RU2845425C1

RU2845425C1 - Probiotic feed additive for fish based on bacillary strains exhibiting antagonism to pathogens

Info

Publication number: RU2845425C1
Application number: RU2024129405A
Authority: RU
Inventors: Екатерина Владиславовна Аллилуева; Владимир Анатольевич Чистяков; Андрей Владимирович Горовцов; Мария Сергеевна Мазанко; Евгения Валерьевна Празднова; Александр Витальевич Теперин; Наталья Григорьевна Сидоренко
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Пробиоаква"
Filing date: 2024-10-02
Publication date: 2025-08-19

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: disclosed is a probiotic feed additive for fish based on bacillar strains exhibiting antagonism to pathogens, which contains soya flour fermented during solid-phase fermentation with a biomass of probiotic spore-forming bacteria of strains Bacillus amyloliquefaciens VKMP-B-14811, Bacillus amyloliquefaciens VKMP-B-14812, Bacillus amyloliquefaciens VKPM-B-14813, Bacillus amyloliquefaciens VKPM-B-14814, Bacillus amyloliquefaciens VKPM-B-14815 taken in ratio 1:1:1:1:1. Probiotic bacteria content in the preparation is no less than 108 CFU/g.

EFFECT: invention is aimed at production of an additive representing a rich source of protein and simultaneously being a source of probiotic microorganisms exhibiting pronounced antagonism in relation to aquaculture species pathogens.

1 cl, 1 dwg, 1 tbl, 2 ex

Description

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, а именно к пробиотической кормовой добавке, предназначенной для использования в качестве готового функционального корма для рыб, содержащего комбинацию пяти уникальных штаммов спорообразующих пробиотических бактерий Bacillus amyloliquefaciens, оказывающих антагонизм в отношении возбудителей болезней объектов аквакультуры: Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas veronii и Vibrio parahaemolyticus. Про биотическая кормовая добавка обеспечивает богатый источник белка, ферментированного пробиотическими микроорганизмами, и касается проведения профилактики и лечения актуальных для гидробионтов инфекций: псевдомоноза, аэромоноза, вибриоза.The invention relates to biotechnology and microbiology, namely to a probiotic feed additive intended for use as a ready-made functional fish feed containing a combination of five unique strains of spore-forming probiotic bacteria Bacillus amyloliquefaciens , which exert antagonism against pathogens of aquaculture objects: Pseudomonas aeruginosa , Aeromonas veronii and Vibrio parahaemolyticus . The probiotic feed additive provides a rich source of protein fermented by probiotic microorganisms and concerns the prevention and treatment of infections relevant to aquatic organisms: pseudomonosis, aeromonosis, vibriosis.

Аквакультура представляет собой активно развивающийся сектор экономики, способный решить проблему мирового голода. При этом разведение объектов аквакультуры осложнено высокой восприимчивостью к бактерильным и грибковым болезням рыб при выращивании в условиях высокой плотности [1]. Использование антибиотиков и противомикробных препаратов для профилактики и лечения заболеваний объектов разведения ограничено повышением антибиотикорезистентности возбудителей вследствие горизонтального переноса генов, а также может оказывать токсическое воздействие на организмы человека и животных, на состояние водных экосистем [2, 3]. Установлено, что бесконтрольное использование противомикробных средств в области ветеринарии и аквакультуре способствует появлению резестентных бактерии в составе микрофлоры человека. При этом дериваты антибиотиков аккумулируются в тканях рыбы, попадая, таким образом, к потребителю [3]. Пробиотики, применяемые в аквакультуре, являются альтернативой антибиотикам и химическим противомикробным средствам, при этом проявляют иммуномодулирующие свойства и способствуют повышению темпов роста объектов разведения [4]. Увеличение скорости роста связано с ферментацией микроорганизмами пищи при использовании пробиотических микроорганизмов, колонизирующих желудочно-кишечный тракт хозяина [5-8].Aquaculture is a rapidly developing sector of the economy that can solve the problem of world hunger. At the same time, the breeding of aquaculture objects is complicated by high susceptibility of fish to bacterial and fungal diseases when grown in high-density conditions [1]. The use of antibiotics and antimicrobials for the prevention and treatment of diseases of breeding objects is limited by the increase in antibiotic resistance of pathogens due to horizontal gene transfer, and can also have a toxic effect on humans and animals, on the state of aquatic ecosystems [2, 3]. It has been established that the uncontrolled use of antimicrobials in veterinary medicine and aquaculture contributes to the emergence of resistant bacteria in the human microflora. In this case, antibiotic derivatives accumulate in fish tissues, thus reaching the consumer [3]. Probiotics used in aquaculture are an alternative to antibiotics and chemical antimicrobials, while they exhibit immunomodulatory properties and contribute to an increase in the growth rate of breeding objects [4]. The increase in growth rate is associated with fermentation of food by microorganisms using probiotic microorganisms colonizing the host's gastrointestinal tract [5-8].

