RU2840702C1 - Способ оценки качества биотрансплантата для герниопластики - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицине, а именно к тканевой инженерии и может быть использовано в абдоминальной хирургии для лечения наружных грыж живота. Предложен способ, который включает обработку ткани передней брюшной стенки путем химической погружной децеллюляризации с последующей морфометрической оценкой ее фрагмента с использованием программы анализа и обработки изображений с плагином, предназначенным для вычисления трабекул черного цвета на белом фоне. При соотношении черных и белых участков более 35,1% биотрансплантат является непригодным для использования при пластике передней брюшной стенки, так как возникает высокий риск разрывов при механическом воздействии. Изобретение обеспечивает объективную оценку степень механической прочности трансплантата, полученного путем химической погружной децеллюляризации кадаверного фрагмента передней брюшной стенки (ПБС) кролика, по результатам морфометрического анализа его тканей. 4 ил., 3 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к тканевой инженерии и может быть использовано в абдоминальной хирургии для лечения наружных грыж живота. Метод позволяет объективно оценить степень механической прочности трансплантата, полученного путем химической погружной децеллюляризации кадаверного фрагмента передней брюшной стенки (ПБС) кролика, по результатам морфометрического анализа его тканей.

В связи с высокой частотой возникновения послеоперационных осложнений (8-14%) [Винник Ю., Петрушко С, Мичуров Е., Назарьянц Ю. Современные способы хирургического лечения грыж и послеоперационная реабилитация больных с грыжами передней брюшной стенки. Современные проблемы науки и образования. Электронный журнал; 2019] при пластике грыжевых ворот синтетическими эндопротезами, большинство хирургов стали задумываться о решения данной проблемы путем создания новых эндопротезов [Касымов А.А., Мусаев А. И. Пластика брюшной стенки при рецидивах послеоперационных вентральных грыжах. 2016; 1: 61-63].

Одной из перспективных стратегий по созданию биотрансплантатов является тканевая инженерия. Однако биологические эндопротезы не нашли широкого применения в клинике, прежде всего из-за риска развития реакции тканевой несовместимости.

Для исключения иммунных реакций биологические каркасы должны быть лишены иммунного материала, то есть децеллюляризированы, но при этом сохранять исходную структуру ткани и внеклеточного матрикса.

Таким образом, существует потребность по разработке методов оценки качества процесса децеллюляризации.

Ссылки на смежные изобретения.

Известен подготовки материала для создания биоинженерной конструкции пищевода [Патент RU 2662554]. Целью данного исследования было получение бесклеточного каркаса из пищевода и оценка его пригодности в качестве каркаса для тканевой инженерии. Для ее достижения было выполнено выделение и очищение пищевода от окружающей соединительной ткани у лабораторных животных. Далее краниальная и каудальная части пищевода были канюлированы и децеллюляризированы детергентами и энзимами.

Качество полученного матрикса оценивали с помощью иммуногистохимического анализа по наличию коллагенов I и IV типов, ламинина, эластина, фибронектина и отсутствию гладкомышечного актина, тропомиозина, компонентов дыхательной цепи митохондрий - с помощью ЭПР-спектроскопии, а также по отсутствию выраженной клеточной воспалительной реакции на пробу подкожной имплантации подготовленного матрикса in vivo.

Недостатком данного способа является отсутствие комплексного подхода для объективной оценки качества децеллюляризации, включающего в себя не только морфологическое исследование, но и биофизические методы оценки различных изменений в получаемом каркасе. Такой подход влечет за собой необъективность оценки, что в свою очередь повышает риск получения некачественного материала для создания тканеинженерной конструкции и последующего возможного отторжения биоинженерного трансплантата.

Известен способ оценки качества децеллюляризированных матриксов для получения биоинженерных трансплантатов на примере интраторакальных органов и тканей [Патент RU 2619642], включающий подтверждение при помощи морфологического метода сохранности внеклеточных компонентов матрикса и отсутствие в нем ядерных структур клеток; подтверждение биосовместимости матрикса калориметрическим методом; определение механическим способом заданной сохранности архитектоники матрикса; оценка биофизическим методом ЭПР-спектроскопии способности матрикса к генерации свободных радикалов, характерных для цепи переноса электронов в митохондриях.

Несмотря на использование комплексного подхода в оценке качества децеллюляризации, у данного метода стоит отметить отсутствие результатов морфологического исследования на наличие внутритканевого отека, что является важным фактором, влияющим на механическую прочность трансплантата.

Технический результат разработанного способа заключается в объективной оценке механической прочности децелюлляризированной ткани ПБС кролика при морфометрии с помощью системы анализа изображений, например, пакета программного обеспечения для управления сканирующим зондовым микроскопом и обработки изображений FemtoScan [Руководство пользователя, найдено в интернет http://www.nanoscopy.org/femtoscan-m.html].

