RU2848131C1 - Способ исследования течения раневого процесса при моделировании аллопластики у лабораторных животных - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной абдоминальной хирургии, и может быть использовано при моделировании лечения послеоперационных вентральных грыж. После выполнения аллопластики на 7 и 14 сутки эксперимента проводят забор крови, определяют количество палочкоядерных нейтрофилов, СОЭ и индекс регенерации. На 14 сутки эксперимента выполняют забор гистологического материала, содержащего ткани брюшной стенки с трансплантатом, проводят биомеханическое и морфологическое исследования. Определение биомеханических свойств материала производят на разрывной машине «INSTRON-5944», определяют напряжение (МПа), деформацию с максимальным значением нагрузки (Н) и модуль Юнга (Па) в момент смены фаз биомеханического поведения и в момент максимальной деформации, предшествовавшей разрыву лоскута. Определяют усредненные значения напряжения, нагрузки и модуля Юнга. Определение морфологических свойств материала производят путем окрашивания срезов методом ОКГ по Зербино и Лукасевич. Определяют наличие или отсутствие незрелого коллагена, лейкоцитарной инфильтрации, кистозных образований, атрофию мышечного волокна, определяют интеграцию сетчатого трансплантата с мышечными волокнами. Способ позволяет провести исследование течения раневого процесса за счет комплексного определения биомеханических и морфологических свойств биоматериала и воспалительной реакции. 7 ил., 1 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной абдоминальной хирургии, и может быть использовано в научных исследованиях, в моделировании лечения послеоперационных вентральных грыж.

Уровень техники

Послеоперационные вентральные грыжи развиваются у 4-15% больных, перенесших лапаротомию, и занимают второе место по частоте встречаемости после паховых грыж. Наиболее часто послеоперационные вентральные грыжи возникают после экстренных вмешательств, а в их структуре преобладают грыжи срединной локализации. Вопросы хирургического лечения вентральных грыж до сих пор остаются в ряду самых важных проблем абдоминальной хирургии (см. Belyansky I. et al. A novel approach using the enhanced view totally extraperitoneal (eTEP) technique for laparoscopic retromuscular hernia repair. Surg Endosc, 2018. Vol. 32. №3. рр. 1525-1532; см. Ермолов А.С. и др. Хирургическое лечение пациентов с большими и гигантскими послеоперационными вентральными грыжами. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова, 2019. №9. С. 38-43; см. Ермолов А.С. Выбор хирургической тактики в зависимости от величины вентральной грыжи и дефицита тканей брюшной стенки. Московский хирургический журнал, 2018. Т. 3. №61. С. 78).

На протяжении трех последних десятилетий приоритетным направлением является пластика с применением синтетических протезов (см. Blagovestnov D.A. et al. The role and place of prosthesis fitting methods of forward belly wall plasticity in primary median hernia surgery. Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologiy. 2011; Vol. 1. №18. pp. 153-155; Ramakrishna H.K., Lakshman K. Intra peritoneal polypropylene mesh and newer meshes in ventral hernia repair: what EBM says? Indian J Surg 2013. Vol. 75. №5. pp. 346-351). К настоящему времени она достигла того рубежа, когда назрела необходимость глубокого анализа накопленного опыта. Особую актуальность при этом приобрели вопросы, связанные с необходимостью индивидуального подхода к выбору способа протезирующей пластики с разработкой новых способов, с тщательным изучением непосредственных и отдаленных результатов и прогнозом поздних осложнений, связанных с миграцией сетки и рецидивом грыжи.

На современном этапе развития аллопластики сформирована четкая позиция о недостаточной надежности аутопластических методик при отсутствии дифференцированного подхода к их применению (см. Rodríguez M. et al. Polymer Hernia Repair Materials: Adapting to Patient Needs and Surgical Techniques. Journal Materials (Basel), 2021. Vol. 14. № 11. рр. 27-90; Sheen A.J. et al. Comparison of Mesh Fixation Techniques in Elective Laparoscopic Repair of Incisional Hernia-ReliaTack™ v ProTack™ (TACKoMesh) - A double-blind randomised controlled trial. BMC Surg, 2018. Vol. 18. №1. Р. 46).