В контексте применения пробиотических препаратов и кормовых добавок в области аквакультуры актуальным представляется поиск микроорганизмов, выживающих и проявляющих про биотические свойства при низких температурах, соответствующих условиям выращивания рыб и других водных животных. Основным лимитирующим фактором возможности применения широкого спектра пробиотических микроорганизмов в качестве добавки для аквакультуры является температурный оптимум [8]. При этом использование пробиотика, содержащего один штамм, уступает по эффективности применению мультшптаммовых пробиотических препаратов и добавок. Сочетанное использование нескольких штаммов обеспечивает широкий спектр эффективности благодаря аддитивному и синергическому эффектам. Таким образом, мультиштаммовые добавки содержат микроорганизмы, сосуществующие в составе пробиотика по принципу симбиоза [4].In the context of the use of probiotic preparations and feed additives in aquaculture, it is relevant to search for microorganisms that survive and exhibit probiotic properties at low temperatures corresponding to the conditions for growing fish and other aquatic animals. The main limiting factor for the possibility of using a wide range of probiotic microorganisms as an additive for aquaculture is the temperature optimum [8]. At the same time, the use of a probiotic containing one strain is inferior in efficiency to the use of multi-strain probiotic preparations and additives. The combined use of several strains provides a wide range of efficiency due to additive and synergistic effects. Thus, multi-strain additives contain microorganisms that coexist in the probiotic according to the principle of symbiosis [4].

Известные про биотики и пробиотические кормовые добавки представляют собой как моно-, так и мультиштаммовые препараты. К микроорганизмам, входящим в их состав, преимущественно относятся бактерии родов Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Pediococcus, Bifidobacterium, Bacillus, в том числе: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens [8, 9]. При этом общим недостатком является использование про биотической добавки с набором штаммов микроорганизмов в качестве универсальной для различных теплокровных и холоднокровных сельскохозяйственных и домашних животных.Known probiotics and probiotic feed additives are both mono- and multi-strain preparations. The microorganisms included in their composition mainly include bacteria of the genera Lactobacillus , Streptococcus , Enterococcus , Pediococcus , Bifidobacterium , Bacillus , including: Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis , Bacillus amyloliquefaciens [8, 9]. At the same time, a common disadvantage is the use of a probiotic additive with a set of microorganism strains as a universal one for various warm-blooded and cold-blooded agricultural and domestic animals.

Так, известна про биотическая кормовая добавка «OLIN» (https://probiotic-olin.ra), используемая для профилактики и лечения болезней разных видов домашних животных [https://veterba.ru/kratkaya-harakteristika-produkta-olin?ysclid=mlks2g75px9000650]. В состав описанной добавки входят два штамма: Bacillus subtilis (ВКПМ 10172) и Bacillus licheniformis (ВКПМ 10135) в соотношении 1:1, с содержанием бактерий не менее 2-10⁹ КОЕ/г и смесью сахаридов и крахмала. Описанный пробиотик может обеспечивать эффективную колонизацию желудочно-кишечного тракта организма-хозяина благодаря использованию спорообразующих пробиотических микроорганизмов. Недостатком является неспецифичность пробиотиков в отношении объекта профилактического и терапевтического воздействия, и, как следствие, неселективного антагонистического эффекта в отношении патогенных микроорганимов. Известна форма описываемой кормовой добавки, применяемая для аквариумных рыб. Обе формы кормовой добавки не адаптированы для использования в рыбоводстве и аквакультуре.Thus, the biotic feed additive "OLIN" (https://probiotic-olin.ra) is known, used for the prevention and treatment of diseases of various types of domestic animals [https://veterba.ru/kratkaya-harakteristika-produkta-olin?ysclid=mlks2g75px9000650]. The composition of the described additive includes two strains: Bacillus subtilis (VKPM 10172) and Bacillus licheniformis (VKPM 10135) in a ratio of 1:1, with a bacterial content of at least 2-10 ⁹ CFU / g and a mixture of saccharides and starch. The described probiotic can ensure effective colonization of the gastrointestinal tract of the host organism due to the use of spore-forming probiotic microorganisms. The disadvantage is the non-specificity of probiotics in relation to the object of preventive and therapeutic action, and, as a consequence, the non-selective antagonistic effect in relation to pathogenic microorganisms. The form of the described feed additive used for aquarium fish is known. Both forms of the feed additive are not adapted for use in fish farming and aquaculture.

