RU2845088C2

RU2845088C2 - Расщепленный с n-конца и/или c-конца растворимый полипептид ph20 и его применение

Info

Publication number: RU2845088C2
Application number: RU2024117969A
Authority: RU
Inventors: Сун Чэ ПАК; Кёван Ким; Санг Хун ЮН; Хён-Нам СОН
Original assignee: Алтеоген Инк.
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2023-06-21
Publication date: 2025-08-13

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к рекомбинантному полипептиду PH20, имеющему активность гиалуронидазы. Указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, (1) начинающуюся с N37 и заканчивающуюся Y482 SEQ ID № 1; (2) начинающуюся с N37 и заканчивающуюся F468 SEQ ID № 1; (3) начинающуюся с F38 и заканчивающуюся Y482 SEQ ID № 1; (4) начинающуюся с N37 и заканчивающуюся L490 любой из SEQ ID № 2-8; (5) начинающуюся с F38 и заканчивающуюся на L490 любой из SEQ ID № 2-8; (6) начинающуюся с D37 и заканчивающуюся на H478 SEQ ID № 9; (7) начинающуюся с D37 и заканчивающуюся на H477 SEQ ID № 10; или (8) начинающуюся с A40 и заканчивающуюся на H477 последовательности SEQ ID № 10. Изобретение также относится к нуклеиновой кислоте, вектору экспрессии, клетке-хозяину и способу получения такого полипептида PH20. Настоящее изобретение обеспечивает полипептид PH20 с повышенной активностью по сравнению с PH20 дикого типа. 5 н. и 1 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 5 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к расщепленному с N-конца и/или C-конца растворимому полипептиду PH20 и его применению.

Уровень техники

Постоянно предпринимаются попытки с помощью способов генной инженерии повысить уровень экспрессии промышленно полезных белков, секретируемых из рекомбинантных клеток.

Было опробовано несколько традиционных способов, и каждый способ имеет свои преимущества и недостатки. Например, на этапе клонирования были выбраны подходящие промоторы для повышения уровня экспрессии, однако, если сворачивание белка представляло собой стадию, ограничивающую скорость, то количество экспрессируемого белка не соответствовало ожидаемому при выбранном промоторе (Su Xiao et al., Curr Opin Struct Biol. 2014, June 32-38).

Для увеличения экспрессии белков, секретируемых клеткой, сигнальные пептиды белка-мишени на N-конце были заменены сигнальными пептидами других белков (Kober, L., Zehe, C. & Bode, J., 2013. Optimized Signal Peptides for the Development of High Expressing CHO Cell Lines. Biotechnology and bioengineering, 110(4), pp. 1164-1173). При этом экспрессия белка иногда увеличивалась по сравнению со случаем применения собственного сигнального пептида, но если сигнальная пептидаза расщепляла экспрессируемый белок при прохождении через мембрану эндоплазматического ретикулума в клетке, то сигнальной пептидазе иногда не удавалось произвести расщепление именно между сигнальным пептидом и N-концевой аминокислотой зрелого белка.

Другие попытки увеличить экспрессию белка включают совместную экспрессию с шапероном, чтобы помочь сворачиванию рекомбинантного белка и предотвратить агрегацию белков, подлежащих экспрессии. Однако этот способ не часто применяют в промышленности из-за технической проблемы, заключающейся в одновременной экспрессии целевого белка и мембраносвязанного шаперона в рекомбинантной клетке, а также внутриклеточных физиологических проблем, вызванных экспрессией шаперона.

Замена аминокислот в рекомбинантном белке с применением сайт-направленного мутагенеза в определенном сайте представляет собой еще одну попытку увеличить экспрессию белка. Белок, состоящий из полипептидов, при продуцировании в клетке сворачивается в трехмерную структуру. Замещение аминокислот может обеспечить благоприятную среду для сворачивания белка, что может привести к увеличению экспрессии белка. Было много успешных случаев, но практические проблемы, такие как увеличение иммуногенности из-за модификации аминокислот, неизбежны.

Гиалуронан (гиалуроновая кислота: ГК) представляет собой гликозаминогликан, обнаруживаемый во внеклеточном матриксе многих клеток, особенно в соединительных тканях. Гиалуронан также содержится преимущественно в коже, хрящах и синовиальной жидкости млекопитающих. Гиалуронан также представляет собой основной компонент стекловидного тела глаза. Гиалуронан играет роль в различных физиологических процессах, таких как гомеостаз воды и белков плазмы (Laurent T.C. et al. (1992) FASEB J. 6: 2397-2404). Некоторые заболевания связаны с экспрессией и/или выработкой гиалуронана. Гиалуронидаза представляет собой фермент, расщепляющий гиалуронан. Гиалуронидазу можно применять для лечения заболеваний или нарушений, связанных с накоплением гиалуронана или другого гликозаминогликана путем катализа гидролиза гиалуронана. Кроме того, поскольку гиалуронан представляет собой основной компонент подкожного барьера, гиалуронидазу можно применять для увеличения проницаемости тканей и, следовательно, для увеличения дисперсии и доставки терапевтических средств при подкожной инъекции.

Различные гиалуронидазы на основе нативного полипептида PH20 (например, Hydase™, Vitrase™, Wydase™) применяют в сочетании с другими терапевтическими средствами, обычно в качестве диспергирующих средств. Многие из этих гиалуронидаз включают PH20, полученный из овечьих или бычьих яичек.

Человеческий белок PH20 состоит из 509 аминокислот и известен как белок с прикрепленным гликофосфоинозитол-липидом, присутствующий в плазматической мембране сперматозоидов. В то время как гиалуронидазы Hyal1, Hyal2, Hyla3 или Hyal4, присутствующие в крови, активны только при кислом pH, PH20 активен даже при нейтральном pH, поэтому PH20 был разработан для смешивания с лекарственными средствами для подкожных инъекций и применения в промышленности.

Недавно, Hylenex™, был применен рекомбинантный человеческий полипептид PH20 из 447 аминокислот, модифицированный для обеспечения растворимости путем отщепления аминокислот на С-конце PH20, которые отвечают за прикрепление гликофосфоинозитола. Кроме того, разрабатываются средства с применением варианта полипептида человеческого PH20.

Между тем, человеческий PH20, гликопротеин, N-гликозилированный в шести сайтах, имеет очень сложную трехмерную структуру и для производства промышленно полезного фермента требует сложного процесса очистки после экспрессии в клетках животных, таких как клетки CHO. Поэтому для промышленного применения человеческого PH20 очень важно повысить продуктивность животных клеток, содержащих гены человеческого PH20, в зависимости от уровня их экспрессии в ферментационной среде.

В рамках этого технического уровня авторы настоящего изобретения определили, что расщепление с N-конца или с N- и C-концов может повысить выход растворимого рекомбинантного полипептида PH20, что лежит в основе настоящего изобретения.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение направлено на создание расщепленного с N-конца и/или C-конца растворимого полипептида PH20 с улучшенным выходом.

Настоящее изобретение направлено на обеспечение нуклеиновой кислоты, кодирующей расщепленный с N-конца и/или C-конца растворимый полипептид PH20.

Настоящее изобретение направлено на обеспечение рекомбинантного вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение направлено на создание клетки-хозяина, трансформированной рекомбинантным вектором экспрессии.

Настоящее изобретение относится к способу получения расщепленного с N-конца и/или C-конца растворимого полипептида PH20, включающему стадию культивирования клетки-хозяина.

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный полипептид PH20, в котором от 1 до 7 аминокислотных остатков удалены с N-конца зрелого PH20 дикого типа животного происхождения.

Конкретно, рекомбинантный полипептид PH20, в котором аминокислотный остаток (остатки) удален (удалены) с N-конца зрелого PH20 дикого типа животного происхождения в соответствии с настоящим изобретением, может быть охарактеризован как выбранный из группы, состоящей, но без ограничений, из:

(a) из рекомбинантного полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из N37-P42 в человеческом PH20 дикого типа, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID № 1;

(b) из рекомбинантного полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от N37 до P42 у PH20 дикого типа от примата, имеющего аминокислотную любую последовательность из SEQ ID №№ 2-8;

(c) из рекомбинантного полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от D37 до P42 у бычьего PH20 дикого типа, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID № 9; и

(d) из рекомбинантного полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из D37 до P42 у PH20 дикого типа от овцы, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID № 10.

Настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный полипептид PH20, и рекомбинантный вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту.

Изобретение также обеспечивает клетку-хозяин, трансформированную рекомбинантным вектором экспрессии, и способ получения расщепленного с N-конца и/или C-конца растворимого полипептида PH20, включающий стадию культивирования клетки-хозяина.

Описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой диаграмму, показывающую ферментативные активности в культурах полипептидов PH20, в которых C-конец SEQ ID № 1 представляет собой Y482 или F468, а N-конец начинается с L36, N37, F38, R39 или A40, согласно воплощениям настоящего изобретения. Каждая активность выражена в виде относительного процента активности, на основе L36-Y482, имеющего наибольшую длину последовательности аминокислот.

