Кирухура / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура генотипа А/AFRICA/G-I, в частности, в настоящее время на территории Восточной Африки.

Источники информации

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 20.09.2024).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 17.09.2024).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов А. Н., Дудников А. И., Малярец П. В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А. П., Узюмов В. Л., Груздев К. Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Cao Y, Lu Z, Liu Z. Foot-and-mouth disease vaccines: progress and problems. Expert Rev Vaccines. 2016 Jun;15(6):783-9. doi: 10.1586/14760584.2016.1140042. Epub 2016 Jan 22. PMID: 26760264.

9. Muleme M, Barigye R, Khaitsa ML, Berry E, Wamono AW, Ayebazibwe C. Effectiveness of vaccines and vaccination programs for the control of foot-and-mouth disease in Uganda, 2001-2010. Trop Anim Health Prod. 2013 Jan;45(1):35-43. doi: 10.1007/s11250-012-0254-6. Epub 2012 Sep 7. PMID: 22956440.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 11.08.2024).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - Р. 746-754.

13. Рахманов А.М. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

15. Мельник Р.Н., Хаустова Н.В., Мельник Н.В., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С.29-31.

16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. - P. 2657-2667.

17. Патент РФ № 2815536, 27.03.2023 Вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-I из штамма «А/Танзания/2013» культуральная инактивированная сорбированная // Заявка № 2023107358 / Доронин М.И., Михалишин Д.В., Борисов А.В., Михалишин В.В., Воеводина М.Э., Никифоров В.В.

18. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

19. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

20. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

21. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

22. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

23. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

24. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

25. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.

Таблица 1

Результаты адаптации штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 в разных условиях

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр	Условия культивирования	Время репродукции, ч	ЦПД, %	Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³	Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³
Состав поддерживающей среды	Среда Игла DMEM+ 2% S_KPC	23	95-100	0,84±0,02	7,02±0,10
	Среда RPMI-1640 + 2% S_KPC	23	95-100	0,86±0,02	7,01±0,10
	Раствор Хэнкса с 5 % ГБК + 2% S_KPC	19	95-100	1,35±0,02	7,47±0,10
Температура, °С	35,0±0,2	24	90-95	0,42±0,02	5,88±0,10
	36,0±0,2	22	90-95	0,75±0,03	6,75±0,10
	37,0±0,2	19	95-100	1,35±0,02	7,47±0,10
	38,0±0,2	20	90-95	1,02±0,02	7,19±0,10
Доза заражения	0,1-0,01	24	90-95	0,45±0,02	5,89±0,10
	0,01-0,001	19	95-100	1,35±0,02	7,47±0,10
	0,001-0,0001	28	90-95	0,22±0,02	5,11±0,10

Примечание: S_KPC- сыворотка крови крупного рогатого скота,

ГБК - гидролизат белков крови,

DMEM - название среды Игла,

RPMI-1640 - название культуральной среды,

ЦПД - цитопатическое действие.

Таблица 2

Результаты репродукции штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клеток

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр	Условия культивирования	Время репродукции, ч	ЦПД, %	Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³	Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³
Концентрация клеток перед заражением, млн кл./см³	3,0	9	95-100	1,08±0,02	7,31±0,10
	3,5	10	95-100	1,74±0,02	7,56±0,10
	4,0	10	95-100	2,24±0,02	8,94±0,10
	4,5	11	95-100	2,27±0,02	9,00±0,10
Температура, °С	35,0±0,2	18	85-90	0,60±0,02	6,98±0,10
	36,0±0,2	16	90-95	0,92±0,02	7,14±0,10
	37,0±0,2	10	95-100	2,24±0,02	8,94±0,10
	38,0±0,2	15	95-100	1,41±0,02	7,33±0,10
Доза заражения	0,1-0,01	15	95-100	1,47±0,02	7,35±0,10
	0,01-0,001	10	95-100	2,24±0,02	8,94±0,10
	0,001-0,0001	13	90-95	0,60±0,02	6,98±0,10

Примечание: ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,

ТЦД - тканевая цитопатическая доза,

ЦПД - цитопатическое действие.

Таблица 3

Исследование кинетики инактивации суспензии вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I

(n=3, M±m, p<0,05)

Время отбора проб с момента инактивации, ч	Титр инфекционной активности вируса ящура, lg ТЦД₅₀/см³
0	8,94±0,10
1	7,43±0,10
2	5,82±0,10
3	4,35±0,10
4	2,73±0,10
5	1,43±0,10
6	0
12	-10,00

Таблица 4

Содержание компонентов штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа
А/AFRICA/G-I вируса ящура в суспензиях до и после очистки

(n=3, M±m, p<0,005)

До очистки		Условия очистки	После очистки
Концентрация балластного белка, мг/см³	Концентрация 146S компонента, мкг/см³	Условия очистки	Концентрация балластного белка, мг/см³	Концентрация 146S компонент, мкг/см³
9,85±0,02	2,17±0,02	ПГМГ, 0,030%	9,06±0,02	2,14±0,02
		ПГМГ, 0,035%	7,78±0,02	2,06±0,02
		ПГМГ, 0,040%	6,80±0,02	1,71±0,02

Примечание: концентрацию балластного белка определяли по формуле Калькара:

С=1,45 × А₂₈₀-0,74 × А₂₆₀,

где А₂₈₀ - значение оптической плотности при длине волны 280 нм,

А₂₆₀ - значение оптической плотности при длине волны 260 нм,

ПГМГ - полигексаметиленгуанидин (флокулянт).