Известен способ оценки основных способов аллопластики с целью оптимизации лечения больных с послеоперационными вентральными грыжами (см. https://stm-journal.ru/ru/numbers/2011/2/735/pdf), в котором сравнивают результаты разных способов аллопластики для разработки системы оптимизации хирургического лечения больных с послеоперационными вентральными грыжами. В способе рассматривают усовершенствованный вариант методики аллопластики sub lay и применяют метод герниоабдоминометрии с помощью КТ для определения адекватного вида пластики при гигантских и больших грыжах, что позволяет оптимизировать их лечение. Проведенный анализ осложнений и отдаленных результатов лечения у 132 пациентов с постоперационными вентральными грыжами показал, что наилучшие непосредственные и отдаленные результаты дает аллопластика по способу sub lay.

Известен способ прогнозирования и профилактики раневых осложнений в лечении послеоперационных вентральных грыж (см. https://dgmu.ru/wp-content/uploads/2023/04/Avtoreferat.-Data-razmeshheniya-25-aprelya-2023g..pdf), согласно которому на первом этапе эксперимента у подопытных животных создавали дефект брюшинно-мышечно-апоневротического слоя в зоне белой линии живота с целью получения модели вентральной грыжи. Второй этап операции проводили через 6 месяцев после формирования ПОВГ у 12 экспериментальных животных. Опыты были разделены на 2 серии: по 6 животных в каждой. В экспериментальной группе по разработанной методике проводилась протезирующая герниопластика с фиксацией имплантата, обработанного 2,5 % раствором арговита. В контрольной группе проводилось оперативное вмешательство, но без обработки сетчатого имплантата. Для проведения морфологических исследований в зоне оперативного вмешательства проводили взятие образцов ткани. Из периферической части апоневроза, мышц и имплантата брали фрагменты размером 2,5-1,5 см на 3, 7, 14-е сутки после операции для изучения динамики тканевой реакции в обозначенные временные точки на фоне обработки имплантата 2,5 % раствором арговита и без таковой.

Известно сравнение методов аллопластики передней брюшной стенки в эксперименте (см. http://www.nauteh-journal.ru/files/ce860e67-8501-4539-93ab-5482099c8ca2?ysclid=m7a9wcjhf2472913814). Ввиду внедрения разнообразных методов вентропластики передней брюшной стенки, а также отсутствия патогенетического обоснования показаний к каждому из них авторами статьи выполнена работа по изучению зависимости биомеханических и морфологических свойств протезирующей вентропластики от методики подшивания сеточного импланта. В качестве биологических моделей в эксперименте использовались 36 лабораторных крыс, породы «Стандарт», массой 400±50 г. В условиях острого эксперимента лабораторным животным под общей анестезией в асептичных условиях выполнялась аллопластика сетчатым имплантом (Эсфил, РФ) по технологии sublay. Были сформированы 2 группы наблюдения (по 18 прооперированных крыс в каждой группе) в зависимости от выполненного способа аллопластики. В 1-й группе производили аллопластику с фиксацией импланта сквозными П-образными швами, тогда как во 2-й группе имплант не фиксировался. На 21-е сутки производился забор материала для биомеханического и морфологического исследований. Было установлено, что разница биомеханических показателей после моделирования протезирующей аллопластики двумя разными методиками (с фиксацией и без фиксации) статистически не значима в области упруго пластичных деформаций. В ходе биомеханического и морфологического исследований было доказано, что прочность брюшной стенки при моделировании задней сепарационной аллопластики не зависит от способа фиксации импланта к брюшным мышцам. Таким образом, существует, описанная в специальной литературе, проблема оценки качества выполненной в эксперименте операции по моделированию вентропластики.

Однако указанные выше решения не позволяют выбрать методику выполнения операций аллопластики брюшной стенки, обеспечивающую снижение риска возникновения поздних раневых осложнений. При анализе отдаленных результатов применения различных способов вентропластики оценивают частоту возникновения рецидива грыжи, но в экспериментальной хирургии этот подход неприемлем.

Раскрытие сущности изобретения

Технической проблемой заявляемого решения является разработка способа оценки методики выполнения операции аллопластики брюшной стенки в эксперименте.

Технический результат заключается в экспериментальном моделировании методики лечения послеоперационной грыжи, позволяющей снизить риск возникновения поздних раневых осложнений.