Фиг. 2 представляет собой диаграмму, показывающую ферментативные активности, выраженные как специфические активности, при pH 5,3 очищенных полипептидов PH20, в которых C-конец SEQ ID № 1 представляет собой Y482 или F468, а N-конец начинается с L36, N37, F38, R39 или A40 согласно воплощениям настоящего изобретения. Каждая активность выражена в виде относительного процента активности на основе L36-Y482, имеющего наибольшую длину аминокислоты.

Фиг. 3 представляет собой диаграмму, показывающую ферментативные активности, выраженные как специфические активности, при pH 7,0 очищенных полипептидов PH20, у которых С-конец SEQ ID № 1 представляет собой Y482 или F468, а N-конец начинается с L36, N37, F38, R39 или A40, согласно воплощениям настоящего изобретения. Каждая активность выражена в виде относительного процента активности на основе L36-Y482, имеющего наибольшую длину последовательности аминокислот.

Фиг. 4 показывает результаты множественного выравнивания последовательностей с применением Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) аминокислотных последовательностей SEQ ID №№ 1, 2, 9 и 10.

Фиг. 5 представляет собой диаграмму, показывающую ферментативные активности культуральных сред полипептидов PH20, N-конец которых начинается с L36, N37 или D37, F38, R39, A40 или P41 для SEQ ID № 2 (в которой C-конец представляет собой Y483), SEQ ID № 9 (в которой С-конец представляет собой H478) или SEQ ID № 10 (в которой C-конец представляет собой H477), соответственно, согласно воплощениям настоящего изобретения. Каждая активность выражена как измеренная величина.

Фиг. 6 представляет собой диаграмму, показывающую ферментативные активности, выраженные как специфические активности, при pH 5,3 очищенных полипептидов PH20, N-конец которых начинается с L36, N37, F38, R39, A40 или P41 для SEQ ID № 2 (в которой C-конец представляет собой Y483), SEQ ID № 9 (в которой C-конец представляет собой H478) или SEQ ID № 10 (в которой С-конец представляет собой H477), соответственно, согласно воплощениям настоящего изобретения. Каждая активность выражена как измеренная величина.

Фиг. 7 показывает результаты измерения ферментативных активностей при pH 5,3 полипептидов PH20 в культурах и в очищенном состоянии, имеющих разные сигнальные пептиды для L36-Y482, N37-482 и F38-Y482 SEQ ID № 1, согласно воплощениям настоящего изобретения. Ферментативные активности культуры и очищенного белка с применением сигнального пептида из сывороточного альбумина человека, ферментативные активности культуры и очищенного белка с применением сигнального пептида из человеческого PH20 и ферментативные активности культуры и очищенного белка с применением сигнального пептида из человеческого иммуноглобулина каппа представлены на фиг. 7. Шкала ферментативной активности культуры представлена на основной оси ординат в виде гистограммы, а шкала активности очищенного белка представлена на вспомогательной оси ординат в виде линейного графика.

Подробное описание настоящего изобретения и предпочтительных воплощений

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют те же значения, которые обычно понимаются специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. В целом, номенклатура, используемая в настоящей заявке, хорошо известна, и ее широко применяют в данной области техники.

Для расширения промышленных масштабов получения рекомбинантного полипептида PH20, который расщеплен на С-конце и конвертирован в растворимую форму, настоящее изобретение предлагает расщепленный с N-конца и/или C-конца полипептид PH20 со значительно улучшенным выходом за счет дополнительного расщепления с N-конца. Используемый здесь термин «растворимый» относится к форме, имеющей трехмерную структуру, которая активна в водном растворе без агрегации.

Соответственно, настоящее изобретение относится к рекомбинантному полипептиду PH20, в котором от 1 до 7 аминокислотных остатков, предпочтительно, от 1 до 6 аминокислотных остатков, предпочтительно, от 1 до 5 аминокислотных остатков, предпочтительно, от 1 до 4 аминокислотных остатков, предпочтительно, от 1 до 3 аминокислотных остатков, предпочтительно, от 1 до 2 аминокислотных остатков, предпочтительно, 1 аминокислотный остаток, удаляют с N-конца зрелого PH20 дикого типа животного происхождения.

Зрелый PH20 дикого типа животного происхождения в настоящем изобретении может относиться к рекомбинантному полипептиду PH20 в форме, которая проявляет желаемую функцию. Зрелый PH20 дикого типа животного происхождения, согласно настоящему изобретению, может относиться, например, к полипептиду, в котором сигнальный пептид, который способствует секреции зрелого PH20 дикого типа животного происхождения из клетки, расщепляется во время процесса секреции.

Животное может представлять собой, например, без ограничений, млекопитающее, грызуна и т.п., такого как человек, крыса, мышь, хомяк, кролик, свинья, корова, олень, овца, обезьяна и т.п.

PH20 дикого типа животного происхождения согласно настоящему изобретению может включать, например, но без ограничений:

(a) рекомбинантный полипептид PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от N37 до P42 в человеческом PH20 дикого типа, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID № 1;

(b) рекомбинантный полипептид PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от N37 до P42 у PH20 дикого типа от примата, имеющем аминокислотную любую последовательность из SEQ ID №№ 2-8;

(c) рекомбинантный полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от D37 до P42 у бычьего PH20 дикого типа, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID № 9; и

(d) рекомбинантный полипептида PH20, в котором N-концевой аминокислотный остаток (N-концевые аминокислотные остатки) удален (удалены) путем расщепления перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из от D37 до P42 у PH20 дикого типа от овцы, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID № 10.

Таблица 1. Информация об аминокислотных последовательностях PH20 животных

Название животного	Научное название	Uniprot ID	SEQ ID №
Человек	Homo sapiens	P38567	1
Обезьяна	Nazalis larvatus	H2DJA7	2
Шимпанзе	Pan troglodytes	A0A2J8QX33	3
Бонобо	Pan paniscus	A0A2R8Z9G5	4
Горилла	Gorilla gorilla gorilla	G3QVL9	5
Орангутан	Pongo abelii	A0A2J8U4U2	6
Обезьяна	Symphalangus syndactylus	H8XWI5	7
Обезьяна	Nomascus leucogenys	G1RNI9	8
Бык	Bos taurus	F1MTV1	9
Овца	Ovis ariens	W5NSU1	10