Таблица 5

Содержание компонентов антигена штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I вируса ящура в суспензиях до и после концентрирования

(n=3, M±m, p<0,01)

Концентрация 146S компонента до концентрирования, мкг/см³	Методы концентрирования (в 12 раз)	Концентрация 146S компонента после концентрирования, мкг/см³
2,06±0,02	ПЭГ-6000, 4 ч	21,42±0,02
	ПЭГ-6000, 12 ч	22,25±0,02
	Тангенциальная фильтрация, 3,5 ч	24,72±0,02

Примечание: ПЭГ - полиэтиленгликоль,

ОВБ - общий вирусный белок.

Таблица 6

Результаты исследования сывороток крови свиней на антитела к неструктурным белкам вируса ящура до и после вакцинации препаратом (предлагаемое изобретение), изготовленным с применением антигена вируса ящура штамма «А / Кирухара / 2023» генотипа А/AFRICA/G-I

№ животного п/п	Значение оптической плотности пробы				Процент ингибиции (PI), %
	тип образца	референс-значения	до вакцинации	на 14 сутки после вакцинации	тип образца	референс-значения	до вакцинации	на 14 сутки после вакцинации
	СПК	0,470	-//-		СПК	53,42	-//-
	ПК	0,050			ПК	95,05
	ОК	1,009			ОК	0,00
1	-//-		0,940	0,890	-//-		6,84	11,79
2	-//-		0,949	0,881	-//-		5,85	12,79

Примечание: СПК - слабоположительный контроль,

ПК - положительный контроль,

ОК - отрицательный контроль, сыворотка отрицательная при PI, меньшим 50%.

Таблица 7

Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины против ящура генотипа А/AFRICA/G-I культуральной моновалентной инактивированной эмульсионной на свиньях

(n=5, p<0,01, M±m)

Наименование штамма для контрольного заражения	Разведение вводимой вакцины	№ животных п/п	Титр антител в РМН, log₂ SN₅₀	Результаты контрольного заражения	ИмД₅₀/ПД₅₀
А / Кирухара / 2023	без разведения	1	8,75	─	0,04/ 55,90
		2	9,00	─
		3	9,00	─
		4	9,50	─
		5	8,75	─
		M±m	9,00±0,31	0/5
	1/5	6	4,50	─
		7	5,50	─
		8	5,00	─
		9	4,50	─
		10	5,50	─
		M±m	5,00±0,50	0/5
	1/25	11	3,50	─
		12	3,50	─
		13	4,00	─
		14	3,50	─
		15	3,50	─
		M±m	3,60±0,22	0/5
	контроль 1		─	+
	контроль 2		─	+

Примечание: «-» отсутствие генерализации процесса ящура,

РМН - реакция микронейтрализации,

ИмД₅₀ - иммуногенная доза,

ПД₅₀ - протективная доза.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMD Vaccine A.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2024-09-28">

</ApplicationIdentification>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны

здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal

Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа

A/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная

эмульсионная</InventionTitle>

<INSDSeq_length>639</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..639</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accaccgcgacgggagagtcagcggaccctgtcaccaccactgttgaga

actacggcggtgaaacacaggtccaaagacggcaccacacaagtgtcgagttcatcatggacagatttgt

gaaattaggagtttccagccccacacatgtcattgacctcatgcaaactcaccaacacggcctggtcggc

gcattgttgcgcgcggccacttactacttctctgacctggaggtagtggtacggcacgagggcaacctga

cctgggtgcccaatggcgcccctgaggccgcccttgcaaacacgagcaaccccacagcatatcacaagga

acccttcacgaggcttgcactcccttacaccgcgccgcaccgcgtgctggcaacggtgtataacgggacg

agcaggtattccgcaaccacctcagggaggcgtggagatctagggcccctggcggcaagggtcgccgcac

aacttcctgcatcttttaactacggtgcacttagggccacgaccatccacgagcttctcgtgcgcatgaa

gcgggccgagctttactgtcccagaccactactggcaacagaagtgagtgtgggggacaggcacaagcag

aagatcatagcacctgcctttcccgggccc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>213</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..213</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTATGESADPVTTTVENYGGETQVQRRHHTSVEFIMDRFVKLGVSSPTH

VIDLMQTHQHGLVGALLRAATYYFSDLEVVVRHEGNLTWVPNGAPEAALANTSNPTAYHKEPFTRLALPY

TAPHRVLATVYNGTSRYSATTSGRRGDLGPLAARVAAQLPASFNYGALRATTIHELLVRMKRAELYCPRP

LLATEVSVGDRHKQKIIAPAFPGP</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

1. Вакцина против ящура генотипа A/AFRICA/G-I культуральная моновалентная инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из возбудителя инфекции штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №524 - деп / 24-04 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 15,0 мкг в дозе вакцины 2,0 см³; в качестве адъюванта - масляный адъювант Montanide ISA-61 VG с содержанием 60% по массе, поддерживающей среды - до 2,0 см³.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из возбудителя инфекции штамма «А / Кирухара / 2023» вируса ящура генотипа A/AFRICA/G-I и масляный адъювант Montanide ISA-61 VG в эффективном соотношении 40% и 60% по массе соответственно.