RU2846000C1 - Спрей назальный иммуностимулирующий, содержащий композицию антигенов условно-патогенных бактерий в качестве активного компонента - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к химии и фармацевтике, а именно к средству, представляющему собой спрей назальный иммуностимулирующий. Предложенное средство содержит: 1,0 мг/мл композиции антигенов условно-патогенных бактерий, состоящей из антигенов бактерий Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris и Klebsiella pneumoniae, в качестве активного компонента (АК); 0,3-1,8 мг/мл пролонгатора действия АК, представляющего собой сополимера 2-метил-5-винил-пиридина и N-винил-пирролидона гидрохлорид с молекулярной массой 35-55 кДа формулы (I)

,

где содержание мономерных звеньев n находится в интервале 25-90 мол.% и m равно 0,1-1,0; вспомогательные вещества, включающие лактозу – 25,0 мг/мл, динатрия гидрофосфат – 0,20 мг/мл; натрий хлористый – 0,175 мг/мл, калия дигидрофосфат – 0,02 мг/мл; воду очищенную в качестве растворителя (до 1 мл). Изобретение обеспечивает снижение вымывания АК из слизистой оболочки носа за счет улучшения адгезии средства. 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики и обеспечивает средство в виде назального спрея, стимулирующее иммунитет.

Уровень техники

Врожденный иммунитет выступает в качестве первой линии защиты и включает в себя:

1. Механический барьер, представленный кожей, слизистыми оболочками (мерцательный эпителий), сальными и потовыми железами. Бактерии, преодолевшие этот барьер, встречаются со следующими линиями защиты, как то:

2. Альтернативный путь активизации системы комплемента, развивающийся в ранние часы после инфицирования. Его активаторами выступают бактериальные полисахариды, липополисахариды, вирусы, вирусные частицы на поверхности клеточных мембран, опухолевые клетки и паразиты.

3. Гуморальные факторы, к которым относят лизоцим, секреты кожи и слизистых оболочек, нормальную микрофлору организма, белки острой фазы и цитокины. Они присутствуют в слизи, слюне, секретах, плазме крови и тканевой жидкости.

4. Клеточные факторы, представленные фагоцитами (нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки) и естественными киллерами - NK-клетками.

Клетки врожденного иммунитета выступают в качестве важнейших посредников процесса активизации механизмов приобретенного иммунитета. Причем последние научные исследования убедительно доказывают ключевую роль врожденного иммунитета не только в активизации, но и в регуляции системы приобретенного иммунитета. Поэтому сегодня эти две системы рассматриваются как две стадии единого процесса защиты организма [Тарасова И.В. Понятие о врожденном иммунитете // Аллергология и иммунология в педиатрии. №4 (27) (2011). С.33-36].

Одним из направлений терапии и профилактики инфекций является назначение иммуностимулирующих препаратов, в частности, содержащих иммуногенные компоненты бактериальной стенки, стимулирующие продукцию специфических антител и повышающих активность неспецифических факторов иммунной защиты. Так, известно стимулирующее действие бактериальных лизатов как на клеточный, так и на гуморальный компонент иммунной системы (Cazzola М, Anapurapu S, Page СР. Polyvalent mechanical bacterial lysate for the prevention of recurrent respiratory infections: a meta-analysis. Pulm Pharmacol Ther. 2012 Feb;25(l):62-8). Иммуностимуляторы, содержащие антигены микроорганизмов, могут выпускаться в виде различных лекарственных форм.

Из уровня техники известен препарат для ускорения лечения больных абсцессом легкого, состоящий из смеси антигенных компонентов клебсиеллы пневмонии, протея, стафилококка, кишечной палочки К-100, взятых в равных соотношениях, и вводимый подкожно (Патент RU 2083223, опубл. 10.07.1997).

Недостатками указанного препарата являются сложная схема лечения, требующая участия квалифицированного медперсонала, применения и утилизации шприцов и соблюдения мер антисептики, что представляется неудобным для пациента по сравнению с неинъекционными способами введения.

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является иммуностимулирующий препарат «Иммуновак-ВП-4®», составленный в форме лиофилизата для приготовления раствора для интраназального введения. Одна доза препарата содержит антигены условно-патогенных микроорганизмов (смесь водорастворимых антигенов микробных клеток Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli F-147 (4 мг и лактозу (100±10 мг) в качестве стабилизатора (per. №: ЛСР-001293/10 от 24.02.10).