Технический результат достигается тем, что в способе исследования течения раневого процесса при моделировании аллопластики у лабораторных животных, согласно решению, после выполнения аллопластики на 7 и 14 сутки эксперимента проводят забор крови, определяют количество палочкоядерных нейтрофилов, СОЭ и индекс регенерации, на 14 сутки эксперимента выполняют забор гистологического материала, содержащего ткани брюшной стенки с трансплантатом, проводят биомеханическое и морфологическое исследования; при этом определение биомеханических свойств материала производят на разрывной машине «INSTRON-5944», определяют напряжение (МПа), деформацию с максимальным значением нагрузки (Н) и модуль Юнга (Па) в момент смены фаз биомеханического поведения и в момент максимальной деформации, предшествовавшей разрыву лоскута, определяют усредненные значения напряжения, нагрузки и модуля Юнга; определение морфологических свойств материала производят путем окрашивания срезов методом ОКГ по Зербино и Лукасевич, определяют наличие или отсутствие незрелого коллагена, лейкоцитарной инфильтрации, кистозных образований, атрофию мышечного волокна, определяют интеграцию сетчатого трансплантата с мышечными волокнами.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 – представлена таблица, отражающая усредненные значения показателей общего анализа крови (ОАК) на 7-е сутки; на фиг. 2 – представлена таблица, отражающая усредненные значения показателей общего анализа крови (ОАК) на 14-е сутки; на фиг. 3 – представлена таблица, отражающая результаты биомеханических испытаний экспериментальных образцов; на фиг. 4 – показана морфологическая картина образцов тканей фрагментов брюшной стенки образцов 1-й группы; на фиг. 5 – показана морфологическая картина образцов тканей фрагментов брюшной стенки образцов 2-й группы; на фиг. 6 – показана морфологическая картина образцов тканей фрагментов брюшной стенки образцов 3-й группы; на фиг. 7 – показана морфологическая картина образцов тканей фрагментов брюшной стенки образцов 4-й группы.

Осуществление изобретения

Способ включает проведение аллопластики группам лабораторных животных, анализ регенеративных процессов на 7-е и на 14-е сутки эксперимента путем забора крови для лабораторного исследования на наличие воспалительного процесса, забора материала для биомеханического и морфологического исследований на 14-е сутки, оценку биомеханических и морфологических свойств и выбор методики аллопластики по результатам полученных в результате оценки референсных значений.

Способ осуществляется следующим образом.

Все манипуляции и содержание животных было регламентировано локальным этическим комитетом Медицинского университета «Реавиз» (протокол №9, 10.09.2024). Условия содержания в виварии лабораторных животных регламентированы РД-АПК 3.10.07.02-09 «Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений», приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 г. №199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами» (актуализированным от 01.01.2021).

В качестве биологических моделей в эксперименте использовались 40 лабораторных животных - крыс, породы «Стандарт», массой 450±50 г. В условиях экспериментальной операционной животным под общей анестезией в асептичных условиях выполнялась аллопластика с фиксированным и нефиксированным антемускулярным и ретромускулярным расположением сетчатого трансплантата (Эсфил, РФ). Формировали 4 группы наблюдения (по 10 экспериментальных крыс в каждой группе) в зависимости от способа аллопластики. В 1-ой группе производили аллопластику ретромускулярно с фиксацией сетчатого трансплантата, во 2-ой группе производили аллопластику ретромускулярно без фиксации сетчатого трансплантата; в 3-й группе производили аллопластику антемускулярно с фиксацией сетчатого трансплантата, в 4-й группе производили аллопластику антемускулярно без фиксации сетчатого трансплантата.

Для моделирования аллопластики с ретромускулярным расположением сетчатого трансплантата после рассечения передней стенки влагалища прямых мышц живота формировали ретромускулярное ложе и размещали трансплантат размером 2×2 см, имитируя заднюю сепарационную аллопластику. Восстановлением белой линии живота укрывали трансплантат прямыми мышцами и передними пластинками их влагалищ.

Для моделирования аллопластики с антемускулярным расположением сетчатого трансплантата выполнялось рассечение передней брюшной стенки до фасциального слоя, формировали антемускулярное ложе и размещали трансплантат размером 2×2 см, имитируя заднюю сепарационную аллопластику. Восстановлением белой линии живота укрывали трансплантат подкожно-жировым слоем.

Для оценки регенеративных процессов на 7-е и на 14-е сутки эксперимента проводился забор крови для лабораторного исследования. На 14-е сутки производился забор материала для биомеханического и морфологического исследований. Оценка биомеханических свойств путем производилась на разрывной машине «INSTRON-5944». С целью анализа данных испытаний брюшной стенки на растяжение, строили графики зависимости напряжений и деформаций от времени. Анализировали напряжение (параметр, необходимый для сравнения напряженности структурных элементов ткани, полученный путем произведения относительной разрывной нагрузки на плотность ткани; МПа), деформацию, с максимальным значением нагрузки (Н) и модуль Юнга (модуль упругости) (Па) в момент смены фаз биомеханического поведения и в момент максимальной деформации, предшествовавшей разрыву лоскута.