Известен другой пробиотик «СУБТИЛИС», применимый как в ветеринарии и в рыбоводстве [https://subtilis.ru/use/fish]. Описываемый препарат также содержит в своем составе лактозу и споры Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в количестве не менее 2⋅10⁹ КОЕ/ г. Another probiotic "SUBTILIS" is known, which is used both in veterinary medicine and in fish farming [https://subtilis.ru/use/fish]. The described drug also contains lactose and spores of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis in an amount of at least 2⋅10 ⁹ CFU/g.

Известен ветеринарный пробиотический препарат «СУБ-ПРО», действующим агентом которого является штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-2335 не менее 5х 10¹⁰ КОЕ/г в споровой форме [https://vetsnab.info/vetpreparaty/sub-pro/]. Несмотря на высокое содержание пробиотических микроорганизмов, препарат неспецифичен в отношении рыб и объектов аквакультуры, и, как следствие, возбудителей специфичных заболеваний хладнокровных гидробионтов.The veterinary probiotic drug "SUB-PRO" is known, the active agent of which is the strain Bacillus subtilis VKPM B-2335 of at least 5x 10 ¹⁰ CFU/g in spore form [https://vetsnab.info/vetpreparaty/sub-pro/]. Despite the high content of probiotic microorganisms, the drug is not specific to fish and aquaculture objects, and, as a consequence, pathogens of specific diseases of cold-blooded aquatic organisms.

Известна кормовая добавка с про биотической активностью для сельскохозяйственных животных, птиц, лошадей и рыб RU 2 652 836 С1, содержащая штаммы Enterococcus faecium 1-35 и Bacillus megaterium В-4801. Препарат обеспечивает нормализацию процессов пищеварения и усвояемости питательных веществ, улучшение показателей роста. Недостатком добавки является неспецифичность в отношении гидробионтов, отсутствие антагонизма в отношении специфичных патогенов.A feed additive with probiotic activity for farm animals, birds, horses and fish RU 2 652 836 C1 is known, containing strains of Enterococcus faecium 1-35 and Bacillus megaterium B-4801. The preparation ensures normalization of digestion processes and assimilation of nutrients, improvement of growth indicators. The disadvantage of the additive is non-specificity in relation to aquatic organisms, lack of antagonism in relation to specific pathogens.

Аналогичными недостатками обладает известный пробиотический препарат: «Новый пробиотический препарат на основе консорциума спорообразующих бактерий для аквакультуры и животных и способ его получения» RU 2799554 C1. Пробиотический препарат предназначен для аквакультуры, а именно для цист рачка артемии и креветок. Таким образом, специфический про биотические свойства входящих в состав Bacillus toyonensis ВКПМ В-13249 и Bacillus pumilus ВКПМ В-13250 проявляются в отношении отдельных гидробионтов. Описанный пробиотик не может быть использован для профилактики и лечения болезней рыб.Similar disadvantages are inherent in the well-known probiotic preparation: "A new probiotic preparation based on a consortium of spore-forming bacteria for aquaculture and animals and a method for obtaining it" RU 2799554 C1. The probiotic preparation is intended for aquaculture, namely for Artemia crustacean cysts and shrimp. Thus, the specific probiotic properties of Bacillus toyonensis VKPM B-13249 and Bacillus pumilus VKPM B-13250 included in the composition are manifested in relation to individual aquatic organisms. The described probiotic cannot be used for the prevention and treatment of fish diseases.