В основе механизма действия препарата лежит активация ключевых эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета. Препарат активирует фагоцитарную активность макрофагов, корректирует количество и функциональную активность некоторых субпопуляций лимфоцитов, увеличивает продукцию IFN-γ, корректирует синтез изотипов иммуноглобулинов в сторону снижения IgE и повышения IgG и IgA. Вызывает выработку антител к 4 видам условно-патогенных микроорганизмов, антигены которых входят в состав препарата, а также к другим видам (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae и др.) за счет наличия в используемых антигенах широкой перекрестной протективной активности.

Недостатком указанного препарата является быстрое вымывание из слизистой оболочки носа, поэтому существует необходимость в усовершенствовании его состава.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является создание средства, обладающего хорошей адгезией при наличии иммуностимулирующих действия, содержащего в качестве активного компонента (АК) антигены условно-патогенных бактерий и использующегося интраназально.

Техническим результатом изобретения является преодоление недостатка, присущего средствам известного уровня техники, например препарату «Иммуновак-ВП-4®», заключающегося в значительном вымывании АК из слизистой оболочки носа. Указанный результат достигнут за счет введения в состав фармацевтической средства сополимера 2-метил-5-винил-пиридина и N-винил-пирролидона гидрохлорида в качестве пролонгатора действия АК.

Такие пролонгаторы используются, например, в фармацевтической композиции с контролируемым высвобождением активного вещества, содержащая, по меньшей мере, один активный агент, по меньшей мере, один рН-зависимый полимер, по меньшей мере, один рН-независимый полимер и, по меньшей мере, один каналообразующий агент, необязательно с другими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами (заявка WO 2007/105229, опубл. 20.09.2007). Композиция предпочтительно представлена таблетками для перорального приема и содержит активный агент, выбранный, в частности, из группы: противоинфекционное, противовоспалительное, противомикробное, противовирусное средство, иммунизирующее средство, иммуномодулятор; иммунорегулятор и иммуностимулятор.

рН-зависимый полимер выбран из группы, включающей, в частности, производное целлюлозы, такое как алкилцеллюлоза и гидроксиалкилцеллюлоза, шеллак, полиакриловые и метакриловые кислоты и полимеры и сополимеры на основе полиакрилата и метакрилата, используемые либо по отдельности, либо в их комбинации. рН-Независимый полимер выбран из группы, включающей, в частности, поливинилпирролидоны и поливинилпиридин N-оксиды. Каналообразующий агент выбран из группы, включающей, в частности, поливинилпирролидон, винилпирролидон, N-метилпирролидон или их смеси.

В соответствии с одним из вариантов осуществления способа получения известной композиции раствор активного агента или агентов с подходящим солюбилизатором и маловязким рН-независимым полимером подвергают распылительной сушке или лиофилизации для получения сыпучего порошка.

Однако такую композицию нельзя использовать местно, поскольку она предполагает системное применение.

Среднему специалисту в данной области очевидно, что требование малой вязкости раствора рН-независимого полимера обусловлено исключительно особенностями используемых массообменных процессов. Поэтому на основании цитированной публикации такой специалист не способен предположить возможность применения поливинилпиридинов для достижения цели заявляемого изобретения.

Однако это возможно путем применения сополимера на основе N-винилпирролидона в форме фармацевтически приемлемых аддитивных солей кислот, представленный общей формулой (I)

отличающийся тем, что

R обозначает водород или метил;

содержание мономерных звеньев n составляет 25-90 мол. %;

X обозначает анион фармацевтически приемлемой неорганической или органической кислоты (в частности, X обозначает хлорид и к равно 1);

k равно 1 или 2;

m принимает значения от 0,1 до 1,0; и

средневязкостная молекулярная масса сополимера М_μ равна 15-150 кДа (патент RU 2533113, дата публикации: 20.11.2014).

В примере 8 (исследование иммуностимулирующего действия соединений методом миграционной активности колониеобразующих клеток селезенки) показано, что фармацевтические приемлемые соли (m равно от 0,5 до 0,97) сополимеров на основе N-винилпирролидона с n равным от 25 до 35 и М_μ составляет около 40 кДа на 10-30% активнее соответствующих оснований (m ≡ 0). Пример 11 показывает, что гидрохлорид сополимера формулы (I), для которого n равно 25 и М_μ составляет около 40 кДа примерно на треть активнее соответствующего основания в качестве активатора фагоцитоза по оценке активации перитонеальных макрофагов. Однако сведений о других свойствах известных солей формулы (I) описание изобретения не содержит.

Не ограничиваясь рамками теории, привлеченной для объяснения изобретательского замысла, авторы изобретения полагают, что уменьшить скорость вымывания АК при сохранении приемлемой скорости его всасывания можно увеличив адгезию фармацевтического средства без существенного уменьшения скорости диффузии АК.