Таблица 2. Аминокислотные последовательности PH20 животных

Аминокислотная последовательность	SEQ ID №
MGVLKFKHIF FRSFVKSSGV SQIVFTFLLI PCCLTLNFRA PPVIPNVPFL WAWNAPSEFC LGKFDEPLDM SLFSFIGSPR INATGQGVTI FYVDRLGYYP YIDSITGVTV NGGIPQKISL QDHLDKAKKD ITFYMPVDNL GMAVIDWEEW RPTWARNWKP KDVYKNRSIE LVQQQNVQLS LTEATEKAKQ EFEKAGKDFL VETIKLGKLL RPNHLWGYYL FPDCYNHHYK KPGYNGSCFN VEIKRNDDLS WLWNESTALY PSIYLNTQQS PVAATLYVRN RVREAIRVSK IPDAKSPLPV FAYTRIVFTD QVLKFLSQDE LVYTFGETVA LGASGIVIWG TLSIMRSMKS CLLLDNYMET ILNPYIINVT LAAKMCSQVL CQEQGVCIRK NWNSSDYLHL NPDNFAIQLE KGGKFTVRGK PTLEDLEQFS EKFYCSCYST LSCKEKADVK DTDAVDVCIA DGVCIDAFLK PPMETEEPQI FYNASPSTLS ATMFIVSILF LIISSVASL	1
MGVIKFKHIF FRSFVKSSGV SQIVFTFLLI PCCLTLNFRA PPIIPNVPFL WAWNAPSEFC LGKFDEPLDM SLFSLIGSPR INVTGQGVTI FYVDRLGYYP YIDITTGVTV HGGIPQKVSL QDHLDKAKQD IIFYMPVDNL GMAVIDWEEW RPTWARNWKP KDVYKNRSIE LVQQQNVQLS LPEATDKAKQ EFEKAGKDFM LETIKLGKSL RPNHLWGYYL FPDCYNHHYK KPGYNGSCFD VEIKRNDDLS WLWNESTALY PSIYLNTQQS PVAATLYVRN RVQEAIRVSK IPDAKNPLPV FVYARLVFTD QVLKFLSRDE LVYTLGETVA LGASGIVIWG SLSIMRSMKS CLLLDNYMET ILNPYIINVT LAAKMCSQVL CQEQGVCIRK DWNSSDYLHL NPDNFAIQME KGGKFTVRGK PTLEDLEEFS EKFYCSCYTT LSCKEKADVKDTDAVDVCIA DGVCIDASLK PPVETEGSPP IFYNTSPSTL STTMFIVSIL FLIISSVVSL	2
MGVLKFKHIF FRSFVKSSGV SQIVFTFLLI PCCLTLNFRA PPVIPNVPFL WAWNAPSEFC LGKFDEPLDM SLFSFIGSPR INVTGQDVTI FYVDRLGYYP YIDSITGVTV NGGIPQKISL QDHLDKAKKD ITFYMPVDNL GMAVIDWEEW RPTWARNWKP KDVYKNRSIE LVQQQNVQLS LTEATEKAKQ EFEKAGKDFL VETIKLGKLL RPNHLWGYYL FPDCYNHHYK KPGYNGSCFN VEIKRNDDLS WLWNESTALY PSIYLNTQQS PVAATLYVRN RVQEAIRVSK IPDAKSPLPV FVYTRIVFTD QVLKFLSQDE LVYTFGETVA LGASGIVIWG TLSIMRSMKS CLLLDNYMET ILNPYIINVT LAAKMCSQVL CQEQGVCIRK NWNSSDYLHL NPDNFAIQLE KGGKFTVRGK PTLEDLEQFS EKFYCSCYST LSCKEKADVK DTDAVDVCIA DGVCIDAFLK PPMETEESQI FYNASPSTLS ATMFIVSILF LIISSVASL	3
MGVLKFKHIF FGSFVKSSGV SQIVFTFLLI PCCLTLNFRA PPVIPNVPFL WAWNAPSEFC LGKFDEPLDM SLFSFIGSPR INVTGQDVTI FYVDRLGYYP YIDSITGVTV NGGIPQKISL QDHLDKAKKD ITFYMPVDNL GMAVIDWEEW RPTWARNWKP KDIYKNRSIE LVQQQNVQLN LTEATEKAKQ EFEKAGKDFL VETIKLGKLL RPNHLWGYYL FPDCYNHHYK KPGYNGSCFN VEIKRNDDLS WLWNESTALY PSIYLNTQQS PVAATLYVRN RVREAIRVSK IPDAKSPLPV FVYTRIVFTD QVLKFLSQDE LVYTFGETVA LGASGIVIWG TLSIMRSMKS CLLLDNYMET ILNPYIINVT LAAKMCSQVL CQEQGVCIRK NWNSSDYLHL NPDNFAIQLE KGGKFTVRGK PTLEDLEQFS EKFYCSCYST LSCKEKADVK DTDAVDVCIA DGVCIDAFLK PPMETEESQI FYNASPSTLS ATMFIVSILF LIISSVASL	4
MGVLKFKHIF FRSFVKSSGV SQIVFTFLLI PCCLTLNFRA PPVIPNVPFL WAWNAPSKFC LGKFDEPLDM SLFSLIGSPR INITGQGVTI FYVDRLGYYP YIDSITGVTV NGGIPQKISL QDHLDKAKKD ITFYMPVDNL GMAVIDWEEW RPTWARNWKP KDVYKNRSIE LVQQQNVQLS LTEATEKAKQ EFEKAGKDFM VETIKLGKLL RPNHLWGYYL FPDCYNHHYK KPGYNGSCFN VEIKRNDDLS WLWNESTALY PSIYLNTQQS PVAATLYVRN RVQEAIRVSK IPDAKSPLPV FVYTRIVFTD QVLKFLSQDE LVYTFGETVA LGASGIVIWG TLSIMRSMKS CLLLDNYMET ILNPYIINVT LAAKMCSQVL CQEQGVCIRK DWNSSDYLHL NPDNFAIQLE KGGKFTVRGK PTLEDLEQFS EKFYCSCYST LSCKEKADIK DTDAVDVCIA DGVCIDAFLK PPMDTEESQI FYNASPSTLS ATMLIVSILF LIISSVARL	5
MGVLKFKHIF FRSFVKSSGV SQIVLTFLLI PCCLTLNFRA PPIIPNMPFL WAWNAPSEFC LGKFDEPLDM SLFSLIGSPR INVTGQAVTI FYVDRLGYYP YIDSITGVTV NGGIPQKISL QDHLDKAKKD ILFYMPVDNL GMAVIDWEEW RPTWARNWKP KDVYKNRSIE LVQQQNVQLN LTEATEKAKQ EFEKAGKDFM VETIKLGKLL RPNHLWGYYL FPDCYNHHYK KPGYNGSCFN VEIKRNDDLS WLWNESTALY PSIYLNTQQS PVAATLYVRN RVREAIRVSK IPDAKSPLPV FVYARIVFTD QVLKFLSQDE LVYTFGETVA LGASGIVIWG SLSIMRSMKS CLLLDNYMET ILNPYIINVT LAAKMCSQVL CQEQGVCIRK DWNSSDYLHL NPDNFAIQLE KGGKFTVRGK PTLEDLEQFS EKFYCSCYST LSCKEKADVK DTDAVDVCIA DGVCIDAFLK PPMETEESQI FYNASPSTLS ATMFIWRLEV WDQGISRMGF F	6
MGVLKFKHIF FRSFVKSNGV SQIVFTFLLI PRCLTLNFRA PPVIPNVPFL WAWNAPSEFC LGKFDEPLDM SLFSLIGSPR INVTGQGVTI FYVDRLGYYP YIDSITGVTV NGGIPQKISL QDHLDKAKQD ITFYMPVDNL GMAVIDWEEW RPTWARNWKP KDVYKNRSIE LVQQQNVQLN LTEATEKAKQ EFEKAGKDFM VETIKLGKLL RPNHLWGYYL FPDCYNHHYK KPGYNGSCFN VEIKRNDDLS WLWNESTALY PSIYLNTQQS PVAATLYVRN RVREAIRVSK IPDAKSPLPV FVYARIVFTD QVLKFLSRDE LVYTLGETVA LGASGIVIWG SLSIMRSMKS CLLLDNYMET ILNPYIINVT LAAKMCSQVL CQEQGVCIRK DWNSSDYLHL NPDNFAIQLE KGGKFTVRGK PTPEDLEQFS EKFYCSCYST LSCKEKADVK DTDAVDVCIA DGVCIDAFLK PPKETEESQI FYNASPSTLS ATMFIVSILF PIISSVVSL	7
MGVLKFKHIF FRSFVKSNGI SQIVFTFLLI PRCLTLNFRA PPVIPNVPFL WAWNAPSEFC LGKFDEPLDM SLFSLTGSPR INVTGQGVTI FYVDRLGYYP YIDSITGVTV NGGIPQKISL QDHLDKAKQD ITFYMPVDNL GMAVIDWEEW RPTWARNWKP KDVYKNRSIE LVQQQNVQLS LAEATEKAKQ EFEKAGKDFM VETIKLGKLL RPNHLWGYYL FPDCYNHHYK KPGYNGSCFN VEIKRNDDLS WLWNESTALY PSIYLNTQQS PVAATLYVRN RVREAIRVSK IPDAKSPLPV FVYARIVFTD QVLKFLSRDE LVYTLGETVA LGASGIVIWG SLSIVRSMKS CLLLDNYMET ILNPYIINVT LAAKMCSQVL CQEQGVCIRK DWNSSDYLHL NPDNFAIQLE KGGKFTVRGK PTPEDLEQFS EKFYCSCYST LSCKEKADVK DTDAVDVCIA DGVCIDAFLK PPKETEESQI FYNASPSTLS ATMFIVSILF LIISSVVSL	8
MRMLRRHHIS FRSFAGSSGT PQAVFTFLLL PCCLALDFRA PPLISNTSFL WAWNAPVERC VNRRFQLPPD LRLFSVKGSP QKSATGQFIT LFYADRLGYY PHIDEKTGKT VFGGIPQLGN LKSHLEKAKN DIAYYIPNDS VGLAVIDWEN WRPTWARNWK PKDVYRDESV ELVLQKNPQL SFPEASKIAK VDFETAGKSF MQETLKLGKL LRPNHLWGYY LFPDCYNHNH NQPTYNGNCP DVEKRRNDDL EWLWKESTAL FPSVYLNIRL KSTQNAALYV RNRVQEAIRL SKIASVESPL PVFVYARPVF TDGSSTYLSQ GDLVNSVGEI VSLGASGIIM WGSLNLSLSM QSCMNLGTYL NTTLNPYIIN VTLAAKMCSQ VLCHNEGVCT RKHWNSSDYL HLNPMNFAIQ TGEGGKYTVP GTVTLEDLQK FSDTFYCSCY ANIHCKKRVD IKNVHSVNVC MAEDICIDSP VKLQPSDHSS SQEASTTTFS SISPSTTTAT VSPCTPEKHS PECLKVRCSE VIPNVTQKAC QSVKLKNISY QSPIQNIKNQ TTY	9
KRMLRRRHIS FRSFVGASGT PQAALAFLLL PCWLALDFRA PPLISNTSFL WAWNAPAERC VKIFKLPPDL RLFSVKGSPQ KSATGQFITL FYADRLGYYP HIDEKTGNTV YGGIPQLGNL KNHLEKAKKD IAYYIPNDSV GLAVIDWENW RPTWARNWKP KDVYRDESVE LVLQKNPQLS FPEASKIAKV DFETAGKSFM QETLKLGKLL RPNHLWGYYL FPDCYNHNYN QPTYNGNCSD LEKRRNDDLD WLWKESTALF PSVYLNIKLK STPKAAFYVR NRVQEAIRLS KIASVESPLP VFVYHRPVFT DGSSTYLSQG DLVNSVGEIV ALGASGIIMW GSLNLSLTMQ SCMNLGNYLN TTLNPYIINV TLAAKMCSQV LCHDEGVCTR KQWNSSDYLH LNPMNFAIQT GKGGKYTVPG KVTLEDLQTF SDKFYCSCYA NINCKKRVDI KNVHSVNVCM AEDICIEGPV KLQPSDHSSS QNEASTTTVS SISPSTTATT VSPCTPEKQS PECLKVRCLE AIANVTQTGC QGVKWKNTSS QSSIQNIKNQ TTY	10

Гиалуронидаза в человеческом организме присутствует в плазме или других органах и включает Hyal1, Hyal2, Hyal3 и Hyal4, которые активны при кислом pH, и PH20, которая экспрессируется в акросоме сперматозоида и играет роль в оплодотворении.