Наиболее близким по технической сущности является Комбинированный пробиотик для аквакультуры на основе спорообразующих бактерий рода Bacillus и способ его производства RU (11) 2 768 281(13) С1, в составе которого находятся штаммы Bacillus subtilis ВКМ B-3154D, Bacillus subtilis ВКМВ-3171D, которые естественно адаптированны к росту в условиях низких температур и штамм Bacillus licheniformis BKM-B-3172D, полученный направленной селекцией на понижение температуры роста из коллекционного штамма Bacillus licheniformis ВКПМ В-10956. Препарат является специфичным для аквакультуры пробиотиком, однако, только один из штаммов обладает антагонизмом в отношении патогенов гидробионтов.The closest in technical essence is the Combined probiotic for aquaculture based on spore-forming bacteria of the genus Bacillus and the method for its production RU (11) 2 768 281 (13) C1, which contains the strains Bacillus subtilis VKM B-3154D, Bacillus subtilis VKMV-3171D, which are naturally adapted to growth in low temperature conditions and the strain Bacillus licheniformis BKM-B-3172D, obtained by targeted selection for lowering the growth temperature from the collection strain Bacillus licheniformis VKPM B-10956. The drug is a probiotic specific for aquaculture, however, only one of the strains has antagonism with respect to pathogens of aquatic organisms.

Первым шагом для решения описанных недостатков и проблем авторами были выделены пять штаммов Bacillus amyloliquefaciens из донных отложений пресноводного водоема, исследованные на наличие антибиотикорезистентности и антагонизма в отношении специфичных патогенов рыб. Микроорганизмы являются естественно адаптированными к росту в условиях низких температур, обладают термостабильностью. Штаммы были депонированы в Национальном биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт»:The first step to solve the described shortcomings and problems was to isolate five strains of Bacillus amyloliquefaciens from bottom sediments of a freshwater reservoir, which were examined for antibiotic resistance and antagonism against specific fish pathogens. The microorganisms are naturally adapted to growth at low temperatures and are thermally stable. The strains were deposited in the National Bioresource Center All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) of the National Research Center "Kurchatov Institute":

1. Bacillus amyloliquefaciens ВКМП-В-148111. Bacillus amyloliquefaciens VKMP-V-14811

2. Bacillus amyloliquefaciens ВКМП-В-148122. Bacillus amyloliquefaciens VKMP-V-14812

3. Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ-В-148133. Bacillus amyloliquefaciens VKPM-V-14813

4. Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ-В-148144. Bacillus amyloliquefaciens VKPM-V-14814

5. Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ-В-148155. Bacillus amyloliquefaciens VKPM-V-14815

Вторым этапом были получены биомассы штаммов путем посева сплошным загоном на твердой питательной среде LB (Luria-Bertani), после чего были перенесены на соевую муку. В процессе твердофазной ферментации сои была получена пробиотическая кормовая добавка для рыб, представляющая собой сухой порошок бежевого цвета, в состав которого входят ферментированная соя и споры пробиотических микроорганизмов Bacillus amyloliquefaciens ВКМП-В-14811, Bacillus amyloliquefaciens ВКМП-В-14812, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ-В-14813, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ-В-14814, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ-В-14815.The second stage involved obtaining biomasses of the strains by continuous seeding on a solid nutrient medium LB (Luria-Bertani), after which they were transferred to soy flour. In the process of solid-phase fermentation of soy, a probiotic feed additive for fish was obtained, which is a dry powder of beige color, which includes fermented soy and spores of probiotic microorganisms Bacillus amyloliquefaciens VKMP-V-14811, Bacillus amyloliquefaciens VKMP-V-14812, Bacillus amyloliquefaciens VKPM-V-14813, Bacillus amyloliquefaciens VKPM-V-14814, Bacillus amyloliquefaciens VKPM-V-14815.

Технический результат изобретения достигается тем, что в состав кормовой добавки входят микроорганизмы отвечающие следующим требованиям:The technical result of the invention is achieved by the fact that the feed additive contains microorganisms that meet the following requirements:

1. В комбинации в составе кормовой добавки пробиотические штаммы проявляют антагонистическую активность в отношении возбудителей актуальных для гидробионтов инфекций (псевдомоноза, аэромоноза, вибриоза), а также проявляют синергизм и антагонизм;1. When combined in a feed additive, probiotic strains exhibit antagonistic activity against pathogens that are relevant to aquatic organisms (pseudomonas, aeromonosis, vibriosis), and also exhibit synergism and antagonism;

2. Ферментированная соя, являющаяся основой кормовой добавки, является богатым источником белка и необходимых нутриентов для аквакультуры;2. Fermented soybean, which is the basis of the feed additive, is a rich source of protein and essential nutrients for aquaculture;

3. Способны к споруляции;3. Capable of sporulation;

4. Безопасны в отношении объектов аквакультуры и других гидробиотнов;4. Safe for aquaculture objects and other aquatic organisms;

5. Содержание пробиотических бактерий в препарате составляет не менее 10⁸ КОЕ/г.5. The content of probiotic bacteria in the preparation is not less than 10 ⁸ CFU/g.