Эксперимент проводился согласно правилам лабораторной практики Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г, со строгим соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г.Страсбург, Франция, 1986).

После аутопсии передней брюшной стенки кролика выделенные фрагменты были обработаны путем химической погружной децеллюляризации и разделены на группы. В 1-й группе были фрагменты, обработанные 1% раствором Тритон-Х 100, представляющим из себя неионное поверхностно-активное вещество, во 2-й группе - 2% раствором Додецилсульфат натрия, являющимся анионным поверхностно-активным веществом, а в 3-й группе - 2% раствором ЧАПС (CHAPS ((3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate - цвиттер-ионным поверхностно-активным веществом. К 4-й группе были отнесены препараты, необработанные детергентными растворами.

Далее для проведения гистологического исследования все фрагменты апоневроза с мышцей фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина, обезвоживание тканей проводили в изопропиловом спирте возрастающей концентрации с помощью гистопроцессора после чего их заливали в гистологическую среду. Срезы ткани толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Для морфометрии использовали микрофотографии гистологических препаратов.

Из стандартных параметров, измеряемых плагином, был выбран показатель, определяющий долю площади трабекул в процентах. В наших изменениях за трабекулы костной ткани были приняты промежутки между тканевыми структурам, образованные межклеточной жидкостью (Фигура 1, 3). Измерения проводили отдельно для апоневроза и мышечной ткани.

В ручном режиме из фотоизображений апоневрозов удаляли мышцы, жировую ткань, которые могли внести ошибку в измерения (Фигура 3).

Микрофотографии разделяли на квадраты (Фигура 2, 4), далее площадь отека автоматически вычислялась в каждом квадрате сетки (ROI). Всего измерено 2083 ROI апоневроза (Таб. 1) и 2761 - мышечной ткани (Таб. 2). Проверка соответствия распределения количественных данных закону нормального распределения выполнялась с помощью критерия Шапиро- Уилка (W-критерий). Сравнение выборок количественных признаков проводили с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Статистически значимым считали результат, если распределение признака отлично от нормального - не превышала 5% (р<0,05).

Дополнительно после выполнения децеллюляризации была проведена тениометрия. Для этого фрагменты ПБС из экспериментальных и контрольной групп были разделены на лоскуты размерами (5±1)х(3±1,5) см для изучения биомеханических свойств внеклеточного матрикса на разрывной электромеханической машине (Таб. 3). При проведении испытаний с помощью электромеханической машины Метротест РЭМ-200, ГОСТ 28840 в качестве критерия использовалось удлинение при нагрузке 16 Н, так как минимально допустимая прочность сетчатых эндопротезов составляет 16 Н/см.

Установлены статистически значимые различия объема отека между группой контроля и экспериментальными группами - Тритон-Х 100, Додепилсульфат натрия, ЧАПС.

Наименьшая величина процента отека из экспериментальных групп отмечена при использовании 2% раствора додецилсульфата натрия как в апоневрозе, так и в мышечной ткани. Наиболее выраженный отек в апоневрозе и мышечной ткани был отмечен в группе, где был использован 2% раствор ЧАПС. Также важно отметить прямую взаимосвязь (r=0,969) между величиной отека и биомеханическими свойствами тканей, которые проявлялись величиной (%) удлинения лоскутов ПБС от начального их размера.

При показатели механического растяжения ткани более 32,5% от исходного уровня, что соответствовало более 35,1% соотношения черных и белых участков по данным морфометрии, степень истончения и дряблости лоскута позволяла судить о его непригодности к использованию для закрытия грыжевого дефекта ПБС, так как возникает высокий риск разрывов биотрансплантатов при механическом воздействии.

Описание к фигурам

Фигура 1 SDS, фрагмент мышцы: гематоксилин-эозин; х12

1-пространство между волокнами;

2 -мышечные волокна.

Фигура 2 SDS, фрагмент мышцы: гематоксилин-эозин; х10 морфометрия

1-пространство между волокнами;

2 -мышечные волокна.

Фигура 3 SDS, фрагмент апоневроза: гематоксилин-эозин; х20.

3 - соединительнотканные волокна фрагмента апоневроза.

Фигура 4 SDS, фрагмент апоневроза: гематоксилин-эозин; х20 морфометрия

3 - соединительнотканные волокна фрагмента апоневроза.

Claims (1)

1. Способ оценки качества биотрансплантата для герниопластики, включающий его обработку путем химической погружной децеллюляризации, отличающийся тем, что выполняют морфометрическое исследовании с использованием программы анализа и обработки изображений с плагином, предназначенным для вычисления трабекул черного цвета на белом фоне и при соотношении черных и белых участков более 35,1 % судят о непригодности биотрансплантата для использования при пластике передней брюшной стенки.