Полипептид PH20 человека, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID № 1, состоит из сигнальной последовательности от M1 до T35, активных сайтов гиалуронидазы от L36 до S490 и C-концевых GPI (гликозилфосфатидилинозитол)-заякоренных последовательностей от A491 до L509, и рекомбинантный полипептид PH20, преобразованный в растворимую форму, лишенную всех С-концевых GPI-заякоренных последовательностей, применяют в качестве терапевтического или диспергирующего средства in vivo. В особенности, сообщалось, что активность фермента не изменяется при сохранении растворимости, даже когда некоторую часть С-концевой аминокислотной последовательности, т.е. любую часть между I465 и L509, расщепляют. У коммерческого продукта С-конец заканчивается в положении 482. Однако в этом случае сохранена последовательность, начинающаяся с L36 N-конца, за исключением сигнальной последовательности (WO 2010/077297A и т.д.).

Недавно было показано, что варианты гиалуронидазы с расщепленным N-концом, начинающиеся с N37, F38, R39, A40, P41 или P42, а также с L36, представляют собой ферментативно активные варианты, и на этой основе был разработан вариант гиалуронидазы с хорошей термостабильностью и ферментативной активностью. (WO 2020/022791A и др.).

Полипептид PH20 обезьяны (Nasalis larvatus) имеет 93,1% идентичности последовательности с полипептидом PH20 человека. Следовательно, основываясь на результатах анализа множественных последовательностей, показанных на фиг. 4, можно ожидать, что полипептид PH20 обезьяны (Nasalis larvatus) с С-концом, который заканчивается на Y483, представляет собой активный и растворимый PH20.

Полипептид PH20 быка (Bos taurus) и полипептид PH20 овцы (Ovis aries) имеют 90,6% идентичности последовательностей друг с другом и 63,6%, и 63,5% идентичности последовательностей с полипептидом PH20 человека, соответственно. Для полипептида PH20 быка (Bos taurus) Meyer et al. (1997) сообщили, что растворимый полипептид имеет С-конец, который заканчивается H478. На основании результатов множественного выравнивания последовательностей, представленных на фиг. 4, можно ожидать, что полипептид PH20 овцы (Ovis aries) с С-концом, который заканчивается H477, представляет собой активный и растворимый PH20.

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный полипептид PH20, расщепленный с N-конца и/или C-конца, с улучшенным выходом за счет дальнейшего расщепления с N-конца, то есть дополнительного удаления аминокислотного остатка из зрелого нативного полипептида PH20. Используемый здесь термин «расщепленный с N-конца и/или C-конца рекомбинантный полипептид PH20» по существу относится к варианту PH20.

Рекомбинантный полипептид PH20, согласно настоящему изобретению, расщеплен до аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из N37-P42, в PH20 дикого типа, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID No: 1, что приводит к удалению N-концевого аминокислотного остатка (N-концевых аминокислотных остатков).

Конкретно, рекомбинантный полипептид PH20 по настоящему изобретению может включать последовательность, которая расщепляется до аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из N37-P42, и начинается с N37, F38, R39, A40, P41 или P42 аминокислотной последовательности SEQ ID No: 1. Более конкретно, рекомбинантный полипептид PH20 согласно настоящему изобретению может включать последовательность, начинающуюся с N37 или F38 аминокислотной последовательности SEQ ID No: 1.

Расщепление перед аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из N37-P42, указывает на то, что все аминокислотные остатки, непосредственно предшествующие аминокислотному остатку, выбранному из группы, состоящей из N37-P42, на N-конце расщепляют и удаляют.

Например, утверждение о том, что расщепление произошло перед аминокислотными остатками N37, F38, R39, A40, P41 или P42, означает, что в аминокислотной последовательности SEQ ID № 1 остатки с 1 по 36 непосредственно перед N37, остатки с 1 по 37 непосредственно перед F38, остатки с 1 по 38 непосредственно перед R39, остатки с 1 по 39 непосредственно перед A40, остатки с 1 по 40 непосредственно перед P41 и остатки с 1 по 41 непосредственно перед P42 были расщеплены и удалены, соответственно.

Рекомбинантный полипептид PH20, согласно настоящему изобретению, может дополнительно включать делецию некоторых аминокислотных остатков на С-конце. Конкретно, рекомбинантный полипептид PH20 по настоящему изобретению может быть расщеплен после аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из F468-Y482 аминокислотной последовательности SEQ ID No: 1, что приводит к удалению аминокислотных остатков на С-конце. Более конкретно, рекомбинантный полипептид PH20 по настоящему изобретению может включать последовательность, которая заканчивается на F468 или Y482 аминокислотных последовательностей SEQ ID No: 1.

Расщепление после аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из с F468 по Y482, аминокислотных последовательностей SEQ ID № 1, и делеция аминокислотных остатков на С-конце означают, что все аминокислотные остатки, расположенные непосредственно после аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из F468-Y482, на С-концах, расщепляют и удаляют. Например, расщепление после остатка F468 или Y482 означает, что все остатки после F468 или Y482 аминокислотных последовательностей SEQ ID № 1 расщепляют и удаляют.

В конкретном воплощении, рекомбинантный полипептид PH20, согласно настоящему изобретению, может быть выбран из группы, состоящей из:

(1) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с N37 и заканчивающуюся Y482 (N37-Y482) последовательности SEQ ID № 1;

(2) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с N37 и заканчивающуюся F468 (N37-F468) последовательности SEQ ID № 1;

(3) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся Y482 (F38-Y482) последовательности SEQ ID № 1; или

(4) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся F468 (F38-Y468) последовательности SEQ ID № 1;

(5) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с N37 и заканчивающуюся L490 (N37-L490) любой из последовательностей SEQ ID №№ 2-8;

(6) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся L490 (F38-L490) любой из последовательностей SEQ ID №№ 2-8;

(7) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с D37 и заканчивающуюся H478 (D37-H478) последовательности SEQ ID № 9;

(8) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся H478 (F38-H478) последовательности SEQ ID № 9;

(9) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с D37 и заканчивающуюся H477 (D37-H477) последовательности SEQ ID № 10;

(10) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся H477 (F38-H477) последовательности SEQ ID № 10;

(11) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с R39 и заканчивающуюся H477 (R39-H477) последовательности SEQ ID № 10; и

(12) полипептида PH20, включающего аминокислотную последовательность, начинающуюся с A40 и заканчивающуюся H477 (A40-H477) последовательности SEQ ID № 10.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает композицию для лечения рака, содержащую рекомбинантный полипептид PH20, и способ лечения рака с применением этой композиции.

Раковые заболевания особо не ограничены и включают как солидные, так и гематологические раковые заболевания. Примеры таких видов рака могут быть выбраны из группы, состоящей из, без ограничений, рака кожи, включая меланому, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, рака молочной железы, рака легких, рака яичников, рака бронхов, рака носоглотки, рака гортани, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря, рака толстой кишки, рака шейки матки, рака мозга, рака простаты, рака кости, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака почки, рака пищевода, рака желчевыводящих путей, рака яичек, рака прямой кишки, рака головы и шеи, рака шейного отдела позвоночника, рака мочеточника, остеосаркомы, нейробластомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, астроцитомы и глиомы. Предпочтительно, раковые заболевания, которые можно лечить с помощью композиции по настоящему изобретению, могут быть выбраны из группы, состоящей, без ограничений, из рака толстой кишки, рака молочной железы, рака легких и рака почки.

Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель, причем носитель обычно применяют в рецептурах лекарственных средств, и он может представлять собой, по меньшей мере, один носитель, выбранный из группы, состоящей, без ограничений, из лактозы, декстрозы, сахарозы, сорбитола, маннитола, крахмал, камеди акации, фосфата кальция, альгината, желатина, силиката кальция, микрокристаллической целлюлозы, поливинилпирролидона, целлюлозы, воды, сиропа, метилцеллюлозы, метилгидроксибензоата, пропилгидроксибензоата, талька, стеарата магния и минерального масла. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать, по меньшей мере, одно средство, выбранное из группы, состоящей из разбавителей, вспомогательных веществ, смазывающих веществ, увлажнителей, подсластителей, ароматизаторов, эмульгаторов, суспензий и консервантов, которые обычно применяют при приготовлении фармацевтических композиций.

Фармацевтическую композицию можно вводить перорально или парентерально. При парентеральном введении ее можно вводить путем внутривенной инъекции, подкожной инъекции, внутримышечной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, эндотелиального введения, местного введения, интраназального введения, внутрилегочного введения или ректального введения. Белки или пептиды перевариваются при пероральном введении, поэтому можно составить пероральную композицию, покрывающую активный агент или защищающую его от разложения в желудке. Кроме того, композицию можно вводить с помощью любого устройства, которое позволяет транспортировать активный агент к клетке-мишени.