Морфологическому исследованию подвергались образцы тканей из фрагментов брюшной стенки, содержащих трансплантаты. Срезы окрашивались методом ОКГ («оранжевый-красный-голубой»), модифицированным Д.Д. Зербино и Л.Л. Лукасевич (1993), который включает использование оранжевого, который используется для выявления коллагеновых волокон, красного (для окраски эритроцитов и других клеточных структур, содержащих гемоглобин) и голубого цветов (предназначен для контрастного выделения ядер клеток и некоторых компонентов соединительной ткани), а также их переходных оттенков. Это позволяло выявлять изменения в стенках сосудов, обусловленные наличием фибрина, и оценивать общую морфологическую картину тканей. Исследование и фотографирование препаратов проводились под световым микроскопом «Leica Scope A1» с интегрированной цифровой камерой «Leica DC-500» при увеличении в 100 раз.

Полученные цифровые данные с разрывной машины «INSTRON-5944» были обработаны методами вариационного математического анализа. Количественные данные в исследуемых группах были представлены в виде среднего арифметического (М), и среднеквадратического отклонения (SD; σ). Коэффициент доверия определяли как предельную ошибку выборки ΔXср., вычисляемую по формуле ΔXср.=tμср., т.е. предельная ошибка выборки равна t-кратному числу средних ошибок выборки. Различия интерпретировались как достоверные при вероятности ошибки менее 5% (p<0,05), т.е. если p>0,05, нулевая гипотеза - не отвергалась.

Так, в ходе эксперимента, при лабораторном исследовании крови крыс на 7-е сутки (фиг. 1) было выявлено небольшое повышение палочкоядерных нейтрофилов, индекс регенерации составлял 0,12 и скорости оседания эритроцитов (СОЭ) в общем анализе крови, что свидетельствует о незначительном воспалительном процессе. На 14-е сутки, в свою очередь эксперимента (фиг. 2) в группах с ретромускулярным положением сетчатого трансплантата показатели палочкоядерных нейтрофилов и СОЭ были в пределах нормальных значений. Однако в группах с антемускулярным положением сетчатого транплантата как и на 7 сутки, так и на 14 сутки наблюдалось стойкое увеличение палочкоядерных нейтрофилов и СОЭ, при этом индекс регенерации составлял 0,2, что говорит о сохраняющемся воспалительном процессе, что позволяет предположить о возможных осложнениях.

Кроме того, важно отметить, что при антемускулярном способе установления сетчатого импланта сохранялось повышение, как и лимфоцитов, так и моноцитов, в то время как на 14 сутки при ретромускулярном способе установления сетчатого импланта наблюдались референсные значения по данным показателям.

В дальнейшем, в результате сравнения показателей биомеханических свойств брюшной стенки были получены следующие усредненные значения нагрузки (Н), напряжения (МПа), и модуля Юнга (Па), представленные на фиг. 3. Следует уточнить, что до 35 секунд исследуемый материал вел себя как упругопластический, а после - уже были выявлены неупругие процессы разрушения. В связи с чем, сравнению подлежали характеристики до 35 секунд.

Исследуя цифровые данные с разрывной машины «INSTRON-5944», представленных на фиг. 3, были выявлены наилучшие показатели в 1-ой и 2-ой группах (после выполненной аллопластики при ретромускулярном расположении сетчатого трансплантата). Однако следует уточнить, что между 1-ой и 2-ой группами не было выявлено значимых изменений, что дает основание полагать, что фиксация сетчатого трансплантата к тканям брюшной стенки не приводит к значимому улучшению прочностных характеристик оперированной брюшной стенки.