Технический результат состоит в высокой селективности и видоспецифичности в отношении патогенов, а также стабильности и эффективности, связанными со способностью штаммов-антагонистов к спорообразованию.The technical result consists of high selectivity and species specificity with respect to pathogens, as well as stability and efficiency associated with the ability of antagonist strains to form spores.

Преимущество пробиотической добавки включает также улучшенную ценность корма, энзиматический вклад в пищеварение, ингибирование патогенных микроорганизмов, повышенный иммунный ответ.The benefits of probiotic supplementation also include improved feed value, enzymatic contribution to digestion, inhibition of pathogenic microorganisms, and enhanced immune response.

Сущность заявляемой группы изобретений иллюстрируются, но не ограничивается следующими примерами.The essence of the claimed group of inventions is illustrated, but not limited, by the following examples.

Пример 1Example 1

С целью выявления антагонистической активности штаммов и оценкой степени ее выраженности в качестве штаммов-патогенов рыб были использованы штаммы грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas veronii, Vibrio parahaemolyticus. Данные штаммы были выделены авторами из больных рыб, в ходе выполнения предыдущих исследований. Pseudomonas aeruginosa и Aeromonas veronii были выделены из карповых рыб, болезнь сопровождалась ершистостью чешуи, кровоизлияниями в кожу, иногда водянкой и пучеглазием. Vibrio parahaemolyticus был выделен из лососевых рыб, болезнь сопровождалась кровоизлияниями и изъязвлениями кожи.In order to identify the antagonistic activity of the strains and assess the degree of its expression, strains of gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas veronii, Vibrio parahaemolyticus were used as fish pathogen strains. These strains were isolated by the authors from diseased fish during previous studies. Pseudomonas aeruginosa and Aeromonas veronii were isolated from carp fish, the disease was accompanied by bristly scales, hemorrhages in the skin, sometimes dropsy and exophthalmos. Vibrio parahaemolyticus was isolated from salmon fish, the disease was accompanied by hemorrhages and ulcerations of the skin.

Полученные штаммы пробиотиков Bacillus amyloliquefaciens инкубировали вместе со штаммами-патогенами при температуре 37°С в течение 24 часов. Оценку проводили путем оценки зоны подавления роста патогенов.The obtained strains of Bacillus amyloliquefaciens probiotics were incubated together with pathogenic strains at 37°C for 24 hours. The assessment was carried out by assessing the zone of inhibition of pathogen growth.

После того, как была подтверждено наличие антагонизма у штаммов пробиотических микроорганизмов, проводили оценку степени антагонизма. Для этого в пробирку наливали по 5 мл жидкой среды LB, после чего инокулировали биомассу каждого пробиотического штамма отдельно.After the presence of antagonism in the strains of probiotic microorganisms was confirmed, the degree of antagonism was assessed. For this purpose, 5 ml of liquid LB medium were poured into a test tube, after which the biomass of each probiotic strain was inoculated separately.

Инкубирование производили при температуре 37°С. Через 24 часа проводили оценку роста штаммов патогенов в присутствии каждой концентрации супернатанта. Оценку степени роста клеток проводили по оптической плотности при длине волны 600 нм.Incubation was performed at a temperature of 37°C. After 24 hours, the growth of pathogen strains in the presence of each concentration of supernatant was assessed. The degree of cell growth was assessed by optical density at a wavelength of 600 nm.

Из таблицы видно, что даже в низких концентрациях, при разведении супернатанта в отношении 1/2,1/4,1/8,1/16 все штаммы провляют антагонизм в отношении патогенов Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas veronii, Vibrio parahaemolyticus.The table shows that even at low concentrations, when diluting the supernatant in the ratio of 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, all strains exhibit antagonism towards the pathogens Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas veronii, Vibrio parahaemolyticus .