Фармацевтическая композиция может быть в форме раствора, суспензии, сиропа или эмульсии в масляной или водной среде или может быть составлена в форме экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы и может дополнительно включать диспергирующее средство или стабилизирующее средство для композиции.

В особенности, композиция для лечения рака, согласно настоящему изобретению, характеризуется применением в комбинированной терапии с другими противораковыми средствами.

Предпочтительные противораковые средства для применения в комбинированной терапии включают, без ограничений, химиотерапевтические средства, противораковые средства типа антител, РНК-интерференцию (RNAi) или клеточную терапию.

Противораковые средства, которые можно применять в комбинированной терапии, представляют собой, помимо прочего, иммунологические противораковые средства и, более предпочтительно, ингибиторы контрольных точек иммунного ответа.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантный полипептид PH20, имеющий делецию аминокислотного остатка с N-конца и/или C-конца зрелого PH20 дикого типа животного происхождения, согласно настоящему изобретению.

Нуклеиновая кислота, согласно настоящему изобретению, может присутствовать в клетках или клеточных лизатах или может присутствовать в частично очищенной или практически очищенной форме. Нуклеиновая кислота представляет собой «выделенную» или «практически очищенную» нуклеиновую кислоту, если она отделена от других клеточных компонентов или других примесей, таких как нуклеиновая кислота или белок из других клеток, с помощью стандартных способов, включая обработку щелочью/SDS, разделение в градиенте плотности CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез в агарозном геле и другие способы, широко известные в данной области техники. Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может представлять собой, например, ДНК или РНК.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, включающему нуклеиновую кислоту, в особенности, к рекомбинантному вектору экспрессии. Для экспрессии рекомбинантного полипептида PH20, согласно изобретению, ДНК, кодирующая рекомбинантный полипептид PH20, может быть получена стандартным способом молекулярной биологии (например, ПЦР-амплификацией или клонированием кДНК с применением гибридомы, экспрессирующей рекомбинантный полипептид PH20), и ДНК может быть «функционально связана» с последовательностью контроля транскрипции и трансляции и вставлена в вектор экспрессии.

Используемый в настоящем описании термин «функционально связанная» может означать, что ген, кодирующий рекомбинантный полипептид PH20, лигируют в вектор таким образом, что последовательность контроля транскрипции и трансляции в векторе выполняет намеченную функцию регулирования транскрипции и трансляции гена, кодирующего рекомбинантный полипептид PH20. Вектор экспрессии и последовательность контроля экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, которая будет применяться для экспрессии. Ген, кодирующий рекомбинантный полипептид PH20, встраивают в вектор экспрессии стандартным способом (например, лигированием фрагмента гена, кодирующего рекомбинантный полипептид PH20, и комплементарного сайта рестрикции вектора, или лигированием тупых концов, если сайт рестрикции отсутствует).

Кроме того, рекомбинантный вектор экспрессии имеет регуляторную последовательность, которая контролирует экспрессию гена, кодирующего рекомбинантный полипептид PH20, в клетке-хозяине. «Регуляторная последовательность» может включать промоторы, энхансеры или другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию гена, кодирующего рекомбинантный полипептид PH20. Специалист в данной области техники может понять, что конструкция вектора экспрессии может варьировать путем выбора другой контролирующей последовательности в зависимости от таких факторов, как тип трансформируемой клетки-хозяина или уровень экспрессии белка.

В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту или вектор. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению предпочтительно выбрана из группы, состоящей, без ограничений, из клеток животных, клеток растений, дрожжей, E.coli и клеток насекомых.

В особенности, клетка-хозяин, согласно настоящему изобретению, может представлять собой прокариотическую клетку, такую как Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis или Staphylococcus sp. Это также может быть клетка грибов, таких как Aspergillus sp., дрожжей, таких как Pichia Pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. или Neurospora crassa, другая низшая эукариотическая клетка или эукариотическая клетка, такая как клетка высших эукариот, например, насекомых.

Кроме того, клетка-хозяин, согласно настоящему изобретению, может быть получена из растений или организма млекопитающих. Предпочтительно можно применять клетки почки обезьяны 7 (COS7), клетки NSO, SP2/0, клетки яичника китайского хомячка (CHO), W138, клетки почки новорождённого хомяка (BHK), MDCK, клеточные линии миеломы, клетки HuT 78 или клетки HEK293, но не ограничиваться ими. Особенно предпочтительно, можно применять клетки CHO.

Нуклеиновую кислоту или вектор трансфицируют в клетку-хозяин. Для «трансфекции» можно применять ряд различных способов, обычно используемых для введения экзогенной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, таких как электрофорез, осаждение фосфатом кальция, трансфекция DEAE-декстраном или липофекция. Для экспрессии рекомбинантного полипептида PH20, согласно настоящему изобретению, можно применять различные комбинации хозяина/вектора экспрессии. Подходящие векторы экспрессии для эукариотического хозяина включают, без ограничений, последовательности контроля экспрессии, полученные из SV40, бычьих папилломавирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, цитомегаловирусов и ретровирусов. Вектор экспрессии, который можно применять в бактериальном хозяине, включает бактериальные плазмиды, полученные из Escherichia coli, такие как pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, векторы pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 или их производные; плазмиды с более широким кругом хозяев, такие как RP4; фаговую ДНК, примером которой может служить очень широкий спектр производных фага лямбда, таких как λgt10 и λgt11 или NM989; и другие ДНК-фаги, такие как М13 или нитчатый одноцепочечный ДНК-фаг. Вектор экспрессии, пригодный для дрожжевых клеток, представляет собой 2°С-плазмиду и ее производные. Вектор, пригодный для клеток насекомых, представляет собой pVL941.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантного полипептида PH20 согласно настоящему изобретению, включающему стадию культивирования клетки-хозяина для экспрессии рекомбинантного полипептида PH20 согласно настоящему изобретению.

Когда рекомбинантный вектор экспрессии, способный экспрессировать рекомбинантный полипептид PH20, вводят в клетку-хозяин млекопитающего, то рекомбинантный полипептид PH20 можно получить путем культивирования клетки-хозяина в течение периода времени, достаточного для экспрессии в клетке-хозяине, или, что более предпочтительно, в течение периода времени, достаточного для секреции рекомбинантного полипептида PH20 в культуральную среду, в которой культивируют клетку-хозяин.

В некоторых случаях экспрессированный рекомбинантный полипептид PH20 можно выделить из клетки-хозяина и очистить до гомогенности. Выделение или очистку рекомбинантного полипептида PH20 можно проводить любыми способами выделения или очистки, обычно применяемыми для белков, такими как хроматография. Хроматография может представлять собой, например, без ограничений, одну или несколько комбинаций, выбранных из аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии или гидрофобной хроматографии. В дополнение к хроматографии можно применять комбинацию фильтрации, ультрафильтрации, высаливания или диализа.

Далее в настоящем описании представлены примеры для дальнейшего раскрытия настоящего изобретения. Следующие примеры представлены только для иллюстрации настоящего изобретения, и для специалиста в данной области техники очевидно, что объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.

Пример 1. Клонирование расщепленной с N-конца и/или C-конца рекомбинантной гиалуронидазы PH20

Для экспрессии полипептида PH20 последовательность, кодирующую аминокислоты от L36 до S509 человеческого полипептида PH20 дикого типа, последовательность ДНК, кодирующую аминокислоты от M1 до L510 полипептида PH20 (Uniprot ID: H2DJA7) от обезьяны (Nasalis larvatus), последовательность ДНК кодирующую аминокислоты от L36 до H478 бычьего полипептида (Bos taurus) PH20 (Uniprot ID: F1MTV1) и последовательность ДНК, кодирующую аминокислоты от L36 до H477 полипептида PH20 (Uniprot ID: W5NSU1) от овцы (Ovis aries), синтезировали с помощью Genscript (Корея).

Каждый синтезированный ген полипептида PH20 амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (далее «ПЦР») и встраивали в сайт фермента рестрикции XhoI или NotI вектора pcDNA3.4-TOPO. Для экспрессии в клетках ExpiCHO применяли сигнальный пептид сывороточного альбумина человека. Для очистки белка с применением колонки HisTrap последовательность ДНК His-Tag располагали на 3'-конце кДНК PH20. Расщепленный с N-конца и/или C-конца полипептид PH20 анализировали с помощью ПЦР и аминокислотные замены подтверждали секвенированием ДНК.

Для получения расщепленного с N-конца варианта человеческого полипептида PH20 была приготовлена плазмида, содержащая L36-Y482, которую применяли в качестве матрицы для получения четырех вариантов, в которых аминокислоты последовательно удаляли одну за другой с N-конца, и каждого варианта из четырех вариантов, в которых С-конец заканчивается F468.

Для получения расщепленного с N-конца варианта обезьяньего полипептида PH20 (Nasalis larvatus) получали плазмиду, содержащую от L36 до Y483, и ее применяли в качестве матрицы для получения пяти вариантов, в которых аминокислоты последовательно удаляли одну за другой с N-конца.

Для получения расщепленного с N-конца варианта бычьего (Bos Taurus) полипептида PH20 получали плазмиду, содержащую от L36 до H478, и ее применяли в качестве матрицы для получения пяти вариантов, в которых аминокислоты последовательно удаляли одну за другой с N-конца.