Морфологическими признаками благоприятного течения раневого процесса при моделировании аллопластики у лабораторных животных являются появление незрелого коллагена с заметными процессами капилляризации, а также интеграцией сетчатого транплантата с мышечными волокнами в срок до 14 суток после операции при минимальной лейкоцитарной инфильтрации (фиг. 4, 5); признаками неблагоприятного раневого процесса является отсутствие незрелого коллагена в срок до 14 суток после операции при выраженной лейкоцитарной инфильтрации, с визуализацией множественных кистозных образований, наличием клеток инородных тел, а также отмечающейся атрофией мышечного волокна (фиг. 6, 7). Для дополнительной интерпретации выявленных изменений и их использования для дальнейшей диагностики было установлено, что происходит закономерное изменение тинкториальных свойств молекул фибрина в стенках сосудов. Образование фибриновых свертков в микроциркуляторном русле происходит в результате того, что микроциркуляционное русло является морфологическим субстратом, в котором протекает кровь и лимфа, а также удаляются продукты метаболизма. Таким образом, микроциркуляция является широким понятием, которое включает в себя не только приток артериальной крови, богатой кислородом, БАВ (биологически активными веществами), а также питательными веществами, к тканевым структурам, но и где совершается обмен и отток венозной крови и лимфы, но и удаление продуктов катаболизма (В.В. Куприянов и соавт., 1975). Важно отметить, что различные повреждающие катаболиты, поступающие из тканей, в наибольшей концентрации оказываются именно в крови сосудов микроциркуляторного русла. В определенных условиях эти вещества могут оказывать патологические воздействия на состав крови. Однако по мере оттока венозной крови от органов концентрация этих вредных веществ уменьшается, поэтому такие эффекты обычно не наблюдаются в крупных сосудах. Анализируя полученные результаты при ретромускулярном положении сетчатого трансплантата, следует отметить, что на 14 сутки заметно наличие выраженных компенсаторных процессов, а также отсутствие диффузной лейкоцитарной инфильтрации всех слоев брюшины, чего нельзя сказать при результатах антемускулярного положения сечтатого трансплантата (фиг. 6, 7), при котором клеточная реакция была представлена очаговыми скоплениями нейтрофильных лейкоцитов с тенденцией к диффузному их распространению, а сосуды артериального и венозного звена были неравномерного кровенаполнения, при этом в зоне мягких тканей нарастал отек.

Таким образом, результаты исследований показали, что метод ОКГ (в модификации Д.Д. Зербино и Л.Л. Лукасевич (1993)) позволяет достоверно выявлять фибрин, позволяя эффективно дифференцировать его от окружающих тканей, установить возраст и морфологическую структуру. Структура внутри- и внесосудистого фибрина несколько различалась, тогда как цвет фибрина при окраске не зависел от подшивания сетчатого трансплантата, однако следует отметить, что на 14 сутки при ретромускулярно расположении сетчатого трансплантата отсутствует лейкоцитарная инфильтрация, что является весьма ценный критерий.

При морфологическом исследовании, также было подтверждено, что фиксация сетчатого трансплантата к тканям брюшной стенки не приводит к значимому улучшению прочностных характеристик оперированной брюшной стенки, однако расположение сетчатого трансплантата имеет значение.

Таким образом, на основании анализа экспериментальных данных, можно сделать вывод о том, что морфологические признаки незрелости коллагена, клеточная картина лейкоцитарной инфильтрации послеоперационного рубца являются неблагоприятными признаками, ухудшающими качество вентропластики. Напротив, морфологические признаки зрелого коллагена послеоперационного рубца, минимальная лейкоцитарная инфильтрация, наличие в рубце фибробластов свидетельствуют о благоприятном характере раневого процесса и достаточном качестве выполненной вентропластики. Данные о значении морфологического исследования послеоперационного рубца на 14-е сутки после операции подтверждаются последующим испытанием оперированной брюшной стенки на разрывной машине: при неблагоприятной морфологической картине наблюдается снижение прочностных характеристик брюшной стенки.

Claims (1)

1. Способ исследования течения раневого процесса при моделировании аллопластики у лабораторных животных, характеризующийся тем, что после выполнения аллопластики на 7 и 14 сутки эксперимента проводят забор крови, определяют количество палочкоядерных нейтрофилов, СОЭ и индекс регенерации, на 14 сутки эксперимента выполняют забор гистологического материала, содержащего ткани брюшной стенки с трансплантатом, проводят биомеханическое и морфологическое исследования; при этом определение биомеханических свойств материала производят на разрывной машине «INSTRON-5944», определяют напряжение (МПа), деформацию с максимальным значением нагрузки (Н) и модуль Юнга (Па) в момент смены фаз биомеханического поведения и в момент максимальной деформации, предшествовавшей разрыву лоскута, определяют усредненные значения напряжения, нагрузки и модуля Юнга; определение морфологических свойств материала производят путем окрашивания срезов методом ОКГ по Зербино и Лукасевич, определяют наличие или отсутствие незрелого коллагена, лейкоцитарной инфильтрации, кистозных образований, атрофию мышечного волокна, определяют интеграцию сетчатого трансплантата с мышечными волокнами.