При проявлении посевов комбинации штаммов в отношении 1:1:1:1:1 методом аналогичным описанному, наблюдали синергизм и полное подавление роста каждого из использованных патогенных штаммов. В комбинации степень антагонизма составила 100%.When developing crops of a combination of strains in a ratio of 1:1:1:1:1 using a method similar to that described, synergism and complete suppression of the growth of each of the pathogenic strains used were observed. In combination, the degree of antagonism was 100%.

Пример 2Example 2

Перед наработкой штаммов для включения их в корма рыб проводили оценку безопасности. Для оценки безопасности использования штаммов в качестве пробиотиков, нами была исследована их антибиотикорезистентность, а также гемолитическая активность.Before developing strains for inclusion in fish feed, a safety assessment was carried out. To assess the safety of using strains as probiotics, we studied their antibiotic resistance, as well as hemolytic activity.

Для исследования антибиотикорезистентности использовали стандартные диски с антибиотиками:To study antibiotic resistance, standard antibiotic discs were used:

1. Азитромицин (15 мкг).1. Azithromycin (15 mcg).

2. Амоксициллин/клавуланат (20 мкг /10 мкг).2. Amoxicillin/clavulanate (20 mcg/10 mcg).

3. Ампициллин (10 мкг).3. Ampicillin (10 mcg).

4. Тетрациклин (30 мкг).4. Tetracycline (30 mcg).

5. Гентамицин (10 мкг).5. Gentamicin (10 mcg).

6. Оксациллин (10 мкг).6. Oxacillin (10 mcg).

7. Кларитромицин (15 мкг).7. Clarithromycin (15 mcg).

8. Цефазолин (30 мкг).8. Cefazolin (30 mcg).

9. Цефтриаксон (30 мкг).9. Ceftriaxone (30 mcg).

Исследуемые изоляты высевали сплошным газоном на питательную среду Мюллера-Хинтона, после чего накладывали диски с указанными антибиотическими препаратами.The isolates under study were sown as a continuous lawn on the Mueller-Hinton nutrient medium, after which discs with the indicated antibiotic preparations were applied.

В ходе проведения теста на антибиотикорезистентность все штаммы показали высокую чувствительность ко всем исследуемым антибиотикам (зона отсутствия роста превышала 0,5-1 см и могла достигать до 3 см в отдельных случаях, фиг. 1).During the antibiotic resistance test, all strains showed high sensitivity to all antibiotics tested (the zone of no growth exceeded 0.5-1 cm and could reach up to 3 cm in some cases, Fig. 1).

Для оценки гемолотической активности отобранные штаммы наносили на кровяной агар и инкубировали 1 сутки при температуре 37°С. Через сутки учитывали наличие либо отсутствие зон гемолиза. При исследовании гемолитической активности показано, что ни один из исследуемых штаммов не образовывал зон позеленения вокруг колоний. Таким образом, штаммы, входящие в состав про биотической кормовой добавки не обладают бета-гемолизом и являются безопасными.To assess the hemolytic activity, the selected strains were applied to blood agar and incubated for 1 day at 37°C. After 24 hours, the presence or absence of hemolysis zones was taken into account. When studying the hemolytic activity, it was shown that none of the studied strains formed green zones around the colonies. Thus, the strains included in the probiotic feed additive do not have beta-hemolysis and are safe.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ источниковLIST OF USED SOURCES

1. E1-Saadony М. Т. et al. The functionality of probiotics in aquaculture: An overview //Fish & shellfish immunology. - 2021. - Т. 117. - C. 36-52.1. E1-Saadony M. T. et al. The functionality of probiotics in aquaculture: An overview //Fish & shellfish immunology. - 2021. - T. 117. - P. 36-52.

2. Assefa A., Abunna F. Maintenance of fish health in aquaculture: review of epidemiological approaches for prevention and control of infectious disease of fish //Veterinary medicine international. - 2018. - T. 2018. - №. 1. - C. 5432497.2. Assefa A., Abunna F. Maintenance of fish health in aquaculture: review of epidemiological approaches for prevention and control of infectious disease of fish //Veterinary medicine international. - 2018. - T. 2018. - No. 1. - C. 5432497.