Для получения расщепленного с N-конца варианта овечьего (Ovis aries) полипептида PH20 получали плазмиду, содержащую от L36 до H477, и ее применяли в качестве матрицы для получения пяти вариантов, в которых аминокислоты последовательно удаляли одну за другой с N-конца.

Пример 2. Экспрессия и очистка расщепленной с N-конца и/или C-конца рекомбинантной гиалуронидазы PH20

Экспрессию расщепленного с N-конца и/или C-конца полипептида PH20 осуществляли с применением системы экспрессии ExpiCHO. Когда плотность клеток клетки ExpiCHO достигала 6×10⁶ клеток/мл, то плазмиду, содержащую кДНК расщепленного с N-конца и/или C-конца полипептида PH20, встроенную в вектор pcDNA3.4-TOPO, трансфицировали в клетки ExpiCHO с применением реагента ExpiFectamine CHO. В качестве среды для культивирования клеток применяли среду экспрессии ExpiCHO (от 100 до 500 мл). После трансфекции клетки ExpiCHO встряхивали и культивировали при 130 об/мин в общей сложности 6 дней, в течение которых клетки инкубировали при 37°С в течение 1-го дня и далее инкубировали при более низкой температуре 32°С в течение 5-ти дней. После завершения инкубации клеточные супернатанты собирали центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 минут.

Полипептид PH20 с His-меткой на С-конце, полученный из клеток ExpiCHO, очищали с помощью двухстадийной колоночной хроматографии с применением оборудования AKTA Prime или аналогичного оборудования (GE Healthcare). Для человеческого PH20 и обезьяньего PH20 применяли Q-сефарозу, которая представляет собой реагент анионообменной хроматографии, поскольку их изоэлектрическая точка (pI) близка к 6. Для бычьего или овечьего полипептида PH20 pI превышает 8, поэтому первую очистку проводили с применением колонки Capto S, которая представляет собой реагент катионообменной хроматографии, а вторую очистку для каждого белка проводили с применением колонки HisTrap HP для His-Tag хроматографии.

Для очистки белка с применением колонки с Q-сефарозой готовили буфер А (20 мМ фосфата натрия, pH 7,5) и буфер B (20 мМ фосфата натрия, pH 7,5, 0,5 М NaCl). pH и проводимость культуральной среды доводили до таких же значений, как у буфера А, и культуральную среду фильтровали через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Белки связывали с колонкой с Q-сефарозой, затем пропускали 5CV буфера A для удаления неспецифически связанных белков и 5CV буфера B пропускали с градиентом концентрации от 0 до 100%, чтобы элюировать белки.

Для очистки белка с применением колонки Capto S готовили буфер А (20 мМ фосфат натрия, 15 мМ NaCl, pH 6,0) и буфер B (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, pH 6,0). pH и проводимость культуральной среды доводили до таких же, как у буфера А, и культуральную среду фильтровали через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Затем белки связывали с колонкой Capto S и пропускали 3 объема колонки (CV) буфера А для удаления неспецифически связанных белков. Последовательно пропускали 4CV буфера B для элюирования целевого белка.

Для очистки белка с применением колонки His-Trap HP готовили буфер А (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, pH 7,5) и буфер B (20 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, pH 7,5). После того как образец белка был связан с колонкой His-Trap HP, пропускали 7 CV 7% буфера B для удаления неспецифически связанных белков и 3 CV 40% буфера B для элюирования целевого белка. Элюат колонки диализовали с применением диализного буфера (20 мМ фосфат натрия, 100 мМ NaCl, pH 7,0).

Пример 3. N-концевое секвенирование расщепленной с N-конца и/или С-конца рекомбинантной гиалуронидазы PH20

Очищенный расщепленный с N-конца и/или C-конца полипептид PH20 наносили в количестве 10 мкг на дорожку 7,5% геля для SDS-PAGE и проводили электрофорез (150 В, 1 час). Гель, содержащий разделенные электрофорезом белки, затем вводили в набор для блоттинга с PVDF мембраной и переносили при 100 В в течение 90 минут, и перенос подтверждали окрашиванием Ponceau S. Наконец, образцы, полученные путем разрезания каждой белковой полосы, секвенировали по 5 аминокислотам с N-конца с применением белкового секвенатора PPSQ-53A (Shimadzu, Япония).

В результате N-концевого секвенирования было подтверждено, что другие полипептиды PH20 имеют ожидаемую последовательность, но в некоторых полипептидах человеческого PH20, имеющих N37-Y482 или N37-F468, в качестве аминокислоты на N-конце был обнаружен аспартат, а не аспарагин, что приводило к дезамидированию. На основании этого результата и анализа множественного выравнивания последовательностей, показанного на фиг. 4, демонстрирующих, что аспартат был обнаружен как соответствующая аминокислота у быка и овцы, можно сделать вывод, что аспартат как аминокислота в этом положении играет роль в стабилизации структуры белка.

Пример 4. Измерение активности рекомбинантной расщепленной с N-конца и/или C-конца гиалуронидазы PH20

Активность гиалуронидазы измеряли с помощью турбидиметрического анализа, который измеряет поглощение мутности, вызванной осадками, образующимися при смешивании гиалуроновой кислоты с альбумином (БСА). Когда гиалуроновая кислота гидролизуется полипептидом PH20, мутность/поглощение осадков, образующихся при смешивании гиалуроновой кислоты и альбумина, уменьшается. Этот анализ обычно проводят при pH 5,3 следующим образом. Стандарты гиалуронидазы с известной активностью (единицы) разводят до 6, 8, 10, 12, 15 и 20 единиц/мл и готовят в каждой пробирке. Образцы очищенного белка разводят в буфере (20 мМ фосфата натрия, рН 5,3, 77 мМ хлорида натрия и 0,01% (масса/объем) бычьего сывороточного альбумина), регулируя коэффициент разведения так, чтобы он соответствовал диапазону стандартной кривой. По 50 мкл разбавленного образца распределяют в каждую лунку 96-луночного планшета и подвергают реакции нагревания при 37°С в течение 10 минут. В каждую лунку дополнительно вносят по 50 мкл 0,06% гиалуроновой кислоты. 0,06% гиалуроновую кислоту растворяют в 300 мМ натрий-фосфатном буфере, имеющем pH 5,3. Образцы и 0,06% гиалуроновой кислоты оставляли для прохождения реакции при 37°C в течение 45 минут. После реакции 40 мкл реакционного раствора фермент-субстрат распределяли в 200 мкл кислого раствора альбумина и оставляли при комнатной температуре на 19 минут. Затем измеряли поглощение при 600 нм с применением спектрофотометра. Кислый раствор альбумина состоит из 0,1% альбумина (БСА), растворенного в буфере с pH 3,75, содержащем 24 мМ ацетата натрия и 79 мМ уксусной кислоты. Значения поглощения измеренных образцов преобразовывали в активности с помощью стандартной кривой с применением стандарта активности.

При выполнении вышеуказанных стадий при pH 7,0 буфер для образцов белка представлял собой 20 мМ фосфат натрия с pH 7,0, 77 мМ хлорид натрия и 0,01% (масса/объем) бычьего сывороточного альбумина, а для 0,06% гиалуроновой кислоты в водном растворе гиалуроновую кислоту растворяли в 20 мМ натрий-фосфатном буфере, имеющем pH 7,0, и 70 мМ хлориде натрия.

Эти измерения активности также можно проводить в культуральных средах. В этом случае, поскольку значения ниже 300 единиц/мл ненадежны, предел количественного определения (LOQ) был установлен на уровне 300 единиц/мл, а величины ниже этого значения были помечены как неактивные, 0. Кроме того, в случае измерения активности с применением образцов очищенного белка предел количественного определения (LOQ) был установлен на уровне15 единиц/мкг.

N-конец был скорректирован до L36, N37, F38, R39 или A40, за исключением сигнальной последовательности от M1 до T35 полипептида PH20 дикого типа, по последовательности SEQ ID № 1, а C-конец был выбран до F468 или Y482, всего 10 N-концевых и/или C-концевых расщепленных полипептидов PH20 были получены способом по примеру 1. Каждый из соответствующих клонов очищали в культуральной среде, полученной путем временной трансфекции культуры клеток животных, и ферментативные активности при pH 5,3 и pH 7,0 сравнивались способом по примеру 2.

Как показано на фиг. 1, удивительно, но в результате сравнения активности человеческой PH20 в каждой культуральной среде активность N37-Y482 в культуральной среде более чем в 3 раза превышала активность в культуральной среде зрелой L36-Y482, имеющей N-конец дикого типа, а активность F38-Y482 человеческой PH20, у которой дополнительно удалили два аминокислотных остатка с N-конца, в культуральной среде, также более чем в 2 раза превышала активность в культуре зрелой L36-Y482, имеющей N-конец дикого типа.

Однако отсутствие трех N-концевых аминокислотных остатка в R39-Y482 приводило к незначительной экспрессии фермента и отсутствие четырех N-концевых аминокислотных остатка в A40-Y382 также приводило к незначительной экспрессии фермента в культуре.