Порядок величины коэффициента диффузии D можно оценить в приближении Стокса-Эйнштейна:

где

- постоянная Больцмана,

- абсолютная температура,

- вязкость жидкости,

- радиус частицы.

Из анализа этого выражения для D следует вывод, что включение пролонгатора в состав фармацевтической композиции не должно увеличивать ее вязкость.

Авторы изобретения неожиданно установили, что такой пролонгатор может быть выбран из фармацевтически приемленых солей сополимеров 2-метил-5-винил-пиридина и N-винил-пирролидона.

Таким образом, заявляемое изобретение обеспечивает спрей назальный иммуностимулирующий, содержащий композицию антигенов условно-патогенных бактерий в качестве активного компонента (АК), вспомогательные вещества и растворитель, в котором композиция антигенов условно-патогенных бактерий содержит антигены бактерий, выбранных из группы, состоящей из Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris и Klebsiella pneumoniae, вспомогательные вещества содержат в качестве пролонгатора действия АК сополимера 2 метил-5-винил-пиридина и N-винил-пирролидона гидрохлорид с молекулярной массой М в интервале 35-55 кДа, представленный формулой (I)

в которой содержание мономерных звеньев n находится в интервале 25-90 мол. % и m равно 0,1-1,0,

Дополнительно в частном случае выполнения вспомогательные вещества, включают лактозу и динартия гидрофосат, натрий хлористый, калия дигидрофосфат.

Дополнительно в частном случае выполнения растворитель представляет собой воду очищенную.

Дополнительно в частном случае выполнения спрей имеет состав (в мг/мл):

Предпочтительно АК содержит антигены Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris и Klebsiella pneumoniae в равных массовых долях и содержание сополимера 2-метил-5-винил-пиридина и N-винил-пирролидона гидрохлорида составляет 1,000 мг/мл.

Далее в соответствии с изобретением предложено устройство для получения заявляемого спрея назального, которое имеет корпус, заключающий в себе объем водного раствора средства для получения назального спрея в соответствии с изобретением, и соединенное с корпусом дозирующее устройство, сообщающееся по потоку жидкости с корпусом, а по потоку воздуха - с атмосферой, обеспечивающее при однократном приведении в действие получение порции спрея, содержащего единицу дозы АК.

Осуществление изобретения

Пример 1. Приготовление иммуностимулирующего средства В 450 мл воды очищенной при комнатной температуре последовательно растворяют динатрия гидрофосфат (200 мг), калия дигидрофосфат (20 мг) и натрия хлорид (175 мг). Значение рН определяют потенциометрически и при необходимости корректируют до величины 7,4±0,05 добавлением 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной или 0,1 М раствора натрия гидроксида.

Лактозу (25,000 г) тщательно смешивают с композицией антигенов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris и Klebsiella pneumoniae (1000 мг), содержащей равные массовые доли каждого из антигенов. Смесь вносят в приготовленный раствор солей и перемешивают до полного растворения с получением раствора АК.

Отдельно в 500 мл воды очищенной при температуре 30-35°С и интенсивном перемешивании растворяют сополимера 2-метил-5-винил-пиридина и N-винил-пирролидона гидрохлорид (1000 мг; М = 35-55 кДа, n = 20 - 90 мол. %, m = 0,1-1). В раствор АК при перемешивании добавляют раствор сополимера и объем смеси растворов доводят до 1000 мл водой очищенной.

Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, фасуют во флаконы полимерные и укупоривают распылительной системой, предназначенной для бесконсервантных препаратов, с извлекаемой дозой 100 мкл и маркируют.

Пример 2. Оценка изменения величины работы адгезии при введении пролонгатора в состав средства для получения спрея в соответствии с изобретением.

Адгезию к тестовым подложкам определяют методом лежащей капли. Для этого измеряют углы смачивания капель исследуемых растворов (Kruss Drop Shape Analyzer DSA30, Германия) с системой автодозирования (объем капли: 2 мкл). В качестве подложек используют листы размером 3×5 см и толщиной 1 мм, выполненные из силикона (ГОСТ Р 57399-2017), тефлона (ГОСТ 10667-90) и пленку муцина, полученную на стеклянной подложке непосредственно перед исследованиями.

Фотофиксацию (5 кадров) смачивания поверхностей подложек проводят с частотой 1 кадр в секунду. В качестве раствора сравнения берут раствор без добавления пролонгатора, содержащий такие же количества остальных компонентов.