3. Santos L., Ramos F. Antimicrobial resistance in aquaculture: Current knowledge and alternatives to tackle the problem //International journal of antimicrobial agents.-2018. - T. 52. - №.2.-C. 135-143.3. Santos L., Ramos F. Antimicrobial resistance in aquaculture: Current knowledge and alternatives to tackle the problem //International journal of antimicrobial agents.-2018. - T. 52. - No. 2.-C. 135-143.

4. Puvanasundram P. et al. Multi-strain probiotics: Functions, effectiveness and formulations for aquaculture applications //Aquaculture Reports. - 2021. - T. 21. - C. 100905.4. Puvanasundram P. et al. Multi-strain probiotics: Functions, effectiveness and formulations for aquaculture applications //Aquaculture Reports. - 2021. - T. 21. - P. 100905.

5. Ninawe A. S., Selvin J. Probiotics in shrimp aquaculture: avenues and challenges //Critical reviews in microbiology. - 2009. - T. 35. - №.1. - C. 43-66.5. Ninawe A. S., Selvin J. Probiotics in shrimp aquaculture: avenues and challenges //Critical reviews in microbiology. - 2009. - T. 35. - No. 1. - pp. 43-66.

6. Prazdnova E. V. et al. Effect of Bacillus subtilis KATMIRA1933 and Bacillus amyloliquefaciens B-1895 on the productivity, reproductive aging, and physiological characteristics of hens and roosters //Beneficial microbes. - 2019. - T. 10. - №.4. - C. 395-412.6. Prazdnova E. V. et al. Effect of Bacillus subtilis KATMIRA1933 and Bacillus amyloliquefaciens B-1895 on the productivity, reproductive aging, and physiological characteristics of hens and roosters // Beneficial microbes. - 2019. - T. 10. - No. 4. - pp. 395-412.

7. Mazanko M. S., Gorlov I.F., Prazdnova E.V., Makarenko M.S., Usatov A.V., Bren A.B., Chistyakov V.A., Tutelyan A.V., Komarova Z.B., Mosolova N.I., Pilipenko D.N., Krotova O.E., Struk A.N., Lin A., Chikindas M.L. Bacillus probiotic supplementations improve laying performance, egg quality, hatching of laying hens, and sperm quality of roosters //Probiotics and Antimicrobial Proteins. - 2018. - V. 10. - P. 367-373.7. Mazanko M. S., Gorlov I.F., Prazdnova E.V., Makarenko M.S., Usatov A.V., Bren A.B., Chistyakov V.A., Tutelyan A.V., Komarova Z.B., Mosolova N.I., Pilipenko D.N., Krotova O.E., Struk A.N., Lin A., Chikindas M.L. Bacillus probiotic supplementations improve laying performance, egg quality, hatching of laying hens, and sperm quality of roosters //Probiotics and Antimicrobial Proteins. - 2018. - V. 10. - P. 367-373.

8. Sumon M. A. A. et al. Single and multi-strain probiotics supplementation in commercially prominent finfish aquaculture: Review of the current knowledge //Journal of microbiology and biotechnology. - 2022. - T. 32. - №.6. - C. 681.8. Sumon M. A. A. et al. Single and multi-strain probiotics supplementation in commercially prominent finfish aquaculture: Review of the current knowledge //Journal of microbiology and biotechnology. - 2022. - T. 32. - No. 6. - P. 681.

9. Subedi В., Shrestha A. A review: Application of probiotics in aquaculture //Int. J. For. Amm. Fish. Res. - 2020. - T. 4. - №. 5.9. Subedi V., Shrestha A. A review: Application of probiotics in aquaculture //Int. J. For. Amm. Fish. Res. - 2020. - T. 4. - No. 5.

Claims

A probiotic feed additive for fish based on bacillary strains exhibiting antagonism to pathogens, characterized by the fact that it contains soy flour fermented in the process of solid-phase fermentation with the biomass of probiotic spore-forming bacteria of the strains Bacillus amyloliquefaciens VKMP-V-14811, Bacillus amyloliquefaciens VKMP-V-14812, Bacillus amyloliquefaciens VKPM-V-14813, Bacillus amyloliquefaciens VKPM-V-14814, Bacillus amyloliquefaciens VKPM-V-14815 taken in the ratio 1:1:1:1:1, while the content of probiotic bacteria in the preparation is not less than 10 ⁸ CFU/g.