В заключение, для человеческой гиалуронидазы PH20 было обнаружено, что варианты, в которых отсутствует один или два N-концевых аминокислотных остатка в зрелой человеческой гиалуронидазе PH20, демонстрируют значительно повышенную экспрессию в культуральной среде. В особенности, учитывая промышленную доступность человеческой гиалуронидазы PH20 для инъекций, показано, что путем получения варианта фермента, в котором расщепляется одна или две N-концевые аминокислоты, можно получить промышленно и экономически выгодные варианты.

Кроме того, как показано на фиг. 2 и 3, существует небольшая разница между специфическими активностями L36-Y482, N37-Y482 и F38-Y482, подтверждающая, что различия в активности человеческой гиалуронидазы PH20 на фиг. 1, обусловлены различиями в выходе. Кроме того, среди вариантов PH20, которые были на 14 С-концевых аминокислот короче, чем белок, С-конец которого заканчивается Y482, в культуральной среде была активна только N37-F468 с удаленной одной N-концевой аминокислотой.

В особенности, на фиг. 2 показана специфическая активность каждого очищенного полипептида при pH 5,3, подтверждая тот факт, что между L36-Y482, N37-Y482 и F38-Y482 была небольшая разница, когда С-конец представлял собой Y482, но когда С-конец представлял собой F468, то N37-F468 и F38-F468 имели удельную активность в 1,5-2 раза выше, чем L36-F468. Такую же закономерность наблюдали и в удельной активности при pH 7,0.

То есть, основываясь на результатах, показанных на фиг. 2 и 3, более короткий вариант коммерчески применяемой PH20, L36-F468, в которой C-концевые аминокислоты были дополнительно расщеплены до положения 468, практически не экспрессировался в клетках животных. В результате очистки очень небольшого количества экспрессированного при этом варианта L36-F468 и измерения его удельной активности удельная, активность фермента составила примерно 60% по сравнению с L36-Y482. На основании этих результатов активность гиалуронидазы или выход полипептида PH20 значительно увеличивается, когда один или два дополнительных N-концевых аминокислотных остатка удаляют из зрелой человеческой гиалуронидазы PH20.

В заключение следует отметить, что хотя удельная активность варианта фермента человеческой гиалуронидазы PH20, состоящего из L36-F468, существенно не снижалась по сравнению с вариантом фермента L36-Y482 PH20, его экспрессия в рекомбинантной клетке была чрезвычайно низкой, что делало его непригодным для промышленного применения.

С другой стороны, для варианта N37-F468 значительно увеличилась экспрессия в клетках, что аналогично экспрессии варианта L36-Y482, но экспрессия в клетках N37-F468, у которого была дополнительно удалена одна N-концевая аминокислота, резко увеличивалась, по меньшей мере, в 100 раз по сравнению с L36-F468.

Принимая во внимание молекулярное моделирование PH20 и экспериментальные результаты настоящего изобретения, можно заключить, что взаимодействие между аминокислотами на N-конце и аминокислотами на C-конце PH20 влияет на стабильность, скорость сворачивания и т.д. во время транскрипции и транслокации рекомбинантного белка PH20, когда он экспрессируется в клетках, и, кроме того, сильно влияет на экспрессию рекомбинантного белка, секретируемого из клеток. Это существенно влияет на выход PH20 и ее вариантов. Эти результаты могут быть применены не только к человеческой PH20, но также к PH20, полученным из организма млекопитающих, таких как бык или овца, и, кроме того, ожидается, что они будут применимы к другим PH20 со структурными или физико-химическими свойствами, аналогичными человеческой PH20.

Кроме того, было обнаружено, что эти свойства сохраняются у PH20 млекопитающих, имеющих структуру последовательности, аналогичную полипептиду человеческой PH20, и ту же самую биологическую функцию, особенно у PH20 обезьяны (Nasalis larvatus), быка (Bos taurus) и овцы (Ovis aries), перечисленных в таблице 1, как показано на фиг. 5 и 6. В особенности, было обнаружено, что полипептид PH20 овцы имеет высокую экспрессию, когда N-конец начинается с A40.

Таким образом, результаты настоящего изобретения показывают, что для зрелого белка PH20, особенно PH20 животного происхождения, такого как человеческий PH20, удаление дополнительных от одного до четырех, предпочтительно, одного или двух, аминокислотных остатков на N-конце может резко увеличить скорость экспрессии в рекомбинантной клетке, тем самым увеличивая продуктивность белка.

Для человеческого белка PH20, когда C-конец оканчивается Y482, PH20 с некоторыми дополнительными N-концевыми аминокислотными остатками, удаленными из зрелого PH20, демонстрировал значительное увеличение экспрессии без существенного изменения собственной активности гиалуронидазы, а когда С-конец заканчивался F468, вариант с одним или двумя N-концевыми аминокислотными остатками, дополнительно удаленными из зрелого PH20, скорее демонстрировал увеличение удельной активности фермента по сравнению со зрелым белком, имеющим полный N-конец. Хотя и предпринимали попытки повысить специфическую активность белка путем замены различных аминокислот в определенных участках аминокислотной последовательности человеческого PH20, не было зарегистрировано ни одного случая значительного увеличения его экспрессии в клетках за счет удаления аминокислот на N-конце при сохранении или увеличении его активности. Прогнозируется, что N-концевые удаленные варианты имеют преимущество с точки зрения иммуногенности по сравнению с PH20, в которой аминокислоту (аминокислоты) заменяют в специфическом сайте (специфических сайтах), даже после длительного введения в организм человека.

Были сообщения, показывающие, что экспрессия увеличивается при расщеплении N-конца в зрелом белке, например, исследования человеческого альфа-1-антитрипсина (H. Johansen et al., Mol. Biol. Med. 1987, 4:291-305) и белка L1 вируса папилломы человека (M. Wei et al., Emerging Microbes & Infections, 2018, 7:160), но трудно найти сходство друг с другом с точки зрения расположение аминокислот на N-концевом участке, по количеству усечений и т.д. Например, в альфа-1-антитрипсине человека делеция от 5 до 10 N-концевых аминокислот увеличивала экспрессию в клетках, но не меняла активность фермента, а в белке L1 вируса папилломы человека расщепление 10 или 15 N-концевых аминокислот не изменяло общую экспрессию белка, но в некоторых случаях увеличивали растворимость белка. В особенности, не было предпринято никаких подобных попыток для гиалуронидазы, такой как PH20, и не было обнаружено случаев, когда расщепление одной или двух N-концевых аминокислот резко увеличивает экспрессию и активность, как в настоящем изобретении.

Трехмерная кристаллическая структура человеческой PH20 пока неизвестна. Однако на основании предсказания трехмерной структуры PH20 с помощью компьютерной программы было спрогнозировано, что, хотя аминокислоты F38, R39 и Y434 расположены близко к боковой цепи аспарагина в положении 37 на N-конце PH20 и имеют соответствующие взаимодействия зарядов между собой, аминокислота Leu36 в зрелом белке не образует каких-либо специфических связей с окружающими аминокислотами, а гидрофобные аминокислоты подвергаются воздействию водного раствора, тем самым, отрицательно влияя на скорость связывания или стабильность и, кроме того, на экспрессию белка.

В зрелом белке дикого типа PH20 животного происхождения вариант с аминокислотной заменой, которая существенно не изменяет трехмерную структуру белка, может показывать те же результаты, что и настоящее изобретение. Поскольку их эффекты были также подтверждены на бычьих и овечьих PH20 с 63,6% и 63,5% идентичностью человеческой PH20, соответственно, а также на PH20 примата с более чем 93,1% идентичностью человеческой PH20, то те же результаты можно предсказать для PH20 с 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью человеческой PH20 в пределах диапазона, в котором трехмерная структура белка существенно не изменяется.

Пример 5. Получение расщепленных с N-конца и/или С-конца рекомбинантных гиалуронидаз PH20, имеющих разные сигнальные пептиды, и измерение активности

Для идентификации изменений сигнального пептида были приготовлены девять вариантов с сигнальными пептидами человеческой PH20, сывороточным гормоном человека или Ig каппа. Последовательности сигнальных пептидов перечислены в таблице 2 ниже.

В предыдущих примерах сигнальный пептид получали из сывороточного альбумина человека (HSA), и было протестировано, обеспечивают ли другие сигнальные пептиды, перечисленные в таблице 2, такие же результаты.

За исключением использования сигнальных пептидов из таблицы 2, L36-Y482, N37-Y482 и F38-Y482 рекомбинантной человеческой PH20 получали, как в примерах 1 и 2, и проводили анализ активности, как в примере 4. Результаты приведены на фиг. 7.

Как показано на фиг. 7, даже когда использовали сигнальные пептиды человеческой PH20 или Ig каппа, изменения продуктивности, зависящие от N-концевой делеции в зрелой PH20, имели тенденцию быть сходными со случаем использования сигнального пептида сывороточного гормона человека. В связи с этим было подтверждено, что увеличение экспрессии и выхода зрелой PH20 при дальнейшей делеции N-концевой аминокислоты в меньшей степени связано с типом сигнального пептида.

Промышленная применимость

Расщепленный с N-конца и/или C-конца полипептид PH20 с улучшенной ферментативной активностью и выходом, представленный в настоящей заявке, демонстрирует превосходную экспрессию и более высокую ферментативную активность по сравнению с обычными рекомбинантными полипептидами PH20, что может привести к снижению терапевтических затрат за счет снижения затрат на производство для промышленного применения.