Были получены следующие результаты:

Для расчета работы адгезии применяют модель Оуэнса-Вендта-Рабела-Кьельбле (ОВРК) (1) и уравнение Дюпре-Юнга (2)

где γ_L и γ_S - поверхностное натяжение жидкости и поверхностная энергия тестовой подложки соответственно, индексы D, Р и Σ обозначают дисперсионную и полярную составляющие, а также их сумму.

Для подложек с применением воды и дииодметана в качестве стандартов были вычислены следующие параметры:

Исходя из экспериментальных величин краевых углов Θ в рамках модели ОРВК, вычислены следующие величины работы адгезии W _a к указанным подложкам:

Работа адгезии средства в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения выше, чем у раствора сравнения для всех подложек, что свидетельствует о хорошем сцеплении заявляемого средства с подложкой.

Выбор границ интервала содержания сополимера 2 метил-5-винил-пиридина и Ивинил-пирролидона гидрохлорида в качестве пролонгатора в средстве для получения спрея в соответствии с изобретением был экспериментально обоснован следующими наблюдениями:

1) при содержании пролонгатора 0,2 мг/мл увеличение работы адгезии по сравнению с раствором сравнения сопоставимо с суммарной погрешностью (±5%) и

2) при содержании пролонгатора 2,0 мг/мл средство приобретает недопустимую мутность 30 NTU (нефелометрических единиц мутности).

Пример 3. Оценка влияния заявляемого спрея на некоторые показатели врожденного иммунитета.

Испытание проводили на мышах линии BALB/C в количестве 20 особей массой 16-18 г. Были сформированы 2 группы по 10 мышей - контрольная и опытная. Мышам опытной группы вводили препарат в соответствии с заявляемым изобретением в виде спрея интраназально в обе ноздри по одному впрыскиванию ежедневно 1 раз в день в течение пяти дней. Мышам контрольной группы проводили интраназальное впрыскивание физиологического раствора по той же схеме, что и мышам опытной группы.

Исследовали фагоцитарную активность моноцитов и гранулоцитов в крови через 7 и 14 дней после последнего введения исследуемого средства. Результаты исследования представлены в табл.1.

На 7-ые сутки отмечают усиление фагоцитоза бактериальных клеток гранулоцитами и моноцитами. Высокий уровень активности фагоцитов сохранялся также на 14-ые сутки.

Также определяли бактерицидную активность (процент погибших микробных клеток) лейкоцитов периферической крови в исследуемых группах мышей. Проводили сравнение бактерицидной активности в отношении живой культуры Staphylococcus aureus через 4 и 24 часа после однократного введения мышам опытной группы спрея, мышам контрольной группы вводили физиологический раствор. Полученные результаты представлены в табл.2.

Таблица 2. Бактерицидная активность лейкоцитов периферической крови в исследуемых группах мышей через 4 и 24 часа после введения препарата.

Значения индекса стимуляции (ИС), рассчитываемого как отношение процента погибших клеток S. aureus в группе «Спрей» к проценту погибших клеток S. aureus в группе «Контроль», свидетельствуют об усилении бактерицидной активности лейкоцитов мышей через 4 и 24 часа после введения спрея.

Claims (6)

1. Спрей назальный иммуностимулирующий, содержащий в качестве активного компонента (АК) композицию антигенов условно-патогенных бактерий, состоящую из антигенов бактерий Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris и Klebsiella pneumoniae, вспомогательные вещества и растворитель, отличающийся тем, что содержит в качестве пролонгатора действия АК сополимера 2-метил-5-винил-пиридина и N-винил-пирролидона гидрохлорид с молекулярной массой М в интервале 35-55 кДа и представленный формулой (I)

,

в которой содержание мономерных звеньев n находится в интервале 25-90 мол. % и m равно 0,1-1,0, при этом вспомогательные вещества включают лактозу, динатрия гидрофосфат, натрий хлористый, калия дигидрофосфат, а растворитель представляет собой воду очищенную, где спрей имеет следующий состав, мг/мл:

композиция антигенов 1,0 сополимера 2-метил-5-винил-пиридина и N-винил-пирролидона гидрохлорид 0,3-1,8 лактоза 25,0 динатрия гидрофосфат 0,20 натрий хлористый 0,175 калия дигидрофосфат 0,02 вода очищенная до 1 мл.

2. Спрей по п. 1, отличающийся тем, что содержание сополимера 2-метил-5-винил-пиридина и N-винил-пирролидона гидрохлорида составляет 1,0 мг/мл.

3. Спрей по п. 1 или 2, отличающийся тем, что антигены бактерий Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris и Klebsiella pneumoniae содержатся в равных массовых долях.