В изложенном выше подробно описаны некоторые аспекты настоящего изобретения. Специалисту в данной области техники очевидно, что эти конкретные примеры представляют собой всего лишь предпочтительные воплощения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Соответственно, существенный объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Ссылки

1. H. Johansen, J. Sultiphong, G. Sathe, P. Jacobs, A. Cravador, A. Bollen, M. Rosenberg, and A. Shatzman, "High-level production of fully active human alpha 1-antitrypsin in Escherichia coli." Mol. Biol. Med. (1987) 4:291-305.

2. J.H. Dunham, R.C. Meyer, E.L. Garcia, and R.A. Hall, "GPR37 Surface Expression Enhancement via N-Terminal Truncation or Protein-Protein Interactions", Biochemistry (2009) 48:10286-10297.

3. M. Wei, D. Wang, Z. Li, S. Song, X. Kong, X. Mo, Y. Yang, M. He, Z. Li, B. Huang, Z. Lin, H. Pan, Q. Zheng, H. Yu, Y. Gu, J. Zhang, S. Li and N. Xia, "N-terminal truncations on L1 proteins of human papillomaviruses promote their soluble expression in Escherichia coli and self-assembly in vitro", Emerging Microbes & Infections (2018) 7:160.

4. M. F. Meyer, G. Kreil, and H. Aschauer, "The soluble hyaluronidase from bull testes is a fragment of the membrane-bound PH-20 enzyme", FEBS letter (1997) 413:385-388.

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="PP-B2945.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.0.0"

productionDate="2023-06-21">

<ApplicantName languageCode="en">Alteogen Inc.</ApplicantName>

N-terminal and/or C-terminal Cleaved Soluble PH20 polypeptide and Use

Thereof

</InventionTitle>

<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM

SLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNL

GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLL

RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN

RVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKS

CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK

PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLS

ATMFIVSILFLIISSVASL

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>510</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..510</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..510</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

MGVIKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPIIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM

SLFSLIGSPRINVTGQGVTIFYVDRLGYYPYIDITTGVTVHGGIPQKVSLQDHLDKAKQDIIFYMPVDNL

GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLPEATDKAKQEFEKAGKDFMLETIKLGKSL

RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFDVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN

RVQEAIRVSKIPDAKNPLPVFVYARLVFTDQVLKFLSRDELVYTLGETVALGASGIVIWGSLSIMRSMKS

CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQMEKGGKFTVRGK

PTLEDLEEFSEKFYCSCYTTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDASLKPPVETEGSPPIFYNTSPSTL

STTMFIVSILFLIISSVVSL

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM

SLFSFIGSPRINVTGQDVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNL

GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLL

RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN

RVQEAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKS

CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK

PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFYNASPSTLS

ATMFIVSILFLIISSVASL

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

MGVLKFKHIFFGSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM

SLFSFIGSPRINVTGQDVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNL

GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDIYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLL

RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN

RVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKS

CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK

PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFYNASPSTLS

ATMFIVSILFLIISSVASL

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSKFCLGKFDEPLDM

SLFSLIGSPRINITGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPVDNL

GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLL

RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN

RVQEAIRVSKIPDAKSPLPVFVYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKS

CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK

PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADIKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMDTEESQIFYNASPSTLS

ATMLIVSILFLIISSVARL

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>511</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..511</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..511</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVLTFLLIPCCLTLNFRAPPIIPNMPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM

SLFSLIGSPRINVTGQAVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDILFYMPVDNL

GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLL

RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN

RVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYARIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGSLSIMRSMKS

CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK

PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEESQIFYNASPSTLS

ATMFIWRLEVWDQGISRMGFF

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

MGVLKFKHIFFRSFVKSNGVSQIVFTFLLIPRCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM

SLFSLIGSPRINVTGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKQDITFYMPVDNL

GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLNLTEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLL

RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN

RVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYARIVFTDQVLKFLSRDELVYTLGETVALGASGIVIWGSLSIMRSMKS

CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK

PTPEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPKETEESQIFYNASPSTLS

ATMFIVSILFPIISSVVSL

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>509</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..509</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

MGVLKFKHIFFRSFVKSNGISQIVFTFLLIPRCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM

SLFSLTGSPRINVTGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKQDITFYMPVDNL

GMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLAEATEKAKQEFEKAGKDFMVETIKLGKLL

RPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRN

RVREAIRVSKIPDAKSPLPVFVYARIVFTDQVLKFLSRDELVYTLGETVALGASGIVIWGSLSIVRSMKS

CLLLDNYMETILNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKDWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK

PTPEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPKETEESQIFYNASPSTLS

ATMFIVSILFLIISSVVSL

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>553</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

MRMLRRHHISFRSFAGSSGTPQAVFTFLLLPCCLALDFRAPPLISNTSFLWAWNAPVERCVNRRFQLPPD

LRLFSVKGSPQKSATGQFITLFYADRLGYYPHIDEKTGKTVFGGIPQLGNLKSHLEKAKNDIAYYIPNDS

VGLAVIDWENWRPTWARNWKPKDVYRDESVELVLQKNPQLSFPEASKIAKVDFETAGKSFMQETLKLGKL

LRPNHLWGYYLFPDCYNHNHNQPTYNGNCPDVEKRRNDDLEWLWKESTALFPSVYLNIRLKSTQNAALYV

RNRVQEAIRLSKIASVESPLPVFVYARPVFTDGSSTYLSQGDLVNSVGEIVSLGASGIIMWGSLNLSLSM

QSCMNLGTYLNTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCHNEGVCTRKHWNSSDYLHLNPMNFAIQTGEGGKYTVP

GTVTLEDLQKFSDTFYCSCYANIHCKKRVDIKNVHSVNVCMAEDICIDSPVKLQPSDHSSSQEASTTTFS

SISPSTTTATVSPCTPEKHSPECLKVRCSEVIPNVTQKACQSVKLKNISYQSPIQNIKNQTTY

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<INSDSeq_length>553</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature_key>REGION</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Synthetic Sequence</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..553</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

KRMLRRRHISFRSFVGASGTPQAALAFLLLPCWLALDFRAPPLISNTSFLWAWNAPAERCVKIFKLPPDL

RLFSVKGSPQKSATGQFITLFYADRLGYYPHIDEKTGNTVYGGIPQLGNLKNHLEKAKKDIAYYIPNDSV

GLAVIDWENWRPTWARNWKPKDVYRDESVELVLQKNPQLSFPEASKIAKVDFETAGKSFMQETLKLGKLL

RPNHLWGYYLFPDCYNHNYNQPTYNGNCSDLEKRRNDDLDWLWKESTALFPSVYLNIKLKSTPKAAFYVR

NRVQEAIRLSKIASVESPLPVFVYHRPVFTDGSSTYLSQGDLVNSVGEIVALGASGIIMWGSLNLSLTMQ

SCMNLGNYLNTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCHDEGVCTRKQWNSSDYLHLNPMNFAIQTGKGGKYTVPG

KVTLEDLQTFSDKFYCSCYANINCKKRVDIKNVHSVNVCMAEDICIEGPVKLQPSDHSSSQNEASTTTVS

SISPSTTATTVSPCTPEKQSPECLKVRCLEAIANVTQTGCQGVKWKNTSSQSSIQNIKNQTTY

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Claims

1. Рекомбинантный полипептид PH20, имеющий активность гиалуронидазы, в котором аминокислотные остатки удалены с N-конца и С-конца зрелого PH20 дикого типа животного происхождения, содержащий:

(1) полипептид PH20, включающий аминокислотную последовательность, начинающуюся с N37 и заканчивающуюся Y482 последовательности SEQ ID № 1;

(2) полипептид PH20, включающий аминокислотную последовательность, начинающуюся с N37 и заканчивающуюся F468 последовательности SEQ ID № 1;

(3) полипептид PH20, включающий аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся Y482 последовательности SEQ ID № 1; или

(4) полипептид PH20, включающий аминокислотную последовательность, начинающуюся с N37 и заканчивающуюся L490 любой из последовательностей SEQ ID № 2-8;

(5) полипептид PH20, включающий аминокислотную последовательность, начинающуюся с F38 и заканчивающуюся на L490 любой из последовательностей SEQ ID № 2-8;

(6) полипептид PH20, включающий аминокислотную последовательность, начинающуюся с D37 и заканчивающуюся на H478 последовательности SEQ ID № 9;

(7) полипептид PH20, включающий аминокислотную последовательность, начинающуюся с D37 и заканчивающуюся на H477 последовательности SEQ ID № 10;

(8) полипептид PH20, включающий аминокислотную последовательность, начинающуюся с A40 и заканчивающуюся на H477 последовательности SEQ ID № 10.

2. Нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный полипептид PH20 по п. 1.

3. Рекомбинантный вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п. 2.

4. Клетка-хозяин для получения рекомбинантного полипептида PH20, трансфицированная рекомбинантным вектором экспрессии по п. 3.

5. Клетка-хозяин по п. 4, характеризующаяся тем, что она выбрана из группы, состоящей из клеток животных, растительных клеток, клеток дрожжей, E. coli и клеток насекомых.

6. Способ получения рекомбинантного полипептида PH20, включающий стадию культивирования клетки-хозяина по п. 5.